ES2599996T3

ES2599996T3 - Polipéptidos

Info

Publication number: ES2599996T3
Application number: ES11194071.4T
Authority: ES
Inventors: Mikaela Friedman; Stefan STÅHL; Andreas Jonsson; Tove Eriksson; Fredrik Nilsson
Original assignee: Affibody AB
Current assignee: Affibody AB
Priority date: 2005-12-05
Filing date: 2006-12-05
Publication date: 2017-02-06
Anticipated expiration: 2026-12-05
Also published as: US9107965B2; JP2009519013A; CN101336250A; US20130005653A1; US20090016957A1; EP2431383B1; WO2007065635A1; EP1973934B1; JP5898826B2; CA2631430C; US20140178301A1; CA2631430A1; DK2431383T3; EP2431383A1; CN103288935B; JP2014087361A; CN103288935A; EP1973934A1; GB0524788D0; US8247375B2

Abstract

Polipéptido que se une al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), que comprende un motivo de unión al receptor del factor de crecimiento epidérmico, EBM, motivo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de: i) EMWX4AWX7EIR X11LPNLNGWQM TAFIASLLD, en donde, independientemente uno de otro, X4 se selecciona de I, V, G y S; X7 se selecciona de D, E, N y K; y X11 se selecciona de D, N y E; y ii) una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 93% de identidad con la secuencia definida en i); el polipéptido que se une al EGFR que se une al EGFR de modo que el valor KD de la interacción es como máximo 10 μM, tal que como máximo 1 x 10-6 M, tal que como máximo 1 x 10-7M.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

fusiones de RNasa o Dnasa; proteínas para la regeneración de células efectoras y otros componentes del sistema inmunitario; citocinas, tales como IL-2, IL-12, TNFα, IP-10; factores procoagulantes, tales como el factor tisular, el factor de von Willebrand; toxinas, tales como ricina A, exotoxinas de Pseudomonas, calicheamicina, maitansinoide, pequeñas moléculas tóxicas, tales como análogos de auristatina, doxorrubicina.

5 Otros aminoácidos descritos anteriormente (en especial hexahistidina, cisteína) se pueden emplear para acoplar quelantes para radioisótopos a los polipéptidos que se unen a EGFR con el fin de incorporar fácilmente radionúclidos para diagnóstico (p. ej., 68Ga, 76Br, 111In, 99Tc, 125I) o tratamiento (p. ej., 90Y, 131I, 211A, 177Lu).

La invención también abarca polipéptidos en los que el polipéptido que se une al EGFR descrito anteriormente se ha provisto de un grupo marcador, tal como al menos un fluoróforo, biotina o isótopo radiactivo, por ejemplo, para la

10 detección del polipéptido.

Con respecto a la descripción anterior de polipéptidos y proteínas de fusión que incorporan un polipéptido que se une al EGFR de la invención, debe señalarse que la designación de primer, segundo y más restos se hace en aras de claridad para distinguir entre el resto o restos que se unen a EGFR, por una parte, y restos que presentan otras funciones por otra parte. Estas designaciones no pretenden hacer referencia al orden real de los diferentes dominios

15 en la cadena de polipéptido de la proteína o polipéptido de fusión. Así, por ejemplo, un primer resto puede aparecer en el extremo del terminal N, en el medio, o en el extremo terminal del C de la proteína o polipéptido de fusión.

Otros aspectos y realizaciones de la invención preferidos serán evidentes a partir de la lista siguiente de realizaciones y las reivindicaciones adjuntas.

Breve descripción de los dibujos

20 Los polipéptidos según la invención y métodos para su empleo se describirán a continuación, a modo de ejemplo solamente, con referencia a los dibujos adjuntos, figuras 1-12, en las que:

La figura 1 es una lista de las secuencias de aminoácidos de ejemplos de motivos que se unen a EGFR comprendidas en los polipéptidos que se unen a EGFR (SEQ ID nº 1-163), los ejemplos de polipéptidos que se unen a EGFR (SEQ ID nº 164-326), el derivado de proteína Z del dominio B de la proteína A de Staphylococcus aureus

25 (SEQ ID nº 327), el EGFR humano completo (SEQ ID nº 328) y el dominio extracelular de EGFR humano (SEQ ID nº 329);

la figura 2A muestra las secuencias de diferentes polipéptidos que se unen a EGFR seleccionados en el Ejemplo 1 en comparación con la secuencia de la proteína Z. La figura indica restos de aminoácidos básicos, ácidos, apolares y polares; la figura 2B muestra la secuencia de aminoácidos de cuatro polipéptidos de la figura 2A e indica restos de

30 aminoácidos hidrófobos, neutros e hidrófilos, la figura 2C muestra las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos de la figura 2B con otras características de relieve, y la figura 2D ilustra una estrategia de maduración de la afinidad para la producción de polipéptidos según la invención;

la figura 3 muestra el resultado del análisis SDS-PAGE de polipéptidos que se unen a EGFR His6 -ZEGFR: 942 (carril 1), His6 -ZEGFR: 948 (carril 2), His6-ZEGFR: 955 (carril 3), His6-(ZEGFR: 942)2 (carril 4), His6-(ZEGFR: 948)2 (carril 5) y His65

35 (ZEGFR:955)2 (carril 6). El carril M contiene proteínas marcadoras. A la derecha, la masa molecular se da en kilodaltons.

La figura 4 muestra el resultado de los estudios de unión de biodetectores realizados utilizando diversos polipéptidos de unión a EGFR;

la figura 5 muestra el resultado del análisis citométrico de flujo de la afinidad por EGFR natural de tres polipéptidos 40 que se unen a EGFR;

la figura 6 es una serie de imágenes de microscopia confocal de células expuestas a polipéptidos que se unen a EGFR marcados con fluoróforo;

la figura 7 es un diagrama que muestra el resultado de los estudios de unión celular con polipéptidos radiomarcados que se unen a EGFR;

45 la figura 8 es una serie de gráficos que muestran los resultados de la saturación y estudios con polipéptidos radiomarcados que se unen a EGFR;

la figura 9 muestra el resultado de los estudios de unión a biodetectores realizados utilizando diversos polipéptidos

que se unen a EGFR;

la figura 10 es una serie de imágenes de las células expuestas a polipéptidos que se unen a EGFR, utilizando A) 50 detección fluorescente y B) detección enzimática;

la figura 11 es un diagrama que muestra los resultados de una prueba de especificidad in vitro de conjugados bencil-DTPA marcados con indio-111 de polipéptidos que se unen a EGFR en células A431. Todos los puntos de datos son

valores medios de tres mediciones, y las barras de error representan SEM.

La figura 12 es una serie de diagramas que muestran la biodistribución de conjugados que se unen a 111In-bencil-DTPA-EGFR y relaciones de tejido tumoral a normal en ratones portadores de xenoinjertos A431. Cada punto de datos representa un promedio de cuatro animales ± desviación típica y se expresa en porcentaje de radiactividad

5 inyectada por gramo de órgano o tejido.

En los siguientes experimentos, se utilizó presentación en fagos para seleccionar variantes de proteína Z que se unen a EGFR procedentes del dominio B de la proteína A de Staphylococcus aureus. Las variantes Z que se unen a EGFR se denominan a veces en conjunto ZEGFR. Cada una de las variantes Z se le ha dado un número de identificación único #####, y cada una de las variantes se denominan indistintamente Z ##### y ZEGFR: #####.

10 Ejemplo 1

Primera selección de polipéptidos que se unen a EGFR

Materiales y métodos

Producción de enlazadores de polipéptidos, cepas, vectores y biblioteca de fagómidos

La cepa RRIΔM15 del supresor ámbar de Escherichia coli (Rüther, U. (1982) Nucleic Acids Res., 10, 5765-5772) se

15 utilizó como anfitrión bacteriano para la producción de fagos y el procedimiento de clonación. El vector fagómido pAffi1, y la construcción de la biblioteca de fagómidos, Zlib2002 (3 x 109 miembros), utilizados en este estudio se describen en la Grönwall C., Jonsson A., Lindström S., Gunneriusson E., Stahl S., Herne N.: "Selection and characterization of Affibody ligands binding to Alzheimer amyloid beta peptides", J. Biotechnol. (2006) en prensa, Epub 27 Sep. 2006. Se subclonaron inserciones de fagómidos de los clones seleccionados en los vectores de

20 expresión pAY442 y pAY430, que contiene un activador T7 (Studier et al., (1990) Methods Enzymol., 185, 60-89), un fragmento de ADN que codifica una etiqueta (His6) hexahistidil y un sitio de clonación múltiple, junto con un gen que confiere resistencia a canamicina, así como una cisteína adicional en el terminal C para marcaje directo por pAY430. Se utilizó la cepa BL21 (DE3) de E. coli (Novagen, Madison, Wis.) para la producción de proteínas a partir de los vectores de expresión.

25 Preparación de estirpes de fagos

La preparación de estirpes de fagos de la biblioteca (una parte de Zlib2002) y entre selecciones se llevó a cabo según los procedimientos previamente descritos (Nord, K. et al., (1997) Nat. Biotechnol., 15, 772-777; Hansson et al., (1999) Immunotechnology, 4, 237-252), utilizando el fago cooperador M13K07 (New England Biolabs, Beverly, MA.). La precipitación con PEG/NaCl dio valoraciones de fagos de alrededor de 1013 pfu/ml.

30 Selecciones de fagos

Durante las selecciones (SEQ ID nº 329) se utilizó como proteína diana un dominio extracelular (ECD) recombinado de ~ 100 kDa de EGFR que comprende 623 aminoácidos, correspondiente a los nucleótidos 259-2127. La proteína se biotiniló in vitro utilizando EZ-Link™-Sulfo-NHS-LC-Biotin (Pierce, Rockford, IL.). Se añadió un exceso molar de 20 veces de biotina al EGFR-ECD en solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 10 mM, NaCl 137 mM, pH

35 7,2), y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 1 h. seguido de una diálisis prolongada contra PBS a 4°C para eliminar el excedente de biotina.

La proteína diana biotinilada se inmovilizó a continuación sobre perlas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidin; Dynal A.S., Oslo, Noruega). Para cada ronda de selección, las perlas se lavaron dos veces con PBS enriquecida con 0,1% de Tween-20 (PBST). Para evitar ligantes no específicos, todos 40 los tubos utilizados en este procedimiento se pretrataron con PBST enriquecido con 0,1% de gelatina. Para evitar más ligantes contra la estreptavidina presente en las perlas paramagnéticas, se preincubó la estirpe de fago en PBST enriquecido con 0,1% de gelatina con 0,2 mg de las perlas (previamente lavadas dos veces con PBST para las rondas 1 y 2. La estirpe de fago no unido se somete a continuación a biopanning contra la proteína diana EGFR-ECD durante 1 h 45 min a temperatura ambiente en rotación continua en tambor vertical, seguido de incubación con 45 las perlas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina durante 15 min (temperatura ambiente, rotación continua en tambor vertical). Se llevaron a cabo dos selecciones independientes, con cada dos concentraciones diferentes de la diana decrecientes en cada ronda de panning de la manera siguiente. Para la ronda 1; se incubaron 12 y 1,2 μg de proteína diana con 6 y 0,6 mg de perlas, respectivamente, para la ronda 2; se incubaron 5, 2,5, 0,5, y 0,35 μg de proteína diana con 2,5, 1,25, 0,25, 0,125 mg de perlas, respectivamente, y para las rondas 3 y 4 se incubaron, 5, 1, 50 0,5, y 0,1 μg de proteína diana con 1, 0,5, 0,1, 0,05 mg de perlas, respectivamente. Este procedimiento dio lugar a una inmovilización de ~ 2 μg de proteína diana por mg de perlas, como se determina por análisis SDS-PAGE. Los cuatro rondas de biopanning se realizaron de la manera siguiente. Las perlas se lavaron dos veces con PBST en la ronda 1, cinco veces en la ronda 2, siete veces en la ronda 3 y 10 veces en ronda 4. Los fagos unidos se eluyeron posteriormente con 500 μl de glicina-HCl 50 mM, pH 2,1, durante 10 min a temperatura ambiente, seguido de

55 neutralización inmediata con 50 μl de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 y 450 μl de PBS.

imagen7

Hilden, Alemania) y se hibridaron antes de la ligadura con T4 ADN ligasa (New England Biolabs). Las ligaduras dieron lugar a vectores de expresión denominados pAY442-ZEGFR:no y pAY430-ZEGFR:no , que codifican los diferentes polipéptidos ligantes fusionados a una etiqueta His6 en el terminal N, lo que permite la purificación por cromatografía de afinidad por iones metálicos inmovilizados (IMAC). Todas las preparaciones de plásmidos, después del cultivo de

5 células de E. coli transformadas durante la noche, se realizaron utilizando QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen GmbH) según las instrucciones del fabricante.

Producción y purificación de proteínas

Los polipéptidos ligantes seleccionados se expresaron como proteínas de fusión etiquetadas con His6 de los plásmidos pAY442 y pAY430 en la cepa BL21 (DE3) de E. Coli.

10 Las células se inocularon en 5 ml de medio TSB (30 g/l de caldo de soja tripsínico), que contenía 50 mg/l de canamicina, y se cultivaron en placa de pocillos profundos durante la noche a 37°C a ~ 150 rpm. TSB reciente (5 ml), enriquecido con 5 g/l de extracto de levadura y 50 mg de canamicina, se inoculó con 20 μl de los cultivos de toda la noche y las células se cultivaron a 37°C durante 4 horas, cuando se indujo la expresión génica mediante la adición de β-D-tiogalactósido de isopropilo (IPTG) a una concentración final de 1 mM. Después del cultivo durante la

15 noche a 25°C, se recogieron las células por centrifugación (10.000 g, 10 min) y se lisaron por congelación y descongelación (-80°C, 40 min). Los sedimentos celulares se volvieron a poner en suspensión posteriormente en un tampón de urea (8 M, pH 8,0). Las proteínas de fusión con His6 -ZEGFR se recuperaron por purificación IMAC en columnas Ni-NTA Superflow en condiciones de desnaturalización (Qiagen) usando el robot BR3000. Las proteínas unidas se eluyeron con tampón de urea a pH bajo (8 M, pH 4,5) y se llevó a cabo la renaturalización de las proteínas

20 de fusión purificadas cambiando el tampón a HBS (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM, 0,005% de tensioactivo P20, pH 7,4) en columnas de cromatografía de exclusión por tamaño NAP™-5 (Amersham Biosciences). La concentración de proteínas para los polipéptidos se calculó a partir de mediciones de absorbancia a 280 nm, utilizando el coeficiente de extinción apropiado para cada proteína. Los polipéptidos purificados se analizaron más por SDS-PAGE en geles PhastGel™ homogéneos al 20% utilizando un sistema Phast (Amersham

25 Biosciences, Uppsala, Suecia). Las concentraciones de proteína para variantes ZEGFR seleccionadas también se determinaron por análisis de aminoácidos (Aminosyraanalyscentralen, Uppsala, Suecia).

La figura 3 muestra el análisis SDS-PAGE de los polipéptidos His6 -ZEGFR: 942 que se unen a EGFR expresados y purificados por IMAC-(carril 1), His6-ZEGFR:948 (carril 2), His6-ZEGFR:955 (carril 3), His6-(ZEGFR:942)2 (carril 4), His6(ZEGFR:948)2 (carril 5) e His6-(ZEGFR:955)2 (carril 6). Carril M, proteínas marcadoras con masas moleculares en

30 kilodaltons.

Análisis de biodetectores

Se utilizó un instrumento BIAcore® 2000 (Biacore AB, Uppsala, Suecia) para la interacción bioespecífica en tiempo real (BIA) entre polipéptidos ligantes seleccionados y la proteína diana. EGFR-ECD (diluido en NaAc 10 mM, pH 4,5) se inmovilizó (~2600 RU) sobre la capa de dextrano carboxilado de una superficie de la cubeta de flujo de un chip 35 detector CM5 (Biacore) mediante acoplamiento de aminas, según las instrucciones del fabricante. Otra superficie de la cubeta de flujo se activó y desactivó para ser utilizado como superficie de referencia, y HER2-ECD e IgG humana (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) se inmovilizaron en las superficies de cubetas de flujo separadas en el chip detector CM5, para servir como referencias negativas. Las muestras de todos los polipéptidos ligantes a prueba se diluyeron en el tampón HBS corriente (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM, tensioactivo P20 al 0,005%, 40 pH 7,4) y se filtraron (0,45 μm;. Millipore, Billerica, MA) antes del análisis de unión se realizaron a 25°C. En un primer experimento, ~1 mM de cada polipéptido ligante a prueba (diluido en HBS) se inyectó sobre todas las superficies con un caudal de 20 μl/min. Un polipéptido ligante de 53 aminoácidos no relacionado, que no tiene afinidad por EGFR, se utilizó como referencia negativa, y se inyectaron también el ligando natural hEGF (Chemicon International, Temecula, Calif., EE.UU.) y el anticuerpo monoclonal comercial cetuximab (MERCK Darmstadt, Alemania) como 45 referencias positivas. En un segundo experimento, los polipéptidos ligantes His6 -ZEGFR monomérico e His6-(ZEGFR)2 dimérico se sometieron a análisis cinético, en el que se inyectaron las proteínas sobre una superficie EGFR-ECD a concentraciones que van desde 0,00625 μM a 12,8 μM con un caudal de 30 μl/min. La constante de equilibrio de disociación (KD), la constante de velocidad de asociación (ka) y la constante de velocidad de disociación (kd) se calcularon utilizando programa informático BIAevaluation 3.2 (Biacore), suponiendo una unión uno a uno. Para el 50 segundo experimento, las muestras se pasaron por duplicado en orden aleatorio, y después de cada inyección las cubetas de flujo se regeneraron mediante la inyección de HCl 10 mM. Los resultados de los análisis de clasificación de biodetectores se representan en la Tabla 1 y la figura 4. La Tabla 1 proporciona una comparación de parámetros cinéticos de los polipéptidos ligantes que se unen a EGFR-ECD monovalentes y bivalentes a partir de análisis de biodetectores en BIAcore. Los montajes de polipéptidos diméricos que se une al EGFR se generaron mediante una 55 estrategia de la duplicación de genes, producidos y purificados por afinidad como se describió anteriormente en Steffen et al. Cancer Biother. & Radiofarmaceuticals, 20, 239-248. Un polipéptido adicional, ZEGFR:1239 (identificado como una secuencia en relación con ZEGFR:955), se incluyó después de la secuenciación de otros clones, y se describen los datos sobre su rendimiento como monómero. La constante de equilibrio de disociación proporciona la siguiente clasificación de afinidad de los cuatro ligantes de polipéptidos His6 -ZEGFR: His6-ZEGFR:1239 < His6-ZEGFR: 955 <

60 His6-ZEGFR: 948 < His6-ZEGFR: 942.

Tabla 1

Polipéptido que se une al EFGR: KD a (nM) ka b (M-1 s -1) kd c (s-1)

His6-ZEGFR: 942: ~ 130 ~ 3,0 × 105 ~ 4,0 × 10-2

His6-(ZEGFR:942)2: ~ 30 ~ 6,0 × 105 ~ 1,6 × 10-2

His6-ZEGFR:948: ~ 180 ~ 4,2 × 105 ~ 7,7 × 10-2

His6-(ZEGFR:948)2: ~ 40 ~ 1,9 × 105 ~ 8,1 × 10-3

His6-ZEGFR:955: ~ 190 ~ 6,2 × 104 ~ 1,2 × 10-2

His6-(ZEGFR:955)2: ~ 50 ~ 4,8 × 104 ~ 2,4 × 10-3

His6-ZEGFR:1239: ~ 490 ~ 1,9 × 105 ~ 9,2 × 10-2

a Constante de equilibrio de disociación

b Constante de velocidad de asociación

5 c Constante de velocidad de disociación

Puede verse que a partir de este análisis de unión in vitro, los cuatro polipéptidos que se unen a EGFR se unieron a EGFR con más bien alta afinidad y que diferían algo en sus características cinéticas de unión.

La figura 4A muestra los resultados de sensogramas obtenidos después de la inyección del variantes His6(ZEGFR:942)2 (cuadrados), His6-(ZEGFR:948)2 (triángulos) e His6-(ZEGFR:955)2 ( círculos) purificadas sobre superficies de

10 cubetas de flujo con chip detector que contienen EGFR-ECD acoplado a amina (cuadrados/triángulos/círculos rellenos) o HER2-ECD (triángulos/cuadrados/círculos blancos). Esto demuestra una unión específica de las tres variantes His6-ZEGFR (His6-ZEGFR:942, His6-ZEGFR:948 e His6-ZEGFR:955) a las superficies de cubetas de flujo inmovilizadas por EGFR-ECD, mientras que no se observa ninguna unión a la superficie de la cubeta de flujo inmovilizada por HER2-ECD.

15 La figura 4B muestra los resultados de sensogramas obtenidos después de la inyección de polipéptidos que se unen a EGFR monovalentes (línea más clara) y la bivalentes (línea más oscura) sobre una superficie de cubetas de flujo de EGFR-ECD. El diagrama muestra los tres ligantes candidatos, donde se demuestra la diferencia en la velocidad de disociación entre los polipéptidos que se unen a EGFR monovalentes y bivalentes, lo que demuestra que la mejora de afinidad aparente por efecto de la avidez se consiguió al obtener principalmente una velocidad de

20 disociación más lenta en los clones de segunda generación.

Cultivo celular

Para los estudios de marcaje con fluoróforo FACS y microscopia confocal a continuación, células cancerosas A431 epiteliales humanas (European Collection of Cell Cultures, Wiltshire, Reino Unido), conocidas por expresar ~2 × 106 EGFR por célula, se cultivaron en medio enriquecido, que contenía medio EMEM enriquecido con 10% de suero de

25 ternera fetal, L-glutamina 2 mM, 1% de aminoácidos no esenciales y 1% de antibiótico-antimicótico, todos de Gibco (Invitrogen AB). Las células se cultivaron a 37°C en aire humidificado que contenía 5% de CO2.

Marcaje con fluoróforo

Los polipéptidos ligantes His6-(ZEGFR:942)2), His6-(ZEGFR:948)2 e His6-(ZEGFR:955)2 se marcaron directamente con la cisteína introducida (en el terminal C) con Oregon Green® 488 maleimide (Molecular Probes). Aproximadamente 1 30 mg de polipéptido ligante His6-(ZEGFR)2 se volvió a poner en suspensión en PBS y se redujo con DTT 20 mM durante 45 min a 37°C. El excedente de TDT se separó en una columna de exclusión por tamaño NAP™-5 (Amersham Biosciences) equilibrada con PBS. Se añadió una solución 10 mM de Oregon Green 488 maleimida en exceso molar de 20 veces y se mantuvo en la oscuridad durante 2 horas a temperatura ambiente con agitación continua. Se realizó diálisis exhaustiva contra PBS para eliminar el exceso de fluoróforo. La concentración y el rendimiento del

35 marcaje de los polipéptidos ligantes marcados con fluoróforo a prueba se realizaron por medio de cálculos según el protocolo del fabricante utilizando mediciones de absorbancia a 280 y 496 nm. Los polipéptidos ligantes marcados se analizaron también en un gel al 20% SDS-PAGE PhastGel™ homogéneo usando un sistema Phast (Amersham Biosciences).

FACS

Los análisis de citometría de flujo se realizaron en un instrumento de citometría de flujo de corriente de aire FACS Vantage SE (BD Biosciences, San José, CA, EE.UU.). El láser se alineó usando perlas de alineación de citometría de flujo para 488 nm (Molecular Probes, Leiden, Países Bajos). Las muestras se iluminaron con un láser de argón 5 refrigerado por aire (488 nm).La fluorescencia, la luz delantera dispersada y lateral dispersada procedente de 10.000 células se detectaron a una velocidad de aproximadamente 300 casos s-1. Los datos de citometría de flujo se analizaron con el programa informático CellQuest (BD Biosciences). Antes de los análisis citométricos de flujo, las células sembradas en placas de Petri ~3 días antes de experimento se tripsinaron (tripsina al 0,25%, 37°C, 10 min). Se centrifugaron las células (582 g, 3 min) y el sedimento se volvió a poner en suspensión en PBS + 1% de BSA, y

10 se tomaron alícuotas a ~300.000 células por pocillo en una placa de 96 pocillos. Las células se incubaron con 10 μg/ml de polipéptido ligante marcado con fluoróforo His6-(ZEGFR)2 durante ~ 30 min en hielo. Después de centrifugación y lavado con PBS + 1% de BSA el sedimento celular se volvió a poner en suspensión en 300 μl de PBS + 1% de BSA y se sometió a análisis de citometría de flujo. Un polipéptido similar (montaje dimérico etiquetado con His6) que no tiene capacidad de unión para EGFR se utilizó como referencia negativa.

15 Los resultados de estos estudios se muestran en la figura 5. Específicamente, la figura 5 muestra un análisis de citometría de flujo que demuestra una clasificación de afinidad por los tres ligantes candidatos His6-(ZEGFR:942)2, His6-(ZEGFR:948)2 e His6-(ZEGFR:955)2 hacia EGFR natural en células A431. Una molécula variante Z no relacionada, utilizada como referencia negativa (blanco), se coloca en el extremo izquierdo en el histograma. Los tres ligantes ZEGFR se colocan entonces en el orden His6-(ZEGFR:942)2 (gris claro) < His6-(ZEGFR:948)2 (gris) < His6-(ZEGFR:955)2

20 (negro). Estos datos sugieren que ZEGFR:955 puede ser el mejor candidato de los tres, a pesar de su afinidad algo más deficiente en BIAcore, ya que el ensayo se basa en la unión de EGFR natural en células.

Microscopio confocal

Se sembraron aproximadamente 300.000 células A431 por placa de Petri de 30 mm el día antes del experimento. Los polipéptidos ligantes His6-(ZEGFR:942)2, His6-(ZEGFR:948)2 e His6-(ZEGFR:955)2 a prueba se diluyeron 25 hasta aproximadamente 10 μg/ml en medio EMEM completo, añadido para separar de las placas de Petri y se incubaron en la oscuridad durante 2 horas a 37°C. Los tres polipéptidos ligantes a prueba se diluyeron también como anteriormente en medio EMEM exento de suero, añadido para separar de las placas de Petri y se incubaron en la oscuridad 1 hora en hielo. Después de la incubación las células se lavaron una vez con medio normal y se añadió algo de medio para el análisis por imágenes en un microscopio confocal (LSM 5 Pascal; Zeiss). Se realizaron

30 exploraciones consecutivas para cubrir el espesor de la célula y se eligió un análisis que representa el centro de la célula. Como referencia negativa, se analizó de la misma manera un polipéptido similar que no tiene afinidad por EGFR.

Los resultados de la microscopia confocal se muestran en la figura 6. Específicamente, la figura 6 muestra imágenes de microscopia confocal de células A431 expuestas al polipéptido His6-ZEGFR marcado con Oregon Green para A) 1

35 hora en hielo y B) 2 horas en 37°C. De izquierda a derecha, His6-(ZEGFR:942)2, His6-(ZEGFR:948)2 e His6-(ZEGFR:955)2 se ven membranas celulares unidas en (A) e internalizadas en (B). Los resultados demuestran que los tres polipéptidos que se unen a EGFR parecen, como era de esperar, unirse a la membrana celular, y esta internalización parece ocurrir en la incubación a 37°C.

Cultivo celular

40 Para los estudios de radiomarcaje, especificidad y saturación a continuación ,se cultivaron células en frascos de cultivo de 75 cm2 y en placas de 24 pocillos (Nunclon surface, Dinamarca). Para el procedimiento de marcaje, se utilizaron 125I (Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia), ácido acético (Merck Darmstadt, Alemania), cloramina-T (Sigma, EE.UU.), metabisulfito de sodio (Aldrich, EE.UU.) y N-succinimidil-4-[tri-metilestannil] benzoato. Se aplicó la columna NAP-5 (Sephadex G-25, Amersham Biosciences, Uppsala, Suecia) para la filtración en gel. Las células se

45 desprendieron con tripsina-EDTA (0,25/0,02%) (Biochrom Kg) y se contaron en un contador de células (Beckman Coulter Z2, Fullerton, Calif., EE.UU.). Se midió la radiactividad con un contador gamma (1480 Wizard, Wallac Oy, Turku, Finlandia). Se utilizó la estirpe celular A431 de carcinoma epidermoide rica en EGFR (ATCC, CLR 1555, Rocksville, Md., EE.UU.). Las células se cultivaron en medio F-10 de Ham enriquecido con L-glutamina (Biochrom Kg 2 mM, Berlin, Alemania), PEST (100 UI/ml de penicilina y 100 mg/ml de estreptomicina) y suero de ternera fetal al

50 10% (Biochrom Kg) ("medio completo"). Las células se cultivaron a 37°C en una incubadora con aire humidificado equilibrado con 5% de CO2.

Radiomarcaje

125I

Los dímeros de los polipéptidos ligantes ZEGFR: 942, ZEGFR: 948 y ZEFGR: 955 se marcaron indirectamente con mediante grupos N-succinimidilo. Se añadió ácido acético (2 μl, ácido acético al 0,1% en milli-Q) y N-succinimidil-4

55 [tri-metilestannil] benzoato (5 μl, ácido acético al 5% en metanol) al 125I (15 MBq). El yodo se acopló al Nsuccinimidil-4-[tri-metilestannil] benzoato añadiendo 10 μl de cloramina-T. La solución se volvió a poner en suspensión a continuación durante 30 segundos y se incubó más a temperatura ambiente durante 5 minutos. Para detener la reacción, se añadieron 15 μl de metabisulfito de sodio. Los polipéptidos ligantes se diluyeron en tampón

de borato y se añadieron a la solución de yodo y se añadió más tampón de borato hasta un volumen total de 150 μl, después de lo cual la solución se incubó durante 30 minutos. Para separar los polipéptidos ligantes marcados de los compuestos de bajo peso molecular, se utilizó una columna NAP-5 equilibrada con PBS.

Prueba de especificidad

5 Se cultivaron células A431 en placas de 24 pocillos y se lavaron una vez con medio F-10 de Ham exento de suero. Los tres polipéptidos ligantes diméricos que se están probando se marcaron con 125I y se añadieron a las células con un exceso molar de aproximadamente 10:1 en relación con el número de receptores disponibles y se incubaron a 37°C durante 4 horas. En algunos pocillos se añadieron polipéptidos ligantes no marcados (exceso molar de aproximadamente 500:1) junto con ligantes de [125I]polipéptido para determinar la unión inespecífica. Se

10 utilizaron de la misma manera EGF (exceso molar de aproximadamente 200:1) y cetuximab (exceso molar de 500:1), pero para investigar si los polipéptidos ligantes tienen el mismo punto de unión que EGF y cetuximab. Las células se lavaron 6 veces a continuación con medio F-10 de Ham exento de suero y se desprendieron añadiendo 0,5 ml de tripsina-EDTA y se incubaron a 37°C durante 30 min o hasta que se desprendieron las células. Se añadió 1 ml de medio completo F-10 de Ham y se volvieron a poner en suspensión las células. En algunos pocillos se utilizó

15 una suspensión de 0,5 ml para contar las células. Se midió la radiactividad (1,5 ml y 1 ml, respectivamente, de las células que se contaron) con un contador gamma.

Los resultados se presentan en la figura 7. En concreto, en la figura 7, se muestra la unión de celular de [125I] (Z00942)2 (42*), [125 I] (Z00948)2 (48*) y [125I] (Z00955)2 (*55). Los datos apoyan los resultados inesperados de la clasificación FACS previa de los ligantes lo que indican que ZEFGR:955 parece ser el mejor ligante de EFGR natural

20 en las células, seguido de ZEGFR:948 y ZEGFR:942 a pesar del hecho de que (ZEGFR: 942)2 presentó la mayor afinidad en el análisis BIAcore. Además, los tres montajes de polipéptidos que se unen a EGFR parecen unirse a epítopos superpuestos. Por otra parte, parece que todos compiten por el mismo sitio de unión que el ligando natural EFG y el anticuerpo monoclonal cetuximab.

Ensayo de saturación

25 Para determinar la constante de afinidad, se determinó la saturación del enlace del polipéptido ligante. La estirpe celular A431 rica en EGFR se cultivó en placas de 24 pocillos. Las células se mantuvieron en hielo y se lavaron una vez en medio F-10 de Ham frío exento de suero. Se preparó una serie de dilución de los polipéptidos diméricos ligantes marcados con 125I y se añadió a las células con un exceso molar de aproximadamente 10:1. Se incubaron las células durante 4 horas, durante el movimiento lento, en hielo en un ambiente donde el aire procedente de una

30 incubadora estaba atrapado dentro de una bolsa de plástico junto con la placa celular. Para cada concentración había también un control bloqueado que contenía polipéptidos ligantes no marcados con un exceso molar de aproximadamente 300:1 para estimación de uniones inespecíficas. Las células se lavaron 6 veces a continuación en medio F10 de Ham frío exento de suero y se desprendieron las células añadiendo 0,5 ml de tripsina-EDTA y se incubaron a 37°C durante 30 min o hasta que se desprendieron las células. Se añadió 1 ml de medio F-10 completo

35 de Ham y se volvieron a poner en suspensión las células. En algunos pocillos se utilizó 0,5 ml de suspensión para contar las células. La radiactividad se midió con un contador gamma. Los datos se analizaron mediante GraphPad Prism 4.

Los resultados se muestran en la figura 8. En concreto, en la figura 8 se muestran los resultados de los estudios de saturación de [125I] Z00942 (A), [125I] Z00948 (B) y [125I] Z00955 (C). Se muestran los valores medios y las

40 desviaciones típicas de tres valores.

Ejemplo 2

Segunda selección de polipéptidos que se unen al EGFR

Materiales y métodos

Cepas y vectores

45 La cepa RRIΔM15 de Escherichia coli supresora ámbar (Rüther, U. (1982) Nucleic Acids Res. 10, 5765-72) se utilizó para la construcción de bibliotecas, como anfitrión bacteriano para la producción de fagos y para el procedimiento de clonación. El vector pAffi1 fagómido se utilizó para la construcción de bibliotecas y se describe en otro lugar (Grönwall C., Jonsson A., Lindström S., Gunneriusson E., Stahl S., Herne N.: "Selection and characterization of Affibody ligands binding to Alzheimer amyloid beta peptides", J. Biotechnol. (2006) en prensa,

50 Epub 27 Sep. 2006). Se subclonaron inserciones de fagómidos de los clones seleccionados en los vectores de expresión pAY442, que contenían un activador T7 (Studier et al., (1990) Methods Enzymol. 185, 60-89), un fragmento de ADN que codifica una etiqueta (His6) de hexahistidil y un sitio de clonación múltiple, junto con un gen que confiere resistencia a la canamicina. La cepa BL21 (DE3) de E. coli (Novagen, Madison, Wis.) se utilizó para la producción de proteínas a partir de los vectores de expresión.

55

Construcción de una biblioteca secundaria de fagómidos

Una estrategia para la maduración de la afinidad se decidió en base a la alineación de cuatro secuencias de la primera selección de moléculas que se unen a EGFR (Ejemplo 1, figura 2). La biblioteca secundaria fue creada por amplificación por PCR a partir de un único oligonucleótido de la plantilla de 129 nucleótidos con determinados 5 codones degenerados (5' ctc gag gta gac aac aaa ttc aac aaa gaa nnk nnk nnk gcg nnk nnk gag atc mry mry tta cct aac tta aac ggt tgg caa atg acc gcc ttc atc gcg agt tta kyt gat gac cca agc caa agc 3'), que codifican las hélices 1 y 2 de la proteína Z. El fragmento del gen se amplificó usando el cebador directo 5'cccccccccctcgaggtagacaacaaattcaa-3' (zona de XhoI subrayada) y el cebador inverso 5'cccccctgctagcaagttagcgctttggcttgggtcatc-3' (zona de NheI subrayada), con 1 pmol de oligonucleótido de la plantilla 10 para cada una de 95 reacciones paralelas. La amplificación se realizó utilizando AmpliTaq Gold polimerasa (Applied Biosystems, Foster City, CA) durante 15 ciclos (15 segundos a 96ºC, 15 segundos a 60°C y 1 minuto a 72°C), se agruparon, se purificaron utilizando QIAquick PCR Purification kit (Qiagen, Hilden, Alemania), XhoI/NheI digerido y ligado al vector pAffi1 fagómido digerido con XhoI/NheI que codifica la tercera hélice α no abigarrada de la proteína

Z. El vector ligado de la biblioteca se extrajo con fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (25:24:21 v/v) (Invitrogen). Se

15 transformaron células RRIΔM15 electrocompetentes de Escherichia coli con 30 alícuotas de de material ligado utilizando cubetas de 0,2 cm de tamaño de abertura en una serie de ECM 630 (BTX, Genetronics) a 2.500 V, 125 Ω y 50 μF. Las células se cultivaron en medio SOC (caldo de soja tripsínica (TSB) + extracto de levadura (YE) enriquecida con 1% de glucosa, 10 mmol/l de MgCl2, 10 mmol/l de MgSO4, 10 mmol/l de NaCl y 2,5 mmol/l de KCl ) durante ~ 1 h a 37°C y se transfirió a seis matraces Erlenmeyer, que contenía cada uno 1 l de TSB enriquecido con

20 2% de glucosa y 25 μg/ml de carbenicilina y se cultivó durante la noche a 37°C. Las células se centrifugaron a 6000 g (15 min, 4°C), después de volver a poner en suspensión en solución de PBS/glicerol a una concentración final aproximada de 20% de glicerol, se dividió en alícuotas y se almacenaron a -80°C.

Procedimientos de selección de fagos

Se utilizó como proteína diana un dominio extracelular biotecnológico de EGFR de ~ 100 kDa (denominado EGFR

25 ECD) durante las selecciones (1095-ER; R & D Systems). El EGFR-ECD se biotiniló in vitro utilizando EZ-Link™Sulfo-NHS-LC-LC-Biotina (Pierce, Rockford, Ill., EE.UU.). Se añadió un exceso molar de 20 veces de biotina a EGFR-ECD en solución salina tamponada con fosfato (PBS; fosfato 10 mM, NaCl 137 mM, pH 7,2), y la mezcla se incubó a temperatura ambiente (T.A.) durante 1 h seguido de diálisis exhaustiva contra PBS durante la noche (ON) a 4°C para eliminar el exceso de biotina.

30 Se realizó la preparación de las estirpes de fagos de la biblioteca y entre selecciones conforme a los procedimientos previamente descritos (Nord, K et al., (1997) Nat. Biotechnol., 15, 772-777; Hansson et al., (1999) Immunotechnology, 4, 237-252), utilizando el fago cooperador M13K07 (New England Biolabs, Beverly, MA., EE.UU.). La precipitación con PEG/NaCl produjo valores de fagos de aproximadamente 1013 unidades formadoras de fagos (pfu) por ml. La selección se llevó a cabo en solución y los fagos unidos se capturaron en perlas

35 paramagnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynabeads M-280 Streptavidin; Dynal, Oslo, Noruega). Para evitar ligantes inespecíficos se trataron previamente todos los tubos con PBST (Tween-20 al 0,1% en PBS) enriquecido con 5% de albúmina de suero bovino (PBST-5% de BSA). Para evitar nuevos ligantes contra la estreptavidina presente en las perlas paramagnéticas recubiertas con estreptavidina se preincubó ~ 1 ml de la estirpe del fago en PBST-3% de BSA (30 min, rotación en tambor vertical) con 0,2 mg de las perlas de las dos primeras rondas de

40 selección.

Se realizaron cuatro rondas de biopanning partiendo de las concentraciones objetivo de 100 nM de la manera siguiente. En la 1ª ronda, una alícuota de la biblioteca que contenía aproximadamente 1012 pfu se incubó en 1 ml de 100 nM de EGFR-ECD biotinilada en PBST-3% de BSA durante 1 h a T.A. con rotación continua, seguido de ~72 horas a 4°C. Para la 2ª ronda, se incubó 50 nM y para la 3ª ronda, 1 nM EGFR-ECD de biotinilada en 1 ml de PBST45 3% de BSA, respectivamente (1 h, T.A., la rotación continua en tambor vertical) con una parte de la estirpe del fago de la ronda anterior. Los fagos unidos se capturaron por incubación con Dynabeads M-280 recubiertas de estreptavidina durante 15 min (T.A., rotación continua en tambor vertical). Se añadió la cantidad de perlas que permite una inmovilización de ~ 2 μg de la proteína diana por mg de perlas, determinada previamente por análisis de SDS-PAGE (datos no mostrados). Para la 4ª ronda, se realizaron seis protocolos de selección ligeramente 50 diferentes, como se detalla a continuación en la Tabla 2. En los protocolos 4-A y 4-B, 0,01 nM y 0,1 nM de EGFR-ECD biotinilado, respectivamente, se incubó durante 2 h a T.A. con una parte de la estirpe del fago de la ronda anterior, seguido de incubación con un exceso de 100 veces de EGFR-ECD durante 1 h a T.A., captura de los fagos unidos por incubación con perlas recubiertas con estreptavidina durante 15 min, lavado 18 veces, incubación con un exceso de 100 veces de de ligantes de EGFR de la primera generación Z00942, Z00948 y Z00955 (Ejemplo 1) 55 durante 1 hora a T.A., y por último se lavó dos veces. En el protocolo 4-C, EGFR-ECD biotinilado 0,5 nM se incubó durante 2 h a T.A. con una parte de la estirpe del fago de la ronda anterior, seguido de la captura de los fagos unidos por incubación con perlas recubiertas con estreptavidina durante 15 min, lavado 18 veces, incubación con un exceso de 100 veces de ligantes de EGFR de primera generación durante 1 h a T.A., y por último se lavaron dos veces. En los protocolos 4-D y 4-E, EGFR-ECD biotinilado 0,1 y 0,5 nM, respectivamente, se incubó durante 2 h a 37°C con 60 una parte de la estirpe del fago de ronda anterior, seguido de incubación con un exceso de 100 veces de EGFR-ECD durante 1 h a 37°C., captura de fagos unidos por incubación con perlas recubiertas con estreptavidina durante 15 min, lavado 18 veces, incubación con un exceso de 100 veces de ligantes de EGFR de primera generación

durante 1 hora a 37°C, y por último se lavaron dos veces. En el protocolo 4-F, se incubó EGFR-ECD biotinilado 0,1 nM durante 2 h a T.A. con una parte de la estirpe del fago de ronda anterior, seguido de la captura de los fagos unidos por incubación con perlas recubiertas con estreptavidina durante 15 min y 20 lavados . El número de etapas de lavado se mantuvo constante a 20 lavados durante el procedimiento de selección y se realizó en PBST-BSA al 5 3% en todas las etapas de lavado, excepto en el último lavado, donde se usó PBST. Los fagos se eluyeron con 500 μl de glicina 50 mM en HCl (pH 2,1) durante 10 min, seguido de neutralización inmediata por adición de 50 μl de Tris-HCl 1 M, pH 8,0 y 450 μl de PBS. Los fagos eluidos se utilizaron para infectar células RRIΔM15 en fase logarítmica durante 30 min a 37°C. Las suspensiones de células infectadas se extendieron sobre placas TYE de agar-agar (15 g/l de agar-agar, 3 g/l de NaCl, 10 g/l de triptona y 5 g/l de extracto de levadura), enriquecidas con 10 glucosa al 2% y 100 mg/l de ampicilina, y se incubaron durante la noche a 37°C. Las colonias cultivadas se recogieron por resuspensión en caldo de soja tripsínica (TSB, 30 g/l; Merck, Darmstadt, Alemania), enriquecido con 5 g/l de extracto de levadura, glucosa al 2% y 100 mg/l de ampicilina, y se utilizó una fracción (~ 500 veces de células en exceso en comparación con el valor de fagos después de la elución) para inoculación, lo que lleva a la generación siguiente de la estirpe del fago. Se rescataron partículas de fagómido de las células infectadas usando el

15 fago M13K07 cooperador, se purificaron y concentraron con precipitación con PEG. El proceso de selección se supervisó por valoración de las estirpes de fagos antes de cada selección y después de la elución. Se dejó que una dilución en serie de fagos infectara células RRIΔM15 en fase logarítmica durante 5 min a T.A., seguida de siembra en placas TYE de agar-agar, enriquecidas con glucosa al 2% y 100 mg/l de ampicilina, y ON a 37°C.

Tabla 2

20 Protocolos para la ronda 4 de selección

4-A: 4-B 4-C 4-D 4-E 4-F

Incubación con bio-EGFR: 2 h, T.A. 2 h, T.A. 2 h, T.A. 2 h, 37°C 2 h, 37°C 2 h, T.A.

Incubación con EGFR (exceso de 100 veces): 1 h, T.A. 1 h, T.A. - 1 h ,37°C 1 h, 37°C -

Captura de fagos unidos en perlas recubiertas de estreptavidina: 15 min 15 min 15 min 15 min 15 min 15 min

Lavar: 1-18 1-18 1-18 1-18 1-18 1-20

Incubación con ligantes de primera generación (exceso de 100 veces): 1 h, T.A. 1 h, T.A 1 h, T.A. 1 h, 37°C 1 h, 37°C -

Lavar: 19-20 19-20 19-20 19-20 19-20 -

Clasificación basada en ELISA de ligantes de segunda generación

Se inocularon colonias aisladas en 1 ml de medio TSB-YE enriquecido con 100 μmol/l de isopropil-L-tio-β-D

galactopiranósido (IPTG) y 100 μg/ml de ampicilina en placas de pocillos profundos (Nunc, Roskilde, Dinamarca), y 25 se cultivaron durante la noche a 37°C. Las células se sedimentaron por centrifugación a 3.000 g durante 10

minutos. Los sedimentos se volvieron a poner en suspensión en 300 μl de PBST y se congelaron durante la noche a

-80°C. Las muestras se descongelaron y centrifugaron a 3.500 g durante 20 minutos. Los sobrenadantes (100 μl),

que contienen moléculas de variantes Z etiquetadas con ABD se cargaron en pocillos de microvaloración, que se

habían recubierto previamente con 6 μg/ml de HSA (A-3782, Sigma) en 15 mmol/l de Na2CO3 y 35 mmol/l de 30 NaHCO3 (pH 9,6) ON a 4°C y se bloquearon con 2% de leche desnatada en polvo en PBST durante 1 hora a T.A.

(agitación continua). Las placas se lavaron cuatro veces con PBST antes de la adición de 50 μl de 8,4 mg/ml de

EGFR-ECD biotinilado por pocillo y se incubaron durante 1,5 h. Después de lavar los pocillos cuatro veces con

PBST, se añadieron 50 μl por pocillo de estreptavidina-peroxidasa de rábano picante (1:5.000, DAKO Cytomation,

Dinamarca) y se incubó durante 1 h. Los pocillos se lavaron cuatro veces y se añadieron 50 μl a cada pocillo de 35 solución de revelado ImmunoPure TMB substrate kit (Pierce). Después de 30 min se añadieron a cada pocillo, 100 μl

de solución de interrupción (H2SO4 2 M). Se midió la absorbancia a 450 nm con un espectrofotómetro Tecan

Sunrise.

Secuenciación del ADN y agrupamiento de secuencias

La secuenciación del ADN de inserciones de fagómidos (pAffi1) se llevó a cabo en 187 clones que se unen a EGFR 40 de la cuarta ronda de panning. Se utilizaron cebadores específicos y terminador Big Dye (Amersham Biosciences,

Uppsala, Suecia) y se analizaron los fragmentos de Sanger en un secuenciador de ADN ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA., EE.UU.). Los fragmentos de ADN subclonados se verificaron por el mismo procedimiento. Las secuencias de los polipéptidos que se unen a EGFR se agruparon utilizando el método denominado de agrupación jerárquica de promedio de afinidad descrito con más detalle por Orlova et al. ( Cancer

5 Res. 66, 4339-48 (2006)).

Las secuencias de aminoácidos deducidas de polipéptidos candidatos que presentan enlace a EGFR en la detección por ELISA descrita en el apartado anterior son ejemplos de polipéptidos que se unen a EGFR. Se presentan en la figura 1 y en la lista de secuencias como SEQ ID nº 174-nº 309. Las secuencias del correspondiente motivo que se une al EGFR de cada uno de dichos polipéptidos de unión se presentan en la figura 1 y en la lista de secuencias

10 como SEQ ID nº 11-nº146.

Detección sistemática de polipéptidos que se unen a EGFR con Biacore

Los sobrenadantes celulares que contienen variantes Z etiquetadas con ABD producidas a partir del vector pAffi de fago preparado para ELISA se sometieron también a un análisis por biodetector. Los sobrenadantes de 54 clones que demuestran buena unión en ELISA se analizaron con interacción bioespecífica en tiempo real en un instrumento 15 Biacore® 2000. La proteína diana EGFR-ECD (diluida en NaAc 10 mM, pH 4,5) se inmovilizó (~1.200 RU) sobre la capa de dextrano carboxilado de una superficie de la cubeta de flujo de un chip detector CM5 (Biacore) mediante acoplamiento de aminas, según las instrucciones del fabricante. Se activó y se desactivó otra superficie de una cubeta de flujo para ser utilizada como superficie de referencia y HSA se inmovilizó sobre una superficie de una cubeta de flujo aparte en el chip detector CM5, para servir como referencia de la cantidad de variante Z etiquetada

20 con ABD que se expresó. También se utilizó como referencia un ligante de EGFR de primera generación, (Z00955)2 del ejemplo 1.

Montajes de ADN

Fragmentos de ADN que codifican diferentes variantes de variantes Z (ZEGFR) que se unen a EGFR de segunda generación se subclonaron en los vectores de expresión pAY442. Los fragmentos se amplificaron en el vector pAffi1 25 con cebadores específicos que introducen un saliente AccI tanto 3' como 5', y se ligaron en el vector pAY442, previamente restringido con la misma enzima y se desfosforiló utilizando fosfatasa alcalina de intestino de ternera (CIAP; Fermentas, Ontario, Canadá). Los fragmentos de ADN amplificados se purificaron con QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania) y se hibridaron antes de la ligadura con T4 ADN ligasa (New England Biolabs, Ipswich, MA., EE.UU.). Las ligaduras dieron lugar a vectores de expresión que codifican, bajo el 30 control del activador de T7, las diferentes variantes Z fusionadas a una etiqueta His6 en el terminal N, lo que permite la purificación por cromatografía de afinidad en iones metálicos inmovilizados (IMAC). Se construyeron montajes de dímeros de las variantes Z que se une al EGFR de ambos vectores, donde un segundo fragmento génico de la variante Z se introdujo cabeza con cola, dando lugar a variantes de His6-(ZEGFR)2. Todas las preparaciones de plásmidos se llevaron a cabo, después del cultivo de células de E. coli transformadas durante la noche, realizado

35 utilizando QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen GmbH) según las instrucciones del fabricante.

Expresión y purificación de proteínas

variantes Z seleccionadas que se unen a EGFR se expresaron como proteínas de fusión etiquetadas con His6 en el plásmido pAY442 en la cepa BL21 (DE3) de E. Coli. Las células se inocularon en 25 ml de medio TSB (30 g/l de caldo de soja tripsínica) enriquecido con 5 g/l de levadura (TSB+YE) y 50 mg/l de canamicina y se cultivaron a 37°C 40 en matraces con agitación. TSB + YE reciente que contenía 50 mg/l de canamicina se inoculó con precultivo a DO600 ~ 0,06 y se cultivó 3 h a 37°C en un fermentador por lotes, cuando se provocó la expresión génica por adición de isopropil-L-tio-β-D-galactopiranósido (IPTG; Apolo Scientific Ltd., Bradbury, UK) a una concentración final de 0,5 mM. Después de 5 h de cultivo se recogieron las células por centrifugación (15.000 g, 20 min). Los sedimentos celulares se congelaron durante la noche, se descongelaron y se volvieron a poner en suspensión en tampón de 45 desnaturalización (urea 7 M, NaH2PO4 100 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 8,0). Después de la incubación a T.A. durante 30 min las células se centrifugaron a 25.000 g durante 15 min y la proteína desnaturalizada del sobrenadante se diluyó en tampón de desnaturalización (urea 7 M, NaH2PO4 100 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 6,3) y se aplicó a una columna Ni-NTA Superflow (Qiagen). La proteína unida se eluyó con tampón de urea (urea 8 M, NaH2PO4 100 mM, Tris-HCl 10 mM, pH 4,5). Las proteínas se aplicaron a una columna PD-10 (GE Healthcare) y se eluyó con PBS (pH 50 7,4). Las proteínas monoméricas se denominan en adelante ZEGFR:no (vector pAY442) y las proteínas diméricas se denominan (ZEGFR:no)2 ( vectorpAY442). Las concentraciones de proteínas se calcularon a partir de mediciones de absorbancia a 280 nm, utilizando el coeficiente de extinción apropiado para cada proteína. Para confirmar la pureza y la masa molecular correcta de la proteína se extendieron en un gel de SDS-PAGE (NuPAGE al 4-12% Bis-Tris gel; Invitrogen), y en HPLC-MS (HPLC-MS1100; Agilent Technologies). Las proteínas purificadas se analizaron más por 55 DC, donde se registraron los espectros de DC de 16 variantes Z que se unen a EGFR usando un espectropolarímetro Jasco-810. Todos los montajes se diluyeron con PBS a una concentración final de 0,5 mg/ml y se colocaron 200 μl de cada muestra en una cubeta de 1 mm y se analizaron desde 195 a 250 nm a 20°C. Se examinó la estabilidad térmica aplicando un gradiente de temperatura de 20 a 90°C a una longitud de onda fija de 220 nm. El punto de fusión, definido como la temperatura a la que se despliega el 50% de la proteína, se interpretó a 60 partir de los espectros de desplegamiento térmico. Las concentraciones de proteína para variantes ZEGFR

imagen8

imagen9

imagen10

La figura 10B muestra criosecciones de xenoinjertos A431 teñidas con a) His6-(Z01864)2-Cys, b) His6-Z01877, c) His6-(Z01853)2-Cys y d) His6-(Z01907)2-Cys. His6-(Z01864)2-Cys, e His6-Z01877 (a y b) se detectaron con anticuerpos de cabra contra Z seguido de detección con anticuerpos anti-cabra conjugados a HRP. Las moléculas His6-(Z01853)2-Cys (c) e His6-(Z01907)2-Cys (d) se conjugaron directamente a HPR. Como referencia positiva, A431 se tiñeron con un anticuerpo anti-EGFR (e).

111

Especificidad y biodistribución de variantes Z que se unen a EGFR marcado con In

Todos los conjugados de variantes Z se lograron marcar con indio-111 con rendimientos mayores del 90%, y después de la purificación con NAP-5, todos los conjugados tenían una pureza superior al 95%.

La especificidad de unión de los conjugados marcados se evaluó en la estirpe celular A431 de carcinoma epidermoide que expresa EGFR. Los resultados se muestran en la figura 11. En la figura, todos los puntos de datos son valores medios de tres mediciones, y las barras de error representan SEM. La unión de todos los conjugados se vio que era específica de EGFR (véase la figura 11), ya que era posible bloquear la absorción por adición de un exceso de 100 veces de ZEGFR no marcado (p <0,0001).

Los resultados de biodistribución para conjugados de variantes Z marcados con indio-111 4 h p.i. en de tumor A431 se resumen en la figura 12. En la figura, cada punto de datos representa un promedio de cuatro animales ± desviación típica y se expresa en porcentaje de radiactividad inyectada por gramo de órganos o tejidos. Erika Nordberg (Ciencias Biomédicas de radiación, Universidad de Uppsala), en colaboración con Affibody AB (VINNOVA) obtuvieron los datos de 111In-CHX-DTPA (ZEGFR: 955)2 y se incluyen para comparación.

La focalización del tumor in vivo se logró con los cinco nuevas variantes Z en el nivel de 4-6% de IA/g, pero no mejoró en comparación con el dímero no madurado (4% de IA/g).

Las principales diferencias entre el dímero de primera generación (Z00955)2 y todos los monómeros madurados pudieron observarse en la depuración de la sangre, la absorción hepática y la acumulación renal: para los nuevos monómeros seleccionados en el experimento de maduración, la concentración de radiactividad en sangre fue mayor, la absorción hepática fue menor y la absorción renal fue mayor que para (Z00955)2. Muy probablemente, estas observaciones están relacionadas: los nuevos monómeros tienen un enlace más débil a los receptores EGFR en el hígado, debido a la menor reactividad cruzada a receptores murinos y/o debido al enlace monovalente al receptor, que no provoca la internalización y el enlace es reversible.

Ejemplo 3

Tercera selección de polipéptidos que se unen a EGFR según la invención

Basándose en un análisis estadístico de los resultados de la selección del ejemplo 2, se preparó una tercera biblioteca de supuestos polipéptidos que se unen a EGFR esencialmente como se ha descrito anteriormente. Después de la selección de presentación en fagos utilizando EGFR como objetivo y detección por ELISA de las variantes seleccionadas, se identificaron 17 secuencias más de variantes de Z que se unen a EGFR. Sus secuencias de aminoácidos se presentan en la figura 1 y en la lista de secuencias como SEQ ID nº 310nº 326. Los motivos de unión a EGFR deducidos de estas variantes Z que se unen a EGFR se presentan en la figura 1 y en la lista de secuencias como SEQ ID nº 147-nº 163.

APARTADOS

1. Polipéptido que se une al receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) que comprende un motivo de unión al receptor del factor de crecimiento epidérmico, EBM, motivo que consiste en una secuencia de aminoácidos seleccionada de:

i) EX2X3X4AX6X7EIX10 X11LPNLNX17X18QX20 X21AFIX25SLX28D,

en donde, independientemente uno de otro,

X2 se selecciona de M, F, V, L, I y S;

X3 se selecciona de entre W, D, E y L;

X4 se selecciona de I, V, G, S, M, L, A, T, N, D y W;

X6 se selecciona de W, V, L, I, M y S;

X7 se selecciona de D, E, N y K;

X10 se selecciona de R, G, H y K;

X11 se selecciona de D, N, E, Y y S;

imagen11

imagen12

imagen13

imagen14

Claims

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

imagen7

imagen8

imagen9

imagen10

imagen11

imagen12