ES2608814A1 - Método para la separación de la fracción unida a glucosaminoglicanos y sus aplicaciones - Google Patents

Método para la separación de la fracción unida a glucosaminoglicanos y sus aplicaciones Download PDF

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Abstract

Método para la separación de la fracción unida a glucosaminoglicanos y sus aplicaciones. La presente invención pertenece al campo de la glicobiología. En particular, se refiere a un método para la separación en muestras biológicas de la fracción unida o asociada a glucosaminoglicanos (GAG) sulfatados y sus aplicaciones en biomedicina, tales como la identificación del perfil de glicoproteínas o del perfil de lípidos unidos o asociados a GAG sulfatados, la detección de una alteración en el patrón de glicosilación por GAG sulfatados, la identificación de biomarcadores de diagnóstico, pronóstico, monitorización de la progresión de una enfermedad o del efecto de una terapia, o para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de una enfermedad. La invención se relaciona también con métodos para diagnosticar mucopolisacaridosis y para diagnosticar y determinar el pronóstico de enfermedad renal.

Description

MÉTODO PARA LA SEPARACIÓN DE LA FRACCIÓN UNIDA A GLUCOSAMINOGLICANOS Y SUS APLICACIONES
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención pertenece al campo de la glicobiología. En particular, se refiere a un método para la separación en muestras biológicas de la fracción unida o asociada a
10 glucosaminoglicanos sulfatados y sus aplicaciones en biomedicina.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
15 Los glucosaminoglicanos (GAG) son grandes polisacáridos no ramificados conformados por secuencias repetidas de disacáridos, donde uno de los componentes siempre es un aminoazúcar (D-galactosamina o D-glucosamina) y el otro componente es un ácido urónico, como el L-glucurónico o el L-idurónico, a excepción del queratán sulfato. Con excepción del ácido hialurónico, todos los GAG poseen grupos sulfato, como O-ésteres o N-sulfato.
20 Los GAG se encuentran formando parte de proteoglicanos y lípidos. Los proteoglicanos son un tipo específico de glicoproteínas que tienen al menos una cadena de GAG unida a la proteína, y que se clasifican en base a la cadena de GAG presente.
25 La glicosilación de moléculas es un proceso enzimático postraduccional llevado a cabo en el retículo endoplásmico y en el aparato de Golgi. Las reacciones de glicosilación son realizadas por enzimas llamadas glicosiltransferasas, a partir de precursores monosacáridos de origen endógeno y exógeno.
30 Existen enfermedades relacionadas con alteraciones congénitas de la glicosilación, tales como las mucopolisacaridosis (MPS). Las MPS son un grupo heterogéneo de errores innatos del metabolismo producidos por la deficiencia de alguna de las enzimas necesarias para la degradación de los GAG. Los GAG no degradados suelen ser excretados parcialmente en la orina, pero el resto permanecen acumulados en los lisosomas. Este
35 acúmulo es el que produce las alteraciones celulares e interferencias en otros procesos
metabólicos con consecuencias graves para el organismo humano, causando daño a nivel celular, tisular y de órgano.
Hasta el momento se han descrito 7 tipos de MPS con varios subtipos que involucran a unas 11 enzimas específicas. Cada tipo de MPS tiene síntomas y signos inespecíficos, y algunas alteraciones consideradas “características”, pero que aun así obligan a realizar el diagnóstico preciso de estas enfermedades utilizando la determinación de la actividad enzimática involucrada y, en el mejor de los casos, la identificación molecular del gen afectado. Suelen ser difíciles de detectar en el recién nacido, y un diagnóstico precoz y preciso de las MPS es crítico para proporcionar los cuidados paliativos apropiados y, cuando es posible, un tratamiento específico de la enfermedad (terapia de reemplazo enzimático, trasplante de células troncales hematopoyéticas, entre otras).
El diagnóstico de la mayoría de las MPS no es fácil y está basado principalmente en los hallazgos clínicos. Una vez establecida la sospecha, el médico puede contar con ciertas pruebas analíticas como el análisis de los GAG en la orina y la cuantificación de la actividad enzimática en tejidos (sangre o fibroblastos). Finalmente, puede encargar la realización de técnicas de biología molecular para confirmar la posible alteración genética.
Para la cuantificación de GAG totales en orina se han utilizado métodos colorimétricos, que miden la elevación de GAG comparados con los niveles de GAG esperados en individuos normales de la misma edad. Se han descrito varios ensayos en los que se utiliza azul de dimetilmetileno (DMB) como colorante. Los GAG se unen a DMB y el compuesto formado se detecta especrofotométricamente. No obstante, no se produce un aislamiento del complejo GAG-DMB formado (Whitley C.B. et al. 1989. Clin. Chem., 35(3):374-379; Jong J.G.N. et al. 1992. Clin. Chem., 38(6):803-807). Sin embargo, presentan un alto porcentaje de falsos positivos y falsos negativos y debido a su baja especificidad no permiten discriminar entre los diferentes tipos de GAG.
También se han desarrollado métodos de ensayo de GAG específicos, que tratan de identificar los tipos de GAG que son excretados en exceso y ayudar a un mejor diagnóstico, puesto que los diferentes tipos de MPS están asociados con el aumento en la excreción de GAG específicos. Entre estos destacan métodos cromatográficos, tales como HPLC, que aunque son sensibles y específicos no son adecuados para un cribaje masivo debido a su elevado precio y al tiempo de análisis requerido; métodos ELISA, que están disponibles comercialmente para algunos tipos de GAG, pero no se han desarrollado para la detección
de todos los GAG; y métodos de espectrometría de masas en tándem, que presentan el inconveniente de ser complejos debido a la heterogeneidad molecular de los GAG y de difícil aplicación para el cribado en masa.
Asimismo, se han desarrollado métodos basados en la despolimerización de los GAG, que miden los residuos de ácido hexurónico que todos los GAG tienen (excepto el queratán sulfato). Esta medición se hace directamente en el líquido de diálisis, tras el fraccionamiento de la muestra en una columna de celulosa ECTEOLA (que separa los GAG sulfatados de los no sulfatados), o después de precipitarla con bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB), cloruro de cetilpiridinio (CPC) o aminoacridina. Estos métodos consumen mucho tiempo y dan resultados poco reproducibles debido a la interferencia de otros cromógenos o a la pérdida de algunas fracciones de GAG en los tratamientos previos.
También existen enfermedades relacionadas con alteraciones adquiridas de la glicosilación, tales como la enfermedad renal. La enfermedad renal adquirida o congénita es un problema de salud pública de primera magnitud mundial. Un reciente estudio prospectivo realizado en Estados Unidos señala que el 54% de los adultos de entre 30-49 años, un 52% de los adultos de entre 50-64 años, y un 42% de los adultos de más de 65 años están afectados por enfermedad renal crónica y se prevé un incremento entre el 13,2% y el 14,4% en el 2020, y del 16,7% en el 2030. Su diagnóstico está basado en la medición de una serie de parámetros clínicos en orina (tasa de filtración glomerular o GFR calculada a través de los niveles de creatinina, cistatina C o inulina, proteinuria, hematuria, etc.), de técnicas de imagen (principalmente ultrasonidos, tomografía computarizada (TC) o resonancia magnética nuclear (RMN)), y de anatomía patológica (mediante biopsias obtenidas de manera invasiva). Todas ellas tienen un limitado poder de diagnóstico diferencial y ninguna es capaz de anticipar la evolución de la enfermedad renal en el tiempo de manera certera y eficiente. Estas herramientas tienen, además, una limitada especificidad y sensibilidad.
Por lo tanto, existe una necesidad de nuevos métodos de detección de las fracciones unidas
o asociadas a GAG que superen las desventajas de los métodos conocidos hasta ahora y que permitan un diagnóstico menos invasivo, rápido, sensible, fiable y barato en etapas tempranas de la enfermedad, que pueda ser utilizado para el cribado masivo en neonatos, y que permita detectar y/o pronosticar, entre otros, enfermedades tales como la MPS o la enfermedad renal.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Los autores de la presente invención han desarrollado un nuevo método para la separación de la fracción unida a glucosaminoglicanos (GAG) sulfatados en muestras biológicas. Este método permite el estudio de las alteraciones en la glicosilación de los GAG de una manera sencilla, rápida, económica y que requiere una cantidad muy pequeña de muestra (microlitros). Este método tiene numerosas aplicaciones en biomedicina, como el diagnóstico y pronóstico de enfermedades que cursan con alteraciones en los niveles de GAG, la búsqueda de biomarcadores para el diagnóstico de estas enfermedades, el seguimiento de la patología o del tratamiento de la misma, etc. Los métodos tradicionales requieren volúmenes de muestra elevados y muchos pasos previos.
El método de la presente invención está basado en que los GAG, dependiendo del tejido en el que se encuentren, tienden a aparecer asociados a otras moléculas, bien sea por motivos funcionales o por interacciones mecánicas. Aunque en algunos ensayos del estado de la técnica ya se describían interferencias en las mediciones debido a otras moléculas que, invariablemente, se purificaban junto con ellos, nadie le buscó una aplicación práctica ulterior a esta asociación.
Particularmente, la presente invención está relacionada con la capacidad del colorante azul de dimetilmetileno (DMB), a pH ácido, de producir complejos con los GAG sulfatados que dan lugar a la formación de turbidez, seguida rápidamente por la precipitación de este complejo DMB-GAG en unos 15 minutos. Después de una centrifugación, el precipitado contiene sólo la fracción unida a los GAG sulfatados. El resto es eliminado de la muestra. A continuación, este precipitado puede ser utilizado para el análisis de la fracción por diversas técnicas como electroforesis desnaturalizante en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) y tinción con un colorante para la visualización de proteínas como Sypro Ruby. Las bandas obtenidas en la electroforesis pueden identificarse mediante Western blot o también pueden escindirse para su identificación mediante proteómica.
El método de la invención combina la propiedad del DMB de unir y precipitar específicamente los GAG sulfatados con las técnicas de análisis de proteínas y/o lípidos. Al detectar fracciones glicadas específicamente con GAG, este método tiene una potencialidad muy elevada, ya que puede ser utilizado en estudios en los que la glicación/glicosilación tenga un papel importante y permitir el descubrimiento de nuevos biomarcadores de diagnóstico, pronóstico o seguimiento de patologías, nuevas dianas terapéuticas y nuevas vías de comunicación celular.
Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención se relaciona con un método in vitro para separar los glucosaminoglicanos (GAG) sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra según se define en las reivindicaciones 1 a 5.
5 El segundo y tercer aspectos de la invención se relacionan con un método in vitro de identificación del perfil de proteínas unidas o asociadas a los GAG sulfatados de una muestra según se define en las reivindicaciones 6 a 12.
En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro de identificación del
10 perfil de lípidos unidos o asociados a los GAG sulfatados de una muestra según se define en la reivindicación 13.
En un quinto aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para detectar una alteración en el patrón de glicosilación por los GAG sulfatados de una muestra según se
15 define en la reivindicación 14.
La invención también se relaciona con métodos de diagnóstico, métodos para determinar el pronóstico, para monitorizar la progresión, para monitorizar el efecto de una terapia y para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de enfermedades asociadas a
20 una alteración (aumento o disminución) de uno o más GAG sulfatados según se define en las reivindicaciones 15 a 35.
La invención también se refiere al uso del método del segundo, tercer, cuarto o quinto aspectos para identificar biomarcadores proteicos o lipídicos unidos o asociados a los GAG
25 sulfatados.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar mucopolisacaridosis en un sujeto que comprende detectar en una muestra de orina de dicho sujeto la presencia del péptido señal SEQ ID NO: 1 de la uromodulina o de una variante del
30 mismo.
La invención también se refiere a métodos para determinar el pronóstico, para monitorizar la progresión de un sujeto, para monitorizar el efecto de una terapia, para diseñar una terapia personalizada o para seleccionar un paciente susceptible de ser tratado con una terapia 35 para la prevención y/o tratamiento de mucopolisacaridosis, y a métodos para la identificación
de compuestos adecuados para el tratamiento de mucopolisacaridosis según se define en las reivindicaciones 46 a 51.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un agente capaz de detectar el péptido señal SEQ ID NO: 1 de la uromodulina o una variante del mismo en una muestra de orina para diagnosticar mucopolisacaridosis, para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de un sujeto que sufre mucopolisacaridosis, para monitorizar el efecto de una terapia en un sujeto que sufre mucopolisacaridosis, para diseñar una terapia personalizada en un sujeto que tiene síntomas de mucopolisacaridosis, para seleccionar un paciente susceptible de ser tratado con una terapia para la prevención y/o tratamiento de mucopolisacaridosis o para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de mucopolisacaridosis.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso del péptido señal SEQ ID NO: 1 de la uromodulina o una variante del mismo como marcador de diagnóstico, pronóstico, monitorización de la progresión de un sujeto que sufre mucopolisacaridosis, o como marcador de monitorización del efecto de una terapia, marcador para diseñar una terapia personalizada, marcador de selección de un paciente susceptible de ser tratado con una terapia para la prevención y/o tratamiento de mucopolisacaridosis o como marcador para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de mucopolisacaridosis.
En otro aspecto, la invención se refiere a métodos de diagnóstico, pronóstico o monitorización de la progresión de enfermedad renal, monitorización del efecto de una terapia, métodos para diseñar una terapia personalizada o para seleccionar un paciente susceptible de ser tratado con una terapia para la prevención y/o tratamiento de enfermedad renal y métodos para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de enfermedad renal según se define en las reivindicaciones 55 a 60.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un agente capaz de detectar uromodulina o una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados y/o de un agente capaz de detectar albúmina o una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados en una muestra de orina para diagnosticar enfermedad renal, para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de un sujeto que sufre enfermedad renal, para monitorizar el efecto de una terapia en un sujeto que sufre enfermedad renal, para diseñar una terapia personalizada en un sujeto que tiene síntomas de enfermedad renal, para seleccionar un paciente susceptible de ser tratado con una terapia para la prevención y/o tratamiento de
enfermedad renal o para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de enfermedad renal.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de uromodulina o una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados y/o de albúmina o de una variante de la misma unida
o asociada a los GAG sulfatados como marcador de diagnóstico de enfermedad renal, como marcador pronóstico de enfermedad renal , como marcador de monitorización del efecto de una terapia en un sujeto que sufre enfermedad renal, como marcador para diseñar una terapia personalizada en un sujeto que tiene síntomas de enfermedad renal, como marcador de selección de un paciente susceptible de ser tratado con una terapia para la prevención y/o tratamiento de enfermedad renal o como marcador para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de enfermedad renal.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar enfermedad renal avanzada en un sujeto que comprende detectar el nivel de los complejos uromodulina
o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas en una muestra de orina de dicho sujeto y comparar dicho nivel con un valor de referencia donde un nivel disminuido de los complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto sufre enfermedad renal avanzada.
La invención también se refiere a métodos para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de enfermedad renal avanzada, o para monitorizar el efecto de una terapia, diseñar una terapia personalizada o seleccionar un paciente susceptible de ser tratado con una terapia para el tratamiento de enfermedad renal avanzada o a métodos para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de enfermedad renal avanzada según se define en las reivindicaciones 65 a 70.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un agente capaz de detectar complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas en una muestra de orina para diagnosticar enfermedad renal avanzada, para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de un sujeto que sufre enfermedad renal avanzada, para monitorizar el efecto de una terapia en un sujeto que sufre enfermedad renal avanzada, para diseñar una terapia personalizada en un sujeto que tiene síntomas de enfermedad renal avanzada, para seleccionar un paciente susceptible de ser tratado con una terapia para el tratamiento de enfermedad renal avanzada o para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de enfermedad renal avanzada.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un complejo uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas como marcador de diagnóstico de enfermedad renal avanzada, como marcador pronóstico de enfermedad renal avanzada, como marcador de monitorización del efecto de una terapia en un sujeto que sufre enfermedad renal avanzada, como marcador para diseñar una terapia personalizada en un sujeto que tiene síntomas de enfermedad renal avanzada, como marcador de selección de un paciente susceptible de ser tratado con una terapia para el tratamiento de enfermedad renal avanzada o como marcador para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de enfermedad renal avanzada.
En otro aspecto, la invención se refiere a un complejo formado por la asociación de uromodulina o una variante de la misma, GAG sulfatados y exosomas.
En otro aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende azul de dimetilmetileno (DMB) a una concentración comprendida entre 0,01 y 100 mM a un pH comprendido entre 2 y 6,9.
En otro aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende un anticuerpo capaz de detectar específicamente un péptido de secuencia SEQ ID NO: 1 o una variante del mismo, e incapaz de detectar la uromodulina madura, o un fragmento de dicho anticuerpo con capacidad para unirse a la secuencia SEQ ID NO: 1 o a una variante de la misma.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso del kit de la invención para separar los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra, para identificar el perfil de proteínas unidas o asociadas a los GAG sulfatados de una muestra, para identificar el perfil de lípidos unidos o asociados a los GAG sulfatados de una muestra, para detectar una alteración en el patrón de glicosilación por los GAG sulfatados, para diagnosticar una enfermedad, para determinar el pronóstico de una enfermedad, para monitorizar la progresión de una enfermedad, para monitorizar el efecto de una terapia para el tratamiento de una enfermedad, para predecir la respuesta a una terapia, para diseñar una terapia personalizada, para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de una enfermedad, para identificar biomarcadores proteicos o lipídicos unidos o asociados a los GAG sulfatados o para detectar complejos formados por exosomas, GAG sulfatados y una proteína.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
Figura 1: Estructuras moleculares de los glucosaminoglicanos (GAG) condroitín sulfato, queratán sulfato, hialuronato, dermatán sulfato y heparán sulfato. Figura 2: Estructura molecular del DMB. A) cloruro de 3,7-bis(dimetilamino)-1,9dimetildifenotiazin-5-io B) doble sal de cloruro de zinc de 3,7-bis(dimetilamino)-1,9dimetildifenotiazin-5-io. Figura 3: Esquema de la invención y sus aplicaciones en biomedicina. DMB, azul de dimetilmetileno; min, minutos; tª amb, temperatura ambiente; GAGs: glucosaminoglicanos. Figura 4: SDS-PAGE en el que se muestra el patrón de bandas proteicas unidas a GAG en orina de individuos controles (16 varones y 16 mujeres de 30-49 años) y la identificación de la uromodulina mediante Western blot. Figura 5: Electroforesis en 2 dimensiones (tiras de pH 3-6 y geles PAGE al 7,5%) de la orina precipitada con DMB de dos individuos control varones e identificación de la uromodulina mediante Western blot. Figura 6: Patrón de bandas proteicas totales y en la fracción unida a GAG en orina y suero de individuos control y con insuficiencia renal (izquierda). Identificación de la albúmina unida a GAG presente mediante Western blot. IR, individuos con insuficiencia renal; ST, marcador de peso molecular; Alb, albúmina; S, suero sin precipitar; O, orina sin precipitar; D, suero u orina precipitados con DMB. Figura 7: Unión entre uromodulina y/o albúmina comerciales con GAG comerciales (heparán, condroitín y dermatán sulfato) en PBS (c y d) u orina libre de uromodulina (a y b) de un paciente con una mutación truncante en el gen de la uromodulina. a) Carril 1, orina sin precipitar; Carril 2, orina precipitada con DMB; Carril 3, orina con uromodulina comercial añadida y precipitada con DMB; Carriles 4, 5 y 6, orina con uromodulina comercial añadida, incubada con heparán, condroitín y dermatán sulfato, respectivamente, y precipitada con DMB; b) Carril 1, orina sin precipitar; Carril 2, orina precipitada con DMB; Carril 3, orina con albúmina comercial añadida y precipitada con DMB; Carriles 4, 5 y 6, orina con albúmina comercial añadida, incubada con heparán, condroitín y dermatán sulfato, respectivamente, y precipitada con DMB; c) Carril 1, uromodulina comercial sin precipitar; Carril 2, uromodulina comercial precipitada con DMB; Carriles 3, 4 y 5, uromodulina comercial incubada en PBS con heparán, condroitín o dermatán sulfato, respectivamente, y precipitada con DMB; d) Carril 1, albúmina comercial sin precipitar; Carril 2, albúmina comercial precipitada con DMB; Carriles 3, 4 y 5, albúmina comercial incubada en PBS con heparán, condroitín y dermatán sulfato, respectivamente, y precipitada con DMB; St, marcador de pesos moleculares.
Figura 8: Patrón de bandas proteicas unidas a glucosaminoglicanos en orina de pacientes con mucopolisacaridosis (MPS) y sus respectivos controles (sexo y edad similares a los pacientes), así como la identificación de la uromodulina y albúmina mediante Western blot. A) MPS I, paciente mujer de 4 años con MPS I; I-1, I-2, I-3 y I-4, controles sanos de la misma edad y sexo que el paciente de MPS I; MPS VII, paciente mujer de 6 años con MPS VII; VII-1, control sano de la misma edad y sexo que el paciente de MPS VII. MPS II, pacientes varones de 6 y 8 años con MPS-II; II-1, II-2, II-3, II-4, II-5, controles sanos de la misma edad y sexo que los pacientes de MPS-II. B). MPS III, pacientes varones de 1 y 10 años con MPS III, respectivamente; III-1, III-2, III-3, III-4, III-5 y III-6, controles sanos de la misma edad y sexo que los pacientes de MPS III. MPS IV, paciente mujer de 17 años, y dos pacientes varones de 14 años con MPS IV, respectivamente; IV-1, IV-2, IV-3 y IV-4, controles sanos de la misma edad y sexo que los pacientes de MPS IV. Los niveles de glucosaminoglicanos totales (mg/mmol creatinina) medidos por el método tradicional con DMB se muestran en la parte superior, los valores elevados con respecto al de referencia se muestran en color gris y los valores normales se muestran en color negro. ST, marcador de peso molecular. Figura 9: Electroforesis en 2 dimensiones (tiras de pH 3-6 y geles SDS-PAGE al 7,5%) de la orina precipitada con DMB de pacientes con MPS. Figura 10: Perfil proteico asociado a GAG en la orina de individuos control, enfermos de PKD tipo 1 y enfermos de PKD tipo 2. La primera columna representa los marcadores de peso molecular. Las siguientes siete columnas muestran la uromodulina precipitada con los GAG después de la incubación con DMB y desnaturalización (se cargan 30 µl de proteína precipitada por columna) en muestras de distintos pacientes de PKD1 o PKD2. Creat, creatinina. Figura 11: Diferencias observadas en el perfil proteico unido a GAG entre los sobrenadantes de orina y sus respectivos pellets celulares a medida que la función renal se va deteriorando. Figura 12: Identificación y caracterización de los complejos UMOD-GAG-exosomas (UGE) mediante imágenes de microscopía electrónica (a), tamaño (b), potencial zeta (c) y Western blot (d) de exosomas purificados y precipitados con DMB donde se cargan 30 µl de proteína precipitada por columna. Las 3 primeras columnas de la Figura 12(d) pertenecen a exosomas purificados por ultracentrifugación y las columnas 4 y 5 pertenecen a exosomas purificados mediante gradiente con un kit comercial (ExoQuick_TC, System Biosciences). ID, código del paciente, Creat, creatinina; Pel, pellet celular de orina de un voluntario sano; Ur, sobrenadante de la orina de un voluntario sano; C-, sobrenadante de la orina de un individuo de ADMCKD (enfermedad renal medular quística autosómica dominante con
mutación conocida en el gen de la uromodulina); C+, control positivo con 1 µg de uromodulina comercial (Human Tamm Horsfall Glycoprotein, Biomedical-BTI). Figura 13. Purificación de los complejos UGE mediante diversas aproximaciones tales como precipitación por centrifugación o gravedad (a) y aislamiento por gradiente (b). Figura 14. Ensayos de disrupción de los complejos UGE mediante tratamiento con DTT (a) y/o filtración (b y c). a) Carriles 1 y 5, exosomas purificados sin precipitar con DMB; Carriles 2 y 6, exosomas purificados precipitados con DMB, Carriles 3 y 7, sobrenadante de las fracciones exosomales; Carriles 4 y 8, mismos sobrenadantes precipitados con DMB. b) Carril 1, exosomas purificados y filtrados sin precipitar con DMB; Carril 2, exosomas purificados, filtrados y precipitados con DMB; Carriles 3 y 4, sobrenadantes de las fracciones exosomales filtradas, y filtradas y precipitadas con DMB, respectivamente; Carriles 5 y 6, exosomas purificados sin precipitar y precipitados con DMB, respectivamente; Carriles 7 y 8, sobrenadantes de las fracciones exosomales sin precipitar, y precipitados con DMB, respectivamente. c) Carriles 1-4, fracción celular remanente después de purificar exosomas, precipitada con DMB, tratada con DTT o tratada con DTT y precipitada con DMB, respectivamente; Carril 5, exosomas purificados, filtrados y tratados con DTT; Carril 6, exosomas purificados, filtrados, tratados con DTT y precipitados con DMB; Carriles 7 y 8, sobrenadantes de las fracciones exosomales filtrados y tratados con DTT con o sin precipitación con DMB, respectivamente. Figura 15. Representación esquemática de los complejos UGE con las posibles asociaciones entre los tres elementos que lo conforman. a) exosomas asociados a GAGs a través de la uromodulina, b) exosomas asociados directamente a GAGs sin necesidad de la uromodulina como puente. Figura 16. Los complejos UGE desaparecen a medida que progresa la enfermedad renal. Se muestra un gel representativo de 3 pacientes con enfermedad poliquística renal causada por mutaciones en el gen PKD2 a) Carriles 1, 4 y 7, sobrenadantes de la fracción exosomal sin precipitar; Carriles 2, 5 y 8, fracción exosomal sin precipitar; Carriles 3, 6 y 9, fracción exosomal precipitada con DMB; St, marcador de pesos moleculares. b) Imágenes de microscopía electrónica de los complejos UGE. en individuo con función renal normal (izquierda) y ausencia de complejos UGE en individuo sin uromodulina y con daño renal (derecha). Figura 17. Separación de los GAG libres en orina precipitados con DMB en geles de acetato de celulosa. C+, mezcla de condroitín sulfato (Con), dermatán sulfato (Der) y heparán sulfato (Hep) comerciales precipitados con DMB; carriles MPS I, MPS II, MPS III y MPS IV, orinas precipitadas con DMB de pacientes con mucopolisacaridosis I, II, III y IV, respectivamente; carriles 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7, orinas precipitadas con DMB de individuos sin
mucopolisacaridosis de diferentes edades (1 mes, 7 meses, 1 año, 3 años, 4 años, 6 años y 7 años, respectivamente), donde el único GAG presente es el condroitín sulfato. Que, banda correspondiente al queratán sulfato característica de la MPS IV.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Método de separación de GAG sulfatados
En un primer aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro (denominado “primer método de la invención”) para separar los glucosaminoglicanos (GAG) sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra que comprende:
a) poner en contacto una muestra con el colorante azul de dimetilmetileno (DMB) a un
pH ácido comprendido entre 2 y 6,9;
b) incubar la mezcla de a) a una temperatura comprendida entre 0ºC y 40ºC durante el tiempo necesario para la formación de un precipitado;
c) eliminar el sobrenadante; y
d) recuperar el precipitado que contiene los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados.
El término “glucosaminoglicano” o “GAG”, también llamado mucopolisacárido, tal y como aquí se utiliza, se refiere a un heteropolisacárido constituido por repeticiones de unidades de disacáridos. Los glucosaminoglicanos son cadenas lineales donde alternan enlaces β 1→3 con enlaces β 1→4 de un ácido urónico (D-glucurónico o L-idurónico) unido por un enlace β 1→3 a un aminoazúcar (N-acetil-glucosamina o N-acetilgalactosamina). Los GAG se diferencian según la naturaleza de las unidades de disacáridos que los constituyen, la longitud de la cadena de disacáridos (10-150 unidades) y sus modificaciones (N-sulfatación, O-sulfatación, N-acetilación o epimerización de las unidades de sacáridos). Entre los GAG de interés biológico destacan los siguientes siete: ácido hialurónico (AH), condroitín-4-sulfato (C4S), condroitín-6-sulfato (C6S), dermatán sulfato (DS) o condroitín sulfato B, queratán sulfato (QS), heparán sulfato (HS) y Heparina (Hna). Por la introducción en su estructura de grupos acídicos (carboxi, sulfatos esterificados y sulfamida) presentan una elevada densidad de carga eléctrica negativa. Sufren grados variables de sulfatación siendo el sulfato esterificado a los OH alcohólicos lo que aumenta su carácter polianiónico. El número de cargas negativas por unidad de disacárido varía entre 1, en el caso del ácido hialurónico y el
queratán sulfato, y 4 en el caso de la heparina. En la figura 1 se muestra la estructura de los GAG más conocidos.
El término “glucosaminoglicano sulfatado” o “GAG sulfatado”, también llamado mucopolisacárido sulfatado, tal como aquí se utiliza, se refiere a aquellos GAG que tienen al menos un grupo sulfato. Con excepción del ácido hialurónico, todos los GAG están sulfatados. Así, entre los GAG sulfatados que pueden separarse según el método de la presente invención se encuentran, sin limitación, condroitín-4-sulfato (C4S), condroitín-6sulfato (C6S), dermatán sulfato (DS) o condroitín sulfato B, queratán sulfato (QS), heparán sulfato (HS) y Heparina (Hna).
Los GAG sulfatados se pueden encontrar en una muestra en forma libre, o bien unidos o asociados a otros componentes. Por “GAG sulfatados libres” se entiende aquellos que no están unidos o asociados a ningún otro componente. Pero además, los GAG sulfatados se pueden encontrar unidos a otros compuestos formando glicoconjugados, tales como glicoproteínas, proteoglicanos y lípidos unidos o asociados a GAG.
El término “glicoproteína” o “glucoproteína”, tal como aquí se utiliza, se refiere a una molécula integrada normalmente por uno o más oligosacáridos unidos de modo covalente a cadenas laterales específicas de polipéptidos. Suelen tener un mayor porcentaje de proteínas que de glúcidos. En el contexto de la presente invención, al menos uno de los glúcidos que compone la glicoproteína debe ser un GAG sulfatado. Los tipos más comunes de glicoproteínas encontrados en células eucariotas son definidos de acuerdo a la naturaleza de las regiones de unión con la proteína, siendo las más frecuentes las de tipo N y O. Los N-glicanos son una cadena de oligosacáridos unida en forma covalente a un residuo de asparagina de una cadena polipeptídica dentro de una secuencia consenso AsnX-Ser/Thr, generalmente vía N-acetilglucosamina (Glc-NAc). Los O-glicanos son una cadena de oligosacáridos unida covalentemente a un residuo de serina o treonina (Ser/Thr-O) generalmente vía una N-acetilgalactosamina (GalNAc).
El término “proteoglicano” o “PG”, tal como aquí se utiliza, se refiere a un tipo específico de glicoproteínas que tienen al menos una cadena de GAG unida a la proteína, y se clasifican en base a la cadena de GAG presente. En el contexto de la presente invención, los GAG unidos a la proteína deben ser GAG sulfatados. Heparán sulfato y condroitín sulfato son los GAG más comunes de los proteoglicanos. Muchos proteoglicanos contienen, además, otros glicanos unidos por enlaces tipo N-u O-glucosídico. Estos compuestos pueden variar en
cuanto a su distribución tisular, naturaleza de la proteína central, su función y los GAG fijados a ellas. El contenido de carbohidratos es mayor que en el de las glucoproteínas, alcanzando en algunos casos hasta el 95% de su peso, y tanto la secuencia como la disposición de los dominios estructurales que los conforman están altamente conservados y ligeramente glicados.
El término “lípido unido o asociado a GAG”, tal como aquí se utiliza, se refiere a una molécula formada por uno o más GAG sulfatados unidos a lípidos mediante un enlace covalente o asociados a ellos de algún otro modo.
Por “fracción unida a GAG sulfatados de una muestra”, tal como aquí se utiliza, se entiende cualquier compuesto que se encuentra unido a los GAG sulfatados mediante un enlace covalente. Ejemplos de estos compuestos son, sin limitación, las glucoproteínas que contienen GAG sulfatados y los proteoglicanos. En una realización preferida la fracción unida a GAG sulfatados es una fracción proteica. En otra realización preferida la fracción unida a GAG sulfatados es una fracción lipídica.
Por “fracción asociada a GAG sulfatados de una muestra”, tal como aquí se utiliza, se entiende cualquier compuesto o estructura que no está unido a los GAG sulfatados mediante un enlace covalente, sino que los GAG sulfatados y el compuesto o estructura se mantienen juntos mediante otro tipo de interacciones, tales como interacciones iónicas, interacciones dipolo-dipolo, interacciones de van der Waals o puentes de hidrógeno, entre otras. En una realización preferida la fracción asociada a GAG sulfatados es una fracción que contiene exosomas, más preferiblemente, una fracción que contiene exosomas y una o más proteínas.
El término “exosomas”, según se utiliza en el presente documento, se refiere a unas pequeñas nanovesículas extracelulares (50-200 nm) rodeadas de membrana que provienen de la vía endocítica y que son liberadas por diferentes tipos celulares a la mayor parte de los fluidos biológicos, incluyendo la orina. También son secretados por células in vitro. Entre las funciones que se les atribuyen destacan, entre otras, el tráfico intercelular de receptores de membrana y ARN, la inducción de inmunidad y presentación de antígenos, la modulación de la mineralización ósea y respuestas antiapoptóticas. Sus membranas son ricas en proteínas involucradas en transporte y fusión, y también en lípidos como colesterol, esfingolípidos, ceramidas, etc. Los exosomas se identifican porque al ser separados en un gradiente de sacarosa muestran un rango de densidad de entre 1,13 y 1,19 g/ml y porque poseen una
serie de marcadores como CD63, CD81, CD9, ALIX, FLOT1, ICAM1, EpCam, ANXA5, TSG101 y Hsp70 que pueden ser detectados, por ejemplo, mediante anticuerpos. La fracción asociada a los GAG sulfatados de la invención puede ser un exosoma procedente de cualquier tipo de muestra, por ejemplo, sin limitación, un exosoma procedente de medios de cultivo celular, sangre, orina, fluido amniótico y fluido ascítico. En una realización preferida los exosomas han sido aislados de la orina. Métodos para aislar exosomas de muestras y fluidos biológicos son bien conocidos por el experto en la técnica.
Los inventores han identificado diversos complejos formados por exosomas y una o más proteínas en muestras de orina, tal y como se demuestra en la Tabla II que aparece en la parte experimental. En una realización particular la fracción asociada a los GAG sulfatados es un complejo formado por uromodulina (o una variante de la misma) y exosomas. En otra realización particular la fracción asociada a GAG sulfatados es un complejo formado por albúmina (o una variante de la misma) y exosomas. En otra realización particular la fracción asociada a GAG sulfatados es un complejo formado por IgA (o una variante de la misma) y exosomas. En otra realización particular la fracción asociada a GAG sulfatados es un complejo formado por IgG (o una variante de la misma) y exosomas.
El término “muestra”, en el contexto del primer método de la invención, se refiere a cualquier tipo de muestra que contenga o sea susceptible de contener GAG sulfatados. En una realización preferida la muestra es una muestra biológica.
El término “muestra biológica”, tal como aquí se utiliza, se refiere a cualquier material procedente de un ser humano, de animales o de plantas que puede albergar información sobre su dotación genética. Ejemplos de muestras biológicas que pueden ser utilizadas en la presente invención son, sin limitación, muestras de orina, suero, plasma, tejidos, células, exosomas, líquido sinovial, humor vítreo, fluido cerebroespinal, piel, mucosa intestinal, líquido peritoneal, pared arterial, hueso, cartílago, tejido embrionario y cordón umbilical, etc. En una realización preferida la muestra biológica es una muestra de orina. En otra realización preferida la muestra biológica es una muestra de exosomas, preferiblemente una muestra de exosomas previamente aislados de un sujeto, más preferiblemente una muestra de exosomas aislados de la orina de un sujeto. En otra realización preferida la muestra biológica es una muestra de suero o plasma.
La muestra se obtiene en las condiciones y en el recipiente que mejor convenga para preservar la integridad de la misma. En el caso de las orinas debe recogerse la segunda
orina de la mañana, descartando la primera micción, en contenedores libres de proteasas. En el caso de sangre, debe recogerse en el tubo adecuado según se quiera trabajar con suero (tubo de bioquímica o STII) o con plasma (tubo con anticoagulante, por ejemplo heparina).
Tras la recogida, la muestra de partida se procesa según su naturaleza y sobre todo antes de su posible almacenamiento. En el caso de las orinas se debe realizar una separación de la fracción celular y no soluble y su sobrenadante. En el caso de muestras de sangre se debe separar la fracción celular del suero o plasma según condiciones estándar.
La conservación de las muestras debe hacerse a bajas temperaturas, idealmente a -80ºC. Los ciclos de congelación-descongelación pueden comprometer la integridad de las muestras y dar lugar a infraestimaciones del contenido de GAG y su fracción unida o asociada.
La obtención, procesado y conservación de otro tipo de muestras se hace según técnicas estándar conocidas por el experto en la materia. Por ejemplo, la obtención de exosomas se realiza a partir del sobrenadante de la orina obtenido como se describe más arriba, sometiéndolo a centrifugación a 5.000 g durante 20 minutos, seguida de filtración a través de filtros de 0,22 µm de baja adsorción proteica y posteriormente ultracentrifugación a
100.000 g durante 2 horas. Los exosomas se resuspenden en un tampón, por ejemplo PBS, y se almacenan a -20ºC. Los exosomas también pueden aislarse mediante kits comerciales.
Cuando se trate de una muestra clínica la obtención de la muestra debe ir acompañada de la obtención de la mayor información posible de la historia clínica del paciente así como todos los parámetros bioquímicos disponibles para la correcta interpretación de los resultados. Es conveniente hacer una clasificación preliminar del estadio patológico en el que se encuentra el individuo antes de la toma de muestra.
En ocasiones, inmediatamente antes de separar los GAG sulfatados por el método de la invención es necesario preparar la muestra mediante dilución, sobre todo en muestras de suero o plasma, diluyendo la muestra según la concentración prevista de GAG sulfatados y la fracción unida o asociada a ellos.
La primera etapa del primer método de la invención consiste en poner en contacto la muestra de la que se quieren separar los GAG sulfatados libres o la fracción unida o
asociada a GAG sulfatados con el colorante azul de dimetilmetileno (DMB) a un pH ácido comprendido entre 2 y 6,9.
Esta puesta en contacto implica mezclar la muestra y el DMB hasta obtener una mezcla 5 homogénea.
El término “azul de dimetilmetileno” o “DMB”, tal como aquí se utiliza, se refiere a un colorante catiónico también conocido como azul de 1,9-dimetilmetileno, que comprende el compuesto 3,7-bis(dimetilamino)-1,9-dimetildifenotiazin-5-io y cualquier sal del mismo. Entre 10 sus sales se encuentran sales con aniones derivados de ácidos inorgánicos, por ejemplo y sin limitación, clorhídrico, sulfúrico, fosfórico, difosfórico, bromuro, yoduro, ácido nítrico y ácidos orgánicos, por ejemplo y sin limitación, ácido cítrico, fumárico, maleico, málico, mandélico, ascórbico, oxálico, succínico, tartárico, benzoico, acético, metanosulfónico, etanosulfónico, bencenosulfónico, ciclámico o p-toluenosulfónico. En una realización
15 preferida el DMB es cloruro de 3,7-bis(dimetilamino)-1,9-dimetildifenotiazin-5-io, cuya estructura se muestra en la figura 2 superior. El término DMB también incluye sales mixtas. En una realización preferida el DMB es una doble sal de cloruro de zinc de 3,7bis(dimetilamino)-1,9-dimetildifenotiazin-5-io, cuya estructura se muestra en la figura 2 inferior. Estos compuestos pueden adquirirse comercialmente.
20 El DMB a pH ácido es capaz de unirse específicamente a los GAG sulfatados debido a la carga negativa de estos. El DMB se ha utilizado para cuantificar GAG, pero siempre se ha considerado que una gran limitación de este método es que los complejos DMB-GAG sulfatados son inestables en solución y precipitan. Hasta el momento, nadie pensó en
25 aprovechar esta característica como una ventaja para separar los GAG de una muestra.
El DMB es una sustancia en polvo que se disuelve en un disolvente adecuado, como por ejemplo etanol, hasta alcanzar una concentración apropiada. En una realización preferida el DMB está a una concentración que oscila entre 0,01 y 100 mM, preferiblemente entre 0,29 y
30 0,35 mM, más preferiblemente a 0,29 mM. En una realización preferida el disolvente en el que está disuelto el colorante es etanol.
El DMB utilizado en el primer método de la invención debe estar a un pH ácido comprendido entre 2 y 6,9.
El término “pH” se refiere a la medida de la acidez o la alcalinidad de una solución. El pH típicamente va de 0 a 14 en disolución acuosa, siendo ácidas las disoluciones con pH inferiores a 7 y alcalinas las que tienen pH superiores a 7. El pH=7 indica la neutralidad de la disolución, donde el disolvente es agua. La determinación del pH de una solución puede hacerse de forma precisa mediante un potenciómetro (o pH-metro) y también de forma aproximada mediante indicadores, por métodos ampliamente conocidos en el estado de la técnica. Puesto que el valor del pH puede variar con la temperatura, en el contexto de esta invención la medición del pH se realiza a 20ºC. El DMB utilizado en el primer método de la invención tiene un pH medido a 20ºC comprendido entre 2 y 6,9; preferiblemente comprendido entre 3 y 4; más preferiblemente comprendido entre 3,3 y 3,6. En una realización preferida el pH medido a 20ºC es de 3,5.
Para que el pH del DMB disuelto en un disolvente adecuado sea ácido, debe añadirse un agente tampón. Por “agente tampón” se entiende, en el contexto de la presente invención, un agente capaz de controlar el pH ácido de la solución y de mantenerlo constante a un pH comprendido entre 2 y 6,9. Agentes tampones adecuados para la presente invención son, sin limitación, tampón acetato, tampón citrato fosfato, tampón difosfato, tampón formiato y una combinación de los mismos. En una realización preferida de la invención el agente tampón es formiato sódico, preferiblemente formiato sódico 0,2 M a pH 3,5. En una realización preferida el agente tampón se mezcla con el DMB previamente disuelto en un disolvente adecuado tal como etanol, en una proporción DMB disuelto/tampón de 1/99 a 10/90. Preferiblemente la proporción DMB disuelto/tampón es de 1/99.
La muestra a analizar que contiene los GAG sulfatados libres y unidos o asociados a otros componentes debe mezclarse con el DMB tamponado en una proporción muestra:DMB tamponado adecuada para que se sature, tal como la comprendida en el intervalo de 1:1 a
1:5. Preferiblemente, se mezclan en una proporción 1:2.
En la etapa b) del primer método de la invención la mezcla de la etapa a) se incuba a una temperatura comprendida entre 0ºC y 40ºC durante el tiempo necesario para la formación de un precipitado. En esta etapa el colorante azul de dimetilmetileno se une de forma específica a los GAG tanto libres como unidos o asociados a otros compuestos, formando complejos con ellos y dando lugar a la formación de turbidez, seguida rápidamente por la precipitación del complejo formado. La incubación puede realizarse a una temperatura comprendida entre 0ºC y 40ºC, preferiblemente entre 4ºC y 30ºC, más preferiblemente entre 10ºC y 28ºC, aún más preferiblemente entre 15ºC y 25ºC, todavía más preferiblemente entre 20ºC y 25ºC. La
incubación se realizará en un entorno refrigerado, atemperado o en una estufa dependiendo de la temperatura que se desee alcanzar por métodos conocidos por el experto en la técnica. En una realización preferida la incubación se realiza a temperatura ambiente (entre 20ºC y 25ºC).
Por “precipitado” se entiende, en el contexto del primer método de la invención, el sólido insoluble que se produce por el complejo formado entre los GAG sulfatados presentes en la muestra a analizar y el DMB. En la mayoría de los casos el precipitado baja al fondo de la disolución y su formación puede observarse a simple vista. En otras ocasiones el precipitado puede flotar o quedarse en suspensión, dependiendo de si es menos denso o igual de denso que el resto de la solución.
El tiempo de incubación es el tiempo necesario para la formación del precipitado y puede ser determinado por el experto en la materia por simple observación de la solución o por métodos conocidos en el estado de la técnica. Una vez formado el precipitado este puede mantenerse inalterado durante días en un intervalo de temperatura comprendido entre 0ºC y 40ºC. En una realización preferida, el tiempo de incubación está comprendido entre 1 minuto y 2 horas, preferiblemente es de al menos 1 minuto, al menos 5 minutos, al menos 10 minutos, al menos 15 minutos, al menos 20 minutos, al menos 30 minutos, al menos 40 minutos, al menos 50 minutos, al menos 60 minutos, al menos 90 minutos. En una realización más preferida el tiempo necesario para la formación del precipitado es de al menos 15 minutos.
En la etapa c) del método de la invención se produce la eliminación del sobrenadante tras la precipitación. Esta eliminación puede realizarse mediante cualquier método conocido por el experto en la materia, por ejemplo, por filtración, decantación o por un proceso de centrifugado y aspiración del sobrenadante. En una realización preferida tras la etapa b) se realiza una centrifugación. En una realización preferida la eliminación se realiza por centrifugación y posterior decantación o aspiración del sobrenadante, más preferiblemente por centrifugación y posterior aspiración del sobrenadante, aún más preferiblemente por centrifugación a 10.000 g durante 10 minutos a 4ºC y posterior aspiración del sobrenadante. Tras la centrifugación, el precipitado contiene sólo los GAG sulfatados libres unidos al DMB y la fracción unida o asociada a GAG sulfatados. El sobrenadante contiene el resto, que es eliminado de la muestra.
En la etapa d) del primer método de la invención se recupera el precipitado que contiene los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a GAG sulfatados. Esta recuperación puede consistir simplemente en la obtención del precipitado aislado separado del sobrenadante tras la etapa c). Opcionalmente, el precipitado obtenido tras la etapa c) puede disolverse o mezclarse con un disolvente o solución adecuada en función del uso posterior que va a hacerse del precipitado. Por ejemplo, si el precipitado va a analizarse por electroforesis de proteínas, puede resuspenderse en un tampón de carga para electroforesis con o sin SDS. En una realización preferida el precipitado se resuspende en 7,5% SDS. Si el precipitado va a analizarse por cromatografía o por secuenciación proteica puede resuspenderse en un tampón adecuado para llevar a cabo estas técnicas. En la figura 3 se muestra un esquema con las diferentes posibilidades de análisis.
Método de identificación del perfil de proteínas unidas o asociadas a GAG sulfatados
Cuando la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados precipitada por el primer método de la invención es una fracción proteica, el precipitado obtenido puede ser utilizado para identificar patrones o perfiles de proteínas característicos de un determinado estado, patológico o no, o de una determinada muestra.
El análisis de la fracción proteica puede ser analizado por diversas técnicas como por ejemplo, sin limitación, la electroforesis de proteínas, la cromatografía, la espectrometría de masas o la secuenciación proteica.
Así, en otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro (en adelante “segundo método de la invención”) de identificación del perfil de proteínas unidas o asociadas a los GAG sulfatados de una muestra que comprende:
a) separación de la fracción proteica unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra según el primer método de la invención;
b) separación electroforética del producto obtenido en a); y
c) identificación del perfil electroforético obtenido en b).
El término “proteína”, en el contexto del segundo método de la invención, se refiere a cualquier molécula formada por aminoácidos unidos por enlaces peptídicos y, por lo tanto, incluye tanto a péptidos y proteínas como a fragmentos de los mismos, incluyendo aquellos modificados postraduccionalmente. Cualquier proteína modificada postraduccionalmente
con GAG o asociada de otro modo a GAG puede ser identificada mediante el segundo método de la invención. En una realización preferida, la proteína se selecciona del grupo que consiste en uromodulina, albúmina, IgA, IgG o una variante de las mismas y fragmentos de las mismas.
Por “perfil de proteínas”, en el contexto del segundo método de la invención, se entiende el patrón específico de proteínas que forma la fracción unida o asociada a los GAG. El perfil de proteínas puede ser cualitativo, cuantitativo o ambos. En el presente documento el perfil de proteínas no se refiere únicamente al conjunto de proteínas de naturaleza conocida que han sido identificadas mediante un anticuerpo específico (perfil específico), sino también al patrón de bandas obtenido tras la separación electroforética, aunque no sea posible relacionar cada banda con una proteína concreta (perfil inespecífico).
Estas proteínas pueden estar directamente unidas o asociadas a los GAG sulfatados o bien indirectamente a través de otros compuestos unidos o asociados a los GAG sulfatados, como los exosomas.
La primera etapa (etapa a) del segundo método de la invención comprende la separación de la fracción proteica unida o asociada a los GAG sulfatados según el primer método de la invención.
El precipitado obtenido en la etapa a) debe resuspenderse en un medio adecuado para poder ser utilizado en la etapa b) del método. Cualquier tampón de carga para electroforesis puede ser adecuado para la resuspensión. Ejemplos de medios en los que puede resuspenderse son, sin limitación, 7,5% SDS; tampón Laemli; tampón Laemli con βmercaptoetanol y 7,5% de SDS en relación 1:1; tampón TBE (100 mM Tris-borato, 1 mM EDTA, pH 8,3) con sacarosa 2 M y 0,02% de azul de bromofenol; tampón TAE (40 mM Tris, 5 mM CH3COONa, 0,9 mM EDTA, pH 7,9); tampón TBE con sacarosa 2 M; etc. El tampón preferido para la resuspensión del precipitado es SDS (dodecil sulfato sódico) al 7,5 % que posteriormente se combina en proporción variable 1:1 a 1:10 con el tampón de carga. Si la cantidad de precipitado es muy grande puede ser necesario vortear la mezcla para conseguir una completa homogeneización.
La etapa b) del segundo método de la invención es la separación electroforética del producto obtenido en la etapa a). Por “separación electroforética” o “electroforesis”, se entiende un método de separación de los componentes de una muestra mediante la aplicación de un campo eléctrico. En el contexto del segundo método de la invención la
separación electroforética es una electroforesis proteica. En función del tipo de separación empleado, la separación electroforética puede ser electroforesis de zona (separación en función de la carga), isoelectroenfoque (separación en función del punto isoeléctrico) y separación por tamaño en tamiz molecular. Ejemplos de separación electroforética son, sin limitación, electroforesis de zona (en papel, acetato de celulosa, agarosa, poliacrilamida y electroforesis capilar), isoelectroenfoque, electroforesis en geles de poliacrilamida nativos (PAGE) o desnaturalizantes (SDS-PAGE). El experto en la materia reconocerá que la separación electroforética puede ser monodimensional o bidimensional, por ejemplo cuando se utiliza como primera dimensión el isoelectroenfoque y como segunda dimensión la electroforesis en geles de poliacrilamida. La separación electroforética o electroforesis se lleva a cabo por métodos conocidos por el experto en la técnica.
En una realización preferida la electroforesis es SDS-PAGE. En otra realización preferida la electroforesis es una electroforesis bidimensional.
En una realización preferida la electroforesis es una electroforesis en un gel de poliacrilamida. En otra realización preferida la electroforesis es una electroforesis en un gel de acetato de celulosa.
En la etapa c) del método de la invención se identifica el perfil electroforético obtenido en b).
En el contexto del segundo método de la invención el término “perfil electroforético” se refiere al patrón específico de bandas o manchas producido por la fracción proteica unida o asociada a los GAG cuando las proteínas son separadas mediante electroforesis. Este patrón específico puede ser debido a varias causas: a) a que cada tipo de GAG se une a una fracción diferente; b) a que la unión del GAG a las proteínas y péptidos hace que esta fracción sea secretada a un fluido o, por ejemplo, excretada en orina; y c) el exceso de GAG hace que se formen isoformas específicas.
La “identificación del perfil electroforético” requiere o bien la visualización de un patrón de bandas o manchas de proteínas que pueden identificarse mediante su peso molecular aunque su naturaleza sea desconocida; o bien la identificación de las bandas o manchas de proteínas mediante el uso de un anticuerpo que reconoce específicamente una proteína concreta, mediante secuenciación proteica o mediante espectrometría de masas.
En una realización preferida, la etapa c) del segundo método de la invención se realiza mediante Western blot, es decir, mediante el uso de anticuerpos que reconocen
específicamente una determinada proteína. Esta técnica es ampliamente conocida por el experto en la materia.
En otra realización preferida, la etapa c) se realiza mediante tinción con un colorante específico para la visualización de proteínas.
Por “tinción”, en el contexto del segundo método de la invención, se refiere a la acción de teñir las bandas de proteínas de modo que adquieran color o fluorescencia y puedan ser detectadas. Los protocolos de tinción de proteínas son conocidos por el experto en la materia.
El término “colorante específico para la visualización de proteínas” se refiere a un compuesto que tiene una afinidad específica por las proteínas y que al unirse a ellas permite visualizar las bandas de proteína de un gel tras la separación electroforética bien por la observación de coloración de las mismas a simple vista o por la detección de la emisión de fluorescencia tras iluminación con luz UV, luz azul o láser. Ejemplos de colorantes específicos para proteínas son, sin limitación, tinción de plata, azul de coomassie, “Blue Silver” o Coomassie G250, tinción negativa (con zinc o cobre), Ponceau S y tinción fluorescente. Ejemplos de tinciones fluorescentes son, sin limitación, Sypro Ruby, Emerald (tiñe específicamente proteínas glicadas), Flamingo™ (Bio-Rad), Oriole™ (Bio-Rad), Pro-Q , marcaje con Cy2, Cy3 y/o Cy5, etc. En una realización preferida el colorante específico para la visualización de proteínas es Sypro Ruby.
Como el experto en la técnica conoce, el colorante a utilizar dependerá del posterior análisis al que se vaya a someter la muestra. Por ejemplo, la tinción con plata no se utiliza si se desean hacer análisis por espectrometría de masas; mientras que la tinción fluorescente o la tinción Coomassie G250 sí que son compatibles con espectrometría de masas.
En una realización preferida, tras la tinción con un colorante específico para la visualización de proteínas, las bandas o manchas obtenidas se escinden del gel y se identifican mediante proteómica. Entre las técnicas de proteómica que pueden ser utilizadas están, sin limitación, técnicas no colorimétricas como espectrometría de masas, secuenciación proteica, espectroscopia de índice de refracción, espectroscopia ultravioleta (UV), análisis de fluorescencia, análisis radioquímico, espectroscopia de infrarojo cercano, espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN), pirolisis espectrometría de masas, espectroscopia de dispersión Raman, espectroscopia de nebulización iónica combinada con espectrometría de
masas y electroforesis capilar. Preferiblemente, las técnicas utilizadas se seleccionan del grupo que consiste en la espectrometría de masas y la secuenciación proteica.
Por “espectrometría de masas” o análisis por MS, se entiende una técnica analítica para identificar compuestos desconocidos que incluye: (1) ionizar los compuestos y potencialmente fraccionar los iones parentales de compuestos formados en iones hijos; y (2) detectar los compuestos cargados y calcular una relación masa a carga (m/z). Los compuestos se pueden ionizar y detectar mediante cualquier medio adecuado. Un “espectrómetro de masas” incluye medios para ionizar compuestos y detectar compuestos cargados.
Preferiblemente, se usa espectrometría de masas en particular cromatografía de gases espectrometría de masas (GC-MS), cromatografía líquida espectrometría de masas (LC-MS), espectrometría de masas por infusión directa o espectrometría de masas de resonancia de ión ciclotrónico por transformada de Fourier (FT-ICR-MS), electroforesis capilar espectrometría de masas (CE-MS), cromatografía líquida de alta resolución acoplada a espectrometría de masas (HPLC-MS), espectrometría de masas en cuadrupolo, cualquier espectrometría de masas acoplada de forma secuencial, tal como MS-MS o MS-MS-MS, espectrometría de masas con plasma de acoplamiento inductivo (ICP-MS), pirolisisespectrometría de masas (Py-MS), espectrometría de masas por movilidad de iones o espectrometría de masas de tiempo de vuelo (TOF), espectrometría de masas de ionización por electrospray (ESI-MS), ESI-MSMS, ESI-MS/(MS)n, espectrometría de masas por desorción/ionización láser asistida por matriz tiempo de vuelo (MALDI-TOF-MS), espectrometría de masas por desorción/ionización láser aumentada por superficie tiempo de vuelo (SELDI-TOF-MS), desorción/ionización sobre silicona (DIOS), espectrometría de masa de ión secundario (SIMS), tiempo de vuelo en cuadrupolo (Q-TOF), espectrometría de masas de ionización química a presión atmosférica (APCI-MS), APCI-MSIMS, APCI-(MS)n, espectrometría de masas de fotoionización a presión atmosférica (APPI-MS), APPI-MSIMS y APPI-(MS)n, espectrometría de masas en cuadrupolo, espectrometría de masas por transformada de Fourier (FTMS) y espectrometría de masas por trampa de iones, donde n es un número entero mayor que cero. Dichas técnicas se divulgan en, por ejemplo, Nissen, Journal of Chromatography A, 703, 1995: 37-57, US 4540884 ó US 5397894.
Los métodos de ionización mencionados anteriormente generalmente producen un ión resultante de la adición de uno o más átomos o mediante rotura de la molécula. Estos iones se pueden usar después como marcadores sustitutos de la molécula que se quiere medir. El
término “marcador sustituto” como se usa aquí significa un parámetro biológico o clínico que se mide en lugar del parámetro biológicamente definitivo o clínicamente más significativo.
Típicamente los iones se producen por la adición de un protón o un núcleo de hidrógeno, [M+H]+ donde M significa la molécula de interés y H significa el ión de hidrógeno, que es lo mismo que un protón. Algunos métodos de ionización también producirán iones análogos. Los iones análogos pueden surgir por la adición de un catión de metal alcalino, más que el protón discutido anteriormente. Una especie típica puede ser [M+Na]+ o [M+K]+. El análisis de las moléculas ionizadas es similar independientemente de si tiene que ver con un ión protonado, como se ha discutido anteriormente, o si se ocupa con un catión de metal alcalino añadido. La diferencia principal es que la adición de un protón añade una unidad de masa (típicamente llamado un Dalton), en el caso del ión de hidrógeno (es decir, protón), 23 Dalton en el caso de sodio ó 39 Dalton en el caso de potasio. Estos pesos o masas adicionales simplemente se añaden al peso molecular de la molécula de interés y el pico de MS se produce en el punto para el peso molecular de la molécula de interés más el peso del ión que se ha añadido. Estos métodos de ionización también pueden producir iones negativos. La señal molecular más común es la molécula desprotonada [M-H]-, en este caso la masa es un Dalton menor que el peso molecular de la molécula de interés. Además, para algunos compuestos se producirán iones múltiplemente cargados. Estos son del tipo general de identificación [M+nH]n+, donde n minúscula identifica el número de protones adicionales que se han añadido.
En una realización preferida la técnica de proteómica utilizada es la espectrometría de masas, preferiblemente por MALDI-TOF o MALDI-TOF/TOF.
En otra realización se utiliza cromatografía de gases combinada con espectrometría de masas, cromatografía líquida combinada con espectrometría de masas o MALDI combinada con espectrometría de masas.
En otra realización preferida la espectrometría de masas es espectrometría de masas en tándem.
Otra posibilidad para identificar la fracción unida a los GAG es secuenciar los péptidos o proteínas. Por “secuenciación proteica”, en el contexto del segundo método de la invención, se entiende la determinación de la secuencia de aminoácidos de una proteína. Cualquier método de secuenciación proteica puede ser utilizado en el método de la invención, por ejemplo y sin limitación, secuenciación por el método de degradación de Edman,
secuenciación por espectrometría de masas bien directamente o tras la digestión de los fragmentos peptídicos, etc. Estos métodos son bien conocidos por el experto en la técnica.
El precipitado obtenido por el primer método de la invención también puede estudiarse por microscopía electrónica. Para ello, el precipitado se resuspende en un tampón específico para observación por microscopía electrónica tal como las resinas como el acrílico Epon o las Epoxi, o 2% glutaraldehido en tampón cacodilato 0,1 M a pH 7,4. En este caso el DMB actúa como contraste.
Por “microscopía electrónica” se entiende una técnica que utiliza un microscopio electrónico, que es aquel que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar las imágenes de los objetos. Las técnicas de microscopía electrónica útiles en la presente invención incluyen tanto microscopía electrónica de transmisión como microscopía electrónica de barrido, entre otras. Esta técnica permite estudiar las fracciones asociadas a los GAG sulfatados, como por ejemplo los exosomas.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro (en adelante “tercer método de la invención”) de identificación del perfil de proteínas unidas o asociadas a los GAG sulfatados de una muestra que comprende: a) separación de la fracción proteica unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra según el primer método de la invención y b) identificación del perfil de proteínas unidas o asociadas a los GAG sulfatados mediante cromatografía o espectrometría de masas de la fracción obtenida en a). Preferiblemente, la espectrometría de masas es espectrometría de masas en tándem.
La primera etapa del tercer método de la invención implica la separación de la fracción proteica unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra utilizando el primer método de la invención.
El precipitado obtenido en la etapa a) puede ser analizado directamente mediante cromatografía o espectrometría de masas, preferiblemente espectrometría de masas en tándem. Para ello, dicho precipitado se resuspende en el medio adecuado para llevar a cabo la siguiente etapa del tercer método de la invención.
En una realización preferida, tras la etapa a) el perfil de proteínas unidas o asociadas a los GAG sulfatados se identifica mediante cromatografía. Por “cromatografía” se entiende un
método para la separación de componentes de una mezcla que se basa en diferencias en el comportamiento de flujo de varios componentes de una mezcla/solución llevada por una fase móvil a través de un soporte/columna recubierto con una cierta fase estacionaria. Específicamente, algunos componentes se unen con fuerza a la fase estacionaria y pasan mayor tiempo en el soporte, mientras que otros componentes están predominantemente en la fase móvil y pasan más rápidamente a través del soporte. El criterio en el que se basa que los varios compuestos se separen a través de la columna se define por el problema particular que se investiga y está impuesto por la estructura, composición y capacidad de unión de la fase estacionaria. Por ejemplo, se podría construir una fase estacionaria de modo que las moléculas lineales y de bajo peso molecular eluyan más rápido que las aromáticas y de alto peso molecular. Según eluyen los componentes del soporte, se pueden analizar inmediatamente mediante un detector o ser recogidos para análisis adicional. Actualmente están disponibles un gran número de métodos de separación, y en particular métodos de cromatografía, incluyendo cromatografía de gases (“GC”), cromatografía líquida (“LC”), cromatografía iónica (“IC”), cromatografía de exclusión molecular (“SEC”), cromatografía de fluidos supercríticos (“SCF”), cromatografía de capa fina (“TLC”), cromatografía líquida de alta resolución (“HPLC”) y electroforesis capilar (“CE”). La cromatografía de gases se puede usar para separar compuestos volátiles. La cromatografía líquida (“LC”) es una técnica cromatográfica alternativa útil para separar iones o moléculas que están disueltas en un solvente. El principio de la separación por GC y LC es el mismo, su diferencia principal está en la fase con la que se produce la separación (fase vapor frente a líquida). Además, GC se usa principalmente para separar moléculas de hasta 650 unidades atómicas de peso, mientras, en principio, LC puede separar compuestos de cualquier peso molecular. Los tipos adecuados de cromatografía líquida que se pueden aplicar en el método de la invención incluyen, sin limitación, cromatografía de fase reversa, cromatografía de fase normal, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía líquida de interacción hidrofílica (HILIC), cromatografía de exclusión molecular y cromatografía quiral. Estos métodos son bien conocidos en la técnica y los puede aplicar el experto en la materia sin más dilación.
En otra realización preferida, tras la etapa a) el perfil de proteínas unidas o asociadas a los GAG sulfatados se identifica mediante espectrometría de masas, preferiblemente espectrometría de masas en tándem.
Por “espectrometría de masas en tándem” se entiende el método de espectrometría en el que se utilizan dos analizadores acoplados, de modo que el primer analizador es usado para
seleccionar el compuesto de interés y luego este ión pasa a la celda de colisión donde se induce la disociación del ión. Esta técnica es bien conocida por el experto en la técnica y es adecuada para cuantificación y para el cribado de muestras.
5 Cualquier realización descrita en el contexto del primer método de la invención es también aplicable al segundo y tercer métodos.
Método de identificación del perfil de lípidos unidos o asociados a GAG sulfatados
10 Cuando la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados precipitada por el primer método de la invención es una fracción lipídica, el precipitado obtenido puede ser utilizado para identificar patrones o perfiles de lípidos característicos de un determinado estado, patológico
o no, o de una determinada muestra.
El análisis de la fracción lipídica puede ser analizado por diversas técnicas como por
15 ejemplo, sin limitación, la electroforesis de lípidos, la cromatografía, o la cromatografía acoplada a espectrometría de masas
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro (en adelante “cuarto método de la invención”) de identificación del perfil de lípidos unidos o asociados a los GAG sulfatados de una muestra que comprende:
20 a) separación de la fracción lipídica unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra según el primer método de la invención; y b) identificación del perfil de lípidos unidos o asociados a los GAG sulfatados mediante electroforesis o cromatografía de la fracción obtenida en a).
25 El término “lípidos”, en el contexto del cuarto método de la invención, se refiere a cualquier molécula orgánica compuesta principalmente por carbono e hidrógeno y en menor medida oxígeno, aunque también pueden contener fósforo, azufre y nitrógeno, que son hidrófobos y solubles en disolventes orgánicos como la bencina, el benceno y el cloroformo. El término lípidos incluye a cualquier tipo de lípidos tales como, sin limitación, triglicéridos, fosfolípidos,
30 hormonas esteroides, etc. Cualquier lípido unido o asociado de otro modo a GAG puede ser identificado mediante el cuarto método de la invención.
Por “perfil de lípidos”, en el contexto del cuarto método de la invención, se entiende el patrón específico de lípidos que forma la fracción unida o asociada a los GAG. El perfil de lípidos puede ser cualitativo, cuantitativo o ambos. En el presente documento el perfil de lípidos no se refiere únicamente al conjunto de lípidos de naturaleza conocida que han sido
5 identificados específicamente (perfil específico), sino también al patrón obtenido tras la separación electroforética, aunque no sea posible relacionar cada banda con un lípido concreto (perfil inespecífico).
El cuarto método de la invención consta de una primera etapa en la que la fracción lipídica
10 unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra se separa según el primer método de la invención.
El precipitado obtenido en la primera etapa se puede identificar mediante electroforesis o cromatografía.
15 En una realización preferida el perfil de lípidos se identifica por electroforesis de lípidos. El término “separación electroforética” o “electroforesis” ha sido definido en relación al segundo y tercer método de la invención y en el contexto del cuarto método de la invención se refiere a una electroforesis lipídica.
20 En otra realización preferida el perfil de lípidos se identifica por cromatografía. El término “cromatografía” ha sido definido en relación al segundo y tercer método de la invención y en el contexto del cuarto método de la invención se refiere a una cromatografía de lípidos.
25 El resto de términos han sido definidos en el contexto de los aspectos anteriores. Cualquier realización descrita para el primer, segundo y tercer métodos de la invención es también aplicable al cuarto método de la invención.
Métodos para detectar alteraciones en el patrón de glicosilación por GAG sulfatados
30 El método de la invención también resulta útil para detectar alteraciones en el patrón de glicosilación por los GAG sulfatados de lípidos o proteínas.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro (en adelante “quinto método de
35 la invención”) para detectar una alteración en el patrón de glicosilación por los GAG sulfatados de una muestra que comprende:
a) identificar el perfil de proteínas unidas o asociadas a los GAG sulfatados de una muestra según el segundo o tercer método de la invención y/o identificar el perfil de lípidos unidos o asociados a los GAG sulfatados de una muestra según el cuarto método de la invención; y b) comparar el perfil de proteínas unidas o asociadas a los GAG sulfatados obtenido en a) con el obtenido para una muestra de referencia y/o comparar el perfil de lípidos unidos o asociados a los GAG sulfatados obtenido en a) con el obtenido para una muestra de referencia donde una diferencia del perfil obtenido en a) respecto al perfil obtenido en la muestra de referencia indica una alteración en el patrón de glicosilación por los GAG sulfatados.
Por “patrón de glicosilación”, en el contexto del quinto método de la invención, se entiende el patrón específico de glicosilación por GAG sulfatados de los componentes de una muestra, donde se adiciona un GAG sulfatado a otra molécula, particularmente a una proteína o lípido.
Por “alteración en el patrón de glicosilación”, en el contexto del quinto método de la invención, se entiende cualquier diferencia en el patrón de glicosilación con respecto a una muestra de referencia, ya sea un aumento o una disminución de la glicosilación por GAG sulfatados.
En la primera etapa del quinto método de la invención se identifica el perfil de proteínas unidas o asociadas a los GAG sulfatados de una muestra por el segundo o tercer método de la invención y/o se identifica al perfil de lípidos unidos o asociados a los GAG sulfatados de una muestra por el cuarto método de la invención como se ha descrito anteriormente.
La segunda etapa del quinto método de la invención consiste en comparar el perfil de proteínas unidas o asociadas a los GAG sulfatados obtenido en a) con el obtenido para una muestra de referencia y/o comparar el perfil de lípidos unidos o asociados a los GAG sulfatados obtenido en a) con el obtenido para una muestra de referencia, donde una diferencia del perfil obtenido en a) respecto al perfil obtenido en la muestra de referencia indica una alteración en el patrón de glicosilación por los GAG sulfatados.
Por “muestra de referencia”, en el contexto del quinto método de la invención, se entiende una muestra del mismo tipo que la muestra que se va a analizar que se toma como base para la comparación. En una realización preferida la muestra de referencia proviene de individuos normales sanos no afectados por ninguna enfermedad. La muestra de referencia
se puede obtener también del mismo sujeto a analizar. En una realización preferida de la invención la muestra de referencia se ha obtenido a partir de individuos sanos de la misma edad y sexo que la muestra a analizar.
5 El patrón de glicosilación de la muestra a analizar se compara con el de la muestra de referencia y esto permite la detección de alteraciones cuantitativas y/o cualitativas en este patrón.
El resto de términos han sido definidos en el contexto de los aspectos anteriores. Cualquier
10 realización descrita para el primer, segundo, tercer y cuarto método de la invención es también aplicable al quinto método de la invención.
Usos de los métodos de la invención
15 Los métodos de la invención, que permiten analizar la fracción unida o asociada a los GAG tienen distintas aplicaciones en biomedicina. Así, sin limitación, pueden utilizarse para la identificación de nuevos biomarcadores o perfiles de biomarcadores a nivel proteico que funcionan como indicadores pronóstico o diagnóstico, o para el seguimiento de una determinada patología o condición. Asimismo, permiten monitorizar una terapia, y diseñar
20 una terapia personalizada en un sujeto que sufre una enfermedad o seleccionar a un paciente susceptible de ser tratado con una determinada terapia. También puede ser útil para el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas. Otra aplicación es su uso en el estudio de nuevas vías de comunicación celular o mecanismos moleculares.
25 Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se relaciona con el uso del segundo, tercer, cuarto y quinto métodos de la invención para identificar biomarcadores proteicos o lipídicos unidos
o asociados a los GAG sulfatados.
El término “biomarcador” o “marcador biológico”, según se usa en el presente documento, se
30 refiere a una sustancia utilizada como indicador de un estado biológico, que debe poder medirse objetivamente y ser evaluado como un indicador de un proceso biológico normal, estado patogénico o de respuesta a un tratamiento farmacológico.
En una realización dichos biomarcadores son útiles para el diagnóstico, pronóstico y/o 35 monitorización de la progresión de una enfermedad.
En otra realización dichos biomarcadores son útiles para monitorizar el efecto de una terapia para el tratamiento de una enfermedad.
En otra realización dichos biomarcadores son útiles para predecir la respuesta a una terapia. 5 Por “predecir la respuesta a una terapia” se entiende la posibilidad de saber con antelación a la administración de una terapia si un individuo va a responder bien o mal a la misma.
En otra realización dichos biomarcadores son útiles para diseñar una terapia personalizada.
10 En otra realización dichos biomarcadores son útiles para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de una enfermedad.
En una realización preferida la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedad renal y mucopolisacaridosis. En otra realización más preferida la enfermedad 15 renal es poliquistosis renal autosómica dominante de tipo 1 o de tipo 2.
Los términos “diagnóstico”, “pronóstico”, “monitorización de la progresión”, “monitorización del efecto de una terapia”, “diseño de una terapia personalizada” e “identificación de compuestos adecuados para el tratamiento” se explican más adelante.
Métodos de diagnóstico de la invención
Los autores de la presente invención han identificado una serie de marcadores presentes en la orina de sujetos que padecen mucopolisacaridosis y enfermedad renal, y que están
25 ausentes o en distinta proporción en individuos que no padecen tales enfermedades. Estos marcadores se pueden usar en un método rápido de diagnóstico de mucopolisacaridosis en recién nacidos, en métodos de diagnóstico precoz de enfermedad renal o en métodos de diagnóstico de enfermedad renal avanzada.
30 En un aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar una enfermedad asociada a una alteración de uno o más GAG sulfatados en un sujeto que comprende: a) separar los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra biológica de dicho sujeto por el primer método de la invención,
35 b) detectar el nivel de uno o más GAG sulfatados separados en a) y c) comparar dicho nivel con un valor de referencia para dicho uno o más GAG sulfatados
donde un nivel aumentado o disminuido de uno o más GAG sulfatados con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto sufre una enfermedad asociada a una alteración de uno o más GAG sulfatados.
En el contexto de la presente invención, “método in vitro para diagnosticar una enfermedad asociada a una alteración de uno o más GAG sulfatados” se entiende como un método que permite mostrar la existencia de cualquier enfermedad en la que se produce una alteración patogénica de los niveles de GAG sulfatados, es decir, cuando dicho proceso es dañino o no deseado en un sujeto por medio de la detección de estos niveles. “Diagnosticar” se refiere a evaluar la probabilidad según la cual un sujeto padece una enfermedad.
Los métodos se llevan a cabo “in vitro”, es decir, no se practican sobre el cuerpo humano o animal.
Como entenderán los expertos en la materia, tal evaluación, aunque se prefiere que sea, puede no ser correcta para el 100% de los sujetos a diagnosticar. El término, sin embargo, requiere que se pueda identificar una parte estadísticamente significativa de los sujetos como que padece la enfermedad. El experto en la materia puede determinar si una parte es estadísticamente significativa sin más dilación usando varias herramientas de evaluación estadística bien conocidas, por ejemplo, determinación de intervalos de confianza, determinación del valor de p, prueba t de Student, prueba de Mann-Whitney, etc. Los intervalos de confianza preferidos son de al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%. Los valores de p son, preferiblemente, 0,2, 0,1, 0,05.
Por “enfermedad asociada a una alteración de uno o más GAG sulfatados” se entiende cualquier enfermedad que cursa con un aumento o con una disminución de los niveles de GAG sulfatados respecto a los niveles de un individuo normal. Enfermedades en las que hay una alteración en uno o más glucosaminoglicanos de manera primaria o secundaria son, sin limitación, mucopolisacaridosis, amiloidosis renal (Tencer J. et al. Nephrol Dial Transplant.
1997.12(6):1161-6), glomerulonefritis (Tencer J.
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trasplante renal (Rodríguez-Cuartero et al. Clin Nephrol. 1997;47(4):274-6), litiasis renal (Hesse et al., Urol. Int. 1986; 41(2):81-7), nefropatía diabética (Pérez Blanco et al. Nephron. 1996; 73(2):344-5), hipotiroidismo (Tokoro T. and Eto Y. Eur J Pediatr. 1985 May;144(1):84
6), diabetes (Nikiforovskaia LF, and Ivanova LN. Vopr Med Khim. 1987;33(1):91-6), artritis reumatoide ((Kéry V. Et al. Clin Chem. 1992;38(6):841-6) y siringomielia (Elaev N.R. and Bakhtiarova KZ. Biull Eksp Biol Med. 1992;114(9):271-2).
5 En una realización preferida la enfermedad asociada a una alteración de uno o más GAG sulfatados se selecciona del grupo que consiste en:
a) una mucopolisacaridosis seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Hurler (deficiencia de alfa-L-iduronidasa), enfermedad de Scheie (deficiencia de alfaL-iduronidasa), enfermedad de Hunter (deficiencia de iduronato-2-sulfatasa),
10 enfermedad de Sanfilippo A (deficiencia de heparán sulfamidasa), enfermedad de Sanfilippo B (deficiencia de alfa-N-acetil-glucosaminidasa), enfermedad de Sanfilippo C (deficiencia de heparán-alfa-glucosaminida N-acetiltransferasa), enfermedad de Sanfilippo D (deficiencia de N-acetilglucosamina-6-sulfatasa), enfermedad de Morquio A (deficiencia de N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa), enfermedad de
15 Morquio B (deficiencia de beta-D-galactosidasa), enfermedad de Maroteaux-Lamy (deficiencia de arilsulfatasa B) y enfermedad de Sly (deficiencia de betaglucuronidasa);
b) una enfermedad renal seleccionada del grupo que consiste en poliquistosis renal autosómica dominante de tipo 1 o de tipo 2, glomerulonefritis, síndrome nefrótico, 20 nefropatía endémica de los Balcanes, trasplante renal, litiasis renal y nefropatía
diabética; c) una endocrinopatía seleccionada del grupo que consiste en hipotiroidismo y diabetes; d) una enfermedad reumatológica seleccionada del grupo que consiste en osteoartritis, 25 espondilitis anquilosante, artritis reumatoide y siringomielia; y e) una enfermedad oncológica.
En una realización la enfermedad oncológica se selecciona de cáncer de próstata y cáncer de colon.
30 En una realización aún más preferida la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en mucopolisacaridosis y enfermedad renal.
El término “mucopolisacaridosis” o “MPS”, tal y como aquí se utiliza, designa a un grupo heterogéneo de errores innatos del metabolismo producidos por la deficiencia de alguna de 35 las enzimas necesarias para la degradación de los GAG, es decir, son alteraciones
congénitas de la glicosilación. Los GAG no degradados suelen ser excretados parcialmente
en la orina, pero el resto permanecen acumulados en los lisosomas. Este acúmulo produce
las alteraciones celulares e interferencias en otros procesos metabólicos con consecuencias
graves para el organismo humano, causando daño a nivel celular, tisular y de órgano. Por
5 ejemplo, la acumulación dentro del cerebro es responsable del retraso mental y retraso
psicomotor y, en general, la acumulación de estas sustancias en otros tejidos ofrece un gran
espectro de hallazgos y formas que van desde signos fenotípicamente leves y poco
perceptibles hasta formas grotescas y deformantes que afectan notablemente a los
individuos que padecen dicha alteración. Hasta el momento se han descrito 7 tipos de 10 mucopolisacaridosis con varios subtipos que involucran a unas 11 enzimas específicas. En
la Tabla I se describen los distintos tipos de MPS y el tipo de GAG excretado.
Tipo de MPS
Otros nombres Tipo de GAG excretado
MPS I
Hurler, Hurler-Scheie, Scheie DS, HS
MPS II
Hunter DS, HS
MPS III
Sanfilippo tipos A-D HS
MPS IV
Morquio tipos A y B A: KS, CS B: KS
MPS VI
Maroteaux-Lamy DS
MPS VII
Sly DS, HS, CS
MPS IX
Deficiencia de hialuronidasa Desconocido
25 Tabla I. Tipos de MPS y GAG excretados. DS: dermatán sulfato; HS: heparán sulfato; CS: condroitín-4 y -6 sulfato; KS: queratán sulfato.
Todos los tipos de MPS son heredados en forma autosómica recesiva, exceptuando el síndrome de Hunter (MPS II), que está ligado al cromosoma X.
El término “enfermedad renal” se refiere a un estado caracterizado por una disminución significativa y progresiva de la función de los riñones, expresada por un filtrado glomerular o por un aclaramiento de creatinina estimados < 60 ml/min/1,73m2 o como la presencia de daño renal de forma persistente durante al menos 3 meses. El daño renal se diagnostica 35 habitualmente mediante marcadores en vez de por una biopsia renal, por lo que su
diagnóstico puede realizarse sin conocimiento de la causa. En una realización preferida la enfermedad renal es poliquistosis renal autosómica dominante de tipo 1 o de tipo 2. El término “poliquistosis renal autosómica dominante de tipo 1 o de tipo 2” o “enfermedad poliquística renal autosómica dominante de tipo 1 o de tipo 2” o “ADPKD1 o ADPKD2”, se refiere a una enfermedad genética progresiva de los riñones caracterizada por la presencia de múltiples quistes en ambos riñones. Esta enfermedad también puede dañar al hígado, vesículas seminales, páncreas, aracnoides y raramente al corazón y al cerebro. Las manifestaciones de esta enfermedad incluyen anormalidades en la función renal, hipertensión, dolor renal, e insuficiencia renal. Los síntomas iniciales son hipertensión, fatiga, dolores severos en la espalda y costados e infecciones en el tracto urinario. La enfermedad conduce frecuentemente al desarrollo de insuficiencia renal crónica y puede resultar en la pérdida total de la función renal, lo que requiere un cierto tipo de diálisis. En el 85% de los pacientes esta enfermedad está causada por la mutación del gen PKD1 (locus 16p13.3-p13.1), y en el 15% restante la causa es la mutación del gen PKD2 (locus 4q21q23).
En una realización la alteración de uno o más GAG sulfatados es un aumento de uno o más GAG. En una realización la enfermedad asociada a un aumento de uno o más GAG sulfatados es una enfermedad que cursa con una acumulación indeseada de uno o más GAG sulfatados seleccionada de mucopolisacaridosis, mucolipidosis, síndrome nefrótico congénito, nefropatía endémica de los Balcanes, artritis reumatoide y siringomielia.
En otra realización la alteración de uno o más GAG sulfatados es una disminución de uno o más GAG. En una realización la enfermedad asociada a la disminución de uno o más GAG sulfatados se selecciona del grupo que consiste en amiloidosis renal, glomerulonefritis, síndrome nefrótico, hipotiroidismo y diabetes.
La primera etapa del método diagnóstico de la invención comprende la separación de los GAG sulfatados libres y de la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra biológica de un sujeto por el primer método de la invención.
El término “muestra biológica” ha sido definido en el contexto del primer método de la invención. En una realización preferida la muestra biológica es una muestra de orina, suero
o plasma. En otra realización preferida la muestra biológica es una muestra de exosomas, preferiblemente exosomas aislados de una muestra de orina.
Por “sujeto” en la presente invención se entiende como cualquier animal clasificado como mamífero e incluye, pero no está limitado a, animales domésticos o de granja, primates y humanos, por ejemplo, seres humanos, primates no humanos, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, perros, gatos o roedores. Preferiblemente, el sujeto es un ser humano hombre o mujer de cualquier raza o edad. En el contexto de este aspecto de la invención el sujeto es un sujeto que potencialmente padece una enfermedad asociada a una alteración de uno o más GAG sulfatados.
La segunda etapa del método diagnóstico comprende detectar el nivel de uno o más GAG sulfatados separados en a).
Los niveles de GAG pueden ser detectados mediante métodos descritos en el estado de la técnica y conocidos por el experto en la materia. Dichos métodos incluyen métodos colorimétricos de detección espectrofotométrica; métodos de ensayo de GAG específicos que permiten identificar los tipos de GAG producidos o excretados en exceso tales como HPLC, ELISA y espectrometría de masas en tándem; y métodos basados en la despolimerización de los GAG (Tomatsu S. et al. 2013. Mol. Genet. Metab. 110(0):42-53).
En una realización preferida la etapa (b) se realiza mediante la tinción de los GAG sulfatados con el colorante DMB. Preferiblemente, la tinción se realiza mediante DMB al 0,02% en agua. Luego el gel debe desteñirse, preferiblemente usando ácido acético al 10%.
La persona experta en la técnica apreciará que el método de la invención se puede poner en práctica utilizando tanto el nivel absoluto como el nivel relativo de los GAG sulfatados. Por lo tanto, en la presente invención, la expresión “nivel de uno o más GAG sulfatados” se utiliza para referirse tanto a los niveles absolutos como a los niveles relativos de los GAG sulfatados.
La expresión “niveles absolutos” se refiere a la cantidad total de GAG sulfatados en una muestra. Dicho valor puede ser dado como la concentración de GAG sulfatados expresado en unidades de masa por unidad de volumen (por ejemplo, en ng/ml de muestra), en el número de moléculas de GAG sulfatados por unidad de volumen (por ejemplo, en pmol de GAG sulfatados/ml de muestra), en las unidades de masa de GAG sulfatados por unidad de masa de GAG totales (pg GAG sulfatados/mg GAG totales), o en el número de moléculas de
GAG
sulfatados por unidad de masa de GAG totales (por ejemplo, en pmol
GAG
sulfatados/mg GAG totales).
38
La expresión “niveles relativos” se refiere a la relación entre los niveles de GAG sulfatados y de un GAG de referencia, es decir, se define como la concentración de GAG sulfatados en forma normalizada con respecto a dicho GAG de referencia.
Con el fin de normalizar los valores de GAG sulfatados entre las diferentes muestras, es posible comparar niveles de GAG sulfatados en las muestras a analizar con la expresión de un GAG de control. “GAG de control” en la presente invención se entiende como un GAG cuya concentración no cambia o solo cambia en cantidades limitadas en las células enfermas con respecto a células normales. Preferiblemente, el GAG de control es condroitín sulfato.
El experto apreciará que en la etapa b) puede detectarse el nivel de los GAG sulfatados totales o bien el nivel de los GAG sulfatados libres o bien el nivel de los GAG sulfatados asociados a una fracción proteica o lipídica. En una realización preferida se detecta el nivel de uno o más GAG sulfatados libres.
Una vez que se ha determinado el nivel de uno o más GAG sulfatados en una muestra se lleva a cabo la etapa (c) del método de la invención que consiste en comparar los niveles de GAG sulfatados obtenidos en la etapa (b) con un valor de referencia para cada GAG sulfatado.
El “valor de referencia” procede de un conjunto de muestras formado preferiblemente por una mezcla del mismo tipo de muestra a analizar de individuos normales no afectados por este tipo de enfermedades. Dicho valor de referencia puede ser determinado mediante técnicas bien conocidas en el estado de la técnica, como por ejemplo, determinación del valor medio de GAG sulfatados medido en muestras de sujetos sanos. El valor de referencia se puede obtener también del mismo sujeto a analizar. En una realización preferida de la invención el valor de referencia se ha obtenido a partir de muestras de individuos sanos de la misma edad y sexo que el sujeto.
Una vez que se establece el valor de referencia, el valor de los niveles de GAG sulfatados obtenidos en la etapa (a) se puede comparar con este valor de referencia y, por lo tanto, permite la detección de alteraciones en los niveles de GAG sulfatados del sujeto con respecto al valor de referencia. En el método de la invención un nivel aumentado o disminuido de uno o más GAG sulfatados con respecto al valor de referencia es indicativo
de que el sujeto sufre una enfermedad asociada a una alteración de uno o más GAG sulfatados. Más específicamente, en el método de la invención, un aumento de los niveles de GAG sulfatados con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto padece una enfermedad asociada a un aumento de los niveles de GAG sulfatados.
En el contexto de la presente invención, “aumento de los niveles” o “nivel aumentado” con respecto al valor de referencia se entiende como una variación de los niveles por encima del valor de referencia de al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 100%, al menos el 110%, al menos el 120%, al menos el 130%, al menos el 140%, al menos el 150% o más, en comparación con el valor de referencia.
En una realización preferida, la enfermedad es mucopolisacaridosis y:
(i)
un nivel aumentado de dermatán sulfato libre con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto sufre mucopolisacaridosis de tipo I, de tipo II, de tipo VI
o de tipo VII;
(ii)
un nivel aumentado de heparán sulfato libre con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto sufre mucopolisacaridosis de tipo III; y
(iii) un nivel aumentado de queratán sulfato libre con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto sufre mucopolisacaridosis de tipo IV.
Por otra parte, en el método de la invención una disminución de los niveles de GAG sulfatados con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto padece una enfermedad asociada a una disminución de los niveles de GAG sulfatados.
De forma similar, “disminución de los niveles” o “nivel disminuido” con respecto al valor de referencia se entiende como una variación de los niveles por debajo del valor de referencia de al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o en al menos el 100% (es decir, ausente) en comparación con el valor de referencia.
En una realización, tras la etapa (a) se realiza una separación electroforética de la muestra. Dicha separación electroforética se puede llevar a cabo en cualquier tipo de gel incluyendo, sin limitación, gel de agarosa, gel de poliacrilamida y gel de acetato de celulosa. En una realización preferida el gel es un gel de acetato de celulosa. En una realización aún más
5 preferida el tampón de electroforesis es acetato de bario.
Por lo tanto, es una realización preferida de la invención un método in vitro para diagnosticar mucopolisacaridosis en un sujeto que comprende: a) separar los GAG sulfatados libres de una muestra de orina de dicho sujeto por el 10 primer método de la invención, b) someter el precipitado obtenido en la etapa anterior a electroforesis, preferiblemente en gel de acetato de celulosa, c) detectar el nivel de uno o más GAG sulfatados libres separados en b) mediante tinción con el colorante DMB, y 15 d) comparar dicho nivel con un valor de referencia para dicho uno o más GAG
sulfatados libres donde un nivel aumentado de dermatán sulfato libre con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto sufre mucopolisacaridosis de tipo I, de tipo II, de tipo VI o de tipo VII;
20 donde un nivel aumentado de heparán sulfato libre con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto sufre mucopolisacaridosis de tipo III; y donde un nivel aumentado de queratán sulfato libre con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto sufre mucopolisacaridosis de tipo IV.
25 Los inventores han encontrado que el péptido señal de la uromodulina está presente en las muestras de orina de un sujeto que padece mucopolisacaridosis, y ausente en sujetos sanos.
Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar
30 mucopolisacaridosis en un sujeto que comprende detectar en una muestra de orina de dicho sujeto la presencia del péptido señal SEQ ID NO: 1 de la uromodulina o de una variante del mismo.
En una realización preferida, el método comprende: 35 a) detectar el nivel del péptido señal SEQ ID NO: 1 de la uromodulina o de una variante del mismo en una muestra de orina de dicho sujeto y
b) comparar dicho nivel con un valor de referencia donde un nivel aumentado del péptido señal SEQ ID NO: 1 de la uromodulina o de una variante del mismo con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto sufre mucopolisacaridosis.
Se entenderá que la muestra de orina se puede analizar como tal o, de forma alternativa, la uromodulina unida a los GAG sulfatados se puede extraer primero de la muestra antes del análisis mediante cualquiera de los métodos de separación de los GAG descrito en el estado de la técnica. En una realización preferida el método de separación de los GAG es el primer método de la invención, y después se analiza la fracción unida a los GAG sulfatados que ha precipitado.
En el caso de muestras urinarias procedentes de enfermos renales, el método de la invención ha dado lugar al descubrimiento de perfiles de biomarcadores a nivel proteico unidos a GAG que funcionan como indicadores de diagnóstico de enfermedad renal.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar enfermedad renal en un sujeto que comprende detectar el nivel de uromodulina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados y/o detectar el nivel de albúmina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados en una muestra de orina de dicho sujeto y comparar dicho nivel con un valor de referencia donde un nivel disminuido de uromodulina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados con respecto al valor de referencia y/o un nivel disminuido de albúmina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto sufre enfermedad renal.
En la búsqueda intensiva de nuevos biomarcadores renales asociados a exosomas, es común realizar estrategias de depleción de la uromodulina o utilizar listas de exclusión de la misma a nivel bioinformático. Sin embargo, los inventores han descubierto un complejo formado por uromodulina, GAG sulfatados y exosomas. Estos complejos pueden ser monitorizados de manera fácil y barata en la orina para su uso como biomarcadores de diagnóstico y pronóstico de enfermedad renal dada la identificación de su característico perfil de expresión.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para diagnosticar enfermedad renal avanzada en un sujeto que comprende detectar el nivel de los complejos uromodulina
o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas en una muestra de orina de dicho sujeto y comparar dicho nivel con un valor de referencia donde un nivel disminuido de los complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto sufre enfermedad renal avanzada.
En una realización preferida la separación de la uromodulina y/o albúmina unida o asociada a GAG sulfatados y la separación de los complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas de la muestra de orina se realiza según el primer método de la invención.
El término “péptido señal”, tal como aquí se utiliza, se refiere a un péptido formado por 24 aminoácidos de secuencia SEQ ID NO: 1 que son los primeros que aparecen cuando se sintetiza la cadena polipeptídica de la uromodulina y que deciden sobre el destino, ruta de transporte y eficiencia de secreción de la uromodulina. En una realización de la invención se detecta el péptido formado por 30 aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
El término “uromodulina”, tal como aquí se utiliza, se refiere a una glicoproteína que es secretada a la orina tras escisión proteolítica, donde contribuye a la presión osmótica previniendo la infección de las vías urinarias y modulando la formación de cristales. Es la proteína más abundante presente en la orina. También se la denomina glicoproteína de Tamm-Horsfall (THP). Se expresa específicamente en el asa de Henle del riñón y se la relaciona con diferentes patologías renales. En humanos está codificada por el gen UMOD (UniGene Hs. 654425). La uromodulina humana es la proteína definida por la secuencia de la base de datos Uniprot con número de acceso P07911 con fecha 22 de julio de 2015. La secuencia P07911 corresponde al precursor de la uromodulina, cuyo péptido señal ocupa las posiciones 1 a 24, y cuyo propéptido (posiciones 615 a 640) es eliminado en la forma madura. De este modo, la uromodulina madura está formada por los aminoácidos 25 a 614; mientras que la forma secretada está formada por los aminoácidos 25 a 587 de la secuencia P07911.
El término “albúmina”, tal como aquí se utiliza, se refiere a un miembro de la familia de proteínas de la albúmina que son proteínas globulares solubles en agua, moderadamente solubles en soluciones salinas concentradas y que experimentan desnaturalización por calor. Las albúminas se encuentran habitualmente en el plasma sanguíneo. La albúmina sérica es producida por el hígado, se disuelve en el plasma sanguíneo y es la proteína sanguínea más abundante en mamíferos. En algunas patologías renales se pierde albúmina
por la orina. Particularmente, el término “albúmina” se refiere a una proteína globular que en humanos está codificada por el gen ALB (UniGene Hs. 418167). La albúmina sérica humana es la proteína definida por la secuencia de la base de datos Uniprot con número de acceso P02768 con fecha 22 de julio de 2015.
El término “complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas” se refiere a un complejo formado por la asociación de al menos tres componentes: la proteína uromodulina, GAG sulfatados y exosomas. También se incluyen en la presente invención aquellos complejos donde la uromodulina ha sido sustituida por una variante de la uromodulina. Estos tres componentes pueden encontrarse unidos o asociados de maneras muy diferentes (ver Figura 15).
El término “proteína” tal como aquí se utiliza, incluye también todas las formas fisiológicamente relevantes de modificación química después de la traducción. Las modificaciones post-traduccionales que caen dentro del alcance de la presente invención incluyen, por ejemplo, la escisión del péptido señal, glicosilación, acetilación, fosforilación, isoprenilación, proteólisis, miristoilación, plegamiento de la proteína y el proceso proteolítico, etc. Además, las proteínas pueden incluir aminoácidos no naturales formados por modificaciones posteriores a la traducción o por medio de la introducción de aminoácidos no naturales durante la traducción. Para el método diagnóstico de la invención, la proteína detectada es la que corresponde a la especie a la que pertenece el sujeto del que se ha tomado la muestra a analizar.
Las “variantes de la proteína” también se pueden utilizar para medir los niveles de proteína en los métodos de la invención. Las variantes de la proteína pueden ser: (i) aquellas en las que uno o más de los residuos de aminoácidos están sustituidos por un residuo de aminoácido conservado o no conservado (preferiblemente un aminoácido conservado) y tal residuo de aminoácido sustituido puede o no puede estar codificado por el código genético,
(ii) aquellas en las que hay uno o más residuos de aminoácidos modificados, por ejemplo, residuos que son modificados por el acoplamiento de grupos sustituyentes, (iii) aquellos en los que la proteína es una variante de corte y empalme alternativo de la proteína y/o (iv) los fragmentos de la proteína. Los fragmentos incluyen proteínas generadas a través del proceso proteolítico (incluyendo proteólisis en múltiples sitios) de una secuencia original. Dichas variantes caen dentro del alcance de la presente invención.
Las variantes según la presente invención incluyen secuencias de aminoácidos que tienen al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 96% de similitud o identidad con la secuencia original de aminoácidos. Como se sabe, la “similitud” entre dos proteínas se determina por medio de la comparación de la secuencia de aminoácidos de una proteína con una secuencia de una segunda proteína. El grado de “identidad” entre dos proteínas se determina usando algoritmos informáticos y métodos que son ampliamente conocidos por el experto en la técnica, preferiblemente usando el algoritmo BLASTP [BLASTManual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894, Altschul, S., et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)].
En una realización particular la variante es una variante de mamífero, preferiblemente una variante humana, más preferiblemente con al menos 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 96% de similitud o identidad con la secuencia original de aminoácidos.
Los niveles de expresión de una proteína o péptido pueden ser detectados y cuantificados mediante métodos convencionales. Dichos métodos incluyen, sin limitación, la detección de la proteína midiendo su afinidad a uno de sus ligandos, y la posterior cuantificación del complejo proteína-ligando, o por medio de la utilización de anticuerpos con capacidad de unirse específicamente a la proteína (o fragmentos de los mismos que contienen los determinantes antigénicos) y la posterior cuantificación de los complejos antígenoanticuerpo resultante. En una forma preferida de realización la detección se lleva a cabo por medio de un anticuerpo que se une específicamente a la proteína o de un fragmento del mismo con capacidad para unirse al antígeno.
Los anticuerpos que pueden ser utilizados en estos ensayos son, por ejemplo, anticuerpos policlonales de suero; sobrenadantes de hibridomas o anticuerpos monoclonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados, anticuerpos primatizados, anticuerpos humanos, anticuerpos biespecíficos, y fragmentos de anticuerpos tales como Fab, Fab’, F(ab’)2, scFv, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y nanocuerpos. Además, los anticuerpos usados en el método de la invención pueden o no pueden estar marcados con un agente detectable. En una forma de realización particular, el anticuerpo utilizado está conjugado con un agente detectable.
En el contexto de la presente invención, los términos “agente detectable” y “marcaje” son sinónimos y se refieren a un agente de tal naturaleza que permite su detección mediante métodos enzimáticos, radiactivos o de fluorescencia. El compuesto detectable puede ser una enzima, un compuesto marcado radiactivamente o un isótopo radiactivo, un
fluorocromo, un reactivo químioluminiscente, un sustrato enzimático o cofactor, un inhibidor enzimático, una partícula, un colorante, etc.
Los compuestos marcados radiactivamente por medio de isótopos radiactivos, también llamados radioisótopos o radionúclidos, pueden incluir, sin limitación, 3H, 14C, 15N, 35S, 90Y, 99Tc, 111In, 125I, 131I. Los marcadores fluorescentes pueden incluir, sin limitación, rodamina, fósforos lantánidos o FITC. Los marcadores enzimáticos pueden incluir, sin limitación, peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa, luciferasa o fosfatasa alcalina. Los marcajes preferidos incluyen, pero no se limitan a, fluoresceína, una fosfatasa tal como la fosfatasa alcalina, biotina, avidina, una peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante y compuestos relacionados con biotina o compuestos relacionados con avidina (por ejemplo, estreptavidina o ImmunoPure® NeutrAvidin disponible en Pierce, Rockford, IL).
Hay una amplia variedad de ensayos bien conocidos que se pueden utilizar en la presente invención, en los que se utilizan anticuerpos no marcados primarios y anticuerpos marcados secundarios: tales técnicas incluyen Western-blot o transferencia de Western, ELISA (ensayo por immunoabsorción ligado a enzimas), RIA (radioinmunoensayo), EIA competitivo (inmunoensayo enzimático competitivo), DAS-ELISA (ELISA sándwich de doble anticuerpo),
o técnicas basadas en el uso de biochips o microarrays de proteínas que incluyan anticuerpos específicos o ensayos basados en la precipitación coloidal en formas tales como tiras reactivas. Otras formas para la detección de proteínas incluyen técnicas tales como cromatografía de afinidad, ensayos de unión a ligando, etc. Hay anticuerpos comerciales contra las proteínas de la invención en el mercado que se pueden utilizar en el contexto de la invención.
En una realización particular, la cuantificación de los niveles de proteína se realiza por transferencia Western o ELISA.
En otra realización preferida, la detección se realiza mediante espectrometría de masas, preferiblemente espectrometría de masas en tándem, que ha sido definida con anterioridad.
La persona experta en la técnica apreciará que el método de la invención se puede poner en práctica utilizando tanto el nivel absoluto como el nivel relativo de expresión de la proteína. Por lo tanto, en la presente invención, la expresión “niveles de la proteína” se utiliza para referirse tanto a los niveles absolutos como a los niveles relativos de dicha proteína.
La expresión "valores absolutos" se refiere a la cantidad total de la proteína de interés en una muestra. Dicho valor puede ser dado como la concentración de proteína expresada en unidades de masa por unidad de volumen (por ejemplo, en ng/ml de muestra), en el número de moléculas de proteína por unidad de volumen (por ejemplo, en pmol de proteína/ml de muestra), en las unidades de masa de proteína X por unidad de masa de proteína total (pg proteína X/mg proteína total) o en el número de moléculas de proteína X por unidad de masa de la proteína total (por ejemplo, en pmol proteína X/mg de proteína total).
La expresión "niveles relativos" se refiere a la relación entre los niveles de expresión de la proteína objeto del estudio y de una proteína de referencia, es decir, se define como la concentración de proteína objeto del estudio en forma normalizada con respecto a dicha proteína de referencia.
Con el fin de normalizar los valores de proteína entre las diferentes muestras, es posible comparar niveles de la proteína en estudio en las muestras a analizar con la expresión de una proteína de control. “Proteína de control” en la presente invención se entiende como una proteína cuya expresión no cambia o solo cambia en cantidades limitadas en las células alteradas con respecto a células no alteradas. Preferiblemente, la proteína de control es una proteína codificada por genes que se expresan constitutivamente, que son aquellos genes siempre activos o que son transcritos constantemente, de tal manera que estas proteínas se expresan constitutivamente y llevan a cabo funciones celulares esenciales. Las proteínas de control preferidas que se pueden utilizar en la presente invención incluyen, sin limitación, β2-microglobulina (B2M), ubiquitina, proteína ribosomal 18-S, ciclofilina, GAPDH, PSMB4, tubulina y actina. En una realización más preferida la proteína de control es tubulina.
La persona experta en la técnica entiende que las mutaciones en la secuencia de aminoácidos de la proteína en estudio no afectan a la detección de la expresión de la misma y, por lo tanto, las variantes de esta proteína generada por mutaciones de la secuencia de aminoácidos caen dentro del alcance de la presente invención.
Una vez que se ha determinado el nivel de expresión de la proteína en una muestra, se lleva a cabo la etapa (b) de la invención que consiste en comparar los niveles de la proteína en estudio obtenidos en la etapa (a) con un valor de referencia.
El término “valor de referencia”, como se usa en el presente documento, se refiere a criterios predeterminados usados como referencia para evaluar los valores o datos obtenidos de las
muestras recogidas de un sujeto. El valor de referencia o nivel de referencia puede ser un valor absoluto, un valor relativo, un valor que tiene un límite superior o inferior, un intervalo de valores, un valor medio, un valor mediana, un valor de media, o un valor comparado con un control particular o valor basal. Un valor de referencia se puede basar en un valor de una muestra individual, tal como, por ejemplo, un valor obtenido de muestra del sujeto que se analiza, pero en un momento anterior en el tiempo. El valor de referencia se puede basar en un gran número de muestras, tal como de una población de sujetos del grupo coincidente de edad cronológica, o basarse en un conjunto de muestras que incluyen o excluyen la muestra que se analiza. En general, el valor de referencia procede de un conjunto de muestras formado preferiblemente por una mezcla del mismo tipo de muestra a analizar de individuos normales no afectados por la enfermedad. Dicho valor de referencia puede ser determinado mediante técnicas bien conocidas en el estado de la técnica, como por ejemplo, determinación del valor medio de la proteína medida en una muestra obtenida de sujetos sanos. El valor de referencia se puede obtener también de proteínas expresadas constitutivamente tomadas del mismo sujeto a analizar.
Una vez que se establece el valor de referencia, el valor de los niveles de proteína obtenidos en la etapa (a) se puede comparar con este valor de referencia y, por lo tanto, permite la detección de alteraciones en los niveles de proteína del sujeto con respecto al valor de referencia.
En el contexto de la presente invención, “aumento de los niveles” o “nivel aumentado” con respecto al valor de referencia se entiende como una variación de los niveles por encima del valor de referencia de al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 100%, al menos el 110%, al menos el 120%, al menos el 130%, al menos el 140%, al menos el 150% o más, en comparación con el valor de referencia.
Por otra parte, en el método de la invención una disminución de los niveles de GAG sulfatados con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto padece una enfermedad asociada a una disminución de los niveles de GAG sulfatados.
De forma similar, “disminución de los niveles” o “nivel disminuido” con respecto al valor de referencia se entiende como una variación de los niveles por debajo del valor de referencia
de al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 35%, al menos el 40%, al menos el 45%, al menos el 50%, al menos el 55%, al menos el 60%, al menos el 65%, al menos el 70%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95% o en al menos el 100% (es decir, ausente) en comparación con el valor de referencia.
Por “enfermedad renal avanzada” se entiende no solamente la etapa final de la enfermedad renal, o enfermedad renal terminal, cuando los riñones ya no tienen capacidad para eliminar suficientes desechos y es necesario someterse a diálisis o a un trasplante de riñón, sin también la etapa en la que la enfermedad ha avanzado de modo que los riñones casi han dejado de ejercer su función y la sintomatología es leve, como por ejemplo, piel anormalmente oscura o clara, dolor óseo, somnolencia o problemas de concentración, entumecimiento o hinchazón de manos y pies, fasciculaciones musculares o calambres, mal aliento, susceptibilidad a hematomas o sangre en las heces, sed excesiva, hipos frecuentes, amenorrea, dificultad para respirar y vómitos.
Estos métodos pueden consistir esencialmente en las etapas mencionadas anteriormente o pueden incluir etapas adicionales.
El resto de términos se han definido en aspectos anteriores. Cualquier realización descrita con anterioridad es aplicable a los métodos diagnósticos de la invención.
Métodos para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de una enfermedad
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de una enfermedad asociada a un aumento de uno o más GAG sulfatados en un sujeto que comprende:
a) separar los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a GAG sulfatados
de una muestra biológica de dicho sujeto por el primer método de la invención;
b) detectar el nivel de uno o más GAG sulfatados separados en a); y
c) comparar dicho nivel con un valor de referencia para dicho uno o más GAG
sulfatados obtenido del mismo sujeto en un momento previo donde una disminución en el nivel de uno o más GAG sulfatados con respecto al valor de referencia es indicativo de que la enfermedad asociada a un aumento de uno o más GAG sulfatados tiene buen pronóstico o
donde un aumento en el nivel de uno o más GAG sulfatados con respecto al valor de referencia es indicativo de que la enfermedad asociada a un aumento de uno o más GAG sulfatados tiene mal pronóstico.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de una enfermedad asociada a una disminución de uno o más GAG sulfatados en un sujeto que comprende:
a) separar los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra biológica de dicho sujeto por el primer método de la invención;
b) detectar el nivel de uno o más GAG sulfatados separados en a); y c) comparar dicho nivel con un valor de referencia para dicho uno o más GAG
sulfatados obtenido del mismo sujeto en un momento previo donde una disminución en el nivel de uno o más GAG sulfatados con respecto al valor de referencia es indicativo de que la enfermedad asociada a una disminución de uno o más GAG sulfatados tiene mal pronóstico o donde un aumento en el nivel de uno o más GAG sulfatados con respecto al valor de referencia es indicativo de que la enfermedad asociada a una disminución de uno o más GAG sulfatados tiene buen pronóstico.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de un sujeto que sufre mucopolisacaridosis que comprende: a) detectar el nivel del péptido señal SEQ ID NO: 1 de la uromodulina o de una variante del mismo en una muestra de orina de dicho sujeto y b) comparar dicho nivel con un valor de referencia obtenido del mismo sujeto en un
momento previo donde una disminución en el nivel del péptido señal SEQ ID NO: 1 de la uromodulina o de una variante del mismo con respecto al valor de referencia es indicativo de que la enfermedad tiene buen pronóstico o donde un aumento en el nivel del péptido señal SEQ ID NO: 1 de la uromodulina o de una variante del mismo con respecto al valor de referencia es indicativo de que la enfermedad tiene mal pronóstico.
El perfil urinario homogéneo observado en población general está alterado en enfermos renales a nivel proteico y podría ser usado como biomarcador de función y prognosis renal, adelantándose en varios años a los cambios en los niveles de creatinina, el biomarcador de
daño renal de referencia actualmente, ya que el 50% de la función renal puede haberse perdido antes de que los niveles de creatinina cambien significativamente.
A nivel proteico esta huella dactilar urinaria está asociada a la uromodulina y a distintos GAG (condroitín, dermatán y heparán sulfato) conocidos por formar parte de la membrana glomerular basal, de la matriz extracelular y de la capa de mucopolisacáridos de la superficie uroepitelial. La uromodulina presenta un patrón de expresión inverso a los niveles de creatinina, tendiendo a disminuir progresivamente en enfermos renales avanzados (determinado por los niveles de creatinina sérica, proteinuria y otros signos clínicos). El método de la invención ha permitido observar que cuanto mayor es el daño y evolución del fallo renal, aún sin cambios significativos en los niveles de creatinina, menor es la presencia (semicuantitativa) de la uromodulina asociada a los GAG en orina.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de enfermedad renal en un sujeto que comprende detectar el nivel de uromodulina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados y/o detectar el nivel de albúmina o de una variante de la misma unida
o asociada a los GAG sulfatados en una muestra de orina de dicho sujeto y comparar dicho nivel con un valor de referencia obtenido del mismo sujeto en un momento previo donde una disminución en el nivel de uromodulina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados y/o una disminución en el nivel de albúmina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados con respecto al valor de referencia es indicativo de que la enfermedad tiene mal pronóstico o donde un aumento en el nivel de uromodulina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados y/o un aumento en el nivel de albúmina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados con respecto al valor de referencia es indicativo de que la enfermedad tiene buen pronóstico.
En otro aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de enfermedad renal avanzada en un sujeto que comprende
a) detectar el nivel de los complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG
sulfatados-exosomas en una muestra de orina de dicho sujeto; y
b) comparar dicho nivel con un valor de referencia obtenido del mismo sujeto en un
momento previo
donde una disminución en el nivel de los complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas con respecto al valor de referencia es indicativo de que la enfermedad tiene mal pronóstico o donde un aumento en el nivel de los complejos uromodulina o una variante de la misma-
GAG sulfatados-exosomas respecto enfermedad tiene buen pronóstico.
al valor de referencia es indicativo de que la
La progresión de la enfermedad puede métodos.
ser f ácilm ente segui da de acuerdo con estos
Tal como se utiliza en la presente invención, la expresión “monitorizar la progresión” de una enfermedad, que es equivalente a “determinar el pronóstico”, se refiere a la determinación de uno o varios parámetros que indican la progresión de la enfermedad en un paciente diagnosticado de la misma. Parámetros apropiados para determinar la evolución de un sujeto diagnosticado con una enfermedad son, sin limitación, riesgo de recaída, supervivencia libre de enfermedad y/o supervivencia global del sujeto. En la presente memoria, la expresión “riesgo de recaída” se entiende como la probabilidad de que un sujeto desarrolle la enfermedad después de un período libre de enfermedad; la “supervivencia libre de enfermedad” se entiende como el período de tiempo después del tratamiento en el que no se detecta la enfermedad; y la “supervivencia global del sujeto” se entiende como el porcentaje de sujetos que sobreviven, desde el momento del diagnóstico o tratamiento, después de un período de tiempo definido.
De acuerdo con estos aspectos de la invención, los niveles de uno o más GAG sulfatados o los niveles de proteína en una muestra biológica de un sujeto que tiene la enfermedad se obtienen en un primer periodo de tiempo (primera muestra del sujeto) y los niveles de uno o más GAG sulfatados o los niveles de proteína en una muestra biológica del mismo sujeto se obtienen en un segundo periodo de tiempo (segunda muestra del sujeto) y se comparan permitiendo monitorizar la progresión de la enfermedad. La segunda muestra del sujeto puede tomarse del mismo sujeto del cual se deriva la primera medida, en un segundo período de tiempo, es decir, en cualquier momento después del primer periodo de tiempo, por ejemplo, un día, una semana, un mes, dos meses, tres meses, 1 año, 2 años, o más después de la primera muestra del sujeto. En una realización particular la primera muestra del sujeto se toma antes de recibir el tratamiento y la segunda muestra del sujeto se toma después del tratamiento. En otra realización particular la primera muestra del sujeto se toma
después de que el sujeto ha comenzado a recibir tratamiento y la segunda muestra del sujeto se toma después en diferentes periodos de tiempo durante el curso del tratamiento.
El término “buen pronóstico” significa que la enfermedad no está en progresión. “Buen
5 pronóstico” también hace referencia a un desenlace positivo para el paciente y depende del tipo de pronóstico; por ejemplo, un buen pronóstico de un año de supervivencia significa que el paciente sobrevivirá durante al menos un año. En una realización preferida, un buen pronóstico se refiere a una probabilidad de más del 40% de sobrevivir 5 años tras el diagnóstico de la enfermedad.
10 El término “mal pronóstico” significa que la enfermedad está en progresión y que la terapia administrada al sujeto en estudio debe ser cambiada y una nueva terapia debe ser diseñada para tratar la enfermedad. “Mal pronóstico” también hace referencia a un desenlace negativo para el paciente y depende del tipo de pronóstico; por ejemplo, un mal pronóstico de 1 año
15 de supervivencia significa que el paciente no sobrevivirá durante al menos 1 año. En una realización preferida, un mal pronóstico se refiere a una probabilidad inferior al 40% de sobrevivir 5 años tras el diagnóstico de la enfermedad.
En una realización preferida la separación de la uromodulina y/o albúmina asociada a GAG
20 sulfatados o la separación de los complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas de la muestra de orina se realiza según el primer método de la invención.
Los niveles de los GAG sulfatados pueden determinarse como se ha descrito anteriormente.
25 Como se ha mencionado anteriormente en relación con el método de diagnóstico de la invención, los niveles de las proteínas o de las variantes de las mismas se pueden determinar mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica, tales como, por ejemplo, Western blot o ELISA.
30 En otra realización preferida, la detección se realiza mediante espectrometría de masas, preferiblemente espectrometría de masas en tándem.
Una vez que se han determinado los niveles de expresión de la proteína o una variante de la
35 misma en las muestras de un sujeto en diferentes períodos de tiempo (primera y segunda muestras del sujeto), es necesario identificar si hay un aumento o disminución significativo
en la expresión de dicha proteína en la segunda muestra del sujeto en comparación con el nivel de expresión de dicha proteína en la primera muestra del sujeto. Los términos “aumento” o “disminución” de los niveles
5 Los términos "incremento de los niveles" y "disminución de los niveles" aplicados al nivel de GAG sulfatados o al nivel de expresión de una proteína o una variante de la misma se han definido anteriormente en el contexto de los métodos diagnósticos de la invención.
En una realización preferida la enfermedad renal es poliquistosis renal autosómica
10 dominante de tipo 1 o de tipo 2, preferiblemente es poliquistosis renal autosómica dominante de tipo 1 o de tipo 2 asociada a mutaciones conocidas en los genes PKD1 (chr16:41711del18bp; chr16:28907c>g; chr16:37060c>t) y PKD2 (chr4:88995974c>t).
La mayoría de términos se han definido previamente en el contexto del método diagnóstico 15 de la invención y se aplican igualmente a este aspecto inventivo.
Las realizaciones descritas para los aspectos inventivos anteriores también son aplicables a los métodos pronósticos de la invención.
20 Métodos para monitorizar el efecto de una terapia
La invención también proporciona métodos para la determinación de la eficacia de una terapia para el tratamiento de una enfermedad asociada a un aumento de uno o más GAG sulfatados, de una enfermedad asociada a una disminución de uno o más GAG sulfatados, y
25 particularmente de mucopolisacaridosis y enfermedad renal.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para monitorizar el efecto de una terapia para el tratamiento de una enfermedad asociada a un aumento de uno o más GAG sulfatados que comprende:
30 a) separar los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra biológica de un sujeto que sufre dicha enfermedad y que ha sido tratado con dicha terapia por el primer método de la invención; y
b) detectar el nivel de uno o más GAG sulfatados separados en a) donde una disminución del nivel de uno o más GAG sulfatados con respecto al nivel del 35 mismo GAG sulfatado en una muestra procedente del mismo sujeto antes de la terapia es indicativo de que la terapia administrada es efectiva o
donde un aumento o la ausencia de cambio en el nivel de uno o más GAG sulfatados con respecto al nivel del mismo GAG sulfatado en una muestra procedente del mismo sujeto antes de la terapia es indicativo de que la terapia administrada es inefectiva o de que el sujeto necesita una terapia alternativa.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para monitorizar el efecto de una terapia para el tratamiento de una enfermedad asociada a una disminución de uno o más GAG sulfatados que comprende:
a) separar los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra biológica de un sujeto que sufre dicha enfermedad y que ha sido tratado con dicha terapia por el primer método de la invención; y
b) detectar el nivel de uno o más GAG sulfatados separados en a) donde un aumento del nivel de uno o más GAG sulfatados con respecto al nivel del mismo GAG sulfatado en una muestra procedente del mismo sujeto antes de la terapia es indicativo de que la terapia administrada es efectiva o donde una disminución o la ausencia de cambio en el nivel de uno o más GAG sulfatados con respecto al nivel del mismo GAG sulfatado en una muestra procedente del mismo sujeto antes de la terapia es indicativo de que la terapia administrada es inefectiva o de que el sujeto necesita una terapia alternativa.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para monitorizar el efecto de una terapia en un sujeto que sufre mucopolisacaridosis y que es tratado con dicha terapia que comprende:
a) detectar el nivel del péptido señal SEQ ID NO: 1 de la uromodulina o de una variante del mismo en una muestra de orina de dicho sujeto y b) comparar dicho nivel con un valor de referencia obtenido del mismo sujeto antes
de la terapia donde una disminución en el nivel del péptido señal SEQ ID NO: 1 de la uromodulina o de una variante del mismo con respecto al valor de referencia es indicativo de que la terapia administrada es efectiva o donde un aumento en el nivel del péptido señal SEQ ID NO: 1 de la uromodulina o de una variante del mismo con respecto al valor de referencia es indicativo de que la terapia administrada es inefectiva o de que el sujeto necesita una terapia alternativa.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para monitorizar el efecto de una terapia en un sujeto que sufre enfermedad renal y que es tratado con dicha terapia que comprende:
a) detectar el nivel de uromodulina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados y/o detectar el nivel de albúmina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados en una muestra de orina de dicho sujeto y
b) comparar dicho nivel con un valor de referencia obtenido del mismo sujeto antes
de la terapia donde un aumento en el nivel de uromodulina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados y/o un aumento en el nivel de albúmina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados con respecto al valor de referencia es indicativo de que la terapia administrada es efectiva o donde una disminución en el nivel de uromodulina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados y/o una disminución en el nivel de albúmina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados con respecto al valor de referencia es indicativo de que la terapia administrada es inefectiva o de que el sujeto necesita una terapia alternativa.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para monitorizar el efecto de una terapia en un sujeto que sufre enfermedad renal avanzada y que es tratado con dicha terapia que comprende:
a) detectar el nivel de los complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas en una muestra de orina de dicho sujeto y b) comparar dicho nivel con un valor de referencia obtenido del mismo sujeto antes
de la terapia donde un aumento en el nivel de los complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas respecto al valor de referencia es indicativo de que la terapia administrada es efectiva o donde una disminución en el nivel de los complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas con respecto al valor de referencia es indicativo de que la terapia administrada es inefectiva o de que el sujeto necesita una terapia alternativa.
En una realización preferida la separación de la uromodulina y/o albúmina asociada a GAG sulfatados o la separación de los complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG
sulfatados-exosomas de la muestra de orina se realiza según el primer método de la invención.
La expresión “monitorizar el efecto de una terapia” tal como aquí se utiliza se refiere a efectuar el seguimiento de la enfermedad a lo largo del tratamiento para determinar si este es efectivo o no lo es.
Como se usa aquí, el término “terapia” o “tratamiento” se refiere colectivamente a los medios de cualquier clase (medios higiénicos, medios farmacológicos, medios quirúrgicos o medios físicos) el propósito de los cuales es prevenir y/o curar o aliviar una enfermedad o patología
o sus síntomas. En una realización la terapia se selecciona de terapia de la dieta, tratamiento farmacológico, terapia de ejercicio y una combinación de las mismas. En una realización preferida, dicho tratamiento es un tratamiento farmacológico, es decir, un tratamiento que comprende la administración de un fármaco a un sujeto para prevenir, aliviar y/o curar una enfermedad; o para aliviar, reducir o eliminar uno o más síntomas asociados con dicha enfermedad.
En la presente invención se entiende por “terapia estándar” ó “terapia convencional” a aquella terapia que emplea los fármacos que han demostrado eficacia clínica en estudios fase III aleatorizados, solos o en combinaciones similares a las empleadas en la presente invención. Por ejemplo, la terapia convencional para el tratamiento de la mucopolisacaridosis puede ser terapia sintomática, tratamientos enzimáticos sustitutivos, inhibidores de sustrato y trasplante de médula ósea (progenitores hematopoyéticos). La terapia convencional para el tratamiento de la enfermedad renal depende de la etiología de la misma, y puede ser, sin limitación, inmunosupresores como tacrolimus o ciclosporina; suplementos o restriccción de sales minerales como sodio, potasio, magnesio; dieta o diuréticos como amilorida, triamtereno o tolvaptan; y en otras ocasiones la única solución es la diálisis o el trasplante. Estos tratamientos son conocidos por los expertos en nefrología.
En la presente invención se entiende por “terapia alternativa” a una terapia distinta de la terapia administrada originalmente, aquí denominada terapia estándar, a un sujeto. Dicha “terapia alternativa” incluye variaciones significativas a la terapia estándar, como la sustitución de unos agentes por otros, la adición de agentes alternativos, cambio de dosis o aumento de la intensidad de dosis de los fármacos, adición de otros agentes (aprobados o en fase de experimentación), alteración en la secuencia de administración de los agentes o el tipo de tratamientos locales, como la cirugía o la radioterapia, etc. Las terapias
alternativas aquí definidas probablemente se asocien con mayores efectos secundarios para el sujeto (aunque no necesariamente) y previsiblemente, mayor efectividad. Ejemplos concretos de agentes incluidos dentro de la terapia alternativa de la mucopolisacaridosis podrían ser terapia de “mejora” enzimática cuando existe actividad enzimática residual, o
5 terapia génica en proceso de ensayo clínico. Ejemplos concretos de agentes incluidos dentro de la terapia alternativa de la enfermedad renal podrían ser cualquiera de los agentes que no se han utilizado como terapia estándar y, preferiblemente, diálisis y/o trasplante renal.
10 La muestra de referencia es una muestra del mismo paciente que padece la enfermedad que o bien no ha sido tratado o bien ha sido tratado con terapia de control, preferiblemente, el mismo excipiente, soporte o vehículo que se usa en la terapia cuya eficacia se va a evaluar.
15 En otra realización preferida, la detección se realiza mediante espectrometría de masas, preferiblemente espectrometría de masas en tándem.
En una realización preferida la enfermedad renal es poliquistosis renal autosómica dominante de tipo 1 o de tipo 2.
20 Las diferentes realizaciones de los métodos de diagnóstico y pronóstico de la invención (los métodos usados para la determinación de los niveles de los marcadores, la naturaleza de la muestra que se va a estudiar, los umbrales para considerar que un marcador ha aumentado
o disminuido) son esencialmente como se han definido previamente con respecto a los 25 métodos de diagnóstico y pronóstico de la invención.
Métodos para identificar compuestos adecuados para el tratamiento de una enfermedad
Los autores de la presente invención también han desarrollado un método para la
30 identificación de un compuesto adecuado para el tratamiento de enfermedades asociadas con un aumento o disminución de uno o más GAG sulfatados, de mucopolisacaridosis y de enfermedad renal. La identificación de una serie de marcadores cuyos niveles aumentan o disminuyen con respecto a muestras de referencia permite el cribado de compuestos en un modelo de estas enfermedades que son capaces de restablecer los niveles de los
35 marcadores a los encontrados en muestras normales.
En un aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de una enfermedad asociada a un aumento de uno o más GAG sulfatados que comprende:
a) separar los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG 5 sulfatados de una muestra biológica de un sujeto que sufre dicha enfermedad y que ha sido tratado con un compuesto candidato por el primer método de la invención; y
b) detectar el nivel de uno o más GAG sulfatados separados en a) donde el compuesto se considera efectivo para el tratamiento de la enfermedad cuando el nivel de uno o más GAG sulfatados disminuye con respecto al nivel del mismo GAG
10 sulfatado en una muestra de referencia.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de una enfermedad asociada a una disminución de uno o más GAG sulfatados que comprende:
15 a) separar los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra biológica de un sujeto que sufre dicha enfermedad y que ha sido tratado con un compuesto candidato por el primer método de la invención; y
b) detectar el nivel de uno o más GAG sulfatados separados en a) donde el compuesto se considera efectivo para el tratamiento de la enfermedad cuando el 20 nivel de uno o más GAG sulfatados aumenta con respecto al nivel del mismo GAG sulfatado en una muestra de referencia.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de mucopolisacaridosis que comprende:
25 a) detectar el nivel del péptido señal SEQ ID NO: 1 de la uromodulina o de una variante del mismo en una muestra de orina de un sujeto que sufre de mucopolisacaridosis y que ha sido tratado con un compuesto candidato y
b) comparar dicho nivel con un valor de referencia donde el compuesto se considera efectivo para el tratamiento de la enfermedad cuando el 30 nivel del péptido señal SEQ ID NO:1 de la uromodulina o de una variante del mismo disminuye con respecto al valor de referencia.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de enfermedad renal que comprende: a) detectar el nivel de uromodulina o de una variante de la misma unida o asociada 35 a los GAG sulfatados y/o detectar el nivel de albúmina o de una variante de la
misma unida o asociada a los GAG sulfatados en una muestra de orina de un sujeto que sufre enfermedad renal y que ha sido tratado con un compuesto candidato y
b) comparar dicho nivel con un valor de referencia donde el compuesto se considera efectivo para el tratamiento de la enfermedad cuando el nivel de uromodulina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados y/o el nivel de albúmina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados aumenta con respecto al valor de referencia.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de enfermedad renal avanzada que comprende:
a) detectar el nivel de los complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas en una muestra de orina de un sujeto que sufre de enfermedad renal avanzada y que ha sido tratado con un compuesto candidato y
b) comparar dicho nivel con un valor de referencia donde el compuesto se considera efectivo para el tratamiento de la enfermedad renal avanzada cuando el nivel de los complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas aumenta con respecto al valor de referencia.
En una realización preferida la separación de la uromodulina y/o albúmina asociada a GAG sulfatados, o la separación de los complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas de la muestra de orina se realiza según el primer método de la invención.
La expresión “identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de una enfermedad” se refiere tanto a un método de cribado para la identificación de compuestos efectivos para el tratamiento de la enfermedad existente como para el tratamiento preventivo (es decir, profilaxis). El término “tratamiento” ha sido definido en el contexto de los métodos de monitorización de una terapia.
El término “muestra de referencia”, como se usa con respecto a este método, se refiere a una muestra que deriva de un sujeto enfermo en donde se está ensayando la terapia pero obtenida del sujeto enfermo antes de la administración de dicha terapia. La muestra de referencia también puede ser una muestra de un sujeto que padece la enfermedad y que no ha sido tratado o que ha sido tratado con terapia control, preferiblemente, el mismo excipiente, soporte o vehículo que se usa en el compuesto candidato que se criba.
El sujeto puede ser un paciente o bien un animal utilizado como modelo de la enfermedad. Los ejemplos de animales adecuados para su uso en el método de cribado de la invención incluyen, pero no están limitados a, ratones, ratas, conejos, monos, cobayas, perros y gatos. Según esta forma de realización, se administra el compuesto a ensayar o un compuesto control (por ejemplo, por vía oral, rectal o parenteral tal como por vía intraperitoneal o intravenosa) a un animal adecuado y se determina el efecto sobre los niveles de uno o más de los marcadores. Los ejemplos de agentes incluyen, pero no están limitados a, ácidos nucleicos (por ejemplo ADN y ARN), hidratos de carbono, lípidos, proteínas, péptidos, peptidomiméticos, moléculas pequeñas y otros fármacos. Los agentes se pueden obtener usando cualquiera de los numerosos planteamientos en los métodos de librerías combinatorias conocidos en la técnica. Los compuestos a ensayar incluyen además, por ejemplo, anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanizados, anti-idiotípicos, quiméricos, y de cadena sencilla así como fragmentos Fab, F(ab’)2, librerías de expresión de Fab, y fragmentos de unión a epítopos de anticuerpos). Además, los agentes o librerías de compuestos se pueden presentar, por ejemplo, en solución, en bolas, chips, bacterias, esporas, plásmidos o fagos.
Si el compuesto es un compuesto de bajo peso molecular, entonces este se puede generar mediante varios métodos conocidos en la técnica, preferiblemente de forma sintética, en particular mediante química combinatoria, o mediante métodos bioquímicos, en particular mediante expresión recombinante o purificación a partir de sondas biológicas. El compuesto puede ser de bajo peso molecular (“moléculas pequeñas”) o la librería puede estar compuesta de moléculas con bajo peso molecular (“librería de moléculas pequeñas”). Una “molécula pequeña” se define como una colección compleja de compuestos, que se producen de forma no biológica, lo que significa que no se producen mediante expresión recombinante, como por ejemplo la mayoría de las librerías de proteínas o péptidos. Las “moléculas pequeñas” se pueden generar mediante varios métodos conocidos en la técnica, pero se producen preferiblemente de forma sintética, más preferiblemente mediante química combinatoria, para generar una librería de compuestos con una diversidad química máxima dentro de las restricciones de las características predichas de un fármaco atractivo. Si el compuesto del que se ensaya su idoneidad para el tratamiento de una enfermedad es un péptido o una librería de péptidos, entonces estos se pueden generar mediante varios métodos conocidos en la técnica para su uso como compuestos candidatos, pero preferiblemente se producen mediante métodos bioquímicos, más preferiblemente mediante expresión recombinante en células procariotas o eucariotas.
El compuesto del que se va a ensayar su idoneidad para la terapia se puede formular con un soporte farmacéuticamente aceptable para producir una composición farmacéutica, que se puede administrar a un ser humano u otro animal. Un soporte farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, agua, tampón fosfato de sodio, solución salina tamponada con fosfato, solución salina normal o solución de Ringer u otra solución salina tamponada fisiológicamente, u otro solvente o vehículo, tales como un glicol, glicerol, un aceite tal como aceite de oliva, o un éster orgánico inyectable. Un soporte farmacéuticamente aceptable también puede contener compuestos fisiológicamente aceptables que actúan, por ejemplo, para estabilizar o aumentar la absorción del compuesto modulador. El experto en la materia sabría que la elección de un soporte farmacéuticamente aceptable, incluyendo un compuesto fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la vía de administración de la composición.
En otra realización preferida, la detección se realiza mediante espectrometría de masas, preferiblemente espectrometría de masas en tándem.
En una realización preferida la enfermedad renal es poliquistosis renal autosómica dominante de tipo 1 o de tipo 2.
Las diferentes realizaciones de los métodos de diagnóstico y pronóstico de la invención (los métodos usados para la determinación de los niveles de los marcadores, la naturaleza de la muestra que se va a estudiar, los umbrales para considerar que un marcador ha aumentado
o disminuido) son esencialmente como se han definido previamente con respecto a los métodos de diagnóstico y pronóstico de la invención.
Métodos para diseñar una terapia personalizada o para seleccionar un paciente susceptible de ser tratado con una terapia para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad
En un aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para diseñar una terapia personalizada en un sujeto que tiene síntomas de mucopolisacaridosis que comprende: a) detectar el nivel del péptido señal SEQ ID NO: 1 de la uromodulina o de una variante del mismo en una muestra de orina de dicho sujeto y b) comparar dicho nivel con un valor de referencia
donde un nivel aumentado del péptido señal SEQ ID NO: 1 de la uromodulina o de una variante del mismo con respecto al valor de referencia es indicativo de que dicho sujeto es susceptible de recibir una terapia para la prevención y/o tratamiento de mucopolisacaridosis.
5 En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para seleccionar un paciente susceptible de ser tratado con una terapia para la prevención y/o tratamiento de mucopolisacaridosis que comprende:
a) detectar el nivel del péptido señal SEQ ID NO: 1 de la uromodulina o de una variante del mismo en una muestra de orina de dicho sujeto y
10 b) comparar dicho nivel con un valor de referencia donde un nivel aumentado del péptido señal SEQ ID NO: 1 de la uromodulina o de una variante del mismo con respecto al valor de referencia es indicativo de que dicho sujeto es un candidato a recibir una terapia para la prevención y/o tratamiento de la mucopolisacaridosis.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para diseñar una terapia personalizada en un sujeto que tiene síntomas de enfermedad renal que comprende: a) detectar el nivel de uromodulina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados y/o detectar el nivel de albúmina o de una variante de la misma 20 unida o asociada a los GAG sulfatados en una muestra de orina de dicho sujeto y
b) comparar dicho nivel con un valor de referencia donde una disminución en el nivel de uromodulina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados y/o una disminución en el nivel de albúmina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados con respecto al valor de
25 referencia es indicativo de que dicho sujeto es susceptible de recibir una terapia para la prevención y/o tratamiento de enfermedad renal.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para seleccionar un paciente susceptible de ser tratado con una terapia para la prevención y/o tratamiento de enfermedad 30 renal que comprende:
a) detectar el nivel de uromodulina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados y/o detectar el nivel de albúmina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados en una muestra de orina de dicho sujeto y
35 b) comparar dicho nivel con un valor de referencia
donde una disminución en el nivel de uromodulina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados y/o una disminución en el nivel de albúmina o de una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados con respecto al valor de referencia es indicativo de que dicho sujeto es un candidato a recibir una terapia para la
5 prevención y/o tratamiento de la enfermedad renal.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para diseñar una terapia personalizada en un sujeto que tiene síntomas de enfermedad renal avanzada que comprende:
10 a) detectar el nivel de los complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas en una muestra de orina de dicho sujeto y
b) comparar dicho nivel con un valor de referencia donde una disminución en el nivel de los complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas con respecto al valor de referencia es indicativo de que dicho
15 sujeto es susceptible de recibir una terapia para el tratamiento de la enfermedad renal avanzada.
En otro aspecto, la invención se refiere a un método in vitro para seleccionar un paciente susceptible de ser tratado con una terapia para el tratamiento de enfermedad renal 20 avanzada que comprende: a) detectar el nivel de los complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas en una muestra de orina de dicho sujeto y b) comparar dicho nivel con un valor de referencia donde una disminución en el nivel de los complejos uromodulina o una variante de la misma
25 GAG sulfatados-exosomas con respecto al valor de referencia es indicativo de que dicho sujeto es un candidato a recibir una terapia para el tratamiento de la enfermedad renal avanzada.
En una realización preferida la separación de la uromodulina y/o albúmina asociada a GAG sulfatados, o la separación de los complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG 30 sulfatados-exosomas de la muestra de orina se realiza según el primer método de la invención.
En otra realización preferida, la detección se realiza mediante espectrometría de masas, preferiblemente espectrometría de masas en tándem.
En una realización preferida la enfermedad renal es poliquistosis renal autosómica dominante de tipo 1 o de tipo 2.
La expresión “diseñar una terapia personalizada”, tal como aquí se utiliza, se refiere al diseño y aplicación de las intervenciones para la prevención y el tratamiento adaptado al sustrato genético del paciente y para el perfil molecular de la enfermedad.
La expresión “síntomas de mucopolisacaridosis”, tal como aquí se utiliza, se refiere a los síntomas producidos por dicha enfermedad que varían en función del tipo de mucopolisacaridosis del que se trate. Por ejemplo, los síntomas pueden ser pérdidas de la audición, retrasos en el desarrollo, hidrocefalia, degeneración de la retina y glaucoma, rasgos faciales toscos, baja estatura (enanismo), displasia, irregularidades esqueléticas, espesamiento de la piel, hepatomegalia o esplenomegalia, hernias, hirsutismo, síndrome del túnel carpiano, infecciones respiratorias recurrentes, enfermedades obstructoras de las vías respiratorias, apnea del sueño, enfermedades cardíacas.
La expresión “síntomas de enfermedad renal”, tal como aquí se utiliza, se refiere a síntomas que están presentes en un estado inicial de la enfermedad, cuando esta pasa desapercibida, por ejemplo y sin limitación, inapetencia, sensación de malestar general y fatiga, dolores de cabeza, prurito y sequedad de la piel, náuseas y pérdida de peso.
La expresión “síntomas de enfermedad renal avanzada”, tal como aquí se utiliza, se refiere a los síntomas que aparecen cuando la enfermedad renal ya ha afectado a la función renal, tales como, sin limitación, piel anormalmente oscura o clara, dolor óseo, somnolencia o problemas de concentración, entumecimiento o hinchazón de manos y pies, fasciculaciones musculares o calambres, mal aliento, susceptibilidad a hematomas o sangre en las heces, sed excesiva, hipos frecuentes, amenorrea, dificultad para respirar y vómitos.
El término “terapia preventiva” o “terapia para la prevención”, tal y como se utiliza en el presente documento, se refiere a la prevención o conjunto de medidas profilácticas para evitar una enfermedad o para prevenir o retrasar la aparición de la sintomatología de la misma. Particularmente, dicho término se refiere a la prevención o el conjunto de medidas para evitar la aparición o para retrasar la sintomatología clínica asociada a la mucopolisacaridosis o a la enfermedad renal. Resultados clínicos deseados asociados con la administración de dicho tratamiento a un sujeto incluyen pero no se limitan a, la estabilización del estado patológico de la enfermedad, retraso en la progresión de la enfermedad o mejoría en el estado fisiológico del sujeto.
“Terapia para el tratamiento”, como se usa aquí, se refiere a la recuperación tentativa de un problema de salud, por lo general después de un diagnóstico concretamente de mucopolisacaridosis o de enfermedad renal. Como tal, no es necesariamente una cura, es decir, una reversión completa de una enfermedad. Por tanto, “tratamiento” tal como se usa en el presente documento cubre cualquier tratamiento de una enfermedad, un trastorno o un estado de un mamífero, particularmente un ser humano, e incluye inhibir la enfermedad o el estado, es decir, detener su desarrollo; o aliviar la enfermedad o el estado, es decir, provocar la regresión de la enfermedad o el estado o la mejora de uno o más síntomas de la enfermedad o el estado. La población de sujetos tratados mediante el método incluye un sujeto que padece el estado o la enfermedad indeseable, así como sujetos en riesgo de desarrollar el estado o la enfermedad. Por tanto, un experto en la técnica comprende que un tratamiento puede mejorar el estado del paciente, pero puede no ser una cura completa de la enfermedad.
Tratamientos preventivos o curativos adecuados en la mucopolisacaridosis incluyen, pero no se limitan, a la iduronidasa para la MPS I, idursulfasa para MPS II, N-acetilgalactosamina-6sulfato sulfatasa (Galns) para MPS IVA, arilsulfatasa recombinante humana para MPS VI (todas ellas son terapias enzimáticas sustitutivas); trasplante de progenitores hematopoyéticos incluyendo trasplante de sangre de cordón umbilical, trasplante de células madre eritropoyéticas y trasplante de células madre de sangre periférica; terapia de reducción de sustrato en caso de existir cierta actividad enzimática residual.
Tratamientos preventivos o curativos adecuados en la enfermedad renal incluyen, pero no se limitan, a tratamiento sintomático o paliativo; específico de la causa (si es bacteriano empleo de antibióticos, etc); inmunosupresores como tacrolimus o ciclosporina; suplementos
o restricción de sales minerales como sodio, potasio, magnesio; dieta o diuréticos como amilorida, triamtereno o tolvaptan; diálisis (peritoneal, hemodiálisis) y trasplante renal.
Tratamientos preventivos o curativos adecuados en la enfermedad renal avanzada son los mismos que se han mencionado en el párrafo precedente en el contexto de la enfermedad renal.
El término “seleccionar” tal y como se usa aquí, se refiere a la acción de escoger a un sujeto para someterlo a un tratamiento preventivo o curativo de mucopolisacaridosis o de enfermedad renal.
Las diferentes realizaciones de los métodos de diagnóstico y pronóstico de la invención (los métodos usados para la determinación de los niveles de los marcadores, la naturaleza de la
muestra que se va a estudiar, los umbrales para considerar que un marcador ha aumentado
o disminuido) son esencialmente como se han definido previamente con respecto a los métodos de diagnóstico y pronóstico de la invención.
Otros aspectos de la invención
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un agente capaz de detectar el péptido señal SEQ ID NO: 1 de la uromodulina o una variante del mismo en una muestra de orina para diagnosticar mucopolisacaridosis, para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de un sujeto que sufre mucopolisacaridosis, para monitorizar el efecto de una terapia en un sujeto que sufre mucopolisacaridosis, para diseñar una terapia personalizada en un sujeto que tiene síntomas de mucopolisacaridosis, para seleccionar un paciente susceptible de ser tratado con una terapia para la prevención y/o tratamiento de mucopolisacaridosis o para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de mucopolisacaridosis.
En una realización preferida el agente es un anticuerpo capaz de detectar específicamente un péptido de secuencia SEQ ID NO: 1 o una variante del mismo, e incapaz de detectar la uromodulina madura o secretada, o un fragmento de dicho anticuerpo con capacidad para unirse a la secuencia SEQ ID NO: 1 o una variante de la misma.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso del péptido señal SEQ ID NO: 1 de la uromodulina o una variante del mismo como marcador de diagnóstico de mucopolisacaridosis, como marcador pronóstico de mucopolisacaridosis, como marcador de monitorización de la progresión de un sujeto que sufre mucopolisacaridosis, como marcador de monitorización del efecto de una terapia en un sujeto que sufre mucopolisacaridosis, como marcador para diseñar una terapia personalizada en un sujeto que tiene síntomas de mucopolisacaridosis, como marcador de selección de un paciente susceptible de ser tratado con una terapia para la prevención y/o tratamiento de mucopolisacaridosis o como marcador para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de mucopolisacaridosis.
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un agente capaz de detectar uromodulina o una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados y/o de un agente capaz de detectar albúmina o una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados en una muestra de orina para diagnosticar enfermedad renal, para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de un sujeto que sufre enfermedad renal, para
monitorizar el efecto de una terapia en un sujeto que sufre enfermedad renal, para diseñar una terapia personalizada en un sujeto que tiene síntomas de enfermedad renal, para seleccionar un paciente susceptible de ser tratado con una terapia para la prevención y/o tratamiento de enfermedad renal o para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de enfermedad renal.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de uromodulina o una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados y/o de albúmina o de una variante de la misma unida
o asociada a los GAG sulfatados como marcador de diagnóstico de enfermedad renal, como marcador pronóstico de enfermedad renal , como marcador de monitorización del efecto de una terapia en un sujeto que sufre enfermedad renal, como marcador para diseñar una terapia personalizada en un sujeto que tiene síntomas de enfermedad renal, como marcador de selección de un paciente susceptible de ser tratado con una terapia para la prevención y/o tratamiento de enfermedad renal o como marcador para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de enfermedad renal.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un agente capaz de detectar complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas en una muestra de orina para diagnosticar enfermedad renal avanzada, para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de un sujeto que sufre enfermedad renal avanzada, para monitorizar el efecto de una terapia en un sujeto que sufre enfermedad renal avanzada, para diseñar una terapia personalizada en un sujeto que tiene síntomas de enfermedad renal avanzada, para seleccionar un paciente susceptible de ser tratado con una terapia para el tratamiento de enfermedad renal avanzada o para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de enfermedad renal avanzada.
En otro aspecto, la invención se refiere al uso de un complejo uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas como marcador de diagnóstico de enfermedad renal avanzada, como marcador pronóstico de enfermedad renal avanzada, como marcador de monitorización del efecto de una terapia en un sujeto que sufre enfermedad renal avanzada, como marcador para diseñar una terapia personalizada en un sujeto que tiene síntomas de enfermedad renal avanzada, como marcador de selección de un paciente susceptible de ser tratado con una terapia para el tratamiento de enfermedad renal avanzada o como marcador para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de enfermedad renal avanzada.
El término “agente” se refiere a cualquier compuesto o reactivo que permita detectar la presencia del péptido señal SEQ ID NO: 1, o capaz de detectar la uromodulina o una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados, o capaz de detectar albúmina
o una variante de la misma unida o asociada a los GAG sulfatados, o capaz de detectar
5 complejos formados por uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas en una muestra.
En una realización preferida el agente es un anticuerpo. En otra realización preferida el agente es un reactivo para espectrometría de masas.
10 El término “marcador” es equivalente al término “biomarcador”, que ha sido definido previamente. Preferiblemente el marcador es un compuesto proteico o lipídico.
En una realización preferida la separación de la uromodulina y/o albúmina asociada a GAG
15 sulfatados o la separación de los complejos uromodulina o una variante de la misma-GAG sulfatados-exosomas de la muestra de orina se realiza según el primer método de la invención.
En una realización preferida la enfermedad renal es poliquistosis renal autosómica 20 dominante de tipo 1 o de tipo 2.
Complejos de la invención
Los inventores han descubierto la existencia de unos complejos formados por uromodulina,
25 GAG sulfatados y exosomas en la orina de sujetos sanos, y también en la orina de sujetos aquejados de enfermedad renal. Estos complejos pueden incluir otras proteínas.
Basándose en estudios de purificación de exosomas, precipitación específica de los GAG y secuenciación proteica, los inventores han determinado que los exosomas y los GAG junto
30 con la uromodulina forman un complejo que puede estar dirigiendo el diálogo entre los distintos segmentos de la nefrona.
Por lo tanto, en otro aspecto, la invención se refiere a un complejo formado por la asociación de uromodulina o una variante de la misma, GAG sulfatados y exosomas.
En una realización preferida de la invención el complejo está aislado, es decir, sustancialmente libre de otros componentes presentes en la orina.
Kits de la invención
En otro aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende azul de dimetilmetileno (DMB) a una concentración comprendida entre 0,01 y 100 nM a un pH comprendido entre 2 y 6,9.
En una realización preferida el pH está comprendido entre 3 y 4; preferiblemente entre 3,3 y 3,6; más preferiblemente es de 3,5.
En otra realización preferida la concentración del DMB está comprendida entre 0,29 y 0,35 mM, y donde el pH está comprendido entre 3,3 y 3,6 y el agente tamponante es tampón formiato.
El término “kit”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una combinación de un conjunto de reactivos adecuados para la separación de los GAG sulfatados libres y de la fracción unida a GAG sulfatados de una muestra junto con uno o más tipos de elementos o componentes para llevar a cabo los métodos de la invención, particularmente para el análisis del patrón proteico o lipídico de la fracción unida a GAG sulfatados y, opcionalmente, reactivos adecuados para la detección de los niveles de GAG sulfatados, de uromodulina madura o de secreción, del péptido de secuencia SEQ ID NO: 1 de uromodulina, de albúmina, de IgA y/o de IgG. El kit incluye opcionalmente otros tipos de reactivos bioquímicos, contenedores, envases adecuados para su venta comercial, componentes de hardware y software electrónico, etc. Los reactivos están empaquetados para permitir su transporte y almacenamiento. Materiales adecuados para el empaquetado de los componentes del kit incluyen cristal, plástico (polietileno, polipropileno, policarbonato y similares), botellas, viales, papel, sobres y similares. Adicionalmente, los kits de la invención pueden contener instrucciones para el uso simultáneo, secuencial o separado de los distintos componentes que se encuentran en el kit. Dichas instrucciones pueden encontrarse en forma de material impreso o en forma de un soporte electrónico capaz de almacenar instrucciones de forma que puedan ser leídas por un sujeto, tales como medios de almacenamiento electrónicos (discos magnéticos, cintas y similares), medios ópticos (CD-ROM, DVD) y similares. Adicional o alternativamente, los medios pueden contener direcciones de Internet que proporcionen dichas instrucciones.
En otra realización preferida, el kit además comprende un gel seleccionado del grupo que consiste en un gel de poliacrilamida y un gel de acetato de celulosa.
5 El término “gel de poliacrilamida”, tal como aquí se utiliza, se refiere a un hidrogel formado por un homopolímero de acrilamida que es uno de los geles más utilizados para realizar electroforesis de proteínas, concretamente, electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE). Estos geles son químicamente inertes, transparentes y estables en un amplio rango de pH, temperatura y fuerza iónica.
10 El término “gel de acetato de celulosa”, tal como aquí se utiliza, se refiere a un medio utilizado para la separación y caracterización de proteínas y otras moléculas según su densidad de carga. El soporte consiste en tiras delgadas de acetato de celulosa, con propiedades de adsorción mínimas, por lo que se logra una separación en bandas bien
15 definidas.
En otra realización preferida, el kit comprende además un tampón de carga.
El término “tampón de carga”, tal como aquí se utiliza, se refiere al tampón que se añade a
20 la muestra que va a cargarse en el pocillo del gel de poliacrilamida o en el soporte de acetato de celulosa. Por lo general, este tampón contiene agua, sacarosa y un colorante (por ejemplo, cianol de xileno, azul de bromofenol, verde de bromocresol, etc. Ejemplos de tampones de carga pueden ser, sin limitación, tampón Laemli; tampón Laemli con βmercaptoetanol y 7,5% de SDS en relación 1:1; tampón TBE (100 mM Tris-borato, 1 mM
25 EDTA, pH 8,3) con sacarosa 2 M y 0,02% de azul de bromofenol; tampón TAE (40 mM Tris, 5 mM CH3COONa, 0,9 mM EDTA, pH 7,9); y tampón TBE con sacarosa 2 M. En una realización preferida el tampón de carga es SDS al 7,5%.
En otra realización preferida, el kit comprende además un tampón de electroforesis.
30 El término “tampón de electroforesis”, tal como aquí se utiliza, se refiere al tampón en el que se sumerge el gel para la realización de la electroforesis. Ejemplos de tampón de electroforesis son, sin limitación, TAE 1x o 0,5X, TBE 1x, Tris-Glicina 1x, y acetato de bario 0,05 M. En una realización preferida el tampón de electroforesis es acetato de bario 0,05 M.
En otra realización el kit además comprende un colorante específico para la visualización de proteínas según se ha definido en el contexto del primer método de la invención. En una realización aún más preferida el colorante es Sypro Ruby.
En otra realización el kit además comprende un agente de destinción, preferiblemente ácido acético, más preferiblemente ácido acético al 10%.
En otra realización el kit además comprende un reactivo capaz de detectar una proteína. En una realización aún más preferida el reactivo es un anticuerpo. En una realización aún más preferida el anticuerpo es un anticuerpo capaz de detectar específicamente un péptido de secuencia SEQ ID NO: 1 o una variante del mismo, e incapaz de detectar la uromodulina madura o secretada, o un fragmento de dicho anticuerpo con capacidad para unirse a la secuencia SEQ ID NO: 1 o a una variante de la misma. En otra realización el anticuerpo es un anticuerpo seleccionado del grupo que comprende un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la uromodulina madura o secretada o una variante de la misma, un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la albúmina o una variante de la misma, un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la IgA o una variante de la misma, un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la IgG o una variante de la misma, y combinaciones de los mismos. Métodos para producir tales anticuerpos son bien conocidos en la técnica.
El término “detectar específicamente” o “reconocer específicamente”, tal como aquí se utiliza, se refiere a que dicho reactivo sólo reconoce ese péptido o proteína de interés y no muestra reacción si dicho péptido o proteína de interés no está presente. Cuando se refiere a un péptido o proteína se refiere a que el reactivo es capaz de reaccionar con al menos un epítopo del péptido o la proteína, en contraposición a una interacción no específica.
Como se entenderá por la persona experta en la técnica, los anticuerpos del kit de la invención se pueden utilizar en todas las técnicas para la determinación de los niveles de proteína conocidas que son adecuados para el análisis de una muestra, tales como Western-blot o transferencia Western, ELISA, RIA, EIA competitivo, DAS-ELISA, técnicas inmunocitoquímicas o inmunohistoquímicas, técnicas basadas en el uso de biochips, microarrays de proteínas, ensayos de precipitación coloidal en tiras reactivas, etc.
Los anticuerpos pueden fijarse a un soporte sólido tal como una membrana, un plástico o un vidrio, opcionalmente tratados para facilitar la fijación de dichos anticuerpos al soporte.
Dicho soporte sólido, comprende, al menos, un conjunto de anticuerpos que reconocen los niveles de un péptido de secuencia SEQ ID NO: 1 o uromodulina madura o de secreción, o albúmina, o IgA o IgG o una variante de las mismas, y que se pueden utilizar para detectar los niveles de expresión de estas proteínas.
Los kits de la invención comprenden, además, reactivos para la detección de una proteína codificada por un gen constitutivo. La disponibilidad de dichos reactivos adicionales permite la normalización de las mediciones realizadas en diferentes muestras (por ejemplo, la muestra a analizar y la muestra de control) para descartar que las diferencias en la expresión de los biomarcadores se deben a una diferencia en la cantidad total de proteínas en la muestra más que a diferencias reales en los niveles relativos de expresión. Los genes consitutivos en la presente invención son genes que siempre están activos o que se transcriben constantemente y que codifican para proteínas que se expresan constitutivamente y que llevan a cabo funciones celulares esenciales. Las proteínas que se expresan constitutivamente y se pueden utilizar en la presente invención incluyen, sin limitación, β-2-microglobulina (B2M), ubiquitina, 18-S proteína ribosómica, ciclofilina, GAPDH, PSMB4, tubulina y actina.
En otra realización, el kit además comprende un reactivo capaz de detectar un lípido. Ejemplos no limitativos de reactivos capaces de detectar un lípido son, sin limitación, reactivos para tinción con azul de luxol rápido, técnica de la hematina ácida de Baker, tinción aceite rojo O, tinción con Negro Sudán B, Sudán II, III y IV.
En otra realización, el kit además comprende un reactivo capaz de detectar un GAG sulfatado. Ejemplos no limitativos de reactivos capaces de detectar un GAG sulfatado son, sin limitación, DMB, Alcian Blue, albúmina ácida y cloruro de cetilpiridinio (CPC). En una realización preferida el reactivo capaz de detectar un GAG sulfatado es DMB, preferiblemente DMB al 0,02% en agua.
En otra realización el kit además comprende un programa de ordenador para ejecutar un método según cualquiera de los aspectos inventivos descritos en esta invención.
En otro aspecto, la invención se refiere a un kit que comprende un anticuerpo capaz de detectar específicamente un péptido de secuencia SEQ ID NO: 1 o una variante del mismo, e incapaz de detectar la uromodulina madura o de secreción, o un fragmento de dicho
anticuerpo con capacidad para unirse a la secuencia SEQ ID NO: 1 o a una variante de la misma.
Todas las formas de realización particulares de los métodos de la presente invención son aplicables a los kits de la invención y a sus usos.
Usos de los kits de la invención
En otro aspecto, la invención se relaciona con el uso de un kit tal como se define anteriormente para separar los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra, para identificar el perfil de proteínas unidas o asociadas a los GAG sulfatados de una muestra, para identificar el perfil de lípidos unidos o asociados a los GAG sulfatados de una muestra, para detectar una alteración en el patrón de glicosilación por los GAG sulfatados, para diagnosticar una enfermedad, para determinar el pronóstico de una enfermedad, para monitorizar la progresión de una enfermedad, para monitorizar el efecto de una terapia para el tratamiento de una enfermedad, para predecir la respuesta a una terapia, para diseñar una terapia personalizada, para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de una enfermedad, para identificar biomarcadores proteicos o lipídicos unidos o asociados a los sulfatados o para detectar complejos formados por exosomas, GAG sulfatados y una proteína.
En una realización preferida la enfermedad es una enfermedad asociada a una alteración de uno o más GAG sulfatados, preferiblemente la alteración es un aumento o disminución de uno o más GAG sulfatados.
En otra realización la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en mucopolisacaridosis y enfermedad renal. Más preferiblemente la enfermedad renal es poliquistosis renal autosómica dominante de tipo 1 o de tipo 2.
Todas las formas de realización particulares de los métodos de la presente invención son aplicables a los kits de la invención y a sus usos.
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La invención se describe en detalle a continuación por medio de los siguientes ejemplos, que han de interpretarse como meramente ilustrativos y no limitativos del alcance de la invención.
EJEMPLOS
Ejemplo 1: Descripción del procesado de la muestra antes del aislamiento de la fracción asociada a glucosaminoglicanos y/o exosomas
En el caso de las orinas, se partió de la segunda orina de la mañana (descartando el primer chorro para evitar contaminaciones del aparato genitourinario externo) recogida en contenedores libres de proteasas y se descartaron aquellas con presencia visible de hematuria e infección de las vías urinarias. Las muestras de orina deben ser almacenadas a -20ºC hasta su utilización en el caso de que no se haga el mismo día.
En el caso de muestras de sangre, se deben recoger en el tubo adecuado según se quiera obtener suero o plasma. En el caso del plasma, la muestra de sangre debe ser recogida en un tubo con anticoagulante, por ejemplo heparina o EDTA, y centrifugar a máxima velocidad durante 10 minutos. En el caso del suero, se debe recoger la muestra en un tubo de bioquímica o STII, dejarla reposar al menos 30 minutos y centrifugar a máxima velocidad durante 10 minutos. Tanto el plasma como el suero deben ser almacenados a -80ºC hasta su utilización en el caso de que no se haga el mismo día.
Ejemplo 2: Descripción del procedimiento de aislamiento de exosomas
Se procesaron las muestras siguiendo una modificación del procedimiento bien referido en la literatura (Christianson et al, Proc Natl Acad Sci USA 2013, 110:17380-5; Hogan et al, J Am Soc Nephrol 2009, 20:278-288). En el caso de las orinas, se partió del sobrenadante urinario obtenido mediante centrifugación de la orina a 1000g durante 5 minutos. Brevemente, los sobrenadantes urinarios se centrifugaron a 5.000 g durante 20 minutos, se sometieron a filtración a través de filtros de baja adsorción proteica y tamaño de poro de 0,22 µm y se ultracentrifugaron a 100.000 g durante 2 horas. Los pellets exosomales se resuspendieron en un volumen adecuado de tampón (por ejemplo, PBS 1X) y se guardaron a -20ºC hasta su utilización.
Ejemplo 3: Descripción del procedimiento de separación de la fracción unida a glucosaminoglicanos
Se utilizó azul de dimetilmetileno (Serva) a una concentración de 0,29 mM disuelto en etanol y se añadió tampón formiato 0,2 M a pH 3,5 en proporción 1:99. A continuación se mezcló con la muestra biológica en una proporción 1:2. Posteriormente, se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Finalmente, se centrifugó a 10.000g durante 10 minutos a 4ºC. Se eliminó el sobrenadante y se recuperó el precipitado, que contiene la fracción unida a glucosaminoglicanos.
Ejemplo 4: Identificación de proteínas unidas a glucosaminoglicanos en muestras de orina
En muestras de orina se identificaron mediante proteómica (identificación por secuenciación en MALDI-TOF/TOF) la presencia de dos proteínas conocidas que están glicadas hasta en un 30%: albúmina y uromodulina.
La figura 4 muestra el patrón de bandas proteicas unidas a GAG en la orina (50 µl) de individuos sanos (16 varones y 16 mujeres, de 20 a 49 años) utilizando el método de la invención. La proteína unida a GAG más abundante en individuos control es la uromodulina, como se muestra en la parte izquierda de la figura, y en menor medida están presentes otras proteínas. Para identificar la uromodulina se utilizaron los protocolos standard para Western blot y un anticuerpo específico para uromodulina (Biomedical-BTI) en dilución 1:3000. Se visualizó utilizando FITC (IgG-FITC de Abcam, dilución 1:1000) y el sistema Molecular Imager (Bio-Rad) con el software Quantity One (Bio-Rad).
Con la finalidad de separar mejor las proteínas que estaban unidas a GAG en la orina, se utilizó la electroforesis en 2D, que permite ver diferentes isoformas de la misma proteína. Tras varias pruebas, se observó que por encima de pH6 no aparecían proteínas en orina precipitada con DMB. La figura 5 muestra el patrón proteico unido a GAG en la orina (300 µl) de dos individuos control (varones de 23 y 26 años) utilizando tiras de pH 3-6 y SDS-PAGE al 7,5%, seguida de tinción con Sypro Ruby. Se observó la presencia de numerosos spots, siendo los más abundantes diferentes isoformas de la uromodulina. El Western blot se realizó como se describe más arriba.
La figura 6 muestra la aplicación de la invención en la búsqueda de patrones proteicos unidos a GAG diferentes en orina y suero de individuos control y con insuficiencia renal (izquierda), y la identificación de la albúmina unida a GAG presente mediante Western blot (derecha). Para la muestra de suero se hizo una dilución 1:100 en PBS y luego se precipitaron 50 µl con DMB siguiendo el método de la invención descrito más arriba. Para el
Western blot de albúmina se utilizó un anticuerpo de Origene a una dilución 1:4000 y se visualizó con un anticuerpo unido a Cy5 (IgG-Cy5 Abcam, dilución 1:5000) utilizando el equipo descrito anteriormente. Se observó que el paciente con insuficiencia renal casi no tenía uromodulina y tenía mucha albúmina en orina, pero sólo una poca estaba glicada.
Ejemplo 5: Descripción de los ensayos de reconstitución de las uniones entre distintas proteínas y glicosaminoglicanos
La figura 7 demuestra que el método de la invención es capaz de separar aquellas proteínas que llevan unidos glucosaminoglicanos.
Para demostrarlo se utilizó uromodulina (Human Tamm Horsfall Glycoprotein, Biomedical-BTI) y albúmina (Bio-Rad) comerciales que se incubaron con glucosaminoglicanos comerciales (heparán, condroitín y dermatán sulfato de Sigma), tanto en PBS (Figura 7, c y d) como en la orina (Figura 7, a y b) de un paciente con una mutación truncante (C255Y) en el gen de la uromodulina que conlleva niveles casi indetectables de la misma en la orina, y con enfermedad quística medular autosómica dominante (ADMCKD) en curso. Se incubaron 1 µg de albúmina sérica bovina (BSA) (Bio-Rad) o uromodulina (Biomedical-BTI) en PBS con 100 µg de los GAG comerciales durante 1 hora a 37ºC para permitir la unión de los GAG a las proteínas. A continuación se añadió el azul de dimetilmetileno y se siguió el método de separación de la fracción unida a GAG descrito anteriormente.
El precipitado se resuspendió en 7,5% SDS y se preparó siguiendo el protocolo estándar para la utilización de SDS-PAGE. Se observó que tanto la albúmina como la uromodulina comerciales están poco glicadas y, tras la incubación con GAG, se produce la glicación y aparecen nuevas bandas proteicas.
Se repitió el experimento utilizando 20 µl de la orina de un paciente sin uromodulina, observando la ausencia de uromodulina y presencia de albumina (Figura 7, a y b, carril 1) y que estaban poco glicadas con GAG (Figura 7, a y b, carril 2). Después de incubar la orina con los GAG comerciales (100 µg) y con BSA y uromodulina (1 µg) se observó la aparición de nuevas bandas unidas a GAG. En las imágenes de los geles se puede observar que se produce una superposición de bandas entre la uromodulina y la albúmina. Se ha comprobado que la albúmina tiene una gran afinidad por los GAG y está ocultando el descubrimiento de otras proteínas, por lo que sería de utilidad el uso de métodos de depleción de albúmina para intentar desenmascarar otras proteínas.
Ejemplo 6: Identificación de patrones de bandas proteicas unidas a GAG específicas en individuos aquejados de mucopolisacaridosis
En la figura 8 se muestran los patrones de bandas proteicas unidas a GAG en orina de pacientes aquejados de diferentes tipos de mucopolisacaridosis (MPS I, MPS II, MPS III, MPS IV y MPS VII) y en individuos control de la misma edad y sexo que los pacientes. Se muestran también los niveles de GAG en orina (por encima del nivel de referencia en los pacientes) medidos por el método tradicional con DMB (Whitley C.B et al, Clin. Chem. 1989, 35:2074-2081); y la identificación de las proteínas uromodulina y albúmina mediante Western blot realizado en las condiciones ya descritas anteriormente.
La figura 9 muestra la electroforesis en 2D en las condiciones descritas anteriormente en la orina de pacientes con mucopolisacaridosis confirmada. Al compararlas con los controles de la Figura 5 se observa la desaparición de las isoformas de alto peso molecular correspondientes a la uromodulina y las proteínas glicadas de bajo peso.
Ejemplo 7: Biomarcador de diagnóstico en mucopolisacaridosis
Al realizar los estudios de secuenciación de la uromodulina mediante MALDI-TOF/TOF se encontró que en los pacientes con mucopolisacaridosis se mantiene el péptido señal SEQ ID NO: 1 (MGQPSLTWML MVVVASWFIT TAAT), detectándose concretamente el péptido de SEQ ID NO: 2 (MGQPSLTWML MVVVASWFIT TAATDTSEAR), que está ausente en las muestras de individuos control. Por lo tanto, sería posible utilizar la tecnología de espectrometría de masas en tándem para cuantificar este péptido señal de la uromodulina y poder utilizarlo como marcador de diagnóstico en MPS.
Ejemplo 8: Diagnóstico, seguimiento y búsqueda de nuevos biomarcadores en enfermedad renal
Se utilizó la invención en el estudio de pacientes o futuros pacientes con poliquistosis renal autosómica dominante asociada a mutaciones conocidas en los genes PKD1 (chr16: 41711del18bp; chr16:28907c>g; chr16:37060c>t) y PKD2 (chr4:88995974c>t). Se estudiaron 23 pacientes de PKD1, 10 pacientes de PKD2 y 17 voluntarios sanos cuyos diagnósticos y funciones renales fueron evaluados por expertos nefrólogos. La enfermedad renal fue diagnosticada en base a los niveles de creatinina sérica así como la medición de otros parámetros renales preestablecidos de rutina en la práctica clínica y diagnóstico genético. La función renal normal de los voluntarios sanos fue evaluada a través de la creatinina sérica y anamnesis.
Los sobrenadantes y pellets obtenidos del fraccionamiento por centrifugación se sometieron a precipitación específica con DMB a un ratio 1:2 según lo descrito y los precipitados se resuspendieron y desnaturalizaron a 95ºC durante 5 minutos en tampón Laemli con βmercaptoetanol y 7,5% SDS en relación 1:1. Entre 15-30 µl se cargaron en un gel al 7,5% SDS-PAGE y las proteínas se separaron a 100 V durante aproximadamente 1 hora y 30 minutos y se visualizaron mediante tinción con agentes de contraste para proteínas (ej. Sypro Ruby Protein-Gel Stain 1X).
La figura 10 muestra que existe un perfil de proteínas asociadas a GAG en los individuos control y que el perfil proteico urinario unido a GAG está alterado en pacientes con enfermedad renal, por ejemplo PKD, y que esta alteración depende de su función renal (determinada por los niveles de creatinina sérica y proteinuria). Futuros pacientes con una mutación conocida y asintomáticos en el momento del ensayo, muestran ya deficiencia en el complejo. Esta observación revela su uso como biomarcador de diagnóstico y pronóstico de enfermedad y daño renal, adelantándose en varios años a los cambios en los niveles de creatinina.
A nivel proteico, esta huella dactilar urinaria parece estar asociada a la uromodulina y a GAG (se ha comprobado para condroitín, dermatán y heparán sulfato) conocidos por formar parte de la membrana glomerular basal, de la matriz extracelular y de la capa de mucopolisacáridos de la superficie uroepitelial. La uromodulina parece presentar un patrón de expresión inverso a los niveles de creatinina, tendiendo a disminuir progresivamente en enfermos renales avanzados. De este modo, se ha observado que cuanto mayor es el daño y evolución del fallo renal, aún sin cambios significativos en los niveles de creatinina, menor es la presencia de uromodulina asociada a GAG en orina (Figuras 10 y 11). Esta alteración es más acusada en pacientes con PKD tipo 2 (gen PKD2 mutado) que en pacientes de PKD tipo 1 (gen PKD1 mutado) donde la uromodulina asociada a GAG prácticamente desaparece a altas creatininas, mientras que otras proteínas asociadas a GAG van apareciendo (figura 10).
Se puede determinar, comparando los perfiles observados entre los sobrenadantes y sus respectivos pellets celulares (Figura 11), que a medida que el fallo renal crónico se agrava se observan menos proteínas asociadas a GAG a nivel intracelular y aparecen más proteínas asociadas a GAG a nivel extracelular.
Un estudio similar pero de menor envergadura fue realizado en plasma de 14 enfermos oncológicos (9 de cáncer de próstata y 5 de cáncer de colon), así como en orinas y sueros procedentes de otros 14 pacientes con enfermedad renal adecuadamente validada (10 con enfermedades glomerulares y 4 con nefropatía por IgA), en líquidos peritoneales de 9 enfermos renales en terapia renal sustitutiva (diálisis peritoneal) y en orinas de tres modelos animales de ADPKD y ARPKD. Se obtuvieron unos resultados similares al primer estudio observándose una alteración del perfil proteico asociado a GAG comparado con la homogeneidad observada en las muestras de sus respectivos controles. Se observó, además, precipitación de proteínas asociadas a GAG en medios de cultivo de distintas líneas celulares renales. Por lo tanto, la aplicación de esta huella proteica unida a GAG como biomarcador de diagnóstico/pronóstico se exitende a cualquier enfermedad con afectación o no renal y en distintos tipos de muestras biológicas.
Ejemplo 9: Descripción de las condiciones para la identificación por Western blot de la uromodulina asociada a glucosaminoglicanos y a exosomas
La identificación y caracterización de los complejos exosomales purificados se realizó mediante técnicas de imagen por microscopía electrónica, validación del tamaño/carga global (basada en el potencial zeta), precipitación específica con DMB según lo descrito anteriormente, separación en geles al 7,5% SDS-PAGE y Western blot.
Las fracciones exosomales purificadas, los sobrenadantes y/o pellets de orina se precipitaron con DMB, fueron procesadas y separadas en un gel SDS-PAGE según lo descrito anteriormente. Las proteínas se transfirieron a membrana de PVDF-FL a 100V durante una hora y media, se bloquearon las uniones inespecíficas con 1% de caseína o 4% de leche desnatada, se incubaron con el anticuerpo primario (Rabbit Anti-human Tamm Horsfall glycoprotein, Biomedical-BTI) en dilución 1:3000 y finalmente se revelaron mediante la incubación con el anticuerpo secundario adecuado marcado con agentes fluorescentes.
La Figura 12 muestra la caracterización de los complejos UGE (uromodulina-GAGexosomas) mediante imágenes de microscopía electrónica (a), tamaño (b), potencial zeta (c) y Western de uromodulina (d).
En la Figura 12(d) se muestra la identificación de la uromodulina asociada a las fracciones exosomales purificadas por distintas aproximaciones y en distintos pacientes de PKD, así como en pellets celulares y orina sin fraccionar.
También se utilizó para la obtención de exosomas un kit comercial (ExoQuick_TC, System Biosciences) siguiendo las instrucciones del fabricante (Figura 13).
Ejemplo 10. Descripción de los ensayos de disrupción de las uniones entre distintas 5 proteínas, glicosaminoglicanos y exosomas
La especificidad de los complejos exosomales se validó mediante la disrupción y reconstitución de las uniones entre sus componentes, UMOD-exosomas-GAG en diferentes medios (ej. orina o tampón PBS) y por diferentes aproximaciones (ej. precipitación por
10 gravedad, purificación por gradiente, tratamiento con ditiotreitol, filtración o incubación con glicosaminoglicanos comerciales).
Se utilizaron exosomas previamente purificados de orinas de distintos pacientes de PKD mediante gradiente (ExoQuick_TC, System Biosciences).
15 La disrupción de los complejos UGE se realizó mediante tratamiento con 100 mg/ml de ditiotreitol (DTT) a 37ºC durante 10 minutos y/o filtración con filtros de baja adsorción proteica y tamaño de poro de 0,22 µm (Millex, Millipore) (Figura 14).
20 La funcionalidad de los complejos UMOD-exosomas-GAG fue testada acorde a estudios proteómicos. Según esto, diversas bandas de proteínas fueron escindidas de los geles SDS-PAGE y procesadas para su identificación por secuenciación en MALDI-TOF/TOF.
Se identificaron las distintas proteínas asociadas a los complejos UGE mediante 25 secuenciación por MALDI-TOF/TOF, que se detallan en la Tabla II.
Tabla II. Proteínas asociadas a los complejos UGE identificadas mediante secuenciación por MALDI-TOF/TOF.
5 Los exosomas aislados de orina parecen formar un complejo con la uromodulina y los GAG tanto en muestras procedentes de voluntarios sanos como de enfermos renales.
Se demuestra además que la asociación uromodulina-glucosaminoglucanos-exosomas es específica (Figura 13) y que la integridad/funcionalidad de estos complejos depende de la 10 adecuada presencia de sus tres elementos constituyentes (Figura 14).
La figura 15 muestra las posibles asociaciones entre los tres elementos que conforman los complejos UGE.
15 Ejemplo 11: Los complejos UGE se pierden cuando el daño/fallo renal progresa
Se utilizaron exosomas previamente purificados de orinas de distintos pacientes con enfermedad renal, concretamente de 6 pacientes de ADPKD y de 3 pacientes de ADMCKD con las mutaciones previamente señaladas. La figura 16 muestra cómo a medida que
20 aumenta el daño renal (que se corresponde con los niveles aumentados de creatinina) los complejos UGE se pierden.
Ejemplo 12: Separación de los GAGs libres en orina en geles de acetato de celulosa para el diagnóstico de mucopolisacaridosis
Los inventores han desarrollado un método que permite mejorar el diagnóstico de las mucopolisacaridosis utilizando la separación de los GAG libres (condroitín sulfato, dermatán sulfato, heparán sulfato y queratán sulfato) en muestras de orina. Para ello se utilizó la segunda orina de la mañana y se precipitaron 0,5 ml de orina con 1 ml de DMB a 0,29 mM en tampón formiato sódico 0,2 M a pH 3,5. Se mezcló y se dejó precipitar durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, se centrifugó 10 minutos a 13.000 rpm a 4ºC, se descartó el sobrenadante por aspiración o por decantación, y el precipitado se resuspendió en 50 microlitros de SDS al 7,5%. Se realizó también una mezcla de condroitín sulfato, dermatán sulfato y heparán sulfato comerciales que se utilizó como control positivo (C+ en la figura 17). Se cargaron 4 microlitros en un gel de acetato de celulosa (Cellogel Electrophoresis Co. Srl; Cod. 01A32-25; 5,7x14 cm/200 µm) y se utilizó como tampón 0,05 M de acetato de bario fresco. Para la separación se corrió a 150 V durante 1 hora y 15 minutos y, a continuación, se tiñó el gel con DMB al 0,02% en agua durante 10 minutos en agitación a temperatura ambiente. Posteriormente, se destiñó utilizando ácido acético al 10% durante 10 minutos en agitación a temperatura ambiente. Como se puede comprobar en la Figura 17, se observó la aparición de las bandas de los GAG libres en color azul, bien definidas y separadas, lo que permitió diferenciar a los individuos con mucopolisacaridosis de los controles no enfermos. En los controles sanos sólo se observó la banda de condroitín sulfato; sin embargo, en los individuos enfermos, dependiendo del tipo de mucopolisacaridosis, se observó la banda de queratán sulfato característica de la mucopolisacaridosis IV, la de heparán sulfato característica de la mucopolisacaridosis III, o la de dermatán sulfato característica de la mucopolisacaridosis I, II, VI y VII.
Conclusiones:
Los resultados de las figuras 8 y 9 muestran que es posible llegar a diagnosticar de forma sencilla las mucopolisacaridosis utilizando el método de la invención. Por otra parte, la identificación de otras proteínas glicadas/glicosiladas con GAG y la caracterización de las diferentes isoformas de la uromodulina y albúmina glicadas permitiría avanzar en el conocimiento de la fisiopatología de la enfermedad y podría dar lugar al descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas.
El método de la invención también es útil para encontrar otros péptidos dentro de cualquier proteína que pudieran estar alterados en determinadas patologías y que pudieran ser utilizados como biomarcadores en patologías relacionadas con la glicosilación/glicación.
El perfil urinario homogéneo observado en población general está alterado en enfermos renales a nivel proteico y podría ser usado como biomarcador de función y prognosis renal, adelantándose en varios años a los cambios en los niveles de creatinina, el biomarcador de daño renal de referencia actualmente, ya que el 50% de la función renal puede haberse perdido antes de que los niveles de creatinina cambien significativamente.
Sabiendo que los exosomas interaccionan con el cilio primario y que son internalizados al menos por las células del ducto colector, se sugiere que el complejo UGE (uromodulinaglucosaminoglicanos-exosomas) puede estar dirigiendo el diálogo entre los distintos segmentos de la nefrona. Esta comunicación podría estar relacionada con el sistema inmunitario a raíz de la identificación del contenido de los exosomas así como de la previamente descrita función de la uromodulina como agente inmunitario (trampa para patógenos, mediador de inflamación o activador de macrófagos y granulocitos).
Con el descubrimiento de los complejos uromodulina-glucosaminoglicanos-exosomas se pone de manifiesto un papel hasta ahora desconocido de la uromodulina y los GAG tanto en comunicación como en el sistema inmunitario a nivel renal y que además pueden ser monitorizados de manera fácil y barata en la orina para su uso como biomarcadores de diagnóstico/pronóstico de enfermedad renal dada la identificación de un perfil característico. Se sugiere que estos complejos UGE y por tanto este mecanismo de comunicación se pierden cuando el daño/fallo renal progresa dando lugar a desregulación de los segmentos de la nefrona y alteraciones en el sistema inmunitario. Estos mecanismos sientan además las bases para el desarrollo de posibles terapias y la aplicación de medidas correctivas antes de alcanzar la enfermedad renal avanzada. Esta técnica y el descubrimiento de este complejo señalizador PGE puede ser además extrapolable a cualquier fluido biológico.
La invención permite, además, partiendo de una muestra de orina de 1 ml y utilizando un gel de acetato de celulosa, distinguir a individuos enfermos de mucopolisacaridosis de los individuos sanos; y también permite diferenciar entre las distintas mucopolisacaridosis como se demuestra en la figura 17. El método habitualmente utilizado para el diagnóstico de las mucopolisacaridosis es muy laborioso y difícil requiriendo el empleo de aproximadamente dos días; mientras que el método de la invención permite que dicho diagnóstico se realice de forma sencilla y rápida en tan solo unas 4 horas aproximadamente.

Claims (61)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Método in vitro para separar los glucosaminoglicanos (GAG) sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra que comprende:
    a) poner en contacto una muestra con el colorante azul de dimetilmetileno (DMB) a un pH ácido comprendido entre 2 y 6,9;
    b) incubar la mezcla de a) a una temperatura comprendida entre 0ºC y 40ºC durante el tiempo necesario para la formación de un precipitado;
    c) eliminar el sobrenadante; y
    d) recuperar el precipitado que contiene los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados.
  2. 2.
    Método según la reivindicación 1 donde la muestra es una muestra biológica seleccionada del grupo que consiste en exosomas, orina, suero y plasma.
  3. 3.
    Método según la reivindicación 1 o 2 donde la fracción unida a los GAG sulfatados se selecciona del grupo que consiste en una fracción proteica y una fracción lipídica.
  4. 4.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la fracción asociada a los GAG sulfatados es un complejo seleccionado del grupo que consiste en:
    (i)
    un complejo formado por uromodulina o una variante de la misma y exosomas,
    (ii)
    un complejo formado por albúmina o una variante de la misma y exosomas,
    (iii) un complejo formado por IgA o una variante de la misma y exosomas, y
    (iv) un complejo formado por IgG o una variante de la misma y exosomas.
  5. 5.
    Método según la reivindicación 4 donde la fracción asociada a los GAG sulfatados es un complejo formado por uromodulina o una variante de la misma y exosomas.
  6. 6.
    Método in vitro de identificación del perfil de proteínas unidas o asociadas a los GAG sulfatados de una muestra que comprende: a) separación de la fracción proteica unida o asociada a los GAG sulfatados de una
    muestra según el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5;
    b) separación electroforética del producto obtenido en a); y
    c) identificación del perfil electroforético obtenido en b).
  7. 7.
    Método según la reivindicación 6 donde la etapa c) se realiza mediante Western blot.
  8. 8.
    Método según la reivindicación 6 donde la etapa c) se realiza mediante tinción con un colorante específico para la visualización de proteínas.
  9. 9.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8 donde la proteína se selecciona del grupo que consiste en uromodulina, albúmina, IgA, IgG o una variante de las mismas y fragmentos de las mismas.
  10. 10.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 8 o 9 donde, tras la tinción con un colorante específico para la visualización de proteínas, las bandas obtenidas se escinden y se identifican mediante espectrometría de masas o secuenciación proteica.
  11. 11.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10 donde la separación electroforética se realiza por SDS-PAGE o por electroforesis bidimensional.
  12. 12.
    Método in vitro de identificación del perfil de proteínas unidas o asociadas a los GAG sulfatados de una muestra que comprende: a) separación de la fracción proteica unida o asociada a los GAG sulfatados de una
    muestra según el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y b) identificación del perfil de proteínas unidas o asociadas a los GAG sulfatados mediante cromatografía o espectrometría de masas de la fracción obtenida en a).
  13. 13.
    Método in vitro de identificación del perfil de lípidos unidos o asociados a los GAG sulfatados de una muestra que comprende: a) separación de la fracción lipídica unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra según el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3; y
    b) identificación del perfil de lípidos unidos o asociados a los GAG sulfatados mediante electroforesis o cromatografía de la fracción obtenida en a).
  14. 14.
    Método in vitro para detectar una alteración en el patrón de glicosilación por los GAG sulfatados de una muestra que comprende:
    a) identificar el perfil de proteínas unidas o asociadas a los GAG sulfatados de una muestra según el método de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 12 y/o identificar el perfil de lípidos unidos o asociados a los GAG sulfatados de una muestra según el método de la reivindicación 13; y
    b) comparar el perfil de proteínas unidas o asociadas a los GAG sulfatados obtenido en a) con el obtenido para una muestra de referencia y/o comparar el perfil de lípidos unidos o asociados a los GAG sulfatados obtenido en a) con el obtenido para una muestra de referencia donde una diferencia del perfil obtenido en a) respecto al perfil obtenido en la muestra de referencia indica una alteración en el patrón de glicosilación por los GAG sulfatados.
  15. 15. Método in vitro para diagnosticar una enfermedad asociada a una alteración de uno o más GAG sulfatados en un sujeto que comprende:
    a) separar los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra biológica de dicho sujeto por un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,
    b) detectar el nivel de uno o más GAG sulfatados separados en a) y c) comparar dicho nivel con un valor de referencia para dicho uno o más GAG
    sulfatados
    donde un nivel aumentado o disminuido de uno o más GAG sulfatados con respecto al
    valor de referencia es indicativo de que el sujeto sufre una enfermedad asociada a una
    alteración de uno o más GAG sulfatados.
  16. 16.
    Método según la reivindicación 15 donde el valor de referencia se ha obtenido a partir de muestras de individuos sanos de la misma edad y sexo que el sujeto.
  17. 17.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 o 16 donde la enfermedad asociada a una alteración de uno o más GAG sulfatados se selecciona del grupo que consiste en:
    a) una mucopolisacaridosis seleccionada del grupo que consiste en enfermedad de Hurler (deficiencia de alfa-L-iduronidasa), enfermedad de Scheie (deficiencia de alfaL-iduronidasa), enfermedad de Hunter (deficiencia de iduronato-2-sulfatasa), enfermedad de Sanfilippo A (deficiencia de heparán sulfamidasa), enfermedad de Sanfilippo B (deficiencia de alfa-N-acetil-glucosaminidasa), enfermedad de Sanfilippo C (deficiencia de heparán-alfa-glucosaminida N-acetiltransferasa), enfermedad de
    Sanfilippo D (deficiencia de N-acetilglucosamina-6-sulfatasa), enfermedad de Morquio A (deficiencia de N-acetilgalactosamina-6-sulfatasa), enfermedad de Morquio B (deficiencia de beta-D-galactosidasa), enfermedad de Maroteaux-Lamy (deficiencia de arilsulfatasa B) y enfermedad de Sly (deficiencia de betaglucuronidasa);
    b) una enfermedad renal seleccionada del grupo que consiste en poliquistosis renal autosómica dominante de tipo 1 o de tipo 2, glomerulonefritis, síndrome nefrótico, nefropatía endémica de los Balcanes, trasplante renal, litiasis renal, y nefropatía diabética;
    c) una endocrinopatía seleccionada del grupo que consiste en hipotiroidismo y diabetes;
    d) una enfermedad reumatológica seleccionada del grupo que consiste en osteoartritis, espondilitis anquilosante, artritis reumatoide y siringomielia; y
    e) una enfermedad oncológica.
  18. 18.
    Método según la reivindicación 17 donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedad renal y mucopolisacaridosis.
  19. 19.
    Método según la reivindicación 18 donde la muestra biológica es una muestra de orina, suero o plasma.
  20. 20.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 18 o 19 donde la enfermedad renal es poliquistosis renal autosómica dominante de tipo 1 o de tipo 2.
  21. 21.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20 donde la alteración de uno o más GAG es un aumento de uno o más GAG.
  22. 22.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 20 donde la alteración de uno o más GAG es una disminución de uno o más GAG.
  23. 23.
    Método in vitro para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de una enfermedad asociada a un aumento de uno o más GAG sulfatados en un sujeto que comprende:
    a) separar los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a GAG sulfatados de una muestra biológica de dicho sujeto por un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5;
    b) detectar el nivel de uno o más GAG sulfatados separados en a); y
    c) comparar dicho nivel con un valor de referencia para dicho uno o más GAG sulfatados obtenido del mismo sujeto en un momento previo
    donde una disminución en el nivel de uno o más GAG sulfatados con respecto al valor de referencia es indicativo de que la enfermedad asociada a un aumento de uno o más GAG sulfatados tiene buen pronóstico o donde un aumento en el nivel de uno o más GAG sulfatados con respecto al valor de referencia es indicativo de que la enfermedad asociada a un aumento de uno o más GAG sulfatados tiene mal pronóstico.
  24. 24. Método in vitro para determinar el pronóstico o para monitorizar la progresión de una enfermedad asociada a una disminución de uno o más GAG sulfatados en un sujeto que comprende:
    a) separar los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra biológica de dicho sujeto por un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5;
    b) detectar el nivel de uno o más GAG sulfatados separados en a); y c) comparar dicho nivel con un valor de referencia para dicho uno o más GAG
    sulfatados obtenido del mismo sujeto en un momento previo donde una disminución en el nivel de uno o más GAG sulfatados con respecto al valor de referencia es indicativo de que la enfermedad asociada a una disminución de uno o más GAG sulfatados tiene mal pronóstico o donde un aumento en el nivel de uno o más GAG sulfatados con respecto al valor de referencia es indicativo de que la enfermedad asociada a una disminución de uno o más GAG sulfatados tiene buen pronóstico.
  25. 25. Método in vitro para monitorizar el efecto de una terapia para el tratamiento de una enfermedad asociada a un aumento de uno o más GAG sulfatados que comprende:
    a) separar los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra biológica de un sujeto que sufre dicha enfermedad y que ha sido tratado con dicha terapia por un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y
    b) detectar el nivel de uno o más GAG sulfatados separados en a)
    donde una disminución del nivel de uno o más GAG sulfatados con respecto al nivel del mismo GAG sulfatado en una muestra procedente del mismo sujeto antes de la terapia es indicativo de que la terapia administrada es efectiva o donde un aumento o la ausencia de cambio en el nivel de uno o más GAG sulfatados con respecto al nivel del mismo GAG sulfatado en una muestra procedente del mismo sujeto antes de la terapia es indicativo de que la terapia administrada es inefectiva o de que el sujeto necesita una terapia alternativa.
  26. 26. Método in vitro para monitorizar el efecto de una terapia para el tratamiento de una enfermedad asociada a una disminución de uno o más GAG sulfatados que comprende:
    a) separar los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra biológica de un sujeto que sufre dicha enfermedad y que ha sido tratado con dicha terapia por un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y
    b) detectar el nivel de uno o más GAG sulfatados separados en a) donde un aumento del nivel de uno o más GAG sulfatados con respecto al nivel del mismo GAG sulfatado en una muestra procedente del mismo sujeto antes de la terapia es indicativo de que la terapia administrada es efectiva o donde una disminución o la ausencia de cambio en el nivel de uno o más GAG sulfatados con respecto al nivel del mismo GAG sulfatado en una muestra procedente del mismo sujeto antes de la terapia es indicativo de que la terapia administrada es inefectiva o de que el sujeto necesita una terapia alternativa.
  27. 27. Método in vitro para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de una enfermedad asociada a un aumento de uno o más GAG sulfatados que comprende:
    a) separar los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra biológica de un sujeto que sufre dicha enfermedad y que ha sido tratado con un compuesto candidato por un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y
    b) detectar el nivel de uno o más GAG sulfatados separados en a) donde el compuesto se considera efectivo para el tratamiento de la enfermedad cuando el nivel de uno o más GAG sulfatados disminuye con respecto al nivel del mismo GAG sulfatado en una muestra de referencia.
  28. 28. Método in vitro para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de una enfermedad asociada a una disminución de uno o más GAG sulfatados que comprende:
    a) separar los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra biológica de un sujeto que sufre dicha enfermedad y que ha sido tratado con un compuesto candidato por un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5; y
    b) detectar el nivel de uno o más GAG sulfatados separados en a) donde el compuesto se considera efectivo para el tratamiento de la enfermedad cuando el nivel de uno o más GAG sulfatados aumenta con respecto al nivel del mismo GAG sulfatado en una muestra de referencia.
  29. 29.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 21, 23 y 25 donde la enfermedad asociada a un aumento de uno o más GAG sulfatados es una enfermedad que cursa con una acumulación indeseada de uno o más GAG sulfatados seleccionada de mucopolisacaridosis, mucolipidosis, síndrome nefrótico congénito, nefropatía endémica de los Balcanes, artritis reumatoide y siringomielia.
  30. 30.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 22, 24 y 26 donde la enfermedad asociada a la disminución de uno o más GAG sulfatados se selecciona del grupo que consiste en amiloidosis renal, glomerulonefritis, síndrome nefrótico, hipotiroidismo y diabetes.
  31. 31.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 30 donde tras la etapa (a) se realiza una separación electroforética de la muestra.
  32. 32.
    Método según la reivindicación 31 donde la separación electroforética se realiza en un gel de acetato de celulosa.
  33. 33.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 32 donde la etapa b) se realiza mediante la tinción de los GAG sulfatados con el colorante DMB.
  34. 34.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 33 donde se detecta el nivel de uno o más GAG sulfatados libres.
  35. 35. Método según cualquiera de las reivindicaciones 18, 19, 21, 23, 25, 27 o 29 donde la enfermedad es mucopolisacaridosis y donde:
    (i)
    un nivel aumentado de dermatán sulfato libre con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto sufre mucopolisacaridosis de tipo I, de tipo II, de tipo VI o de tipo VII;
    (ii)
    un nivel aumentado de heparán sulfato libre con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto sufre mucopolisacaridosis de tipo III; y
    (iii) un nivel aumentado de queratán sulfato libre con respecto al valor de referencia es indicativo de que el sujeto sufre mucopolisacaridosis de tipo IV.
  36. 36.
    Uso del método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 14 para identificar biomarcadores proteicos o lipídicos unidos o asociados a los GAG sulfatados.
  37. 37.
    Uso según la reivindicación 36 donde dichos biomarcadores proteicos o lipídicos son útiles para el diagnóstico, pronóstico y/o monitorización de la progresión de una enfermedad.
  38. 38.
    Uso según la reivindicación 36 donde dichos biomarcadores proteicos o lipídicos son útiles para monitorizar el efecto de una terapia para el tratamiento de una enfermedad.
  39. 39.
    Uso según la reivindicación 36 donde dichos biomarcadores proteicos o lipídicos son útiles para predecir la respuesta a una terapia.
  40. 40.
    Uso según la reivindicación 36 donde dichos biomarcadores proteicos o lipídicos son útiles para diseñar una terapia personalizada.
  41. 41.
    Uso según la reivindicación 36 donde dichos biomarcadores proteicos o lipídicos son útiles para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de una enfermedad.
  42. 42.
    Uso según cualquiera de las reivindicaciones 37 a 41 donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en enfermedad renal y mucopolisacaridosis.
  43. 43.
    Uso según la reivindicación 42 donde la enfermedad renal es poliquistosis renal autosómica dominante de tipo 1 o de tipo 2.
  44. 44.
    Kit que comprende azul de dimetilmetileno (DMB) a una concentración comprendida entre 0,01 y 100 mM a un pH comprendido entre 2 y 6,9.
  45. 45.
    Kit según la reivindicación 44 donde el pH está comprendido entre 3 y 4.
  46. 46.
    Kit según la reivindicación 45 donde la concentración de DMB está comprendida entre 0,29 y 0,35 mM y donde el pH está comprendido entre 3,3 y 3,6 y el agente tamponante es tampón formiato.
  47. 47.
    Kit según cualquiera de las reivindicaciones 44 a 46 que además comprende un gel seleccionado del grupo que consiste en un gel de poliacrilamida y un gel de acetato de celulosa.
  48. 48.
    Kit según cualquiera de las reivindicaciones 44 a 47 que además comprende un tampón de carga.
  49. 49.
    Kit según cualquiera de las reivindicaciones 44 a 48 que además comprende un tampón de electroforesis.
  50. 50.
    Kit según cualquiera de las reivindicaciones 44 a 49 que además comprende un colorante específico para la visualización de proteínas.
  51. 51.
    Kit según cualquiera de las reivindicaciones 44 a 50 que además comprende un reactivo capaz de detectar una proteína.
  52. 52.
    Kit según la reivindicación 51 donde el reactivo es un anticuerpo.
  53. 53.
    Kit según la reivindicación 52 donde el anticuerpo es un anticuerpo seleccionado del grupo que comprende: un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la uromodulina madura o secretada o una variante de la misma, un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la albúmina o una variante de la misma, un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la IgA o una variante de la misma, un anticuerpo capaz de reconocer específicamente la IgG o una variante de la misma, y combinaciones de los mismos.
  54. 54.
    Kit según cualquiera de las reivindicaciones 44 a 53 que además comprende un reactivo capaz de detectar un lípido.
  55. 55.
    Kit según cualquiera de las reivindicaciones 44 a 54 que además comprende un reactivo capaz de detectar un GAG sulfatado.
  56. 56.
    Kit según cualquiera de las reivindicaciones 44 a 55 que además comprende un programa de ordenador para ejecutar un método según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 35.
  57. 57.
    Uso de un kit según cualquiera de las reivindicaciones 44 a 56 para separar los GAG sulfatados libres y la fracción unida o asociada a los GAG sulfatados de una muestra, para identificar el perfil de proteínas unidas o asociadas a los GAG sulfatados de una muestra, para identificar el perfil de lípidos unidos o asociados a los GAG sulfatados de una muestra, para detectar una alteración en el patrón de glicosilación por los GAG sulfatados, para diagnosticar una enfermedad, para determinar el pronóstico de una enfermedad, para monitorizar la progresión de una enfermedad, para monitorizar el efecto de una terapia para el tratamiento de una enfermedad, para predecir la respuesta a una terapia, para diseñar una terapia personalizada, para la identificación de compuestos adecuados para el tratamiento de una enfermedad, para identificar biomarcadores proteicos o lipídicos unidos o asociados a los sulfatados o para detectar complejos formados por exosomas, GAG sulfatados y una proteína.
  58. 58.
    Uso según la reivindicación 57 donde la enfermedad es una enfermedad asociada a una alteración de uno o más GAG sulfatados.
  59. 59.
    Uso según la reivindicación 58 donde la alteración es un aumento o disminución de uno
    o más GAG sulfatados.
  60. 60.
    Uso según cualquiera de las reivindicaciones 57 a 59 donde la enfermedad se selecciona del grupo que consiste en mucopolisacaridosis y enfermedad renal.
  61. 61.
    Uso según la reivindicación 60 donde la enfermedad renal es poliquistosis renal autosómica dominante de tipo 1 o de tipo 2.
    DIBUJOS
    Figura 1
    Figura 2
    Figura 3
    Figura 4
    Figura 5
    Figura 6
    Figura 7
    A)
    Figura 8
    B)
    Figura 8
    Figura 9
    Figura 10
    Figura 11
    b)
    Figura 12
    Carga media complejos UGE: neutra
    d)
    100 KDa
    ID Creat
    Pel Ur C-C+
    Figura 12
    a)
    Precipitación por Precipitación por centrifugación gravedad
    b)
    Fracción UGE Sobrenadante de UGE DMB Creatinina
    Figura 13
    1 2 3 4 5 6 7 8
    a)
    Fracción UGE Sobrenadante de UGE DTT DMB Creatinina
    1 2 3 4 5 6 7 8
    b)
    Fracción UGE Sobrenadante de UGE-Filtración
    DMB Creatinina
    Figura 14
    1 2 3 4 5 67 8
    c)
    Fracción celular Fracción UGE
    Filtración DTT DMB Creatinina
    Figura 14
    a)
    b)
    UMOD
    Figura 15
    Figura 16
    Figura 17
    LISTA DE SECUENCIAS
    <110> Fundación Ramón Domínguez Universidade de Santiago de Compostela Servizo Galego de Saúde
    <120> MÉTODO PARA LA SEPARACIÓN DE LA FRACCIÓN UNIDA A GLUCOSAMINOGLICANOS Y SUS APLICACIONES
    <130> P12162ES00
    <160> 2
    <170> PatentIn version 3.5
    <210> 1
    <211> 24
    <212> PRT
    <213> Homo sapiens
    <400> 1 Met Gly Gln Pro Ser Leu Thr Trp Met Leu Met Val Val Val Ala Ser 1 5 10 15 Trp Phe Ile Thr Thr Ala Ala Thr
    <210> 2
    <211> 30
    <212> PRT
    <213> Homo sapiens
    <400> 2 Met Gly Gln Pro Ser Leu Thr Trp Met Leu Met Val Val Val Ala Ser 1 5 10 15 Trp Phe Ile Thr Thr Ala Ala Thr Asp Thr Ser Glu Ala Arg
    20 25 30
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