ES2600907T3 - Reactivos de diagnóstico - Google Patents

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Abstract

Un reactivo de diagnóstico que consiste en la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 7 o una variante de la misma, o un reactivo de diagnóstico que comprende un polipéptido que comprende la SEQ ID NO: 7 o una variante de la misma, y que consiste en 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 o 30 aminoácidos, en el que la variante es al menos un 85 % idéntica a la SEQ ID NO: 7, que se determina como un porcentaje de la longitud completa del más largo de los polipéptidos que se comparan, estando el reactivo de diagnóstico caracterizado por que desencadena un resultado de ensayo de diagnóstico negativo cuando se realiza un ensayo de infección por tuberculosis en una muestra de un animal que ha sido vacunado contra una infección por un agente de la tuberculosis.

Description

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1 mg/ml/péptido, y los agrupamientos peptídicos se usaron para estimular sangre entera a una concentración final de 5 g/ml/péptido. Los péptidos que comprendían los agrupamientos para algunos antígenos se sintetizaron individualmente (Mimotopes Pty Ltd, Clayton, Australia), se disolvieron en RPMI 1640 que contenía DMSO al 20 % para obtener una concentración de 5 mg/ml y se usaron individualmente para estimular sangre entera a una concentración final de 10 g/ml, o se formularon en agrupamientos peptídicos adicionales a una concentración de 10 g/ml/péptido. Los péptidos de ESAT-6 y CFP-10 se formularon para obtener un cóctel peptídico como se ha descrito previamente (Vordermeier y col. (2001) Clin. Diagn. Lab. Immunol. vol. 8 págs. 571-578) y se usaron a una concentración final de 5 g/ml/péptido. Este cóctel peptídico se usó como un "estándar de oro" con el que comparar las inmunogenicidades de los demás antígenos.
Se suministró tuberculina bovina (PPD-B) por la Tuberculin Production Unit en la Veterinary Laboratories Agency, Weybridge, Surrey, Reino Unido, y se usó a una concentración final de 1 g/ml. Se incluyó una enterotoxina B estafilocócica (SEB; Sigma-Aldritch, Reino Unido) como un control positivo a una concentración final de 1 g/ml, mientras que la sangre entera se incubó con RPMI 1640 en solitario como un control negativo.
Ensayo inmunoabsorbente ligando a enzimas (ELISA) de IFN-
Se añadieron alícuotas de sangre entera (250 l) por duplicado a antígeno en placas de 96 pocillos y se incubaron a 37 ºC en presencia de CO2 al 5 % durante 24 horas, después de lo cual se recogieron los sobrenadantes plasmáticos y se almacenaron a -80 ºC hasta que se necesitaron. La cuantificación de IFN- en los sobrenadantes plasmáticos se determinó usando el kit Bovigam ELISA (Prionics AG, Suiza). Un resultado se consideró positivo si la densidad óptica a 450 nm (DO450) con el antígeno menos la DO450 sin el antígeno (DO450) era 0,1 en ambos de los pocillos duplicados.
Evaluación de prueba cutánea de Rv2346c (agrupamiento peptídico n.º 11) o Rv3020c (agrupamiento peptídico n.º 14)
La evaluación de prueba cutánea de los antígenos proteicos y peptídicos definidos se realizó en ganado expuesto de forma natural a infección por M. bovis (n = 17). Este ganado se incluyó como resultado de proporcionar repuestas positivas a la prueba cutánea de tuberculina comparativa cervical intradérmica simple (SICCT) durante operaciones de vigilancia en el terreno habituales.
Los antígenos se administraron en 8 sitios por animal (4 en cada lado del cuello). Los antígenos se administraron en un volumen de 100 l. Todos los cócteles de antígenos proteicos o peptídicos definidos se administraron a una concentración de 5 ug/ml por componente de cóctel. El espesor de la piel se midió en el sitio de inyección inmediatamente antes de la administración intradérmica del antígeno. El espesor de la piel en el sitio de inyección se midió de nuevo 72 horas después de la administración del antígeno, y se determinó el aumento del espesor de la piel en este tiempo. Este método también es adecuado para determinar la reacción en ganado no infectado con M. bovis, ya esté vacunado o sin vacunar contra tal infección.
Los antígenos proteicos recombinantes purificados se suministraron por Lionex GmbH. La composición del cóctel de ESAT-6, CFP-10 y Rv3615c era SEQ ID NO: 11-43. Se usó una combinación de 11 péptidos que proporcionaban un solapamiento de la secuencia completa para cada uno de los antígenos Rv3020c y Rv2346c, como se enumera en la Tabla 2 a continuación (las SEQ ID NO: 7 y 50-59 proporcionan un solapamiento de la secuencia completa para Rv2346c y las SEQ ID NO: 8 y 60-69 proporcionan un solapamiento de la secuencia completa para Rv3020c). Los cócteles Rv3020c y Rv2346c (es decir, los agrupamientos peptídicos n.º 14 y n.º 11, respectivamente, como se muestra en la Tabla 2) se ensayaron individualmente y en combinación con un cóctel que contenía los péptidos solapantes de ESAT-6, CFP-10 y Rv3615c (es decir, las SEQ ID NO: 11-43), que por su parte es el objeto de la solicitud de patente pendiente junto con la presente PCT/GB2011/050843.
Resultados
Para probar la hipótesis de que las proteínas secretadas por M. bovis es probable que contengan antígenos inmunógenos que pueden usarse para aumentar la especificidad de las pruebas diagnósticas, se cribaron 379 agrupamientos de péptidos solapantes (4129 péptidos en total que representaban 119 antígenos) para comprobar su capacidad para estimular una respuesta a IFN- in vitro usando sangre entera tanto de animales reactores a TB (n = 23) como animales vacunados con BCG (n = 8). Como se esperaba, todos los animales reactores a TB y los animales vacunados con BCG respondieron a PPD-B y al antígeno de control positivo SEB, mientras que 22
9
animales reactores de TB (96 %) y 2 animales vacunados con BCG (25 %) respondieron al cóctel peptídico ESAT6/CFP-10 (datos no mostrados). De los 379 agrupamientos peptídicos, aproximadamente la mitad (n = 184) no indujeron IFN- en ninguno de los animales reactores a TB ni vacunados con BCG. Para los 195 agrupamientos peptídicos restantes, se reconocieron 163 y 77 por los animales reactores a TB y los animales vacunados con BCG
5 respectivamente, reconociéndose 45 por ambos grupos de animales (Tabla 1). De forma alentadora, con respecto a los reactores de diagnóstico diferenciales, se reconocieron 118 agrupamientos peptídicos diferentes por los animales reactores a TB pero no se indujo ninguna respuesta a IFN- en ninguno de los animales vacunados con BCG estudiados.
10 Se apreció una jerarquía de respuestas a diferentes agrupamientos peptídicos, con frecuencias de respuesta que variaban del 4 % al 65 % en los animales reactores a TB, y del 13 % al 38 % den los animales vacunados con BCG (Tabla 1).
Tabla 1: Reconocimiento de los agrupamientos peptídicos de antígenos secretados.
Número de agrupamientos peptídicos reconocidos (%)
Número de agrupamientos peptídicos no reconocidos (%)
Reactores a TAMBIÉN
Vacunados con BCG Reactores a TAMBIÉN Vacunados con BCG
Todos los agrupamientos peptídicos (379 en total)
163 (43 %) 77 (20 %) 216 (57 %) 302 (80 %)
Agrupamientos de reactores a TB (163 en total)
163 (100 %) 45 (28 %) N.A. 118 (72 %)
15 La figura 1 detalla las frecuencias de respuesta para los 8 agrupamientos peptídicos reconocidos con más frecuencia, es decir, aquellos que indujeron una respuesta a IFN- en más de la mitad de los animales reactores a TB estudiados. Sorprendentemente, todos menos un agrupamiento peptídico (n.º 30-2) representaron antígenos que pertenecían a la familia de proteínas ESAT-6. De manera interesante, los agrupamientos peptídicos n.º 11 y n.º 14
20 no se reconocieron por ninguno de los animales vacunados con BCG, lo que sugería que contenían péptidos con aplicación potencial como reactivos DIVA. Los péptidos incluidos en estos agrupamientos se indican en la Tabla 2.
Tabla 2: Secuencias de los agrupamientos peptídicos n.º 11 y n.º 14.
Secuencia
SEQ ID NO Secuencia SEQ ID NO
Agrupamiento peptídico n.º 11 (agrupamiento Rv2346c)
Agrupamiento peptídico n.º 14 (agrupamiento Rv3020c)
MTINYQFGDVDAHGAMIRAQ
50 MSLLDAHIPQLIASHTAFAA 60
DVDAHGAMIRAQAGLLEAEH
51 PQLIASHTAFAAKAGLMRHT 61
IRAQAGLLEAEHQAIVRDVL
52 AFAAKAGLMRHTIGQAEQQA 62
EAEHQAIVRDVLAAGDFWGG
53 MRHTIGQAEQQAMSAQAFHQ 63
RDVLAAGDFWGGAGSVACQE
7 EQQAMSAQAFHQGESAAAFQ 64
FWGGAGSVACQEFITQLGRN
54 AFHQGESAAAFQGAHARFVA 65
ACQEFITQLGRNFQVIYEQA
55 AAFQGAHARFVAAAAKVNTL 66
LGRNFQVIYEQANAHGQKVQ
56 RFVAAAAKVNTLLDIAQANL 67
YEQANAHGQKVQAAGNNMAQ
57 VNTLLDIAQANLGEAAGTYV 68
QKVQAAGNNMAQTDSAVGSS
58 QANLGEAAGTYVAADAAAAS 8
VQAAGNNMAQTDSAVGSSWA
59 EAAGTYVAADAAAASSYTGF 69
25 Aunque 6 de los 8 agrupamientos peptídicos reconocidos con más frecuencia indujeron una respuesta a IFN- en algunos animales vacunados con BCG, los inventores razonaron a continuación que una investigación al mínimo detalle de la inmunogenicidad de los componentes de estos agrupamientos puede revelar péptidos individuales adicionales con uso potencial como reactivos DIVA. Para este fin, los péptidos solapantes contenidos en estos agrupamientos peptídicos se cribaron individualmente para determinar su capacidad para inducir la producción de
30 IFN- tanto en animales reactores a TB (n = 22) como vacunados con BCG (n = 23). En estos experimentos, 19 animales reactores a TB (86 %) pero ningún animal vacunado con BCG (0 %) respondieron al cóctel peptídico (datos no mostrados). Se identificaron cincuenta y tres péptidos individuales como inmunógenos en animales reactores a TB, con frecuencias de respuesta que variaban del 5 % al 50 % (figura 2). De estos péptidos, seis (péptidos n.º 17, n.º 32, n.º 48, n.º 58, n.º 67 y n.º 69) también indujeron respuestas a IFN- en animales vacunados con BCG con
35 frecuencias de respuesta que variaban del 4 % al 17 % (figura 2).
Con el fin de evaluar si una combinación de péptidos individuales de diferentes antígenos de secretoma es suficiente
10
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Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
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