ES2611485T3 - Uso de sustancias naturales como aditivos para piensos para animales del género equidae - Google Patents

Abstract

Una composición que comprende una cantidad efectiva de una mezcla de compuestos activos naturales, en donde dicha mezcla comprende guayacol, cúrcuma y timol, para usarse en estabilizar el pH intestinal en un nivel > 6,3 en caballos, y en donde el timol, la cúrcuma y el guayacol se usan en unas cantidades suficientes para proporcionar una dosificación diaria de 0,25 mg por 1 mg de timol y de cúrcuma y de 0,1 mg a 0,5 mg de guayacol por kg de peso corporal del individuo al que ella se ha de administrar.

Description

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DESCRIPCION

Uso de sustancias naturales como aditivos para piensos para animales del genero equidae

El presente invento se refiere al uso de compuestos activos naturales de guayacol, curcuma y timol en la produccion de una dieta para caballos.

Mas particularmente, el invento se refiere al uso de los tres compuestos que se han definido mas arriba para el mejoramiento de la digestibilidad de la dieta, una estabilidad intestinal mejorada, una mejor ingestion del pienso (un apetito mejorado) y un mejor bienestar, y para estabilizar o modular la microflora intestinal del animal.

Ademas, el presente invento se refiere a una nueva composicion de pienso para animales del genero equidae, cuya composicion comprende los tres compuestos activos de guayacol, curcuma y timol.

El termino dieta, pienso o composicion de pienso significa cualquier compuesto, preparado, mezcla o composicion que se adecue, o se destine a una ingestion por el animal.

El genero equidae abarca a los caballos. A diferencia de un rumiante, la capacidad intestinal de estos animales en relacion con su tamano corporal es pequena. Esto requiere que el animal tenga que consumir pequenas cantidades de pienso a intervalos relativamente frecuentes.

A causa de la ingestion continua de pequenas cantidades de pienso, los caballos tienen - en el estado natural - un flujo relativamente constante de substrato disponible para bacterias del intestino posterior, que permite una digestion adaptada natural del pienso. Sin embargo, dentro de practicas pecuarias corrientes, esto con frecuencia no se da el caso. En vez de ello, los animales consumen una porcion significativa de su dieta a lo largo de un breve penodo de tiempo. Especialmente los caballos de alto rendimiento, tales como por ejemplo los caballos de carreras, son alimentados con una dieta que es rica en hidratos de carbono para obtener una energfa aumentada en un penodo de tiempo muy breve, preferiblemente ad libitum.

Estos metodos de alimentacion no naturales dan como resultado un movimiento erratico de la ingesta a traves del tracto gastrointestinal. Una parte mayoritaria de la dieta llega con frecuencia al intestino posterior relativamente sin degradar. Esto permite una fermentacion bacteriana que provoca un significativo cambio en el pH intestinal, a saber desde un pH de 7 hasta un pH en el intestino ciego de < 6,5, lo cual, a su vez, da como resultado unas fluctuaciones en la especie y en las densidades de las poblaciones bacterianas colonicas. Esta desestabilizacion del intestino esta asociada principalmente con una perdida de apetito, que puede ser observada por una actividad de masticacion reducida y, en una etapa posterior, por graves enfermedades metabolicas, tales como por ejemplo un colico, un colapso, una azoturia y otros problemas digestivos relacionados.

Actualmente no se conoce ninguna manera de controlar el pH intestinal, ni de estimular o modificar unas poblaciones bacterianas intestinales en los caballos, aparte de la metodologfa de alimentacion y el uso restrictivo de ciertos ingredientes.

Por lo tanto existe una necesidad de una composicion de pienso para usarse en la alimentacion pecuaria que impida un colico, un colapso y otros trastornos digestivos y que se pueda administrar al animal con el fin de estimular el apetito asf como los movimientos de las mandfbulas y las velocidades de masticacion.

A la vista de las deficiencias de la tecnica anterior, que mas arriba se han descrito, y otras metas relacionadas bien conocidas en la especialidad, un objeto del presente invento es proporcionar un aditivo para piensos que estimule la digestibilidad de la dieta, la estabilidad intestinal, la ingestion de pienso, el apetito del animal y que estabilice o module a la microflora intestinal del animal.

Otro objeto del presente invento es proporcionar un aditivo para piensos que estabilice el pH intestinal, preferiblemente mantenga al pH en un nivel > 6,3 con el objetivo espedfico de mantener el pH intestinal en unos niveles que impidan la formacion de enfermedades asociadas con unos intervalos de pH mas pequenos que 6,3.

Este y otros objetos pueden resultar mas evidentes a un experto en la especialidad despues de repasar la materia objetivo de este invento, como se detalla aqrn.

Los inventores de la presente solicitud encontraron sorprendentemente que los compuestos que mas arriba se han descrito, especialmente unas combinaciones de los mismos, tienen un gran potencial para usarse en piensos para caballos, p.ej. para mejorar la digestibilidad de la dieta, la estabilidad intestinal, la ingestion del pienso, el apetito y para modular la microflora intestinal del animal.

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El termino "intestino", tal como se utiliza en el presente contexto, designa el tracto gastrointestinal o digestivo (tambien citado como el canal alimentario) y se refiere al sistema de organos dentro de animales multicelulares que recibe el alimento, lo digiere para extraer energfa y nutrientes y expulsa el material de desecho remanente.

El termino "microflora" intestinal, tal como se usa en el presente contexto, se refiere a los cultivos microbianos naturales que residen en el intestino y mantienen la salud ayudando a una apropiada digestion

El termino "modula" o "estimula" tal como se usa en el presente contexto en conexion con la microflora intestinal significa generalmente cambiar, manipular, alterar o ajustar la funcion o el estado de la misma en un animal sano y que funciona normalmente, es decir un uso no terapeutico.

En un segundo aspecto, el presente invento proporciona una composicion de pienso para caballos que comprende los tres compuestos activos de guayacol, curcuma y timol.

El presente invento proporciona tambien un metodo de alimentar a animales con los tres compuestos que se han definido mas arriba para el mejoramiento de la digestibilidad de la dieta, conseguir una estabilidad intestinal mejorada, una mejor ingestion del pienso y un mejor bienestar y para estabilizar o modular la microflora intestinal del animal.

Los compuestos de acuerdo con el invento estan disponibles comercialmente o se pueden preparar con facilidad por una persona experta usando procedimientos y metodos bien conocidos en la tecnica anterior.

Los compuestos del invento se pueden usar en la forma de extractos o mezclas de extractos naturales disponibles o en la forma de una sustancia natural.

El termino "extracto", tal como se usa en el presente contexto, incluye unas composiciones obtenidas mediante una extraccion con disolventes (que tambien se conocen como "aceites extrafdos"), una destilacion con vapor de agua (que se conocen tambien como "aceites esenciales") u otros metodos conocidos por una persona experta. Unos apropiados disolventes para la extraccion incluyen unos alcoholes tales como etanol.

Por la expresion "natural" y "sustancia natural" se entiende en este contexto una sustancia que se compone de compuestos que se presentan en la naturaleza y se obtienen a partir de productos naturales o por medio de una smtesis.

Al (a los) compuesto(s) activos o a la(s) mezcla(s) de los mismos o a una sustancia natural o a un extracto se les pueden anadir otros ingredientes activos en cantidades minoritarias. Ejemplos de tales ingredientes son: capsaicina, tanino, piperina, caravacrol, trimetilamina, 3,4, xilenol, alcohol furfunlico, propilideno, butilideno, ftalidas, gingerol, aceite de lavanda; deca-, undeca-, dodecalactonas, iononas, irona, resorcinol, aceite de menta piperita, alfa-pineno; limoneno, anetol, linalool, dihidrojasmonato de metilo; carvacrol, acido propionico, acetico o butmco, aceite de romero, aceite de clavo, geraniol, terpineol, citronelol; los salicilatos de amilo y/o de bencilo, cinamaldetudo, vainillina, un polifenol vegetal (tanino) y mezclas de los mismos.

Si se prefiere una mezcla de los tres compuestos que se han especificado mas arriba, se usan curcuma y/o timol como un componente principal de la mezcla, es decir una composicion de pienso para caballos. Apropiadamente, la mezcla contiene 10-40 % en peso de timol y/o curcuma, 5-30 % en peso de guayacol y opcionalmente 2-15 % en peso de 3-metil-fenol y/o eugenol y/o eucaliptol y/o L-mentol, en donde las cantidades se calculan con relacion a la cantidad total de dichos componentes. La cantidad total de estos ingredientes activos puede variar dentro de amplios lfmites, pero finalmente se usan en el pienso para caballos de 1 a 500 ppm (partes por millon), preferiblemente entre 5 y 150 ppm, calculadas con respecto al peso en seco del pienso para caballos.

En un ejemplo preferido, la composicion comprende los tres compuestos curcuma, timol y guayacol como componentes principales de la mezcla. Apropiadamente, la mezcla contiene 25-35 % en peso de timol, 20-30 % en peso de curcuma, 15-25 % en peso de guayacol y opcionalmente 5-10 % en peso de 3-metil-fenol y/o eugenol y/o eucaliptol y/o L-mentol y 1-5 % en peso de piperina.

Todos los compuestos que se han definido aqrn anteriormente (compuestos activos e ingredientes adicionales) se pueden usar en la alimentacion de animales en forma de una composicion de pienso. En dicha composicion de pienso los compuestos se pueden usar en combinacion con un compuesto tensioactivo emulsionante. El agente emulsionante se puede seleccionar ventajosamente entre los que tienen una naturaleza bastante hidrofila, por ejemplo entre esteres de poligliceroles de acidos grasos tales como acido ricinoleico esterificado o esteres de propilen glicol de acidos grasos, esteres sacaricos o gliceridos sacaricos, un poli(etilen glicol), lecitina, etc.

Otra caractenstica de la composicion de pienso puede consistir en que los compuestos de aceites esenciales presentes en la composicion son adsorbidos sobre un vetuculo vegetal y/o mineral, en donde el vetuculo mineral se

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selecciona por ejemplo entre el conjunto que se compone de dioxido de silicio, los silicatos de aluminio y de magnesio y en donde el vetuculo vegetal se selecciona por ejemplo entre el conjunto que se compone de fibras, tales como por ejemplo fibras de madera, semolina de trigo y derivados lacteos.

La incorporacion de la composicion de pienso que contiene el (los) compuesto(s) activo(s) dentro de un pienso final para animales, por ejemplo un pienso para caballos, se puede llevar a cabo preparando una premezcla de los ingredientes activos y otros aditivos apropiados. Dicha premezcla puede comprender 2-10 % en peso de la mezcla activa o sustancia o extracto natural, 0-40 % en peso de otros aditivos convencionales, tales como aromatizantes, y 50-98 % en peso de cualquier soporte absorbente convencional.

El soporte puede contener por ejemplo 40-50 % en peso de fibras de madera, 8-10 % en peso de estearina, 4-5 % en peso de polvo de curcuma, 4-5 % en peso de polvo de romero, 22-28 % en peso de piedra caliza, 1-3 % en peso de una goma, tal como goma arabiga, 5-50 % en peso de azucares y/o almidones y 5-15 % en peso de agua.

Esta premezcla es mezclada luego con vitaminas, sales minerales y otros ingredientes aditivos para piensos y finalmente se anade luego al pienso en unas cantidades tales que este pienso contendra finalmente 1-500 ppm, preferiblemente 100-400 ppm o 150-300 ppm de la mezcla de ingredientes activos de acuerdo con el invento.

Unos ejemplos de dosificaciones particularmente preferidas de, por ejemplo, los tres compuestos timol, curcuma y guayacol en un pienso final para caballos estan independientemente unos de otros en los siguientes intervalos: timol entre 30 y 150 ppm, preferiblemente entre 50 y 100 ppm; curcuma entre 20 y 100 ppm, preferiblemente entre 30 y 80 ppm; guayacol entre 10 y 80 ppm, preferiblemente entre 25 y 60 ppm.

Otros opcionales ingredientes aditivos para piensos son agentes colorantes, p.ej. carotenoides tales como beta- caroteno, astaxantina y lutema; compuestos de aroma (aromaticos), estabilizadores, peptidos antimicrobianos; acidos grasos poliinsaturados; y/o por lo menos una enzima seleccionada entre fitasa (Ec 3.1.3.8 o 3.1.3.26); xilanasa (EC 3.21.8); galactanasa (EC 3.2.1.89); alfa-galactosidasa (EC 3.2.1.22); una proteasa (EC 3.4.), fosfolipasa A1 (EC 3.1.1.32); fosfolipasa A2 (EC 3.1.1.4); lisofosfolipasa (EC 3.1.1.5); fosfolipasa C (EC 3.1.4.3); fosfolipasa D (EC 3.1.4.4); una amilasa tal como, por ejemplo, alfa-amilasa (EC 3.2.1.1); y/o beta-glucanasa (EC 3.2.1.4 o EC 3.2.1.6).

Ejemplos de acidos grasos poliinsaturados son unos acidos grasos poliinsaturados de C18, C20 y C22 tales como acido araquidonico, acido docosahexaenoico, acido eicosapentaenoico y acido gamma-linoleico.

El termino "pienso para caballos", tal como se usa en presente contexto, incluye una composicion de pienso de acuerdo con el invento y los componentes que se han descrito mas arriba. Tfpicamente, un pienso para caballos incluye una harina para caballos como un componente. Apropiadamente, el pienso para caballos esta en la forma de escamas o granulos, por ejemplo granulos extrudidos.

Un pienso para caballos tiene una composicion aproximada de 8-20 % en peso de protemas, y 3-15 % en peso de humedad. Unos caballos de alto rendimiento viven en unas condiciones que estan caracterizadas por una alta necesidad de energfa. Por ejemplo, un tfpico pienso para caballos, concretamente para caballos de carreras, comprende una cantidad aumentada de un almidon rico en energfa, por ejemplo almidon de mafz. La utilizacion del almidon disminuye notablemente cuando la ingestion aumenta por debajo de los niveles de mantenimiento puesto que el caballo tiene una fuente limitada de enzimas, especialmente amilasas, que son capaces de reducir al almidon. Estos metodos de alimentacion no naturales dan como resultado problemas, como se ha debatido mas arriba.

Los inventores de la presente solicitud encontraron sorprendentemente que los compuestos que mas arriba se han definido, especialmente unas combinaciones de los mismos, tienen tambien un gran potencial para la estimulacion de enzimas digestivas, tales como por ejemplo amilasas producidas a partir tanto del pancreas como de la mucosa intestinal.

Por lo tanto, el invento se refiere tambien al uso de los tres compuestos que se han definido mas arriba para la estimulacion de enzimas digestivas, preferiblemente amilasas.

Otro objeto del presente invento es proporcionar unas amilasas alternativas, preferiblemente mejoradas, que se pueden usar en combinacion con los compuestos de aceites esenciales que mas arriba se han definido para mejorar la utilizacion de los piensos, es decir para degradar el almidon en el rumen, en los intestinos gruesos y/o en los intestinos delgados.

Por lo tanto el presente invento se refiere tambien al uso de los tres compuestos que se han definido mas arriba en combinacion con una amilasa en piensos para animales del genero equidae, tales como caballos, en particular para mejorar la degradacion de almidon. El invento se refiere ademas a unas composiciones tales como unos piensos y

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unos aditivos para piensos que comprenden una amilasa, por ejemplo una amilasa bacteriana, en combinacion con unos compuestos de aceites esenciales que se han definido mas arriba.

Las amilasas utiles de acuerdo con el invento pueden tener ademas, o de manera alternativa, propiedades mejoradas tales como el perfil de dosis y respuesta, el perfil de pH, la estabilidad en granulacion, la estabilidad en temperatura, la estabilidad de sales biliares, la estabilidad de proteasas y/o la estabilidad espedfica.

En el presente contexto, una amilasa es una enzima que cataliza la endo-hidrolisis de almidon y/o otros oligo- y polisacaridos lineales y ramificados. En una forma de realizacion particular, la amilasa destinada a su uso de acuerdo con el invento tiene una actividad de alfa-amilasa, es decir cataliza la endohidrolisis de enlaces 1,4-alfa- glucosfdicos en oligosacaridos y polisacaridos.

Las alfa-amilasas actuan p.ej. sobre almidon, glicogeno y polisacaridos y oligosacaridos relacionados de una manera aleatoria liberando grupos reductores en la configuracion alfa.

En una forma preferida de realizacion del invento es una alfa-amilasa (nombre sistematico: 1,4-alfa-D-glucano glucanohidrolasa). En otras formas de realizacion, la amilasa del invento pertenece al grupo de amilasas EC 3.2.1. tales como EC 3.2.11. (alfa-amilasa), EC 3.2.1.2 (beta-amilasa), EC 3.2.1.3 (1,4-alfa-glucosidasa, amiloglucosidasa o glucoamilasa), EC 3.2.1.20 (alfa-glucosidasa), EC 3.2.1.60 (glucano 1,4-alfa-maltotetraohidrolasa), EC 3.2.1.68 (isoamilasa), eC 3.2.1.98 (glucano 1,4-alfa-maltohexosidasa) o Ec 3.2.1.133 (glucano 1,4-alfa-maltohidrolasa).

En una forma preferida de realizacion la amilasa destinada a su uso de acuerdo con el invento puede ser, o es, clasificada como perteneciente al grupo EC 3.2.11. Los numeros EC se refieren a la Nomenclatura de Enzimas de 1992 de NC-IUBMb, Academic Press, San Diego, California, incluyendo los suplementos 1-5 publicados en Eur. J. Biochem. 1994, 223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995, 232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996, 237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997, 250, 1-6; y Eur. J. Biochem. 1999, 264, 610-650; respectivamente. La nomenclatura es suplementada y puesta al dfa regularmente, vease p.ej. en
http://www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme/index.html.

La actividad de amilasa se puede determinar mediante cualquier ensayo apropiado. Generalmente el pH del ensayo y la temperatura del ensayo se pueden adaptar a la enzima en cuestion. Ejemplos de valores del pH de ensayo son los pH 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 o 12. Ejemplos de temperaturas del ensayo son 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90 o 95°C. Unos valores del pH y unas temperaturas preferidos/as estan en la region fisiologica, tales como unos valores del pH de 3, 4, 5, 6, 7 o 8 y unas temperaturas de 30, 35, 37 o 40°C. Se puede usar el siguiente ensayo de amilasa: Substrato: tabletas de Phadebas (de Pharmacia Diagnostics; un polfmero de almidon reticulado, insoluble y coloreado de azul, que se mezcla con una albumina de suero bovino y una sustancia tamponadora y se fabrica en la forma de tabletas). Temperatura del ensayo: 37°C. Valor del pH del ensayo: 4,3 (o 7,0, si se desea). Tiempo de reaccion: 20 min. Despues de su suspension en agua, el almidon es hidrolizado por la alfa-amilasa proporcionando unos fragmentos solubles de color azul. La absorbencia de la resultante solucion de color azul, medida a 620 nm, es una funcion de la actividad de alfa-amilasa. Una Unidad de alfa-Amilasa Fungica (1 FAU) es la cantidad de enzima que descompone 5,26 g de almidon por hora en las condiciones normalizadas de ensayo. Un almidon preferido es Merck, Amylum solubile Erg. B. 6, Tanda 9947275. Una descripcion mas detallada del ensayo, APTSMYQI-3207, esta disponible a peticion en Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, dK-2880 Bagsvaerd, Dinamarca.

En una forma particular de realizacion, la amilasa, en la forma en la que ella es anadida al pienso, o cuando es incluida en un aditivo para pienso, esta bien definida. El concepto de “bien definida” significa que la preparacion de amilasa es pura en por lo menos un 50 % sobre una base de protema. En otras formas de realizacion particulares, la preparacion de amilasa es pura en por lo menos 60, 70, 80, 85, 88, 90, 92, 94 o en por lo menos 95 %. La pureza puede ser determinada por cualquier metodo conocido en la especialidad, p.ej. mediante una SDS-PAGE, o una cromatograffa de exclusion de tamanos (vease el Ejemplo 12 del documento WO 01/58275).

Un preparado de una amilasa bien definida es ventajoso. Por ejemplo, es mucho mas facil anadir dosificadamente de manera correcta al pienso una amilasa que esta esencialmente exenta de otras enzimas interferentes o contaminantes. El termino “anadir dosificadamente de manera correcta” se refiere en particular al objetivo de obtener unos resultados coherentes y constantes, y la capacidad de optimizar la dosificacion basandose en el efecto deseado.

Unos preparados de amilasas con unas purezas de este orden de magnitud son obtenibles en particular usando unos metodos recombinantes de produccion, mientras que ellos no se obtienen con tanta facilidad y tambien son susceptibles a una variacion mucho mayor de una tanda a otra tanda cuando se producen por metodos de fermentacion tradicionales.

El aislamiento, la purificacion y la concentracion de la amilasa del invento se pueden llevar a cabo por medios convencionales. Por ejemplo, ella se puede recuperar a partir de un caldo de fermentacion por procesos convencionales incluyendo, pero sin limitarse a, los de centrifugacion, filtracion, extraccion, secado por atomizacion,

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evaporacion o precipitacion, y se puede purificar ulteriormente por una diversidad de procesos conocidos en la especialidad, que incluyen, pero no se limitan a, procesos de cromatograffa (p.ej. de intercambio de iones, de afinidad, hidrofoba, cromatoenfoque y exclusion de tamanos), procesos electroforeticos (p.ej. enfoque isoelectrico preparativo), de solubilidad diferencial (p.ej. precipitacion con sulfato de amonio), SDS-PAGE, o extraccion (vease, p.ej. Protein Purification, J.-C. Janson y Lars Ryden, coordinadores de edicion, VCH Publishers, New York, 1989). La amilasa purificada puede ser formulada, tal como se conoce en la especialidad, en forma de un producto lfquido o solido que es apropiado para usarse en piensos para animales y/o aditivos para piensos para animales.

La amilasa bacteriana destinada a usarse de acuerdo con el invento es incluida en dietas para caballos o aditivos para piensos para caballos en una cantidad efectiva. Actualmente se considera que una cantidad efectiva esta por debajo de 1.000 mg de protema enzima por kg de materia seca de dieta (ppm), preferiblemente por debajo de 800, 600, 500, 400 o por debajo de 300 ppm. En una forma de realizacion preferida, la dosificacion de la amilasa esta por debajo de 200 mg de protema enzima por kg de materia seca de dieta, preferiblemente por debajo de 150, 100, 90, 80, 70, 60 o por debajo de 50 ppm. En una forma de realizacion incluso mas preferida, la dosificacion de la amilasa esta por debajo de 40, 35, 30, 25 o por debajo de 20 ppm. En una forma de realizacion sumamente preferida la dosificacion de la amilasa esta por debajo de 15, 12, 10, 9, 8 o por debajo de 7 mg de protema enzima por kg de materia seca de dieta Por otro lado, una cantidad efectiva puede estar por encima de 0,01 mg de protema de enzima por kg de materia seca de dieta, preferiblemente por encima de 0,05, 0,10, 0,15, 0,20, 0,25, 0,30, 0,35, 0,40, 0,45, 0,50, 0,75, 1, 2, 3 o por encima de 4 mg de protema enzima por kg de materia seca de dieta (ppm).. Correspondientemente, unos ejemplos no limitativos de intervalos de dosis preferidos son los de: 0,10-50 mg de protema enzima/kg, preferiblemente 0,50-10, 1-9, 2-8, 3-8 o 4-7 mg de protema enzima/kg. Ejemplos adicionales de intervalos de dosificacion preferidos, todos ellos en ppm, son los de: 1-35, 1-30, 2-25, 3-20 y 4-15.

Para determinar los mg de protema amilasa por kg de pienso, la amilasa es purificada a partir de la composicion de pienso y la actividad espedfica de la amilasa purificada es determinada usando el deseado ensayo de amilasa. La actividad de amilasa de la composicion de pienso es como tal se determina tambien usando el mismo ensayo y, sobre la base de estas dos determinaciones, se calcula la dosificacion en mg de protema enzima amilasa por kg de pienso.

Los mismos principios se aplican para determinar los mg de protema amilasa en aditivos para piensos. Desde luego, si esta disponible una muestra de la amilasa usada para preparar el aditivo para piensos o el pienso, la actividad espedfica se determina a partir de esta muestra (no hay necesidad de purificar la amilasa a partir de la composicion de pienso o del aditivo).

La amilasa destinada a usarse de acuerdo con el invento se deriva preferiblemente de una cepa de Bacillus, tal como cepas de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus circulans, Bacillus halmapalus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus sp., Bacillus stearothermophilus y Bacillus subtilis; preferiblemente a partir de cepas de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus halmapalus, Bacillus licheniformis, Bacillus sp., Bacillus subtilis y Bacillus stearothermophilus; mas preferiblemente a partir de cepas de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus halmapalus, Bacillus licheniformis, Bacillus sp. y Bacillus stearothermophilus; incluso mas preferiblemente a partir de Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus halmapalus, Bacillus sp. y Bacillus stearothermophilus; de manera sumamente preferible a partir de Bacillus stearothermophilus.

Ejemplos no limitativos de amilasas destinadas a usarse de acuerdo con el invento son las que se derivan de Bacillus licheniformis, tal como el nombre de entrada en Swissprot AMY_BACLI y el numero de acceso primario P06278; de Bacillus amyloliquefaciens, tal como el nombre de entrada en Swissprot AMY_BACAM y el numero de acceso primario P00692; de Bacillus megaterium, tal como el nombre de entrada en Swissprot AMY_BACME y el numero de acceso primario P20845; de Bacillus circulans, tal como el nombre de entrada en Swissprot AMY_BACCI y el numero de acceso primario P08137; de Bacillus stearothermophilus, tal como el nombre de entrada en Swissprot AMY_BACST y el numero de acceso primario P06279. Otro ejemplo se deriva de Bacillus subtilis, tal como el nombre de entrada en Swissprot AMY_BACSU y el numero de acceso primario P00691

Para las finalidades del presente invento, unas amilasas preferidas son las amilasas que estan contenidas en los siguientes productos comerciales: BAN, Stainzyme, Termamyl SC, Natalase y Duramyl (todos de Novozymes).

Otros ejemplos particulares de amilasas destinados a usarse de acuerdo con el invento son las amilasas contenidas en los productos comerciales Validase BAAy Validase HT (de Valley Research).

Todavfa otras ejemplos particulares adicionales de amilasas destinadas al uso de acuerdo con el invento son las amilasas contenidas en los siguientes productos comerciales: Clarase, DexLo, GC 262 SP, G-Zyme G990, G-Zyme G995, G-Zyme G997, G-Zyme G998, HTAA, Optimax 7525, Purastar OxAm, Purastar ST, Spezyme AA, Spezyme Alpha, Spezyme BBA, Spezyme Delta AA, Spezyme DBA, Spezyme Ethyl, Spezyme Fred (GC521), Spezyme HPA, Spezyme Extra y Ultraphlow (todos de Genencor); Validase HT340L, Valley Thin 340L (todos de Valley Research); Avizyme 1500, Dextro 300 L, Kleistase, Maltazyme, Maxamyl, Thermozyme, Thermatex, Starzyme HT 120 L, Starzyme Super Conc y Ultraphlo.

El invento descrito y reivindicado en el presente contexto no ha de ser limitado en su alcance por las formas de realizacion espedficas que aqu se describen, puesto que se pretende que estas formas de realizacion sirvan como ilustraciones de varios aspectos del invento. Se pretende que cualesquiera formas de realizacion equivalentes esten dentro del alcance de este invento. Desde luego, diversas modificaciones del invento, ademas de las mostradas y 5 descritas en el presente contexto, resultaran evidentes a los expertos en la especialidad a partir de la precedente descripcion. Se pretende que tambien dichas modificaciones caigan dentro del alcance de las reivindicaciones anejas.

Se pretende que el siguiente Ejemplo espedfico ilustre el invento.

Ejemplo 1: Pienso para caballos

10 Un pienso compuesto para caballos ("High Energy Musli, Eggersmann"), que contiene una mezcla de compuestos de acuerdo con el invento, se puede preparar mezclando conjuntamente los siguientes ingredientes usando un convencional aparato mezclador a la temperatura ambiente.

Ingrediente Cantidad (por kg)

Cebada (escamas) 356 g

Mafz 264 g

Harina de soja 87 g

Melaza 57g

Aceite 51 g

Mafz expandido 50 g

Guisantes (escamas) 44 g

Salvado de trigo 41 g

DCP 10 g

NaCl 6 g

MgO 2 g

Levadura de cerveza, secada 1 g

Residuos de cervecero 1 g

Premezcla de vitaminas y elementos traza 30 g

Timol 5 mg

Curcuma 2 mg

Guayacol 0,35 mg

Ejemplo 2: Efecto de compuestos de aceites esenciales sobre la palatabilidad, el pH cecal, los acidos grasos 15 volatiles cecales y las concentraciones de amoniaco y los numeros de protozoos cecales

Se realizo una prueba con tres caballos. Junto a un tratamiento testigo no suplementado se anadieron 312,5 mg de una composicion de pienso que comprendfa timol, curcuma y guayacol (citada aqrn abreviadamente por el nombre CRINA) se anadio a un kg de pienso.

La composicion CRINA comprende como ingredientes activos principales los siguientes compuestos, en donde estos 20 compuestos se mezclan sobre un vedculo vegetal y mineral que comprende fibras de vidrio, semolina de trigo y carbonato de calcio:

Composicion CRINA:

Ingredientes activos

%(p/p)

Timol

10 100 g/kg

Curcuma en polvo

8 80 g/kg

Guayacol

8 60 g/kg

Aplicacion en mg/dfa/100 kg corporal: 60

El estudio se realizo con 3 caballos castrados (trotones noruegos de sangre fna) con una edad de 8-11 anos y con unos pesos corporales de 530-560 kg en el establo experimental de la Universidad Noruega de Ciencias de la Vida, Aas, Noruega.

Los caballos se mantuvieron en los establos acomodados en lechos de virutas de madera y se ejercitaron 5 diariamente durante una hora en una maquina rotatoria de ejercicios al aire libre controlada por ordenador (0 27 m)

Hubo dos intensidades de ejercicio:

1. Intensidad de ejercicio 1: Paseo (40 minutos), trote lento (20 minutos).

2. Intensidad de ejercicio 2: Paseo (20 minutos), trote lento (20 minutos), medio galope (20 minutos)

3. Velocidad: Paseo (1,8 m/s), trote lento (3,5-4,0 m/s), medio galope (6,5 m/s).

10 Piensos y alimentacion

Las raciones diarias se compoman de heno de prado (principalmente hierba timotea) y ya sea cebada granulada con 3 % de melaza (dieta testigo) o bien cebada granulada con 3 % de melaza y 0,03125 % de CRINA (dieta experimental).

15

Tabla 1. Raciones diarias de heno y cebada granulada (kg).

Comida

Nivel de ejercicio 1 Nivel de ejercicio 2

Heno de prado

Cebada granuladaab Heno de prado Cebada granuladaab

Por la manana, 08:00 h

2 2,2 2 2,2

Por el mediodfa, 14:00 h

2 0 2 0,5

Por la noche, 19:00 h

3 0 3 0,5

a Dieta testigo: Cebada granulada sin CRINA. b Dieta CRINA: Cebada granulada con CRINA.

La cantidad de cebada granulada se habfa aumentado en el Nivel de ejercicio 2. Sin embargo, la comida por la manana era identica en ambos niveles de ejercicio. Un heno de prado de la misma cosecha se uso a lo largo de todo el experimento. (Analisis qmmico del heno: Materia seca (92,2%), Cenizas (5,25%), NDF (57,8%), N de Kjeldahl 20 (11,4%); El contenido de almidon de la cebada era de52,1%.)

Diseno experimental

El experimento se dividio en 4 periodos de acuerdo con la dieta y la intensidad de ejercicio (Tabla 2). Cada penodo constaba de un penodo de preparacion de 23 dfas antes del muestreo del fluido cecal en los dfas 24 y 27, y el registro del pH cecal en el dfa 28. Despues de un analisis qmmico, se calcularon las medias de los datos 25 procedentes de los dfas 24 y 27 y se usaron para el analisis estadfstico

Tabla 2. Tratamientos dieteticos e intensidades de ejercicio.

Dieta

Penodo

Intensidad de ejercicio Caballo 1 Caballo 2 Caballo 3

1

1

Testigo Experimental Testigo

2

1 Experimental Testigo Experimental

3

2 Testigo Experimental Testigo

4

2 Experimental Testigo Experimental

Analisis qmmico

La materia seca se determino en unas muestras secadas en horno a 103°C durante un mmimo de 16 horas. Las 30 cenizas y el N de Kjeldahl se determinaron de acuerdo con AOAC (1990). La NDF se determino tal como se describio por Goering y van Soest (1970) con la modificacion de que las muestras no fueron lavadas en acetona. Se uso el metodo de Mcleary y colaboradores (1994) para determinar el almidon sin ninguna correccion para azucar.

Los acidos volatiles en un lfquido cecal se determinaron por cromatograffa de gases por el Sistema Perkin-Elmer Auto (de Perkin-Elmer Inc., Norwalk, CT, EE.UU.) usando una columna ECONO-CapTM (Alltech Associates Inc.,

Deerfield, IL, EE.UU.). El nitrogeno de amomaco (NH3-N) en el fluido cecal se ensayo usando el proceso de Tingwall (1978) y el analizador por inyeccion de flujo FIA 5035 Spectrophotometer; Techato Ab, H0ganas, Suecia.

Medicion del pH: El pH se midio colocando un electrodo para pH directamente en el intestino ciego usando la fistula y los valores se registraron automaticamente cada 5 segundos (WTW-pH 340, Ehlert & Partner, Alemania).

5 Muestreo del contenido cecal: El contenido cecal se evacuo manualmente a traves de la fistula cecal antes de la comida mananera y 3 horas y 6 horas despues de la alimentacion. Se guardaron diez ml en unos tubos que conteman 1 ml de acido formico y se almacenaron a 4°C hasta el analisis de VFA.

Analisis estadistico

El analisis estadistico de la palatabilidad (tiempo hasta que se coman los concentrados despues de la comida 10 mananera) se realizo usando el proceso Proc Mixed de SAS (1998). La declaracion repetida se uso para indicar las variables (repetidas) dentro de un individuo (registros individuales diarios del tiempo de comer). En el modelo, los efectos fijados fueron un caballo y una dieta individuales. El tiempo (dfa) fue definido como “un efecto aleatorio”. La estructura de covarianza de las mediciones repetidas era una simetna compuesta (tipo = cs).

Los analisis estadfsticos de la VFA cecal se realizaron usando el proceso GLM de SAS (1998). Se calcularon las 15 medias para muestras procedentes de los dfas 24 y 27 en cada penodo, y se usaron para el analisis estadistico. El caballo, la dieta y la intensidad de ejercicio individuales se incluyeron en el modelo estadistico como efectos explicatorios. El efecto de la intensidad de ejercicio no era significativo y se elimino desde el modelo. Las medias fueron separadas de acuerdo con el ensayo de la diferencia significativa mmimo (LSD). Todos los resultados son presentados como LSMEANS para cada tratamiento. En el apendice los valores se dan como media ± desviacion 20 fipica.

Resultados

Palatabilidad

El tiempo que cada caballo necesitaba para comer la comida mananera de cebada granulada se registro durante 34 dfas consecutivos. No hubo ningun efecto de la intensidad de ejercicio, por lo que este efecto fue excluido desde el 25 modelo. Los caballos consuirnan la comida mananera de concentrados con mayor rapidez cuando se inclrna CRINA en la cebada granulada (16,9 min) en comparacion con el testigo sin CRINA (19,5 min) (p < 0,001). Los residuos de pienso se registraron en 7 ocasiones, seis veces con la dieta testigo y una vez con la dieta CRINA. Cuando los residuos fueron registrados en la dieta CRINA (0,1 kg) fue la primera vez que a un caballo se le ofrecio un pienso con CRINA.

30 Hubo tambien un efecto de un caballo individual (p < 0,001), pero no hubo ninguna interaccion entre un caballo y una dieta (Figura 1 y Tabla 3 - Tiempo consumido para comer la comida mananera de concentrados). El Caballo 2 tema la mas alta diferencia en cuanto al tiempo de comer entre la dieta testigo y la dieta CRINA. Este caballo podna ser caracterizado como un "comedor lento" y es en general un caballo dificil de alimentar puesto que el con frecuencia reacciona a nuevos piensos o cantidades de pienso dejando residuos. Hubo tambien una marcada diferencia entre 35 dietas para el Caballo 1 que podna ser caracterizado como un "caballo normal" cuando el viene a ingerir pienso. El Caballo 3, sin embargo, comena aproximadamente todo lo que se le ofreciese y nosotros podnamos ver una muy pequena diferencia en el tiempo consumido para comer las diferentes dietas. Incluso aunque hubiesen solamente tres caballos individuales en esta prueba era interesante observar que el efecto de CRINA sobre la palatabilidad (tiempo para comer) era mas pronunciado para el comedor lento que para el comedor rapido.

40

Tabla 3. Tiempo consumido en comer la comida mananera de concentrados (min).

Dieta

Testigo

CRINA

Media

20,3 ±8,2 16,0 ± 4,5

Caballo 1

15,7 ± 3,4 13,3 ± 1,0

Caballo 2

28,1 ± 7,3 22,8 ± 3,9

Caballo 3

14,1 ± 1,9 13,9 ± 0,9

De acuerdo con la bibliografia, el tiempo normal promedio para comer un kg de concentrado granulado es de aproximadamente 10 minutos para caballos grandes, pero con grandes variaciones individuales (Meyer, H., L. 45 Ahlswede y H. Reinhard, 1975. Untersuchungen uber Fressdauer, Kaufrequenz und Futterzerkleinerung beim Pferd.

5

10

15

20

25

30

Dtsch. Tieraztl. Wschr. 82, 54-58.). En el presente estudio, el caballo 1 y el caballo 3 son mas rapidos y el caballo 2 es mas lento en comparacion con estas figuras.

Valores de pH cecales

Registrando el valor del pH en el ciego cada 5 minutos durante 6 horas despues de la alimentacion se dio una buena imagen de los cambios en el pH cecal (Figura 2 - Valores del pH cecal).

El pH cecal estaba proximo a 7,0 al penodo de registro. A aproximadamente los 60 minutos despues de la alimentacion, los valores comenzaron a disminuir independientemente de la dieta. En la dieta CRINA los valores alcanzaron un mmimo de 6,35 a aproximadamente los 200 minutos y comenzaron a aumentar nuevamente a los 225 minutos. En el final del penodo de registro (335 minutos despues de la alimentacion) el valor del pH era de 6,6. En la dieta testigo, sin embargo, los valores se mantuvieron descendentes hasta que se alcanzaron los valores mas bajos (6,1) a los 280 minutos despues de la alimentacion. Despues de esto, los valores aumentaron hasta 6,2 hacia el final del penodo de registro. La Figura 2 muestra con claridad que la CRINA habfa afectado a los cambios en el pH cecal.

Acidos grasos volatiles

La cantidad de acidos grasos volatiles totales (VFA) en un fluido cecal no fue influenciada por la dieta. Los valores para la dieta testigo y la dieta CRINA fueron de 50,22 y 50,48 mmol/l, respectivamente (p=0,91) (Figura 3 - acidos grasos volatiles cecales totales (mmol/l) y Tabla 4).

Tabla 4. Concentraciones de VFA cecales totales y % molar de VFA y concentracion de nitrogeno de amoniaco cecal (media ± desviacion tipica).

Horas despues de la alimentacion

0

3 6 Media

VFA cecales totales, mmol/l: Dieta testigo Dieta CRINA Acetato, % molar: Dieta testigo Dieta CRINA Propionato, % molar: Dieta testigo Dieta CRINA Butirato, % molar: Dieta testigo Dieta CRINA

48,1 ± 13,5

51,3 ± 8,4 51,2 ± 9,6 50,2 ± 10,2

43,9 ± 5,6

48,6 ± 8,5 58,9 ± 9,4 50,5 ± 9,9

74,1 ± 2,3

73,6 ± 4,7 70,2 ± 5,2 72,6 ± 4,4

73,0 ± 1,7

69,7 ± 2,1 68,0 ± 2,2 70,2 ± 2,8

18,5 ± 3,0

15,9 ± 3,5 20,5 ± 4,6 18,3 ± 4,0

19,7 ± 1,3

19,8 ± 2,4 24,1 ± 1,9 21,2 ± 2,8

6,2 ± 0,6

7,8 ± 0,5 7,7 ± 0,8 7,2 ± 1,0

6,1 ± 0,7

6,7 ± 1,2 6,7 ± 1,3 6,5 ± 1,1

Sin embargo, los porcentajes molares de los diferentes VFA's fueron influenciados por la dieta.

Para la dieta testigo y la dieta CRINA los porcentajes molares de acetato fueron de 72,63 y 70,22, respectivamente (p < 0,001). Estas diferencias eran solamente significativas (p < 0,05) a las 3 horas despues de la alimentacion (Figura 4 - porcentaje molar de acetato cecal).

El porcentaje molar de propionato era mas bajo en la dieta testigo que en la dieta CRINA, 18,31 y 21,22, respectivamente (p < 0,003). Estas diferencias podnan observarse en los tiempos 0, 3 y 6 horas despues de la alimentacion y alcanzaron un nivel significativo en los tiempos 3 y 6 horas despues de la alimentacion (Figura 5 - porcentaje molar de propionato cecal).

El porcentaje molar de butirato era mas alto en la dieta testigo que en la dieta CRINA, 7,25 y 6,47, respectivamente (p < 0,01). Estas diferencias alcanzaron un nivel significativo en los tiempos de 3 y 6 horas despues de la alimentacion (p < 0,05)

(Figura 6 - porcentaje molar de butirato cecal).

10

15

Conclusiones

- La inclusion de CRINA en la cebada granulada mejoraba la palatabilidad medida como el tiempo consumido para comer la comida mananera de concentrados y tambien redujo las negativas.

- Los valores del pH cecal eran influenciados por la dieta. La cafda en el pH hasta 6 horas despues de la alimentacion era menor cuando los caballos se alimentaban con la dieta CRINA que cuando lo hadan con la dieta testigo.

- La concentracion de acidos grasos volatiles totales cecales no era influenciada por la dieta.

- El porcentaje molar de los acidos grasos volatiles cecales era influenciado por la dieta, puesto que las cantidades de acetato (C2) y de butirato (C4) fueron reducidas mientras que la cantidad de propionato (C3) aumentaba en la dieta CRINA.

El hecho de anadir CRINA a la cebada granulada (dieta CRINA) tema un efecto positivo sobre la palatabilidad medida como el tiempo consumido para comer la comida mananera de concentrado (p < 0,001). En la dieta CRINA, la cafda en los valores del pH cecal despues de la comida mananera era reducida. Habfa tambien un efecto de CRINA sobre los porcentajes molares de acidos grasos volatiles cecales (VFA), con una reduccion de las cantidades de acetato (p < 0,001) y de butirato (p < 0,01), y una proporciones aumentadas de piruvato (p < 0,003). La concentracion de VFA cecales totales no difiere entre dietas. No hubo ningun efecto de CRINA sobre la concentracion de amomaco cecal o la concentracion de protozoos en el fluido cecal. La intensidad de ejercicio no influye sobre ninguno de los parametros registrados.

Claims (2)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una composicion que comprende una cantidad efectiva de una mezcla de compuestos activos naturales, en donde dicha mezcla comprende guayacol, curcuma y timol, para usarse en estabilizar el pH intestinal en un nivel > 6,3 en caballos, y en donde el timol, la curcuma y el guayacol se usan en unas cantidades suficientes para

   5 proporcionar una dosificacion diaria de 0,25 mg por 1 mg de timol y de curcuma y de 0,1 mg a 0,5 mg de guayacol por kg de peso corporal del individuo al que ella se ha de administrar.
2. 2. Una composicion para el uso de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicha mezcla es combinada con una amilasa para mejorar la utilizacion del pienso, es decir para degradar el almidon en los intestinos gruesos y/o en los intestinos delgados.