ES2590462T3

ES2590462T3 - Polinucleótidos que codifican epítopos hTERT restringidos al MHC clase I HLA-B7, análogos de los mismos y poliepítopos

Info

Publication number: ES2590462T3
Application number: ES13165854.4T
Authority: ES
Inventors: Pierre Langlade-Demoyen; Fransisco Garcia Pons; Olivier Adotevi; Sylvain Cardinaud; Christine Neuveut
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2005-07-29
Filing date: 2006-07-31
Publication date: 2016-11-22
Anticipated expiration: 2026-07-31
Also published as: EP1910529A2; EP2626420B1; JP2016104031A; WO2007014740A2; CA2616674A1; EP1910529B1; JP5931812B2; EP2626420A2; US8003773B2; EP2626420A3; JP2009502150A; US20100172878A1; US20090175892A1; US8858931B2; JP2013230164A; JP2012183076A; DK1910529T3; PT2626420T; JP6257667B2; CA2616674C

Abstract

Un polinucleótido que codifica un poliepítopo y que comprende al menos dos unidades polinucleotídicas consecutivas que codifican un epítopo hTERT restringido a HLA-B7 elegido entre el grupo que consiste en: a. MPRAPRCRA (p1), b. APRCRAVRSL (p4), c. APSFRQVSCL (p68), d. RPAEEATSL (p277), e. RPSFLLSSL (p342), f. RPSLTGARRL (p351), g. DPRRLVQLL (p444), h. FVRACLRRL (p464), i. AGRNMRRKL (p966), j. LPGTTLTAL (p1107), y k. LPSPKFTIL (p1123) en el que dicho polinucleótido no es la secuencia codificante de hTERT de longitud completa, para su uso en la prevención y/o tratamiento del cáncer mediante la inducción de una respuesta inmune restringida a HLA-B7.

Description

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i.: GCTGGGAGGAACATGCGTCGCAAACTC (n966),

j.: CTCCCGGGGACGACGCTGACTGCCCTG (n1107), y

k.: CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTG (n1123), y

l.: GCCCCCCGTCGCCTGGTGCAGCTGCTC (n444*).

5 -un polinucleótido, que comprende al menos una unidad polinucleotídica seleccionada entre:

a.: AGGCCCAGCCTGACTGGCGCTCGGAGGCTC (n351)

b.: GCCCCCTCCTTCCGCCAGGTGTCCTGCCTG (n68),

c.: GCTCCCCGCTGCCGAGCCGTGCGCTCCCTG (n4),

d.: GACCCCCGTCGCCTGGTGCAGCTGCTC (n444),

e.: TTCGTGCGGGCCTGCCTGCGCCGGCTG (n464),

f.: GCTGGGAGGAACATGCGTCGCAAACTC (n966),

g. CTCCCGGGGACGACGCTGACTGCCCTG (n1107), y 15 h. CTGCCCTCAGACTTCAAGACCATCCTG (n1123), y

l.: GCCCCCCGTCGCCTGGTGCAGCTGCTC (n444*) o sus análogos como se ha definido anteriormente, y al menos una unidad polinucleotídica seleccionada entre:

j.: ATGCCGCGCGCTCCCCGCTGCCGAGCC (n1),

k.: AGACCCGCCGAAGAAGCCACCTCTTTG (n277),

l.: CGGCCCTCCTTCCTACTCAGCTCTCTG (n342) o sus análogos como se ha definido anteriormente.

También se incluyen para su uso en la presente invención, polinucleótidos o unidades polinucleotídicas de acuerdo con un epítopo, análogo o poliepítopo de la invención, teniendo en consideración la degeneración del código genético. Por lo tanto, cada aminoácido puede codificarse por el codón de la secuencia de nucleótidos de referencia

25 de hTERT, o por cualquier codón que codifique dicho aminoácido.

La invención también se refiere al uso de un polinucleótido que comprende o consta de cualquier combinación de al menos dos de estas unidades polinucleotídicas, seleccionados entre el grupo anterior, y opcionalmente análogos adicionalmente de estas unidades polinucleotídicas, donde dicha unidad polinucleotídica o análogo codifica un epítopo hTERT restringido a HLA-B7.

Todas las características dadas anteriormente referentes a epítopos, análogos, poliepítopos, combinación de los mismos, espaciadores, secuencias señal diana… son aplicables a cualquier polipéptido de la invención, así como a las secuencias polinucleotídicas correspondientes.

35 Un vector recombinante, que comprende o consta de un polinucleótido de la invención, como se ha definido anteriormente, también es un objeto de la presente invención. El vector recombinante puede ser un vector para expresión eucariota o procariota, tal como un plásmido, un fago para introducción en bacterias, un YAC capaz de transformar levaduras, un vector viral y especialmente un vector retroviral, o cualquier vector de expresión. Un vector de expresión como se define en este documento se elige para posibilitar la producción de un epítopo o análogo o poliepítopo como se ha definido anteriormente, in vitro o in vivo.

Por lo tanto, además del polinucleótido, el vector para el uso de la invención puede comprender adicionalmente regiones de regulación de la transcripción (incluyendo promotor, potenciador, sitio de unión al ribosoma (RBS), señal

45 poliA), una señal de terminación, un origen de replicación procariota o eucariota y/o un gen de selección. Las características del promotor pueden determinarse fácilmente por los especialistas en la técnica en vista de la expresión necesaria, es decir, promotor constitutivo, transitorio o inducible, fuerte o débil, específico de tejido y/o específico de la fase del desarrollo. Por lo tanto, pueden elegirse promotores específicos de tejido dependiendo del órgano en el cual se administra una composición que contenga este vector, por ejemplo, inyectado, y dependiendo de la intensidad de expresión requerida. En una realización particular, el promotor es un promotor CMV (citomegalovirus humano). Dicho vector también puede comprender una secuencia que posibilite la expresión condicional, tal como secuencias del sistema Cre/Lox o sistemas análogos.

Los vectores de expresión para el uso de la invención pueden ser vectores virales, y particularmente un vector de

55 expresión viral, tal como vectores derivados de retrovirus, especialmente derivados de lentivirus tales como vectores derivados de VIH, VIF o VIS. Más particularmente, el vector derivado de lentivirus es un vector derivado de lentivirus humano tal como un vector de expresión de VIH, particularmente un vector derivado de VIH-1 o VIH-2. Un vector derivado de retrovirus comprende un genoma del vector retroviral, habitualmente incluido 3n una construcción de ADN, tal como un plásmido, y expresado en partículas virales, donde dicho genoma de vector retroviral comprende los elementos necesarios para la retrotranscripción, particularmente las LTR posiblemente mutadas incluyendo delecionadas en parte, especialmente delecionadas en la región U3. En ningún caso, el vector derivado de retrovirus contiene todas las secuencias nucleotídicas que codifican las proteínas retrovirales de longitud completa. Posiblemente, contenga parte de una o varias de dichas secuencias de nucleótidos siempre que no codifique dichas proteínas o fragmentos funcionales de las mismas. Dicha construcción de ADN que comprende dicho genoma de

65 vector retroviral comprende adicionalmente un ADN de interés recombinado con las secuencias nucleotídicas retrovirales, comprendiendo o constando dicho ADN de interés de un polinucleótido de la invención.

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Un vector particular para el uso de la invención es el vector pTRIP-CMV-hTERT, depositado en la CNCM (Institut Pasteur, París, Francia) con el número CNCM I-3660 el 28 de julio de 2006. Un medio de crecimiento adecuado para cultivar este vector es un medio TB, opcionalmente suplementado con higromicina. Otro vector de expresión para el uso de la invención es el vector pTRIP-CMV-hTERT depositado en la CNCM con el número CNCM I-3660 el 28 de

5 julio de 2006, en el cual se ha sustituido la secuencia hTERT delecionada por cualquier polinucleótido de la invención.

La presente invención también se refiere al uso de células que comprenden polinucleótidos o unidades polinucleotídicas de la invención.

10 En una realización, la célula se transfecta con un vector de la invención, por métodos bien conocidos para los especialistas en la técnica, es decir, por transfección química (fosfato cálcico, lipofectamina), técnicas basadas en lípidos (liposoma), electroporación, fotoporación, uso de vectores virales… En otra realización, una célula se transforma o transduce con un polinucleótido de la invención, de un modo que posibilite la integración del

15 polinucleótido en el genoma de la célula por recombinación con la secuencia celular homóloga o por inserción en el genoma celular. La transfección, infección o transducción puede suceder ex vivo, es decir, en un entorno artificial fuera del organismo vivo.

Entre las células particularmente interesantes en la estrategia de vacuna están células del sistema inmune, y

20 especialmente células presentadoras de antígeno (APC). En una realización particular, estas células son APC implicadas en el reconocimiento MHC clase I, como células dendríticas (DC) o en el reconocimiento MHC clase II tal como macrófagos o linfocitos B. Entre las DC, se prefieren DC maduradas completamente ex vivo, es decir, DC que se han madurado in vitro por epítopos o análogos.

25 Como se usa en este documento, los términos "transfectado", "transformado" o "infectado" se refieren a una célula que comprende un vector de la invención (expresión transitoria), mientras que la expresión "genéticamente transformado" se refiere a una célula cuyo genoma se ha modificado definitivamente por un polinucleótido de la invención (expresión permanente).

30 Dichas células transformadas de forma transitoria o estable pueden cualquier célula procariota (bacterias) o eucariota (levaduras, células animales incluyendo de mamífero especialmente humanas). En una realización, las células son células no humanas. En una realización particular, las células de la invención son células humanas aisladas, significando "aisladas" fuera de su entorno natural.

35 Un hospedador particular es la cepa de E. coli depositada en la CNCM con el número CNCM I-3660 el 28 de julio de 2006.

La invención también se refiere al uso de poliepítopos definidos anteriormente cuando se describen los polinucleótidos de la invención y particularmente al uso de cualquier polipéptido codificado por un polinucleótido o

40 unidades polinucleotídicas de la invención. También se describe el uso de epítopos y análogos definidos anteriormente cuando se describen los polinucléotidos de la invención. Polipéptidos particulares son epítopos hTERT restringidos a MHC clase I, especialmente restringidos a HLA-B7, elegidos entre el grupo que consiste en:

a.: MPRAPRCRA (p1), 45 b. APRCRAVRSL (p4),

c.: APSFRQVSCL (p68),

d.: RPAEEATSL (p277),

e.: RPSFLLSSL (p342),

f.: RPSLTGARRL (p351), 50 g. DPRRLVQLL (p444),

h.: FVRACLRRL (p464),

i.: AGRNMRRKL (p966),

j.: LPGTTLTAL (p1107), y

k.: LPSPKFTIL (p1123).

55 Los epítopos hTERT restringidos a HLA-B7 particulares, se eligen entre el grupo que consiste en:

a. RPSLTGARRL (p351),

b.: APSFRQVSCL (p68), 60 c. APRCRAVRSL (p4),

d.: DPRRLVQLL (p444),

e.: FVRACLRRL (p464),

f.: AGRNMRRKL (p966),

g.: LPGTTLTAL (p1107), y 65 h. LPSPKFTIL (p1123).

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adicionalmente un excipiente farmacéuticamente adecuado (incluyendo agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos), o un medio y/o un vehículo.

En una realización particular, dicha composición comprende un polinucleótido de la invención que codifica un

5 poliepítopo descrito anteriormente. Dicha composición puede comprender otras moléculas de ácido nucleico que codifican al menos un epítopo hTERT o análogo del mismo o poliepítopo, restringido a un alelo diferente de MHC clase I al de HLA-B7. La combinación de epítopos hTERT restringidos a diferentes supertipos HLA o alelos posibilita cubrir una población más grande de pacientes en necesidad de tratamiento que un único supertipo o alelo. Para este fin, se prefieren HLA-A1, -A2, -A3 y –A24.

En otra realización, la composición comprende moléculas de ácido nucleico que codifican al menos un epítopo hTERT o análogo del mismo o poliepítopo, restringido a MHC clase II. Dicha composición puede comprender cualquier combinación de moléculas de ácido nucleico descritas anteriormente, con al menos un epítopo hTERT restringido a HLA-B7, análogo o poliepítopo de la presente invención. La combinación, en una composición de

15 moléculas de ácido nucleico, de polinucleótidos que codifican epítopos restringidos a Clase I y Clase II que posibilitan la reacción de diversas células inmunes (linfocitos T o células NK para clase I frene a linfocitos auxiliares para clase II), y/o la provocación de diversas respuestas inmunes (respuesta humoral frente a celular) también está dentro de la presente invención.

En otra realización, la composición comprende moléculas de ácido nucleico que comprenden al menos dichas moléculas que codifican un antígeno específico de tumor (TSA) y/o al menos un antígeno asociado a tumor (TAA), tal como antígeno específico de próstata (PSA), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA) o fosfatasa ácida prostática (PAP) (Tartour et al. 2000 Immunol Lett Sep 15; 74(1): 1-3; Tartour et al. 1996 Presse Med. Nov 16; 25(25): 1717-22).

25 Pueden usarse varios tipos de composiciones terapéuticas para provocar una respuesta inmune contra un epítopo o análogo de la invención.

Una composición que comprende un polinucleótido para el uso de la invención se administra a un hospedador, por ejemplo inyectado (conocido como vacunación con ADN) y dicho ácido nucleico expresa in vivo un polipéptido que comprende o que consta de múltiple epítopos de acuerdo con la invención. Dichas vacunas de ADN habitualmente constan de vectores plasmídicos como se ha descrito anteriormente. El suministro de ADN desnudo ha demostrado ser poco eficaz, y se necesitan algunos vehículos para mejorar el suministro y captación de ADN en las células. Hasta la fecha se han desarrollado dos tipos de vehículos: (1) vehículos virales (adenovirus, lentivirus, virus del 35 sarampión), o (2) vehículos no virales tales como polímeros (y especialmente polímeros catiónicos), ADN encapsulado (liposomas, que comprenden lípidos catiónicos que interaccionan espontánea y rápidamente con polianiones, tales como ADN y ARN, produciendo complejos liposoma/ácido nucleico) o ADN ligado a micropartículas de oro. Además, pueden usarse ventajosamente agentes que ayudan a la captación celular del ácido nucleico, tal como iones calcio, proteínas bacterianas (proteínas de Shigella), proteínas virales y otros agentes que facilitan la transfección. Otro tipo de composición de acuerdo con la invención es una composición que comprende pseudopartículas lentivirales que comprenden un vector o genoma de vector como se ha mencionado anteriormente.

Otro tipo de composición comprende un poliepítopo para el uso de la invención. Dicha composición es inmunogénica, es decir, es capaz de provocar una respuesta inmune en un hospedador en que se administra. Sin

45 embargo, para aumentar las propiedades inmunogénicas de los polipéptidos de la invención, puede administrarse un adyuvante con el polipéptido, para provocar o mejorar la respuesta inmune. Un adyuvante se define como cualquier sustancia que potencia la inmunogenicidad de un antígeno mezclado con dicho adyuvante. Algunos adyuvantes convierten antígenos solubles en pequeñas partículas, tales como hidróxido de aluminio en gel, emulsión de aceite en agua o complejos inmunoestimuladores (ISCOM). Otra clase de adyuvantes comprende constituyentes estériles de bacterias tales como pared celular o polisacáridos, adyuvante de Freund. Finalmente, también pueden usarse agentes emulsionantes o agentes tamponantes del pH para potenciar el comportamiento inmunogénico del epítopo o análogo.

Todas las composiciones indicadas anteriormente pueden inyectarse en un hospedador mediante diferentes vías:

55 inyección subcutánea (s.c.), intradérmica (i.d.), intramuscular (i.m.) o intravenosa (i.v.), administración oral y administración a la mucosa, especialmente administración intra-nasal o inhalación. La cantidad a administrar (dosificación) depende del sujeto a tratar, incluyendo la afección del paciente, el estado del sistema inmune del individuo, la vía de administración y el tamaño del hospedador. Las dosificaciones adecuadas varían entre 200 ga 1 mg, y pueden modificarlas los especialistas en la técnica, dependiendo de las circunstancias.

Las composiciones para el uso de la invención son útiles para la profilaxis y/o tratamiento de estados neoplásicos en pacientes, resultantes de proliferación celular no controlada, incluyendo tumores, resultantes de la sobre-expresión de hTERT, así como para el tratamiento de consecuencias perjudiciales que acompañan a dicho estado neoplásico, por ejemplo, cáncer. La expresión "tratamiento" abarca el efecto curativo conseguido con las composiciones de la 65 invención y también el efecto beneficioso para el paciente que experimenta el tratamiento, obteniéndose dicho efecto a nivel celular o nivel clínico, incluyendo como resultado, una mejora de la afección del paciente y/o un estado de

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ellas, las células dendríticas (DC), son particularmente eficaces en la presentación de epítopos endógenos restringidos a MHC clase I, a linfocitos T. Uno de los objetivos de la maduración de dichas células es su administración una vez maduradas, a un paciente en necesidad de tratamiento. La administración de dichas DC maduradas provocaría in vivo la activación de los linfocitos del paciente, y la rápida reacción contra la célula que

5 expresa el epítopo (la única, las DC con las que se ha transformado).

En una realización particular, un proceso para madurar in vitro células dendríticas comprende:

a. proporciona células dendríticas, 10 b. posibilitar la maduración de dichas células dendríticas con al menos un epítopo hTERT restringido a HLA-B7

o análogo de epítopo o poliepítopo de la invención, y

c. opcionalmente, favorecer la expansión de dichas células dendríticas maduradas.

En una realización particular, dichas células dendríticas se aíslan de sangre en circulación o células de médula ósea.

15 En otra realización, las células dendríticas se aíslan del paciente en necesidad de tratamiento o de un donante de HLA coincidente, para evitar el rechazo después de la administración a dicho paciente.

La maduración de las DC puede conseguirse por transformación genética de dichas células dendríticas con un polinucleótido de la invención, por transfección de dichas células dendríticas con un vector de la invención o por

20 contacto de dichas células dendríticas con al menos un epítopo, análogo de epítopo o poliepítopo de la invención. Se prefiere la transformación genética a causa de su eficacia y la expresión permanente del epítopo, análogo o poliepítopo codificado por el polinucleótido insertado en el genoma de la DC.

La invención también se refiere a un polinucleótido que codifica un epítopo hTERT restringido a HLA-B7 para su uso

25 en la prevención y/o tratamiento del cáncer. En una realización particular, dicho polinucleótido, para su uso en la prevención y/o tratamiento del cáncer codifica un poliepítopo hTERT restringido a HLA-B7 que comprende al menos dos epítopos restringidos a HLA-B7 como se describe en la presente solicitud. En cuanto a lo que se refiere al polinucleótido que codifica el poliepítopo, no coincide con la secuencia codificante de hTERT de longitud completa. Por otro lado, puede coincidir con una versión mutada o delecionada de HTERT, suprimiendo dicha mutación o

30 deleción la actividad catalítica de la telomerasa humana. En una realización particular, dicho polinucleótido comprende al menos dos unidades polinucleotídicas que codifican un epítopo hTERT restringido a HLA-B7, elegido entre el grupo que consiste en:

a.: MPRAPRCRA (p1), 35 b. APRCRAVRSL (p4),

c.: APSFRQVSCL (p68),

d.: RPAEEATSL (p277),

e.: RPSFLLSSL (p342),

f.: RPSLTGARRL (p351), 40 g. DPRRLVQLL (p444),

h.: FVRACLRRL (p464),

i.: AGRRMNRKL (p966),

j.: LPGTTLTAL (p1107), y

k.: LPSPKFTIL (p1123).

45 La solicitud también describe polinucleótidos que comprende al menos una unidad polinucleotídica que codifica un epítopo hTERT restringido a HLA-B7, elegido entre el grupo que consiste en a. a k. anteriores, o al menos un análogo de dicho epítopo hTERT restringido a HLA-B7 tal como APRRLVQLL (p444*) o cualquier combinación que tenga al menos dos unidades polinucleotídicas que codifiquen dichos epítopos HLA-B7 y/o análogos. La invención

50 se refiere a un poliepítopo hTERT HLA-B7 y, especialmente, un epítopo restringido a HLA-B0702 para su uso en la prevención y/o tratamiento del cáncer. La invención se refiere también a un polinucleótido, un vector, una célula hospedadora o un polipéptido de la invención, para su uso en la prevención y/o tratamiento del cáncer.

La invención también se refiere al uso de un poliepítopo hTERT HLA-B7, (o polinucleótido correspondiente) para la

55 fabricación de un fármaco para la prevención y/o tratamiento del cáncer. Los poliepítopos hTERT HLA-B7 particulares (o polinucleótidos correspondientes) son aquellos descritos anteriormente, así como vectores, células o composiciones que comprenden o que constan de los mismos. En una realización particular, se pretende el uso del polinucleótido, vector, célula hospedadora o polipéptido que comprende o consta de un poliepítopo de la invención en la fabricación de un fármaco para la prevención y/o tratamiento del cáncer para pacientes que tienen al menos un

60 alelo HLA-B7 como se ha definido anteriormente, y particularmente al menos un alelo HLA-B0702.

Cada definición proporcionada en la memoria descriptiva se aplica a todos y cada uno de los péptidos (epítopos, análogos o poliepítopos) así como a todos y cada uno de los polinucleótidos, tomados individualmente (como tales)

o abarcados en un grupo. 65

Breve descripción de lo dibujos

Figura 1: Gen que codifica la proteína hTERT y secuencia correspondiente de aminoácidos.

La secuencia codificante está localizada entre el nucleótido 56 y 3454. Los codones de inicio y terminación están

5 subrayados. La primera línea es la secuencia de nucleótidos; la segunda línea es la correspondiente secuencia de aminoácidos. La tercera línea es la numeración de la secuencia codificante de hTERT, empezando desde el codón de inició como primer aminoácido.

Figura 2: Los péptidos derivados de hTERT se procesan en ratones transgénicos HLA-B0702.

Se inmunizaron ratones HLA-B7 Tg y ratones vírgenes (N) con 100 g de ADN codificante de Htert. En el día 14, se estimularon células esplénicas de cada ratón por separado in vitro con diferentes péptidos derivados de hTERT. Las células efectoras se ensayaron 6 días después contra dianas RMA-B7 cargadas con péptidos relevantes (■) o de control ( ) como se describe en materiales y métodos. Se muestra el porcentaje de lisis a una proporción 60/1 (resultados de dos experimentos independientes).

Figura 3: Inducción de respuesta CTL contra hTERT en PBMC de donantes sanos de sangre.

15 Se activaron células linfocíticas T de donantes sanos HLA-*B0702+ con cada una de las seis PBMC autólogas pulsadas con péptido hTERT como se detalla en materiales y métodos. Después de cuatro rondas de estimulación semanal, se ensayaron las células efectoras, pulsadas con péptidos relevantes (■) o de control ( ), para la actividad lítica contra células T2-B7 marcadas con 51Cr. Se muestra el porcentaje de lisis a una proporción efector-diana de 20/1. Se presentan los resultados de 8 de 10 donantes (d1 a d8). Figura 4: Efecto de un mAb anti-HLA clase I sobre la citotoxicidad de CTLp351 contra células tumorales. Se determinó la citotoxicidad de la línea CTLp351 contra las líneas celulares de tumor HLA-*B0702+ Mamo y U293T pre-tratadas en ausencia (ninguno) o presencia de mAb contra HLA (mAb anti-HLA clase I o mAb anticlase II (HLA-DR)) por ensayo convencional de liberación de 51Cr a una proporción efector-diana de 10/1. Figura 5: Detección ex-vivo de respuesta de células T específica de hTERT después de inmunización con

25 Lv-hTERT. A) Se inmunizaron ratones transgénicos HLA-B7 con partículas recombinantes Trip-hTERT o Trip-GFP de control (1500 ng). Después de 12 días, se detectaron ex vivo las células T específicas de péptido hTERT que producían IFN de cada ratón por ensayo IFN-ELISPOT en células esplénicas frescas. Se calcularon las SFC de IFN después de sustraer los valores del control negativo. Se representan los resultados de tres experimentos independientes. B) Se inmunizaron ratones HHD con Trip-hTERT como se ha descrito anteriormente. Se detectaron ex vivo las células T específicas de péptido hTERT que producían IFN por ELISPOT como se ha descrito anteriormente. Se representan los resultados de dos experimentos independientes. Figura 6: Sensibilización de respuestas de células T CD8+ específicas en ratones transgénicos HLA

35 B*0702 después de inmunización con Trip-hTERT Se inmunizaron ratones transgénicos HLA-B*0702 con Trip-hTERT (4 primeras barras negras) o control (2 últimas barras verticales con bandas horizontales). Doce días después, se detectaron ex vivo las células individuales productoras de IFN- dentro en los esplenocitos de cada ratón por ensayo ELISPOT de IFN-. Se cultivaron linfocitos purificados en Ficoll de esplenocitos recién aislados de ratones inmunizados individuales directamente con o sin 5 g/ml de cada péptido derivado de hTERT restringido a HLA-B*0702 durante 24 h. La cantidad de SFC de IFN- específicas se calculó tras sustraer los valores no específicos obtenidos con control sin péptido (< 15 SFC), y las respuestas se consideraron positivas para SFC  30. Figura 7: Representación esquemática de pTRIP-hTERT Este vector derivado de lentivirus contiene la secuencia psi, las secuencias cPPT y CTS activa en cis central

45 (Solapa) del genoma de VIH-1 y el promotor CMV que permite la expresión del gen de interés. Además, el dominio U3 está delecionado en la LTR 3' (U3). Figura 8: A) Respuestas de células T CD8+ específicas de hTERT sensibilizadas por inmunización con ADN pTRIP-CMV-hTERT en ratones HHD. Se inmunizaron con ADN ratones HHD (HLA-A2.1 Tg) con un ADN que codificaba una forma no funcional de HTERT (pTRIP-CMV-hTERT). Diez días después, se detectaron ex vivo las células T específicas de péptido productoras de IFN- por ensayo IFN--ELISPOT. Se cultivaron linfocitos purificados en Ficoll de esplenocitos de ratones inmunizados individuales directamente durante 24 h, con o sin 5 g/ml de cada péptido derivado de hTERT restringido a HLA-A2.1. La cantidad de SFC de INF- específicas se calculó como se ha descrito anteriormente. Las respuestas se consideraron positivas para SFC  30.

55 B) Inducción de cortas respuestas CTL en ratones HHD después de inmunización con pTRIP-CMVhTERT. Se inmunizaron ratones HHD con un ADN que codificaba una forma no funcional de HTERT (pTRIP-CMV-hTERT) durante 10 días. Las células esplénicas de ratones individuales se volvieron a estimular in vitro con los péptidos p540 y pY572 derivados de hTERT restringidos a HLA-A2.1 durante 6 días. Las células efectoras se ensayaron en un ensayo de liberación de 51Cr frente a células EL4 transfectadas con HHD cargadas con el péptido relevante o el péptido irrelevante. Figura 9: Secuencia de una proteína hTERT no funcional (deleción de los aminoácidos 867 a 869) La secuencia codificante está localizada entre el nucleótido 59 y 3348. Los codones de inicio y terminación están subrayados. La primera línea es la secuencia de nucleótidos; la segunda línea es la correspondiente secuencia de aminoácidos. La tercera línea es la numeración de la secuencia codificante de hTERT, empezando desde el

65 codón de inició como primer aminoácido.

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Los resultados se expresan como valores de avidez relativa, que es la proporción de concentración de péptido de ensayo necesaria para alcanzar el 20% de la unión máxima (obtenida con el péptido de referencia) sobre la concentración del péptido de referencia. Por lo tanto, cuanto menor sea el valor, más fuerte será la unión.

5 Inmunización con péptido de ratones transgénicos HLA-*B0702 para inducción de CTL

A ratones transgénicos HLA-*B0702 hembra de 8-10 semanas de edad se les inyectó por vía subcutánea (s.c.) en la base de la cola 50 g de individual péptidos hTERT restringidos a HLA-B0702 suplementados con 140 g de péptido auxiliar co-emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (Difco, Detroit, MI). Diez días después, se reactivaron las células esplénicas de los ratones individuales in vitro con péptido relevante en placa de seis pocillos. Las células CTL efectoras se ensayaron en un ensayo convencional de liberación de 51Cr de 4-5 h, usando células RMA transfectadas con HLA-*B0702 (RMA-B7) pulsadas con péptido relevante o de control negativo. Los ratones se consideraron respondedores cuando se observó lisis específica  10%.

15 Inmunización con ADN en ratones transgénicos HLA-*B0702

Se purificó el vector plasmídico LvCMV-hTERT que codifica el gen hTERT bajo el control del promotor CMV en columnas plasmid Giga kit en condiciones libres de endotoxinas (Qiagen). A ratones transgénicos HLA-*B0702 anestesiados se les inyectó dicho plásmido (50 g cada lado) en los músculos tibialis anterior en regeneración. Catorce días después, se reactivaron las células esplénicas de los ratones individuales in vitro con LPS-linfoblasto singénico con irradiación  (50 Gy), pulsado con péptido (10 g/ml) en medio completo, suplementado con un 10% de sobrenadante de células esplénicas de rata activadas por Con A. Se realizaron ensayos de citotoxicidad 6 días como se ha descrito.

25 Construcción y producción de vector lentiviral

La construcción pTRIP-deltaU3-CMV-hTERT (mencionada como TRIPLv-hTERT o Lv-hTERT o pTrip-hTERT) (Figura 7) se creó subclonando primero un inserto EcoRI-SalI de hTERT derivado del plásmido pBABE-hygro-hTERT (Counter et al. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 1998; 95: 14723-8) en el vector pSP73 (Promega). Después se insertó un fragmento BglII-SalI en el plásmido pTRIP-CMV cortado con BamH1 y XhoI. Se produjeron partículas retrovirales recombinantes pseudo tipadas por transfección transitoria (48 h) de células 293T como se ha descrito (Zennou et al. Cell 2000; 14; 101: 173; Firat et al. J Gene Med 2002; 4: 38-45). Las partículas retrovirales recombinantes se concentraron por ultra-centrifugación y se resuspendieron en PBS. La cantidad de partículas vectoriales se estimó a partir de la de proteína p24 en un ensayo ELISA disponible en el mercado (NEN, DUPONT, France Perkin Elmer).

35 El vector pTRIP-CMV-hTERT, depositado en la CNCM (Institut Pasteur, París, Francia) con el número CNCM I3660 el 28 de julio de 2006, se realizó como se ha descrito en el párrafo anterior. Sin embargo, la proteína hTERT se volvió no funcional por deleción de los aminoácidos 867 a 869, correspondientes a los nucleótidos 2654 a 2662 de la Figura 1 (tipo silvestre). El mutante de RT hTERT catalíticamente muerto (hTERT) se generó creando una deleción de los restos aminoacídicos 867 a 869 usando el kit de mutagénesis dirigida al sitio QuickChange XL (Stratagene) y se verificó por secuenciación.

Inmunización en ratones transgénicos para MHC clase I y detección de CTL

45 La inmunización con TRIPLv-hTERT se realizó como una única inyección subcutánea (en la base de la cola) de 1500 ng de suspensión de TripLv-hTERT o vector de control.

La inmunización se realizó en ratones transgénicos HLA.A2 como una única inyección intraperitoneal de partículas lentivirales recombinantes, pTRIP-CMV-hTERT o Trip-GFP como control, equivalente a 1500 ng de antígeno p24 en 500 l de PBS.

Doce días depuse, se detectaron células T específicas de péptido hTERT entre los esplenocitos mediante un ensayo ELISPOT (véase a continuación). Se realizaron ensayos de citotoxicidad en las mismas poblaciones de esplenocitos inmunes después de estimulación in vitro con pulsación con péptido como se ha descrito anteriormente.

55

Evaluación de la respuesta de células T por ensayo ELISPOT de IFN- ex vivo

Se detectaron células T específicas de péptido de ratones inmunizados por ensayo ELISPOT de IFN- como se ha descrito previamente (Miyahira et al. J Immunol Methods 1995; 181: 45-54). Se depositaron mAb anti-IFN- de ratón (3 g/ml; Pharmigen, Becton Dickinson biosciences) sobre microplacas de nitrocelulosa de 96 pocillos (multi screen; Millipore corp, Molsheim, Francia). Después de la lisis de los glóbulos rojos, se cultivaron los linfocitos de bazo recién aislado de un ratón individual (5x105, 2,5x105 y 1,25x105 células/pocillo) directamente con o sin 5 g de péptido hTERT nativo durante 18 h a 37ºC. Después de los lavados, las placas se incubaron 2 horas con anticuerpo biotinilado anti-IFN- de ratón (2 g/ml; Pharmigen, Becton Dickinson biosciences). Finalmente, las placas se lavaron 65 y se incubaron a 37ºC durante 1 h con fosfatasa alcalina conjugada con estreptavidina (Roche molecular

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Como se muestra en la Figura 4, la actividad citotóxica de la línea CTLp351 hacia células tumorales HLA-B7+ está inhibida por un mAb anti-clase I anti-HLA-B0702, pero no por un mAb anti-HLADR (MHC clase II). Se obtuvieron datos similares con otras líneas CTL específicas de péptido (datos no mostrados) y sugieren que las líneas CTL ejercen citotoxicidad contra células tumorales hTERT+ de un modo restringido a HLA-B0702. De forma colectiva,

5 estos resultados muestran que estos seis péptidos derivados de hTERT no se expresan equitativamente de forma natural en la superficie de células tumorales y que los CTL específicos de péptido hTERT pueden discriminar entre células tumorales y células normales, a través del reconocimiento del péptido hTERT en el contexto de moléculas HLA-B0702.

10 5. La vacunación con vector lentiviral que codifica hTERT induce respuestas eficaces de células T específicas de péptido en ratones.

A continuación se ensayaron vacunas candidatas, que comprenden un gen hTERT de longitud completa o un gen hTERT no funcional, insertado en un vector de ADN solapa derivado de VIH (Figura 7). Los datos previos han

15 demostrado que vectores lentivirales de este tipo abordan células dendríticas in vitro e in vivo, e inducen fuertes respuestas CTL anti-tumorales poli-específicas en animales. Por lo tanto, se inmunizaron ratones transgénicos HLA*B0702 con Lv-hTERT recombinante o con pTRIP-CMV-hTERT. Doce días después, se evaluaron las células esplénicas de los ratones individuales mediante un ensayo ELISPOT ex vivo.

20 Como se muestra en la figura 5A, se obtuvieron respuestas de células T CD8+ específicas de péptido contra epítopos hTERT restringidos a HLA-B0702, en comparación con ratones que recibieron vector de control Lv-GFP. El análisis funcional de las células CD8+ específicas de péptido inducidas en ensayo de liberación de cromo después de estimulación in vitro confirmó los datos de ELISPOT ex vivo (Tabla 3) y demuestra que se genera una respuesta CTL específica y eficaz contra estos seis péptidos en aproximadamente el 50-70% de los ratones después de una

25 única inyección de Lv-hTERT y en el 100% de los ratones después de un refuerzo con TRIPLv-hTERT (figura 6). Esto también se asoció con fuertes respuestas CTL responses en todos los ratones (Tabla 3). Además, como se muestra en la Tabla 3, la inmunización de ratones HHD transgénicos para HLA-A2.1 con el mismo vector indujo potentes respuestas CTL específicas para dos epítopos restringidos a HLA-A2.1.1 previamente clasificados como dominante (p540) y críptico (p572). Colectivamente, estos resultados demuestran claramente que la administración

30 de Lv-hTERT provoca la inducción de respuestas de células T multi-específicas muy eficaces en ratones, apoyando que hTERT podría servir como poliepítopo y TAA polialélico para inmunoterapia contra el cáncer.

Como se muestra en la Figura 8, se detectaron respuestas de células T CD8+ específicas de péptido hTERT ex vivo en ratones transgénicos HLA-A2 (Tg) después de una única inyección de pTRIP-CMV-hTERT recombinante. Se

35 demostró que se inducían células T CD8+ específicas para los epítopos p540 y PY572 al menos en el 50% de los ratones inmunizados (Figura 8). Estos resultados demuestran claramente que se procesaban correctamente de forma endógena dos epítopos y se presentaban en ratones HLA-A2 Tg después de inmunización con pTRIP-CMVhTERT.

40 Colectivamente, estos resultados demostraron que una única inyección de TRIP-hTERT provocaba la inducción de una potente respuesta de células T CD8+ anti-hTERT multi-específica en ambos grupos de ratones transgénicos HLA.

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Tabla 3: Inducción de respuestas CTL después de inmunización con Lv-hTERT Inmunización con ADN solapa + Lv-hTRT Ratones HLA-B7 Tg Ratones HHD Péptido de re-estimulación R/T

Lisis específica (%) Péptido de re-estimulación R/T Lisis específica (%)

p1 4/8 27, 30, 29, 32 P540 2/6 21, 18 p4 6/8 18, 25, 54, 33, 16 pY572 5/6 22, 19, 14, 35, 24 p68 4/8 15, 64, 24, 16, p277 5/8 21, 25, 23, 52, 33 p342 4/8 18, 24, 20, 37 p351 5/8 17, 20, 18, 36, 19

III-Conclusión

5 Se han identificado nuevos epítopos hTERT, que son inmunogénicos in vivo y se procesan en ratones transgénicos HLA-B0702 knockout para H-2-clase I. Además, in vitro, la inmunización con péptido hTERT usando PBL HLA-B702+ de donantes sanos induce respuestas CTL específicas que reconocen tumores hTERT+ de diversos orígenes, lo que implica que no hay deleción en el repertorio de células T humanas para estos epítopos. Además, se demostró que dependiendo de los orígenes de los tumores, el repertorio de péptidos expresado en la superficie celular podría ser

10 cualitativamente diferente, subrayando la utilidad de caracterizar hTERT como poliepítopo de antígenos asociados a tumor para esquivar la variabilidad antigénica de las células cancerosas. Finalmente, se usaron ratones transgénicos HLA-*B0702 y HLA-A2 1 humanizados, para ensayar una vacuna candidata que consta de un gen de telomerasa no funcional insertado en una nueva generación de vectores de ADN solapa derivados de lentivirus. Se observaron fuertes respuestas de células T CD8+ específicas de hTERT en todos los ratones transgénicos para HLA. Estos

15 datos apoyan el uso para vacunación terapéutica en pacientes con cáncer y extiende la aplicabilidad potencial de hTERT como diana terapéutica para cubrir una gran población de paciente con cáncer.

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