ES2619943T3 - Anticuerpos de alta afinidad que neutralizan la enterotoxina B estafilocócica - Google Patents

Anticuerpos de alta afinidad que neutralizan la enterotoxina B estafilocócica Download PDF

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ES2619943T3 ES08712978.9T ES08712978T ES2619943T3 ES 2619943 T3 ES2619943 T3 ES 2619943T3 ES 08712978 T ES08712978 T ES 08712978T ES 2619943 T3 ES2619943 T3 ES 2619943T3
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heavy chain
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Abstract

Anticuerpo humano aislado, o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que se une a la enterotoxina B estafilocócica, con una constante de disociación (KD) inferior a 3 x 10-10 M, en el que la CDR1 de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC N.º ID: 144, la CDR2 de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC N.º ID: 146, y la CDR3 de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC N.º ID: 148; y en el que, además, la CDR1 de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC N.º ID: 136, la CDR2 de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC N.º ID: 138, y la CDR3 de la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC N.º ID: 140, o en el que el dominio variable de la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC N.º ID: 230, y la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC N.º ID: 228, o en el que la cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC N.º ID: 216 y la cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC N.º ID: 214.

Description

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Cebador 974
5
Cebador 975
6
Cebador 1463
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Cebador 882
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Cebador 885
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Cebador 888
10
Cebador 900
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Cebador 1017
12
Cebador 1018
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Cebador 1019
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Cebador 1024
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Cebador 1040
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Cebador 1500
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Cebador 1550
18
Cebador 1551
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20
Cebador 1553
21
Secuencia de nucleótidos líder 2
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Cebador 1557
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Cebador 1559
24
Cebador 1560
25
Cebador 1570
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Cebador 996
43
Secuencia de nucleótidos líder 1
44
Secuencia de aminoácidos líder
133
Secuencia de nucleótidos correspondiente a la cadena ligera del 154G12
134
Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del 154G12
135
Secuencia de aminoácidos de la región FWR1 de la cadena ligera del 154G12
136
Secuencia de aminoácidos de la región CDR1 de la cadena ligera del 154G12
137
Secuencia de aminoácidos de la región FWR2 de la cadena ligera del 154G12
138
Secuencia de aminoácidos de la región CDR2 de la cadena ligera del 154G12
139
Secuencia de aminoácidos de la región FWR3 de la cadena ligera del 154G12
140
Secuencia de aminoácidos de la región CDR3 de la cadena ligera del 154G12
141
Secuencia de nucleótidos correspondiente a la cadena pesada del 154G12
142
Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del 154G12
143
Secuencia de aminoácidos de la región FWR1 de la cadena pesada del 154G12
144
Secuencia de aminoácidos de la región CDR1 de la cadena pesada del 154G12
145
Secuencia de aminoácidos de la región FWR2 de la cadena pesada del 154G12
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Secuencia de aminoácidos de la región CDR2 de la cadena pesada del 154G12
147
Secuencia de aminoácidos de la región FWR3 de la cadena pesada del 154G12
148
Secuencia de aminoácidos de la región CDR3 de la cadena pesada del 154G12
150
Secuencia de nucleótidos con codones optimizados correspondiente al dominio variable de la cadena ligera del 100C9
5
178
Secuencia de nucleótidos con codones optimizados correspondiente al dominio variable de la cadena ligera del 154G12
192
Secuencia de nucleótidos con codones optimizados correspondiente al dominio variable de la cadena pesada del 154G12
205
Secuencia de nucleótidos con codones optimizados correspondiente a la cadena ligera del 154G12
206
Secuencia de nucleótidos líder 3
207
Secuencia de nucleótidos con codones optimizados correspondiente a la región FWR1 de la cadena ligera del 154G12
208
Secuencia de nucleótidos con codones optimizados correspondiente a la región CDR1 de la cadena ligera del 154G12
209
Secuencia de nucleótidos con codones optimizados correspondiente a la región FWR2 de la cadena ligera del 154G12
210
Secuencia de nucleótidos con codones optimizados correspondiente a la región CDR2 de la cadena ligera del 154G12
211
Secuencia de nucleótidos con codones optimizados correspondiente a la región FWR3 de la cadena ligera del 154G12
212
Secuencia de nucleótidos con codones optimizados correspondiente a la región CDR3 de la cadena ligera del 154G12
213
Secuencia de nucleótidos correspondiente a la cadena ligera del 154G12 (menos la secuencia líder)
214
Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del 154G12 (menos la secuencia líder)
215
Secuencia de nucleótidos correspondiente a la cadena pesada del 154G12 (menos la secuencia líder)
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Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del 154G12 (menos la secuencia líder)
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Secuencia de nucleótidos con codones optimizados correspondiente a la cadena ligera del 154G12 (menos la secuencia líder)
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Secuencia de nucleótidos con codones optimizados correspondiente a la cadena pesada del 154G12 (menos la secuencia líder)
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Secuencia de nucleótidos con codones optimizados correspondiente a la cadena pesada del 154G12
220
Secuencia de nucleótidos líder 4
221
Secuencia de nucleótidos con codones optimizados correspondiente a la región FWR1 de la cadena pesada del 154G12
222
Secuencia de nucleótidos con codones optimizados correspondiente a la región CDR1 de la cadena pesada del 154G12
223
Secuencia de nucleótidos con codones optimizados correspondiente a la región FWR2 de la cadena pesada del 154G12
224
Secuencia de nucleótidos con codones optimizados correspondiente a la región CDR2 de la cadena pesada del 154G12
225
Secuencia de nucleótidos con codones optimizados correspondiente a la región FWR3 de la cadena pesada del 154G12
226
Secuencia de nucleótidos con codones optimizados correspondiente a la región CDR3 de la cadena pesada del 154G12
227
Secuencia de nucleótidos correspondiente al dominio variable de la cadena ligera del 154G12
6
228
Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena ligera del 154G12
229
Secuencia de nucleótidos correspondiente al dominio variable de la cadena pesada del 154G12
230
Secuencia de aminoácidos del dominio variable de la cadena pesada del 154G12
233
Cebador 1015
234
Cebador 1020
235
Cebador 1321
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Cebador 1582
240
Cebador 1730
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Cebador 1732
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Cebador 1733
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Cebador 1734
245
Cebador 1735
246
Cebador 1736
247
Cebador 1737
252
Secuencia de nucleótidos correspondiente a la región FWR1 de la cadena pesada del 154G12
253
Secuencia de nucleótidos correspondiente a la región CDR1 de la cadena pesada del 154G12
254
Secuencia de nucleótidos correspondiente a la región FWR2 de la cadena pesada del 154G12
255
Secuencia de nucleótidos correspondiente a la región CDR2 de la cadena pesada del 154G12
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Secuencia de nucleótidos correspondiente a la región FWR3 de la cadena pesada del 154G12
257
Secuencia de nucleótidos correspondiente a la región CDR3 de la cadena pesada del 154G12
258
Secuencia de nucleótidos correspondiente a la región FWR1 de la cadena ligera del 154G12
259
Secuencia de nucleótidos correspondiente a la región CDR1 de la cadena ligera del 154G12
260
Secuencia de nucleótidos correspondiente a la región FWR2 de la cadena ligera del 154G12
261
Secuencia de nucleótidos correspondiente a la región CDR2 de la cadena ligera del 154G12
262
Secuencia de nucleótidos correspondiente a la región FWR3 de la cadena ligera del 154G12
263
Secuencia de nucleótidos correspondiente a la región CDR3 de la cadena ligera del 154G12
264
Cebador 1577
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Cebador 1584
[0022] En la especificación y en las reivindicaciones se usan diversos términos relacionados con los procedimientos y otros aspectos de la presente invención. A menos que se indique de otro modo, se debe dar a dichos términos el significado que tienen ordinariamente en este campo del conocimiento. Otros términos, definidos
5 específicamente, se deben entender de manera acorde con las definiciones de ellos que se proporcionan en el presente.
[0023] En esta invención se usan las siguientes abreviaturas: SEB, enterotoxina B estafilocócica; PBMC, células mononucleares de sangre periférica; BSA, seroalbúmina bovina; TT, toxoide tetánico; HEL, lisozima de
10 huevo de gallina; CAB, albúmina de embrión de pollo; BGG, gammaglobulina bovina; TCR, receptor de células T; CDR, región determinante de complementariedad; FWR, región de andamiaje (región “framework”).
[0024] Tal y como se usan en esta especificación y en las reivindicaciones anexas, las formas singulares “un”, “uno”, “una”, “el” y “la” engloban también las formas plurales, a menos que se desprenda de otro modo del
15 contenido. Por ejemplo, cuando aquí se hace referencia a “una célula”, ello comprende también una combinación de dos o más células, y así en otros casos en general.
[0025] En este contexto, el término “aproximadamente” (o “aproximado” o “alrededor de unos” o “en torno a”, etc.) se usa al hacer referencia a un valor medible como, por ejemplo, una cantidad, una duración en el tiempo, y
20 similares, y se debe entender que engloba variaciones del ±20% o del ±10%, más preferiblemente del ±5%, aún más preferiblemente del ±1%, e incluso más preferiblemente del ±0,1%, respecto del valor especificado, dado que tales variaciones resultan apropiadas para la puesta en práctica de los procedimientos aquí descritos.
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391
AGCGGATAACAATTTCACACAGG 2
883
TGGAAGAGGCACGTTCTTTTCTTT 3
974
AGGTRCAGCTGBWGSAGTCDG 4
975
GAHRTYSWGHTGACBCAGTCTCC
1463
GATCGAATTCTTAACACTCTCCCCTGTT GAAGCTCTTTGTGACGGGCGAGCTCAGGCC 6
882
GTCCACCTTGGTGTTGCTGGGCTT 7
885
TGAAGATTCTGTAGGGGCCACTGTCTT 8
888
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG 9
900
TCCTATGTGCTGACTCAGCCACC
1017
TGCAAGGTCTCCAACAAAGC 11
1018
CCTGGTTCTTGGTCAGCTCA 12
1019
GGCACGGTGGGCATGTGTGA 13
1024
ACCAAGGGCCCATCGGTCTT 14
1040
GCAACACCAAGGTGGACAAG
1500
GGTTCAGGGGGAGGTGTGGGAGGT 16
1550
GGGAAGCTTGCCGCCACCATGGGATGGAGCTGT ATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTG TACACAGCTCCTATGTGCTGACTCAGCCACC 17
1551
CCCGAATTCCTATGAAGATTCTGTAGGGGCCACTGTCTT 18
1552
GGGAAGCTTGCCGCCACCATGGGATGGAGCTG TATCATCCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGG TGTACACAGCGAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGG 19
1553
CCCGAATTCTCATTTACCCAGAGACAGGGAGAGGCTCTTCTG
1557
GGGAAGCTTGCCGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCAT CCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTACACAGCG ACATTGAGTTGACCCAGTCTCCA 22
1559
GGGAAGCTTGCCGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCAT CCTCTTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTACACAGCGT ACAGCTGTTGGAGTCTGGCGCA 23
1560
CCCTTCGAATTAATCACTCTCCCCTGTTGAAGCTCTTTG 24
1570
GGGAAGCTTGCCGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTC TTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTACACAGCGAGGTACAG CTGTTGGAGTCTGGCGCA
996
GATCGAATTCTCATTTCCCGGGAGACAGGGAGAGG 26
1015
GGTTCGCTTATTGGGGCCAA 233
1020
CGGTGTCTTCGGGTCTCAGG 234
1321
GGAGGGCAGTGTAGTCTGAG 235
21
1461
CCTCTACAAATGTGGTATGGCTGATTATG 236
1530
GGGAACGGTGCATTGGAACG 237
1577
CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTC TTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCSAGGTRCAGC TGBWGSAGTCDG 264
1578
CCCAAGCTTGCCGCCACCATGGGATGGAGCTGTATCATCCTC TTCTTGGTAGCAACAGCTACAGGTGTCCACTCCGAHRTYSWG HTGACBCAGTCTCC 238
1582
CCCGAATTCTCATGAAGATTCTGTAGGGGCCACTGTCTT 239
1584
CCCGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTCTTC 265
1730
ACGCCGTCCACGTACCAATT 240
1731
AAGCCCTTCACCAGACAGGT 241
1732
TGGTGGACGTGTCCCACG 242
1733
GGAAGGGCCCTTGGTGGA 243
1734
ACCGTGGCCGCTCCTTCC 244
1735
TGCAGGGCGTTGTCCACC 245
1736
AGGCCGCTCCCTCCGTGA 246
1737
TTCACAGGGGAGGAGTCAG 247
En esta tabla, R = A o G; B = C o G o T; W = A o T; S = C o G; D = A o G o T; H = A o C o T; Y = C o T.
[0117] Los productos de la PCR resultantes se clonaron en el vector pCR4-TOPO (Invitrogen), se transformaron en células Mach1 de E. coli, se emplacaron en placas de ágar con medio LB y kanamicina, y se seleccionaron con arreglo a su resistencia a la kanamicina. Se cribaron las colonias, seleccionándose insertos,
5 usando los cebadores N.º 1578 (SEC N.º ID: 238) y N.º 1582 (SEC N.º ID: 239) para la cadena ligera, y N.º 1584 (SEC N.º ID: 265) y N.º 1577 (SEC N.º ID: 264) para la cadena pesada (Tabla 4). Se usaron cuatro colonias positivas en cada caso, a fin de generar ADN plantilla para la determinación de las secuencias de ADN, usando el reactivo TempliPhi (GE Healthcare).
10 [0118] Los insertos de ADN correspondientes a la cadena ligera se secuenciaron con los cebadores N.º 1321 (SEC N.º ID: 235), 1461 (SEC N.º ID: 236), 1500 (SEC N.º ID: 16), 1551 (SEC N.º ID: 18) y 1552 (SEC N.º ID: 19) (Tabla 4), usando el reactivo DTCS (Beckman Coulter) de secuenciación; después, se adquirieron y analizaron los datos en un Beckman Coulter CEQ2000. Se secuenció el ADNc correspondiente a la cadena pesada de longitud completa del 154G12, con los cebadores N.º 996 (SEC N.º ID: 26), 1015 (SEC N.º ID: 233), 1017 (SEC N.º ID: 11),
15 1018 (SEC N.º ID: 12), 1019 (SEC N.º ID: 13), 1020 (SEC N.º ID: 234), 1040 (SEC N.º ID: 15) y 1530 (SEC N.º ID: 237) (Tabla 4), usando el ADN plantilla generado mediante el reactivo TempliPhi.
[0119] Las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes al anticuerpo y de aminoácidos del anticuerpo se proporcionan en las Figuras 2A-2D; en ellas, las regiones en negrita de las secuencias indican las CDRs, el
20 segmento subrayado denota una secuencia líder añadida mediante PCR, y las regiones sombreadas indican el dominio variable. Las regiones en negrita de las secuencias indican las CDRs. Las Figuras 3A-3D proporcionan las secuencias de ácidos nucleicos correspondientes a las regiones CDR y FWR del anticuerpo y las secuencias de aminoácidos de las regiones CDR y FWR del anticuerpo.
25 EJEMPLO 4
Desarrollo de los anticuerpos IgG plenamente humanos anti-SEB, con codones optimizados, 79G9, 100C9 y 154G12 (los anticuerpos 79G9 y 100C9 no forman parte de la invención)
30 [0120] Se remitieron a Gene Art AG (Regensburg, Alemania) los marcos de lectura abiertos completos
22
imagen17

Claims (1)

  1. imagen1
ES08712978.9T 2007-01-03 2008-01-03 Anticuerpos de alta afinidad que neutralizan la enterotoxina B estafilocócica Active ES2619943T3 (es)

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US88327107P 2007-01-03 2007-01-03
US883271P 2007-01-03
US88840507P 2007-02-06 2007-02-06
US888405P 2007-02-06
PCT/US2008/000104 WO2008085878A2 (en) 2007-01-03 2008-01-03 High affinity antibodies that neutralize staphylcoccus enterotoxin b

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ES08712978.9T Active ES2619943T3 (es) 2007-01-03 2008-01-03 Anticuerpos de alta afinidad que neutralizan la enterotoxina B estafilocócica

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