ES2607801T3 - Extracto de arándano útil en el tratamiento y la prevención de las infecciones urinarias - Google Patents

Extracto de arándano útil en el tratamiento y la prevención de las infecciones urinarias Download PDF

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Abstract

Extracto de arándano, ventajosamente desesterificado, que comprende: * 5 a 20% en peso, ventajosamente 10 a 15% en peso, de proantocianidoles (PAC) con respecto al peso total del extracto seco (medido mediante el método de BL-DMAC), * 2 a 12% en peso, ventajosamente 3 a 10% en peso, ventajosamente de manera estricta más de 5% y menos de 10% en peso de ácidos orgánicos con respecto al peso total del extracto seco, incluyendo: - 1 a 10% en peso, ventajosamente 1 a 5% en peso, ventajosamente 1 a 3% en peso de ácido quínico con respecto al peso total del extracto seco, - 0,5 a 8% en peso, ventajosamente 1 a 4% en peso, de ácidos fenólicos con respecto al peso total del extracto seco, * por lo menos 0,5% en peso, ventajosamente por lo menos 1% en peso, de antocianos y/o de anticianidoles con respecto al peso total del extracto seco, * 1 a 10% en peso de azúcares con respecto al peso total del extracto seco, * 1 a 10% en peso, ventajosamente 2 a 5% en peso, de flavonoles, en forma glicosilada /o aglicona.

Description

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DESCRIPCION
Extracto de arandano util en el tratamiento y la prevencion de las infecciones urinarias.
Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un extracto concentrado de arandano (Vaccinium macrocarpon) cuya composicion compleja permite aumentar sus efectos antibacterianos, util para la prevencion o el tratamiento de las infecciones urinarias, y en particular para el tratamiento preventivo o antirrecidiva de infecciones urinarias. La invencion se refiere tambien a un procedimiento de preparacion de tal extracto, de composiciones alimenticias, nutraceuticas o farmaceuticas que comprenden el extracto y a su utilizacion en el tratamiento o la prevencion de las infecciones urinarias.
Tecnica anterior
Las infecciones urinarias (UTIs) estan entre las enfermedades infecciosas mas extendidas, y constituyen un presupuesto de salud considerable para la sociedad. Los microorganismos pueden alcanzar las vfas urinarias por via hematogena o linfatica, pero la mayorfa de las pruebas clfnicas y experimentales muestran que la ascension de la uretra por los microorganismos constituye la via mas comun que conduce a una infeccion urinaria, en particular por los organismos de origen enterico (Escherichia coli y otras enterobacterias). Esto proporciona una explicacion logica para la mayor frecuencia de las infecciones urinarias en las mujeres que en los hombres y para el riesgo incrementado de infeccion tras el cateterismo de la vejiga o de la instrumentacion.
Basandose en la utilizacion tradicional de arandano (Vaccinium macrocarpon, tambien denominado “arandano de america” o “gran arandano rojo de America”, o tambien “atoca” o “ataca” en Quebec, en ingles “cranberry” o “American cranberry”), se utilizan numerosos ingredientes procedentes de fruto o zumo en el mercado de los complementos alimenticios como agente curativo o preventivo que permite limitar el riesgo de aparicion de infecciones urinarias. Se han demostrado unos vfnculos epidemiologicos y clfnicos entre el consumo de arandano de America y la aparicion de infecciones urinarias.
El arandano es un arbusto de pequeno tamano (no mas de 30 cm) que crece espontaneamente unicamente en el Este de America del Norte desde las Carolinas hasta Canada. Su presencia caracteriza las turberas acidas. El fruto es una pequena baya que mide de 10 a 20 mm de diametro. En su madurez, su coloracion es rojo vivo y su sabor acidulado y astringente.
La baya de arandano se caracteriza por su riqueza en flavonoides y comprende numerosos tipos de compuestos diferentes, incluyendo:
- unos acidos organicos, y en particular el acido qufnico, el acido cftrico, el acido malico y los acidos fenolicos tales como los acidos benzoicos, hidroxi-benzoicos e hidroxi-cinamicos,
- unos antocianos (tambien denominados “antocianosidos”),
- unos flavanoles, y en particular:
o unos flavan-3-ol monomeros tales como la catequina, la epicatequina, la galocatequina, y la epigalocatequina,
o unos flavan-3-oles polfmeros, los proantocianidoles (tambien denominados “proantocianidinas” (ingles) o “taninos condensados”),
- unos galotaninos y elagitaninos (tambien denominados taninos hidrolizables),
- unos flavonoles, como la quercetina por ejemplo, en forma glicosilada y/o aglicona.
El arandano comprende diferentes acidos organicos, tales como el acido qufnico, el acido cftrico o el acido malico. Durante mucho tiempo, el efecto del consumo de zumo de arandano se ha considerado como relacionado con una acidificacion de la orina que permite limitar el crecimiento de las bacterias uropatogenas disminuyendo el pH urinario.
Asf, el documento US 010/028456 describe una composicion para tratar las infecciones urinarias, que comprende una formulacion de timoquinona y de frutos, zumos o extractos de arandano. Un extracto de arandano susceptible de ser utilizado es un extracto a 5:1 estandarizado para tener un contenido en acido qufnico del 3,4% (el resto de su composicion no se especifica). Sin embargo, se recuerda en la introduccion que la eficacia terapeutica de los extractos de arandano para el tratamiento de las infecciones urinarias no se ha demostrado.
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En efecto, el mecanismo de accion relacionado con una acidificacion de la orina es demasiado simplificador, siendo estos acidos organicos en realidad metabolizados in vivo y por lo tanto no alcanzan intactos las vfas urinarias. Asf, a pesar de que las celulas humanas no metabolizan el acido qufnico, el material enzimatico de la flora intestinal permite reducir el acido qufnico en acido benzoico a nivel del colon.
Entre los acidos organicos, el arandano esta particularmente concentrado en diferentes acidos fenolicos, incluyendo los acidos benzoicos, hidroxi-benzoicos e hidroxi-cinamicos. Contiene asf 0,05 g/100 g de acido hidroxi-benzoico (esencialmente representados por el acido benzoico), y menos de 0,1 g/100 g de acidos hidroxicinamicod representados esencialmente por los acidos p-cumarico, sinapico y cafeico. Comprende tambien otros acidos organicos como los acidos fenolicos, y en particular el acido qufnico, que es un intermediario de la sfntesis del nucleo bencenico mediante la via shikimato (4-hidroxibenzoico), que permite la sfntesis de los aminoacidos aromaticos, de los fenil-propanoides y compuestos fenolicos acidos hidroxicinamicos y flavonoides.
Los acidos fenolicos, y mas particularmente los mas apolares de ellos (tal como el acido benzoico) interrumpen las posibilidades de intercambios metabolicos de los transportadores de las membranas bacterianas y tienen por lo tanto un efecto bactericida.
Sin embargo, los acidos fenolicos son biodisponibles y facilmente transportados a traves de la barrera intestinal del intestino delgado a traves de los transportadores de los carboxilatos (Cong et al., 2001) y, una vez en circulacion enterohepatica, se conjugan despues con glicina para formar el acido hipurico, para finalmente ser excretados en la orina por los rinones. La actividad bactericida del acido hipurico es menos importante que la de los acidos fenolicos. La actividad antibacteriana directamente aportada por los acidos fenolicos del arandano es por lo tanto, en este caso, potencialmente disminuida por su biodisponibilidad en el intestino delgado.
En consecuencia, los efectos de los acidos organicos, tales como el acido qufnico y los acidos fenolicos, sobre la prevencion o la disminucion de la aparicion de infecciones urinarias no son completamente claros.
Desde hace algunos anos, el interes por el arandano en la prevencion de las infecciones urinarias se focalizo en los compuestos de tipo proantocianidoles (tambien denominados “proantocianidinas” o “taninos condensados”, abreviados en “PAC” en la presente descripcion).
Las PAC son unos polfmeros de unidades flavanoles (tales como la catequina, la epicatequina, la galocatequina y la epigalocatequina), que pueden estar unidas entre sf de diferentes maneras.
En particular, se han descrito dos tipos de enlaces:
- unos enlaces de tipo A, en los que las dos unidades flavanol estan unidas por dos enlaces covalentes, uno entre el carbono C-4 de la primera unidad flavanol y el carbono C-8 de la segunda unidad flavanol (C-4 ^ C- 8), siendo el otro un enlace eter entre el carbono C-2 de la primera unidad flavanol y el carbono C-7 de la segunda unidad flavanol (C-2 ^ O ^ C-7). La presencia de PAC con este tipo de enlace es una de las caracterfsticas del arandano, presentando pocos vegetales unas PAC con este tipo de enlace.
- unos enlaces de tipo B, en los que las dos unidades flavanol estan unidas por un unico enlace covalente, entre el carbono C-4 de la primera unidad flavanol y el carbono C-6 o C-8 de la segunda unidad flavanol (union C-4 ^ C-6 o C-4 ^ C-8), estos enlaces estan tambien presentes en las PAC de arandano.
Las PAC de arandano comprenden al mismo tiempo unos enlaces de tipo A y de tipo B y son particularmente polimerizadas, con un grado de polimerizacion medio de 15 unidades en la fruta (Gu et al., 2002), es decir un 80% de proantocianidoles con un grado de polimerizacion superior a 5, y que comprende un 46% de enlaces interflavanicos de tipo A.
El interes por las PAC de arandano proviene del hecho de que se ha demostrado in vitro que estos compuestos son capaces, como la mayorfa de los taninos, de interactuar con las paredes de las celulas del tracto urinario y/o con los componentes extracelulares de las bacterias que limitan sus posibles interacciones, y por lo tanto potencialmente la fijacion o la adhesion de las bacterias sobre las paredes de las vfas urinarias. Este efecto curtiente se supone que explica, por lo tanto, que tiene un efecto sobre la aparicion y la persistencia de las bacterias uropatogenas que colonizan el tracto urinario.
Asf, la patente EP 0 752 871 B1 describe unos extractos de una planta del genero Vaccinium (en particular de arandano) enriquecidos en una fraccion que tiene unos efectos antiadhesion sobre las bacterias y desprovisto de azucares simples o dimericos, en acidos y en antocianos, purificado por cromatograffa, en particular con la ayuda de una columna lipofila. La fraccion que tiene unos efectos antiadhesion sobre las bacterias corresponde principalmente a las PAC.
De manera similar, la solicitud WO 96/30033 describe unas PAC particulares que tienen un grado de polimerizacion de entre 2 y 18 y su utilizacion para la prevencion o el tratamiento de las infecciones urinarias a traves de un efecto
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anti-adhesion de las bacterias. Estas PAC son susceptibles de ser purificadas a partir de arandano (vease el ejemplo 1), por un procedimiento que comprende la alcalinizacion del arandano a un pH superior a 10 para ionizar los grupos fenol de los compuestos polifenolicos en grupos fenoxidos, la precipitacion con metanol, la reacidificacion del producto obtenido para reconvertir los grupos fenoxidos en fenoles, y su purificacion sobre una columna lipofila. El extracto obtenido comprende unas PAC y unos flavonoides. A partir del procedimiento de preparacion (utilizacion de una columna lipofila en particular), este extracto no comprende cantidades significativas de acidos organicos, tales como el acido qufnico o los acidos fenolicos (pero solo eventualmente unas cantidades bajas residuales, ampliamente inferiores al 5% en peso con respecto al peso total del extracto seco).
La patente EP 1 014 969 B1 describe un extracto de PAC de plantas (en particular de arandano) que tiene un efecto antiadhesion de bacterias particulares sobre unas superficies. Dicho extracto contiene uno o varios proantocianidoles con de 5 a 6 unidades, de las cuales al menos dos estan unidas por un enlace de tipo A. Este extracto se puede obtener por un procedimiento que comprende una extraccion por un disolvente acuoso, una etapa de purificacion por cromatograffa con una columna lipofila o por extraccion con un disolvente no polar, y una segunda etapa de purificacion por cromatograffa con una columna hidrofilo-lipofila. El extracto obtenido comprende unas PAC, pero esta desprovisto en particular de azucares, de acidos organicos, de antocianos y de flavonoles.
La solicitud EP 2 108 268 A1 describe la preparacion de un extracto de arandano fuertemente enriquecido en PAC de arandano de grado de polimerizacion superior a 5 y su utilizacion para disminuir la fijacion de ciertas bacterias E. coli sobre las paredes de las vfas urinarias. El extracto se obtiene mediante un procedimiento que comprende una extraccion por un disolvente organico (en particular un alcohol) de las fracciones insolubles obtenidas a partir de bayas de arandano. Comprende al menos un 15% en peso de PAC expresado en equivalente procianidina C1 con respecto al peso seco del extracto, una cantidad de antocianos similar a la de la baya de arandano, unos flavonoles, y unos restos de azucares, de protefnas, de fibras y de materias minerales. Obteniendose a partir de fracciones insolubles de arandano, no comprende sin embargo ninguna cantidad significativa de acidos organicos, tales como el acido qufnico o los acidos fenolicos (pero solo eventualmente unas cantidades bajas residuales, ampliamente inferiores al 5% en peso con respecto al peso total del extracto seco).
La solicitud WO 2010/121203 describe un extracto de arandano destinado a reducir la contaminacion bacteriana en bebidas, que comprende unas PAC y unos antocianos, pero que comprende unas cantidades residuales muy limitadas en azucares y acidos organicos debido a una etapa de purificacion sobre una resina que fija los compuestos fenolicos, pero que no se une de manera sustancial a los azucares y a los acidos organicos. La descripcion general indica que la cantidad residual de azucares o de acidos organicos es, en todo caso, inferior al 5%, y los ejemplos de extracto caracterizados en la parte experimental comprenden todos menos del 1% de azucares y de acidos organicos residuales.
Unos efectos bactericidas y bacterioestaticos de las PAC de arandano tambien se han puesto en evidencia in vitro (Sanchez-Patan et al., 2012).
El documento EP 2 033 641 A1 describe un procedimiento de preparacion de extractos ricos en PAC, en particular a partir de arandano, susceptibles de tener unos efectos antibacterianos, en particular en el ambito de infecciones urinarias. El procedimiento descrito y reivindicado implica una etapa de lavado con agua desmineralizada de la resina utilizada para enriquecer el extracto en PAC, que conduce a la eliminacion de los azucares y de los acidos fenolicos. Ademas, se describe tambien una etapa opcional que tiene como objetivo eliminar las antocianidinas. El procedimiento descrito pretende por lo tanto tambien, en primer lugar, enriquecer al maximo el extracto en PAC, en detrimento de los otros compuestos activos contenidos en el arandano.
Asf, se ha considerado generalmente estos ultimos anos que el efecto positivo del consumo de arandano sobre la prevencion de las infecciones urinarias estaba relacionado con los efectos anti-adhesion, bacterioestaticos y bactericidas de las PAC comprendidas en el arandano.
Sin embargo, las PAC resultan poco biodisponibles en su forma de PAC natural, y solo una baja proporcion de PAC parece superar la barrera intestinal tal cual (Appeldoorn et al., 2009). Las pAc parecen ademas tanto menos biodisponibles cuando su grado de polimerizaicon es elevado (Pu et al., 2012). Asf, la mayorfa de las PAC de arandano permanece en el lumen intestinal que atraviesa el intestino delgado para alcanzar el colon. A este nivel, las PAC debilmente polimerizadas se hidrolizan en forma de acidos fenolicos y resultan biodisponibles en esta forma.
En consecuencia, si los efectos antiadhesion, bacterioestaticos y bactericidas de las PAC tfpicas del arandano se demuestran in vitro, no pueden tener lugar de manera mayoritaria en la vejiga o el tracto urinario, siendo una muy baja proporcion de estos compuestos susceptibles de alcanzar las vfas urinarias. Por el contrario, estos efectos son posibles en el colon, pero no esta claro si se pueden explicar para ellos mismos el efecto positivo del consumo de arandano sobre la prevencion de las infecciones urinarias.
Por lo tanto, es diffcil, a partir de la tecnica anterior, determinar que componentes de la baya de arandano entera permiten evitar o disminuir la aparicion de infecciones urinarias.
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En el contexto de la presente invencion, los inventores han elaborado un nuevo extracto de arandano que, en lugar de focalizarse sobre un tipo de componente particular (PAC, acidos fenolicos, acidos organicos) susceptible de poseer un efecto antibacteriano, incorpora en un unico extracto unas fracciones enriquecidas de cada uno de estos componentes. Ademas, el extracto segun la invencion es un extracto desesterificado, es decir que se ha sometido, en una etapa o en otra, a un tratamiento enzimatico por unas esterasas, lo que tiene por efecto aumentar la concentracion en compuestos de interes y hacer el extracto mas fermentable.
El extracto segun la invencion posee por lo tanto la ventaja de ser altamente concentrado en compuestos de interes con respecto a la baya de arandano, y combinar diferentes mecanismos de prevencion o de disminucion de la aparicion de infecciones urinarias.
Descripcion de la invencion
La presente invencion se refiere por lo tanto a un extracto de arandano, que comprende:
- del 5 al 20% en peso, ventajosamente del 10 al 15% en peso, de proantocianidoles (PAC) con respecto al peso total del extracto seco (medido mediante el metodo de BL-DMAC),
- del 2 al 12% en peso, ventajosamente del 3 al 10% en peso, ventajosamente de manera estricta mas del 5% y menos del 10% en peso, de acidos organicos con respecto al peso total del extracto seco, incluyendo:
o del 1 al 5% en peso, ventajosamente del 1 al 3% en peso de acido qufnico con respecto al peso total del extracto seco,
o del 0,5 al 8% en peso, ventajosamente del 1 al 4% en peso, de acidos fenolicos con respecto al peso total del extracto seco,
- al menos el 0,5% en peso, ventajosamente al menos el 1% en peso, de antocianos y/o de anticianidoles con respecto al peso total del extracto seco,
- del 1 al 10%, ventajosamente del 1 al 5% en peso, en peso de azucares con respecto al peso total del extracto seco,
- del 1 al 10% en peso, ventajosamente del 2 al 5% en peso, de flavonoles, con respecto al peso total del extracto seco.
En una forma de realizacion preferida de la presente invencion, el extracto de arandano esta ademas desesterificado.
Por “arandano”, se entiende la planta Vaccinium macrocarpon, tambien denominada “arandano de america” o “gran arandano rojo de America”, o tambien “atoca” o “abaca” en Quebec, en ingles “cranberry” o “American cranberry”). Para simplificar, se utiliza generalmente el termino “arandano” en la presente descripcion.
Por “desesterificado” se entiende que el extracto ha sufrido, durante su procedimiento de preparacion, una etapa de tratamiento enzimatica mediante al menos una enzima de tipo “esterasa” que puede hidrolizar algunos enlaces ester seleccionada entre las tanasas (en particular las galoil-estearas y las elagi-estearasas), las cinamoil-esterasas, las p- glucosidasas y sus mezclas. Este tratamiento tiene por efecto aumentar la fermentabilidad intestinal del extracto segun la invencion, hidrolizando, al menos parcialmente, algunos compuestos complejos presentes en el arandano. Ventajosamente, se puede utilizar una mezcla que comprende unas actividades tanasa, cinamol-esterasa y p- glucosidasa.
Por “tanasa” se entiende una enzima capaz de hidrolizar la union ester entre el azucar y los acidos galicos o elagicos de los galotaninos y elagitaninos. En particular, en la nomenclatura EC (siendo EC la sigla de “Enzyme Commission numbers”, la comision de las enzimas, que ha definido una clasificacion numerica de las enzimas, basada en la reaccion qufmica que catalizan), las tanasas llevan el n° EC 3.1.1.20, y permiten catalizar las reacciones siguientes:
- digalato + H2O = 2 galato,
- elagitaninos + H2O = acido hexahidroxifenico + acido galico,
- (+/-)-epicatequina-galato + H2O = epicatequina + acido galico,
- (+/-)-epigalocatequin-3-galato + H2O = epigalocatequina + acido galico,
- (-)-epigalocatequina galato + H2O = (-)-epigalocatequina + acido galico,
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- 1,2,3,4,6-pentagaloil glucosa + H2O = 5 galato + D-glucosa,
- acido tanico + H2O = 10 galato + D-glucosa,
- propilgalato + H2O = galato + propanol,
- ester etflico del acido protocatequico + H2O = protocatecuato + etanol.
Cuando se utilizan las tanasas, el tratamiento tiene por efecto en particular hidrolizar los galotaninos y los elagitaninos del arandano en azucares y acido galico o acido elagico respectivamente, dos acidos fenolicos naturalmente poco o nada presentes en forma libre en el arandano. Tales enzimas estan disponibles comercialmente en diferentes proveedores tales como:
- AB Enzymes GmbH, Feldbergstrasse 78, 64293 Darmstadt, Germany: (Rohapect 10L; Rohament CL; Rohalase BX/BXL; Endozym B-Split)
- Biocatalysts Ltd, Cefn Coed, Parc Nantgarw, Cardiff, CF15 7QQ, Wales, UK: (Depol 670L, Depol 40, Depol 793L; Cellulase 13L, Tannase 795P)
- Novozymes A/S, Krogshoejvej 36,2880 Bagsvaerd, Dinamarca: (Pectinex BE-3L; Pectinex Ultra SP-L)
Por “p-glucosidasas” se entiende una enzima capaz de hidrolizar una glucosa no reducida terminal, unida a una aglicona por un enlace p, con liberacion de D-glucosa. En la nomenclatura EC, las p-glucosidasas llevan el n° EC 3.2.1.21, y permiten catalizar las reacciones:
- antocianidina-glucosido + H2O = antocianidina + glucosa con la parte antocianidina: cianidina, petunidina, malvidina, peonidina,
y con la parte glucosido: glucosa, galacatosa, arabinosa principalmente,
- quercetina-3,4'-di-beta-D-glucopiranosido + H2O quercetina + beta-D-glucosa,
- quercetina-4'-beta-glucopiranosido + H2O quercetina + beta-D-glucosa,
- quercetina-7-O-beta-D-glucosido + H2O quercetina + beta-D-glucosa.
Tales enzimas estan disponibles comercialmente en diferentes proveedores, en particular en los mencionados anteriormente en lo referente a las tanasas.
Por “cinamol-esterasa” se entienden las enzimas que lleva los n° EC 3.1.1.42 y EC 3.1.1.73 en la nomenclatura EC, y capaces de catalizar las reacciones siguientes:
- EC 3.1.1.42 - clorogenato hidrolasa:
- acido clorogenico + H2O = acido cafeico + acido qufnico,
- acido 5-O-cafeoil qufnico + H2O = acido cafeico + acido qufnico;
- EC 3.1.1.73 - feruloil esterasa:
- ester metflico del acido ferulico + H2O = acido ferulico + metanol,
- 5-O-(trans-feruloil)-L-arabinofuranosido + H2O = acido ferulico + L-arabinosa,
- acido 5-O-p-cumaroilqufnico + H2O = acido p-cumarico + acido qufnico.
Tales enzimas estan disponibles comercialmente en diferentes proveedores, y en particular en los mencionados anteriormente referente a las tanasas.
El tratamiento enzimatico por al menos una esterasa permite por lo tanto tambien aumentar la concentracion del extracto, en particular en acidos organicos y en acidos fenolicos libres. Las enzimas descritas anteriormente podran ser utilizadas a lo largo de la cadena de produccion en cantidades variables generalmente del 0,05% al 0,1% de la materia seca de arandano utilizada.
Ventajosamente, el tratamiento enzimatico por al menos una enzima de tipo “esterasa” capaz de hidrolizar algunos
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enlaces ester, seleccionada entre las tanasas (en particular las galoil-esterasas y las elagi-esterasas), las cinamoil- esterasas, las p-glucosidasas y sus mezclas, se ha realizado simultaneamente o despues de un tratamiento por unas enzimas de licuefaccion (pectinasa, poligalacturonasa, celulasa) que tiene principalmente por objetivo:
- distinguir unas fracciones fenolicas hidrolizables de fracciones resistentes a la hidrolisis,
- hacer estos compuestos mas apolares y en consecuencia mas facilmente separables.
Algunas preparaciones que comprenden unas enzimas de licuefaccion (pectinasa, poligalactuonasa, celulasa) pueden comprender minoritariamente unas actividades secundarias de tipo celobiasa (p-glucosidasa), galactosidasa, arabinosidasas, xilanasas, incluso unas actividades secundarias de tipo tanasa, cinamoil-esterasa, y/o p- glucosidasa, susceptibles de conducir a una desesterificacion muy limitada de los polifenoles de arandano. Sin embargo, la etapa de licuefaccion enzimatica no permite obtener una desesterificacion significativa del extracto, que puede ser obtenida solo mediante una etapa suplementaria de tratamiento enzimatico especffico por al menos una esterasa seleccionada entre las tanasas (en particular las galoil-esterasas y las elagi-eterasas), las cinamoil- esterasas, las p-glucosidasas y sus mezclas. En consecuencia, un extracto de arandano que ha sufrido una simple etapa de licuefaccion enzimatica con la ayuda de una composicion que comprende muy mayoritariamente unas enzimas de licuefaccion de tipo pectinasa, poligalacturonasa, y celulasa, sin adicion suplementaria de al menos una esterasa seleccionada entre las tanasas (en particular las galoil-esterasas y las elagi-esterasas), las cinamoil- esterasas, las p-glucosidasas y sus mezclas, no se considerara como un extracto desesterificado en el sentido de la invencion.
Por “proantocianidoles”, “proantocianidinas” o “taninos condensados” abreviados por “PAC”, se entienden los oligomeros o polfmeros de flavanoles de arandano. El termino “oligomero” agrupa los dfmeros y trfmeros de flavanoles, el termino “polfmero” agrupa los multfmeros de flavanoles que tienen un grado de polimerizacion (DP) de por lo menos 4. El extracto desesterificado de arandano segun la invencion comprende al mismo tiempo unos oligomeros y unos polfmeros de PAC, en una proporcion global del 5 al 20% en peso, ventajosamente del l0 al 15% en peso, de PAC con respecto al peso total del extracto seco. Dentro de las PAC totales, los polfmeros de PAC (DP>4 que representan al menos el 30% en peso, con respecto al peso de todos las PAC presentes en el extracto.
Los polfmeros de PAC son muy poco biodisponibles in vivo y permanecen en su mayorfa en el lumen intestinal que atraviesa el intestino delgado para alcanzar el colon, en el que son susceptibles de tener un efecto anti-adhesion, bactericida y bacterioestatico sobre las bacterias entericas susceptibles de migrar hacia la uretra y dar lugar a infecciones urinarias. La presencia de polfmeros de PAC en el extracto segun la invencion contribuye por lo tanto a su eficacia de prevencion o de disminucion de las infecciones urinarias.
Los oligomeros de PAC son tambien poco biodisponibles in vivo y llegan en su mayorfa hasta el colon, en el que son hidrolizados en forma de acidos fenolicos. Estos, y en particular los mas apolares de ellos tales como el acido benzoico, pueden entonces ejercer otro tipo de efecto bacteriano, por perturbacion de las posibilidades de intercambios metabolicos de los transportadores de las membranas bacterianas.
El extracto segun la invencion comprende tambien del 2 al 12% en peso, ventajosamente de 3 al 10% en peso, ventajosamente estrictamente mas del 5% y menos del 10% en peso, de acidos organicos con respecto al peso total del extracto seco. Por “acido organico” se entiende cualquier compuesto hidrocarbonado (saturado o insaturado) que comprende al menos una funcion acida. Asf, los acidos organicos de arandano presentes en el extracto segun la invencion incluyen:
- unos acidos fenolicos, en una cantidad del 0,5 al 8% en peso, ventajosamente del 1 al 4% en peso, con respecto al peso total del extracto seco.
El extracto segun la invencion comprende en particular los principales acidos fenolicos presentes naturalmente en el arandano: el acido p-cumarico, el acido sinapico, el acido cafeico y el acido ferulico, asf como otros acidos fenolicos presentes en menor cantidad en el arandano: acido orto-hidroxi-cinamico, acido para-hidroxigenil-acetico, acido ftalico, y acido elagico.
Ademas, cuando el extracto ha sufrido una etapa de tratamiento por al menos una esterasa, las cantidades de algunos acidos fenolicos tales como los acidos galico, elagico, p-cumarico, ferulico y cafeico libres aumentan con respecto a un extracto que no ha sufrido este tipo de tratamiento.
Los acidos fenolicos, que son capaces de pasar la barrera intestinal, se conjugan despues normalmente con glicina para formar el acido hipurico (que posee un poder bactericida menor), antes de su excrecion en la orina. Sin embargo, debido a cantidades bastante importantes de acidos fenolicos presentes en el extracto segun la invencion (y en particular en un extracto desesterificado que ha sufrido un tratamiento enzimatico por unas esterasas), no es imposible que las capacidades de conjugacion con la glicina por el hfgado sean saturadas y que una parte de los acidos fenolicos, no conjugados a la glicina, puedan alcanzar la orina, y ejercer sus efectos bactericidas de manera preventiva o curativa. La presencia en el extracto de diferentes
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precursores de acidos fenolicos (en particular el acido qufnico, que puede ser transformado en acido benzoico por aromatizacion reductora; los oligomeros de PAC, que son hidrolizados en forma de acidos fenolicos en el colon; y los antocianos o antocianidoles hidrolizados en forma de acidos benzoicos en el colon) contribuye tambien a la presencia en el organismo de una concentracion elevada y sostenida en acidos fenolicos, y por lo tanto a una saturacion de las capacidades de conjugacion con la glicina por el hfgado.
- otros acidos organicos naturalmente presentes en el arandano, en particular el acido qufnico, el acido cftrico, y el acido malico.
El extracto segun la invencion comprende en particular del 1 al 5% en peso, ventajosamente del 1 al 3% en peso de acido qufnico con respecto al peso total del extracto seco.
El acido qufnico se reduce en acido benzoico (un acido fenolico) a nivel del colon por el material enzimatico de la flora intestinal. El acido benzoico asf obtenido a nivel del colon no se metaboliza y puede por lo tanto ejercer sus efectos bactericidas sobre las bacterias presentes en el colon y susceptibles de migrar en la uretra y causar una infeccion urinaria.
En consecuencia, la presencia en el extracto segun la invencion (y en particular en un extracto desesterificado que ha sufrido un tratamiento enzimatico por una esterasas) de una cantidad no despreciable de acido qufnico contribuye por un tercer mecanismo al poder de prevencion o de disminucion de las infecciones urinarias del extracto segun la invencion.
El extracto segun la invencion comprende tambien al menos el 0,5% en peso, ventajosamente al menos el 1% en peso, de antocianos y/o de antocianidoles con respecto al peso total del extracto seco. Por “antocianidol” o “antocianidina”, se entiende una subclase de los flavonoides, cuya estructura de base esta formada por dos nucleos aromaticos A y B unidos por 3 carbonos que forman, con el oxfgeno, el anillo C. Los seis antocianidoles mas habituales son: la cianidina, la delfinidina, la pelargonidina, la peonidina, la petunidina y la malvidina, construidos sobre el mismo esqueleto Flavylium responsable del color del compuesto, como se indica en la tabla 1 siguiente:
Tabla 1: estructura de seis antocianidoles mas habituales.
Nombre
Estructura R3' R4' R5' R3 R5 R6 R7
Cianidina
Ry. . T T & k A A Ji R5 -OH -OH -H -OH -OH -H -OH
Delfinidina
-OH -OH -OH -OH -OH -H -OH
Pelargonidina
-H -OH -H -OH -OH -H -OH
Malvidina
-OCH3 -OH -OCH3 -OH -OH -H -OH
Peonidina
-OCH3 -OH -H -OH -OH -H -OH
Petunidina
-OCH3 -OH -OH -OH -OH -H -OH
Por “antocianos” o “antocianosidos” (o tambien “antocianinas” en el modelo ingles), se entienden unos heterosidos de antocianidoles, es decir unos antocianidoles que llevan unos azucares. La parte osfdica de los antocianosidos puede ser un monosacarido (glucosa, galactosa, ramnosa), un diholosido (rutinosa constituido de una glucosa unida a una ramnosa, xiloglucosa) o a veces un triholosido. La mayorfa de los antocianosidos son unos 3-monosidos y unos 3,5-diosidos de antocianidoles. Existen tambien unos diosidos unidos en 3, 7 y unos triosidos unidos en 3, 5, 3'. Numerosos antocianosidos son, ademas, acilados por:
- unos acidos hidroxicinamicos: acidos 4-cumarico, cafeico, ferulico, sinapico,
- unos acidos benzoicos: acido galico,
- unos acidos alifaticos carboxflicos: acido acetico, o unos acidos dicarboxflicos como los acidos malonico, malico, oxalico, succfnico.
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Estos acidos esterifican un hidroxilo de azucar, generalmente en su C-6.
Cuando el extracto no se ha desesterificado, comprende principalmente unos antocianos. Por el contrario, cuando el extracto se ha desesterificado, comprende principalmente unos antocianidoles.
Los antocianos, y mas particularmente los antocianidoles (presentes principalmente cuando el extracto esta desesterificado), han demostrado tener tambien unas actividades bactericidas (Pratt et al., 1960). Ademas, son tambien fermentados por la flora intestinal, conduciendo a nivel del colon a su transformacion en acidos fenolicos, y en particular en acido benzoico (Keppler et al., 2005). Estos compuestos son por lo tanto tambien unos precursores de acidos fenolicos in vivo.
El extracto segun la invencion comprende ademas del 1 al 10%, ventajosamente del 1 al 5% en peso de azucares
residuales con respecto al peso total del extracto seco. Esto representa una fuerte disminucion del contenido en
azucares con respecto a la baya de arandano, en la que los azucares representan aproximadamente del 45 al 67% (Blumenthal et al., 2003) en peso de azucares con respecto al peso total del extracto seco. Los azucares presentes incluyen en particular glucosa, fructosa, sacarosa, sorbitol.
El extracto segun la invencion comprende tambien del 1 al 10% en peso, ventajosamente del 2 al 5% en peso, de
flavonoles, tales como la quercetina, en forma glicosilada y/o aglicona, con respecto al peso total del extracto seco.
Asf, el extracto segun la invencion posee una composicion compleja, que permite acumular varios efectos antibacterianos a nivel del colon (efectos antiadhesion, bactericida y bacterioestatico a traves de los polfmeros de PAC presentes en el colon, efectos bactericidas de los de los acidos fenolicos generados a nivel del colon a partir de los oligomeros de PAC y del acido qufnico), uniendose estos efectos para conferir al extracto segun la invencion un fuerte poder de prevencion o de disminucion de la aparicion de las infecciones urinarias.
Ademas, la presencia de acidos fenolicos en cantidades importantes permite potencialmente, mediante una saturacion de las capacidades del hfgado, conjugar los acidos fenolicos con la glicina, un efecto bactericida directo a nivel de las vfas urinarias, de manera preventiva o curativa.
El extracto segun la invencion puede presentarse en diferentes formas, en particular en forma de disolucion, o bien en forma seca. Ventajosamente, el extracto segun la invencion es un extracto seco. En forma de polvo, este puede ser utilizado bajo diferentes formas, permitiendo por ejemplo preparar comprimidos, capsulas, granulos y soluciones bucodispersables. En forma solida o lfquida puede tambien permitir formular geles, cremas, jabones para aplicaciones topicas, y formular unas bebidas diluidas para ser reconstituidas o listas para el uso.
El extracto segun la invencion se puede preparar mediante un procedimiento segun la invencion que comprende las etapas siguientes:
a) enriquecimiento de una fraccion hidrosoluble de arandano en compuestos polifenolicos apolares (antocianos, antocianidoles, y oligomeros de PAC) por un lado y en acidos organicos, por otro lado, para obtener una fraccion I,
b) enriquecimiento de una fraccion no-hidrosoluble de arandano en polfmeros de PAC particularmente curtientes con unos grados de polimerizacion media superior a 6-7 de tipo B y que comprende siempre al menos una union de tipo A, para obtener una fraccion II,
c) montaje de las fracciones I (rica en compuestos polifenflicos apolares y en acidos organicos) y II (rica en polfmeros de PAC) obtenidas respectivamente en las etapas a) y b), en proporciones que corresponden a una relacion en peso (fraccion I/fraccion II) comprendida entre 20/80 y 80/20, y
d) digestion enzimatica por al menos una esterasa seleccionada entre las tanasas (en particular las galoil- esterasas y las elagi-esterasas), las cinamol-esterasas, las p-glucosidasas y sus mezclas.
En el procedimiento segun la invencion, el extracto se prepara a partir de la combinacion de dos fracciones I y II, obtenidas respectivamente a partir de fracciones hidrosolubles (para la fraccion I) y no-hidrosoluble (para la fraccion II) de arandano.
Estas fracciones hidrosolubles y no hidrosolubles de arandano pueden ser obtenidas a partir de bayas de arandano enteras, por:
i) molienda de bayas de arandano enteras,
ii) decantacion y separacion de las fracciones hidrosolubles y no hidrosolubles.
Las bayas de arandano enteras pueden ser frescas, secas o congeladas (preferentemente mediante un
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procedimiento de congelacion individual rapido denominado “IQF” (por “Individually Quick Frozen”). Despues se muelen mediante tecnicas clasicas (etapa i)). En esta etapa, la molienda se somete preferentemente a una etapa de licuefaccion enzimatica (etapa i1)). Esta etapa es una clasica bien conocida por el experto en la materia, durante la cual unas pectinasas, poligalacturonasas y/o celulasas se anaden al molido con el fin de licuarlo. El molido, preferentemente licuado, se somete despues a una etapa de decantacion y de separacion de las fracciones hidrosolubles y no hidrosolubles (etapa ii)). Esta etapa se realiza ventajosamente a un pH comprendido entre 2 y 7, a una temperatura comprendida entre 15 y 70°C, y a una presion comprendida entre 1 y 15 atmosferas.
De manera alternativa, se puede utilizar directamente como fraccion hidrosoluble un zumo de arandano, es decir una fraccion lfquida de arandano obtenida por prensado de bayas de arandano. El zumo puede ademas ser un zumo concentrado. Este se ha sometido preferentemente a una etapa de licuefaccion enzimatica por al menos una pectinasa, poligalacturonasa, celulasa y sus mezclas.
Asimismo, se puede utilizar directamente como fraccion no hidrosoluble un hollejo de arandano. Por “hollejo de arandano” u “orujo de arandano” se entiende el residuo humedo o secado de bayas de arandano prensadas. Estas se han sometido preferentemente a una etapa de licuefaccion enzimatica por al menos una pectinasa, poligalacturonasa, celulasa y sus mezclas.
En el procedimiento segun la invencion, las fracciones hidrosolubles y no hidrosolubles se tratan separadamente (etapa a) para la fraccion hidrosoluble, etapa b) para la fraccion no hidrosoluble). Estos tratamientos separados se pueden realizar en un orden cualquiera (etapa a) y despues etapa b), etapa b) y despues etapa a), o tratamiento simultaneo en paralelo de las dos fracciones).
En la etapa a), la fraccion hidrosoluble esta enriquecida en compuestos polifenolicos apolares, por un lado, y en acidos organicos, por otro lado, para obtener una fraccion denominada “fraccion I”. Este enriquecimiento se realiza mediante dos etapas sucesivas de purificacion, seguidas de una etapa de montaje que conduce a la fraccion I:
- en una 1a etapa a1), los compuestos apolares (y en particular los compuestos fenolicos apolares, como los flavanoles, flavonoles y los antocianos, eventualmente desesterificados) son separados de los compuestos polares (tales como los azucares y los acidos) por adsorcion de la fraccion hidrosoluble sobre un soporte apolar. El lavado por un disolvente polar permite recoger los compuestos polares no adsorbidos sobre el soporte (fraccion denominada “fraccion polar Ia”). Una etapa de elucion por un disolvente apolar permite despues recoger los compuestos apolares (fraccion denominada “fraccion apolar Ib”).
Los soportes apolares adecuados para esta separacion incluyen, por ejemplo:
o los soportes de adsorcion de tipo copolfmero estireno / divinil benceno, sulfonado o no:
■ FPX68; FPX66 (Dow Chemicals)
■ Sepabeads SP411, SP70, SP700, SP852L, SP850 (Mitsubishi Chemicals);
o Los soportes microporosos que soportan unos grupos ionizados de tipo sulfona o amina terciaria.
■ FPA51, FPA54, FPC23H, XAD761 (Dow Chemicals),
■ Diaion UBK530, UBK550, WA20, WA30.
Los disolventes polares de lavado que permiten recuperar la fraccion polar Ia se pueden seleccionar en particular entre los alcoholes (en particular el etanol, el metanol, el 2-propanol).
Los disolventes apolares de elucion que permiten recuperar la fraccion apolar Ib segun la resina intercambiadora de iones seleccionada se pueden seleccionar en particular entre unas soluciones diluidas de sosa, de potasa, o unas soluciones diluidas de acido fuerte de acido clorhfdrico, sulfurico, o baja de acido cftrico.
Al final de esta etapa a1), la fraccion apolar Ib que comprende en particular los compuestos fenolicos apolares tales como los antocianos o antocianidoles y los oligomeros de PAC se separa, mientras que la fraccion polar Ia que comprende en particular los azucares y los acidos organicos se somete a una segunda etapa a2) de purificacion.
- en una segunda etapa a2), los acidos organicos presentes en la fraccion polar Ia se purifican (y en particular se separan de los azucares tambien presentes en la fraccion polar Ia) por adsorcion sobre una resina intercambiadora de iones (que retiene los acidos organicos, pero no los azucares). Despues del lavado con agua (lo que conduce en particular a una eliminacion de la mayorfa de los azucares), una fraccion denominada “fraccion Ic” enriquecida en acidos organicos de arandano (acido qufnico, acido cftrico, acido
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malico y acidos fenolicos en particular) se eluye con la ayuda de un disolvente acuoso acido.
- en una tercera etapa a3), la fraccion I, enriquecida en compuestos polifenolicos apolares (antocianos, antocianidoles, y oligomeros de PAC), por un lado, y en acidos organicos, por otro lado, se obtiene por montaje de las fracciones Ib y Ic.
En la etapa b), la fraccion no hidrosoluble (hollejo) se enriquece en polfmeros de PAC, para obtener una fraccion denominada “fraccion II”, por un tratamiento que comprende una etapa de extraccion de los polfmeros de PAC por un disolvente organico, preferentemente seguida de etapas de clarificacion, destilacion y concentracion de la disolucion enriquecida asf obtenida. Diferentes procedimientos de este tipo se describen en la solicitud EP 2 108 268 A1.
Asf, el disolvente organico utilizado para la extraccion puede, en particular, ser seleccionado entre los alcoholes (en particular el etanol), los aldehfdos (en particular el acetaldehfdo) y los esteres (en particular acetato de etilo). Ventajosamente, el disolvente organico utilizado es un alcohol, en particular el etanol.
La cantidad de disolvente organico anadida a la fraccion hidrosoluble de arandano puede estar, en particular, comprendida entre el 10 y el 15% en volumen, con respecto al volumen de la fraccion hidrosoluble de arandano en la que se realiza la extraccion.
En particular, la etapa de extraccion se puede realizar por extraccion hidroalcoholica a contracorriente, las mezclas hidroalcoholicas que comprenden del 35 al 80% de etanol se vierten sucesivamente en partes de hollejo de arandano fresco cada vez menos secas; comprendiendo las fracciones etanolicas, por su parte, cada vez mas disolucion extrafble de materia seca.
Son ventajosas unas etapas finales de clarificacion, destilacion y concentracion.
Las fracciones I (Ib y Ic enriquecidas en compuestos fenolicos apolares tales como antocianos, antocianidoles, y oligomeros de PAC, y en acidos organicos) y II (enriquecida en polfmero de PAC) se reunen despues para formar un extracto enriquecido en estos diferentes compuestos de interes. El montaje se puede realizar en proporciones variables que corresponden a una relacion en peso (fraccion I/fraccion II) comprendida entre 20/80 y 80/20, ventajosamente entre 30/70 y 70/30, entre 35/65 y 65/35, entre 40/60 y 60/40, incluso entre 45/55 y 55/45. Ventajosamente, la relacion en peso (fraccion I/fraccion II) puede ser proxima a 50/50. En efecto, corresponden a un montaje en el que las fracciones I y II obtenidas respectivamente al final de las etapas c) y d) se mezclan simplemente, sin eliminacion de una parte de una de las fracciones. Asf, el conjunto de los compuestos de interes se valoriza en el extracto, sin perdida relacionada con la exclusion de una parte de los compuestos de interes.
Sin embargo, se pueden utilizar otras relaciones en peso (fraccion I/fraccion II) si se desea aumentar o disminuir la proporcion en el extracto de algunos compuestos de interes.
El procedimiento segun la invencion, de preparacion del extracto segun la invencion, comprende ademas una etapa d) de digestion enzimatica por al menos una esterasa. Esta etapa d) tiene como objetivo aumentar la fermentabilidad intestinal del extracto segun la invencion, hidrolizando, al menos parcialmente, algunos compuestos complejos presentes en el arandano, y no interfiere de manera significativa con las otras etapas del procedimiento de preparacion. En consecuencia, se puede realizar en diferentes fases del procedimiento de preparacion. En particular, se puede realizar:
- antes de la etapa a), durante la preparacion de las fracciones hidrosoluble y no hidrosoluble (por ejemplo entre las etapas i) y ii), en el molido, preferentemente licuado), o bien sobre las fracciones hidrosoluble y no hidrosoluble, preferentemente licuadas,
- entre las etapas a) y b) y la etapa c) de montaje final, en las fracciones I y II, o
- al final del procedimiento, en el extracto montado obtenido al final de la etapa c).
El procedimiento segun la invencion puede comprender ademas una etapa adicional de secado del extracto, con el fin de obtener un extracto seco. Tal secado se puede realizar mediante cualquier tecnica clasica adecuada, y en particular por atomizacion, con la ayuda de una torre de secado simple o de multiples efectos alimentada por unos concentrados acuosos que presentan una materia seca superior al 20% y previamente puesta en temperatura (50°C-80°C). Estos concentrados se pulverizan mediante unos sistemas de conductos y/o de turbinas, y se secan en forma de polvo a partir de gotitas vaporizadas en un flujo de aire seco a temperaturas inferiores a 180°C. Segun los casos, las fracciones polifenolicas de los extractos de arandano se pueden secar sin soporte en el caso de los extractos apolares desarrollados, o ventajosamente sobre unos soportes tales como unos carbohidratos (maltodextrina, almidones resistentes, inulina). En el caso de las fracciones particularmente acidas, las fracciones pueden ser neutralizadas por adicion de hidroxido de magnesio antes del secado.
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La invencion se refiere tambien a un extracto susceptible de ser obtenido por el procedimiento segun la invencion. Tal extracto comprende, preferentemente:
- del 5 al 20% en peso, ventajosamente del 10 al 15% en peso, de proantocianidoles (PAC) con respecto al peso total del extracto seco,
- del 2 al 12% en peso, ventajosamente del 3 al 10% en peso, ventajosamente de manera estricta mas del 5% y menos del 10% en peso, de acidos organicos con respecto al peso total del extracto seco, incluyendo:
o del 1 al 10% en peso, ventajosamente del 1 al 5% en peso, ventajosamente del 1 al 3% en peso de acido qufnico con respecto al peso total del extracto seco,
o del 0,5 al 8% en peso, ventajosamente del 1 al 4% en peso, de acidos fenolicos con respecto al peso total del extracto seco,
- al menos el 0,5% en peso, ventajosamente al menos el 1% en peso, de antocianos con respecto al peso total del extracto seco,
- del 1 al 10%, ventajosamente del 1 al 5% en peso, en peso de azucares con respecto al peso total del extracto seco,
- del 1 al 10% en peso, ventajosamente del 2 al 5% en peso, de flavonoles, con respecto al peso total del extracto seco.
El extracto susceptible de ser obtenido por el procedimiento segun la invencion puede tambien presentarse en diferentes formas, en particular en forma de disolucion (particularmente en forma de concentrado lfquido), o bien en forma seca. Ventajosamente, el extracto susceptible de ser obtenido por el procedimiento de la invencion es un extracto seco. Este puede presentarse en diferentes formas, por ejemplo en forma de polvo, de comprimido, de capsula dura, de granulos.
La invencion se refiere tambien a una composicion alimenticia o nutraceutica que comprende, entre otros, un extracto segun la invencion o un extracto susceptible de ser obtenido por el procedimiento segun la invencion. Esta composicion esta destinada a ser ingerida, y comprende por lo tanto solo unos componentes aceptables para esta aplicacion. Puede presentarse en cualquier forma habitualmente utilizada en la alimentacion o en la nutraceutica, y en particular en forma de polvo, de capsula dura, de comprimido, de bebida, o de formulas topicas de tipo geles o jabones.
Los extractos segun la invencion comprenden diferentes compuestos de arandano que tienen in vivo unos efectos antibacterianos a nivel del colon.
Comprenden tambien unos acidos fenolicos en cantidad importante, susceptible de saturar las capacidades del hfgado para conjugar los acidos fenolicos con la glicina, permitiendo esto potencialmente a una parte de estos acidos fenolicos alcanzar las vfas urinarias y ejercer sus efectos bactericidas de manera preventiva o curativa.
Los extractos segun la invencion son particularmente utiles para la prevencion y/o el tratamiento de las infecciones urinarias.
La invencion se refiere por lo tanto tambien a una composicion farmaceutica, que comprende un extracto segun la invencion o un extracto susceptible de ser obtenido por el procedimiento segun la invencion y un excipiente farmaceuticamente aceptable.
La invencion se refiere ademas a un extracto segun la invencion o a un extracto susceptible de ser obtenido por el procedimiento segun la invencion, para su utilizacion como medicamento.
La invencion se refiere tambien a un extracto segun la invencion o a un extracto susceptible de ser obtenido por el procedimiento segun la invencion, para su utilizacion en la prevencion o el tratamiento de las infecciones urinarias.
La invencion se refiere tambien a la utilizacion de un extracto segun la invencion o de un extracto susceptible de ser obtenido por el procedimiento segun la invencion, para la preparacion de un medicamento, en particular de un medicamento destinado al tratamiento o a la prevencion de las infecciones urinarias.
La invencion se refiere ademas a un metodo de tratamiento o de prevencion de las infecciones urinarias en un sujeto (preferentemente humano, eventualmente animal), que comprende la administracion (preferentemente por via oral) de una cantidad eficaz de un extracto segun la invencion o de un extracto susceptible de ser obtenido por el procedimiento segun la invencion a dicho sujeto.
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Por “tratamiento” se entiende el hecho de disminuir la infeccion bacteriana a nivel de las vfas urinarias. Tal disminucion puede ser puesta en evidencia mediante analisis de orina que muestran una disminucion del numero de bacterias presentes o por una disminucion de los sfntomas de la infeccion urinaria (frecuente necesidad de orinar, quemaduras asociadas al hecho de orinar, etc.). Ventajosamente, el tratamiento permite eliminar completamente la infeccion, pero el termino “tratamiento” comprende cualquier disminucion significativa de la infeccion. En el ambito del tratamiento de las infecciones urinarias, el extracto segun la invencion o el extracto susceptible de ser obtenido por el procedimiento segun la invencion puede ser asociado a otro tratamiento habitual de las infecciones urinarias, en particular por diferentes antibioticos bien conocidos por el experto en la materia.
Por “prevencion” se entiende el hecho de disminuir la probabilidad de aparicion de una infeccion urinaria. Ventajosamente, el extracto segun la invencion o el extracto susceptible de ser obtenido por el procedimiento segun la invencion permite evitar cualquier infeccion urinaria durante el tiempo de toma del extracto (probabilidad de que la aparicion de infeccion urinaria sea cero). Sin embargo, el termino “prevencion” comprende tambien la posibilidad de disminuir significativamente la frecuencia de aparicion de infecciones urinarias en una poblacion de pacientes que ingieran una cantidad eficaz de extracto durante el periodo de extraccion del extracto, con respecto a una poblacion de pacientes similares que no toma el extracto (en cuyo caso la probabilidad de infeccion urinaria durante la toma del extracto se disminuye simplemente de manera significativa). Para tal comparacion, las poblaciones comparadas deben ser similares, en particular en lo referente a la proporcion de sujetos que tienen habitualmente una frecuencia elevada de aparicion de infecciones urinarias.
El extracto segun la invencion o el extracto susceptible de ser obtenido por el procedimiento segun la invencion son particularmente utiles para la prevencion o el tratamiento de las infecciones urinarias por las bacterias uropatogenas: enterobacterias, coliformes, Escherichia coli (mas particular E. coli denominada “manosa resistente” que presenta unas adhesinas fimbrial de tipo I, pero tambien mas generalmente las bacterias gram positivas (en particular Pseudomonas aeruginosa), y otras bacterias de tipo Proteus mirabilis, las especies del genero Staphylococcus (en particular Staphylococcus aureus), las especies del genero Saprophyticus, y las especies del genero Klebsiella. En una forma de realizacion, el extracto segun la invencion o el extracto susceptible de ser obtenido por el procedimiento segun la invencion se puede utilizar para la prevencion o el tratamiento de las infecciones urinarias por Escherichia coli. En otra forma de realizacion, el extracto segun la invencion o el extracto susceptible de ser obtenido por el procedimiento segun la invencion se puede utilizar para la prevencion o el tratamiento de las infecciones urinarias por Pseudomonas aeruginasa.
En otra forma de realizacion mas, el extracto segun la invencion o el extracto susceptible de ser obtenido por el procedimiento segun la invencion se puede utilizar para la prevencion o el tratamiento de las infecciones urinarias por unos hongos, y en particular por las especies del genero Candida, particularmente Candida albicans.
El extracto segun la invencion o el extracto susceptible de ser obtenido por el procedimiento segun la invencion son particularmente utiles en la prevencion de las recidivas urinarias, en pacientes que padecen infecciones urinarias recurrentes mas o menos frecuentes.
El extracto segun la invencion o el extracto susceptible de ser obtenido por el procedimiento segun la invencion puede ser administrado en particular a pacientes en periodo de curacion de una infeccion urinaria, a fin de disminuir la probabilidad de recidiva. El extracto se administra entonces en cantidades eficaces durante de algunos dfas (por ejemplo 3, 4, 5, 6 o 7 dfas) a varias semanas (por ejemplo 2, 3, 4, 5 o 8 semanas).
Por “cantidad eficaz” se entiende una cantidad que permite obtener un efecto de tratamiento o preventivo (tal como se ha definido anteriormente) en el sujeto de interes. Una cantidad eficaz de extracto seco segun la invencion puede estar comprendida en particular entre 100 y 1.000 mg/kg/dfa, ventajosamente entre 150 y 450 mg/kg/dfa.
Descripcion de las figuras
Figura 1: perfiles cromatograficos en UPLC en fase inversa a 280 nm de las fracciones Ib obtenidas con o sin tratamiento por enzima previo (Pectinex Ultra SP-L; Cellualse 13L; Tannase 795P; Endozym B-split) al 0,05% de la materia seca utilizada en el molido de arandano.
Figura 2: Perfiles cromatograficos en UPLC en fase inversa a 280 nm de las fracciones II obtenidas con o sin tratamiento por enzima previo (Pectinex Ultra SP-L; Cellulase 13L; Tannase 795P; B-split) al 0,05% de la materia seca utilizada en el molido de arandano.
Figura 3. Efectos bactericidas de diferentes extractos sobre Escherichia coli (ATCC 8739): crecimiento de las bacterias Escherichia coli (ATCC 8739) en un medio de cultivo en ausencia de extracto (control sin extracto), en presencia de la fraccion Ib a 5 g/l, de la fraccion (Ic+II) a 5 g/l, o de la mezcla de la fraccion Ib y de la fraccion (Ic+II) a 5g/l total (es decir 2,5 g/l de fraccion Ib y 2,5 g/l de fraccion (Ic+II), extracto combinado), para un recuento sin filtracion (A) o despues de la filtracion de los agregados (B). Se indican tambien los resultados que corresponden a la media de los resultados obtenidos con cada una de las fracciones Ib, por un lado, y (Ic+II) por otro lado.
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Figura 4. Efectos bactericidas de diferentes extractos sobre Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027): (A) Crecimiento de las bacterias Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) en un medio de cultivo en ausencia de extracto (control sin extracto), en presencia de la fraccion Ib a 0,5 g/l, de la fraccion (Ic+II) a 0,5 g/l, o de la
mezcla de la fraccion Ib y de la fraccion (Ic+II) a 0,5 g/l total (es decir 0,25 g/l de fraccion Ib y 0,25 g/l de fraccion
(Ic+II), extracto combinado), para un recuento sin filtracion. Se indican tambien los resultados que corresponden a la media de los resultados obtenidos con cada una de las fracciones Ib, por un lado, y (Ic+II) por otro lado. (B) Crecimiento de las bacterias Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027) en un medio de cultivo en ausencia de extracto (Control sin extracto), en presencia de la fraccion Ib a 0,1 g/l, de la fraccion (Ic+II) a 0,1 g/l, o de la
mezcla de la fraccion Ib y de la fraccion (Ic+II) a 0,1 g/l total (es decir 0,05 g/l de fraccion Ib y 0,05 g/l de fraccion
(Ic+II), Extracto combinado), para un recuento despues de la filtracion de los agregados. Se indican tambien los resultados que corresponden a la media de los resultados obtenidos con cada una de las fracciones Ib, por un lado, y (Ic+II) por otro lado.
Figura 5. Efectos bactericidas de diferentes extractos sobre Staphylococcus aureus (ATCC 6538): crecimiento de las bacterias Staphylococcus aureus (ATCC 6538) en un medio de cultivo en ausencia de extracto (Control sin extracto), en presencia de la fraccion Ib a 0,1 g/l, de la fraccion (Ic+II) a 0,1 g/l, o de la mezcla de la fraccion Ib y de la fraccion (Ic+II) a 0,1 g/l total (es decir 0,05 g/l de fraccion Ib y 0,05 g/l de fraccion (Ic+II), Extracto combinado), para un recuento sin filtracion (A) o despues de la filtracion de los agregados (B). Se indican tambien los resultados que corresponden a la media de los resultados obtenidos con cada una de las fracciones Ib, por un lado, y (Ic+II).
Figura 6. Efectos fungicidas de diferentes extractos sobre Candida albicans (ATCC 10231): crecimiento de los hongos Candida albicans (ATCC 10231) en un medio de cultivo en ausencia de extracto (Control sin extracto), en presencia de la fraccion Ib a 0,5 g/l, de la fraccion (Ic+II) a 0,5 g/l, o de la mezcla de la fraccion Ib y de la fraccion (Ic+II) a 0,5 g/l total (es decir 0,25 g/l de fraccion Ib y 0,25 g/l de fraccion (Ic+II), Extracto combinado), para un recuento sin filtracion (A) o despues de la filtracion de los agregados (B). Se indican tambien los resultados que corresponden a la media de los resultados obtenidos con cada una de las fracciones Ib, por un lado, y (Ic+II) por otro lado.
Ejemplos
Ejemplo 1. Preparacion de un extracto desesterificado de arandano segun la invencion,
Se han molido 5 kg de arandano IQF con la ayuda de un molino de martillo y se han diluido por 2 los 400 g de materia seca de molido asf obtenido. La masa de molido se dividio por dos y se trato directamente o bien se sometio a un tratamiento enzimatico en agua que procede de una mezcla de enzimas que comprende:
o 0,05 g de Pectinex Ultra-SP L,
o 0,05 g de tanasa 795P,
o 0,05 g de celulasa 13L, y
o 0,05 g de Endozym B-Split.
La mezcla se llevo a 40°C durante 4h, bajo agitacion.
Los molidos se prensaron despues y los 2 jugos obtenidos se clarificaron por los sobrenadantes se almacenaron en frfo. Los residuos de centrifugacion arandano obtenidos paralelamente.
Los hollejos se extrajeron despues con una mezcla hidroalcoholica al 75% de 1, la disolucion hidroetanolica asf obtenida se filtro sobre un filtro PTFE de 0,2 pm de porosidad, despues se concentro bajo vacfo a temperatura moderada (50°C) a fin de obtener una suspension concentrada que se seco por liofilizacion.
Las fracciones de jugo obtenidas se pasaron en una columna de adsorcion llena con 200 ml de resina Sepabeads SP411 (BV), a la velocidad de 600 ml/h; el resto del jugo se lava despues con 800 ml de agua y la columna se eluye finalmente con 400 ml de etanol. El eluido obtenido se concentra finalmente por evaporacion a vacfo (50°C) y se recoge en agua y se liofiliza para formar las fracciones Ia que han sufrido una hidrolisis enzimatica o no.
Los extractos acuosos parcialmente decolorados (fraccion Ib) se pasaron despues en una resina intercambiadora de aniones llena de 200 ml de resina FPA51 previamente puesta en su forma de cloruro con 400 ml de acido clorhfdrico al 0,1% y aclarada con agua. Las fracciones Ib se pasaron en la resina a 600 ml/h y se lavaron con 400 ml de agua. Los acidos organicos retenidos se eluyeron con 400 ml de acido clorhfdrico al 0,05%, y despues se concentraron a
centrifugacion (3.000 rpm, 10 min.) y se anadieron a los dos hollejos de
etanol v/v para una relacion de 3 por
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vacfo formando la fraccion Ic.
Ejemplo 2. Caracterizacion del extracto segun la invencion
Se ha caracterizado el extracto producto en el ejemplo 1.
Los perfiles cromatograficos en UPLC en fase inversa a 280 nm de las fracciones Ib y II obtenidas con o sin tratamiento por enzima previa (Pectinex Ultra SP-L; Cellualse 13L; Tannase 795P; B-split) al 0,05% de la materia seca utilizada en el molido de arandano se presentan respectivamente en las figuras 1 y 2.
Estas figuras muestran claramente el efecto de la desesterificacion (tratamiento por al menos una esterasa) sobre la modificacion de composicion del extracto.
Los analisis de las diferentes fracciones de interes obtenidas se describen en la tabla 2 siguiente. Las fracciones fenolicas Ib y II pueden ser ventajosamente complementadas por los acidos organicos del eluato Ic.
Tabla 2. Caracterizacion de las fracciones desesterificadas obtenidas con utilizaciones de
esterasas durante la extraccion
en g/100g
Fraccion Ib Fraccion le Fraccion II
Acidos organicos
Ac. malico
0,11% 11,88% 1,93%
Ac. qufnico
0,25% 33,26% 3,17%
Ac. cftrico
0,18% 14,21% 3,12%
Acidos fenolicos
Ac. galicos
0,07% 0,59% 0,33%
Ac. protocatequico
0,06% 0,43% 0,05%
Ac. benzoico
0,37% 1,48% 0,48%
Acido cinamico
Ac. p-cumarico
0,31% 2,48% 1,40%
Ac. cafeico
0,07% 0,49% 0,06%
Acido ferulico
0,05% 0,20% 0,07%
Antocianos
Eq cianidol
1,03% nd 0,25%
Flavonoles
Eq quercetina
3,24% nd 1,70%
Proantocianidoles
DMAC
16,10% nd 5,70%
Farmacopea europea
88,6% nd 35,50%
Entre las fracciones obtenidas, las fracciones Ib y II se pueden montar con el concentrado lfquido Ic que contiene lo esencial de los acidos organicos del arandano, permitiendo asf formular unos extractos secos especfficos que contienen al mismo tiempo unos polifenoles y unos acidos polares.
Ejemplo 3. Formulaciones que comprenden el extracto segun la invencion
Se pueden considerar diferentes tipos de comprimidos que contienen los extractos desarrollados, siendo el objetivo general de este proceso al mismo tiempo aumentar el potencial bactericida y bacteriestatico de los diferentes componentes activos del arandano directamente en forma de acidos fenolicos y de procianidoles aglomerantes a nivel del colon, o en forma de acidos fenolicos una vez absorbidos en la circulacion general y excretados en la orina.
Es importante recordar que, a nivel del colon, la conservacion del poder curtiente de los proantocianidoles de tipo B y A, implica que las funciones ortodifenolicas que comprenden no se hayan oxidado previamente y/o movilizado por las protefnas y aminoacidos del bolo alimenticio.
Tfpicamente, para limitar estas interacciones durante el transito, se pueden considerar varias soluciones:
- limitar la aportacion proteica, en el momento de la cura y durante la toma de los activos de arandano, podra asf ser favorable para la eficacia de los extractos de arandano desarrollados.
- favorecer unas formas galenicas de liberacion enteral prolongada.
- complementar la formula del complemento alimenticio por un reductor capaz de ralentizar la oxidacion de los polifenoles, tfpicamente el acido ascorbico puede desempenar este papel. Ademas, su poder reductor puede
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contribuir directa o indirectamente a la reduccion colonica del acido qufnico en acido benzoico.
Se pueden desarrollar las composiciones de comprimidos clasicas, favoreciendo una liberacion enteral prolongada a fin de limitar las interacciones. En consecuencia, las composiciones galenicas retenidas seran importantes para dirigir la flora uropatologica sensible al efecto de los compuestos fenolicos de arandano, al mismo tiempo:
- los acidos fenolicos directamente presentes en el extracto empleado,
- el acido qufnico precursor de acido benzoico producido por reduccion por la flora intestinal,
- los flavonoles y antocianos, asf como los flavonoles monomeros y proantocianidoles oligomeros que comprenden unas uniones de tipo B y de tipo A fermentables por la flora intestinal, precursores de acidos fenolicos.
- el efecto bacterioestatico, aglomerante de los taninos proantocianidoles de arandano poco fermentables polfmeros, es decir los proantocianidoles de mas alto peso molecular que comprenden preferiblemente varios enlaces de tipo A.
El comprimido se traga, se disuelve y debe ser, por lo tanto, absorbido en todo el tracto gastrointestinal. Se pueden utilizar una gran variedad de soportes, incluyendo la lactosa, el fosfato de calcio, el almidon, la celulosa microcristalina, unas celulosas modificadas como, por ejemplo, la hidroxipropilmetilcelulosa y la hidroxietilcelulosa. Tambien se pueden considerar unas formulas con unos agentes de recubrimientos tales como el azucar, el barniz o la cera para ocultar el sabor, a fin de aumentar la resistencia del comprimido durante el paso del estomago. Estos revestimientos hacen al comprimido resistente a los acidos del estomago y tales que se desintegran solo en el duodeno, el yeyuno y en el colon tras la accion de las enzimas y/o del pH alcalino.
Los comprimidos diana que utilizan los extractos de arandano desarrollan una preparacion de comprimido que contienen generalmente:
- del 5 al 25% del extracto de arandano (sustancia activa),
- del 0 al 10% de agente reductor, tfpicamente acido ascorbico,
- del 70 al 85% de cargas matriciales que permiten la cohesion y la compresion, tfpicamente unos polfmeros de base celulosica,
- del 0 al 15% de los compuestos que aseguran la desintegracion facil, la desintegracion y la disolucion del comprimido a partir del estomago o del intestino,
- del 0 al 10% de agentes lubricantes, de agentes de deslizamiento, unas ceras y agentes de recubrimiento, y de aglutinantes complementarios.
- el tiempo de desintegracion puede ser modificado para obtener un efecto rapido o para la liberacion prolongada.
Como se describe a continuacion, las diferentes fracciones, en sinergia con la farmacocinetica de liberacion enteral de los comprimidos, permiten controlar la utilizacion del conjunto de los activos del arandano.
Tabla 3: Ejemplos de composicion de comprimidos de 500 mg de liberacion enteral prolongada especialmente formuladas en el ambito del tratamiento curativo, de un tratamiento sinergico completo, de un tratamiento preventivo, y que permite una transferencia metabolica permanente de los activos de arandano.
En el ambito de una cura de 15 dfas (2 x 500 mg / dfa)
Tratamiento curativo Tratamiento sinergico completo Tratamiento preventivo
Velocidad de disolucion
Disolucion rapida Disolucion media Disolucion lenta
Mezcla
Tipo Precursores metabolizables Precursores metabolizables y taninos Esencialmente taninos Poco metabolizado
mg % mg % mg %
Extracto de arandano
Fraccion I 100 20% 60 12% 20 4%
En el ambito de una cura de 15 dfas
Tratamiento Tratamiento sinergico Tratamiento
(2 x 500 mg / dfa)
curativo completo preventivo
Velocidad de disolucion
Disolucion rapida Disolucion media Disolucion lenta
Precursores metabolizables Precursores Esencialmente
Mezcla
Tipo metabolizables y taninos taninos Poco metabolizado
mg % mg % mg %
Extracto de arandano
Fraccion II 20 4% 60 12% 100 20%
Acido ascorbico
40 8% 40 8% 40 8%
Hidroxipropil- metilcelulosa
Metolosas 90SH 4000SR 50 10% 70 14% 90 18%
Diluyente
Microcel 2175 44% 217,5 44% 217,5 44%
Lactosa 55 11% 35 7% 15 3%
Talco
10 2% 10 2% 10 2%
Sflice coloidal
Aerosil 2,5 0,50% 2,5 0,50% 2,5 0,50%
Estearato de Mg
5 1% 5 1% 5 1%
Total
500 100% 500 100% 500 100%
Como se describe en la tabla 3 anterior, las vfas de extraccion y las diferentes fuentes de polifenoles de arandano (fruto, jugo, hollejo) expuestas anteriormente permiten diferenciar varias composiciones que comprenden las actividades bacterioestaticas y bactericidas de interes en el ambito:
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- de un tratamiento de tipo cura rapida, mas particularmente bactericida,
- de un tratamiento sinergico bacterioestatico y bactericida,
10 - de un tratamiento “antirrecidiva” o denominado de “prevencion” esencialmente bacterioestatico.
Es conocido que el riesgo de aparicion de infecciones urinarias es favorecido por un bajo consumo de agua. Favorecer un consumo de agua mas elevado en el ambito de un tratamiento (al menos 2l por dfa) con los extractos de la invencion, permite formular o bien unas soluciones bucodispersables o unas bebidas diluidas particularmente, 15 o bien adecuadas para el tratamiento considerado. Los extractos simples y/o sus mezclas sinergicas descritos anteriormente se mezclan, en primer lugar, con unas fibras, es decir unos coloides resistentes a la hidrolisis digestiva superior (pH acido estomacal, enzimas del intestino delgado), que permite favorecer la liberacion de los taninos de arandano a nivel del colon.
20 Tabla 4: ejemplo de composicion de bebida diluida y su forma de reconstitucion denominada “bebida instantanea”
Composicion de bebida instantatanea % en g/100g
bebida que se va a reconstituir diluida en g/l
Extracto de arandano
1,6% 0,25
Almidon resistente pregelificado
15,6% 2,5
Maltodextrina
6,2% 1
Goma xantana
0,9% 0,15
Acido cftrico
12,5% 2
Sacarosa
62,3% 10
acesulfame K; sacarosa
0,05% 0,01
Cloruro de sodio
0,6% 0,1
Total
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Ejemplo 4. Efectos antimicrobianos del extracto segun la invencion
Se han ensayado los efectos antimicrobianos del extracto segun la invencion, y se han comparado con los de extractos mas simples, que comprenden:
- fraccion Ib tal como se obtiene en el ejemplo 1 y caracterizada en el ejemplo 2: fraccion que comprende principalmente unos proantocianidoles (PAC) de un grado de polimerizacion medio de aproximadamente 4, asf como unos antocianos. Esta fraccion contiene solo muy pocos acidos organicos (vease la tabla 2 anterior). El efecto antibacteriano de esta fraccion puede estar relacionado con las PAC y/o con los antocianos.
- fracciones Ic y II (Ic+II tales como se obtienen en el ejemplo 1 y caracterizadas en el ejemplo 2: mezcla que comprende una pequena proporcion de PAC de un grado de polimerizacion medio de aproximadamente 8, asf como una fuerte proporcion de acidos organicos (vease la tabla 2 anterior). El efecto antibacteriano de esta mezcla esta principalmente relacionado con los acidos organicos presentes (y en particular con los acidos fenolicos mas apolares), y eventualmente de manera parcial con las PAC.
En particular, la capacidad de las fracciones Ib, (Ic+II), de una mezcla de 50/50 en peso de fracciones Ib y (Ic+II), para inhibir la proliferacion de diferentes microorganismos, se ha medido a fin de poner en evidencia una eventual sinergia entre los dos tipos de extractos, siendo uno mas bien dirigido hacia los acidos organicos, el otro mas bien hacia las PAC y los antocianos.
Se han seleccionado cinco microorganismos:
- Tres especies de bacterias conocidas por estar implicadas en las infecciones del tracto urinario:
° Escherichia coli (ATCC 8739): esta bacteria gram-negativa responsable de una proporcion importante de las infecciones del tracto urinario (Orenstein et al., 1999, Shigemura et al., 2005) y es por lo tanto esencial que el extracto segun la invencion tenga una accion inhibidora sobre esta bacteria.
° Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027): esta bacteria gram-negativa es responsable de una proporcion mas o menos importante (segun el origen de la infeccion y el origen geografico del paciente) de las infecciones del tracto urinario (Orenstein et al., 1999, Shigemura et al., 2005), en particular unas infecciones complicadas. En efecto, conduce frecuentemente a unas infecciones persistentes, cronicas, resistentes a los antibioticos y finalmente recidivantes. Por lo tanto, serfa tambien util que el extracto segun la invencion tenga una accion inhibidora sobre esta bacteria.
° Staphylococcus aureus (ATCC 6538): esta bacteria gram-positiva se encuentra tambien en ciertas infecciones del tracto urinario (Shigemura et al., 2005). Ademas, ciertas cepas son resistentes a los antibioticos clasicos, y serfa por lo tanto tambien util que el extracto segun la invencion tenga una accion inhibidora sobre esta bacteria.
- Dos cepas de hongos:
° Candida albicans (ATCC 10231): este hongo es responsable de un cierto numero de infecciones del tracto urinario, en particular en los pacientes de riesgo, debido a su avanzada edad, a enfermedades cronicas como la diabetes, o a tratamientos prolongados por unos tratamientos inmunosupresores o anticancerfgenos (Krcmery et al., 1999).
° Aspergillus brasiliensis (ATCC 16404): este hongo no es particularmente conocido por estar asociado a unas infecciones del tracto urinario, pero constituye un modelo de estudio para cuantificar unos efectos sobre los mohos.
Las cepas seleccionadas corresponden ademas a unas cepas recomendadas en los metodos reglamentarios actuales para los ensayos de la eficacia de conservacion, y de contaminacion de los alimentos o de producto de higiene.
Los microorganismos se han inoculado en un medio de cultivo adecuado y cultivados en placas de 96 pocillos. Se ha efectuado un recuento de los microorganismos en los dfas 1, 3, 7, 14 y 21 con un ensayo de trifeniltetrazolio (TTC) para las tres cepas bacterianas y para Candida albicans. Este ensayo se basa en la transformacion del TCC blanco en trifenilformazan (TPF) rojo por las celulas vivas en multiplicacion. La deteccion del TPF permite entonces estimar el numero de microorganismos presentes en el medio. Para Aspergillus brasiliensis, se efectua un recuento sobre caja convencional.
El recuento de los microorganismos se realiza o bien directamente sobre el cultivo, o bien despues de la filtracion del cultivo para eliminar los agregados. En efecto, las PAC son conocidas por agregar las bacterias formando unas
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acumulaciones en cultivo, limitando asf la formacion de biopelfculas o la interaccion de las bacterias con las mucosas infectadas. La identificacion de la presencia de tales agregados es por lo tanto importante, y los resultados obtenidos despues de la filtracion son los mas representativos de los efectos globales de los extractos ensayados.
Los resultados obtenidos se presentan en las figuras 3 a 6, para cuatro microorganismos ensayados.
Escherichia coli
Las figuras 3A y 3B muestran respectivamente el crecimiento de las bacterias en un medio de cultivo en ausencia de extracto, en presencia de la fraccion Ib a 5 g/l, de la fraccion (Ic+II) a 5 g/l, o de la mezcla de la fraccion Ib y de la fraccion (Ic+II) a 5g/l total (es decir 2,5 g/l de fraccion Ib y 2,5 g/l de fraccion (Ic+II)). Se indican tambien los resultados que corresponden a la media de los resultados obtenidos con cada una de las fracciones Ib, por un lado, y (Ic+II) por otro lado. Los resultados se presentan para una medicion sin filtracion (figura 3A) o con filtracion de los agregados (figura 3B).
En ausencia de filtracion, la fraccion Ib es mas eficaz que la fraccion (Ic+II) para inhibir el crecimiento de E. Coli in vitro. El extracto combinado (mezcla de las fracciones Ib y (Ic+II)) es casi tan eficaz como la fraccion Ib sola, a pesar de que contiene solo la mitad de la concentracion en fraccion Ib con respecto a la fraccion Ib sola. Sin embargo, los resultados obtenidos con el extracto combinado son mucho mejores que la media de los resultados obtenidos con cada una de las fracciones Ib y (Ic+II) separadamente. Estos resultados sugieren un efecto de sinergia.
Cuando se realiza el recuento despues de la filtracion de los agregados, la fraccion Ib es otra vez mas eficaz que la fraccion (Ic+II) para inhibir el crecimiento de E. Coli in vitro. El extracto combinado (mezcla de las fracciones Ib y (Ic+II)) es tan eficaz como la fraccion Ib sola, a pesar de que contiene solo la mitad de la concentracion en fraccion Ib con respecto a la fraccion Ib sola. Ademas, los resultados obtenidos con el extracto combinado son mucho mejores que la media de los resultados obtenidos con cada una de las fracciones Ib y (Ic+II) separadamente. Estos resultados sugieren otra vez un efecto de sinergia entre las dos fracciones sometidas a ensayo (Ib/Ic+II).
Pseudomonas aeruginosa
La figura 4A muestra el crecimiento de las bacterias en un medio de cultivo en ausencia de extracto, en presencia de la fraccion Ib a 0,5 g/l, de la fraccion (Ic+II) a 0,5 g/l, o de la mezcla de la fraccion Ib y de la fraccion (Ic+II) a 0,5g/l total (es decir 0,25 g/l de fraccion Ib y 0,25 g/l de fraccion (Ic+II)), siendo el recuento realizado sin filtracion de los agregados susceptibles de estar presentes en el cultivo.
La fraccion Ib es ligeramente mas eficaz que la fraccion (Ic+II) para inhibir el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa in vitro. El extracto combinado (mezcla de las fracciones Ib y (Ic+II)) es tan eficaz como la fraccion Ib sola, a pesar de que contiene solo la mitad de la concentracion en fraccion Ib con respecto a la fraccion Ib sola. Ademas, los resultados obtenidos con el extracto combinado son mejores que la media de los resultados obtenidos con cada una de las fracciones Ib y (Ic+II) separadamente. Estos resultados sugieren un efecto de sinergia.
La figura 4B representa el crecimiento de las bacterias en un medio de cultivo en ausencia de extracto, en presencia de la fraccion Ib a 0,1 g/l, de la fraccion (Ic+II) a 0,1 g/l, o de la mezcla de la fraccion Ib y de la fraccion (Ic+II) a 0,1 g/l total (es decir 0,05 g/l de fraccion Ib y 0,05 g/l de fraccion (Ic+II)), siendo el recuento realizado despues de la filtracion de los agregados susceptibles de estar presentes en el cultivo.
La fraccion (Ic+II) es, esta vez, mas eficaz que la fraccion Ib para inhibir el crecimiento de Pseudomonas aeruginosa in vitro. El extracto combinado (mezcla de las fracciones Ib y (Ic+II)) es mas eficaz que cada una de las fracciones Ib o (Ic+II) sola, a pesar de que contiene solo la mitad de la concentracion en fraccion Ib con respecto a la fraccion Ib sola, ya que actua mas rapidamente que cada una de las fracciones Ib o (Ic+II) sola. Estos resultados muestran claramente la existencia de un efecto de sinergia entre las dos fracciones ensayadas (Ib/Ic+II).
Staphylococcus aureus
Las figuras 5A y 5B representan respectivamente el crecimiento de las bacterias en un medio de cultivo en ausencia de extracto, en presencia de la fraccion Ib a 5 g/l, de la fraccion (Ic+II) a 5 g/l, o de la mezcla de la fraccion Ib y de la fraccion (Ic+II) a 5g/l total (es decir 2,5 g/l de fraccion Ib y 2,5 g/l de fraccion (Ic+II)). Se indican tambien los resultados que corresponden a la media de los resultados obtenidos con cada una de las fracciones Ib, por un lado, y (Ic+II) por otro lado. Los resultados se presentan para una medicion sin filtracion (figura 5A) o con filtracion de los agregados (figura 5B).
En los dos casos, cada uno de los extractos separadamente y el extracto combinado son extremadamente eficaces para inhibir el crecimiento de Staphylococcus aureus in vitro, hasta tal punto que las condiciones ensayadas no permiten poner en evidencia una sinergia entre los dos extractos, siendo cada uno de los extractos ya eficaz al maximo. Sin embargo, no se puede excluir la presencia de una sinergia, que podra quizas ser demostrada utilizando unas concentraciones mas bajas de extractos. Los efectos de las combinaciones de las fracciones fenolicas son
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claramente dependientes de la cepa y la Staphylococcus aureus, cepa Gram positiva, comprende una pared particularmente sensible a los efectos de las fracciones ensayadas en el presente contexto.
Candida albicans
Las figuras 6A y 6B representan respectivamente el crecimiento de los hongos en un medio de cultivo en ausencia de extracto, en presencia de la fraccion Ib a 0,5 g/l, de la fraccion (Ic+II) a 0,5 g/l, o de la mezcla de la fraccion Ib y de la fraccion (Ic+II) a 0,5g/l total (es decir 0,25 g/l de fraccion Ib y 0,25 g/l de fraccion (Ic+II)). Se indican tambien los resultados que corresponden a la media de los resultados obtenidos con cada una de las fracciones Ib, por un lado, y (Ic+II) por otro lado. Los resultados se presentan para una medicion sin filtracion (figura 6A) o con filtracion de los agregados (figura 6B).
En ausencia de filtracion, la fraccion Ib es claramente mas eficaz que la fraccion (Ic+II) para inhibir el crecimiento de Candida albicans in vitro. El extracto combinado (mezcla de las fracciones Ib y (Ic+II)) posee una actividad inhibidora intermedia, no obstante mejor que la media de los resultados obtenidos con cada una de las fracciones Ib y (Ic+II) separadamente.
Cuando se realiza el recuento despues de la filtracion de los agregados, la fraccion Ib es otra vez mas eficaz que la fraccion (Ic+II) para inhibir el crecimiento de Candida albicans in vitro. El extracto combinado (mezcla de las fracciones Ib y (Ic+II)) es mas eficaz que cada una de las fracciones Ib o (Ic+II) sola, a pesar de que contiene solo la mitad de la concentracion en fraccion Ib con respecto a la fraccion Ib sola, ya que actua mas rapidamente que cada una de las fracciones Ib o (Ic+II) sola. Estos resultados muestran claramente la existencia de un efecto de sinergia entre las dos fracciones sometidas a ensayo (Ib/Ic+II).
Aspergillus brasiliensis
No se ha observado ninguna inhibicion significativa para ninguno de los extractos sometidos a ensayo.
Conclusion
Los resultados presentados anteriormente muestran claramente que el extracto segun la invencion, que combina las fracciones Ib, Ic y II, posee una actividad antimicrobiana sobre tres bacterias y un hongo conocidos por ser responsables de infecciones del tracto urinario.
Ademas, al menos en ciertas condiciones, se ha podido poner en evidencia un efecto de sinergia entre la fraccion Ib rica en PAC de un grado de polimerizacion medio de aproximadamente 4 y que comprende tambien unos antocianos, por un lado, y la fraccion Ic+Ii rica en acidos organicos y que comprende tambien una proporcion de PAC de un grado de polimerizacion medio de aproximadamente 8, por otro lado, demostrando asf todo el interes del extracto segun la invencion, que combina los diferentes productos activos del arandano en forma concentrada, para mejorar el tratamiento o la prevencion de las infecciones del tracto urinario.
Conviene senalar que la sinergia entre los diferentes componentes activos del extracto segun la invencion podrfa ser aun mas pronunciada in vivo.
En efecto, in vivo, el efecto de los acidos organicos, y en particular de los acidos fenolicos mas apolares como el acido benzoico, esta potencialmente limitado en la orina debido a su conjugacion con glicina para formar acido hipurico cuando estan en la circulacion entero-hepatica, antes de su excrecion en la orina.
Ahora bien, el extracto segun la invencion comprende, ademas de los acidos fenolicos, diferentes precursores de estos acidos, y en particular del acido benzoico. Es el caso del acido qufnico, que puede ser transformado en acido benzoico por aromatizacion reductora. Es tambien el caso de los oligomeros de PAC, que no pasan la barrera intestinal, pero son fermentados por la flora intestinal y escindidos para formar unos acidos fenolicos de cadenas cortas. Asf, ademas de sus efectos de agregacion de los microorganismos en el tracto digestivo, las PAC son tambien utiles como precursores de acidos fenolicos. Ademas, el grado de polimerizacion de las PAC tiene una influencia importante sobre su fermentabilidad por la flora intestinal, como se ha podido demostrar para las PAC de tipo B de la manzana (Bazzocco et al., 2008). Las PAC oligomericas son mas propensas a producir unos acidos fenolicos, mientras que los polfmeros superiores, menos fermentables, pueden inhibir la flora por agregacion. Este efecto es tambien responsable de la reduccion de las poblaciones de floras en los experimentos despues de la filtracion en comparacion con la reduccion sin filtracion. En el caso de Pseudomonas aeruginosa sin filtracion a 0,5 g/l, el efecto de la fraccion (Ic+II) sola es mas baja que la fraccion Ib sola (figura 4A). En comparacion, el efecto para las mismas fracciones a 0,1 g/l despues de la filtracion se invierte. Despues de la filtracion, la fraccion (Ic+II) sola es mas eficaz, a pesar de que comprende menos PAC que la fraccion Ib, pero mas polimerizados, formando asf eficazmente unos agregados. Estos efectos son particularmente adecuados para la formulacion de curas, de tratamientos de ataques o de tratamiento de fondo antirecidivo, modificando las proporciones de las diferentes fracciones tales como se describen en la tabla 3.
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Finalmente, es tambien el caso de los antocianos y/o antocianidoles, que son como, los oligomeros de PAC, fermentados por la flora intestinal y escindidos para formar unos acidos fenolicos de cadenas cortas en el colon, incluyendo los acidos benzoicos.
La combinacion en el extracto segun la invencion de la presencia de acidos fenolicos y de diversos precursores que conducen mas o menos rapidamente a nuevos acidos fenolicos, tiene como ventaja conducir a una mayor concentracion de acidos fenolicos, sostenida en el tiempo, que permite asf potencialmente saturar el sistema de conjugacion de los acidos fenolicos, con la glicina para formar el acido hipurico, unos acidos fenolicos no conjugados, mas activos, que pueden asf alcanzar la orina, lo que tiene poca posibilidad de producirse cuando estan presentes solamente unos acidos fenolicos.
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WO 2010/121203;
WO 96/30033

Claims (15)

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    REIVINDICACIONES
    1. Extracto de arandano, ventajosamente desesterificado, que comprende:
    • 5 a 20% en peso, ventajosamente 10 a 15% en peso, de proantocianidoles (PAC) con respecto al peso total del extracto seco (medido mediante el metodo de BL-DMAC),
    • 2 a 12% en peso, ventajosamente 3 a 10% en peso, ventajosamente de manera estricta mas de 5% y menos de 10% en peso de acidos organicos con respecto al peso total del extracto seco, incluyendo:
    o 1 a 10% en peso, ventajosamente 1 a 5% en peso, ventajosamente 1 a 3% en peso de acido qufnico con respecto al peso total del extracto seco,
    o 0,5 a 8% en peso, ventajosamente 1 a 4% en peso, de acidos fenolicos con respecto al peso total del extracto seco,
    • por lo menos 0,5% en peso, ventajosamente por lo menos 1% en peso, de antocianos y/o de anticianidoles con respecto al peso total del extracto seco,
    • 1 a 10% en peso de azucares con respecto al peso total del extracto seco,
    • 1 a 10% en peso, ventajosamente 2 a 5% en peso, de flavonoles, en forma glicosilada /o aglicona.
  2. 2. Extracto segun la reivindicacion 1, caracterizado por que los polfmeros de PAC que presentan un grado de polimerizacion superior o igual a 4, representan por lo menos 30% en peso con respecto al peso de todas los PAC presentes en el extracto.
  3. 3. Procedimiento de preparacion de un extracto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2, que comprende las etapas siguientes:
    a) enriquecer una fraccion hidrosoluble de arandano en compuestos polifenolicos apolares por un lado, y en acidos organicos, por otro lado, para obtener una fraccion I,
    b) enriquecer una fraccion no-hidrosoluble de arandano en polfmeros de PAC para obtener una fraccion II,
    c) montar las fracciones I y II obtenidas en las etapas a) y b) respectivamente, en las proporciones que corresponden a una razon en peso (fraccion I/fraccion II) comprendida entre 30/70 y 70/30, y
    d) digerir enzimaticamente mediante por lo menos una esterasa.
  4. 4. Procedimiento segun la reivindicacion 3, caracterizado por que:
    • la fraccion hidrosoluble utilizada en la etapa a) es un zumo de arandano, eventualmente concentrado, y la fraccion no hidrosoluble utilizada en la etapa b) es un hollejo de arandano, o
    • la fraccion hidrosoluble utilizada en la etapa a) y la fraccion no hidrosoluble utilizada en la etapa b) se han obtenido a partir de bayas de arandano enteras, por:
    i) molienda de bayas de arandano enteras, y
    ii) decantacion y separacion de las fracciones hidrosoluble y no hidrosoluble.
  5. 5. Procedimiento segun la reivindicacion 3 o 4, caracterizado por que la fraccion I se obtiene en la etapa a) mediante las etapas siguientes:
    a1) separar entre los compuestos apolares y los compuestos polares por:
    • adsorcion de la fraccion hidrosoluble sobre un soporte apolar,
    • lavado con un disolvente polar y recogida de la fraccion polar Ia, y
    • elucion y recogida de la fraccion apolar Ib;
    a2) separar entre los acidos organicos y los azucares presentes en la fraccion polar Ia por:
    • adsorcion de la fraccion Ia sobre una resina intercambiadora de iones,
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    • lavado con un disolvente acuoso,
    • elucion con un disolvente acido y recogida de la fraccion Ic que comprende los acidos organicos; a3) montar las fracciones Ib y Ic para formar la fraccion I.
  6. 6. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 3-5, caracterizado por que la fraccion II se obtiene en la etapa b) mediante un tratamiento que comprende una etapa de extraccion de los polfmeros de PAC de la fraccion no hidrosoluble por un disolvente organico, preferentemente seguida de etapas de clarificacion, destilacion y concentracion de la disolucion enriquecida asf obtenida.
  7. 7. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 3-6, caracterizado por que el montaje de la fraccion I obtenida en la etapa a) y de la fraccion II obtenida en la etapa b) se realiza por mezcla simple de las fracciones I y II, sin eliminacion de una parte de una de las fracciones.
  8. 8. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 3-7, caracterizado por que la etapa d) de digestion enzimatica mediante por lo menos una esterasa se realiza:
    • antes de la etapa a), durante la preparacion de las fracciones hidrosoluble y no hidrosoluble sobre el molido, preferentemente licuado, o bien sobre la fraccion hidrosoluble y la fraccion no hidrosoluble, preferentemente licuadas,
    • entre las etapas a) y b) y la etapa c) de montaje final, sobre las fracciones I y II, o
    • al final del procedimiento, sobre el extracto montado obtenido al termino de la etapa c).
  9. 9. Extracto susceptible de ser obtenido mediante el procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 3-8.
  10. 10. Extracto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 9, que es un extracto seco, y que se presenta ventajosamente en forma de polvo, de comprimido, de capsula, de granulos, o de concentrado lfquido.
  11. 11. Composicion alimenticia o nutraceutica, que comprende un extracto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 9-10.
  12. 12. Composicion farmaceutica, que comprende un extracto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 9-10.
  13. 13. Extracto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 9-10, para su utilizacion como medicamento.
  14. 14. Extracto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 9-10, para su utilizacion en la prevencion o el tratamiento de las infecciones urinarias, en particular por las bacterias uropatogenas, las bacterias gram positivas, y otras bacterias seleccionadas de entre Proteus mirabilis, las especies del genero Staphylococcus, las especies del genero Saprophyticus, y las especies del genero Klebsiella.
  15. 15. Extracto segun cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 9-10, para su utilizacion en la prevencion de las recidivas de infecciones urinarias.
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