ES2622737T3 - Ensayo de detección de proteasas - Google Patents

Abstract

Un método para detectar la actividad proteasa (o actividad de las proteasas) en una solución de muestra, de manera que el método incluye poner en contacto la solución de muestra con un sustrato de proteasa marcado con un marcador electroquímicamente activo, proporcionar las condiciones adecuadas para que cualquier proteasa que pueda estar presente en la muestra pueda degradar el sustrato de proteasa, y determinar electroquímicamente la información relacionada con el marcador electroquímicamente activo, que se caracteriza por el hecho de que el marcador electroquímicamente activo es una fracción de metaloceno y el sustrato de proteasa es un péptido de al menos 5 residuos de aminoácidos.

Description

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Ensayo de deteccion de proteasas

CAMPO DE LA INVENCION

La invencion esta relacionada con diversos metodos para la deteccion o evaluacion de la actividad de la(s) proteasa(s).

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Las enzimas proteasas estan presentes en diversos fenomenos biologicos; por ejemplo, en la activacion de protemas y en la senalizacion celular. La actividad de la(s) proteasa(s) -o, simplemente, 'actividad proteasa’- desempena un papel clave en procesos como la coagulacion sangumea, la apoptosis y la regulacion hormonal. Las proteasas tambien son esenciales para el funcionamiento de diversos patogenos vmcos y microbianos. Existe un interes cada vez mayor respecto al desarrollo de inhibidores de proteasa para su uso como agentes terapeuticos.

Determinar la actividad proteasa en las muestras biologicas es importante para el analisis de procesos como la apoptosis, la deteccion o ’screening’ de potenciales inhibidores de proteasa y la monitorizacion de la pureza de las muestras, por ejemplo durante la purificacion de protemas. Las enzimas proteasas hidrolizan amidas y esteres para producir peptidos, aminoacidos simples o fragmentos de aminoacidos marcados, dependiendo de la estructura del sustrato y la naturaleza de la enzima. La determinacion o especificacion de la actividad proteasa puede realizarse utilizando un sustrato proteico que existe de forma natural o un sustrato peptfdico sintetico analogo que esta marcado, por ejemplo con un fluoroforo o un cromoforo. La determinacion de la actividad proteasa tambien puede realizarse utilizando un peptido corto y sintetico que esta marcado y que, de manera opcional, incorpora una secuencia de reconocimiento de proteasas. En algunos casos, la determinacion de la actividad proteasa puede realizarse utilizando un unico aminoacido marcado. En estos casos, la actividad proteasa se detecta gracias a la capacidad de la proteasa para deshacer el enlace entre el aminoacido simple y el marcador (o etiqueta) con el que esta marcado (o etiquetado).

La naturaleza de la protema utilizada depende de la solubilidad requerida y de los requisitos particulares de la prueba; normalmente, se utiliza albumina de suero bovino (BSA) o casema. Tambien se ha utilizado gelatina, ovoalbumina y protemas reticuladas.

La mayona de ensayos o metodos de deteccion presentes en el mercado utilizan un analogo de sustrato marcado. La deteccion de actividad proteasa puede realizarse utilizando un montaje reactivo homogeneo o heterogeneo. Normalmente, en un ensayo de deteccion homogeneo el sustrato esta en solucion y el producto tambien esta en solucion. Normalmente, los sistemas de deteccion basados en la fluorescencia que utilizan fluoroforos (por ejemplo, fluorescema, rodamina o fluoroforos BODIPY) funcionan de acuerdo con uno de estos dos principios: la deteccion de una senal fluorescente despues de la escision de una protema -con multiples marcadores- autoinhibida (kits de ensayos de proteasa enzCheck, Molecular Probes Inc.) o la deteccion de un cambio en el tamano de la fraccion/el conjugado marcados con fluorescentes utilizando tecnicas de polarizacion de fluorescencia (Beacon ®, kit de deteccion de la actividad proteasa, PanVera Corporation; kit de polarizacion enzCheck, Molecular Probes Inc.).

En un metodo de uso habitual, se utiliza un sustrato peptfdico cuyo carboxilo terminal se ha marcado con un tinte o medio de contraste que tiene una funcionalidad amina. Dicho tinte puede ser un cromoforo o un fluoroforo, por ejemplo, cumarina, fluorescema, rodamina o BODIPY (Molecular Probes Inc, apoalert™, kits de ensayo de proteasa CPP32, Clontech). El enlace amida que une el tinte y el aminoacido se rompe por medio de la proteasa para producir un derivado amina. El cambio en la estructura afecta a las caractensticas espectrales del tinte y se produce asf una senal detectable. Una estrategia alternativa para conseguir una deteccion homogenea es usar un sustrato peptfdico que esta marcado en una parte de un sitio de escision con un fluoroforo donante y, en la otra parte, con un ’quencher’ receptor, que conjuntamente forman un par FRET (’transferencia de energfa de resonancia de Forster’ o 'transferencia de energfa de resonancia fluorescente’). La escision del peptido provoca la separacion del donante y el receptor y, por lo tanto, produce un cambio en la senal fluorescente. La hidrolisis de una secuencia peptfdica espedfica puede detectarse por medio de un analisis basado en gel (ensayo de proteasa Peptag, Promega).

Normalmente, en un ensayo heterogeneo se produce la escision de un fragmento marcado con tinte respecto a un sustrato inmovilizado y, posteriormente, se realiza un analisis de la fase lfquida (ProteaseSpots, Jerini, Ensayo de Proteasa Universal ProCheck™, Intergen).

La actividad proteasa tambien puede determinarse usando un sustrato proteico no modificado (es decir, que existe de forma natural). Normalmente, los ensayos que utilizan sustratos proteicos no modificados requieren la precipitacion del sustrato no digerido y la posterior deteccion de los fragmentos proteicos escindidos. Dicha deteccion puede realizarse, por ejemplo, midiendo la absorbancia a 278 nm o mediante la deteccion de la funcionalidad amina primaria resultante. A menudo, estos metodos carecen de sensibilidad, requieren un sampleado para obtener datos cineticos y dependen de la precipitacion cuantitativa para obtener resultados precisos. De manera alternativa, la hidrolisis de las protemas succiniladas puede detectarse siguiendo la reaccion de los fragmentos peptfdicos resultantes con TNBSA (acido trinitrobenceno sulfonico).

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DE 10016775, US 4304853 y US 6495356 desvelan el uso de un marcador electroqmmico para la deteccion de enzimas de coagulacion sangumea. EP 1808494, que es anterior segun el Artmulo 54(3) EPC, describe compuestos de metaloceno electroqmmicamente activos.

A no ser que se deduzca lo contrario a partir del contexto, en lo que resta del presente documento el termino ’sustrato’ incluye tanto los sustratos que existen de forma natural como los sustratos sinteticos. Los sustratos sinteticos incluyen analogos sinteticos de sustratos que existen de forma natural, peptidos sinteticos que incorporan una secuencia de reconocimiento de proteasa y otros peptidos sinteticos, y aminoacidos simples. Los aminoacidos simples se consideran un sustrato porque, a pesar de que carecen de un enlace interno que puede escindirse mediante una enzima proteasa, dicho enlace puede formarse mediante la union de un marcador.

Tal y como se utiliza en el presente texto, el termino ’proteasa’ pretende incluir dentro de su alcance las protemas que se conocen como proteinasas.

Los terminos ’peptido’ y ’protema’ se usan indistintamente en el presente texto y ambos incluyen secuencias de aminoacidos de cualquier longitud, incluyendo aquellas con un pequeno numero de residuos de aminoacidos, por ejemplo, cinco residuos o tres residuos. Los terminos ’peptido’ y ’protema’ incluyen tanto las moleculas hechas en celdas como las moleculas hechas mediante smtesis sin celdas. Los terminos ’peptido’ y ’protema’ incluyen moleculas que tienen secuencias que existen de forma natural, que son semisinteticas o que son artificiales, de manera que dichas secuencias pueden incluir aminoacidos que no existen de manera natural en protemas. Por ejemplo, los terminos ’peptido’ y ’protema’ hacen referencia a una secuencia de aminoacidos de un peptido recombinante o no recombinante que tiene una secuencia de aminoacidos de (i) un peptido nativo, (ii) un fragmento biologicamente activo de un peptido nativo, (iii) un peptido biologicamente activo y analogo de un peptido nativo, (iv) una variante biologicamente activa de un peptido nativo, (v) un peptido que tiene una secuencia artificial que comprende una secuencia de consenso biologicamente activa o (vi) un peptido que tiene una secuencia completamente artificial.

El termino ’aminoacido’ incluye los aminoacidos que existen de forma natural y los aminoacidos que no se dan de forma natural en las protemas. Tambien incluye los derivados de aminoacidos; por ejemplo, aminoacidos acilados, enzimas proteasas, amidas hidrolizadas y esteres. Por tanto, debe entenderse que uno de los requisitos claves de un sustrato de proteasa marcado es la presencia de enlaces que puedan ser hidrolizados por enzimas proteasas. Por tanto, y de manera general, los terminos ’protema’, ’peptido’ y ’aminoacido’ deben interpretarse en su sentido mas amplio para que abarquen cualquier molecula derivada (o derivado molecular) que proporciona uno o mas enlaces que pueden ser hidrolizados por enzimas proteasas. Estos enlaces hidrolizables pueden proporcionarse dentro de la estructura de la propia molecula o, de forma alternativa o adicional, pueden formarse cuando la molecula se marca mediante la union con un marcador.

RESUMEN DE LA INVENCION

La invencion proporciona un metodo para detectar la actividad proteasa en una muestra, de manera que esto conlleva poner en contacto una solucion de muestra con un sustrato de proteasa(s) marcado con un marcador electroqmmicamente activo, proporcionar las condiciones para que cualquier proteasa que pueda estar presente en la muestra pueda degradar el sustrato de proteasa, y determinar electroqmmicamente la informacion relacionada con el marcador electroqmmicamente activo. La informacion relacionada con el marcador se usa convenientemente para obtener informacion sobre la presencia o ausencia de actividad proteasa. Preferiblemente, la informacion electroqmmica puede usarse para cuantificar las proporciones relativas del sustrato degradado y no degradado. Tal y como se utiliza en el presente texto, el termino ’degradar’ incluye cualquier degradacion que se produzca como resultado de una actividad enzimatica, por ejemplo, mediante digestion. Tal y como se utiliza en el presente texto, el termino ’degradar’ incluye la escision o descomposicion del marcador con respecto al sustrato marcado, incluso aunque no haya ninguna escision dentro de la propia molecula de sustrato.

Es bien conocida la modificacion de diversas moleculas biologicas con un marcador redox activo. El ferroceno es un marcador que se utiliza habitualmente para dicho proposito debido a su estabilidad y sus propiedades electroqmmicas y debido a la disponibilidad de derivados de ferroceno adecuados. Por ejemplo, se sintetizo una glucosa oxidasa modificada con ferroceno en la que el ferroceno esta unido covalentemente con la superficie de la glucosa oxidasa mediante una molecula espaciadora, y se descubrio que esta enzima modificada permite una transferencia de electrones mas eficiente entre la enzima y el mediador (International Journal of Biological Macromolecules (1992) 14(4), 210-214). El ferroceno tambien se ha utilizado para marcar protemas y facilitar asf su deteccion mediante metodos voltametricos (por ejemplo, BSA, avidina o citocromo P450). Tambien se conocen las moleculas biologicas ferroceniladas que se conjugan con una segunda molecula; por ejemplo, anticuerpos de digoxina marcados con ferroceno, anti-HCG IgG marcado con ferroceno y biotina marcada con ferroceno.

El marcado de protemas, peptidos o aminoacidos con ferroceno puede realizarse, por ejemplo, mediante una union covalente de un derivado de ferroceno (que sea carboxil-, sulfhidril- o amino-reactivo) con residuos espedficos de aminoacidos de la protema. Los ejemplos de derivados de ferroceno que se han desarrollado hasta la

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fecha incluyen diamidas, esteres de succinimidilo, aldehfdos, aminas primarias, iodoacetamidas y maleimidas. Los metodos conocidos para marcar protemas con marcadores electroqmmicamente activos incluyen el marcado de los grupos aminas de las protemas. La presente invencion proporciona metodos para el marcado de protemas, peptidos y aminoacidos que incluyen metodos para el marcado mediante uno o mas grupos carboxilos y tambien nuevos marcadores que son apropiados para el marcado mediante uno o mas grupos aminas. El hecho de proporcionar metodos para marcar protemas, peptidos y aminoacidos mediante un grupo carboxilo proporciona la ventaja de permitir la produccion de sustratos marcados que tienen un extremo o terminal amino libre y sin derivatizar que puede ser necesario para desarrollar ensayos de trabajo para determinadas aminopeptidasas, que son un tipo de proteasas que degradan peptidos del terminal amino.

DESCRIPCION DETALLADA

La aplicacion de la deteccion electroqmmica a ensayos de proteasa tiene diversas ventajas respecto a la deteccion fluorescente. La deteccion electroqmmica tiene el potencial necesario para niveles muy elevados de sensibilidad y muestra un rango dinamico lineal mas amplio que la fluorescencia. No es necesario que las muestras sean opticamente claras. Tambien hay una menor interferencia de contaminantes de fondo (muchas muestras biologicas son autofluorescentes).

La presente invencion se basa en la observacion de que un marcador electroqmmicamente activo presenta caractensticas electroqmmicas diferentes dependiendo del hecho de que este unido o no a un residuo de aminoacido, dependiendo del hecho de que dicho residuo de aminoacido este incorporado o no en un peptido o una protema y dependiendo de la longitud de dicho peptido o protema.

Bajo las circunstancias adecuadas, la actividad electroqmmica de un marcador puede variar en un grado o nivel detectable despues de producirse una perdida de la union de uno o muy pocos residuos de aminoacidos.

El tamano y las caractensticas de una molecula a la que esta unido un marcador electroqmmicamente activo influyen en las caractensticas observables del marcador electroqmmico. Esto puede suceder, por ejemplo, influyendo en la tasa de migracion del marcador mediante difusion o en su tasa de migracion en respuesta a un campo electrico.

La actividad electroqmmica de un marcador tambien puede verse influida por los efectos estericos que estan relacionados con la presencia de la molecula a la que esta unido. Por ejemplo, el impedimento esterico puede impedir que el marcador se aproxime a un electrodo y acepte o done electrones.

Si el marcador esta unido a un peptido, la estructura secundaria del peptido (ampliamente determinada por la secuencia principal) puede influir en las propiedades ffsicas del marcador. Por ejemplo, si el marcador esta unido a un residuo de aminoacidos en un peptido de manera que la estructura del peptido supone un impedimento esterico para el marcador electroqmmicamente activo, las senales observables mediante voltametna pueden disminuir. La digestion del peptido puede destruir o liberar los elementos de la estructura secundaria y, de este modo, puede reducir o eliminar la influencia de la estructura del peptido sobre el marcador. Por consiguiente, la digestion del peptido provoca un cambio, normalmente un aumento, en la senal electroqmmica producida por el segmento del marcador. En un experimento de voltametna de pulso diferencial, la respuesta de la corriente faradica -aplicando un voltaje particular- puede aumentar tras la digestion del peptido.

Las personas versadas en la materia entenderan que, puesto que la estructura secundaria de un peptido depende de la temperatura, los efectos que el peptido tiene sobre un marcador electroqmmicamente activo vanan con la temperatura. Una persona versada en la materia es capaz de escoger una temperatura adecuada para llevar a cabo la tecnica electroqmmica de la invencion con el objetivo de obtener una senal optima del mdice de ruido de fondo para dicha tecnica. Si la tecnica esta incorporada en un ensayo en el que se lleva a cabo un calentamiento o un enfriamiento, se puede obtener una medicion a la temperatura deseada seleccionando simplemente un punto adecuado en el regimen de temperatura para realizar la medicion.

La informacion relacionada con el marcador electroqmmicamente activo puede obtenerse mediante voltametna o mediante un metodo amperometrico. La voltametna de pulso diferencial resulta particularmente apropiada. Si se desea, el proceso de deteccion electroqmmica puede realizarse usando uno o mas electrodos cubiertos con una membrana que puede excluir moleculas de forma selectiva basandose en una o mas caractensticas; por ejemplo, tamano, carga o hidrofobia. Esto puede ayudar a la hora de eliminar la corriente de ruido de fondo que proviene, por ejemplo, de los componentes cargados presentes en la solucion.

Los marcadores electroqmmicamente activos que son adecuados incluyen aquellos que comprenden complejos pi metalo-carbodclicos, es decir, complejos organicos con electrones pi parcial o totalmente deslocalizados. Los marcadores adecuados incluyen aquellos que comprenden fracciones o segmentos sandwich (’sandwich moiety’, en ingles) en las que dos anillos carbodclicos son paralelos, o compuestos sandwich plegados (compuestos angulares) y monociclopentadienilos. Preferiblemente, el marcador electroqmmicamente activo es un marcador de metalocenilo. Mas preferiblemente, es un marcador de ferrocenilo.

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El anillo de ferroceno o metaloceno, que constituye preferiblemente el segmento o fraccion de marcado (tambien llamada 'fraccion marcadora'; 'labelling moiety', en ingles), puede estar sin sustituir. Si se desea, la estructura del anillo de ferroceno o metaloceno puede estar sustituida con uno o mas sustituyentes cuya naturaleza y posicion se seleccionan para que influyan de la manera deseada en las caractensticas redox de la fraccion de ferroceno o metaloceno. Ademas, o en vez de ello, el anillo de ferroceno o metaloceno puede estar sustituido con cualquier sustituyente anular que no reduzca sustancialmente la sensibilidad electroqmmica del marcador. De forma ventajosa, los marcadores de ferrocenilo y metalocenilo pueden ser ferroceno o metaloceno carboxamidas N- sustituidas, o ferrocenilaminas o metalocenilaminas. La fraccion de ferroceno o metaloceno carboxamida puede estar unida a la protema o al peptido mediante el nitrogeno de la carboxamida. El ligamiento ('linkage', en ingles) con el peptido o la protema puede realizarse por medio de cualquier ligamiento que sea adecuado, normalmente mediante el ligamiento con una cadena lateral de aminoacidos. Cuando el ligamiento se produce mediante un grupo amina de un aminoacido, peptido o protema, el atomo de nitrogeno puede constituir el nitrogeno de la fraccion de carboxamida. Cuando el ligamiento se produce mediante un grupo carboxilo de un aminoacido, peptido o protema, la fraccion de marcado de ferrocenilamina o metalocenilamina puede convertirse en una fraccion de ferrocenilamida o metalocenilamida tras la union con un grupo carboxilo de un aminoacido, peptido o protema. Cuando el sustrato no marcado no contiene un enlace que puede sufrir una hidrolisis por parte de la enzima proteasa prevista, por ejemplo, cuando el sustrato no marcado es un aminoacido simple, es necesario que el ligamiento del sustrato al marcador electroqmmico sea tal que provoque la formacion de un enlace que puede sufrir una hidrolisis por parte de la enzima proteasa prevista. En estas circunstancias, el marcado del sustrato se llevara a cabo preferiblemente mediante una union covalente con una fraccion carboxil- o amino-reactiva del sustrato. Se han desarrollado diversos metodos sinteticos para la derivatizacion de cadenas laterales de protemas, peptidos o aminoacidos, o de las porciones terminales (o restos terminales) de protemas, peptidos o aminoacidos. Por ejemplo, los residuos de lisina en una protema pueden derivatizarse por medio de una reaccion con un ester de succinimidilo. Para la derivatizacion en otros residuos de aminoacidos, pueden usarse otros metodos sinteticos conocidos. Por ejemplo, puede utilizarse un agente de maleimida para derivatizar residuos de cistema. Puede usarse un ester de N-hidroxisuccinimida para derivatizar el terminal amino o el grupo amino de la cadena lateral de una protema o peptido, o una fraccion amino de un aminoacido.

El grupo del marcador puede estar unido al sustrato de protemas, peptidos o aminoacidos a traves de una fraccion o segmento enlazador ('linker moiety', en ingles). Puede utilizarse cualquier fraccion enlazadora que sea adecuada. Las fracciones enlazadoras que son adecuadas pueden comprender una cadena alifatica que puede ser lineal o ramificada, y saturada o no saturada. De forma ventajosa, cuando se marca una protema, la fraccion enlazadora es una cadena alifatica lineal o ramificada, por ejemplo, una cadena de alquileno, que tiene entre 4 y 20 atomos de carbono, y, preferiblemente, entre 6 y 16, y especialmente entre 8 y 14 atomos de carbono, especialmente 12 atomos de carbono. Las cadenas de alquileno pueden ser sustituidas con cualquier sustituyente o pueden interrumpirse por medio de cualquier atomo o fraccion siempre y cuando dicho sustituyente, atomo o fraccion no reduzca sustancialmente la sensibilidad electroqmmica del marcador. Sin pretender vernos limitados por la teona, parece que la fraccion enlazadora disminuye el grado en el que la estructura terciaria de un sustrato proteico interfiere estericamente con el grupo del marcador, y viceversa. Esta teona es coherente con la observacion de que, cuando el sustrato es un aminoacido simple o un peptido corto -por ejemplo, un tripeptido-, es decir, una molecula de sustrato sin una cantidad significativa de estructura terciaria, generalmente no es necesario el uso de una fraccion enlazadora.

Los ejemplos ilustrativos de los marcadores de ferrocenilo que pueden usarse de acuerdo con la invencion se muestran en las Formulas I, II y III. En las formulas la y Ila, los marcadores de las formulas I y II se muestran - respectivamente- unidos al grupo amino de la cadena lateral de un residuo de aminoacido de lisina de un peptido. En la formula IIIa, el marcador que se muestra en la formula III se muestra unido al aminoacido alanina. En la formula IIIb, el marcador que se muestra en la formula III se muestra unido a un tripeptido Ala-Ala-Ala. En la formula IIIb puede apreciarse que el terminal amino de la fraccion del tripeptido de alanina es acilado. El grupo acilo, que se indica en su forma abreviada mediante 'Ac', se anadio al tripeptido durante la smtesis de la molecula que se muestra en la formula IIIb para proteger el terminal amino potencialmente reactivo del tripeptido. Para sintetizar algunas de las moleculas de sustrato marcadas de la invencion, puede ser necesario anadir grupos de proteccion como un BOC (butoxicarbonilo) y un acilo a la molecula de sustrato. De manera opcional, estos grupos de proteccion pueden eliminarse en fases posteriores de la smtesis. Sin embargo, en algunas circunstancias puede resultar mas conveniente conservar dichos grupos siempre y cuando su presencia no reduzca sustancialmente la utilidad de la molecula en el ensayo previsto.

Formula I

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Formula II

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En el caso de un sustrato de peptidos o protemas con una estructura secundaria significativa, la smtesis de un peptido o protema -marcados- a partir de una fraccion de marcado y la protema o peptido apropiados no da como resultado, generalmente, una derivatizacion completa de la protema o peptido. Muchos sitios no son accesibles para los reactivos en solucion. Por ejemplo, la molecula de BSA comprende 60 residuos de lisina (Hirayama et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1990, 173, 639-646). Segun la literatura especializada, el marcado de BSA con esteres de succinimidilo da ratios de BSA:marcador de entre 1:5 y 1:23 (Jones, L. J. Et al., Analytical Biochem., 1997, 251, 144-152; e Hiroaki, S. et al., 'Sensors and Actuators B’, 2000, 65, 144-146). Normalmente, el producto de reaccion de una smtesis de marcado contiene una mezcla de diferentes moleculas del producto con un numero diferente de marcadores. El numero promedio de marcadores puede calcularse mediante diversos metodos espectroscopicos, por ejemplo, espectroscopia ultravioleta-visible. La distribucion del numero de marcadores por cada molecula proteica puede calcularse con mas precision utilizando la espectrometna de masas.

El numero exacto de fracciones de marcado (o fracciones marcadoras) presentes en una protema o peptido no es cntico para el exito del ensayo de la invencion. Para obtener una buena sensibilidad, preferiblemente hay de media varias fracciones de marcado en cada molecula proteica o peptfdica. Sin embargo, cuando el sustrato es un aminoacido simple o un peptido corto, por ejemplo, un tripeptido, normalmente es suficiente una unica fraccion de marcado en cada molecula de sustrato. De hecho, algunas moleculas de sustrato pequenas pueden contener un unico grupo que es valido para el marcado con una fraccion de marcado. Para el uso en ensayos con enzimas que solamente escinden o descomponen secuencias de aminoacidos particulares, es preferible que la fraccion de marcado este situada relativamente cerca del sitio de escision de manera que el entorno inmediato del marcador se vea afectado por la escision y sus propiedades electroqmmicas observables tambien se vean afectadas. Los peptidos cortos sinteticos marcados y los aminoacidos simples marcados pueden ser los tipos de sustrato preferidos para ciertos ensayos de enzimas proteasas, especialmente ensayos de enzimas como aminopeptidasas y endopeptidasas. En general, se prefiere el uso de grandes protemas marcadas, como la BSA o la casema, en ensayos sobre la actividad proteasa general. Esto es asf porque, habitualmente, las protemas grandes contienen diversos sitios de escision, incluyendo al menos algunos que pueden ser reconocidos por muchas de las enzimas proteasas presentes en la muestra analizada.

En determinadas circunstancias se prefiere el uso de peptidos cortos porque permite la smtesis de sustratos que solo contienen las secuencias de reconocimiento espedficas para la proteasa espedfica o la clase de proteasas examinadas. Por ejemplo, un sustrato que incorpore un peptido corto con una secuencia Ala-Ala-Phe o Ala-Ala-Pro- Phe y, preferiblemente, muy pocas o ninguna secuencia mas, puede usarse en un ensayo espedfico sobre la actividad de la quimotripsina. En otro ejemplo adicional, la leucina aminopeptidasa (LAP) es una enzima proteolftica que es una exopeptidasa que hidroliza los enlaces peptfdicos adyacentes a un grupo amino libre. Muestra la especificidad para los enlaces peptfdicos cerca de los residuos de leucina. Se observan niveles elevados de LAP en suero y orina en diversas condiciones clmicas, incluyendo colestasis, cirrosis hepatica, necrosis hepatica, tumores hepaticos, cancer de mama, cancer de endometrio, cancer de ovarios, lupus eritematoso sistemico y tumores de celulas germinales de ovarios y testmulos. Un sustrato que comprende un peptido corto que contiene residuos de alanina en el extremo N-terminal o un sustrato que comprende un aminoacido de alanina marcado, por ejemplo, el sustrato que se muestra en la formula Ilia, pueden usarse para analizar muestras de suero u orina en busca de niveles elevados de LAP con el objetivo de ayudar en el diagnostico de una de las enfermedades enumeradas previamente.

Otras enfermedades clmicas asociadas con niveles en suero elevados de proteasas espedficas incluyen el cancer de prostata asociado con niveles en suero elevados de proteasa glandular kallikrema-2 (ver Nam et al., J. Clin. Oncol., (2000) 18(5):1036-42) y el cancer de prostata y de mama asociados con niveles elevados de antfgeno espedfico de la prostata (PSA), una enzima serina (Black et al., Clin. Cancer. Res., (2000) 6(2):467-73).

Los sustratos 'in vivo’ de muchas proteasas son protemas que comprenden varios cientos de residuos de aminoacidos. Asf, el uso de un analogo de sustrato que es un peptido de longitud completa (es decir, su longitud es igual o similar a la del sustrato de la que es analogo) puede ser util en algunas circunstancias. Por ejemplo, puede esperarse que un analogo cuya longitud es similar a la de un sustrato que existe de forma natural, y del que es analogo, tenga caractensticas (como la estabilidad y las caractensticas conformacionales) que son mas similares a las del sustrato natural de lo que sedan las de un analogo mucho mas corto y, por lo tanto, pueden imitar o replicar el comportamiento del sustrato natural.

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Sin embargo, en muchas circunstancias no es esencial utilizar una protema de longitud completa. De acuerdo con la invencion, el peptido comprende al menos 5 y, preferiblemente, al menos 20 residuos de aminoacidos. Por ejemplo, el peptido puede comprender entre 20 y 100 residuos de aminoacidos; mas preferiblemente, el peptido comprende entre 20 y 50 residuos de aminoacidos. Tambien se desvelan metodos en los que el sustrato comprende una sola molecula de aminoacido. De acuerdo con otra realizacion de la invencion, el sustrato comprende un peptido que tiene poco o nada mas que la secuencia de reconocimiento de proteasa. A menudo, estas secuencias de reconocimiento tienen una longitud de entre 2 y 6 residuos de aminoacidos y, mas preferiblemente, tienen una longitud de 3 aminoacidos. En la practica, la longitud del peptido se selecciona de tal manera que haya al menos un sitio de escision para la enzima o enzimas de interes. Preferiblemente, el peptido tiene un sitio de escision diferente para la enzima o enzimas de interes. Por ejemplo, la proteasa Factor Xa requiere de la presencia de la secuencia de reconocimiento Ile-Glu-Gly-Arg en su sustrato. Los peptidos que tienen mas de un sitio de escision pueden ser utiles, por ejemplo, cuando el sustrato se va a utilizar en un analisis de actividad general de la proteasa.

El metodo de la invencion puede usarse para obtener una medida cualitativa de la actividad proteasa en una muestra desconocida. La cantidad de actividad proteasa puede cuantificarse, por ejemplo, usando una curva de calibracion obtenida con soluciones estandares. Si se conoce la identidad de la proteasa presente en una muestra, se puede calcular la concentracion de la proteasa.

Tambien se desvela un kit de ensayo de proteasa que comprende un sustrato de proteasa marcado con un marcador electroqmmicamente activo. Dicho kit tambien puede comprender otros reactivos, por ejemplo, las soluciones adecuadas. El kit tambien puede incluir las instrucciones para realizar una determinacion de proteasa.

Tambien se desvelan peptidos o protemas marcados y electroqmmicamente activos. La divulgacion proporciona compuestos de la formula IV,

M c-NR ’ -C(=0 )-X- (Ar)n- (L)m-R iv

en la que

- Mc es un grupo metalocenilo en el que cada anillo puede estar -de manera independiente- sustituido o no sustituido,

- el grupo metalocenilo comprende un ion metalico M seleccionado de un grupo que se compone de hierro, cromo, cobalto, osmio, rutenio, mquel y titanio,

- R’ es H o un alquilo inferior,

-X es NR’ u O,

- Ar es un grupo arilo sustituido o no sustituido,

- n es 0 o 1,

- L es un grupo enlazador,

- m es 0 o 1,

- R es un residuo de protema, peptido o aminoacido.

La divulgacion proporciona un compuesto que comprende un grupo metalocenilo unido a un grupo carboxilo de un residuo de aminoacido, peptido o protema. El grupo carboxilo puede ser un grupo carboxilo de un terminal o una cadena lateral.

Preferiblemente, el compuesto tiene la formula V,

Mc-(CH2)b-X-R V

en la que

- Mc es un grupo metalocenilo en el que cada anillo puede estar -de manera independiente- sustituido o no sustituido,

- el grupo metalocenilo comprende un ion metalico M seleccionado de un grupo que se compone de hierro, cromo, cobalto, osmio, rutenio, mquel y titanio,

- n es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12,

- X es NR’- u O, y

- R’ es H o un alquilo inferior.

- R es un residuo de protema, peptido o aminoacido.

Los grupos de metaloceno (por ejemplo, ferroceno), incluyendo grupos de Mc de acuerdo con la formula IV o la formula V, pueden sustituirse por uno o mas grupos seleccionados de alquilos inferiores (por ejemplo, de alquilo C1 a C4); alquilos inferiores sustituidos con un hidroxi, halo, ciano, oxo, amino, ester o amido, o un grupo metaloceno adicional; arilos; o arilos sustituidos con un hidroxi, halo, ciano, oxo, amino, ester o amido, o un grupo metaloceno adicional. Si esta presente, el grupo metaloceno adicional puede sustituirse del mismo modo que el grupo Mc, con la excepcion de que el numero total de grupos de Mc en la molecula preferiblemente no pase de cuatro. Preferiblemente, el grupo Mc no esta sustituido.

Preferiblemente, M es un ion seleccionado de un grupo formado por hierro, osmio y rutenio. Mas

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preferiblemente, M es un ion de hierro. Cuando M es un ion de hierro, Mc es un ferroceno.

Preferiblemente, el alquilo inferior es un alquilo C1 a C4. Preferiblemente, R' es H. Cada R' tiene una identidad separada del otro R'.

Preferiblemente, X es NH.

Preferiblemente, el grupo Ar en la formula IV tiene al menos 5 y, por ejemplo, entre 5 y 10 anillos de atomos de carbono, de manera que se prefiere el C6-arilo. El grupo Ar puede sustituirse con uno o mas grupos seleccionados de alquilos inferiores (por ejemplo, de alquilo C1 a C4); alquilos inferiores sustituidos con un grupo hidroxi, halo, ciano, oxo, amino, ester o amido; alquenilos inferiores; alquenilos inferiores sustituidos con un grupo hidroxi, halo, ciano, oxo, amino, ester o amido; arilos; y arilos sustituidos con un grupo hidroxi, halo, ciano, oxo, amino, ester o amido. Preferiblemente, el grupo Ar no esta sustituido. Por ejemplo, Ar puede ser fenileno.

Preferiblemente, n=1. Preferiblemente, m=1 en la formula IV. En una realizacion preferida del compuesto de la formula IV, n=1 y m=1.

Se desvelan otros grupos enlazadores aptos para su uso en el compuesto de la formula IV (que se muestran en la formula IV como 'L'), incluyendo cualquier fraccion que es adecuada para enlazar un grupo amino de una protema con un grupo Ar o X adyacente, respectivamente, de manera que la seleccion de dichos grupos no supondna mas que un trabajo rutinario para las personas versadas en la materia. A modo de ejemplo, el grupo enlazador L puede ser una cadena alifatica que puede ser lineal o ramificada, y saturada o no saturada. De forma ventajosa, la fraccion enlazadora es una cadena alifatica lineal o ramificada que tiene entre 1 y 20 atomos de carbono, preferiblemente al menos 4 atomos de carbono, y, mas preferiblemente, entre 6 y 16, y especialmente entre 8 y 14 atomos de carbono, mas especialmente 12 atomos de carbono. La fraccion enlazadora puede ser una cadena de alquileno que puede sustituirse con cualquier sustituyente o puede interrumpirse por medio de cualquier atomo o fraccion siempre y cuando dicho sustituyente, atomo o fraccion no reduzca sustancialmente la sensibilidad electroqmmica del marcador.

Las realizaciones espedficas preferidas son aquellos compuestos que se ilustran en las formulas IIa, IIIa y IIIb.

Preferiblemente, R es una protema o peptido con una longitud de entre 2 y 1000 residuos de aminoacidos. Por ejemplo, R puede ser un peptido con una longitud de 3 residuos de aminoacidos o un peptido con una longitud de entre 2 y 40 aminoacidos o un peptido con una longitud de entre 40 y 1000 aminoacidos. En una realizacion alternativa preferida, R es un aminoacido. Preferiblemente, R es una protema que es un sustrato para una enzima proteasa. En una realizacion preferida, R es BSA o casema. Otros sustratos de proteasa adecuados pueden incluir gelatina, elastina, colageno y ovoalbumina, cuyas formas marcadas fluorescentemente estan disponibles a traves de Molecular Probes, Inc.

De forma alternativa, R puede ser un aminoacido que existe de manera natural o un aminoacido artificial.

En una clase de sustrato marcado, la fraccion de marcado esta unida a un grupo amino que esta contenido en una cadena lateral colgante de una protema, y, preferiblemente, se encuentra en el terminal amino libre de dicha cadena lateral colgante. Esta cadena lateral puede ser una cadena lateral que forma parte de un aminoacido que existe de forma natural. Asf, en la formula IIa de mas arriba, la cadena de NH-(CH2)4 se deriva de la cadena de NH2(CH2)4, que se encuentra presente de forma inherente en la lisina. Sin embargo, debe entenderse que, si se desea, puede introducirse sinteticamente una cadena lateral colgante adecuada en cualquier parte deseada de la protema.

En otra clase de sustrato marcado, la fraccion de marcado esta unida a un grupo carboxilo que esta contenido en la cadena lateral colgante de una protema y, preferiblemente, esta en el terminal carboxilo libre de esta cadena lateral colgante. Esta cadena lateral puede ser una cadena lateral que forma parte de un aminoacido que existe de forma natural. Sin embargo, debe entenderse que, si se desea, puede introducirse sinteticamente una cadena lateral colgante de sustrato en cualquier parte deseada de la protema.

En una clase preferida de protemas marcadas, ilustrada en la formula IIa mostrada previamente:

Mc es ferrocenilo, R' es H, X es -NH-, Ar es fenileno, L es carbonilo y n=m=1, y R representa una protema en la que la fraccion de marcado esta unida al esqueleto o estructura central de la protema mediante una cadena lateral colgante de un residuo de lisina.

En otra clase de sustrato marcado, la fraccion de marcado puede estar unida mediante el grupo amino terminal de una protema o aminoacido y, en ese caso, normalmente sera preferible que L tenga un mmimo de cuatro

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atomos de carbono, de manera que comprenda preferiblemente un grupo carbonilo que en la protema marcada se combina con el grupo amina terminal de la protema para formar una fraccion de carboxamida.

En otra clase de sustrato marcado, la fraccion de marcado puede estar unida mediante el grupo carboxilo terminal de una protema o aminoacido.

En una clase adicional de protema marcada, la fraccion de marcado esta unida mediante una cadena lateral colgante que se ha unido sinteticamente al esqueleto de la protema y, en ese caso, normalmente L comprendera una cadena con un mmimo de cuatro atomos de carbono, de manera que un extremo de dicha cadena tendra -o estara interrumpido por- una fraccion de carboxamida.

El compuesto de la divulgacion puede comprender mas de un grupo metaloceno. Normalmente, varios grupos de metaloceno estan unidos a la misma molecula proteica o peptfdica. Por ejemplo, en el caso de la BSA, puede haber entre 10 y 20 grupos de metaloceno por cada molecula de BSA. El grupo metaloceno puede estar sustituido por cualquier otro grupo marcador (o grupo de marcado) electroqmmicamente activo. El compuesto puede ser un compuesto que es electroqmmicamente activo o que se hace electroqmmicamente activo despues de una escision parcial.

Sin embargo, si el sustrato marcado es relativamente pequeno, por ejemplo, si contiene un aminoacido simple o un peptido corto, por ejemplo, un tripeptido, puede que no sea necesario o factible que el sustrato comprenda multiples fracciones de marcado.

Los compuestos se pueden preparar mediante la reaccion de un compuesto metaloceno que comprenda un grupo funcional adecuado con una protema, peptido o aminoacido.

Por ejemplo, se puede usar un ester de N-hidroxisuccinimida de un derivado (tambien llamado ’derivativo’ o ’derivatizado’) de metaloceno. Los detalles sobre como usar un compuesto asf para marcar un peptido se proporcionan en los Ejemplos 2, 3 y 4a. Los esteres de N-hidroxisuccinimida son adecuados para unir un marcador a las cadenas laterales de lisina. De forma alternativa, se puede usar una metaloceno metilamina, por ejemplo, una ferroceno metilamina. Los detalles sobre como usar un compuesto asf para marcar un aminoacido y un peptido se proporcionan en los Ejemplos 4b y 4c. Sin embargo, para las personas versadas en la materia resultara evidente que se pueden unir a un peptido marcadores similares en cualquier cadena lateral adecuada mediante el uso de un grupo funcional de marcado apropiado.

Los compuestos de la divulgacion son particularmente utiles en los metodos con arreglo a la invencion. Con las condiciones que se establecen en la tabla 1, los acidos carboxflicos de ferroceno sustituidos tienen un potencial de electrodo de alrededor de 400 mV. Por otra parte, los compuestos de metaloceno sustituidos de acuerdo con la divulgacion tienen un potencial de electrodo de alrededor de 150 mV. El potencial mas bajo es un potencial en el que la propension de las impurezas de fondo para interferir con los datos recogidos es mucho menor. Asf, los compuestos de la divulgacion permiten obtener lecturas mas precisas. En la figura 12, se muestran voltamogramas de la digestion de una molecula de BSA marcada con 4-(3’-ferrocenilurefdo)-1-benzono; en la figura 3, se muestran los voltamogramas de la digestion de una molecula de BSA marcada con ferrocenilo en las mismas condiciones de reaccion. Tal y como se puede observar mediante una comparacion entre las figuras 12(c) y 3(c), el pico del derivativo de 4-(3’-ferrocenilurefdo)-1-benzoflo con una fraccion de ferroceno, tal y como se halla en las moleculas de la invencion, se produce a alrededor de 100 mV, mientras que el pico del derivativo de ferrocenilo se produce a alrededor de 400 mV.

La invencion tambien proporciona metodos para diagnosticar o monitorizar una enfermedad en un sujeto, lo que incluye utilizar un metodo de la invencion para detectar una proteasa o un inhibidor de proteasas, asociados con dicha enfermedad, en un tejido o fluido corporal del sujeto.

Ademas, la invencion proporciona el uso de un metodo de la invencion para detectar una enfermedad en un

sujeto.

Los ejemplos de enfermedades que estan asociadas con la presencia de una proteasa o un inhibidor de proteasas en un tejido del sujeto incluyen la predisposicion hereditaria a un tromboembolismo causado por deficiencias de la antitrombina III en el suero sangumeo. Los niveles elevados de catepsina en el suero o la matriz extracelular pueden ser indicativos del Alzheimer, el cancer o la artritis. Preferiblemente, el tejido o fluido corporal del sujeto es suero, plasma, saliva u orina, o cualquier otro tejido o fluido corporal del que se pueda obtener una muestra de forma conveniente y segura.

La invencion tambien proporciona metodos para detectar un patogeno u otro organismo no deseado -por ejemplo, un organismo procedente de los desechos de los alimentos-, lo que conlleva un metodo de la invencion para detectar en una muestra una proteasa o un inhibidor de proteasas asociados con el mencionado patogeno u organismo no deseado. Ademas, la invencion proporciona el uso de un metodo de la invencion para detectar un patogeno u otro organismo no deseado en una muestra. Por ejemplo, Cochliobolus heterostrophus es un patogeno

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de las manchas de las hojas de mafz que puede diagnosticarse en una planta mediante la deteccion de proteasas espedficas en una muestra de hojas de mafz infectadas. Hay muchos otros patogenos que se asocian con proteasas espedficas, por ejemplo, Alp, la proteasa de serina en el fluido pulmonar de los humanos infectado con Aspergillus fumigatus y, PT, la proteasa de HlV-1 en los leucocitos humanos infectados con HIV-1.

La divulgacion tambien proporciona metodos para rastrear inhibidores de proteasa. Estos metodos pueden usarse para rastrear potenciales inhibidores de proteasa con el objetivo de identificar nuevos compuestos de interes clmico.

La divulgacion tambien proporciona equipos o sistemas preparados para desarrollar uno o mas de los metodos desvelados en el presente texto. Dichos equipos pueden incluir electrodos, celdas electroqmmicas y artfculos de plastico adecuados, y equipos para detectar, registrar, manejar y mostrar o visualizar los resultados. Tambien puede incluirse un termostato y/o dispositivo de calentamiento.

La divulgacion proporciona un equipo que contiene una o mas partes receptoras para alojar o recibir una o mas muestras, medios para controlar la temperatura de las mencionadas partes receptoras de muestras y medios para medir las propiedades electroqmmicas de las mencionadas muestras. El mencionado equipo puede fabricarse de modo que utilice celdas de electrodos convencionales (por ejemplo, las que se utilizan en los ejemplos incluidos en el presente texto).

Ademas, la presente divulgacion proporciona un recipiente que contiene una o mas partes receptoras para muestras y que sirve para contener una o mas muestras. Dicho recipiente puede estar basado en el diseno de los tubos de polipropileno o de las placas de 96 pocillos, tal y como se utilizan actualmente en muchas aplicaciones de biologfa molecular. Idealmente, el mencionado recipiente estara adaptado para alojar al menos un componente del electrodo. Por ejemplo, el componente del electrodo puede formar parte de la cubierta del recipiente, de manera que cuando se usa para cerrar el recipiente, el/los componente(s) del electrodo llega(n) a la solucion de la muestra. Normalmente, se considera que las celdas electroqmmicas convencionales no son desechables debido a su coste relativamente alto. El uso de artfculos de plastico desechables se ha convertido en una practica estandar en biologfa molecular, ya que reduce el riesgo de contaminar las muestras.

Ahora se describiran en detalle algunas realizaciones ilustrativas de la invencion haciendo referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 (Fig. 1) es una representacion esquematica de una celda electroqmmica utilizada en las mediciones de voltametna de pulso diferencial que se describen en el presente texto;

La Figura 2 es un conjunto de espectros UV-visibles superpuestos de los conjugados y mezclas de ferroceno y BSA;

Las Figuras 3a, 3b y 3c son voltamogramas de pulso diferencial de productos de tripsina para la digestion de Fc-BSA, tal y como se describe en el Ejemplo 5A;

Las Figuras 4a, 4b y 4c son voltamogramas de pulso diferencial de productos de a-quimotripsina para la digestion de Fc-BSA, tal y como se describe en el Ejemplo 5B;

Las Figuras 5a, 5b y 5c son voltamogramas de pulso diferencial de productos de elastasa para la digestion de Fc-BSA, tal y como se describe en el Ejemplo 5C;

Las Figuras 6a, 6b y 6c son voltamogramas de pulso diferencial de productos de pepsina para la digestion de Fc-BSA, tal y como se describe en el Ejemplo 5D;

Las Figuras 7a, 7b y 7c son voltamogramas de pulso diferencial de productos de Fc-BSA para la digestion de carboxipeptidasa, tal y como se describe en el Ejemplo 5E;

Las Figuras 8a, 8b y 8c son voltamogramas de pulso diferencial de productos de termolisina para la digestion de Fc-BSA (a 37° C), tal y como se describe en el Ejemplo 5F;

Las Figuras 9a, 9b y 9c son voltamogramas de pulso diferencial de productos de termolisina para la digestion de Fc-BSA (a 70° C), tal y como se describe en el Ejemplo 5G;

Las Figuras 10a y 10b son voltamogramas de pulso diferencial de productos de tripsina para la digestion de BSA sin marcar, tal y como se describe en el Ejemplo 5H;

Las Figuras 11a, 11b y 11c son voltamogramas de pulso diferencial de productos de tripsina para la digestion de FcU-BSA, tal y como se describe en el Ejemplo 5I;

Las Figuras 12a, 12b y 12c son voltamogramas de pulso diferencial de productos de papama para la digestion de FcU-BSA, tal y como se describe en el Ejemplo 5J;

Las Figuras 13a, 13b y 13c son voltamogramas de pulso diferencial de productos de tripsina para la digestion de FcU-casema, tal y como se describe en el Ejemplo 5K;

La Figura 14 muestra voltamogramas de pulso diferencial superpuestos de productos de tripsina para la digestion de Fc-BSA realizados con diversas concentraciones enzimaticas, tal y como se describe en el Ejemplo 6;

La Figura 15 muestra voltamogramas de pulso diferencial superpuestos de productos de tripsina para la digestion de Fc-BSA realizados con diversos tiempos de incubacion, tal y como se describe en el Ejemplo 7;

La Figura 16 muestra voltamogramas de pulso diferencial superpuestos de productos de tripsina para la digestion de Fc-BSA realizados con diversas concentraciones de los inhibidores de proteasa presentes, tal y

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como se describe en el Ejemplo 8;

La Figura 17 muestra las trazas o huellas amperometricas superpuestas de la digestion de Fc-BSA por medio de la tripsina durante un periodo de tiempo;

La Figura 18 muestra las senales amperometricas superpuestas de la digestion de FcU-BSA por medio de la papama durante un periodo de tiempo;

La Figura 19a muestra las trazas superpuestas de los voltamogramas de pulso diferencial de la alanina marcada con ferroceno (Fc-Ala), antes y despues de la digestion con aminopeptidasa, tal y como se describe en el Ejemplo 10;

La Figura 19b muestra los valores de referencia de la Figura 19a corregidos;

La Figura 20a muestra las trazas superpuestas de los voltamogramas de pulso diferencial del peptido de trialanina marcado con ferroceno (Ac-Ala-Ala-Ala-Fc), antes y despues de la digestion con elastasa, tal y como se describe en el Ejemplo 11;

La Figura 20b muestra los valores de referencia de la Figura 20a corregidos.

En referencia a la Figura 1 (Fig. 1), una celda electroqmmica 1 adecuada para usarse en los experimentos de voltametna dclica descritos en el presente texto comprende un recipiente 2, que contiene una solucion de electrolitos de fondo 3, que es una solucion acuosa de 100 mM de cloruro de sodio. En la solucion 3 hay una camara 4 inmersa en la que se localiza la muestra que se va a analizar e, inmersa en ella, hay un electrodo de trabajo 5 - vftreo y de carbono-. De manera alternativa, puede usarse un electrodo de oro. Tambien inmerso en la solucion 3, hay un contraelectrodo 6 de alambre de platino y un electrodo de referencia 7 de plata/cloruro de plata inmerso en una solucion de 4M de cloruro de potasio, de manera que las soluciones se comunican entre sf mediante un disco sinterizado.

Los ejemplos que se ofrecen a continuacion ilustran la invencion:

MATERIALES Y METODOS - Preparaciones y ensayos de BSA ferrocenilada

Se adquirio albumina de suero bovino (o BSA) (polvo liofilizado, aproximadamente 99%), casema (leche bovina, polvo purificado), tripsina de pancreas porcino (1120 unidades de BAEE/mg de solido), a-quimotripsina de pancreas bovino de tipo II (51 unidades/mg de solido), pepsina de mucosa estomacal porcina (632 unidades/mg de solido), termolisina de Bacillus termoproteoliticus rokko (44 unidades/mg de solido), proteinasa K de Tritirachium album (33 unidades/mg de solido), papama de latex de papaya (14 unidades/mg de protema, 99%), inhibidor de tripsina de soja de tipo I-S, aminopeptidasa (entre 50 y 150 unidades/mg de protema) y elastasa (>= 50 unidades/mg de protema) por medio de Sigma.

Se adquirio acido carboxflico de ferroceno por medio de Aldrich Chemical Co.

Se adquirio bicarbonato de potasio (reactivo A.C.S.), carbonato de potasio (un mmimo de 99%) y dimetilsulfoxido (reactivo A.C.S., un mmimo de 99,9%) por medio de Sigma.

Se adquirieron columnas de NAP-10 (Grado de ADN, Sephadex, G-25) por medio de Amersham Biosciences. Se adquirio Trizma hidrocloruro (+99%), Trizma base (+99%), cloruro de sodio (SigmaUltra, mmimo de 99,5%), acetato de sodio (grado de biologfa molecular), sal tetrasodica de acido etilendiaminotetraacetico (SigmaUltra, mmimo de 99,0%), hidroxido de sodio (SigmaUltra, mmimo de 98%), hidrocloruro de DL-cistema (mmimo de 98%), acido hidroclorico y agua de grado de biologfa molecular por medio de Sigma. Se adquirio persulfato de amonio (reactivo para electroforesis) de Ponceau S (grado practico), N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina (TEMED), acrilamida/bis- acrilamida (37,5:1), 30% de solucion y gel reactivo de tincion azul EZ por medio de Sigma. Se adquirio acido acetico (glacial, +99,99%) por medio de Aldrich y se adquirio isopropanol por medio de Hayman. Se adquirio membrana de biodina C por medio de Pall Life Sciences.

Las incubaciones se realizaron utilizando un controlador termico programable PTC-100 (MJ Research Inc.).

Todas las soluciones se prepararon con agua desionizada y esterilizada en autoclave (sistema WaterPro, Labconco).

MATERIALES Y METODOS - Deteccion electroqmmica

Los siguientes artmulos se adquirieron por medio de BAS, Congleton, Cheshire, Reino Unido:

Electrodo de trabajo, vftreo y de carbono (numero de catalogo MF-2012)

Electrodo de referencia de plata/cloruro de plata (numero de catalogo MF-2079)

Contraelectrodo (o electrodo auxiliar) de alambre de platino (numero de catalogo MW-4130)

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Celda de bajo volumen (numero de catalogo MF-2040) que contiene un vial de voltametiia de vidrio y una camara de muestras de vidrio, con punta de Vycor reemplazable.

La estacion de trabajo electroqmmica de AutoLab (PGSTAT 30 con analizador de respuesta de frecuencia o pAutoLab de tipo II) se adquirio por medio de Windsor Scientific, Slough, Berkshire, Reino Unido.

EJEMPLO 1 -Voltametna ciclica

Este ejemplo describe el metodo de voltametna cfclica utilizado en los Ejemplos 5 a 11 de mas adelante.

La celda de bajo volumen de la Figura 1 se lleno con aproximadamente 10 ml de solucion de cloruro de sodio (100 mM). Una ahcuota de 200 pl de la muestra para analizar se coloco en la camara para muestras de cristal, que despues se coloco en la celda de bajo volumen junto con el electrodo de referencia y el contraelectrodo. Los electrodos se conectaron a la estacion de trabajo electroqmmica de AutoLab y se realizo una voltametna de pulso diferencial usando los parametros que se describen en la Tabla 1. Previamente al analisis, el electrodo de trabajo vftreo y de carbono se pulio (utilizando un kit de pulido de BAS, numero de catalogo MF-2060) y posteriormente se acondiciono. El acondicionamiento del electrodo incluye una voltametna dclica, alternando entre ±1 voltios con el ’buffer’ de fondo apropiado.

Tabla 1. Parametros de la voltametna de pulso diferencial

Parametro

Barrido anodico

Potencial de acondicionamiento (V)

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Duracion del acondicionamiento (s)

10

Potencial de deposicion (V)

0

Duracion de la deposicion (s)

0

Tiempo de estabilizacion (s)

0

Tiempo de modulacion (s)

0,04

Tiempo de intervalo (s)

0,1

Potencial inicial (V)

-0,1

Potencial final (V)

0,7

Potencial de paso (V)

0,003

Amplitud de modulacion (V)

0,05

EJEMPLO 2 - Sintesis de ester de N-hidroxisuccinimida de acido ferrocenocarboxilico

El acido ferrocenocarboxilico (303 mg, 1,32 mmol) y la N-hidroxisuccinimida (170 mg, 1,47 mmol) se disolvieron en dioxano (15 ml) y se anadieron, removiendo, a una solucion de diciclohexilcarbodiimida (305 mg, 1,48 mmol) en dioxano (3 ml). La mezcla se removio a temperatura ambiente durante 24 horas, y durante ese periodo de tiempo se formo un precipitado. El precipitado se extrajo mediante filtracion, el solvente se extrajo del filtrado en vacfo (’in vacuo’) y el solido resultante se depuro mediante cromatograffa de columna con gel de sflice, eluyendo con gasolina:acetato de etilo (8:2). Rendimiento: 320 mg, 74%.

EJEMPLO 3a - Sintesis de azida de ferroceno carbonilo

La azida de ferroceno carbonilo se preparo a partir de acido ferrocenocarboxilico mediante reaccion con cloruro de

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oxalilo y azida de sodio.

EJEMPLO 3b - Sintesis de acido 4-(3'-ferrocenilureido)-1-benzoico

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Un matraz de fondo redondo purgado se lleno con azida de ferroceno carbonilo (300 mg, 1,18 mmol, equiv. de 1,00), acido 4-aminobenzoico (244 mg, 1,78 mmol, equiv. de 1,50) y 1,4-dioxano (40 ml) bajo nitrogeno. La mezcla de reaccion se removio bajo nitrogeno en un bano de 100° C durante 2 h 50 min. y, posteriormente, se dejo que se enfriara a temperatura ambiente. Se anadieron 2M de HCl (100 ml) a la mezcla de reaccion y el producto se extrajo y se anadio a acetato de etilo (150 ml). Esta fase se lavo con 2M de HCl (100 ml), se seco con sulfato de sodio y se concentro en vado para obtener el producto. Un secado adicional en un horno de vado produjo cristales naranjas (413 mg, 96%). 1H-NMR 6 (300 MHz, d6-DMSO) 3,96 (2H, b, Hc), 4,14 (5H, s, Ha), 4,53 (2H, b, Hb), 7,54 (2H, m, Hf), 7,85 (2H, m, Hg), 7,98 (1H, s, Hd), 8,87 (1H, s, He), 12,57 (1H, s, Hh), donde la posicion de cada hidrogeno es tal y como se muestra en la formula Va. 13C-NMR 6 (75,5 MHz, d6-DMSO) 61,0 64,1 66,7 68,1 (Ca,d), 117,2 (Cg), 123,5 (Cj), 130,9 (Ch), 144,6 (Cf), 152,8 (Ce), donde la posicion de cada carbono es tal y como se muestra en la formula Vlb.

EJEMPLO 3c - Sintesis de ester de N-hidroxisuccinimida de acido 4-(3'-ferrocenilureido)-1-benzoico

Se disolvio diciclohexilcarbodiimida (DCC) (194 mg, 0,939 mmol, equiv. de 1,14) en 1,4-dioxano anhidro (2 ml) y se anadio a un matraz de fondo redondo purgado, bajo nitrogeno. Se anadio N-hidroxisuccinimida (108 mg, 0,939 mmol, equiv. de 1,14). Se disolvio acido 4-(3’-ferrocenilurefdo)-1-benzoico (300 mg, 0,823 mmol, equiv. de 1,0) en

l, 4-dioxano anhidro (13 ml) y se anadio al matraz gota a gota. La solucion se removio a temperatura ambiente durante 23 horas. Se extrajo una pequena cantidad de un solido marron claro de la mezcla de reaccion roja/naranja mediante filtracion Buchner. Se anadieron agua (100 ml) y acetato de etilo (50) a la mezcla de reaccion. Se separo la fase de acetato de etilo y la parte acuosa se extrajo con acetato de etilo (100 ml). Se combinaron las fases de acetato de etilo, se secaron con sulfato de sodio y se concentraron en vado para obtener el producto crudo en forma de aceite naranja, que se purifico utilizando cromatograffa flash de silice con un sistema de gradiente desde acetato de etilo 60/eter de petroleo (punto de ebullicion: 40-60° C) hasta acetato de etilo. El secado en un horno de vado produjo ester de N-hidroxisuccinimida de acido 4-(3’-ferrocenilurefdo)-1-benzoico en forma de finos cristales naranjas (237 mg, 66%). Rf (acetato de etilo/eter de petroleo a 5:1) (punto de ebullicion: 40-60° C) = 0,41 1H-NMR 6 (300 MHz, d6-DMSO) 2,88 (4H, s, Hh), 3,98 (2H, t, j = 1,8 Hz, Hc), 4,16 (5H, s, Ha), 4,55 (2H, t, j = 1,8 Hz, Hb), 7,68 (2H,

m, Hf), 8,00 (2H, m, Hg), 8,11 (1H, s, Hd), 9,16 (1H, s, He). 13C-NMR 6 (75,5 MHz, d6-DMSO) 25,9 (Cl), 61,1 64,2 (Cb y Cc), 69,1 (Ca), 117,7 (Cg), 131,9 (Ch), 170,9 (Ck). Espectrometna de masas (FAB(bombardeo rapido de atomos)+ m/z) 462,07 [M+H].

EJEMPLO 4a - Sintesis de proteinas ferroceniladas

En el presente texto se sigue la siguiente nomenclatura:

- Fc = grupo metanoflo de ferroceno, de manera que Fc-OH es acido carboxflico de ferroceno y Fc-NHR es un compuesto de metilamida de ferroceno.

- FcU = grupo 4-(3’-ferrocenilurefdo)-1-benzoflo, de manera que FcU-OH es acido 4-(3’-ferrocenilurefdo)-1-benzoico y FcU-NHR es un compuesto de 4-(3’-ferrocenilurefdo)-1-benzamida.

- BSA = albumina de suero bovino

Se utilizo el mismo procedimiento general para la sintesis de todas las proteinas marcadas con ferroceno. La sintesis de Fc-BSA se describe a modo de ejemplo.

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La BSA liofilizada se puso de nuevo en suspension (o se resuspendio) con el volumen correcto de solucion amortiguadora de K2CO3/KHCO3 (200 mM, pH 8.5) para obtener una concentracion de BSA de 10 mgml-1. La solucion de BSA (100 pl, 10 mgmK1) se anadio lentamente -mezclando en vortex- a una solucion de ester de N- hidroxisuccinimida de acido ferrocenocarboxflico en DMSO (100 pl, 375 nM). La solucion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas, despues se diluyo con tris HCl (800 pl, 100 mM, pH 7.8) y se purifico usando dos columnas de NAP 10 (siguiendo el protocolo suministrado), eluyendo primero con tris HCl (800 pl, 100 mM, pH 7.8) y despues con agua desionizada.

La concentracion de BSA se determino por ’blotting’ en Biodina C utilizando concentraciones estandares de BSA y una tincion con Ponceau S. Usando el metodo, se descubrio que las concentraciones de BSA eran de 0,3-0,6 mgml- 1. La presencia del marcador de ferroceno se confirmo mediante analisis voltametrico.

Las protemas marcadas con FcU se prepararon de forma analoga.

El numero promedio de grupos de ferroceno presentes en cada molecula de BSA marcada se analizo mediante espectroscopia ultravioleta-visible. El espectro UV-visible del conjugado de Fc-BSA obtenido mediante el procedimiento descrito previamente se comparo con los espectros de las mezclas de Fc/BSA en diversos ratios. Los espectros superpuestos se muestran en la Figura 2, en la que la lmea A es el espectro de la muestra; la lmea B es del acido de BSA:Fc-OH a 20:1; la lmea C es de la BSA sola; la lmea D es del Fc-OH solo y la lmea E es del BSA:Fc-OH a 10:1. Tomando en cuenta estos datos, se estima que el numero de moleculas de ferroceno presentes por cada molecula de BSA es de entre 10 y 20.

EJEMPLO 4b - Smtesis de alanina ferrocenilada (Fc-Ala, formula Ilia)

Dos equivalentes de EDCL (1-[3-(Dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida clorhidrato) se anadieron -removiendo vigorosamente- a una suspension de ferroceno metilamina y Boc-Ala-OH (N-Boc-alanina) con 2,1 equivalentes de DMAP (4-(N.N-dimetilamino)piridina) en DCM (diclorometano) seco bajo N2. La reaccion se removio durante la noche. Despues, la reaccion se diluyo con DCM y se vertio en 1N de HCL. Las capas se separaron y la capa organica se seco con MgSO4, se filtro y se extrajo el solvente.

EJEMPLO 4c - Sintesis de peptido de trialanina ferrocenilado (Fc-Ala-Ala-Ala, formula lllb)

El Ac-Ala-Ala-Ala-OH se adquirio por medio de Sigma-Aldrich.

Dos equivalentes de EDCL (1-[3-(Dimetilamino)propil]-3-etilcarbodiimida clorhidrato) se anadieron -removiendo vigorosamente- a una suspension de ferroceno metilamina y Ac-Ala-Ala-Ala-OH (trialanina con acetilacion del grupo amino termimnal) con 2,1 equivalentes de DMAP (4-(N.N-dimetilformamida) bajo N2. La reaccion se removio durante la noche. Despues se anadio metanol y el producto se precipito usando CHCb y se obtuvo mediante centrifugado, decantando el sobrenadante y lavando con mas CHCb. No se realizo ninguna ninguna desproteccion del grupo amino terminal acetilado.

EJEMPLO 5 - Ensayos de proteasa

A menos que se indique lo contrario, los ensayos de proteasa se realizaron tal y como se explica a continuacion. Las enzimas liofilizadas se resuspendieron para obtener una concentracion de 10 mgml'1. Las enzimas se resuspendieron en las siguientes soluciones: HCl (1 mM, pH 3.0) (tripsina, a-quimotripsina, pepsina), NaCl (100 mM) (proteinasa K, elastasa, papama, carboxipeptidasa, termolisina). Se usaron 75 pl de solucion de Fc-BSA (0,3-0,6 mgml-1) para cada reaccion. Cada reaccion se realizo en un volumen total de 200 pl y las reacciones se llevaron a cabo en los siguientes ’buffers’ o soluciones amortiguadoras (se ofrecen las concentraciones finales): 100 mM de tris HCl, pH 7.8 (tripsina, a-quimotripsina, termolisina, proteinasa K); 100 mM de tris HCl, pH 8.5 (elastasa); 200 mM de acetato de sodio, 200 mM de cistema, 20 mM de EdTA (papama); 10 mM de HCl, pH 2,0 (pepsina); 25 mM de tris HCl, pH 7.5, 500 mM de NaCl (carboxipeptidasa). Se anadieron 2 pl de enzimas (10 mgml-1) a la mezcla de reaccion de 200 pl. Las muestras se incubaron a 37° C durante 1 hora. Los productos de reaccion se analizaron mediante voltametna de pulso diferencial, tal y como se describe en el Ejemplo 1.

Presentacion de Datos

Ademas de los datos brutos, los datos o valores de referencia corregidos (tambien llamados ’datos de lmea de base corregida’) se muestran como archivos superpuestos. Los datos de referencia corregidos se obtuvieron usando un GPES Manager (Ecochemie BV, Utrecht, Pafses Bajos), seleccionando ’correccion de la lmea de base’ (’baseline correction’) en el menu de edicion de datos, y seleccionando ’media movil’ y ’ancho maximo mas pequeno’ (’minimum peak width’) de 0,003 V.

EJEMPLO 5A - Digestion de Fc-BSA con tripsina

Se realizo una digestion de Fc-BSA con tripsina tal y como se ha explicado previamente. Los resultados del voltamograma de pulso diferencial se muestran en la Figura 3, en la que (a) es la traza o rastro del producto

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digerido; (b) es la traza del producto de un control sin tripsina y (c) muestra los datos de (a) y (b) con la correccion de la lmea de base. En la reaccion positiva, la posicion maxima o posicion pico (’peak position’, en ingles) es de 435 mV y la altura maxima o altura pico (’peak height’, en ingles) es de 4,58x10'7 A; en la reaccion del control sin tripsina, la posicion maxima es de 432 mV y la altura maxima es de 2,55x10'8 A.

Como se observa en la Figura 3, la corriente observada a 435 mV aumenta en un factor de 18 tras la digestion de la protema a la que esta unido el marcador electroqmmico.

EJEMPLO 5B - Digestion de Fc-BSA con a-quimotripsina

Se realizo una digestion de Fc-BSA con a-quimotripsina tal y como se ha explicado previamente. Los resultados del voltamograma de pulso diferencial se muestran en la Figura 4, en la que (a) es la traza o rastro del producto digerido; (b) es la traza del producto de un control sin a-quimotripsina y (c) muestra los datos de (a) y (b) con la correccion de la lmea de base. En la reaccion positiva, la posicion maxima es de 438 mV y la altura maxima es de 4,48x10-7 A; en la reaccion del control sin a-quimotripsina, la posicion maxima es de 432 mV y la altura maxima es de 2,55x10-8 A.

EJEMPLO 5C - Digestion de Fc-BSA con elastasa

Se realizo una digestion de Fc-BSA con elastasa tal y como se ha explicado previamente. Los resultados del voltamograma de pulso diferencial se muestran en la Figura 5, en la que (a) es la traza o rastro del producto digerido; (b) es la traza del producto de un control sin elastasa y (c) muestra los datos de (a) y (b) con la correccion de la lmea de base. En la reaccion positiva, la posicion maxima es de 430 mV y la altura maxima es de 2,57x10'7 A; en la reaccion del control sin elastasa, la posicion maxima es de 432 mV y la altura maxima es de 2,55x10'8 A.

EJEMPLO 5D - Digestion de Fc-BSA con pepsina

Se realizo una digestion de Fc-BSA con pepsina tal y como se ha explicado previamente. Los resultados del voltamograma de pulso diferencial se muestran en la Figura 6, en la que (a) es la traza o rastro del producto digerido; (b) es la traza del producto de un control sin pepsina y (c) muestra los datos de (a) y (b) con la correccion de la lmea de base. En la reaccion positiva, la posicion maxima es de 537 mV y la altura maxima es de 8,90x10'8 A; en la reaccion del control sin pepsina, la posicion maxima es de 522 mV y la altura maxima es de 4,19x10'8 A.

EJEMPLO 5E - Digestion de Fc-BSA con carboxipeptidasa

Se realizo una digestion de Fc-BSA con carboxipeptidasa tal y como se ha explicado previamente. Los resultados del voltamograma de pulso diferencial se muestran en la Figura 7, en la que (a) es la traza o rastro del producto digerido; (b) es la traza del producto de un control sin carboxipeptidasa y (c) muestra los datos de (a) y (b) con la correccion de la lmea de base. En la reaccion positiva, la posicion maxima es de 435 mV y la altura maxima es de 1,31x10'7 A; en la reaccion del control sin carboxipeptidasa, la posicion maxima es de 427 mV y la altura maxima es de 6,86x10-8 A.

EJEMPLO 5F - Digestion de Fc-BSA con termolisina a 37° C

Se realizo una digestion de Fc-BSA con termolisina, tal y como se ha explicado previamente, de manera que la incubacion de la digestion se realizo a 37° C. Los resultados del voltamograma de pulso diferencial se muestran en la Figura 8, en la que (a) es la traza o rastro del producto digerido; (b) es la traza del producto de un control sin termolisina y (c) muestra los datos de (a) y (b) con la correccion de la lmea de base. En la reaccion positiva, la posicion maxima es de 429 mV y la altura maxima es de 1,62x10'8 A; en la reaccion del control sin termolisina no se hallo ningun pico o maximo.

EJEMPLO 5G - Digestion de Fc-BSA con termolisina a 70° C

Se realizo una digestion de Fc-BSA con termolisina, tal y como se ha explicado previamente, de manera que la incubacion de la digestion se realizo a 70° C. Los resultados del voltamograma de pulso diferencial se muestran en la Figura 9, en la que (a) es la traza o rastro del producto digerido; (b) es la traza del producto de un control sin termolisina y (c) muestra los datos de (a) y (b) con la correccion de la lmea de base. En la reaccion positiva, la posicion maxima es de 455 mV y la altura maxima es de 2,0x10'8 A; en la reaccion del control sin termolisina no se hallo ningun pico.

EJEMPLO 5H - Digestion de BSA con tripsina

Se realizo una digestion de BSA sin marcar con tripsina de la misma manera que con las moleculas marcadas, tal y como se ha explicado previamente. Los resultados del voltamograma de pulso diferencial se muestran en la Figura 10, en la que (a) es la traza o rastro de la reaccion de un control sin tripsina y (b) es la traza de la reaccion de BSA con tripsina. No se hallo ningun pico en ninguna solucion de productos de reaccion.

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EJEMPLO 5I - Digestion de FcU-BSA con tripsina

Se realizo una digestion de FcU-BSA con tripsina tal y como se ha explicado previamente. Los resultados del voltamograma de pulso diferencial se muestran en la Figura 11, en la que (a) es la traza o rastro del producto digerido; (b) es la traza del producto de un control sin tripsina y (c) muestra los datos de (a) y (b) con la correccion de la lmea de base. En la reaccion positiva, la posicion maxima es de 97 mV y la altura maxima es de 5,01x10-7 A; en la reaccion del control sin tripsina no hubo ningun pico.

EJEMPLO 5J - Digestion de FcU-BSA con papaina

Se realizo una digestion de FcU-BSA con papaina tal y como se ha explicado previamente. Los resultados del voltamograma de pulso diferencial se muestran en la Figura 12, en la que (a) es la traza o rastro del producto digerido; (b) es la traza del producto de un control sin papaina y (c) muestra los datos de (a) y (b) con la correccion de la lmea de base. En la reaccion positiva, la posicion maxima es de 93 mV y la altura maxima es de 2,62x10-7 A; en la reaccion del control sin papaina no se detecto ningun pico.

EJEMPLO 5K - Digestion de FcU-casema con tripsina

Se realizo una digestion de FcU-casema con tripsina tal y como se ha explicado previamente. Los resultados del voltamograma de pulso diferencial se muestran en la Figura 13, en la que (a) es la traza o rastro del producto digerido; (b) es la traza del producto de un control sin tripsina y (c) muestra los datos de (a) y (b) con la correccion de la lmea de base. En la reaccion positiva, la posicion maxima es de 148 mV y la altura maxima es de 3,79x10'7 A; en la reaccion del control sin tripsina, la posicion maxima es de 147 mV y la altura maxima es de 1,55x10'7 A.

EJEMPLO 6 - Variacion de la senal del marcador electroquimico segun la concentracion enzimatica

Se realizaron cinco digestiones de Fc-BSA con tripsina usando el protocolo descrito previamente. Tal y como se explica en el protocolo general, se usaron 2pl de enzimas por cada 200 pl de reaccion; en la reaccion (i) se uso una solucion enzimatica de 10 mg/ml; reaccion (ii): 1 mg/ml; reaccion (iii): 0,1 mg/ml; reaccion (iv): 0,01 mg/ml; y la reaccion (v) fue un control sin tripsina. Los resultados del voltamograma de pulso diferencial se muestran en la Figura 14 con la correccion de la lmea de base. En la reaccion (i), la posicion maxima es de 430 mV y la altura maxima es de 5,42x10'7 A; en la reaccion (ii), la posicion maxima es de 428 mV y la altura maxima es de 2,29x10'7 A; en la reaccion (iii), la posicion maxima es de 429 mV y la altura maxima es de 1,04x10'7 A; en la reaccion (iv), la posicion maxima es de 429 mV y la altura maxima es de 7,53x10'8 A; en la reaccion de control sin tripsina, la posicion maxima es de 448 mV y la altura maxima es de 3,17x10'9 A.

Tal y como se observa en la Figura 14, la magnitud de senal del voltamograma de pulso diferencial depende en gran medida de la concentracion enzimatica presente en el experimento de digestion. Pueden usarse diversas diluciones en serie -como las aqrn descritas- para obtener datos de una curva de calibracion estandar. Dicha curva es util para cuantificar los niveles enzimaticos o las actividades enzimaticas en una muestra experimental cuyo contenido de proteasa es desconocido.

EJEMPLO 7 - Variacion de la senal del marcador electroquimico segun el tiempo de incubacion

Se realizaron cinco digestiones de Fc-BSA con tripsina usando el protocolo descrito previamente. En la reaccion (i) la incubacion a 37° C se realizo durante 60 minutos; en la reaccion (ii), durante 15 minutos; en la reaccion (iii), durante 5 minutos; en la reaccion (iv), durante 2 minutos; y la reaccion (v) fue un control sin tripsina de 0 minutos. Los resultados del voltamograma de pulso diferencial se muestran en la Figura 15 con la correccion de la lmea de base. En la reaccion (i), la posicion maxima es de 435 mV y la altura maxima es de 2,49x10'7 A; en la reaccion (ii), la posicion maxima es de 429 mV y la altura maxima es de 1,88x10'7 A; en la reaccion (iii), la posicion maxima es de 435 mV y la altura maxima es de 1,57x10'7 A; en la reaccion (iv), la posicion maxima es de 428 mV y la altura maxima es de 1,04x10'7 A; en la reaccion de control sin tripsina, la posicion maxima es de 460 mV y la altura maxima es de 2,11x10'8 A.

Tal y como se observa en la Figura 15, cuanto mayor sea el tiempo de incubacion, mayor sera la magnitud de senal del voltamograma de pulso diferencial.

EJEMPLO 8 - Los efectos de un inhibidor de proteasa sobre la senal del marcador electroquimico

Se realizaron cinco digestiones de Fc-BSA con tripsina usando el protocolo descrito previamente. Ademas, se anadio un inhibidor de tripsina de soja a las mezclas de reaccion (i) a (iv). Las soluciones del inhibidor de tripsina de soja se prepararon resuspendiendo el inhibidor-tal y como se habfa proporcionado- en agua desionizada hasta una concentracion de 10 mg/ml y 1 mg/ml, segun correspondiera. No se anadio ningun inhibidor a la reaccion (i); se anadieron 0,5 pl de una solucion inhibidora de 1 mg/ml a la reaccion (ii); se anadieron 0,5 pl de una solucion inhibidora de 10 mg/ml a la reaccion (iii); se anadieron 5 pl de una solucion inhibidora de 10 mg/ml a la reaccion (iv);

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y se anadieron 5 pi de una solucion inhibidora de 10 mg/ml a una reaccion de control sin tripsina. Los resultados del voltamograma de pulso diferencial se muestran en la Figura 16 con la correccion de la lmea de base. En la reaccion (i), la posicion maxima es de 439 mV y la altura maxima es de 2,56x10-7 A; en la reaccion (ii), la posicion maxima es de 435 mV y la altura maxima es de 2,12x10-7 A; en la reaccion (iii), la posicion maxima es de 430 mV y la altura maxima es de 1,60x10-7 A; en la reaccion (iv), la posicion maxima es de 426 mV y la altura maxima es de 5,33x10-8 A; en la reaccion de control sin tripsina, la posicion maxima es de 429 mV y la altura maxima es de 2,75x10-8 A.

Tal y como se observa en la Figura 16, la magnitud de senal del voltamograma de pulso diferencial depende en gran medida de la concentracion del inhibidor presente en el experimento de digestion. Pueden usarse diversas diluciones en serie -como las aqrn descritas- para obtener datos de una curva de calibracion estandar, y dicha curva es util para cuantificar los niveles del inhibidor o las potencias inhibidoras en una muestra experimental cuyo contenido de proteasa es desconocido. Una curva de calibracion tambien puede ser util en un ensayo para rastrear los inhibidores de proteasa potenciales.

EJEMPLO 9 -Analisis amperometrico de las reacciones de digestion

Se realizaron cuatro reacciones de digestion con un analisis amperometrico en tiempo real. Se resuspendieron enzimas liofilizadas para obtener una concentracion de 10 mgml-1. Se resuspendio tripsina en HCl (1 mM, pH 3.0); se resuspendieron papama y carboxipeptidasa en NaCl (100 mM). Se usaron 75 pl de solucion de Fc-BSA (0,3-0,6 mgml-1) por cada reaccion. Cada reaccion se realizo en un volumen total de 200 pl en los siguientes 'buffers’ (se muestran las concentraciones finales): 100 mM de tris HCl, ph 7.8, en la reaccion con tripsina; 20 mM de EDTA en la reaccion con papama; y 25 mM de tris HCl (pH 7.5) y 500 mM de NaCl en la reaccion con carboxipeptidasa. Se anadieron 2 pl de enzimas (10 mgml-1) a la mezcla de reaccion de 200 pl. Los productos de reaccion se analizaron mediante amperometna en un equipo como el que se ha descrito previamente y que se muestra en la Figura 1. Las condiciones amperometricas fueron como las que se establecen en las Tablas 2 y 3.

Tabla 2. Parametros de la amperometna

Parametro

Pretratamiento

Potencial del primer acondicionamiento (V)

0

Duracion (s)

0

Tiempo de estabilizacion (s)

4

Medicion

Tiempo de intervalo (>0,1 s)

0,4

Potencial (V)

*

Duracion (s)

1200

*El potencial aplicado al electrodo de trabajo dependfa del marcador de ferrocenilo y el pH del ’buffer’. Los potenciales del electrodo de trabajo en el caso de las diversas combinaciones de sustratos (de enzimas/ferrocenilados) se muestran en la Tabla 3:

Tabla 3. Potenciales de electrodo usados para la deteccion amperometrica de los marcadores de ferrocenilo

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Enzima

Marcador de ferrocenilo Potencial de electrodo*

Tripsina

Fc 0,44

Tripsina

FcU 0,13

Papama

FcU 0,13

Los resultados de los experimentos amperometricos se muestran en las Figuras 17 y 18.

En la Figura 17, se muestra la traza o huella amperometrica -en intervalos de tiempo- de la digestion de Fc-BSA con tripsina. La Lmea A muestra la respuesta de la corriente no faradica a la aplicacion del potencial al electrodo de trabajo antes de la adicion de enzimas. A medida que el movimiento de los elementos presentes en la solucion alcanza un estado constante, parece que la respuesta de la corriente empieza a disminuir. La Lmea B muestra la respuesta de la corriente faradica a lo largo del tiempo tras la adicion de enzimas, que tiene lugar una vez que la respuesta de la corriente no faradica alcanza un equilibrio. El aumento de la corriente que se muestra en la Lmea B parece estar relacionado con la digestion enzimatica del sustrato marcado con ferroceno.

En la Figura 18, se muestra la traza amperometrica -a lo largo del tiempo- de la digestion de FcU-BSA con papama. La Lmea A muestra la respuesta de la corriente no faradica a la aplicacion del potencial al electrodo de trabajo antes de la adicion de enzimas. A medida que el movimiento de los elementos presentes en la solucion alcanza un estado constante, parece que la respuesta de la corriente empieza a disminuir. La Lmea B muestra la respuesta de la corriente faradica a lo largo del tiempo tras la adicion de enzimas, que tiene lugar una vez que la respuesta de la corriente no faradica alcanza un equilibrio. El aumento de la corriente que se muestra en la Lmea B parece estar relacionado con la digestion enzimatica del sustrato marcado con ferroceno. La traza amperometrica -a lo largo del tiempo- de la digestion de FcU-BSA con tripsina no se ilustra en los dibujos, pero fue analoga.

Tal y como se observa en las Figuras 17 y 18, el marcador electroqmmicamente activo permite seguir en tiempo real una reaccion de proteasas a medida que la reaccion avanza, sin que sea necesario retirar las almuotas. Es posible obtener una gran cantidad de informacion cinetica a partir de graficos como los de las Figuras 17 y 18, lo que brinda la posibilidad de estudiar la cinetica de las enzimas.

EJEMPLO 10 - Ensayo de aminopeptidasa

Se obtuvo aminopeptidasa en forma de 20Uml'1 en una solucion de sulfato de amonio. El sustrato de alanina ferrocenilado del Ejemplo 4b se disolvio en etanol a una concentracion de 100 mM. Despues, se diluyo aun mas para obtener una solucion de trabajo de 1 mM en 100 mM de tris HCl (pH 7.5). Para un volumen de 200 pl, se incubaron 195 pl de solucion de sustrato (1 mM en tris HCl/ 1% v/v de etanol) y 5 pl (0,01 U) de aminopeptidasa durante un maximo de 15 minutos a 37° C. La muestra se analizo mediante voltametna de pulso diferencial (VPD o DPV, por sus siglas en ingles) antes de la incubacion, despues de 5 minutos de incubacion y despues de 15 minutos de incubacion. La DPV se realizo como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Figura 19a y la Figura 19b. La Figura 19a muestra los datos sin procesar y la Figura 19b muestra los mismos datos con la lmea de base corregida utilizando el GPES Manager tal y como se ha explicado en el Ejemplo 5. La lmea A muestra la traza voltametrica de la alanina ferrocenilada, antes de la incubacion con aminopeptidasa; la lmea B muestra la traza voltametrica despues de 5 minutos de incubacion con aminopeptidasa; y la lmea C muestra la traza voltametrica despues de 15 minutos de incubacion con aminopeptidasa. Puede apreciarse que la digestion del sustrato provoca que el potencial de corriente maximo cambie. Tras 15 minutos de digestion, el cambio es de aproximadamente 80 mV.

EJEMPLO 11 - Ensayo de elastasa

La elastasa se obtuvo, liofilizo y rehidrato en un ’buffer’ de 100 mM de tris HCl (pH 8.5) a 10 mg/ml. Se preparo una almuota de 200 pl de muestra de prueba para contener 50 pl de sustrato de tripeptido marcado con ferroceno (el peptido de trialanina ferrocenilado se preparo como en el Ejemplo 4c), 1 pl de elastasa en tris HCl, y se completo el volumen hasta 200 pl anadiendo mas ’buffer’ de tris HCl. La solucion se incubo durante 1 hora a 37° C. La muestra se analizo mediante voltametna de pulso diferencial (DPV) antes de la incubacion y despues de 1 hora de incubacion. La DPV se realizo como se describe en el Ejemplo 1. Los resultados se muestran en la Figura 20a y la Figura 20b. La Figura 20a muestra los datos sin procesar y la Figura 20b muestra los mismos datos con la lmea de base corregida utilizando el GPES Manager tal y como se ha explicado en el Ejemplo 5. La lmea A muestra la traza voltametrica del sustrato, antes de la incubacion con elastasa; la lmea B muestra la traza voltametrica despues de 1 hora de incubacion con elastasa. Puede apreciarse que la digestion del sustrato provoca que el potencial de corriente maximo cambie. Sin embargo, el cambio es menor que el que se senala en el Ejemplo 10.

Claims (148)

1. 5

   10

   15

   20

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   30

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   40

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   50

   55

   60

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   Reivindicaciones

   1. Un metodo para detectar la actividad proteasa (o actividad de las proteasas) en una solucion de muestra, de manera que el metodo incluye poner en contacto la solucion de muestra con un sustrato de proteasa marcado con un marcador electroqmmicamente activo, proporcionar las condiciones adecuadas para que cualquier proteasa que pueda estar presente en la muestra pueda degradar el sustrato de proteasa, y determinar electroqmmicamente la informacion relacionada con el marcador electroqmmicamente activo, que se caracteriza por el hecho de que el marcador electroqmmicamente activo es una fraccion de metaloceno y el sustrato de proteasa es un peptido de al menos 5 residuos de aminoacidos.
2. 2. Un metodo como el que se reivindica en la reivindicacion 1, en el que la informacion relacionada con el marcador electroqmmicamente activo se obtiene mediante voltametna.
3. 3. Un metodo como el que se reivindica en la reivindicacion 2, en el que la informacion relacionada con el marcador electroqmmicamente activo se obtiene mediante voltametna de pulso diferencial.
4. 4. Un metodo como el que se reivindica en la reivindicacion 1, en el que la informacion relacionada con el marcador electroqmmicamente activo se obtiene mediante tecnicas amperometricas.
5. 5. Un metodo como el que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la informacion relacionada con el marcador electroqmmicamente activo se obtiene mediante una tecnica que utiliza uno o mas electrodos que estan rodeados funcionalmente por una membrana selectivamente permeable.
6. 6. Un metodo como el que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el marcador electroqmmicamente activo es una fraccion de ferroceno.
7. 7. Un metodo como el que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el marcador electroqmmicamente activo esta unido al sustrato mediante un enlazador.
8. 8. Un metodo como el que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que cada molecula del sustrato se marca, de media, con mas de una molecula del marcador electroqmmicamente activo.
9. 9. Un metodo como el que se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para detectar una enfermedad en un sujeto.
10. 10. Un metodo como el que se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para detectar un patogeno.
11. 11. Un metodo como el que se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para rastrear un inhibidor de proteasas.

    FIGURAS (Figs.)

    imagen1

    Figura 1

    imagen2

    Figura 2

    A = muestra de Fc:BSA B = BSA:FCA 20:1 C = BSA D = FCA

    E = BDSA:FCA 10:1

    -Absorbance (OD): absorbancia (DO) -Wavelength (nm): longitud de onda (nm)

    imagen3

    i (I) = corriente o intensidad electrica A = amperio(s)

    E = potencial de electrodo V = voltio(s)

    imagen4

    Figura 3(b)

    imagen5

    imagen6

    imagen7

    0 210x10 -5
12. 0.200x10 5
13. 0.190x10 -5
14. 0.180x10
15. 0.170x10 ‘s
16. 0.160x10 ’5
17. 0.150x10 '5
18. 0.140x10

    E / V

    Figura 4(a)
19. 0.180x10
20. 0.175x10 s
21. 0.170x1 O'5
22. 0.165x10
23. 0.160x1 O'5

    - 0.155x10‘5
24. 0.150x10 s
25. 0.145x10
26. 0.140x10

    0 135x1 Q'5

    Figura 4(b)

    imagen8
27. 0.450x10
28. 0.400x10
29. 0.350x10
30. 0.300x10
31. 0.250x10
32. 0.200x10
33. 0.150x10
34. 0.100x10
35. 0.050x10
36. -0.050x10

    imagen9

    Figura 4(c)

    imagen10

    imagen11

    imagen12

    imagen13

    imagen14

    185x10
37. 0.205x10
38. 0.203x10
39. 0.200x10
40. 0.198x10
41. 0.195x10'5
42. 0.193x10'5
43. 0.190x10
44. 0.188x10

    0 450
45. 0.500
46. 0.550

    /V

    Figura 6(a)
47. 0.175x10 s
48. 0.173x10"5
49. 0.170x1 O'5
50. 0.168x10'5
51. 0.165x10"s
52. 0.163x10‘5
53. 0.160x10
54. 0.158x10
55. 0.155x10.
56. 0.600
57. 0.450
58. 0.500
59. 0.550
60. 0.650
61. 0.350

    Figura 6(b)

    imagen15

    imagen16

    imagen17

    imagen18

    i/A
62. 0.180x10 s 0.175x10® 0.170x10-® 0.105x10'® 0.160x10-® 0.155x10-® 0.150x10-® 0.145x10-® 0.140x10-®

    imagen19
63. 0.135x10®

    0 130x10"® ■——---------------------------------------------------------------------------

    ' 0.200 0.250 0.300 0.350 0.400 0.450 0.500

    E / V

    Figura 8(a)

    imagen20

    150x10
64. 0.200x10
65. 0.195x10®
66. 0.190x10®
67. 0.185x10-®
68. 0.180x10®
69. 0.175x10
70. 0.170x1 O'®
71. 0.165x10®
72. 0.160x10
73. 0.155x10 s
74. 0.300
75. 0.350
76. 0.400
77. 0.450
78. 0.500
79. 0.250

    Figura 8(b)

    imagen21

    i/A

    imagen22
80. 0.220x1 O'5 0.218x1 O’5 0.215x1 O'5

    imagen23

    Figura 9(b)

    cn I

    imagen24

    imagen25
81. 0.240x10
82. 0.230x10
83. 0.220x1 O’5
84. 0.210x10
85. 0.200x10‘5
86. 0.190x105
87. 0.100 0.200 0.300 0.400
88. 0.500
89. -0.100

    El V

    Figura 10(a)

    imagen26

    imagen27

    imagen28
90. 0.240x10
91. 0.230x10 5
92. 0.220x10
93. 0.210x10 '5
94. 0.200x10
95. 0.190x10 '5
96. 0.180x10
97. 0.170x10 -5
98. -0.100 -0.050

    Figura 11(b)

    imagen29
99. 0.350x10 '6
100. 0.300x10 6
101. 0.250x10 *
102. 0.200x10 -6
103. 0.150x10 -6
104. 0.100x10 -6
105. 0.050x10 ‘6
106. -0.050x10 *
107. -0.100x10 -6
108. -0.100 -0.050

     Figura 11(c)

     imagen30

     imagen31
109. 0.265x10 ‘5 •
110. 0.260x10 '5 0.255x10 '5 0.250x10 '5 0.245x10 '5 0.240x10 *5 0.235x10 -5 0.230x10 -5 0.225x10 -5 0.220x10 '5 0.215x10 '6 0.210x10 '5
111. -0.100 -0.050 0 0.050 0.100 0.150 0.200 0.250 0.300

     E/V

     imagen32

     Figura 12(b)

     imagen33

     imagen34

     imagen35
112. 0.250x10
113. 0.240x10
114. 0.230x1 O'5
115. 0.220x1 O'5
116. 0.210X10-5
117. 0.200x10
118. 0.190x10

     -5 _
119. 0.180x10
120. 0.050
121. 0.050
122. 0.100
123. 0.150
124. 0.200
125. 0.250
126. 0.220x10"5
127. 0.210x10
128. 0.200x10-

     < 0.190x1 O'5
129. 0.180x10

     -v5
130. 0.1 70x10
131. 0.160x10‘5
132. 0.150x10
133. -0.050
134. 0.050
135. 0.100
136. 0.150
137. 0.200
138. 0.250

     Figura 13(a)

     Figura 13(b)

     imagen36

     imagen37

     imagen38

     imagen39

     imagen40
139. 0.350x10

     0 3?5x10'7
140. 0.300x10
141. 0.2^5x10
142. 0.250x10
143. 0.225x10"
144. 0.200x10
145. 0.175x10
146. 0.150x10-'
147. 250.0 500.0 750 0 1000.0 1250.0

     Figura 17

     i (I) = corriente o intensidad electrica A = amperio(s) t = tiempo s = segundo(s)

     imagen41

     i/A
148. 0.35x1 O'6 0.33x10 s 0.30x10-® 0.28x1 O’6 <0.25x1 O'6 '"0.23x1 O'6 0.20x1 O'6 0.18x10-® 0.15X106 0.13x10®

     imagen42

     Figura 19(a)

     imagen43

     Figura 19(b)

     i / A

     imagen44

     imagen45

     Figura 20(b)