ES2605433T3 - Fosforamidatos de espironucleósido oxetánico uracílico - Google Patents

Abstract

Un compuesto de la fórmula I:**Fórmula**

Description

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DESCRIPCION

Fosforamidatos de espironucleosido oxetanico uradlico.

Antecedentes de la invencion

Esta invencion se refiere a un fosforamidato de espironucleosido oxetanico uradlico util en el tratamiento de pacientes infectados con el virus de la hepatitis C (HCV, por sus siglas en ingles).

El HCV es un virus de ARN de sentido positivo, monocatenario, que pertenece a la familia Flaviviridae de los virus en el genero hepacivirus. La region NS5B del poligen de ARN codifica una ARN polimerasa dependiente de ARN (RdRp), que es esencial para la replicacion vmca. Despues de la infeccion aguda inicial, una mayona de los individuos infectados desarrolla hepatitis cronica debido a que el HCV se replica preferentemente en los hepatocitos pero no es directamente citopatica. En particular, la ausencia de una respuesta vigorosa de los linfocitos T y la alta propension del virus a mutar parecen fomentar una alta tasa de infeccion cronica. La hepatitis cronica puede progresar a fibrosis hepatica, conduciendo a cirrosis, enfermedad hepatica terminal y HCC (carcinoma hepatocelular), haciendola la causa principal de trasplantes de hugado. Hay seis genotipos de hCv principales y mas de 50 subtipos, que se distribuyen geograficamente de manera diferente. El genotipo 1 de HCV es el genotipo predominante en Europa y en los Estados Unidos. La extensa heterogeneidad genetica de HCV presenta importantes implicaciones de diagnostico y clmicas, que explica quiza las dificultades en el desarrollo de vacunas y la ausencia de respuesta al tratamiento actual.

La transmision de HCV puede tener lugar por contacto con sangre o productos sangumeos contaminados, por ejemplo despues de transfusion sangumea o uso de farmacos intravenosos. La introduccion de ensayos de diagnostico usados en cribado sangumeo ha conducido a una tendencia descendente en la frecuencia de HCV postransfusion. Sin embargo, dado el lento progreso a la enfermedad hepatica terminal, las infecciones existentes continuaran presentando una seria carga medica y economica durante decadas.

El tratamiento actual de HCV se basa en interferon-alfa (pegilado) (IFN-a) junto con ribavirina. Este tratamiento asociado proporciona una respuesta virologica sostenida en mas del 40% de los pacientes infectados por HCV de genotipo 1 y aproximadamente 80% de los infectados por los genotipos 2 y 3. Ademas de la eficacia limitada contra el genotipo 1 de HCV, este tratamiento asociado presenta efectos secundarios significativos y es deficientemente tolerado en muchos pacientes. Los principales efectos secundarios incluyen smtomas de tipo gripe, anormalidades hematologicas y smtomas neuropsiquiatricos. Por lo tanto, hay una necesidad de tratamientos mas eficaces, convenientes y mejor tolerados.

La experiencia con farmacos de VIH, en particular con inhibidores de la proteasa del VIH, ha explicado que la farmacocinetica suboptima y las pautas posologicas complejas dan como resultado rapidamente fracasos en la adhesion al tratamiento accidentales. Esto a su vez significa que la concentracion minima de 24 horas (concentracion minima en plasma) para los respectivos farmacos en un tratamiento de VIH con frecuencia cae por debajo del umbral de IC90 o ED90 durante partes prolongadas del dfa. Se considera que una concentracion minima de 24 horas de al menos el IC50, y de manera mas realista, el IC90 o ED90, es esencial para retardar el desarrollo de mutantes de escape del farmaco. Conseguir la farmacocinetica y el metabolismo del farmaco, necesarios, para permitir dichas concentraciones mmimas proporciona un reto riguroso para el diseno de farmacos.

La RdRp de NS5B es esencial para la replicacion del genoma de ARN de HCV, de sentido positivo, monocatenario. Esta enzima ha provocado un interes significativo entre los qmmicos farmaceuticos. Se conocen tanto los inhibidores de nucleosidos como de no nucleosidos de NS5B. Los inhibidores de los nucleosidos pueden actuar como terminador de cadena o como un inhibidor competitivo o como ambos. Para ser activos, se tienen que absorber los inhibidores de nucleosidos por la celula y convertirse in vivo en un trifosfato. Esta conversion en el trifosfato esta mediada comunmente por cinasas celulares, que imparte requerimientos estructurales adicionales sobre un inhibidor nucleosido de la polimerasa potencial. Ademas esto limita la evaluacion directa de los nucleosidos como inhibidores de la replicacion de HCV para ensayos basados en celulas capaces de fosforilacion in situ.

Se han realizado diversos intentos para desarrollar nucleosidos como inhibidores de RdRp de HCV, ninguno ha proseguido todo el camino hasta el registro. Entre los problemas que han encontrado los nucleosidos fijados como objetivo de HCV hasta la fecha son toxicidad, mutagenicidad, ausencia de selectividad, deficiente eficacia, deficiente biodisponibilidad, pautas posologicas suboptimas y consiguiente alta carga de medicamentos y coste de productos.

Hay una necesidad de inhibidores de HCV que puedan superar las desventajas del tratamiento de HCV actual tales como efectos secundarios, eficacia limitada, la aparicion de resistencia y fracasos en la adhesion al tratamiento, asf como mejorar la respuesta vmca sostenida.

La presente invencion se refiere a N-[(R)-{[(4R,5R,7R,8R)-5-(2,4-dioxo-3,4-di-hidropirimidin-1(2H)-il)-8-hidroxi-1,6- dioxaspiro[3.4]oct-7-il]metoxi}(fenoxi)-fosforil]-L-alaninato de butilo con propiedades antivmcas utiles. Se han descrito espironucleosidos oxetanicos, en particular 1-(2-O,2-C-etano-p-D-ribofuranosil)timina y 1-(2-O,2-C-etano-p-D- ribofuranosil)uracilo en Org. Biomol. Chem., 2.003, 3.514-3.526. Se ensayaron estos compuestos contra VIH, pero no se encontro actividad. La patente internacional WO 2007/095269, la patente internacional WO 2007/020193 y la

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patente internacional WO 2006/012078 describen todas compuestos anti-HCV que consisten en nucleosidos modificados ligados a un profarmaco de fosforamidato.

El compuesto de la invencion tambien puede ser atractivo debido al hecho de que carece de actividad frente a otros virus, en particular frente a VIH. Los pacientes infectados por VIH con frecuencia padecen co-infecciones tales como HCV. El tratamiento de dichos pacientes con un inhibidor de HCV que tambien inhibe VIH puede conducir a la aparicion de cepas de VIH resistentes.

Descripcion de la invencion

En un aspecto, la presente invencion proporciona N-[(R)-{[(4R,5R,7R,8R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidropirimidin-1(2H)-il)- 8-hidroxi-1,6-dioxaspiro[3.4]oct-7-il]metoxi}(fenoxi)fosforil]-L-alaninato de butilo y las sales farmaceuticamente aceptables y solvatos del mismo. Este compuesto se representa por la formula I:

imagen1

Siempre que se use en la presente memoria, el termino "compuesto de la formula I", "el compuesto presente", "compuesto de la presente invencion", significa que incluye el compuesto de la formula I asf como las sales y solvatos farmaceuticamente aceptables del mismo, a menos que se especifique de otro modo.

El nombre IUPAC en esta descripcion para el compuesto de la formula (I) ha sido generado por la version 12 del programa informatico NAME ACD/Labs comercial.

En un aspecto mas, la invencion se refiere al uso del compuesto de la formula I como una medicina, mas en particular, para inhibir HCV. Convenientemente, la presente invencion se refiere a un compuesto de la formula I para uso en el tratamiento o la profilaxis de infeccion por HCV. Alternativamente, se proporciona el uso de un compuesto de la formula I para la fabricacion de un medicamento para inhibir HCV. Convenientemente, la presente invencion se refiere al uso de un compuesto de la formula I para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o la profilaxis de infeccion por HCV.

Genotipos de HCV representativos en el contexto de tratamiento o profilaxis segun la invencion incluyen genotipo 1b (dominante en Europa) o 1a (dominante en Norteamerica). La invencion tambien proporciona un metodo para el tratamiento o la profilaxis de infeccion por HCV, en particular del genotipo 1a o 1b.

El compuesto de la formula (I) es una forma estereoisomera pura. Una forma estereoisomera pura como se menciona en la presente memoria se define como un estereoisomero sustancialmente exento de otras formas enantiomeras o diastereomeras de la misma estructura molecular basica del compuesto de la formula (I). En particular, una forma estereoisomera pura se refiere a un compuesto con un exceso de estereoisomero de al menos 80% (es decir, mmimo 90% de un isomero y maximo 10% de los otros isomeros posibles) hasta un exceso de estereoisomero de 100% (es decir, 100% de un isomero y nada del otro), mas en particular, un compuesto que tiene un exceso de estereoisomero de 90% hasta 100%, incluso mas en particular con un exceso de estereoisomero de 94% hasta 100% y lo mas en particular con un exceso de estereoisomero de 97% hasta 100% o de 98% hasta 100%. Los terminos "enantiomericamente puro" y "diastereomericamente puro" se debenan entender de una manera similar, pero teniendo en cuenta entonces el exceso de enantiomero y el exceso de diastereomero, respectivamente, de la mezcla en cuestion.

La forma estereoisomera pura del compuesto presente se puede obtener por tecnicas de separacion o por procedimientos de smtesis estereoespedfica usando formas isomeras estereoqmmicamente puras de los materiales de partida apropiados. Por ejemplo, se pueden separar enantiomeros entre sf por la cristalizacion selectiva de sus sales diastereomeras con acidos o bases opticamente activos. Ejemplos de los mismos son acido tartarico, acido dibenzoil-tartarico, acido ditoluoiltartarico y acido camforsulfonico. Alternativamente, se pueden separar enantiomeros por tecnicas cromatograficas usando capas estacionarias quirales o usando cromatograffa de fluidos supercnticos.

Las sales de adicion farmaceuticamente aceptables comprenden las formas de sal de adicion de acido o base, no

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toxicas, terapeuticamente activas, del compuesto de formula I. Tiene interes la forma libre, es dedr, no de sal, del compuesto de formula I.

Las sales de adicion de acido farmaceuticamente aceptables se pueden obtener de manera conveniente tratando la forma basica con dicho acido apropiado. Los acidos apropiados comprenden, por ejemplo, acidos inorganicos tales como acidos hidracidos, por ejemplo acido clortndrico o bromtHdrico, acidos sulfurico, mtrico, fosforico y similares o acidos organicos tales como, por ejemplo, acidos acetico, propionico, hidroxiacetico, lactico, piruvico, oxalico (es decir, etanodioico), malonico, sucdnico (es decir, acido butanodioico), maleico, fumarico, malico (es decir, acido hidroxilbutanodioico), tartarico, dtrico, metanosulfonico, etanosulfonico, bencenosulfonico, p-toluenosulfonico, ciclamico, salidlico, p-aminosalidlico, pamoico y similares. A la inversa, se pueden convertir dichas formas de sal por tratamiento con una base apropiada en la forma de base libre.

Las sales de adicion de base farmaceuticamente aceptables, tales como formas de sal de metal o de amina, se pueden obtener de manera conveniente por tratamiento de la forma acida con una base organica o inorganica apropiada. Las formas de sal basica apropiadas comprenden, por ejemplo, las sales de amonio, las sales de metal alcalino y de alcalino-terreo, por ejemplo, las sales de litio, sodio, potasio, magnesio, calcio y similares, sales con bases organicas, por ejemplo, las sales de benzatina, N-metil-D-glucamina, hidrabamina y sales con aminoacidos tales como, por ejemplo, arginina, lisina y similares.

El termino "solvatos" cubre cualquier solvato farmaceuticamente aceptable que pueda formar el compuesto de formula I, asf como las sales del mismo. Dichos solvatos son, por ejemplo, hidratos, alcoholatos, por ejemplo etanolatos, propanolatos y similares.

La presente invencion tambien incluye un compuesto etiquetado de isotopo de la formula I en el que se reemplaza uno o mas de los atomos por un isotopo que difiere de uno o unos encontrados tipicamente en la naturaleza. Los

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ejemplos de tales isotopos incluyen isotopos de hidrogeno, tales como H y H; carbono, tales como C, C y C; nitrogeno, tales como 13N y 15N; oxfgeno, tales como 15O, 17O y 18O; fosforo, tales como 31P y 32P. Un compuesto etiquetado de isotopo de la invencion se puede preparar por procedimientos analogos a los descritos en la presente memoria usando los reactivos o materiales de partida etiquetados de isotopo apropiados o por tecnicas conocidas en la tecnica. La eleccion del isotopo incluido en un compuesto etiquetado de isotopo depende de la aplicacion espedfica de ese compuesto. Por ejemplo, para ensayos de distribucion de tejidos, se incorpora un isotopo radiactivo tal como 3H o 14C. Para aplicaciones de radioimagenes, sera util un isotopo emisor de positrones tal como

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C, F, N u O. La incorporacion de deuterio puede proporcionar mayor estabilidad metabolica, dando como resultado, por ejemplo, una semivida in vivo aumentada del compuesto o requerimientos de dosificacion reducidos.

En un aspecto mas, la presente invencion se refiere a una composicion farmaceutica que comprende una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de la formula I como se especifica en la presente memoria y un portador farmaceuticamente aceptable. Dicha composicion puede contener de 1% a 50% o de 10% a 40% de un compuesto de la formula I y el resto de la composicion es dicho portador. Una cantidad terapeuticamente eficaz en este contexto es una cantidad suficiente (i) para actuar de una manera profilactica contra la infeccion por HCV o (ii) para inhibir la replicacion de HCV o (iii) para estabilizar la infeccion por HCV o (iv) para reducir la infeccion por HCV o (v) erradicar la infeccion por HCV, en individuos infectados o individuos que estan en riesgo de llegar a estar infectados. En otro aspecto mas, esta invencion se refiere a un procedimiento para preparar una composicion farmaceutica, que comprende mezclar mtimamente un portador farmaceuticamente aceptable con una cantidad terapeuticamente eficaz de un compuesto de la formula I.

El compuesto de la formula I se puede formular en diversas formas farmaceuticas para fines de administracion. Como composiciones apropiadas allf se pueden citar todas las composiciones empleadas normalmente para administrar sistemicamente farmacos. Para preparar las composiciones farmaceuticas de esta invencion, se combina una cantidad eficaz de un compuesto de la presente invencion, como el ingrediente activo en mezcla mtima con un portador farmaceuticamente aceptable, portador que puede tomar una amplia variedad de formas dependiendo de la forma de preparacion deseada para administracion. Estas composiciones farmaceuticas son deseables en forma farmaceutica unitaria adecuada, particularmente, para administracion por via oral, por via rectal, por via percutanea o por inyeccion parenteral. Por ejemplo, en la preparacion de las composiciones en forma farmaceutica oral, se puede emplear cualquiera de los medios farmaceuticos habituales tales como, por ejemplo, agua, glicoles, aceites, alcoholes y similares en el caso de preparaciones lfquidas orales tales como suspensiones, jarabes, elixires, emulsiones y disoluciones o portadores solidos tales como almidones, azucares, caolm, lubricantes, aglutinantes, agentes disgregantes y similares en el caso de polvos, pfldoras, capsulas y comprimidos. Debido a su facilidad de administracion, los comprimidos y las capsulas representan las formas farmaceuticas unitarias orales mas ventajosas, en cuyo caso se emplean obviamente portadores farmaceuticos solidos. Para composiciones parenterales, el portador comprendera normalmente agua esteril, al menos en gran parte, aunque se pueden incluir otros ingredientes, por ejemplo para ayudar a la solubilidad. Se pueden preparar disoluciones inyectables, por ejemplo, en que el portador comprende disolucion salina, disolucion de glucosa o una mezcla de disolucion salina y disolucion de glucosa. Tambien se pueden preparar suspensiones inyectables en cuyo caso se pueden emplear portadores lfquidos apropiados, agentes de suspension y similares. Tambien se incluyen preparaciones de formas solidas destinadas a convertirse, poco antes de uso, en preparaciones en forma lfquida. En las composiciones adecuadas para administracion percutanea, el portador comprende opcionalmente un agente potenciador de la

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penetracion y/o un agente humectante adecuado, combinado opcionalmente con aditivos adecuados de cualquier naturaleza en proporciones minoritarias, aditivos que no introducen un efecto perjudicial significativo en la piel. Los compuestos de la presente invencion tambien se pueden administrar via inhalacion oral o insuflacion en la forma de una disolucion, una suspension o un polvo seco usando cualquier sistema de suministro conocido en la tecnica.

Es especialmente ventajoso formular las composiciones farmaceuticas ya mencionadas en forma farmaceutica unitaria para facilidad de administracion y uniformidad de dosificacion. Forma farmaceutica unitaria como se usa en la presente memoria se refiere a unidades ffsicamente discretas adecuadas como dosis unitarias, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de ingrediente activo calculada para producir el efecto terapeutico deseado junto con el portador farmaceutico requerido. Ejemplos de dichas formas farmaceuticas unitarias son los comprimidos (incluyendo comprimidos ranurados o recubiertos), capsulas, pfldoras, supositorios, paquetes de polvo, obleas, disoluciones inyectables o suspensiones y similares y multiples segregadas de los mismos.

El compuesto de la formula I es activo frente a HCV y se puede usar en el tratamiento y o la profilaxis de infeccion por HCV o enfermedades asociadas a HCV. Lo ultimo incluye fibrosis hepatica progresiva, inflamacion y necrosis que conduce a cirrosis, enfermedad hepatica terminal y HCC. Se cree que el compuesto de esta invencion es activo contra cepas mutadas de HCV y presenta un perfil farmacocinetico favorable. Ademas presenta propiedades atractivas en terminos de biodisponibilidad, incluyendo una semivida aceptable, ABC (area bajo la curva) y valores de pico.

La actividad antivmca in vitro contra HCV del compuesto de la formula I se ensayo en un sistema de replicon de HCV celular basado en Lohmann et al. (1.999) Science 285: 110-113, con las modificaciones adicionales descritas por Krieger et al. (2.001) Journal of Virology 75: 4.614-4.624 (incorporado en la presente memoria como referencia), que se ejemplifica ademas en la seccion ejemplos. Este modelo, aunque no un modelo de infeccion completo para hCv, esta extensamente aceptado como el modelo mas robusto y eficaz de replicacion de ARN de HCV autonoma actualmente disponible. Se apreciara que es importante distinguir entre compuestos que interfieren de manera espedfica con las funciones de HCV de aquellos que ejercen efectos citotoxicos o citostaticos en el modelo de replicon de HCV y como consecuencia causan una disminucion en ARN de HCV o concentracion de enzima informadora ligada. Los ensayos son conocidos en el campo para la evaluacion de citotoxicidad celular basados por ejemplo en la actividad de las enzimas mitocondriales usando colorantes redox fluorogenicos tales como resazurina. Ademas, los sistemas celulares de cribado existen para la evaluacion de inhibicion no selectiva de actividad de los genes informadores ligados, tal como luciferasa de luciernaga. Los tipos de celulas apropiados pueden estar equipados por transinfeccion estable con un gen informador de luciferasa cuya expresion depende de un informador de genes constitutivamente activos y se pueden usar tales celulas como un sistema de cribado para eliminar inhibidores no selectivos.

Debido a sus propiedades anti-HCV, el compuesto de la formula I, incluyendo las sales de adicion o solvatos del mismo farmaceuticamente aceptables, son utiles en el tratamiento de animales de sangre caliente, en particular seres humanos, infectados con HCV y en la profilaxis de infecciones por HCV. Los compuestos de la presente invencion se pueden usar por lo tanto como una medicina, en particular como una medicina anti-HCV o una medicina inhibidora de HCV. La presente invencion tambien se refiere al uso de los compuestos presentes en la fabricacion de un medicamento para el tratamiento o la prevencion de infeccion por HCV. En un aspecto mas, la presente invencion se refiere a un metodo para tratar a un animal de sangre caliente, en particular un ser humano, infectado por HCV o que esta en riesgo de llegar a estar infectado por HCV, comprendiendo dicho metodo la administracion de una cantidad eficaz anti-HCV de un compuesto de la formula I. Dicho uso como una medicina o metodo de tratamiento comprende la administracion sistemica a individuos infectados por HCV o a individuos susceptibles de infeccion por HCV de una cantidad eficaz para combatir o prevenir las afecciones asociadas a la infeccion por HCV.

Cuando se administra a un ser humano, en particular un paciente, el compuesto de la presente invencion es un profarmaco del tipo fosforamidato. Actua como un precursor para su derivado de ester monofosfato, que se puede fosforilar despues ademas al ester de trifosfato. De acuerdo con Hecker, S. et al. J. Med. Chem. 2.008, Vol 51 (8) pag. 2.328, la escision de este tipo de profarmaco se inicia por una esterasa. Se libera un compuesto intermedio de carboxilato que se cree que se cicla de manera intramolecular para proporcionar un compuesto intermedio de cinco miembros por el cual se libera un resto ariloxi. El compuesto intermedio de cinco miembros formado se hidroliza despues para formar un acido fosforairndico. Finalmente este monoamidato se hidroliza ademas (catalizado posiblemente por una segunda enzima (fosforamidasa) para proporcionar el nucleosido monofosfato.

En general se considera que una cantidad diaria eficaz antivmca sena desde aproximadamente 1 a aproximadamente 200 mg/kg o aproximadamente 5 a aproximadamente 175 mg/kg o aproximadamente 10 a

aproximadamente 150 mg/kg o aproximadamente 20 a aproximadamente 100 mg/kg o aproximadamente 50 a

aproximadamente 75 mg/kg de peso corporal. Se pueden obtener dosis diarias promedio multiplicando estas cantidades diarias por aproximadamente 70. Puede ser apropiado administrar la dosis requerida como dos, tres, cuatro o mas subdosis a intervalos apropiados a lo largo del dfa. Dichas subdosis se pueden formular como formas farmaceuticas unitarias, por ejemplo, conteniendo aproximadamente 1 a aproximadamente 5.000 mg o aproximadamente 50 a aproximadamente 3.000 mg o aproximadamente 100 a aproximadamente 1.000 mg o

aproximadamente 200 a aproximadamente 600 mg o aproximadamente 100 a aproximadamente 400 mg de

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ingrediente activo por forma farmaceutica unitaria.

Como se usa en la presente memoria el termino "aproximadamente" tiene el significado conocido para el experto en la materia. En ciertas realizaciones, el termino "aproximadamente" se puede omitir y significa la cantidad exacta. En otras realizaciones, el termino "aproximadamente" significa que los numeros a continuacion del termino "aproximadamente" estan en el intervalo de ± 15% o de ± 10% o de ± 5% o de ± 1%, de dicho valor numerico.

Metodos usados en los ejemplos

El analisis LC-MS se realizo usando uno de los siguientes metodos.

Condicion de HPLC A

Sistema: Waters Alliance 2695

Columna: Waters XTerra 2,5 pm 4,6x50 mm; Temp. columna: 55°C; Caudal : 2 ml/min Fase movil A: acetato de amonio 10 mM + HCOOH al 0,1% en H2O Fase movil B: CH3CN

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Condicion de HPLC B Sistema: Waters Alliance 2695

Columna: Hypercarb 3 p 4,6x50 mm; Temp. columna: 50°C; Caudal : 2 ml/min Fase movil A: acetato de amonio 10 mM en H2O/CH3CN 1/9 Fase movil B: acetato de amonio 10 mM en H2O/CH3CN 9/1

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de RMN en un espectrometro Bruker 400, operando a 400 MHz para 1H. Los proporcionan en ppm y los valores J en Hz. La multiplicidad se indica usando las doblete, t para triplete, m para un multiplete.

Ejemplos

Se registraron los espectros desplazamientos qmmicos se siguientes abreviaturas: d para

El compuesto de la formula (I) se preparo segun un esquema de smtesis 3 e implica la reaccion de 1- [(4R,5R,7R,8R)-8-hidroxi-7-(hidroximetil)-1,6-dioxaspiro[3.4]oct-5-il]pirimidin-2,4(1H,3H)-diona (compuesto

intermedio 10), preparado segun el esquema de smtesis 1 y (2S)- 2-(cloro(fenoxi)fosforilamino)-propanoato de butilo (compuesto intermedio 12), preparado segun el esquema de smtesis 2.

imagen2

Ejemplo 1: Smtesis de compuesto intermedio (2S,3R,4R,5R)-3-alil-4-(benciloxi)-5-(bencil-oximetil)-2- metoxitetrahidrofuran-3-ol (5).

En atmosfera de argon, se anadio a una disolucion de 4 (que se puede preparar segun los procedimientos descritos 5 en Org. Lett., 2.007, 9, 3.009-3.012) en tetrahidrofurano seco (tHf; 400 ml) a -78°C, bromuro de alilmagnesio (400 ml, 400 mmol; 1,0 M en dietil eter). Despues de agitar la mezcla de reaction a -78°C durante 4 horas, se dejo con agitation la mezcla de reaccion a temperatura ambiente durante 2 horas. Se enfrio rapidamente cuidadosamente la reaccion con cloruro de amonio acuoso, saturado. Se extrajo la mezcla con diclorometano y se lavo la capa organica con salmuera. Se retiro el disolvente y se purifico el residuo mediante cromatograffa de gel de sflice (600 g de sflice), 10 por elucion en gradiente con acetato de etilo al 15% a 20% en hexano para proporcionar el producto de reaccion 5 como un aceite incoloro (32,9 g, 70%).

Condition de HPLC A, tr: 2,97 min, m/z = 402 (M+NH,,)+. RMN de 1H (400 MHz, CDCla) S ppm 7,38-7,20 (m, 10H), 5,84-5,97 (m, 1H), 5,12 (d, 1H, J = 10,2 Hz), 5,01 (d, 1H, J = 17,2 Hz), 4,74 (d, 1H, J = 12,3 Hz), 4,56 (s, 1H), 4,534,40 (m, 3H), 4,05-4,11 (m, 1H), 3,32-3,53 (m, 4H), 3,44 (s, 3H), 2,37 (dd, 1H, J = 14,3; 6,7 Hz), 2,25 (dd, 1H, J = 15 14,3; 7,6 Hz).

Ejemplo 2: Smtesis de compuesto intermedio benzoato de (2S,3R,4R,5R)-3-alil-4-(benciloxi)-5-(bencil-oximetil)-2-

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metoxitetrahidrofuran-3-ilo (6).

A una disolucion de 5 (26,6 g, 69,2 mmoles) en diclorometano seco (500 ml) a temperatura ambiente, se anadio N,N- dimetilpiridin-4-amina (DMAP; 2,113 g, 17,30 mmoles), trietilamina (217 ml, 1.557 mmoles) y cloruro de benzoMo (18,05 ml, 156 mmoles). Despues de 1 hora, se anadio cloruro de benzoMo adicional (6 ml) y DMAP (2,1 g). La mezcla se agito durante 5 dfas.

Despues se agito la mezcla de reaccion con HCl 1 N y se extrajo con diclorometano. Se combinaron las capas organicas y se lavaron con NaHCO3 acuoso, saturado, seguido por salmuera. Despues de secado con MgSO4, filtracion y evaporacion de los componentes volatiles, se purifico el residuo por cromatograffa de columna (400 g de sflice) eluyendo con heptano a acetato de etilo al 15% en heptano para proporcionar producto de reaccion como un aceite (como una mezcla con compuesto 5). Se purifico la mezcla de nuevo con CH2CI2 como eluyente (400 g de sflice). Se recogieron las fracciones puras y se obtuvo compuesto intermedio 6 como un aceite incoloro (13,05 g; 39 %). Condicion de HPLC A; tr: 3,41 min; m/z = 457 (M-OMe)+. RMN de 1H (400 MHz; CDCh) 8 ppm 8,1 (d; 2H; J = 7,9 Hz); 7,68-7,28 (m; 13H); 5,84-5,77 (m; 1H); 5,12 (d; 1H; J= 16 Hz); 4,95 (d; 1H; J= 16 Hz); 4,92 (d; 1H; J = 12,3 Hz); 4,56 (d; 1H; J = 12,3 Hz); 4,48 (d; 1H; J = 11,6 Hz); 4,40 (d; 1H; J = 11,6 Hz); 4,2 (m; 1H); 3,85 (d; 1H; J = 6,2 Hz); 3,53 (d; 1H; J = 10,8 Hz); 3,7 (s; 3H); 3,45 (dd; 1H; J = 10,8; 6,2 Hz); 3,25 (dd; 1H; J = 15,5; 7,3 Hz); 2,45 (dd; 1H; J = 15,5; 7,3 Hz).

Ejemplo 3: Smtesis de compuesto intermedio 1-[(2R,3R,4R,5R)-3-alil-4-(benciloxi)-5-(benciloximetil)-3- hidroxitetrahidrofuran-2-il]pirimidin-2,4(1H,3H)-diona (7).

Se anadio bis(trimetilsilil)acetamida (BSA; 29,2 ml, 118 mmoles) a una mezcla de 6 (14,0 g, 23,1 mmoles) y uracilo (5,99 g, 53,4 mmoles) en acetonitrilo anhidro (300 ml). Se calento la mezcla de reaccion para hacerla hervir a reflujo durante 1 hora y se dejo que la solucion clara se enfriara a temperatura ambiente. Se anadio gota a gota cloruro de estano (11,55 ml, 99 mmoles) a temperatura ambiente y se agito ademas la mezcla durante 1 hora. Despues se agito la mezcla a reflujo durante 1,5 horas y se enfrio de nuevo a temperatura ambiente. Se anadio acetato de etilo (250 ml), seguido por NaHCO3 acuoso, saturado (250 ml) y se agito la mezcla durante 15 minutos. Despues de filtracion por Celite, se separo la capa organica y se lavo con NaHCO3 acuoso, saturado (250 ml). Se extrajo la capa acuosa combinada con acetato de etilo (250 ml) y se seco la capa organica combinada (MgSO4), se filtro y se evaporo a sequedad a presion reducida. Se disolvio el aceite amarillo resultante en metanol y se anadio metanolato de sodio al 25% (25 ml). Se continuo con agitacion durante la noche. Se anadio mas metanolato de sodio al 25% (15 ml) y se continuo la agitacion durante la noche. Se anadio acido acetico (30 ml) y se retiro el disolvente. Se purifico el residuo por cromatograffa de columna con heptano/acetato de etilo 50:50 a acetato de etilo al 100%. Se obtuvo compuesto intermedio 7 (9,38 g, 76%) como un aceite incoloro. Condicion de HPLC A, tr: 2,49 min, m/z = 465 (M+H)+. RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 8 ppm 8,39 (1H, NH), 7,75 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 7,22-7,43 (m, 10H), 6,05 (s, 1H), 5,71-5,84 (m, 1H), 5,35 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 5,00-5,11 (m, 2H), 4,70 (d, 1H, J= 11,5 Hz), 4,53 (d, 1H, J= 11,5 Hz), 4,47 (d, 1H, J= 11,1 Hz), 4,47 (d, 1H, J= 11,1 Hz), 4,11-4,16 (m, 1H), 4,04 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 3,81-3,87 (m, 1H), 3,45-3,52 (m, 1H), 3,17 (s a, OH), 2,15-2,33 (m, 2H).

Ejemplo 4: Smtesis de compuesto intermedio 1-[(2R,3R,4R,5R)-4-(benciloxi)-5-(bencil-oximetil)-3-hidroxi-3-(2- hidroxietil)tetrahidrofuran-2-il]pirimidin-2,4(1H,3H)diona (8).

A una disolucion agitada de 7 (7,8 g, 16,79 mmoles) en una mezcla de THF (10 ml) y H2O (10 ml) se anadio peryodato de sodio (11,17 g, 52,2 mmoles) seguido por tetraoxido de osmio (VIIl) (2 ml, 2,5% p/v en terc-Butanol, 0,168 mmoles) y se continuo agitando durante 2 horas a temperatura ambiente. Se anadio agua (100 ml) y se realizo extraccion con acetato de etilo (2x50 ml). Se lavo la capa organica con NaHCO3 acuoso, saturado (2x30 ml). Se extrajo la capa acuosa combinada con acetato de etilo y se seco la capa organica combinada sobre (Na2SO4), se filtro y se evaporo a sequedad a presion reducida. Se disolvio el residuo oleoso obtenido en una mezcla de THF (100 ml) y H2O (20 ml) y se anadio borohidruro de sodio (1,361 g, 36,0 mmoles). Se agito la mezcla de reaccion durante la noche a temperatura ambiente, despues de lo cual se anadio agua (100 ml) y se realizo extraccion con acetato de etilo (2x50 ml). Se lavo la capa organica combinada con NaHCO3 acuoso, saturado, se extrajo la capa acuosa combinada con acetato de etilo y se seco la capa organica combinada sobre (Na2SO4), se filtro y se evaporo a sequedad a presion reducida. Se purifico el residuo oleoso obtenido por cromatograffa de columna (metanol al 010% (v/v) en CH2CI2 despues isocratico al 10%) proporcionando el producto de reaccion 8 como una espuma blanca (4,8 g, 57 %). Condicion de HPLC A, tr: 2,12 min, m/z = 469 (M+H)+, RMN de 1H (400 MHz, CDCh) 8 ppm 9,85 (1H, NH), 7,85 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 7,22-7,43 (m, 10H), 6,05 (s, 1H), 5,35 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 4,75 (d, 1H, J= 11,5 Hz), 4,53 (d, 1H, J= 11,5 Hz), 4,45 (d, 1H, J= 11,3 Hz), 4,35 (d, 1H, J= 11,3 Hz), 4,27 (d, 1H, J= 6,6 Hz), 4,2 (s, 1H), 4,1, (d, 1H, J = 6,6 Hz), 3,95 (d, 1H, J= 10,8 Hz), 3,75-3,7 (m, 1H), 3,62 (d, 1H, J= 10,8 Hz), 3 ,17 (s a, OH), 1,8-1,7 (m, 2H).

Ejemplo 5: Smtesis de compuesto intermedio 1-[(4R,5R,7R,8R)-8-(benciloxi)-7-(benciloxi-metil)-1,6-

dioxaspiro[3.4]octan-5-il]pirimidin-2,4(1H,3H)-diona (9).

Se anadio cloruro de metanosulfonilo (0,800 ml, 10,34 mmoles) a 8 (4,32 g, 9,22 mmoles) en piridina seca (100 ml). Despues de 1 hora y 15 minutos, se anadieron 0,1 equivalentes mas de cloruro de metanosulfonilo y se agito ademas la mezcla a temperatura ambiente durante 45 minutos. Despues, se anadio una cantidad pequena de metanol y se evaporo la mezcla a sequedad. Se disolvio el residuo en acetato de etilo (100 ml) y se lavo con

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NaHCO3 saturado (2x50 ml). Se extrajo la capa acuosa combinada con acetato de etilo. Despues se seco la capa organica combinada sobre Na2SO4 y se concentro a vado. Se disolvio el residuo obtenido en THF seco y se anadio NaH al 95% (932 mg, 36,9 mmoles) inmediatamente a temperatura ambiente. Despues de agitar durante 2 horas a temperatura ambiente, se vertio la mezcla de reaccion sobre una disolucion acuosa saturada de NH4CI (30 ml) seguido por adicion de CH2CI2 (250 ml). Se lavo la capa organica separada con NaHCO3 acuoso, saturado (2 x 100 ml) y se extrajo la capa acuosa combinada con CH2CI2 (250 ml). Se seco la capa organica combinada (Na2So4), se filtro y se evaporo a sequedad a presion reducida. Se purifico el residuo obtenido por cromatografia de columna eluyendo primero con heptano, despues con acetato de etilo para proporcionar 9 (3,27 g, 79%) como una espuma. Condicion de HPLC A, tr: 2,33 min, m/z = 451 (M+H)+. RMN de 1H (400 MHz, CDCI3) 8 ppm 2,20 - 2,38 (m, 1 H), 2,38 - 2,52 (m, 1 H), 3,62 - 3,73 (m, 1 H), 3,89 - 4,13 (m, 3 H), 4,38 - 4,56 (m, 3 H), 4,56 - 4,68 (m, 1 H), 4,70 - 4,88 (m, 2 H), 5,25 (d, J=8,00 Hz, 1 H), 6,25 (s, 1 H), 7,18 - 7,47 (m, 10 H), 7,87 (d, J=8,20 Hz, 1 H), 8,90 (s a, 1 H).

Ejemplo 6: Smtesis de compuesto intermedio 1-[(4R,5R,7R,8R)-8-hidroxi-7-(hidroxil-metil)-1,6-dioxaspiro[3.4]octan- 5-il]pirimidin-2,4(1H,3H-diona (10).

imagen3

Una mezcla de 9 (50 mg, 0,111 mmoles) en metanol (1 ml) y Pd(OH)2 (8 mg) se agito bajo una atmosfera de hidrogeno a temperatura ambiente. Despues de 4 horas, se anadio mas Pd(OH)2 (30 mg) y metanol (1 ml). Se agito vigorosamente la mezcla bajo atmosfera de H2 durante la noche. Se retiro el catalizador por filtracion sobre decalita y se retiro el disolvente por evaporation. Se purifico el residuo resultante por cromatografia sobre gel de sflice eluido con metanol al 10% en acetato de etilo para proporcionar el compuesto intermedio 10 como polvo blanco (16,8 mg; 56%). Condicion de HPLC B, tr: 1,98 min, m/z = 271 (M+H)+. RMN de 1H (400 MHz, D2O) 8 ppm 7,65 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 6,11 (s, 1H), 5,82 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 4,46-4,61 (m, 2H), 4,06-4,13 (m, 1H), 3,87-3,95 (m, 1H), 3,69-3,77 (m, 2H), 2,62-2,73 (m, 1H), 2,48-2,58 (m, 1H).

Esauema 2: Sintesis de compuesto intermedio 12

imagen4

Ejemplo 7: Smtesis de compuesto intermedio (2S)- 2-(cloro(fenoxi)fosforilamino)propanoato de butilo (12).

Se enfrio 1-butanol (1.200 ml) a -20°C y 50 ml de SOCh anadido con agitation seguido por 50 g (33,67 mmoles) de acido (S)-2-aminopropanoico. Se calento la disolucion 24 h para hacerla hervir a reflujo, se elimino la mayor parte del disolvente y se disolvio el residuo en 800 ml de dietil eter. Se dejo la mezcla durante 1 h a 0°C para proporcionar hidrocloruro de (S)-2-aminopropanoato de butilo (compuesto intermedio 11,47 g). Se suspendio fosforodicloridato de fenilo (48,9 g, 232 mmoles) e hidrocloruro de (S)-2-aminopropanoato de butilo (42 g, 232 mmoles) en CH2Cl2 anhidro (200 ml). Se anadio gota a gota N,N-diisopropiletilamina (59,9 g, 464 mmoles) a -78°C y despues de 4 h se concentro la reaccion. Se anadio dietil eter (Et2O, 500 ml) y se separo por filtracion el precipitado resultante y se lavo con Et2O seco (dos veces 100 ml). Se evaporo a sequedad el fiquido filtrado. Se almaceno (2S)- 2- (cloro(fenoxi)fosforilamino)propanoato de butilo (12) como disolucion 0,5 M en THF a -18°C hasta reaccion adicional.

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Esauema 3: sintesis de corrmuesto P1

imagen5

A una disolucion de 10 (12 g, 44,4 mmoles) en 480 ml de CH2CI2 seco se anadio 1-metil-imidazol (43,74 g, 532 mmoles) a 25°C. Se anadio gota a gota una disolucion de 12 (120 ml, 0,5 M en THF) y se agito la mezcla a 25°C durante 18 h. Se anadieron gota a gota otros 120 ml de 12 (0,5 M en THF). Se agito la mezcla resultante durante 5 h. Se enfrio rapidamente la mezcla de reaction con 20 ml de agua. Se concentro la mezcla resultante.

Ejemplo 9: Preparation de N-[(R)-{[(4R,5R,7R,8R)-5-(2,4-dioxo-3,4-dihidro-pirimidin-1(2H)-il]-8-hidroxi-1,6-

dioxaspiro[3.4]oct-7-il]metoxi}(fenoxi)-fosforil]-L-alaninato de butilo (compuesto P1).

Se purifico el residuo resultante del ejemplo 8 por cromatografia de columna sobre gel de sflice (CH2Cl2/metanol=30/1) proporcionando 3 fracciones: 1) 4 g, 96% puro (pureza basada en LC-MS), 2) 7 g, 80 % puro y 3) 3,5 g con una pureza menor que 80%. Se combinaron las fracciones impuras (con pureza < 95 %) y se purifico de nuevo por cromatografia de columna sobre gel de sflice (de CH2CI2 a CH2CI2/metanol =50/1) para obtener una fraction adicional de 3,1 g con una pureza de al menos 95%. En total se obtuvieron 7,1 g con una pureza de al menos 95%. Se purificaron 1,3 g de los mismos por cromatografia de fluidos supercriticos (SFC, por sus siglas en ingles) en un sistema II Supercritical Fluid Cromatografia Multigram ™ de Berger instruments (Newark, DE, USA), usando una columna Chiralpak Diacel OJ de 20 x 250 mm.

Se realiza purification a temperatura ambiente usando una presion de la boquilla de 10 MPa (100 bar) y un caudal de 50 ml/min. La fase movil usada fue CO2, etanol con isopropilamina al 0,2%. Se obtuvieron 464 mg de P1 100 % puro como un solido blanco.

El tiempo de retention para el compuesto P1 fue como sigue: Rt (SFC): 7,7 min.

El analisis LC-MS en este ejemplo se realizo usando las siguientes condiciones: Columna: SunFire C18 3,5 ^ 4,6x100 mm, fase movil A: NH4OOCH 10 mM + HCOOH al 0,1% en H2O, fase movil B: metanol operando a una temperatura de columna de 50°C usando un caudal de 1,5 ml/min. Condiciones de gradiente: t = 0 min: 65% A, 35% B; t = 7 min, 5% de A, 95% de B; t = 9,6 min, 5% de A, 95% de B; t = 9,8 min: 65% de A, 35% de B; t = 12 min, 65% de A, 35% de B. Para P1 se encontraron los siguientes datos: Rt (LC-MS): 4,60 min, m/z= 554 (M+H)+

RMN para P1: RMN de 1H (400 MHz, METANOL-d4) 5 ppm 0,92 (t, J=7,4 Hz, 3 H) 1,23 - 1,47 (m, 5 H) 1,49 - 1,67 (m, 2 H) 2,52 (ddd, J=11,9, 8,7, 6,8 Hz, 1 H) 2,60 - 2,78 (m, 1 H) 3,86 (dddd, J=9,5, 3,7, 2,0, 1,9 Hz, 1 H) 3,88 - 3,99 (m, 1 H) 4,03 (d, J=9,5 Hz, 1 H) 4,05 -4,18 (m, 2 H) 4,34 (ddd, J=11,7, 5,6, 3,5 Hz, 1 H) 4,43 -4,61 (m, 3 H) 5,66 (d, J=8,0 Hz, 1 H) 6,13 (s, 1 H) 7,12 - 7,29 (m, 3 H) 7,31 - 7,41 (m, 2 H) 7,56 (d, J=8,0 Hz, 1 H).

Se midio la rotation optica para P1 usando un polarimetro Perkin Elmer 341. [a]D20 indica la rotation optica medida con luz a la longitud de onda de la flnea D del sodio (589 nm) a una temperatura de 20°C. El camino optico de la

celda es 1 dm. A continuacion del valor real, se menciona la concentracion y el disolvente de la disolucion que se uso para medir la rotacion optica. [a]o20 = +7,48° (589 nm, c 0,3742% p/v, etanol, 20°C).

Ejemplo biologico: Ensayo de replicon.

Se examino en el compuesto P1 la actividad en la inhibicion de replicacion de ARN de HCV en un ensayo celular. Se 5 uso el ensayo para demostrar que el compuesto P1 inhibia una estirpe celular de replicacion celular funcional de HCV, tambien conocidos como replicones de HCV. El ensayo celular se baso en una construccion de expresion bicistronica, como se describe por Lohmann et al. (1.999) Science vol. 285 pags. 110-113 con modificaciones descritas por Krieger et al. (2.001) Journal of Virology 75: 4.614-4.624, en una estrategia de cribado multidiana.

En esencia, el metodo fue como sigue. El ensayo utilizo la estirpe celular transinfectada de manera estable Huh-7 10 luc/neo (a partir de ahora referida como Huh-Luc). Esta estirpe celular alberga un ARN que codifica una construccion de expresion bicistronica que comprende las regiones NS3-NS5B de tipo natural de HCV tipo 1 traducido de un sitio interno de entrada de ribosomas (IRES, por sus siglas en ingles), de virus de encefalomiocarditis (EMCV, por sus siglas en ingles), precedido por una porcion informadora (FfL-luciferasa) y una porcion marcadora seleccionable (neoR, neomicina fosfotransferasa). La construccion esta limitada por las NTR (regiones no traducidas) 5' y 3' de 15 genotipo 1b de HCV. El cultivo continuado de las celulas de replicones en presencia de G418 (neoR) depende de la replicacion del ARN de HCV. Las celulas de los replicones transinfectadas de manera estable que expresan ARN de HCV, que se replica de manera autonoma y a altos niveles, codificando entre otros luciferasa, se usaron para cribar los compuestos antivmcos.

Se pusieron en placas las celulas de replicones en placas de 384 pozos en presencia de los compuestos de ensayo 20 y de control que se anadieron en diversas concentraciones. Despues de una incubacion de tres dfas, se midio la replicacion de HCV ensayando la actividad de luciferasa (usando sustratos de ensayo de luciferasa estandar y reactivos y un generador de imagenes de microplacas ultraHTS de Perkin Elmer ViewLux™). Las celulas de replicones en los cultivos de control presentan alta expresion de luciferasa en ausencia de cualquier inhibidor. La actividad inhibidora del compuesto sobre la actividad de la luciferasa se controlo sobre las celulas Huh-Luc, 25 permitiendo una curva dosis - respuesta para el compuesto de ensayo. El valor de EC50 se calculo despues, valor que representa la cantidad del compuesto requerida para disminuir el nivel de actividad de luciferasa detectada por 50% o mas espedficamente, la capacidad del ARN del replicon de HCV unido geneticamente para replicarse.

El resultado se muestra en la tabla 1.

Tabla 1

Compuesto

EC50 (^M) (HCV) CC50 (^M) (Huh-7)

P1

4,47 >98

30 Ejemplo farmaceutico: Comprimido recubierto de pelfcula.

"Ingrediente activo" como se usa en todo este ejemplo se refiere a un compuesto de la formula (I), incluyendo una sal farmaceuticamente aceptable del mismo o un solvato del mismo.

Preparacion del centro del comprimido.

Se mezcla bien una mezcla de 100 g de ingrediente activo, 570 g de lactosa y 200 g de almidon y se humidifica 35 despues con una disolucion de 5 g de dodecilsulfato de sodio y 10 g de polivinilpirrolidona en aproximadamente 200 ml de agua. Se tamiza la mezcla de polvo humedo, se seca y se tamiza de nuevo. Despues hay anadidos 100 g de celulosa microcristalina y 15 g de aceite vegetal hidrogenado. Se mezcla bien el total y se comprime en comprimidos, proporcionando 10.000 comprimidos, comprendiendo cada uno 10 mg de ingrediente activo.

Recubrimiento

40 A una disolucion de 10 g de metilcelulosa en 75 ml de etanol desnaturalizado se anade una disolucion de 5 g de etilcelulosa en 150 ml de diclorometano. Despues se anaden 75 ml de diclorometano y 2,5 ml de 1,2,3-propanotriol, se muelen 10 g de polietilenglicol y se disuelven en 75 ml de diclorometano. Se anade la disolucion ultima a la primera y despues se anaden 2,5 g de octadecanoato de magnesio, 5 g de polivinilpirrolidona y 30 ml de suspension de color concentrada y se homogeniza el total. Se recubren los centros de los comprimidos con la mezcla asf 45 obtenida en un aparato de recubrimiento.

Claims (4)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un compuesto de la formula I:

   imagen1

   5 3. Una forma de sal segun la reivindicacion 2, en la que la sal es una sal farmaceuticamente aceptable.
2. 4. Una forma solvatada de un compuesto segun la reivindicacion 1,2 o3.
3. 5. Una composicion farmaceutica que comprende una cantidad antivmcamente eficaz de un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 y un portador farmaceuticamente aceptable.
4. 6. Un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso como una medicina.

   10 7. Un compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 para uso en el tratamiento o la profilaxis de

   infeccion por HCV.