ES2612690T3 - Marcador de cáncer y diana terapéutica - Google Patents

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Abstract

Un método para predecir si un tumor sólido o no hematológico que expresa receptor de quimiocinas CCR4 será susceptible a un tratamiento anticanceroso, que comprende la etapa de medir la cantidad y/o la actividad del ligando de CCR4 CCL17 en una muestra de dicho tumor tomada del paciente, comparar la cantidad y/o actividad de CCL17 en dicha muestra tumoral con una cantidad y/o nivel de referencia de la actividad de CCL17 medido en, o predeterminado de, una o más muestras no tumorales y predecir si dicho tumor será susceptible a un tratamiento anticanceroso, en el que una cantidad y/o actividad aumentada de CCL17 en comparación con la cantidad y/o actividad de referencia es indicativa de un tumor que será susceptible de un tratamiento anticanceroso, y en el que dicho tumor se selecciona de cáncer del cuello uterino, esofágico, bronquial, nasofaríngeo, laríngeo, cutáneo, cerebral, pancreático, de cuello, de riñón, hepático, de mama, de vejiga, de estómago, ovárico, de célula germinal y de próstata.

Description

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(A)
Sumario del porcentaje de muestras que expresan ARNm del receptor de quimiocinas CC y CXC en tejido del cuello uterino no neoplásico (barras de color blanco) y maligno (barras de color negro) después del análisis de protección de ribonucleasa (RPA) para la expresión de ARNm.
(B)
RPA de muestras de tejido no neoplásico 1 a 14 y tejidos malignos: Biopsias de adenocarcinoma, muestras 1 a 4 y biopsias de carcinoma de células escamosas (SCC), muestras 1 a 11. Las fases de los tejidos de adenocarcinoma fueron: 1 a 3, 1 B1; 4, 1 B2. Las fases de SCC fueron: 1, 1 A2; 2 a 8-11, 1 B1; 9, 1 B2 y 10, 2A.
(C)
Regulación al alza de la expresión del gen de CCR4 en compartimentos epiteliales y estromales cuando se comparan con sus homólogos no neoplásicos. La expresión de ARNm en el tejido del cuello uterino no neoplásico se utilizó como un punto de partida para comparar el ARNm de tejido maligno y se representa como valor "1".
Figura 2 -Inmunohistoquímica para CCR4 durante la progresión maligna del cuello uterino. Expresión de la proteína CCR4 en el estroma de (A) tejido del cuello uterino no neoplásico, 200x, (B) CIN 200x;
(C)
tejido del cuello uterino invasivo, 200x. Expresión de la proteína CD68+ en (D) normal, 400x: (E) CIN, 200x: y
(F)
cáncer del cuello uterino invasivo, 400x. Tinción de proteínas FoxP3+ en (G) del tejido del cuello uterino no neoplásico, 200x; (H) CIN, 400x; e (I) cáncer del cuello uterino invasivo, 400x. Expresión de proteína CCR4 epitelial en (J) no neoplásico, 200x; (K) CIN, 400x y (L) cáncer del cuello uterino invasivo, 400x.
Figura 3 -Puntuación inmunohistoquímica para células positivas para CCR4, CD68 y FoxP3 durante la progresión maligna del cuello uterino
(A) Puntuación total para la tinción de células epiteliales (barras de color negro) y células del estroma (barras de color blanco) para CCR4, calculada por la "positividad" X "intensidad" en normal (n = 23), CIN (n = 63) y SCC (n = 45), cáncer recurrente (n = 15), metástasis de ganglios linfáticos (n = 10) y adenocarcinoma (n = 10). (B) Puntuación media de CD68+ (+ET) de la infiltración intra-y peritumoral de macrófagos en normal (n = 11), CIN (n = 16), adenocarcinomas (n = 16), cáncer recurrente (n = 24) y depósitos metastásicos en ganglios linfáticos (n = 11); **p < 0,001, *p < 0,005. (C) Puntuación media para FoxP3+ (+ET) de la infiltración intra-y peritumoral de células Treg en normal (n = 11), CIN (n = 16), SCC (n = 44), adenocarcinomas (n = 16), cánceres recurrentes (n = 24) y depósitos metastásicos en ganglios linfáticos (n = 11), *p < 0,01. (D) Puntuación total para CCR4 en células epiteliales (barras de color negro) y células del estroma (barras de color blanco) calculada por "positividad" X "intensidad" en CIN I (n = 26), CIN II (n = 19) y CIN III (n = 17).
Figura 4 -Expresión de ARNm y proteína del ligando de CCR4 CCL22 en cuello uterino normal, CIN y SCC
(A) Niveles de expresión de ARNm de CCL22 evaluados mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real en biopsias de cuello uterino normales (n = 14) y SCC (n = 11) (P = 0,43). Expresión de la proteína CCL22 en (B) tejidos del cuello uterino no neoplásico, 200x; (C) CIN, 200x y (D) SCC, 200x. (E) Puntuación total de CCL22 de células epiteliales (barras de color negro) y células del estroma (barras de color blanco) calculada mediante "Positividad X Intensidad" en muestras del cuello uterino normal (n = 16), CIN (n = 17), SCC (n = 19) y adenocarcinomas (n = 5).
Figura 5 -Expresión de ARNm y proteína del ligando de CCR4 CCL17 en cuello uterino normal, CIN y SCC
(A) Niveles de expresión de ARNm de CCL17 evaluados mediante RT-PCR cuantitativa en tiempo real en biopsias del cuello uterino normal (n = 7), en comparación con SCC (n = 11) (P = 0,02). Expresión de la proteína CCL17 en (B) no neoplásico, 200x; (C) CIN, 200x y (D) SCC, 200x. (E) Puntuación total de CCL17 de células epiteliales (barras de color negro) y células del estroma (barras de color blanco) calculada mediante "positividad X intensidad" en muestras del cuello uterino normal (n = 21), CIN (n = 33), SCC (n = 20) y adenocarcinomas (n = 4).
Figura 6 -CCR4 es funcional en la línea celular de cáncer del cuello uterino C-41
(A) Se midió la expresión de las proteínas CCR4, CCL17 y CCL22 (líneas de color azul) en la línea celular de cáncer del cuello uterino C-41 mediante el uso de citometría de flujo. Se examinó la expresión/internalización de CCR4 por C-41 después de la estimulación con 100 ng/ml de (B) CCL17 y (C) CCL22 (la línea de color azul representa el control de CCR4 a los 0 minutos; la línea de color naranja indica la expresión de la proteína CCR4 después de la estimulación con el ligando apropiado). (D) Migración de células de cáncer del cuello uterino C-41 en respuesta a CCL17 y CCL22. Los valores son la media ± DT de 10 determinaciones, * P < 0,05, ** P < 0,01. (E y F) crecimiento de C-41 en condiciones subóptimas después de la estimulación con 1 ng/ml, 10 ng/ml y 100 ng/ml de CCL17 y CCL22 durante 2, 4 y 6 días. Después de 6 días C-41 mostró un aumento significativo del crecimiento después de la estimulación con 10 ng/ml de CCL17; (P = 0,017) y 100 ng/ml de CCL17 (P = 0,044), pero no con 1 ng/ml de CCL17 (P = 0,383). La estimulación con 1 ng/ml de CCL22 y 100 ng/ml de CCL22 también mostró aumento significativo del crecimiento: 1 ng/ml de CCL22; (P = 0,026) y 100 ng/ml de CCL22 (p = 0,043), pero no con 10 ng/ml de CCL22 (P = 0,195).
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Figura 7 -Expresión de CCR4 en carcinogénesis de esófago Expresión de CCR4 en células epiteliales normales (A, x40; D, x40), hiperplásicas (B, x100), displásicas (C, x40; D, x40) de esófago y células cancerosas invasivas (H, x200). Expresión de CCR4 en el estroma durante la carcinogénesis de esófago: E, esófago normal (x200); F, displasia I (x200); G, displasia III (x200); H, cáncer invasivo (x200).
Figura 8 -Resultados de la puntuación inmunohistoquímica de células del estroma positivas para CCR4 durante la progresión maligna del cuello uterino La puntuación se evaluó mediante el número de células positivas para CCR4 y mediante la intensidad de la tinción de CCR4. El número de células se midió como la media de 15 HPF: 0 = sin expresión de proteína CCR4; +1 = 1-10 células positivas para CCR4 por HPF; +2 = 10-20 células positivas por HPF; +3 (21-30 células por HPF); +4 (>30 células). La intensidad se midió como: 0 = sin expresión; 1+ = expresión leve, 2++ = expresión moderada; 3+++ = expresión fuerte.
Figura 9 -Resultados de puntuación inmunohistoquímica de células epiteliales positivas para CCR4 durante la progresión maligna del cuello uterino La puntuación se evaluó mediante el número de células positivas para CCR4 y mediante la intensidad de la tinción de CCR4. 0 = sin expresión de la proteína CCR4 en las células epiteliales; +1 = menos de 25 % de la sección tiene expresión de CCR4; +2 = 26-50 % de células positivas; +3 = 51-75 % de células positivas; +4 más de 76 % de células positivas para CCR4. La intensidad se mide como: 0 = sin expresión; 1+ = expresión leve, 2++ = expresión moderada; 3+++ = expresión fuerte.
Figura 10 -Resultados del escrutinio para determinar la expresión de CCR4 en una gama más amplia de tumores utilizando una biblioteca de ADNc derivada de tejidos humanos (Cancer Research UK). La biblioteca contiene ADNc generado a partir de ARN aislado de 5-10 muestras tumorales y 2-5 muestras normales de 11 tipos de tumores diferentes: de pulmón, colon, vejiga, estómago, páncreas, piel, mama, cerebro, esófago, ovario y próstata. Los niveles de expresión de ARNm de CCR4 se midieron utilizando RT-PCR cuantitativa en tiempo real.
La Figura 11 muestra los resultados del análisis FACS para la expresión de CCR4 en líneas de células del cuello uterino (C41, C33A) y líneas celulares de cáncer renal (786, A498, CAKI). Línea discontinua: anticuerpo control de isotipo coincidente; línea de color gris: expresión de CCR4.
La Figura 12 muestra los resultados del análisis FACS de la expresión de CCR4 en células C41 después de 24 h de estimulación con IL-10, TGF-β y FGF. Línea discontinua: control de isotipo; línea de color gris: expresión de CCR4; línea en negrita: expresión de CCR4 después de la estimulación de citocinas.
La Figura 13 muestra una secuencia de ADNc de CCR4. Este es el SEQ ID NO: 1 referido en la presente memoria.
Descripción Detallada de la Invención
Los autores de la presente invención han descubierto que la expresión del receptor de quimiocinas CCR4 es un evento temprano en la carcinogénesis en ciertos tipos de tumores. La expresión epitelial de un receptor para las quimiocinas homeostáticas generalmente presentes en un tejido puede conferir una ventaja de supervivencia en la célula iniciada.
El receptor de quimiocinas CCR4 estuvo presente en las lesiones no invasivas displásicas del cuello uterino y el esófago. Esto fue particularmente sorprendente en algunas de las muestras de cáncer de esófago donde las zonas displásicas positivas para CCR4 se observaron claramente adyacentes a las zonas epiteliales normales en la misma sección (p. ej., Figura 7C y D).
El receptor de quimiocina CCR4 aumentó con la progresión maligna del cuello uterino. Esto no solamente se debió al aumento de la infiltración de macrófagos positivos para CCR4 y las células Treg, sino también a la adquisición de la expresión de CCR4 por las células epiteliales. Un hallazgo inesperado fue que CCR4 se expresaba fuertemente en células epiteliales no invasivas en lesiones intraepiteliales (CIN) así como en células cancerosas invasivas. La progresión de CIN a enfermedad invasiva se asoció con un aumento de expresión en células del estroma de los ligandos de CCR4 CCL17 y 22 y estas quimiocinas estimularon el crecimiento y la migración de una línea celular de cáncer del cuello uterino positiva para CCR4 (p. ej., Figura 4 y Figura 6). También se detectó CCR4 en células displásicas así como epiteliales invasivas en el cáncer de esófago, de nuevo con aumento de los niveles de CCL17 y CCL22 durante la progresión maligna. Los cambios en los gradientes de CCL17 y 22 ayudan a la transición de enfermedad pre-invasiva a invasiva y atraen leucocitos promotores de tumores que ayudan a las células iniciadas a evadir la vigilancia inmunitaria.
Las dos quimiocinas de unión a CCR4, CCL17 y CCL22, también se encontraron en la superficie de los vasos sanguíneos y linfáticos en las biopsias de tumores. No fue posible cuantificar esto, pero observaciones preliminares
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indican un aumento en la intensidad de la tinción con la progresión maligna.
Otro elemento del sistema de CCR4 es el receptor D6 de quimiocinas no señalizador que tiene una alta afinidad para CCL17 y CCL22 [18]; se esperaría que su presencia en los tejidos influyera en los gradientes de estas quimiocinas [19].
La Figura 6 muestra que el receptor CCR4 es funcional en la línea celular de cáncer del cuello uterino C-41. CCR4 puede ser regulado al alza por el microambiente. Las células positivas y negativas para CCR4 se expusieron a varias citocinas (TNF-α, TGF-β, IFN-γ, IL-4 e IL-10) que se sabe que están presentes en el microambiente del cuello uterino y para las cuales era probable que estuvieran presentes los receptores en las células tumorales. Ninguna de estas influyó en la expresión de CCR4. Sin embargo, los niveles de ARNm de CCR4, pero no los niveles de proteína, fueron regulados al alza por medio del cultivo simultáneo de células C-41 con los macrófagos.
CCR4 y D6 se localizan en el cromosoma 3p cerca de donde se cree que se localizan los genes supresores de tumores de cáncer del cuello uterino críticos con aberraciones complejas (pérdida de heterocigosidad, homocigosidad y amplificación génica) referidas [25, 26, 27]. Aunque ni CCR4 ni D6 están implicados directamente en estos cambios [26], las alteraciones genéticas próximas pueden tener impacto en su regulación.
Las células B inmortalizadas con EBV secretan CCL22, así como CCL3 y CCL4 [28]. La expresión estable del oncogén de EBV LMP1 también indujo CCL17 y CCL22 en una línea de células B y la expresión de CCL17 y CCL22 inducida por LMP1 fue regulada por NF-kB. Se sugirió que la inducción de estas dos quimiocinas por EBV ayuda a las células malignas evadir la vigilancia inmunitaria mediante la atracción de las células Th2 y Treg. Otros cambios oncogénicos pueden inducir la producción de CCL17 y CCL22 por las células epiteliales.
Los autores de la presente invención llevaron a cabo la cuantificación detallada de dos componentes del producto infiltrado mononuclear en el cáncer del cuello uterino, específicamente macrófagos CD68 + y Treg FoxP3+. La densidad de células infiltrantes positivas para CCR4 aumenta en CIN en comparación con el cuello uterino normal y aumenta adicionalmente tanto en SCC como en adenocarcinomas. Los macrófagos CD68+ siguen el mismo patrón, y los autores de la presente memoria encontraron que estos eran positivos para CCR4. La intercomunicación entre los macrófagos y las células malignas es fundamental en todas las fases de la progresión del cáncer, influyendo en la supervivencia de las células malignas, ayudando al interruptor angiogénico, polarizando leucocitos y ayudando a la invasión de células malignas [29,30,31]. En los cánceres del cuello uterino y de esófago, las quimiocinas CCL17 y CCL22 juegan un papel en el reclutamiento de macrófagos mientras que en otros tipos de cáncer, por ejemplo cáncer de ovario, quimiocinas tales como CCL2 son críticas [32].
CCL17 y CCL22 también son importantes en el reclutamiento de Treg que aumentan de manera paralela a las células CD68+ en las biopsias del cuello uterino. El reclutamiento de las células Treg a las lesiones premalignas y malignas fomenta privilegio inmunitario. Por ejemplo, en el linfoma de Hodgkin, LH, las células malignas están rodeadas por un gran número de linfocitos CCR4+ FoxP3+ [33]. Estas células, reclutadas por las células LH malignas, crean un ambiente favorable para que las células malignas escapen del sistema inmunitario del hospedador. Los autores de la presente invención creen que este es también el caso del cáncer del cuello uterino y de esófago. Por lo tanto no solamente los cambios en los gradientes de CCL17 y CLL22 fomentan directamente la supervivencia y diseminación de las células tumorales, sino que atraen a los leucocitos que también pueden proporcionar factores de supervivencia a las células del tumor y contribuir al privilegio inmunitario/inmunosupresión que impide respuestas del hospedador eficaces contra el tumor.
Estos datos demuestran que la presencia de CCR4 epitelial es a la vez un biomarcador altamente sensible y altamente específico para la neoplasia del cuello uterino tanto premaligna como maligna. El papel de la expresión de CCR4 en la progresión del cáncer del cuello uterino, hasta ahora, no está claro aunque los datos de los autores de la presente invención sugieren que CCR4 puede ofrecer protección a las células contra los estímulos apoptóticos dentro del entorno del tumor, además de ser necesario para la invasión por células tumorales de la membrana basal. Debido a su alta sensibilidad y selectividad, existe el potencial para que CCR4 sea utilizado como un biomarcador de diagnóstico para todas las etapas de cáncer del cuello uterino.
Posteriormente los autores de la presente invención también sometieron a ensayo la expresión de CCR4 en 31 muestras de tumores esofágicos, otro tipo de tumor que tiene una fuerte vinculación con la inflamación. Por medio de IHC encontraron que CCR4 no era detectable en cualquier tejido epitelial del esófago normal, pero estaba presente en las células epiteliales de todas las lesiones preinvasivas e invasivas. Debido a su alta sensibilidad y selectividad, existe el potencial para que CCR4 sea utilizado como un biomarcador de diagnóstico para todas las etapas de cáncer de esófago.
En resumen, el receptor de quimiocina CCR4 y sus ligandos aumentan durante la progresión maligna de los cánceres de cuello uterino, esófago, riñón, cerebro, ovario o mama. Los cambios en CCR4 y los gradientes de su ligando tienen varias implicaciones protumorales. En primer lugar la estimulación de CCR4 aumenta el crecimiento y la supervivencia de las células de cáncer de iniciadas e invasivas; en segundo lugar, los cambios en los gradientes de quimiocinas ayudan a la invasión de la membrana basal y el movimiento subsiguiente de las células malignas en
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los vasos sanguíneos o el sistema linfático. Finalmente CCL17 y CCL22 atraen los tipos de células, incluyendo macrófagos M2 y Treg FoxP3 que fomentan el crecimiento del tumor y permiten que las células iniciadas escapen a la vigilancia inmunitaria. CCR4 y sus ligandos pueden ser marcadores de diagnóstico y dianas terapéuticas útiles en las neoplasias epiteliales.
La invención se describe en parte a modo de trabajo experimental y ejemplos, en los que se emplearon los siguientes materiales y métodos:
Ejemplos
Muestras de tejido del cuello uterino y muestras de ensayo esofágicas
Para los estudios del ARNm, se obtuvieron quince biopsias de tumores de pacientes con cáncer del cuello uterino (11 de carcinoma de células escamosas, S1-S11, y 4 adenocarcinomas, A1-A4) y 14 muestras de tejido del cuello uterino no neoplásico (N1-N14) durante la cirugía y se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido. El diagnóstico fue realizado por el departamento de patología de Barts y The London NHS Trust. Las muestras de pacientes se dividieron de acuerdo con la clasificación de la FIGO (fase I, II, III, IV) y las biopsias de los tumores se clasificaron de acuerdo con el aumento del grado de atipia nuclear (1, 2, 3) o también, moderada o escasamente diferenciados.
Para la inmunohistoquímica, se obtuvieron muestras incluidas en parafina (n = 166) de 150 pacientes diferentes de Barts y The London NHS Trust y el Centro Clínico de Serbia, Belgrado. El acceso a muestras humanas nuevas e incluidas en parafina satisfizo los requisitos del East London and City Health Authority Research Ethics Subcommitee (LREC N.º T/02/046).
También se incluyeron en este trabajo muestras de ensayo resecadas de treinta y un pacientes con carcinoma esofágico escamoso primario. Estos pacientes eran de una zona de alto riesgo de carcinoma esofágico en la ciudad de Anyang, provincia de Henan, China. Todos los pacientes recibieron tratamiento quirúrgico en el Departamento de Cirugía del Hospital Central de Anyang. Ninguno de estos pacientes había sido sometido a quimioterapia, radioterapia o terapia inmunomoduladora antes de la cirugía. Se tomaron muestras de zonas macroscópicamente cancerosas y las zonas normales correspondientes del mismo paciente de cáncer. Los tejidos se fijaron en PBS que contenía 10 % de formalina tamponada neutra.
Extracción de ARN y Ensayo de protección contra ARNasa (RPA)
Se homogeneizaron biopsias de tejido del cuello uterino utilizando un molino enfriado con nitrógeno líquido 6750 (Glen Creston Ltd., Stanmore) y se solubilizaron en el Tri Reagent™ (Sigma, Poole, Reino Unido). El ARN extraído se trató con 10 unidades de ADNasa (Pharmacia, St Albans, Reino Unido) siguiendo las instrucciones del fabricante. El RPA se realizó utilizando conjuntos de moldes hCR5 y hCR6 RiboQuant® (BD Pharmingen, Oxford, Reino Unido) y UTP [α32p] (Amersham International plc, Aylesbury, Reino Unido). Se hicieron correr fragmentos protegidos contra ARNasa en un gel de secuenciación de acrilamida-urea (BioRad Laboratories Ltd, Hemel Hempstead, Reino Unido), se adsorbieron sobre papel de filtro y se secaron al vacío. La autorradiografía se realizó utilizando película Kodak Biomax MS con una pantalla amplificadora Transcreen LE (Sigma).
Microdisección y Matriz génica
Se cortaron tejidos del cuello uterino incluidos en parafina en condiciones libres de ARNasa y se montaron en portaobjetos con membrana PALM® tratados con UV (PALM, Microlaser Technologies, Alemania). Estos se desparafinizaron a continuación en xileno y se rehidrataron por medio de alcoholes graduados. Las muestras se tiñeron durante 1 min con una disolución de hematoxilina de Mayer, se deshidrataron y se secaron al aire antes de su procesamiento. Las secciones se microdisecaron con láser siguiendo el protocolo del fabricante. En resumen, las áreas de interés se microdisecaron con láser y se lanzaron a una tapa de microcentrífuga que contenía tampón de Proteína Quinasa (PK). Se capturaron aproximadamente 500-5000 células en cada sesión. Las células microdisecadas por medio de láser se disolvieron en 100 µl de Tampón de PK mezclado con 5 µl de PK. A continuación, se extrajo el ARN total utilizando el kit de aislamiento de ARN en bloque de parafina (1902, Ambion, Estados Unidos) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc se amplificó como se ha descrito anteriormente y se analizó utilizando tarjetas microfluídicas de matrices génicas diseñadas a medida (PE Applied Biosystems) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El perfil de expresión génica de los genes individuales en siete muestras de tumor del cuello uterino se comparó con cinco muestras del cuello uterino normales. Los niveles de expresión génica en las muestras de células epiteliales o estromales normales se utilizaron como un valor inicial de "1" y se compararon con el valor medio de cualquiera de las células epiteliales tumorales o las células estromales tumorales, respectivamente. Las muestras de tumor microdisecadas por medio de láser se componían de una muestra de la fase 1A2 y 2B, y cinco de la fase 1B1.
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Inmunohistoquímica
Se tiñeron secciones incluidas en parafina (4 µm) para determinar CCR4, CCL17 y CCL22. En resumen, las secciones se separaron de la cera en xileno y se deshidrataron a través de un gradiente de etanol. Tras el lavado con PBS el antígeno se expuso utilizando Disolución de Recuperación de la Diana (S1700, DAKO) a 95°C durante 20 min o Disolución Desenmascaradora de Antígeno (H-3300, Vector) durante 9 min en un microondas. Las secciones se bloquearon con suero de conejo o de cabra normal durante 30 min y se incubaron durante la noche a 4 °C con el anticuerpo primario: CCR4 (1:300, ab1669, AbCam, Cambridge), CCL17 (01:50, ab9816-50, AbCam, Cambridge) y CCL22 (1:20, 500-P107, Peprotech). Después de la incubación con un anticuerpo secundario biotinilado (anti-IgG de cabra o conejo, 1:200, Vector) durante 30 min a temperatura ambiente, los antígenos se revelaron con 3,3'-diaminobencidina (DAB, Sigma). Los portaobjetos se contratiñeron a continuación con hematoxilina, se deshidrataron y se montaron. Se utilizó la omisión del anticuerpo primario como control negativo. Para comprobar la especificidad del anticuerpo contra CCR4, se transfectaron algunas células negativas para CCR4 con ADNc para este receptor de quimiocinas. El anticuerpo contra CCR4 detectó proteína de superficie solamente en las células transfectadas con éxito.
Tinción doble, CD68, FoxP3, SR-A: Métodos de puntuación y categorías
Para la evaluación de la expresión de CCR4, CCL17 y CCL22 en las células epiteliales no malignas y malignas, cada muestra se evaluó semi-cuantitativamente con el siguiente sistema de puntuación: 0 (sin expresión de la proteína positiva), +1 (<25 % de la sección transversal de promedio tiene expresión positiva), +2 (26-50 %), +3 (5175 %), +4 (>76 %). La intensidad de las células positivas se analizó de la siguiente manera: 0 (sin expresión), 1 (expresión leve), 2 (expresión moderada), 3 (expresión fuerte). La puntuación de la expresión de CCR4, CCL17 y CCL22 en el estroma tumoral (células infiltrantes intratumorales) y la frontera invasiva del tumor (células infiltrantes peritumorales) se realizó basándose en el método de la 'media del recorrido' [43]. Se evitaron las áreas necróticas. Se contaron un total de 15 campos de alta potencia (aumento X400). Se establecieron cinco escalas de la siguiente manera: 0 = ninguna expresión de la proteína CCR4; +1 = 1-10 células positivas para CCR4 por HPF; +2 = 10-20 células positivas por HPF; +3 (21-30 células por HPF); +4 (>30 células). El resultado global de la tinción se obtuvo mediante el cálculo del "porcentaje" X "intensidad". La puntuación IHC en tumores y células infiltrantes fue realizada por un patólogo certificado por el colegio de médicos (YW).
Cultivo de línea celular de cáncer del cuello uterino
La línea celular de cáncer del cuello uterino C-41 (ATCC, Rockville, MD, Estados Unidos) se cultivó en medio DMEM con un suplemento de FCS al 10 %. En algunos experimentos las células se estimularon con 1, 10, 100 o 1000 ng/ml de CCL17 o CCL22 (PeproTech, Londres, Reino Unido). La proliferación y la migración se evaluaron utilizando los métodos descritos anteriormente [11].
Análisis estadístico
La significación estadística se evaluó utilizando la prueba de t para muestras no relacionadas con la corrección de Welch (soporte lógico Instat, San Diego, CA). Un valor de p < 0,05 se consideró significativo.
Experimento 1-Ensayo de protección contra ribonucleasa para receptores de quimiocinas
Se utilizaron ensayos de protección contra ribonucleasa (RPA) para escrutar 13 ARNm de receptores de quimiocinas en biopsias frescas congeladas de tejido del cuello uterino humano. Como se puede observar a partir del gráfico de resumen en la Figura 1A, se encontró una gama de ARNm de los receptores de quimiocinas en extractos de tejido del cuello uterino con algunas diferencias discretas entre biopsias no neoplásicas y malignas. De particular interés fue el receptor de quimiocinas CCR4, que estaba presente en el cuello uterino maligno pero no en extractos de biopsias no neoplásicas del cuello uterino (Figura 1B).
Puesto que se examinaba la expresión del receptor de quimiocinas en extractos de tejidos completos que contenían una población mixta de células del estroma y células epiteliales, los autores de la presente memoria investigaron a continuación la fuente celular del ARNm de CCR4. El ARNm se extrajo de zonas de células estromales y epiteliales de biopsias del cuello uterino normales y malignas microdisecadas con láser, y se utilizó RT-PCR semicuantitativa en Tiempo Real para analizar la expresión de CCR4 con ARNr 18S como control. Como se muestra en la Figura 1C, el ARNm de CCR4 se reguló al alza en las zonas del estroma de tejidos malignos cuando estos se compararon con sus homólogos no neoplásicos. Además, y de forma inesperada, el ARNm de CCR4 también se reguló al alza en extractos de las zonas de células epiteliales malignas en comparación con el epitelio normal.
Para investigar adicionalmente estas observaciones referentes al ARNm de CCR4, los autores de la presente memoria tiñeron una cohorte de biopsias para determinar CCR4 mediante inmunohistoquímica, IHC. Los autores de la presente memoria evaluaron la expresión de la proteína CCR4 en 166 muestras de tejidos del cuello uterino incluidos en parafina de 150 pacientes diferentes: no neoplásicas, n = 23; CIN I, n = 30; CIN II, n = 17; CIN III, n = 16; SCC, n = 45; tumor recurrente, n = 15; metástasis en ganglio linfático (mets GL), n = 10; adenocarcinoma, n =
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10. Tanto los leucocitos como las células epiteliales expresan la proteína CCR4. Para cuantificar los resultados de los autores de la presente memoria, una puntuación IHC se calculó multiplicando la "positividad" e "intensidad" (véase la descripción de los métodos y las Figuras 8 y 9 para más detalles).
Experimento 2 -La proteína CCR4 se encuentra en leucocitos infiltrantes en biopsias del cuello uterino humanas.
Como se muestra en la Figura 2 (A-C), los leucocitos en las zonas del estroma de las biopsias se tiñeron positivas para CCR4. La puntuación IHC para la positividad de CCR4 en las zonas del estroma se resume en la Figura 3A (barras de color blanco). Los tejidos no neoplásicos fueron negativos para los leucocitos CCR4 (Figuras 2A, 3A). Hubo más células del estroma que expresaban CCR4 en las muestras de CIN (Figura 2B, 3A) y esto aumentó adicionalmente en las muestras del cuello uterino neoplásicas invasivas (Figura 2C, 3A). La intensidad de la expresión de CCR4 en los leucocitos infiltrantes también aumentó con la progresión maligna. En los tejidos no neoplásicos esta fue leve; la intensidad fue de moderada a fuerte en CIN y adenocarcinomas, y la intensidad fue fuerte en SCC invasivo, tumores recurrentes y metástasis en los ganglios linfáticos (Figura 8).
El estroma consiste en diversos tipos de células, y se llevaron a cabo ensayos para determinar cuáles de las células infiltrantes contribuían a la expresión de CCR4. Puesto que los macrófagos y las células Treg expresan CCR4, la expresión de la proteína CCR4 se examinó en estos dos tipos de células y también se contó el número de macrófagos CD68+ y células Treg FoxP3+ en las biopsias de tejido.
Experimento 3 -Los macrófagos positivos para CCR4 y las células Treg aumentan con la progresión maligna.
El número de macrófagos CD68+ y Treg FoxP3+ aumentó con la progresión maligna del cuello uterino. Como se muestra en la Figura 2D-I hubo pocas células CD68 y FoxP3 en las biopsias del cuello uterino normal, pero el número aumentó en CIN y ambos tipos de células fueron prominentes en los cánceres invasivos.
El número de células CD68+ y FoxP3+ se contó a continuación en las biopsias 122 y 33 respectivamente. Como se muestra en la Figura 3B hubo un aumento significativo (p<0,001) de células CD68+ en las lesiones CIN en comparación con el cuello uterino normal. El número de células CD68+ en 13 se incrementó adicionalmente en SCC, adenocarcinoma, cánceres recurrentes y metástasis en ganglios linfáticos (p<0,001, y para mets GL P<0,05, en comparación con el cuello uterino normal). Se produjo un aumento similar en células FoxP3+ con progresión maligna mostrando el SCC, los adenocarcinomas y las metástasis en ganglios linfáticos aumentos significativos en el producto infiltrado de FoxP3+ en comparación con cuello uterino normal (p<0,01).
Para estudiar el fenotipo de las células que expresan CCR4 infiltrantes, se realizó una evaluación de la expresión en la superficie celular de CCR4 por los macrófagos y Treg utilizando tinción inmunohistoquímica doble para CD68 y FoxP3. Esto confirmó que las células CD68+ y FoxP3+ también expresan la proteína CCR4 (datos no mostrados). También se tiñó un subconjunto de 33 tejidos incluidos en parafina para determinar la proteína del receptor eliminador A (SR-A) (no neoplásico = 10, CIN = 10, SCC = 10, adenocarcinoma = 3). El SR-A es un marcador de superficie celular para macrófagos activados alternativamente M2 [12]. El SR-A no se pudo detectar en las células del estroma en las lesiones no neoplásicas, pero en CIN y cáncer invasivo, una proporción de las células CD-68+ expresaron SR-A (datos no mostrados).
Estos estudios muestran, en primer lugar, que la progresión maligna del cuello uterino se asocia con un aumento en el número de macrófagos CD68+ y células Treg FoxP3+. Estas células podrían proporcionar los factores de crecimiento pro-tumorales para las células malignas y también ayudar a crear un microentorno inmunosupresor que ayudaría a las células transformadas a evadir la vigilancia inmunitaria. En segundo lugar, estos resultados mostraron que la observación original de un aumento del ARNm de CCR4 en cáncer del cuello uterino maligno en comparación con el normal fue debido, al menos en parte, a un aumento del producto infiltrado de leucocitos que expresan CCR4, incluyendo macrófagos y células Treg.
Sin embargo, el resultado de la microdisección por láser mostró que el ARNm de CCR4 también se incrementó en las zonas epiteliales de los tumores, y cuando se evaluó la proteína CCR4 en leucocitos infiltrantes, resultó evidente que el receptor de quimiocinas también estaba presente en algunas células epiteliales (véase la Figura 2B y C). Esto fue inesperado y justificó una investigación adicional.
Experimento 4 -Las células epiteliales en las biopsias del cuello uterino también expresan CCR4
En las biopsias del cuello uterino no neoplásicas, las células epiteliales normales no expresaron CCR4 (Figura 2A). Sin embargo las células epiteliales en más de 90 % de los casos de CIN expresaron CCR4 (Figura 2B y 2E). 96 % de las muestras de SCC tenía células epiteliales positivas para CCR4 (Figura 2C y 2F) y las células epiteliales de 90 % de las muestras de adenocarcinoma fueron positivas para CCR4 (Figura 2G). Las células epiteliales malignas en todos los tumores recurrentes y metástasis de ganglios linfáticos expresaron la proteína CCR4. Los detalles completos de los resultados de IHC para la proteína CCR4 sobre las células epiteliales se muestran en la figura 9 y se resumen en la Figura 2D (barras de color negro). La expresión de CCR4 no se limitó a una minoría de células epiteliales. Las Figuras 2E-G y 9 muestran que la mayoría de las células epiteliales malignas en las biopsias del
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1000 ng/ml (P = 0,0348). Las células C-41 mostraron aumento de la proliferación después de la estimulación con 10 ng/ml (P = 0,017) o 100 ng/ml (P = 0,044) de CCL17. 1 ng/ml de CCL22; (P = 0,026), 100 ng/ml de CCL22 (P = 0,043), pero no 10 ng/ml de CCL22 (P = 0,195), también estimularon el crecimiento de células C-41 (Figura 5C y D). CCR4 fue por lo tanto funcional en esta línea celular de cáncer del cuello uterino, lo que sugiere que también puede ser funcional in vivo.
Experimento 9 -CCR4 se expresa en células epiteliales y estromales durante la progresión maligna del esófago
No se sabía si la expresión de CCR4 y los cambios en el ligando de quimiocina eran específicos del cáncer del cuello uterino o si se observaron en algunos otros tumores malignos epiteliales que tuvieran un vínculo con la inflamación. El cáncer de esófago es un cáncer epitelial en el que los ejemplos de todas las fases de la progresión neoplásica se pueden obtener fácilmente, a menudo de forma simultánea a partir del mismo paciente. La expresión de CCR4 fue examinada en 31 muestras de pacientes con cáncer de esófago. En 27 de los casos, todas las fases de la carcinogénesis del esófago: normal, hiperplasia, displasia, carcinoma in situ y cáncer invasivo, estaban presentes en las biopsias del mismo paciente. Cuatro de los 31 casos tenían lesiones pre-invasivas, sin zonas de cáncer invasivo. Como se muestra en la Figura 7A, no hubo expresión de CCR4 detectable en células epiteliales normales de esófago, aparte de unas pocas células positivas para CCR4 alrededor de la capa basal del epitelio hiperplásico (Figura 7B). En 30 de 31 casos la proteína CCR4 estuvo presente en las células epiteliales en todas las fases de las lesiones pre-invasivas (Figura 7C, D), en las que la intensidad y el porcentaje de células que expresan CCR4 en lesiones displásicas fue mucho mayor que en las células epiteliales hiperplásicas. Las células epiteliales en el cáncer invasivo fueron también positivas para CCR4 (Figura 7H). En algunos lugares, hubo una transición abrupta entre la mucosa normal y anormal (Fig. 7C, D). Resulta más interesante que hubo altos niveles de expresión de CCR4 en las células displásicas, pero las células en las capas superficiales, y la mucosa normal adyacente fueron negativas. Las células positivas para CCR4 también estuvieron presentes en el estroma, siendo el patrón el mismo que en el cáncer del cuello uterino. Como se muestra en la Figura 7E, hubo pocas células positivas para CCR4 en la submucosa normal; con la progresión maligna, hubo más células positivas para CCR4 que se infiltraban en el estroma (Figura 7F-H).
Experimento 10 -CCL17 y CCL22 en biopsias esofágicas
Se utilizó IHC para evaluar la expresión de CCL17 y CCL22 en 23 de las muestras de esófago en las que estaban presentes todas las etapas de la carcinogénesis en cada muestra. CCL17 estuvo generalmente ausente tanto en las zonas epiteliales como estromales de los tejidos normales, aunque hubo unas pocas células positivas para CCL17 en el estroma y una minoría de áreas hiperplásicas. El número de muestras que continúan siendo células epiteliales
o estromales positivas para CCL17 aumentó en la displasia y fue más alto en zonas invasivas mostrando 10/23 de estas alguna positividad para CCL17. De particular interés fue la fuerte inmunorreactividad de CCL17 en las células endoteliales o los vasos sanguíneos/linfáticos en la submucosa del epitelio displásico pero no normal.
De manera similar a lo observado en el cáncer del cuello uterino, los niveles de positividad estromal para CCL22 también aumentaron con la progresión maligna. Solo 1/23 muestras mostraron células positivas para CCL22 en el estroma de las zonas normales, pero en las zonas displásicas y las zonas invasivas 20/23 y 18/23 muestras contenían respectivamente células positivas para CCL22 en el estroma. La positividad para CCL22 de las células del estroma aumentó con el grado de displasia. Ocho de 23 muestras de displasia I tenían células positivas para CCL22 en el estroma, lo que aumentó a 19 de 23 muestras de displasia II y 20/23 muestras de displasia III. Hubo una diferencia entre el epitelio del cuello uterino y de esófago ya que CCL22 no se detectó en el epitelio normal aunque se ha informado de que está presente en el epitelio intestinal normal [15]. La expresión de CCL22 epitelial aumentó con la progresión maligna del esófago; 0/23 muestras fueron positivas en las zonas normales, 2/23 hiperplasias, 7/23 displasias y 14/23 zonas invasivas tenían células epiteliales positivas para CCL22. Finalmente, más células endoteliales de los vasos sanguíneos dentro del estroma de los tejidos de cáncer invasivos fueron positivas para la tinción de CCL22 en comparación con el epitelio normal y displásico.
Experimento 11 -Resultados de un escrutinio para determinar la expresión de CCR4 en una gama más amplia de tumores
Se utilizó una biblioteca de ADNc tumoral (Cancer Research UK) que contenía los ADNc generados a partir de ARN aislado de 5-10 muestras de tumor y 2-5 muestras normales para 11 tipos de tumores diferentes: pulmón, colon, vejiga, estómago, páncreas, piel, mama, cerebro, esófago, ovario y próstata. Los niveles de expresión de ARNm de CCR4 se midieron utilizando RT-PCR cuantitativa en tiempo real.
Los niveles de ARNm de CCR4 fueron significativamente elevados en los cánceres del cuello uterino, esófago, riñón, cerebro, mama y ovario.
Experimento 12 -Análisis de la expresión de CCR4 en líneas celulares de cáncer del cuello uterino y renales
La Figura 11 muestra los resultados del análisis de Clasificación Celular Activada por Fluorescencia (FACS) de líneas celulares del cuello uterino (C41, C33A) y de cáncer renal utilizando un anticuerpo anti-CCR4 para detectar la
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