ES2622435T3 - Composiciones que comprenden complejos de proantocianidinas con proteínas de guisantes - Google Patents

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Abstract

Complejo de proteína de guisante y proantocianidinas para uso en el tratamiento de trastornos causados por alteraciones del tejido epitelial intestinal seleccionado del grupo de enfermedades inflamatorias intestinales, enfermedad celíaca, infecciones entéricas bacterianas y parasitarias y síndrome de intestino irritable.

Description

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DESCRIPCION
Composiciones que comprenden complejos de proantocianidinas con protemas de guisantes
La invencion se refiere a complejos de proantocianidinas con una protema de guisante como ingredientes activos en composiciones para uso en el tratamiento de trastornos gastrointestinales, en particular trastornos causados por alteraciones del tejido epitelial intestinal (epitelio cilmdrico simple no ciliado).
Arte previo
La diarrea es un smtoma de muchos trastornos gastrointestinales y es a menudo incapacitante y peligrosa, especialmente en ninos y ancianos. La diarrea aguda es causada principalmente por infecciones intestinales, pero tambien puede ser debido al uso de medicamentos o a la radioterapia y a otras condiciones patologicas (diverticulitis, intoxicacion por metales pesados, isquemia intestinal, alergias e intolerancias).
La diarrea aguda con una causa infecciosa es un problema serio en los pafses en desarrollo; se cree que causa la muerte de al menos 4 millones de ninos menores de 5 anos cada ano.
La diarrea cronica se debe generalmente al smdrome del intestino irritable, enfermedad celfaca o enfermedades inflamatorias intestinales (enfermedad de Crohn, rectocolitis ulcerativa).
En vista de sus diferentes etiologfas, existen diversas opciones de tratamiento basadas en la administracion de antibioticos/antibacterianos, espasmolfticos/anticolinergicos, probioticos u agonistas de los receptores opioides. Sin embargo, algunos de dichos tratamientos se deben administrar con gran precaucion, ya que no actuan sobre el proceso patologico causal.
Los complejos de taninos complejados con protemas animales y gelatinas, en particular con gelatina de origen bovino, albumina, casema u ovoalbumina, se han propuesto desde hace algun tiempo como remedios eficaces para trastornos gastrointestinales.
Por ejemplo, el uso de dichos complejos en el tratamiento de las diversas formas de diarrea se describe en EP 1764105, EP 2526939, EP 2361623 y US 20090062191. El tanato de gelatina ha estado disponible en el mercado desde hace algun tiempo como un dispositivo medico para el tratamiento de la diarrea aguda.
Aunque los complejos conocidos hasta ahora son eficaces y bien tolerados, todavfa hay necesidad de nuevos complejos con caractensticas mejoradas en terminos de eficacia, seguridad, caractensticas organolepticas, estabilidad y compatibilidad con otros ingredientes de formulaciones orales. Ademas, los complejos conocidos y disponibles hasta la fecha se obtienen a partir de materiales protemicos de origen animal, con los consiguientes problemas de seguridad asociados con la posible transmision de enfermedades tales como BSE o alergias, que son particularmente frecuentes en el caso de las protemas derivadas de la leche y huevos. Los complejos con protemas animales tambien pueden dar lugar a problemas eticos o religiosos en algunas poblaciones de pacientes.
Por lo tanto, existe todavfa la necesidad de nuevos tratamientos para reemplazar o acompanar a los disponibles en la actualidad.
Descripcion de la invencion
Ahora se ha encontrado sorprendentemente que el complejo de proantocianidinas con protema de guisante es particularmente eficaz en el tratamiento de trastornos causados por alteraciones del tejido epitelial intestinal (epitelio cilmdrico simple no ciliado). El complejo de la invencion es ventajoso en terminos de seguridad, porque esta practicamente desprovisto de toxicidad hepatica, a diferencia de los taninos ya utilizados para tratar la diarrea y otros trastornos gastrointestinales.
"Trastornos causados por alteraciones del tejido epitelial intestinal" significa enfermedades intestinales inflamatorias (Crohn y colitis ulcerativa), enfermedad celfaca, infecciones entericas bacterianas y parasitarias (esto es, Escherichia coli enteropatogenica, infeccion por Giardia lamblia, infeccion por C. difficile, etc.), y smdrome del intestino irritable.
"Complejo" significa una entidad qmmica derivada de la interaccion entre los grupos funcionales presentes en la protema y en la estructura del polifenol. Dichas interacciones, principalmente de naturaleza ionica (tales como enlaces de hidrogeno), dan al complejo o aducto diferentes propiedades fisicoqmmicas y biologicas de las de los componentes del complejo o su mezcla ffsica.
"Protema de guisante" significa una protema en polvo obtenida por extraccion de semillas de Pisum sativum disponibles en el mercado (
http://en.wikipedia.org/wiki/Pea protein).
Un producto comercialmente disponible, por ejemplo, es suministrado por Dal Cin Gildo S.p.A. El producto esta en forma de un polvo amarillento con un olor caractenstico, que es poco soluble en agua.
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El termino "proantocianidinas" se refiere a compuestos de polifenoles formados por la union de 2 a 8 unidades de catequina. Las proantocianidinas son abundantes en diversas plantas, especialmente en pieles y pepitas de uva, arandanos rojos y arandanos, y algunos tipos de madera, como madera de quebracho. Las proantocianidinas, que pertenecen a la familia de los taninos condensados, tienen un alto nivel de actividad antioxidante, y diversos estudios han demostrado su eficacia en la reduccion de la presion sangumea, reduciendo la agregacion plaquetaria y contrarrestando el progreso o aparicion de trastornos del sistema cardiovascular. Las proantocianidinas tambien poseen propiedades antibacterianas, antivirales, antiangiogenicas, antitumorales y quimiopreventivas. Existen en el mercado diversas preparaciones de proantocianidinas, especialmente preparaciones de proantocianidinas extrafdas de Vitis vinifera.
La protema de guisante y el complejo de proantocianidina se pueden preparar mezclando una suspension acuosa de la protema con una solucion de proantocianidinas. En particular, la protema de guisante se suspende en agua, preferiblemente en la proporcion de 1:20 p/v. A esta suspension se adiciona una solucion de proantocianidinas obtenida a partir de pepitas de uva en la proporcion de 1:10 p/v en agua.
La proporcion de protema de guisante con proantocianidinas oscila entre 1:0.1 y 1:2.5; esta preferiblemente entre 1:0.5 y 1:2; y mas preferiblemente de 1:1.5.
Puede ser util acidificar la suspension de protema de guisante en agua, por ejemplo, con acido dtrico, acido ascorbico u otros acidos, para mejorar la solubilidad de la protema; el pH esta entre 3 y 5, preferiblemente entre 3.5 y 4.5.
La temperatura puede variar dentro de un amplio intervalo durante la preparacion del complejo: preferiblemente entre 10°C y 50°C, y mas preferiblemente entre 20°C y 40°C.
El complejo se afsla por metodos conocidos, tales como filtracion, centrifugacion, secado por pulverizacion, liofilizacion, etc.
El complejo se puede secar bajo vado, en una corriente de aire, en secadores de lecho fluido, etc., a una temperatura preferiblemente comprendida entre 20°C y 40°C.
El complejo obtenido de este modo es muy estable a la humedad ambiental, incluso a temperaturas que exceden la temperatura ambiente. El complejo de la invencion, ya sea solo o combinado con otros ingredientes activos y/o excipientes, se puede formular en formas de administracion apropiadas para los usos recomendados.
Otros ingredientes activos que se pueden combinar ventajosamente con los complejos de la invencion incluyen antibioticos, agentes antimotilidad, antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, compuestos para el tratamiento de la hinchazon gastrointestinal (simeticona y similares), mesalazina, sucralfato, polisacaridos naturales y sinteticos tales como pectinas, quitosano (animal o vegetal), acido hialuronico, goma guar, goma de xantano, gelatina animal, celulosa y hemicelulosa y derivados tales como hidroxipropilcelulosa, carragenanos, carbomeros y compuestos de reticulacion/polimerizacion tales como acido ferulico; y probioticos, tales como Lactobacilli, Bifidobacteria, levaduras y similares.
El complejo de la invencion es util para el tratamiento y prevencion de trastornos gastrointestinales y otros trastornos originados en el sistema gastrointestinal y transferidos a otros sistemas, tales como el sistema urogenital. El complejo de la invencion tambien es util para prevenir la proliferacion de patogenos en el sistema gastrointestinal y su transferencia a otros sistemas del cuerpo humano a traves de las uniones intestinales estrechas. El complejo de la invencion es tambien util para proteger la mucosa intestinal contra agentes qmmicos o ffsicos que pueden reducir la funcionalidad y la regeneracion natural del epitelio intestinal y para reducir el flujo paracelular de patogenos a traves de las paredes intestinales.
Ejemplos de formas de administracion apropiadas incluyen capsulas, comprimidos, soluciones, suspensiones, granulos, geles, etc. Ejemplos de otros ingredientes activos con los que la protema de guisante y el complejo de proantocianidina se pueden combinar incluyen antibioticos, agentes antimotilidad, antiinflamatorios, compuestos para el tratamiento de flatulencias gastrointestinales, prebioticos, probioticos, etc.
En vista de su ausencia sustancial de toxicidad, la protema de guisante y el complejo de proantocianidina se pueden administrar varias veces al dfa a dosis que oscilan entre 50 mg y 6000 mg/dfa.
En particular, el complejo de proantocianidina y protema de guisante, ademas de ser muy eficaz y seguro, es estable a la hidrolisis y oxidacion del componente proantocianidina.
Los siguientes ejemplos ilustran la invencion con mayor detalle.
Ejemplo 1
Preparacion de complejo
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A) Se suspenden 10 g de protema de guisante (Dal Cin Gildo S.p.A.) en 200 g de agua purificada. El pH de la suspension se ajusta desde pH 6.3 a pH 4 con acido cftrico anhidro, 20% de sol. p/v en agua. La suspension se deja bajo agitacion durante 3 horas, y la temperature se incrementa a 30°C.
B) Se disuelven 10 g de proantocianidinas (extracto seco de semilla de uva (r), Indena Spa) en 100 mL de agua purificada; la solucion se prepara poco antes del uso, ajustando el pH desde 6.7 a 4 con acido cftrico anhidro, 20% de sol. p/v en agua y se calento a 30°C; la solucion de color rojo oscuro se adiciona en porciones a la suspension A), todavfa bajo agitacion.
El complejo en suspension homogenea que se forma inmediatamente es rojo oscuro, mientras que la solucion acuosa es rojiza.
La suspension se mantiene bajo agitacion durante 3 horas, dejando caer la temperatura a 20 °C.
Se detiene la agitacion y se deja reposar la suspension durante otras 8 horas, tiempo durante el cual se decanta rapidamente. La suspension se filtra a traves de papel a baja presion.
El solido se lava con 100 mL de agua purificada acidificada a pH 4 con una solucion de acido cftrico en porciones de 20 mL, aspirando cuidadosamente cada vez; el ultimo lavado es practicamente incoloro. El solido se seca en estufa a 35- 40°C hasta que alcanza un peso constante.
Rendimiento: 14.5 g; un solido de color rojo ladrillo, inodoro, practicamente insfpido.
Datos de analisis
La figura 1 muestra el espectro de 1H RMN del complejo caracterizado por senales ampliadas en la region a 5 7.0, atribuible a los protones aromaticos de las proantocianidinas.
La formacion de un complejo que se deriva de la interaccion qmmica entre el componente proteico y el componente polifenolico se demuestra por la tecnica RMN 2D DOSY (espectroscopfa de difusion ordenada).
El espectro tiene un eje horizontal (T2) que se refiere a las frecuencias de resonancia del proton (5 o ppm), y un eje vertical (T1) que presenta el parametro de difusion.
Las figuras 2, 3 y 4 muestran los espectros registrados para proantocianidina obtenida de Vitis vinifera, protema de guisante, y el complejo de la invencion, respectivamente.
Se pueden observar senales distribuidas entre los valores en log (m2/s) (T1) de -9.2 y -10.5 en el espectro de proantocianidina obtenido de Vitis vinifera.
Por el contrario, el espectro 2D DOSY de protema de guisante presenta senales con valores de T1 entre -8.7 y -10.1. El complejo tiene un comportamiento diferente del anterior, con senales que oscilan entre -9.1 y 10.0.
Esto indica que existe una interaccion entre la especie para formar una situacion diferente de los componentes. Se sugiere que la interaccion entre protema y proantocianidina provoca modificaciones en la estructura de la protema, haciendola mas compacta y consecuentemente obteniendo un coeficiente de difusion diferente.
Tambien se realizaron ensayos de permeacion de gel por HPLC. La elucion isocratica se llevo a cabo con un sistema movil formado por agua, acido formico al 0.1% y metanol al 3% (velocidad de flujo de 1 mL/min, ELSD 60°C, 1.2 bar de N2), fase estacionaria Tosohaas TSK G5000 PWXL 7.8 x 300 mm.
Los cromatogramas muestran la interaccion entre protema y proantocianidina. En particular, el cromatograma de la mezcla de protemas de guisantes (Figura 5) muestra claramente un pico predominante en aproximadamente 10 minutos, mientras que el 95% de extracto de uva negra muestra un pico predominante a casi 11 minutos y un pico mas pequeno a aproximadamente 10 minutos. (Figura 6).
El complejo 50:50 muestra un cromatograma diferente (Figura 7), caracterizado por un pico a tiempos de retencion que exceden aproximadamente 13 minutos, confirmando las observaciones de RMN.
Ejemplo 2 - Ensayos biologicos in vitro
La eficacia de la barrera y la estabilidad qmmica del complejo de la invencion se evaluaron por comparacion con la tanato de gelatina comercial (Tasectan®) en el epitelio intestinal utilizando el modelo predictivo bien establecido de celulas Caco-2, una lmea celular del epitelio intestinal derivado de un adenocarcinoma colorrectal (ATCC HTB 37) (Cell. Biol. Toxicol., 2005, 21 (1) 1-26).
Se determinaron el flujo paracelular y la permeabilidad de la barrera de los compuestos ensayados.
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El flujo paracelular se determino midiendo la resistencia electrica transepitelial (TEER), que proporciona una medicion directa de la funcion de barrera y es otro parametro de la integridad de la barrera en las uniones estrechas.
La permeabilidad de la barrera se midio determinando el paso del colorante Lucifer Yellow (Le Ferrec et al., Altern Lab Anim. 2001 Nov-Dec; 29(6):649-68; Hidalgo et al., Gastroenterology. 1989 Mar; 96(3):736-49) despues de la exposicion al tratamiento con los compuestos ensayados. Este ensayo se utilizo para evaluar la integridad de las uniones celulares en presencia de la sustancia ensayada. De acuerdo con la tecnica descrita por Zucco et al., Altern. Lab Anim. 2005 Dec;33(6):603-18, la monocapa celular se incubo con los compuestos ensayados a la concentracion de 5 mg/mL a dos valores de pH diferentes, 7.4 y 8.3. La TEER se evaluo a tiempo 0 y despues de 4 horas, y el flujo del colorante Lucifer Yellow se monitorizo durante dos horas despues del tratamiento con los productos ensayados.
Los resultados demostraron la capacidad de los productos ensayados para actuar como agentes formadores de pelmula capaces de restaurar la funcion de barrera y reducir su permeabilidad con el fin de proteger la mucosa intestinal y la estructura de las uniones celulares estrechas. El complejo de la invencion resulto estable y activo hasta pH 8.3, a diferencia del tanato de gelatina, que es activo a pH 7.4 pero menos activo a pH 8.3, muy probablemente debido a la hidrolisis de los taninos.
Por lo tanto, el complejo de proantocianidina es mas estable que el tanato de gelatina conocido en el medio alcalino tfpico del medio intestinal.
Ejemplo 3 - Ensayos biologicos in vivo
Se evaluo la actividad del complejo de proantocianidina obtenido a partir de Vitis vinifera y protema de guisante sobre la permeabilidad intestinal alterada e inflamacion intestinal inducida por lipopolisacarido (LPS).
Se han utilizado grupos de 8 ratas Wistar macho (200-225 g). Despues de una noche de ayuno, los animales se inyectaron por via intraperitoneal (IP) con 250 |iL de solucion salina esteril (NaCl al 0.9%) que contema o no (control) 1 mg/kg de lipopolisacarido (LPS) de E. Coli. Se ha demostrado previamente que esta dosis altera la permeabilidad intestinal y libera citocinas proinflamatorias en la mucosa (TNFa, IL-ip, IFNy (Moriez R,. Am J Pathol. 2005;167(4):1071- 9). Seis horas despues se sacrificaron los animales y se utilizaron tiras de yeyuno para la evaluacion de TEER y la permeabilidad paracelular FITC-dextrano. Otros segmentos tambien se recogieron para otros parametros de la inflamacion de la mucosa (mieloperoxidasa-MPO).
Seis horas despues de la administracion de LPS, las ratas se sacrificaron por dislocacion cervical y se retiro la parte proximal del yeyuno. Se montaron tiras de yeyuno en camaras de tipo Ussing (Physiologic Instruments, San Diego, CA). Ambos lados de cada capa de colon se banaran en solucion reguladora Krebs-Henseleit (Sigma) y se oxigenaran a una temperatura mantenida de 37°C. Despues de 15 minutos para el equilibrio, se midio TEER y se reemplazo 1 mL de solucion reguladora con solucion salina fisiologica y 500 |iL de FITC-dextrano (4000 MW, 0.022 g/mL, Sigma) en el lado mucosal de cada camara. La intensidad de fluorescencia generada se midio entonces 1 hora mas tarde.
Actividad de mieloperoxidasa (MPO)
La actividad de MPO, un marcador de granulos primarios de neutrofilos polimorfonucleares, se determino en tejidos proximales de yeyuno, de acuerdo con un metodo modificado de Bradley et al., (1982). Despues del sacrificio, se retiraron las muestras de colon y se congelaron hasta la determinacion de la actividad de MPO. En resumen, los segmentos de colon se trituraron utilizando un Polytron, antes de ser sometidos a 3 ciclos de congelacion- descongelacion y centrifugacion. Los sobrenadantes se desecharon y las pellas se resuspendieron en un detergente que libera MPO. Estas suspensiones se sonicaron sobre hielo, y luego se centrifugaron otra vez. Las pellas se desecharon y los sobrenadantes se ensayaron espectrofotometricamente para medir la actividad de MPO y las mediciones de protemas. La concentracion de protema se determino por el metodo de Lowry (Bio Rad Detergent Compatible Protein Assay, BIO Rad, Ivry-France), y la actividad de MPO se expresara como U MPO/g de protema.
El protocolo experimental se realizo en grupos de 8 ratas Wistar machos (Janvier S.A., Le Genest St. Isle, Francia) que pesaban 200-225 g en el momento de los experimentos. El protocolo consistio en una administracion oral preventiva del complejo de la invencion a una dosis de 500 mg/kg o su vehmulo (agua) 2 horas antes de la inyeccion ip de LPS de E. coli (1 mg/kg). Estos experimentos se llevaron a cabo finalmente en 3 grupos separados de animales:
-1 grupo como grupo de control (vehmulo) - sin LPS
-1 grupo como el grupo positivo (vehmulo + LPS)
-1 grupo compuesto CL-8 (500 mg/kg + LPS)
Permeabilidad intestinal:
Seis horas despues del tratamiento IP con LPS, utilizando las mediciones de camara la permeabilidad yeyunal al FITC- dextrano indico que habfa un enorme aumento en la permeabilidad a las macromoleculas, este aumento tambien fue significativamente (P<0.05) reducido por el compuesto de la invencion (500 mg/kg de PO) en un 64.6%.
Los resultados se describen en la figura 8 que muestra la influencia de un solo tratamiento oral sobre la permeabilidad yeyunal incrementada inducida por LPS en ratas (permeabilidad media ± SEM n = 2x8).
Actividad de mieloperoxidasa mucosa (MPO):
En condiciones basales, la actividad de MPO de la mucosa yeyunal es muy baja (52±31 miliunidades/g de protema) y 5 esta actividad tisular aumento a 389±192 miliunidades/g. de protema cuando se mide 6h. Despues de la administracion de LPS. El complejo de la invencion afecto significativamente (P<0.05) este aumento inducido por LPS en la MPO yeyunal.
Los resultados se describen en la figura 9 que muestra la influencia de un solo tratamiento oral sobre la actividad de MPO en la mucosa en ratas (MPO media±SEM n = 8)).
10 Ejemplo 4 - Formulacion farmaceutica
Composicion para el tratamiento de diarrea, 4 g de una dosis unica de bolsita
Complejo de protema de guisante con proantocianidinas (ejemplo 1) 0.500 g

Inulina 1.500 g

Maltodextrina 1.675 g

Acido ascorbico 0.100 g

Monoglicerido (Rimulsoft super (V) 0.150 g

Dioxido de silicio (Aerosil 200) 0.020 g

Esteviosido (Stevia) 0.015 g

Coloracion E160a (betacaroteno) 0.025 g

Claims (4)

  1. Reivindicaciones
    1. Complejo de protema de guisante y proantocianidinas para uso en el tratamiento de trastornos causados por alteraciones del tejido epitelial intestinal seleccionado del grupo de enfermedades inflamatorias intestinales, enfermedad ceKaca, infecciones entericas bacterianas y parasitarias y smdrome de intestino irritable.
    5 2. Complejo para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde las proantocianidinas se extraen de Vitis vinifera,
    arandanos o arandanos o madera de quebracho.
  2. 3. Complejo para uso de acuerdo con la reivindicacion 2, en donde las proantocianidinas se extraen de Vitis vinifera.
  3. 4. Complejo para uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 3, en donde la proporcion entre la protema de guisante y las proantocianidinas esta entre 1:0.1 y 1:2.5.
    10 5. Complejo para uso de acuerdo con las reivindicaciones 1-4, en donde el trastorno es diarrea.
  4. 6. Composiciones orales que comprenden el complejo como se reivindica en las reivindicaciones 1-5, en mezcla con portadores apropiados y opcionalmente con otros ingredientes activos para uso en el tratamiento de trastornos causados por alteraciones del tejido epitelial intestinal seleccionado del grupo de enfermedades inflamatorias intestinales, enfermedad celfaca, infecciones entericas bacterianas y parasitarias y smdrome del intestino irritable.
    15 7. Composiciones orales para uso de acuerdo con la reivindicacion 6, en combinacion con otros ingredientes activos
    seleccionados entre antibioticos, agentes antimotilidad, antiinflamatorios esteroideos y no esteroideos, compuestos para el tratamiento de la hinchazon gastrointestinal, mesalazina, sucralfato, pectinas, quitosano, acido hialuronico, goma de guar, goma de xantano, gelatinas de animal, protemas vegetales, celulosa y hemicelulosa, hidroxipropilcelulosa, carragenanos, carbomeros, acido ferulico, probioticos, tanato de gelatina y electrolitos.
    20
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