ES2589507T3 - Obtención de imágenes espectrales para la medición de características patológicas nucleares en células de cáncer preparadas para el análisis in situ - Google Patents

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Abstract

Método diagnóstico del cáncer multivariante, comprendiendo el método: a. obtener datos de marcadores moleculares de una única muestra de un sujeto que comprende una única célula o población de células procedente de un tejido, en el que el marcador molecular es una reorganización genética, b. obtener datos cuantitativos de la morfología celular de la misma célula individual o población de células utilizada en la etapa (a), en la que los datos de marcadores de la morfología celular son el tamaño nuclear, la forma nuclear y el contenido de ADN, c. llevar a cabo un análisis multivariable de dicha muestra única para generar un conjunto de datos de análisis multivariable que comprende datos cuantitativos de marcadores de la morfología celular de la etapa (b) y datos de marcadores moleculares de la etapa (a), d. comparar los datos de análisis multivariable obtenidos en la etapa (c) con un conjunto de datos de análisis multivariable de referencia creado mediante la obtención de tanto datos de marcadores moleculares como datos cuantitativos de morfología celular de muestras celulares de cáncer y de no cáncer obtenidas de individuos con resultado clínico conocido, en el que el marcador molecular es una reorganización genética y los datos de marcadores de la morfología celular son el tamaño nuclear, la forma nuclear y el contenido de ADN, y e. predecir un resultado clínico definido por combinaciones específicas de datos de marcadores de la morfología celular y datos de marcadores moleculares asociados estadísticamente con la progresión, incidencia y metástasis del cáncer u otro determinante de resultado clínico observado en el conjunto de datos de análisis multivariable de referencia.

Description

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DESCRIPCION
Obtencion de imagenes espectrales para la medicion de caractensticas patologicas nucleares en celulas de cancer preparadas para el analisis in situ
Campo de la invencion
En general, la tecnologfa dada a conocer se refiere a la identificacion de subtipos de cancer. Mas concretamente, la tecnologfa dada a conocer se refiere a metodos para determinar reguladores moleculares del cancer y/o progresion utilizando datos multivariantes de imagenes y el analisis estadfstico de marcadores moleculares in situ y caractensticas morfologicas en las mismas celulas de una muestra de tejido de un cancer. Esta analisis tiene lugar tras una unica adquisicion que obtiene los datos morfologicos moleculares y anatomicos en paralelo. El analisis compara marcadores morfologicos y moleculares espedficos con muestras conocidas que muestran reguladores geneticos particulares del cancer. Este metodo proporciona informacion estadfstica que proporciona una mayor fiabilidad para la identificacion de los reguladores moleculares espedficos del cancer.
Antecedentes de la invencion
Se utilizan los ensayos pronosticos patologicos para proporcionar informacion para ayudar a guiar y desarrollar regfmenes de tratamiento y predecir resultados para una multitud de tipos de cancer. La deteccion precoz y la determinacion precisa de la base molecular de un cancer es una caractenstica clave en el tratamiento de los pacientes de cancer. Para muchos canceres lo anterior requiere multiples preparaciones separadas de muestras de tejido del paciente para determinar diferentes factores morfologicos y moleculares.
Tfpicamente, se examinan patologicamente muestras de cancer mediante la fijacion de las celulas sobre portaobjetos de microscopfa y se tinen utilizando una diversidad de metodos de tincion (por ejemplo tinciones morfologicas o citogeneticas). A continuacion se evaluan los espedmenes tenidos para la presencia o la ausencia de celulas anormales o cancerosas y las morfologfas celulares. Aunque proporcionan solo informacion general, los metodos de tincion histologica son los metodos mas comunes actualmente puestos en practica para la deteccion de las celulas cancerosas en las muestras biologicas. Entre otros metodos de tincion utilizados frecuentemente para la deteccion del cancer se incluyen la inmunohistoqmmica y las tinciones de actividad. Estos metodos se basan en la presencia o ausencia de antfgenos espedficos o actividad enzimaticas en las celulas cancerosas. Otros metodos de deteccion de celulas cancerosas utilizan la presencia de aberraciones cromosomicas en las celulas de cancer. En particular, la delecion o multiplicacion de copias de cromosomas completos o segmentos cromosomicos y niveles mas altos de amplificacion de regiones espedficas del genoma son incidencias comunes en el cancer. Las aberraciones cromosomicas con frecuencia se detectan utilizando metodos citogeneticos tales como los cromosomas tenidos con Giemsa (bandeo G) o la hibridacion in situ fluorescente (FISH).
Tfpicamente, las muestras biologicas tenidas mediante cualquiera de los metodos anteriormente indicados son evaluadas manualmente por un tecnico de laboratorio o un patologo. Los portaobjetos de microscopfa son visionados bajo una magnificacion baja para localizar las areas candidatas y dichas areas se ven bajo magnificacion mas elevada para evaluar la presencia de celulas cancerosas. Ademas, los metodos actuales habitualmente requieren un unico metodo de tincion en cada ocasion y en el caso de que se lleve a cabo mas de un metodo de tincion, habitualmente no se realiza en exactamente las mismas celulas. Lo anterior se anade a la probabilidad de resultados falsos negativos asociados a los metodos de tincion citologicos o a los resultados falsos positivos asociados a metodos de tincion inmunogenicos o basados en la actividad. La incapacidad de asociar directamente medidas objetivas de morfologfa a reorganizaciones geneticas particulares al utilizar portaobjetos separados presenta una utilidad limitada a la combinacion de dichas mediciones de una manera significativa.
En el hombre, el cancer de prostata es la forma mas prevalente de cancer de todas las razas. Mientras que cada ano se diagnostican mas de 300.000 hombres con cancer de prostata solo en los Estados Unidos, los ensayos actualmente disponibles resultan notoriamente inexactos y subjetivos. En consecuencia, muchas incidencias de cancer de prostata no resultan diagnosticadas hasta que la enfermedad ha progresado a estadios tardms, incluyendo metastasis. Tanto la incidencia del cancer de prostata como su mortalidad asociada han ido incrementandose durante los ultimos diez anos. La enfermedad clmicamente evidente representa solo la punta del iceberg, en el sentido de que practicamente el 30 por ciento de todos los hombres de mas de 50 anos alojan una forma microscopica silenciosa de cancer de prostata latente. Los metodos de deteccion precoz actualmente utilizados estan incrementando la identificacion de esta forma latente de cancer, que ahora representa mas de 11 millones de casos en la poblacion masculina de los Estados Unidos. Los estudios de tasa de crecimiento indican que estos tumores aparentemente crecen muy lentamente y que la gran mayona seguramente permaneceran en estado clmicamente silencioso. Se estima que aproximadamente 50% a 65% de los canceres de prostata son localizados, 9% a 17% se ha extendido a un area proxima a la prostata y 20% a 25% ha metastizado a otras partes del cuerpo.
El cribado para el cancer de prostata se realiza principalmente mediante AEP (un analisis de sangre para el Antfgeno Espedfico de la Prostata) y las pruebas de ERD (examen rectal digital). La confirmacion del cancer se lleva a cabo
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mediante examen de muestras de tejido derivadas de biopsias con aguja. Estos metodos no pueden diferenciar entre enfermedad benigna y cancer. La no diferenciacion puede resultar, por ejemplo, en la exposicion de los pacientes con enfermedad benigna a tratamientos que resultan innecesarios y presentan efectos secundarios (por ejemplo impotencia e incontinencia). Actualmente los factores que deben considerarse en la evaluacion de la progresion del cancer son estimaciones. Puede utilizarse el volumen tumoral, la gradacion histologica pre- y post-operatoria del cancer y la neoplasia intraepitelial de grado elevado, la estadificacion tumoral clmica y patologica y la AEP serica para predecir la agresividad biologica del cancer de prostata. Desafortunadamente estas tecnicas generalmente presenta solo un valor predictivo marginal. Ademas, se estima que los ensayos de AEP omite 20% a 30% de todos los individuos con cancer. De acuerdo con lo anterior, existe una clara necesidad de diagnosticos de mejor sensibilidad y especificidad.
Esta bien aceptado que la transformacion epigenetica y genetica de una celula prostatica normal en una celula de cancer con progresion a un fenotipo metastatico requiere multiples etapas. El desarrollo de metodos para identificar estos cambios con el fin de seleccionar mejor las terapias y de predecir la agresividad del tumor ha sido el objetivo de mucho trabajo en el cancer de prostata. A pesar de los progresos realizados en la evaluacion de la progresion del cancer de prostata, resulta evidente que se requieren mejoras en la exactitud de dichas determinaciones.
De esta manera, existe una necesidad ampliamente reconocida, y resultana altamente ventajoso disponer de, un metodo de analisis del cancer y las morfologfas asociadas al cancer que puedan analizar multiples variables en celulas individuales de una muestra biologica en una unica adquisicion, proporcionando un nivel de fiabilidad mas elevado para la identificacion de mecanismos espedficos que regulen el pronostico del cancer y que proporcionen mas informacion al profesional sanitario en el diseno y seleccion de los protocolos de tratamiento.
La patente US n° 6.025.128 se refiere a la prediccion de la progresion del cancer de prostata (reivindicacion 1) mediante la realizacion de analisis multivariantes (reivindicaciones 7 y 8, columna 37, lmea 38) de descriptores de la morfologfa nuclear (DMN, columna 37, lmea 32), biomarcadores, varianza de la redondez nuclear (VRN, columna 37, lmea 32).
El documento n° US 2010/317002 da a conocer un metodo de diagnostico del cancer mediante analisis multivariante que considera la delecion genetica (parrafo 146) y variables citologicas (displasia).
Breve descripcion resumida de la invencion
La tecnologfa actualmente dada a conocer proporciona metodos mejorados para una especificidad incrementada en el analisis de los mecanismos moleculares de un cancer de tejido. De esta manera, en determinadas realizaciones, la tecnologfa se refiere a un metodo de diagnostico de cancer multivariante en el que dicho metodo determina la presencia de tanto marcadores moleculares como marcadores morfometricos fenotfpicos al nivel celular en una celula individual o en una muestra individual que contiene una poblacion de celulas de un tejido, comprendiendo dicho metodo:
a. obtener datos de marcadores moleculares de una unica muestra de un sujeto que comprende una unica celula o poblacion de celulas procedente de un tejido,
b. obtener datos cuantitativos de la morfologfa celular de la misma celula individual o poblacion de celulas tal como se utiliza en la etapa (a) para proporcionar un analisis multivariante de dicha muestra individual, comprendiendo el conjunto de datos multivariable tanto datos cuantitativos de la morfologfa celular de la etapa (b) como datos de marcadores moleculares de la etapa (a), y
c. comparar los datos de analisis multivariante obtenidos en la etapa (b) con un conjunto de datos de analisis multivariante de referencia creado mediante la obtencion de tanto datos de marcadores moleculares como datos cuantitativos de morfologfa celular de muestras celulares de cancer y de no cancer obtenidas de individuos con resultado clmico conocido.
Los resultados de la comparacion de la etapa (c) proporcionan una prediccion de un resultado clmico del sujeto definido por combinaciones espedficas de caractensticas y marcadores asociados estadfsticamente con la progresion, incidencia y metastasis del cancer u otras caractensticas del resultado clmico observadas en el conjunto de datos de analisis multivariante de referencia.
En dichos metodos diagnosticos, el marcador molecular es un reorganizacion genetica. Por ejemplo, dicha reorganizacion genetica puede ser una reorganizacion del gen ETS, incluyendo el gen ERG.
En los metodos dados a conocer, las medidas morfologicas incluyen el tamano, forma y contenido de ADN del nucleo.
Una aplicacion preferente del metodo diagnostico es en una celula de cancer que es una celula de cancer de prostata.
La tecnologfa contempla ademas un metodo de identificacion de reorganizaciones geneticas espedficas o patrones de marcadores moleculares en una muestra de ensayo que contiene una unica celula o una poblacion de celulas de un tejido canceroso que comprende:
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a. obtener la relevancia estadfstica de caractensticas fenotfpicas medibles y marcadores moleculares derivados mediante analisis de regresion de multiples variables marcadores morfologicos y moleculares de una unica muestra perteneciente a una poblacion de celulas de cancer de cohortes de resultados moleculares conocidos de cancer para crear una biblioteca de referencia que muestra marcadores fenotipicos y moleculares asociados a un resultado clmico,
b. correlacionar fenotipos morfometricos espedficos con reorganizaciones geneticas espedficas o patrones de marcadores moleculares de dicha biblioteca,
c. realizar analisis moleculares in situ en una muestra de ensayo que contiene una unica celula o una poblacion de celulas de un tejido canceroso y simultanea o concurrentemente medir caractensticas morfometricas en la misma muestra de ensayo para determinar tanto la morfologfa como los marcadores moleculares de la muestra,
d. comparar los datos moleculares y morfometricos in situ agrupados que se han obtenido de la muestra de ensayo de la etapa (c) con la biblioteca en la etapa (b) e identificar reorganizaciones geneticas especificas o patrones de marcadores moleculares en dicha unica celula o poblacion de celulas de la muestra de ensayo de tejido canceroso.
El tejido canceroso puede ser un tejido solido un tejido fluido, tal como un tejido hematologico. En los metodos dados a conocer en la presente memoria, las celulas de cancer pueden ser celulas de cancer que estan asociadas a un cancer seleccionado de entre el grupo que consiste de leucemia, linfoma, cancer de cerebro, cancer cerebroespinal, cancer de vejiga, cancer de prostata, cancer de mama, cancer de cervix, cancer de utero, cancer ovarico, cancer de rinon, cancer de esofago, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer pancreatico y melanoma.
En los metodos dados a conocer, el contraste morfologico puede derivarse de la utilizacion de una tincion fluorescente (por ejemplo DAPI y los puntos cuanticos), las propiedades opticas del tejido (por ejemplo la iluminacion de campo oscuro transmitida), marcadores de reflexion o de dispersion (por ejemplo el oro coloidal y la tincion de plata) o agentes de contraste absorbentes de la luz (por ejemplo la hematoxilina o el DAB).
El contraste de marcadores moleculares in situ utilizado en la presente memoria puede derivarse de la utilizacion de tincion fluorescente (por ejemplo DAPI o puntos cuanticos), de las propiedades opticas del tejido (por ejemplo la iluminacion de campo oscuro transmitida), de marcadores de reflexion o dispersion (por ejemplo el oro coloidal), o de los agentes de contraste absorbentes de la luz (por ejemplo la hematoxilina, el DAB, Fast Red, Fast Blue o la tincion de plata).
En otros aspectos, el marcador molecular in situ es una sonda inmunologica, una sonda de ADN, una sonda de ARN, lectina, un aptamero, un ligando de protema o un cofactor enzimatico.
En una realizacion espedfica, el ensayo multivariante se lleva a cabo en una celula de cancer que es una celula de cancer de prostata, en la que se utiliza el analisis molecular in situ para determinar la presencia de una reorganizacion genica ETS, incluyendo eRg, y la tincion morfologica es una tincion DAPI. Mas concretamente, la reorganizacion ERG es una insercion en el gen ERG, o la delecion de la region 5' de ERG, y el metrico morfologico es un redondez irregular de los nucleos.
La presente tecnologfa se refiere ademas a metodos de identificacion precoz de celulas precancerosas o asociadas a cancer que es probable que presenten una reorganizacion genetica espedfica, que comprende:
a. obtener una biblioteca de marcadores moleculares in situ y mediciones morfometricas realizadas en una poblacion de celulas a partir de cohortes precancer de reorganizaciones geneticas conocidas que se asocian con un resultado de cancer,
b. correlacionar los fenotipos morfometricos con una reorganizacion genetica espedfica de dicha biblioteca para generar datos de biblioteca,
c. realizacion de un analisis molecular in situ en una muestra celular de ensayo que contiene una unica celula o una poblacion de celulas y medir caractensticas anatomicas de la misma muestra para determinar la morfologfa de la muestra celular de ensayo, y
d. comparar los datos moleculares y morfometricos in situ agrupados que se han obtenido de la muestra celular de ensayo de la etapa (c) con los datos de biblioteca en la etapa (b) y proporcionar una confianza estadfstica incrementada de identificacion de la muestra celular de ensayo como muestra celular de cancer o precancer.
Las celulas precancerosas o asociadas a cancer pueden estar asociadas a un celula seleccionado de entre el grupo que consiste de leucemia, linfoma, cancer cerebral, cancer cerebroespinal, cancer de vejiga, cancer de prostata, cancer de mama, cancer de cervix, cancer de utero, cancer ovarico, cancer de rinon, cancer de esofago, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer pancreatico y melanoma.
En dichos metodos nuevamente el contraste morfologico puede derivarse de la utilizacion de una tincion fluorescente (por ejemplo DAPI o puntos cuanticos), de las propiedades opticas del tejido (por ejemplo la iluminacion de campo oscuro transmitida), de marcadores de reflexion o de dispersion (por ejemplo el oro coloidal o la tincion de plata) o de agentes de contraste absorbentes de la luz (por ejemplo la hematoxilina o el DAB) 14. El contraste de marcadores moleculares in situ puede derivarse de la utilizacion de una tincion fluorescente (por ejemplo DAPI o puntos cuanticos), de las propiedades opticas del tejido (por ejemplo la iluminacion de campo oscuro transmitida), de marcadores de
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reflexion o dispersion (por ejemplo el oro coloidal) o de agentes de contraste absorbentes de la luz (por ejemplo la hematoxilina, el DAB, Fast Red, Fast Blue o la tincion de plata).
El marcador molecular in situ puede ser una sonda inmunologica, una sonda de ADN, una sonda de ARN, una lectina, un aptamero, un ligando de protema o un cofactor enzimatico.
En un metodo espedfico, la celula precancerosa o asociada a cancer es una celula de la prostata, el analisis molecular in situ se utiliza para determinar la presencia de una reorganizacion ERG y la tincion morfologica es una tincion DAPI. Mas particularmente, la reorganizacion ERG es una insercion en el gen ERG o la delecion de la region 5' del gen ERG, y el metrico morfologico es un redondez irregular de los nucleos celulares.
En otra realizacion, la celula precancerosa o asociada a cancer es una celula de cancer de prostata, se utiliza el analisis FISH para determinar la presencia de una reorganizacion de ERG y la tincion morfologica es una tincion DAPI. La reorganizacion de ERG puede ser una insercion en el gen ERG, o la delecion de la region 5' del gen ERG, y dicho cambio morfometrico es un redondez irregular de los nucleos celulares.
Se describe ademas un metodo de identificacion de la presencia de un marcador molecular predictivo de un resultado clmico en un sujeto de cancer, presentando las etapas siguientes:
a. preparar una biblioteca de referencia de reorganizaciones geneticas asociadas a un resultado de cancer espedfico de muestras obtenidas de una pluralidad de sujetos que presentan un cancer conocido y un resultado clmico asociado a dicho cancer,
b. preparar una biblioteca de referencia de cambios morfologicos asociados a un resultado de cancer espedfico de muestras obtenidas de una pluralidad de sujetos que presentan un cancer conocido y un resultado clmico asociado a dicho cancer,
c. combinar la biblioteca de reorganizaciones geneticas con la biblioteca morfologica para obtener una biblioteca en la que los cambios morfologicos en las celulas de cancer se correlacionan o de asocian de otro modo a reorganizaciones geneticas espedficas en tipos individuales de cancer y resultados clmicos,
d. obtener datos cuantitativos de morfologfa celular a partir de una muestra de ensayo que contiene una unica celula o una poblacion de celulas obtenida de un sujeto de ensayo que se sospecha que presenta cancer,
e. comparar los datos cuantitativos de morfologfa celular obtenidos del sujeto de ensayo con la reorganizacion genetica y biblioteca morfologica agrupadas de la etapa c) con el fin de identificar la reorganizacion genetica espedfica presente en el sujeto de ensayo. Mas concretamente, el metodo puede caracterizada en que la presencia de una combinacion de caractensticas morfologicas y reorganizaciones geneticas proporciona la identificacion de un resultado clmico espedfico en el sujeto.
En dicho metodo, el metodo puede comprender ademas la confirmacion de la presencia de la reorganizacion genetica mediante la deteccion in situ de un marcador molecular.
Breve descripcion de varias vistas de los dibujos
Figura 1: ilustra el metodo de la presente tecnologfa en el que se adquieren los datos en bruto mediante obtencion
de imagenes espectrales cuantitativas se descompone basandose en la distribucion de la senal de longitudes de onda de la tincion nuclear y la deteccion de la sonda.
Figura 2: ilustra una vista ejemplar de un campo.
Figura 3: ilustra un grafico de dispersion del area media representada frente al coeficiente de la varianza (CV)
expresada como porcentaje del valor de la media.
Figura 4: ilustra un grafico de dispersion de la redondez media representado frente al coeficiente de la varianza
(CV) expresado como porcentaje del valor de redondez media.
Figura 5: ilustra un grafico de dispersion del area media (abscisa) representado frente al valor de redondez media
(ordenada).
Figura 6: ilustra un grafico de dispersion del area media (abscisa) representado frente al area de CV (ordenadas).
Los cores de cancer negativos para reorganizacion de ERG se representan en azul (rombos), los cores positivos solo para traslocacion de ERG se representan en magenta (cuadrados) y los cores positivos para traslocacion de ERG + delecion son verdes (triangulos).
Figura 7: ilustra un grafico de dispersion dla redondez media (abscisa) representado frente al redondez CV
(ordenada). Los cores de cancer negativos para reorganizacion de ERG se representan en azul (rombos), los cores positivos solo para traslocacion de ERG se representan en magenta (cuadrados) y los cores positivos para translocacion de ERG + delecion se representan en verde (triangulos).
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Figura 8: ilustra un grafico de dispersion del area media (abscisa) representado frente al redondez media
(ordenada). Los cores de cancer negativos para reorganizacion de ERG se representan en azul (rombos), los cores positivos solo para la traslocacion de ERG se representan en magenta (cuadrados) y los cores positivos para traslocacion de ERG + delecion se representan en verde (triangulos).
Figura 9: ilustra un grafico de la frecuencia de nucleos de cancer con una intensidad integrada total (DAPI) dada
obtenida de 1 campo por cada core.
Figura 10: ilustra un grafico de la significancia estadfstica y el analisis de regresion para el tamano nuclear y la
puntuacion de Gleason.
Figura 11: ilustra un grafico de la significancia estadfstica y el analisis de regresion para la forma nuclear
(redondez) y las reorganizaciones de ERG.
Descripcion detallada de la invencion
La presente tecnologfa proporciona un analisis cuantitativo de imagenes de muestras biologicas utilizando una nueva adquisicion unica de informacion multivariante de datos moleculares y morfologicos de celulas de cancer individuales analizadas en combinacion para proporcionar una especificidad y sensibilidad mejoradas con el fin de determinar los mecanismos subyacentes que controlan un cancer. Preferentemente, las celulas proceden de una muestra de tejido. Estos nuevos datos de tejido multivariantes pueden ayudar a estratificar el riesgo y ayudar en las decisiones de tratamiento en casos que de otra manera resultanan diffciles de clasificar basandose en la gradacion convencional de patologfas con biopsias tenidas con H y E unicamente.
La presente tecnologfa proporciona informacion para determinar los estados de pronostico patologico del cancer mediante de marcaje fluorescente de marcadores moleculares conjuntamente con enfoques especializados de obtencion de imagenes que implican la deteccion con resolucion espectral y el preprocesamiento de los datos. La presente tecnologfa proporciona un enfoque de obtencion de imagenes que puede adquirir y analizar la morfologfa nuclear en tejido que ha sido preparado para la deteccion de sondas espedficas de molecula en el tejido en un unico ciclo de adquisicion de datos. Este enfoque de obtencion de imagenes utiliza una combinacion de tecnologfas de marcaje, adquisicion, preprocesamiento y analisis. Se capta una imagen multidimensional y se analiza para separar y distinguir diferentes canales de analito de interes segun la longitud de onda de emision. Los canales de analito posteriores representan diferentes aspectos de los datos que cuantifican la morfologfa y la reorganizacion genetica, la expresion genetica y/o la expresion de protemas de la celula.
En una realizacion, de la presente tecnologfa, la recoleccion de datos y el analisis de la combinacion de informacion morfologica y de reorganizaciones geneticas de celulas de cancer individuales se analiza para proporcionar un nivel de confianza mas alto de la identificacion de los controladores subyacentes del cancer basados en el estudio patologico de lo que puede conseguirse mediante cualquier parte separada de la informacion considerada por sf sola. Los datos recogidos se comparan con caractensticas de poblaciones celulares analizadas previamente a fin de proporcionar una referencia para el tipo de cancer espedfico con el fin de determinar los mecanismos contributivos al subtipo de cancer. En la presente tecnologfa, la distribucion de marcadores y caractensticas de la poblacion de referencia pueden crearse mediante correlacion o asociacion de otro modo de los datos de la informacion morfologica y molecular in situ obtenida mediante el metodo de la presente tecnologfa en muestras que presentan un genotipo de cancer y resultado conocidos. De esta manera, las identidades de subtipo de cancer y la probabilidad asociada de resultado para un tipo espedfico de cancer se obtiene con intervalos de confianza estadfstica a partir de los datos morfologicos medidos y datos espedficos de reorganizacion genetica molecular. Los datos obtenidos de una muestra de cancer desconocida seguidamente pueden compararse con datos de los subtipos moleculares conocidos de la biblioteca de tejidos de cancer para proporcionar una identificacion mejorada de subtipos moleculares y la prediccion de resultados para la muestra de cancer desconocida.
Se encuentra contemplado que la presente tecnologfa pueda utilizarse para el pronostico de diferentes tipos de cancer, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, cancer de prostata, leucemia, cancer de cerebro, cancer cerebroespinal, cancer de vejiga, cancer de mama, cancer de cervix, cancer de utero, cancer ovarico, cancer de rinon, cancer de esofago, cancer de pulmon, cancer de colon, melanoma, neuroblastoma y cancer pancreatico. En una realizacion preferente de la presente tecnologfa, los metodos se utilizan para proporcionar una identificacion mejorada del subtipo molecular de cancer de prostata.
Entre las caractensticas morfologicas de la celula de cancer de la presente tecnologfa se incluyen la medicion y el analisis estadfstico de una diversidad de caractensticas nucleares, incluyendo el tamano, la morfologfa, la distribucion de la cromatina intranuclear ("textura de la cromatina"), la variabilidad internuclear de cantidad de marcaje de la cromatina (contenido de ADN o de cromatina), la presencia de macronucleolos y los patrones globales de crecimiento de los tejidos segun pone de manifiesto la distribucion nuclear. Se obtienen imagenes de las caractensticas morfologicas nucleares utilizando una tecnica de tincion del ADN fluorescente, por ejemplo DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, una tincion fluorescente que se une fuertemente a regiones ricas en A-T del ADN).
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Entre los ejemplos de otras tinciones fluorescentes del ADN se incluyen el yoduro de propidio (YP) y el bromuro de etidio, que pueden visionarse bajo un microscopio de fluorescencia utilizando una modalidad de iluminacion fluorescente. Las tinciones morfologicas absorbentes de la luz, tales como una tincion May-Grunwald-Giemsa, una tincion Giemsa, una tincion Papanicolau o una tincion de hematoxilina-eosina tambien pueden visualizarse mediante microscop^a optica. Las propiedades opticas constitutivas del tejido preparado, tal como el mdice de refraccion, tambien pueden aprovecharse para mejorar y/o identificar la forma del lfmite nuclear.
La reorganizacion genetica de acuerdo con la presente tecnologfa puede medirse mediante hibridacion in situ. La hibridacion in situ es un metodo util para detectar aberraciones cromosomicas mayores y/o menores. En dicho metodo, las sondas de acidos nucleicos marcadas se desnaturalizan y se aplican sobre celulas fijadas y desnaturalizadas. Las celulas en los estadios de metafase o interfase del ciclo celular permiten que las sondas se hibridan con secuencias espedficas en el genoma de las celulas. Entre los ejemplos de hibridacion in situ se incluyen, aunque sin limitarse a ellas, la hibridacion in situ fluorescente (FISH), la hibridacion in situ cromogenica (CISH), la hibridacion in situ marcada radioactivamente, la hibridacion in situ marcada con digoxigenina y la hibridacion in situ biotinilada. Se conocen de la tecnica numerosas tecnicas de marcaje de acidos nucleicos. Por ejemplo, un pigmento fluorescente puede unirse covalentemente al extremo 5' o 3' de una sonda de acidos nucleicos. Tras la hibridacion, la sonda marcada puede visualizarse directamente utilizando un microscopio fluorescente y la modalidad de campo oscuro. Puede llevarse a cabo una FISH utilizando metodos manuales y automatizados que son conocidos por el experto en la materia. En una realizacion particular del pronostico del cancer de prostata, los acidos nucleicos marcados para detectar las reorganizaciones de ERG pueden utilizarse en la FISH.
En la presente memoria, la expresion "mecanismo molecular" se refiere a la caracterizacion de las celulas de cancer basada en v arios parametros que se utilizan para determinar los cambios moleculares subyacentes del cancer y las opciones terapeuticas relevantes. La naturaleza multifactorial del cambio fenotfpico y el muestreo del os tejidos proporciona un nivel de confianza, en el que la presente tecnologfa proporciona un nivel mas alto de confianza en la identificacion de los mecanismos moleculares subyacentes de un cancer utilizando los metodos descritos de manera general en la presente memoria que cualquier metodo utilizado por si solo.
En una realizacion preferente, la presente tecnologfa proporciona un metodo para determinar adicionalmente los cambios moleculares subyacentes de una muestra de cancer de prostata mediante la realizacion de una unica recoleccion de datos de imagenes multivariante y el analisis de celulas de cancer de prostata individuales de la muestra. Este analisis multivariante incluye la realizacion de la tincion FISH para detectar la reorganizacion de ERG y tambien el analisis morfologico con la tincion DAPI de la misma celula. Los resultados del analisis tanto de reorganizacion de ERG como morfologico se recogen de una unica adquisicion de imagen de las celulas de la muestra de tejido de cancer de prostata y se analizan mediante comparacion de los resultados de cada celula en la poblacion de celulas espedficas de cancer muestreadas en la imagen con los resultados que han sido recogidos y compilados en la biblioteca de poblaciones de celulas de cancer de referencia con cambios moleculares conocidos y los cambios morfologicos medibles correspondientes. La biblioteca de celulas de cancer de prostata esta compuesta de datos recogidos de las muestras de tejido de cancer de prostata con reorganizaciones geneticas conocidas. Esta realizacion y el desarrollo de la biblioteca celular de cancer de prostata se describe en mayor detalle en los ejemplos, tal como se detalla posteriormente.
Tal como se indica en los ejemplos, se consiguieron tanto datos morfometricos y fotometricos de alta calidad que representan la morfologfa nuclear basica como el contenido relativo de cromatina nuclear revelado por la tincion DAPI de secciones de tejido preparadas para la hibridacion in situ fluorescente (FISH). Se utilizo el analisis FISH para determinar la reorganizacion de un gen particular (ERG) que participa en sucesos tempranos que controlan el cancer de prostata, y estos datos conjuntamente con el tamano nuclear, la forma nuclear y el contenido relativo de cromatina de nucleos medidos en combinacion pueden utilizarse para comparar con una biblioteca de estado de ERG de cancer de prostata conocido y grado morfologico.
Por ejemplo, se creo una biblioteca espedfica de la reorganizacion por insercion de ERG en celula de cancer de prostata mediante la recoleccion de caractensticas basicas de tamano nuclear (area), forma nuclear (redondez) y cantidad de tincion contenida en el nucleo (intensidad integrada) de nucleos de cancer seleccionados de entre 150 cores de tejido diferentes que representan una cohorte retrospectiva en un tejido. Ademas de las mediciones basicas, el coeficiente de la varianza (CV) se calculo para las caractensticas de tamano y forma para cada core, permitiendo una comparacion mas sencilla de la relacion entre variabilidad del tamano nuclear en un core y la variabilidad de la forma nuclear en los mismos cores. El CV tambien permite investigar la relacion entre el tamano y forma nucleares medios y la correlacion con la dispersion de dichos valores en un core. De media, se muestrearon 4 campos de vision para cubrir cada core de tejido y cada core de tejido representa un foco de cancer individual. Se midieron y evaluaron varios miles de nucleos que representaban diferentes estadios de grado patologico con el fin de producir dichos datos de biblioteca. Pueden analizarse bibliotecas espedficas de otros canceres de una manera similar tal como se indica para el cancer de prostata en la presente memoria.
La presente tecnologfa utiliza una implementacion estandarizada de la obtencion de imagenes espectrales
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fluorescentes para la adquisicion de imagenes destinadas a la medicion de patolog^a nuclear y sondas moleculares in situ. Las imagenes fluorescentes proporcionan ventajas significativas respecto a las imagenes de campo brillante en terminos de linealidad, contraste y rango dinamico. Este enfoque de obtencion de imagenes nucleares esta disenado para producir datos de imagenes estandarizadas de muy alta calidad bajo condiciones de no inmersion (preferentemente a una magnificacion de 32x, aunque pueden obtenerse imagenes secas de alta resolucion a una diversidad de magnificaciones opticas). Resolucion espacial, rango dinamico y senal: el ruido generado en los datos en bruto esta altamente controlado mediante la utilizacion de un tren optico, tecnologfa de sensores y de iluminacion bien caracterizados. Los factores que presentan un impacto sobre los datos (nivel de iluminacion, magnificacion, apertura numerica, tamano de los pfxeles de los sensores, exposicion de la camara, etc.) se hacen corresponder y se estandarizan cuidadosamente para maximizar el rendimiento para los requisitos de la aplicacion. Debido a que se cualifican y se calibran los parametros de ruido del sistema, puede garantizarse la significancia estadfstica de los niveles de brillantez. Los lfmites de resolucion espacial en los planos X, Y y Z se entienden bien y se optimizan para producir datos de alta calidad.
En algunas realizaciones, puede combinarse un grado anatomico Gleason y otras variables clmicas importantes con dichos datos de morfologfa nuclear y correlacionarse con el resultado del paciente en un analisis posterior con el fin de revelar los factores predictivos mas significativos.
El grado Gleason es un patron de puntuacion para el cancer de prostata que es conocido de la tecnica. Brevemente, el patologo asigna un grado al patron tumoral mas comun y un segundo grado al segundo patron tumoral mas comun. Los dos grados se unen para generar una puntuacion de Gleason. El grado Gleason tambien se conoce como patron Gleason y la puntuacion de Gleason tambien se conoce como suma de Gleason. El grado Gleason o el patron Gleason se encuentra comprendido entre 1 y 5, siendo 5 el peor pronostico.
La presente tecnologfa proporciona una nueva aplicacion de tecnologfas de obtencion de imagenes para cuantificar multiples variables de secciones de tejido preparadas para la fluorescencia in situ multianalito. Entre los multiples puntos de datos se incluyen la reorganizacion de un gen particular (tal como ERG) que participan en sucesos tempranos que controlan el cancer de prostata, el tamano nuclear, la forma nuclear y el contenido relativo de cromatina de nucleos medidos en una unica imagen adquirida.
La presente tecnologfa utiliza equipos y procesamiento para la obtencion de imagenes espectrales cuantitativas cuidadosamente optimizadas para proporcionar informacion morfologica de alta calidad que puede medirse objetiva y fiablemente en el software. Los equipos y software de obtencion de imagenes adecuados se describen en los ejemplos, posteriormente. Se interroga el tamano nuclear (area) y la forma nuclear (redondez) a partir de una micromatriz de tejidos (MMT) bien caracterizada. La presente tecnologfa demuestra que los valores elevados de tamano nuclear se correlacionan con una probabilidad mas alta de pertenecer a un cancer de grado morfologico Gleason mas alto en el cancer de prostata.
La presente tecnologfa proporciona una nueva capacidad de medir objetivamente la morfologfa y correlacionar la morfologfa con la reorganizacion molecular en la misma seccion de tejido, proporcionando una sensibilidad y especificidad mejoradas en la determinacion de la condicion de insercion, tal como demuestra la asociacion estadfsticamente relevante de la reorganizacion por insercion de ERG y la mayor irregularidad de la forma nuclear (menor redondez), tal como se demuestra en los ejemplos, posteriormente.
En enfoque de obtencion de imagenes espectrales cuantitativas y analisis morfometrico nuclear de la presente tecnologfa proporciona informacion cuantitativa sobre la intensidad integrada relativa para caractensticas segmentadas. Esta informacion puede utilizarse de una manera unica, por ejemplo para medir el contenido relativo de cromatina en tejido fijado en formalina e incluido en parafina preparado mediante procedimientos de FISH automatizado. Se encuentra contemplado que dicho enfoque se utilice adicionalmente para determinar las celulas en division rapida o las condiciones de ploidfa anomala en muestras preparadas para el analisis multiplexado de analitos.
El experto en la materia reconocera que pueden realizarse modificaciones en la presente tecnologfa sin apartarse del espmtu o alcance de la invencion. La invencion se ilustra adicionalmente mediante los ejemplos siguientes, los cuales no deben interpretarse como limitativos de la invencion en espmtu o alcance a los procedimientos o composiciones espedficos indicados en la misma.
Ejemplos
Valor correlativo con la morfologia nuclear y la reorganizacion de ERG para las celulas de cancer de prostata
Las tecnologfas cuantitativas se han hecho avanzar y se han aplicado en el presente estudio para permitir la extraccion de datos morfometricos de tejido preparado para el analisis molecular in situ fluorescente de sondas multiplexadas. Se utiliza un enfoque de obtencion de imagenes espectrales altamente caracterizado para producir datos de alta resolucion (resolucion de longitudes de onda, resolucion espacial y resolucion de intensidad) (figura 1). La figura 1 ilustra las etapas de la presente tecnologfa en la que los datos en bruto adquiridos mediante obtencion de imagenes
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espectrales cuantitativas se descompone basandose en la distribucion de las senales de longitud de onda de la tincion nuclear y la deteccion de sondas. Lo anterior produce una imagen cuantificable que representa la distribucion relativa real del marcaje sobre la seccion de tejido. La proporcion de senal a ruido de dichas imagenes es muy elevada, en parte debido a la capacidad de separar la senal real de senales contaminantes constitutivas del tejido.
Dichos datos se procesan posteriormente para proporcionar mediciones de caractensticas nucleares en secciones de tejido de cancer de prostata. Los datos producidos mediante la utilizacion de imagenes espectrales se descomponen basandose en la distribucion de las senales de longitud de onda de la tincion nuclear y la deteccion de sondas; lo anterior produce una imagen cuantificable que representa la distribucion relativa verdadera del marcaje sobre la seccion de tejido. La proporcion de senal a ruido de dichas imagenes es muy elevada, en parte debido a la capacidad de separar la senal verdadera de las senales contaminantes constitutivas del tejido.
La morfologfa nuclear y el contenido relativo de cromatina nuclear se evaluaron mediante tincion DAPI de secciones de tejido preparadas para la hibridacion in situ fluorescente (FISH). Las caractensticas basicas de tamano nuclear (area), forma nuclear (redondez) y cantidad de tincion contenida en el nucleo (intensidad integrada) se extrajeron de los nucleos de cancer seleccionados de entre 150 cores de tejido diferentes que representaban una cohorte retrospectiva en una matriz de tejidos (CTMA 17.1). Ademas de las mediciones basicas, se calculo el coeficiente de la varianza (CV) para las caractensticas de tamano y forma para cada core, permitiendo una comparacion mas sencilla de la relacion entre la variabilidad del tamano nuclear en el core y la variabilidad de la forma nuclear en los mismos cores; el CV tambien permitio investigar la relacion entre el tamano y forma nucleares medios y la correlacion con la dispersion de dichos valores dentro de un core. De promedio, se muestrearon 4 campos de vision para cubrir cada core de tejido, y cada core de tejido representaba un foco de cancer individual. Se midieron varios miles de nucleos que representaban diferentes estadios de grado patologico para producir dichos datos.
Las muestras se prepararon de manera automatizada que habfa sido optimizada para el interrogatorio molecular multiplexado con tecnologfa de deteccion de puntos cuanticos y contratincion nuclear DAPI. Los datos espectrales se obtuvieron de CTMA 17.1 utilizando un microscopio Zeiss AxioImager.M2 (Zeiss Microimaging, Thornwood, NY) configurado con un objetivo 20X N.A 0.85 plan con correccion apocromatica en serie con un lente de tubo de 1,6X con correccion apocromatica que genera una magnificacion total de 32X con una profundidad de campo de 1,8 micrometros. Esta magnificacion total se habfa determinado previamente que produda datos de imagen limitados por la difraccion optica (resolucion de la imagen de ~0,4 micrometros) convolucionada con las dimensiones de pixel de 6,5 micrometros del sensor de imagenes CCD incorporado en el sistema. Se utilizo un filtro de interferencia de paso largo con corte de 409 nm (Omega, Brattleboro, VT) para separar la senal visible de la excitacion de fluorescencia. Para la excitacion DAPI se utilizo una fuente de luz de UV proximo estabilizada con bucle cerrado (Exfo (ahora Lumen Dynamics) Exacte, Ontario, CA), calibrada para proporcionar una fluencia integrada de 110 mW (370 nm ±20 nm) en el plano de muestra a traves del objetivo de 20X. Para permitir un registro de la estructura del tejido extranuclear e informacion contextual, se utilizo una luz transmitida filtrada a 710 nm +/-10 nm y calibrada a una fluencia integrada de 1,27 mw en el plano de muestra, para capturar datos contextuales en la misma adquisicion espectral.
Dicha estrategia de obtencion de imagenes utiliza una fuente de luz estabilizada capaz de repetir la iluminacion en el plano de muestra con menos de 1% de variacion en el nivel absoluto de iluminacion; el nivel de iluminacion tambien puede ajustarse de manera lineal en incrementos de 1%. Mas comunmente, el rango de iluminacion para la deteccion de puntos cuanticos se restringe al rango del UV proximo. La combinacion de una fuente de luz cuantitativa calibrada (haluro de metal de bucle cerrado) y un sistema de deteccion cuantitativa calibrado (deteccion espectral basada en CCD) garantiza que la variabilidad de los niveles de brillantez pueda trazarse al origen en la muestra y reflejar la distribucion real de la tincion. Pueden medirse las variaciones relativas de la tincion con elevada repetibilidad. De esta manera, ahora resulta posible analizar la variabilidad en las intensidades de tincion nuclear y de la cromatina entre nucleos y extraer conclusiones que pueden resultar utiles para determinar el contenido relativo de cromatina en los nucleos.
Se adquirieron datos espectrales utilizando un interferometro Sagnac en una configuracion de espectrometro de imagenes (Malik Z. et al., J. Microsc. 182:133-140, 1996); se configuraron los parametros de adquisicion del interferometro para proporcionar una resolucion espectral de 5 nm a 7 nm en el rango de longitudes de onda visibles (400 nm a 800 nm) en una serie de adquisicion rapida de exposiciones. Los datos espectrales que conteman intensidades de todas las longitudes de onda visibles en cada pixel se desconvolucionaron en canales espedficos de longitud de onda que representaban la contribucion DAPI pura y la contribucion contextual (700 nm a 720 nm) a la senal total mediante descomposicion lineal (Garini Y. et al., Cytometry Part A. 69A:735-747, 2006). Se llevo a cabo la descomposicion lineal utilizando espectros de referencia normalizados para DAPI y los componentes de iluminacion de IR proximo. Los espectros de referencia se adquirieron utilizando instrumentacion identica bajo condiciones estandarizadas para cancelar la influencia de la respuesta dependiente de las longitudes de onda opticas. Este enfoque permite proporciones de senal a ruido ideales de cada componente espectral. De esta manera, el contenido relativo de DAPI de los nucleos de cancer individuales en un campo de vision puede medirse con exactitud conjuntamente con las caractensticas especiales; ello ayuda a controlar la posibilidad de nucleos parciales debido al seccionado histologico y puede proporcionar informacion adicional.
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De promedio, se requirieron cuatro campos de vision para cubrir cada core. Los campos se ajustaron interactivamente para maximizar la captura de los nucleos glandulares. Los cores danados, los no cancerosos y los campos no informativos fueron excluidos de los analisis. Las intensidades maximas de imagen en un campo de vision se normalizaron para que se encontrasen comprendidas en 3/4 del Kmite superior del rango dinamico del sensor de imagen (16.000 e- de capacidad de pozo) mediante el ajuste del tiempo de exposition.
Las imagenes que representan los componentes espectrales individuales se obtuvieron de software de adquisicion espectral como datos monocromaticos de 16 bits. El software de analisis de imagen (Imagen Pro Analyzer 7.0, Media Cybernetics, Bethesda, MD) se calibro espacialmente a la magnification de adquisicion de 32X para permitir la expresion de las mediciones en unidades micrometricas. Se aplico un filtro de paso alto de Fourier a cada imagen como etapa de preprocesamiento con el fin de incrementar las transiciones de limite de los nucleos (Russ J.C., The Image Processing Handbook, New York: CRC Press LLC, 2002). Se determinaron los umbrales para las caracteristicas nucleares en la imagen con el fin de separar los objetos en estrecha proximidad.
Los nucleos no glandulares, los nucleos no de cancer y las estructuras irrelevantes se eliminaron manualmente de cada campo de vision, de manera que solo se mantuviesen los nucleos glandulares cancerosos (figura 2). Este procedimiento de elimination fue guiado por un patologo principal. La figura 2 muestra un ejemplo de campo de vision. La imagen de la izquierda representa un ejemplo del campo de vision. La imagen de la izquierda representa la morfologia del tejido en el campo adquirido tal como la proporciona los componentes espectrales contextuales nucleares y del tejido. La imagen de la derecha representa el componente DAPI y las caracteristicas nucleares segmentadas tras deseleccionar manualmente los nucleos irrelevantes o pobremente segmentados.
De esta manera, se midieron objetivamente los parametros de forma nuclear relevantes con el software, con gma medica experta para garantizar el mmimo ruido en los datos de celulas irrelevantes y estructuras extranas. Tras deseleccionar los nucleos irrelevantes, se guardaron las siluetas nucleares en archivos separados y se exportaron las mediciones de area, redondez e intensidad integrada a Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA). El area se expresa en pixels, con 0,2 micrometros/pixel. Se calculo la redondez utilizando la formula siguiente:
penmetro2 4 pix area
- en la que un circulo perfecto presentara un redondez de 1, y una desviacion creciente respecto al redondez presentara un valor superior a 1. La intensidad integrada es la suma de todos los valores de pixel contenidos en un nucleo; cada pixel puede presentar un valor comprendido entre 0 y 65.536 (escala de 16 bits). La intensidad integrada es una medida indirecta del contenido de cromatina despues del procesamiento del tejido; el contenido relativo de cromatina es fiablemente informado por la tincion intercalante DAPI (Coleman A.W. et al., J. Histochem. Cytochem. 29:959-968, 1981).
Los datos CTMA17-1 se guardaron en un directorio que contema una unica carpeta para cada core que se habia analizado. Dentro de cada carpeta se encuentran los archivos de imagen contextual DAPI y anatomico del tejido (formato *.tif de 16-bits monocromo) para cada campo de vision de ese core particular. La carpeta contema ademas los archivos de silueta guardados para cada imagen DAPI analizada (formato propietario de ImagePro). Ademas, se exportaron los datos numericos a una hoja de calculo de Microsoft Excel que contema los datos de recuentos para ese corte al ser exportado desde Image Pro Analyzer 7.0 (Media Cybernetics, Bethesda, MD).
Se utilizo un archivo de Microsoft Excel en el directorio CTMA 17.1 principal para medir los datos de mediciones en bruto para el analisis posterior. La hoja de calculo del archivo contema todos los datos de cada core (cada core presentaba su propia hoja de calculo marcada), asi como una hoja de calculo de resume que contema valores medios y coeficientes de varianza para area y redondez para cada core, asi como graficos que mostraban sus relaciones mutuas. La carpeta principal contema otra hoja de Microsoft Excel titulada "Datos de histograma", que contema un histograma creado a partir de las intensidades de DAPI integradas y normalizadas. Para este histograma se utilizo un campo por cada core canceroso.
Se resumieron los resultados preliminares y despues se sometieron a analisis estadistico y de regresion adicional. El objetivo del analisis estadistico para este estudio era evaluar cuantitativamente las caracteristicas morfometricas y fotometricas de los nucleos de cancer en el contexto de la progresion tumoral. Para ello, se analizaron las variables de tamano nuclear (area), forma nuclear (redondez) y contenido relativo de cromatina (intensidad normalizada) frente a los puntos finales de grado Gleason, estado de reorganization de ERG y celulas tumorales vs. benignas.
Con el fin de evaluar la posibilidad de diferencias de distribution de la forma o tamano nucleares o el contenido de cromatina con respecto al estado de reorganizacion de ERG, se utilizo la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para someter a ensayo la hipotesis nula de que no exisria ninguna diferencia entre tipos de reorganizacion (normal, reorganizacion mediante insertion, reorganizacion mediante deletion) y su redondez, tamano o contenido de cromatina. En las situaciones en las que se detecto una diferencia estadisticamente significativa en un grupo de reorganizacion, se llevo a cabo un analisis de regresion logistica.
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Con el fin de evaluar la posibilidad de diferencias de distribucion de la forma o tamano nucleares o el contenido de cromatina con respecto a un estado con puntuacion de Gleason superior a 6 (en comparacion con una puntuacion de Gleason inferior a 6), se utilizo la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para someter a ensayo la hipotesis nula de que no existfan diferencias entre Gleason >6 y Gleason =<6 y la redondez, tamano o contenido de cromatina. En situaciones en las que se detectaba una diferencia estadfsticamente significativa entre grupos de Gleason, se llevo a cabo un analisis de regresion logfstica.
Se resumen posteriormente y en las figuras los resultados preliminares de tamano y forma; antes del analisis estadfstico se representaron los valores que representaban el tamano y la forma para cores individuos con codificacion de color para nucleos normales vs. nucleos de cancer, y para el estado de reorganizacion de ERG en nucleos de cancer (figura 3, figura 4 y figura 5). Cada punto de datos representa el valor de varios campos recogidos de un core micromatriz. Los cores de cancer se representan en azul (rombos) y los cores normales, en magenta (cuadrados).
Se creo un histograma de contenido de DAPI integrado, normalizado respecto a la intensidad integrada de los nucleos mas brillantes, con el fin de proporcionar una medida del contenido relativo de cromatina remanente en los nucleos con imagenes obtenidas de los tejidos seccionados y procesados (figura 9). Los valores se normalizaron para cada campo de vision de manera que los nucleos en el campo con la intensidad integrada mas alta se les asignase un valor de 1. Los nucleos con la mitad de intensidad integrada se esperana que presentasen un valor de 0,5. Se esperana que los valores mas frecuentes representasen los nucleos con 2 juegos de cromosomas (2N), tal como se esperana para las celulas en interfase, y los valores mas brillantes representanan los nucleos con mas de 2 juegos de cromosomas, tal como se esperana en la poliploidfa o en celula s en division. Existe una distribucion de valores de intensidad integrada consistente con dicho modelo; ello proporciona cierta evidencia para controlar la posibilidad de que los nucleos han sido seccionados en diferentes planos.
Los analisis estadfsticos y de regresion adicionales de dichos datos preliminares revelan diferencias significativas de tamano nuclear para las puntuaciones anatomicas de Gleason superiores a 6 (por ejemplo Gleason 3+4) (figura 10). Los resultados indican que los nucleos de mayor tamano es mas probable que esten asociados a un grado de Gleason superior a 6.
El analisis estadfstico revela ademas diferencias significativas en el caso de nucleos de cancer con ERG reorganizado en comparacion con nucleos de cancer con ERG normal. Se observa ademas una asociacion estadfsticamente relevante entre menos redondez y la reorganizacion de ERG por insercion (figura 11). Los resultados indican que los nucleos de forma irregular es mas probable que esten asociados a reorganizaciones de ERG y en particular sucesos de unicamente insercion de ERG.
A continuacion, se describe la presente tecnologfa en terminos lo suficientemente completos, claros y concisos para permitir al experto en la materia a la que se refiere la misma, ponerla en practica. Debe entenderse que lo anteriormente indicado describe las realizaciones preferentes de la presente tecnologfa y que pueden llevarse a cabo modificaciones en la misma sin apartarse del esprntu o alcance de la tecnologfa dada a conocer, tal como se indica en las reivindicaciones adjuntas. Ademas, los ejemplos se proporcionan a tttulo no exhaustivo sino ilustrativo de varias realizaciones que se encuentran comprendidas dentro del alcance segun las reivindicaciones.

Claims (11)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    REIVINDICACIONES
    1. Metodo diagnostico del cancer multivariante, comprendiendo el metodo:
    a. obtener datos de marcadores moleculares de una unica muestra de un sujeto que comprende una unica celula o poblacion de celulas procedente de un tejido, en el que el marcador molecular es una reorganizacion genetica,
    b. obtener datos cuantitativos de la morfologfa celular de la misma celula individual o poblacion de celulas utilizada en la etapa (a), en la que los datos de marcadores de la morfologfa celular son el tamano nuclear, la forma nuclear y el contenido de ADN,
    c. llevar a cabo un analisis multivariable de dicha muestra unica para generar un conjunto de datos de analisis multivariable que comprende datos cuantitativos de marcadores de la morfologfa celular de la etapa (b) y datos de marcadores moleculares de la etapa (a),
    d. comparar los datos de analisis multivariable obtenidos en la etapa (c) con un conjunto de datos de analisis multivariable de referencia creado mediante la obtencion de tanto datos de marcadores moleculares como datos cuantitativos de morfologfa celular de muestras celulares de cancer y de no cancer obtenidas de individuos con resultado clmico conocido, en el que el marcador molecular es una reorganizacion genetica y los datos de marcadores de la morfologfa celular son el tamano nuclear, la forma nuclear y el contenido de ADN, y
    e. predecir un resultado clmico definido por combinaciones espedficas de datos de marcadores de la morfologfa celular y datos de marcadores moleculares asociados estadfsticamente con la progresion, incidencia y metastasis del cancer u otro determinante de resultado clmico observado en el conjunto de datos de analisis multivariable de referencia.
  2. 2. Metodo segun la reivindicacion 1, en el que la reorganizacion genetica es una reorganizacion del gen ERG.
  3. 3. Metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la celula unica o poblacion de celulas de un tejido es una unica
    celula o poblacion de celulas asociada a un cancer seleccionado de entre el grupo que consiste de leucemia, linfoma, cancer de cerebro, cancer cerebroespinal, cancer de vejiga, cancer de prostata, cancer de mama, cancer de cervix, cancer de utero, cancer ovarico, cancer de rinon, cancer de esofago, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer pancreatico y melanoma.
  4. 4. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 3, en el que la reorganizacion del gen ERG se detecta mediante hibridacion in situ.
  5. 5. Metodo segun la reivindicacion 4, en el que la reorganizacion del gen ERG se detecta mediante hibridacion in situ fluorescente (FISH) utilizando acido nucleicos marcados fluorescentemente.
  6. 6. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que se detecta el tamano nuclear, la forma nuclear y el contenido de ADN utilizando una tecnica de tincion de ADN fluorescente.
  7. 7. Metodo segun la reivindicacion 6, en el que la tecnica de tincion de ADN fluorescente es una tincion DAPI.
  8. 8. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que la reorganizacion del gen ERG y el tamano
    nuclear, la forma nuclear y el contenido de ADN se cuantifican mediante obtencion de imagenes espectrales fluorescentes con el fin de proporcionar datos de imagenes espectrales cuantitativas.
  9. 9. Metodo segun la reivindicacion 8, en el que el conjunto de datos de analisis multivariable se crea utilizando los datos de imagenes espectrales cuantitativas.
  10. 10. Metodo segun la reivindicacion 9, en el que los datos de imagenes espectrales cuantitativas son la resolucion de longitudes de onda, la resolucion espacial y la resolucion de intensidad de las senales de fluorescencia detectadas mediante la tecnica de tincion de ADN fluorescente y la hibridacion in situ fluorescente.
  11. 11. Metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 2 a 10, en el que la reorganizacion del gen ERG es una insercion en el gen ERG, o la delecion de la region 5' de ERG, y los datos de marcadores de la morfologfa celular son de redondez irregular de los nucleos celulares.
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