ES2588436T3 - Análogos de interferón - Google Patents

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ES2588436T3 ES10807562.3T ES10807562T ES2588436T3 ES 2588436 T3 ES2588436 T3 ES 2588436T3 ES 10807562 T ES10807562 T ES 10807562T ES 2588436 T3 ES2588436 T3 ES 2588436T3
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ES
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amino acid
receptor
acid sequence
ifny
sequence
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Klaas Poelstra
Jai Prakash
Eleonora Beljaars
Ruchi Bansal
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Biorion Technologies BV
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Abstract

Análogo de interferón gamma (IFNγ), donde la fracción que media la unión a su receptor natural está al menos funcionalmente interrumpida y donde el análogo comprende una fracción de señalización capaz de mediar la actividad de IFNγ intracelular, donde la fracción de señalización comprende en el extremo C-terminal del análogo una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: (a) la secuencia de aminoácidos KFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR; (b) la secuencia de aminoácidos YSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQ; (c) una secuencia de aminoácidos que muestra al menos 90% de identidad con (a) o (b) siempre que la actividad de señalización intracelular se mantenga; (d) la secuencia de aminoácidos (a) o (b) donde como mucho residuos de aminoácidos son eliminados, adicionados o sustituidos, siempre que la actividad de señalización, por ejemplo translocación nuclear, se mantenga; (e) la secuencia de consenso Vxxxx[V/I]Q[R/H][Q/K]A[F/V/I][N/H]ELI[R/Q] Vx[H/A][Q/E]L[L/S]P[E/A][S/A][S/A][L/K]xxKRKRS donde x es cualquier residuo de aminoácido; y (f) la secuencia Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4 Val Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Gln Xaa10 Xaa11 Ala Xaa12 Xaa13 Glu Leu Ile Xaa14 Val Xaa15 Xaa16 Xaa17 Leu Xaa18 Pro Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23Lys Arg Lys Arg Ser Xaa24 Xaa25, donde Xaa1, Xaa2, Xaa3 Xaa4 Xaa6 Xaa11, Xaa13, Xaa14, Xaa16 Xaa17, Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 y Xaa25 es cualquier residuo de aminoácido Xaa5 es Asn o Thr Xaa7 es Pro o Leu Xaa8 es Gln o Asn Xaa9 Val, Ile o Leu Xaa10 es Arg, His o Lys Xaa12 es Phe, Val o Ile Xaa15 es Val, Ile o Met dicha fracción de señalización está provista en su N-término, opcionalmente vía un enlazador, con al menos un dominio de selección capaz de unión a un receptor de superficie celular diferente del receptor de IFNγ, donde dicho dominio de selección puede enlazar con el receptor de PDGFß, el receptor de manosa6-fosfato/factor- II de crecimiento tipo insulina (M6P/ IGF2R), el receptor de asialoglicoproteína (ASGP) o el receptor de manosa (CD 206).

Description

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DESCRIPCION
Analogos de interferon
[0001] La invencion se refiere al campo de la medicina. Entre otros, se refiere a analogos biologicamente activos de interferones (IFNs) que muestran efectos secundarios menos deseados y a los usos terapeuticos de los mismos.
[0002] Alrededor de 10 IFNs diferentes se han identificado en mamiferos; siete de ellos se han descrito para seres humanos. Se dividen tipicamente en tres clases: IFN tipo I, IFN tipo II e IFN tipo III. Todos los IFNs tipo I enlazan con un complejo receptor de superficie celular especifico conocido como el receptor de IFN-a (IFNAR) que consiste en las cadenas IFNAR1 e IFNAR2. Los interferones tipo I presentes en los seres humanos son IFN-a, IFN-p e IFN-w. El interferon tipo II se enlaza a IFNGR. En los seres humanos este es IFN-y. Por la interaccion con sus receptores de superficie celular especificos, los IFNs activan el transductor y el activador de senal de complejos de transcripcion (STAT); los STATs son una familia de factores de transcripcion que regulan la expresion de determinados genes del sistema inmunologico. Algunos STATs se activan tanto mediante los IFNs de tipo I como de tipo II. Sin embargo, cada tipo de IFN puede tambien activar STATs unicos (Platanias, L. C. 2005 Nature reviews. Immunology 5 (5): 375-386).
[0003] IFNs de todas las clases de IFN son muy importantes para combatir las infecciones viricas. Aunque reciben su nombre por su capacidad para "interferir" con la replicacion virica dentro de las celulas huesped, los IFNs tienen otras funciones: activan las celulas inmunes, tales como las celulas asesinas naturales y los macrofagos; aumentan el reconocimiento de infecciones o celulas tumorales mediante la sobrerregulacion de la presentacion de antigenos para los linfocitos T; y aumentan la capacidad de las celulas huesped no infectados para resistir a nuevas infecciones por virus. Ciertos sintomas del huesped, tales como dolores musculares y fiebre, estan relacionados con la produccion de IFNs durante la infeccion.
[0004] IFNy es una citocina pleiotropica producida por las celulas inmunes activadas. Actua a traves del IFNy receptor que es expresado casi en todos los tipos de celulas, sin embargo muestra una especificidad de especies estricta. IFNy se ha aplicado al tratamiento de enfermedades inmunologicas, viricas y cancerosas (Younes and Amsden, J Pharm Sci 2002) con efectos significativos. Ademas, diferentes estudios han demostrado el papel potencial de IFNy en la fibrosis renal y de higado (Kidney Int. 1999;56:2116-27, Hepatology 1996 23:1189-99). Desafortunadamente, la corta vida media de circulacion y los efectos secundarios sistemicos indeseables de los interferones actualmente disponibles han limitado su aplicacion clinica e incluso ensayos clinicos se han detenido. Muchos intentos se han hecho para circunvenir estos problemas, por ejemplo mediante la incorporacion de IFNy en liposomas, microesferas y elastomeros (Pharm Res. 2000 17:42-8, Pharm Res. 1996 13:1464-75, J Control Release. 2005 102:607-17). Metodos de entrega especificos de celula no se han usado hasta el momento. Esto no es sorprendente debido al hecho de que tal metodo se ha considerado generalmente imposible para las citocinas que necesitan ser entregadas a sus propios receptores para suscitar un efecto biologico, de modo que siempre acaban en celulas diana que expresan estos receptores. La entrega a otros receptores diana sera por lo tanto en la mayoria de los casos inutil y a lo mejor llevara a la asimilacion en otros tipos de celulas causando la perdida de actividad o mayor diversificacion de los efectos adversos. Sin embargo, los presentes inventores reconocieron que la estructura del IFN ofrece oportunidades unicas de focalizacion ya que la molecula contiene una fraccion de union al receptor que es especifica de especies y una fraccion de senalizacion que es no es especifica de especies y que actua intracelularmente. Se descubrio sorprendentemente que la estructura unica de IFNy permite entregar la fraccion de senalizacion de IFNy a otro receptor objetivo, siempre que este nuevo receptor objetivo permita la liberacion intracelular de esta fraccion de senalizacion y la activacion posterior de la via de senalizacion del IFNy intracelular/nuclear. Por ejemplo, un IFNy truncado mimetico dirigido al receptor del Factor de Crecimiento Derivado de las Plaquetas (PDGF) mostro significativamente menos efectos secundarios sistemicos en un modelo de raton con dano hepatico agudo cuando se comparo con IFNy de longitud total o IFNy no dirigido mimetico.
[0005] Por consiguiente, la invencion se refiere a un analogo de interferon (IFN), donde la fraccion que media la union a su receptor natural es al menos funcionalmente interrumpida y donde el analogo comprende una fraccion de senalizacion capaz de mediar la actividad IFN intracelular, dicha fraccion de senalizacion es proporcionada en su N- termino, opcionalmente via un enlazador, con al menos un dominio objetivo capaz de enlazar a un receptor de superficie celular diferente del receptor de IFN. Preferiblemente, el analogo es un analogo de IFN gamma (IFNy).
[0006] Analogos de interferones provistos de una fraccion de seleccion heterologa se conocen en la tecnica. La WO2008/068621 divulga un producto de conjugacion de IFNy y una fraccion de seleccion, tal como una fraccion de seleccion de tumor o una fraccion de seleccion de vasculatura tumoral. El estado de la tecnica solo divulga la conjugacion para IFNy de longitud total, que todavia enlazara con su receptor nativo causando efectos adversos.
[0007] La EP0844252 pretende proporcionar peptidos ciclicos y su proceso de preparation, que permiten injerto quimico posterior en el acoplamiento en dichos peptidos ciclicos, es decir, su fijacion a un soporte solido, a un compuesto de peso molecular alto, a un marcador y/o a otros peptidos ciclicos, para proporcionar aplicaciones biotecnologicas nuevas o mejoradas, particularmente en el campo de la cromatografia de afinidad, inmunizacion, desarrollo de pruebas de diagnostico, vacunas y composiciones farmaceuticas. Ensena el acoplamiento de ligandos de peptido ciclico a moleculas biologicas, entre otros a interferones. No se hace ninguna mention en la EP0844252 acerca del uso de una molecula de IFN truncada que carezca de un dominio de union funcional para su receptor natural.
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[0008] Un interferon analogo de la presente invencion tiene ventajas claras e inesperadas sobre el uso de un interferon de longitud total (modificado), no solo con respecto a su uso terapeutico (menos efectos secundarios, eficacia aumentada, antigenicidad reducida debido a peso molecular inferior) sino tambien a su proceso de production (sintesis recombinante).
[0009] La interruption funcional de la fraction que media la union a su receptor natural se puede conseguir eliminando, insertando, substituyendo uno o varios residuos de aminoacidos pertinentes en el dominio de union al receptor. Dominios de union al receptor de interferon se han identificado y se conocen en la tecnica. Por ejemplo, union de IFNy murino al receptor de IFNy se puede abolir borrando al menos parcialmente los primeros 40, 30 o 20 residuos N- terminales.
[0010] En una forma de realization, el analogo es un polipeptido de IFNy truncado que solo contiene los residuos implicados en la serialization intracelular. Como se utiliza en este caso, la serialization intracelular puede comprender translocation nuclear y/o actividad antivirica.
[0011] Preferiblemente, la fraccion de senalizacion que media la actividad intracelular comprende un motivo de senal de localization nuclear polibasica (NLS) como se encuentra en el C-termino de IFN humano y murino (Subramaniam et al. 2000, J. Cell Science 113, 2771-2781). Este motivo de NLS se cree que forma un complejo con un transductor de senal y activador de transcription (STAT); STATs son una familia de factores de transcription que regulan la expresion de determinados genes del sistema inmunologico. Algunos STATs se activan mediante los IFNs tanto de tipo I como de tipo II. Sin embargo cada tipo de IFN puede tambien activar STATs unicos (Platanias, L. C. 2005 Nature reviews. Immunology 5 (5): 375-386). La activation de STAT inicia la ruta de senalizacion celular mejor definida para todos los IFN, la ruta de senalizacion Janus quinasa-STAT tradicional (JAK-STAT). En esta ruta, las JAKs se asocian con receptores de IFN y, despues del acoplamiento del receptor con IFN, fosforilan tanto STAT1 como STAT2. Como resultado, un complejo de factor genico 3 estimulado por IFN (ISGF3) se forma - este contiene STAT1, STAT2 y un tercer factor de transcripcion llamado IRF9 - y se mueve en el nucleo celular. Dentro del nucleo, el complejo de ISGF3 se enlaza a secuencias de nucleotidos especificas llamadas elementos de respuesta estimulada por IFN (ISREs) en los promotores de ciertos genes; esto induce la transcripcion de esos genes.
[0012] Un analogo proporcionado aqui puede comprender el motivo de NLS polibasico que comprende la secuencia de aminoacidos (R)KRXRS(R), donde X es cualquier residuo de aminoacido, preferiblemente donde X es R, K, S o T. Preferiblemente, el motivo de NLS esta presente en el extremo C-terminal del analogo. En una forma de realizacion, comprende la secuencia, preferiblemente la secuencia C-terminal RKRKRSR, KSKRSR, KRTRS o KRTRSQ. En un aspecto especifico, la fraccion de senalizacion comprende o consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
(a) la secuencia de aminoacidos KFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR;
(b) la secuencia de aminoacidos YSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRTRSQ o
ysvtdlnvqrkaiheliqvmaelspaaktgkrkrsq;
(c) la secuencia de aminoacidos AKFEVNNPQIQHKAVNELIRVIHQLSPESSLRKRKRSRC
(d) una extension de al menos 10, preferiblemente al menos 15, aminoacidos contiguos de la secuencia de (a), (b) o (c);
(e) una secuencia de aminoacidos que muestra al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 90% de identidad con a) o b) o c) siempre que la actividad de la senalizacion intracelular se mantenga; y
(f) la secuencia de aminoacidos de (a) o (b) o (c) donde como mucho 10, preferiblemente como mucho 8, mas preferiblemente como mucho 5 residuos de aminoacidos son eliminados, adicionados o sustituidos, siempre que la actividad de senalizacion, por ejemplo la translocacion nuclear, se mantenga.
(g) la secuencia de consenso VxxxxVQRxAxxELIxVxxxLxPxxxxxKRxRS donde x es cualquier residuo de aminoacido;
(h) la secuencia de consenso VxxxxxQxxAxxELIxVxxxLxPxxxxxKRKRS donde x es cualquier residuo de aminoacido;
(i) la secuencia de consenso Vxxxx[V/l]Q[R/H] [Q/K]A[F/V/I] [N/H] ELI[R/Q]Vx[H/A] [Q/E]L[L/S]P[E/A] [S/A] [S/A] [L/ K]xxKRKRS donde x es cualquier residuo de aminoacido;
La secuencia de aminoacidos de (a) representa una secuencia de IFNy murino truncado, la secuencia de (b) es una homologa humana y la secuencia de (c) es la homologa de rata. Preferiblemente, un analogo de la invencion comprende una extension de al menos 10, preferiblemente al menos 15, mas preferiblemente al menos 20 aminoacidos contiguos de la secuencia de (a) o (b) o (c). En una forma de realizacion, dicha extension comprende la secuencia N-terminal de la secuencia de (a) o (b) o (c). En otra forma de realizacion, comprende la secuencia C-terminal de la secuencia de (a) o (b) o (c), preferiblemente al menos los ultimos 15 aminoacidos. En otra forma de realizacion, la extension comprende una secuencia interna de la secuencia de (a) o (b) o (c). Secuencias ejemplares son LLPESSLRKRKRSR,
kfevnnpqvqrq, qafnelirvvhqll, maelspaaktgkrtrsq, ysvtdlnvqrkai, kaiheliqvmaels.
[0013] La persona experta entendera que variantes con una o varias modificaciones de aminoacido en las secuencias de (a) o (b) o (c) estan tambien dentro del campo de la invencion. La secuencia de aminoacidos de (a) o (b) o (c) donde como mucho 10, preferiblemente como mucho 8, mas preferiblemente como mucho 5 residuos de aminoacidos son
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eliminados, adicionados o sustituidos, siempre que la actividad de senalizacion, por ejemplo la translocacion nuclear, se mantenga.
[0014] La alineacion de secuencias de IFNy humano y murino muestra que 15 de cada 36 residuos (41%) son identicos y 24 de cada 36 residuos (66%) estan positivamente cargados. La correspondencia de identidad se hace segun el programa de alineacion Clustal W.
huInterferon gamma 4 YSVTDLN VQR K AIHE L I Q V MAELS PAAKTG KRTRSQ 39
+ V + VQR + A + E L I + V + + L P + KR RS+
MuInterferon gamma 3 FEVNNPQ VQRQ AFNE L IRV VH QLL PESS LRKRK RS R 38
La linea entre las secuencias indica los residuos conservados, dando una produccion de una secuencia de consenso anteriormente citada de (g). La alineacion del interferon gamma de humano, de rata y de raton puede proporcionar las secuencias de consenso de (h) y (i). En una forma de realization, un analogo comprende una fraction de senalizacion segun la secuencia de consenso (g), (h) o (i) mencionada anteriormente. Otras secuencias utiles incluyen secuencias de aminoacidos que muestran al menos 70%, preferiblemente al menos 80%, mas preferiblemente al menos 90%, de la forma mas preferible al menos 95% de identidad con (a) o (b) o (c) siempre que la actividad de senalizacion intracelular se mantenga.
Xaa16 Xaa17 Leu Xaa18
Xaa Xaa Xaa Xaa
Pro Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23Lys Arc
Xaa13, Xaa
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Xaa16 Xaa17,
[0015] En un aspecto espetifico, el analogo comprende una fraccion de senalizacion segun la secuencia de consenso: Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4 Val Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Gln Xaa10 Xaa11 Ala Xaa12 Xaa13 Glu Leu Ile Xaa14 Val Xaa15
Lys Arg Ser Xaa24 Xaa25, donde Xaa1, Xaa2,
, Xaa18 Xaa19 Xaa^° Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 y Xaa25 es cualquier residuo de aminoacido Xaa5 es un residuo polar sin carga tal como Asn o Thr Xaa7 es un residuo no polar hidrofobico tal como Pro o Leu Xaa8 es un residuo polar sin carga tal como Gln o Asn Xaa9 es un residuo hidrofobico no polar tal como Val, Ile o Leu Xaa es un residuo polar basico tal como Arg, His o Lys Xaa12 es un residuo hidrofobico no polar tal como Phe, Val o Ile Xaa15 es un residuo hidrofobico no polar tal como Val, Ile, Met. Preferiblemente, un analogo comprende como fraccion de senalizacion una secuencia que corresponde a los residuos 95-133 en IFNy murino o residuos 95-134 en IFNy humano. Esta secuencia tiene actividad antivirica (Mujtaba et al. 2006, Clinical and Vaccine Immunology, Vol. 13, No.8, p.944-952).
[0016] La actividad de senalizacion de un analogo puede ser facilmente determinada por metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la capacidad del analogo para inducir translocacion nuclear de STAT1a cuando se absorbe intracelularmente por una linea celular macrofaga murina se puede determinar como se describe por Subramaniam et al. La actividad de senalizacion puede tambien ser evaluada por formation del complejo con el factor de transcription Statlalpha y el importador nuclear de Statlalpha, el analogo importina-alfa NPI-1. Vease en particular Subramaniam et al. (2001, J. Interferon Cytokine Res. 21(11):951-959). Otros ensayos in vitro adecuados incluyen la No-produccion en macrofagos murinos tal como la linea celular RAW. En una forma de realizacion, el analogo muestra al menos 30%, preferiblemente al menos 50%, mas preferiblemente al menos 75% de la actividad (en el vitro) de su homologo interferon de longitud total. La senalizacion especifica de celula puede mejorar significativamente la eficacia in vivo de un analogo que muestra actividad relativamente baja in vitro.
[0017] Tal y como se menciona aqui por encima, un analogo de la presente invention se caracteriza por la ausencia de un dominio de union al receptor de IFN funcional y la presencia de un dominio de selection capaz de union a un receptor alternativo que puede mediar la asimilacion intracelular del analogo, por ejemplo un receptor que entra en la via endocitica tras la union de ligandos y/o como parte de la rotation de receptor constante. Como se entendera, el receptor alternativo o "secundario" al que se va a dirigir tiene algun grado de expresion especifica del tipo de celula. Los receptores expresados de forma ubicua son candidatos menos adecuados. Ademas, el receptor debe ser expresado en una celula que sea sensible a la fraccion de senalizacion intracelular, por ejemplo en caso de un analogo de IFNy, este debe contener un elemento sensible al IFNy.
[0018] Preferiblemente, el dominio de seleccion puede enlazar con un receptor que sea especifico para celulas de fibroblasto y de tipo fibroblasto, tales como por ejemplo miofibroblastos, fibroblastos portales, celulas mesangiales, fibroblastos intersticiales, fibroblastos alveolares o celulas estromales. Tambien se preven receptores expresados en las celulas tumorales. Un analogo de IFNy puede inducir la apoptosis en celulas tumorales, que puede ser especificamente dirigidas via un receptor secundario expresado en celulas tumorales. En una forma de realizacion, el receptor se selecciona del grupo que consiste en los receptores PDGF, receptor de tipo VI de colageno, receptores de citocina incluyendo receptor de TGFp, receptor de TNFa y el receptor de IL1 p, receptores de factor de crecimiento de insulina, receptores de VEGF y receptores de quimiocina (por ejemplo CXCR4). Resultados optimos fueron obtenidos cuando el analogo fue dirigido al receptor de PDGF, preferiblemente el receptor de PDGF-p. Otros dominios diana adecuados incluyen peptidos de adhesion celular, tal como el tripeptido Arg-Gly-Asp (RGD) que fue originalmente identificado como la secuencia dentro de la fibronectina que media la fijacion celular. El motivo RGD se ha encontrado ahora en otras numerosas proteinas y soporta la adhesion celular en muchas, pero no en todas, ellas. Las integrinas, una familia de las proteinas de superficie celular, actuan como receptores para las moleculas de adhesion celular. Un subconjunto de las integrinas reconoce el motivo RGD dentro de sus ligandos, cuya union media tanto en el substrato celular como en las
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interacciones celula-celula. Analogos que contienen RGD se pueden utilizar como agentes terapeuticos para el tratamiento de enfermedades tales como la trombosis y el cancer.
[0019] En un aspecto especifico, los objetivos del dominio de seleccion pueden enlazar con un receptor para un oligosacarido o una glicoproteina, preferiblemente el receptor de asialoglicoproteina (ASGP) o el receptor de manosa (CD 206). Por ejemplo, el dominio de seleccion es un oligosacarido, preferiblemente manosa o lactosa, conjugado con una molecula portadora. En otra forma de realizacion, manosa-6-fosfato (M6P) o un derivado del mismo se puede usar como dominio de seleccion para el receptor de M6P/IGF II. Vease por ejemplo EP1117443.
[0020] El dominio de seleccion es un preferiblemente una sustancia proteinaceo (peptido) de manera que el analogo en su conjunto es un polipeptido de fusion que puede ser facilmente producido por ejemplo recombinantemente. Sin embargo, otros tipos de dominios de seleccion no proteinaceos son tambien previsto tales como sacaridos, Kpidos, acidos nucleicos, moleculas sinteticas y similares.
[0021] En un aspecto, el dominio de seleccion comprende al menos una porcion de peptido ciclico. Los peptidos se pueden ciclar por varios medios, incluyendo formacion de puente de santonina o disulfuro de cisteina. Peptidos ciclicos utiles para seleccionar un analogo de la invencion para un tipo de celula deseada son descritos en la tecnica. Por ejemplo, la EP1117443 divulga un peptido ciclico que comprende al menos una secuencia que codifica un peptido de reconocimiento de receptor celular (RPR). En una forma de realizacion, un analogo de la invencion comprende en su dominio de seleccion (ciclado o lineal) al menos una secuencia de aminoacidos seleccionada del grupo que consiste en RGD, KPT, SRN, NLI y LID.
[0022] Una forma de realizacion preferida se refiere a analogos que tienen un dominio de seleccion que comprende multiples secuencias de union al receptor, preferiblemente en forma de al menos una repeticion en tandem de una porcion de peptido (ciclico). La repeticion en tandem puede comprender dos partes de peptido ciclico, preferiblemente partes de peptido ciclico identicas, conectadas via un enlazador de 1 a 5 aminoacidos. Esto es particularmente ventajoso para seleccionar un receptor que sea activo como un dimero, tal como el receptor de PDGF, TGFp o IL-10. En una forma de realizacion, el dominio de seleccion comprende uno, preferiblemente dos, copia(s) de la secuencia de aminoacidos X1SRNLIDX2, donde X1 y X2 indican fracciones que juntas pueden formar un enlace (peptidico) de manera que se forme una estructura ciclica donde la secuencia SRNLID es parte del anillo. Las dos copias estan preferiblemente separadas por una secuencia enlazadora de 1 a 7 aminoacidos. Preferiblemente, X1 y X2 son residuos Cys. Los inventores descubrieron que un dominio de seleccion que comprende la secuencia de aminoacidos CSRNLIDC-enlazador-CSRNLIDCS, donde el enlazador es una secuencia de aminoacidos de 1 a 7, como 1, 2, 3, 4, 5, 6 o 7 residuos de aminoacidos, es muy eficaz en la union al receptor de PDGFp dimerico. Por ejemplo, se realizo un experimento comparativo donde dos peptidos ciclicos capaces de union al receptor de PDGF fueron enlazados uno al otro via un separador que consistia en 6 aminoacidos mientras que en otro constructo estos dos peptidos ciclicos fueron acoplados via un separador de 11 aminoacidos. En ambos constructos, el separador contenia un residuo de lisina para permitir el acoplamiento de un farmaco o trazador. Ambos constructos biciciicos fueron marcados FITC y anadidos a cultivos de celulas 3T3, expresando el receptor de PDGF y se incubaron durante 2 horas para examinar la union. Tras la incubacion y la coloracion con un anticuerpo contra FITC, los datos inmunohistoquimicos mostraron union significativa del constructo que comprende el separador de 6 aminoacidos, mientras que solo union baja se observo con el constructo que contenia el separador mas largo de 11 aminoacidos.
[0023] En una forma de realizacion, el enlazador puede consistir en 4 o 5 residuos de aminoacidos, preferiblemente
seleccionados del grupo de residuos Gly, Ala, Ser y Thr, mas preferiblemente al menos 3 de estos siendo un residuo de glicina. Los enlaces preferidos consisten en la secuencia K(GS)mGG donde m es 1 o 2. Como un ejemplo especifico, el dominio de seleccion comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCS o CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCS. En otra forma de realizacion, el enlazador consiste en 5 o 6 residuos de aminoacidos, preferiblemente seleccionados del grupo de los residuos Asp, Lys, Gly, Ala, Ser y Thr. Buenos resultados fueron obtenidos con un enlazador de 4 a 7 residuos, al menos 4, preferiblemente al menos 5, siendo un residuo de glicina. Otros enlaces adecuados incluyen una secuencia de 4 a 7 residuos, los residuos se seleccionan de los residuos de Gly y de Asp, por ejemplo [GnDm] donde n+m es de 4 a 7, donde n s 4 y M un numero entero entre 0 y 3. En una forma de realizacion especifica, el dominio de seleccion comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos CSRNLIDC[GnDm] CSRNLIDC, donde n+m es de 4 a 7, donde n s 4 y M un numero entero entre 0 y 3. Por ejemplo, el dominio de seleccion consiste en o comprende la secuencia CSRNLIDCGGGDGGCSRNLIDC,
CSRNLIDCGGDGGCSRNLIDC, CSRNLIDCGDDGGCSRNLIDC o CSRNLIDCGGGGGGCSRNLIDC.
[0024] El dominio de seleccion se puede estar unido al dominio de serialization por cualquier medio, por ejemplo por
una secuencia enlazadora o separadora. Secuencias enlazadoras adecuadas son tipicamente de hasta 15, preferiblemente hasta 10 residuos de aminoacidos de longitud. Enlaces de polialanina pueden ser utilizados. Por ejemplo, se proporciona aqui un analogo de interferon gamma, que consiste en la secuencia CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCSAAAAKFEVNNPQVQRQAFNELIR VVHQLLPESSLRKRKRSR,
CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCSAAA AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR o CSRNLIDC GGGDGGCSRNLIDCSAAA KFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR.
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[0025] El dominio de selection tambien puede estar unido al dominio de serialization via una molecula portadora, por ejemplo albumina. Esto es especialmente ventajoso si el dominio de seleccion es una sustancia no proteinacea, por ejemplo un oligosacarido tal como manosa o lactosa. En una forma de realization, la molecula portadora comprende grupos reactivos libres como hidroxilo, amina y/o sulfato. El tamano del portador es preferiblemente una proteina plasmatica endogena, como albumina, lactoferrina o fibronectina.
[0026] La invention tambien se refiere a un conjugado que comprende un compuesto de interes, por ejemplo una molecula biologicamente activa, conjugada con un dominio de seleccion de PDGF biciclico, dicho dominio de seleccion comprende dos copias de la secuencia de aminoacidos X1SRNLIDX2, donde Xi y X2 indica fracciones que juntas pueden formar un enlace, como un enlace peptidico o de disulfuro, de manera que se forme una estructura biciclica donde la secuencia SRNLID es parte de cada anillo. Preferiblemente, Xi y X2 son residuos Cys que permiten la ciclizacion via formation de enlaces de disulfuro. Un conjugado segun la invencion se caracteriza por el hecho de que las dos copias estan separadas por una secuencia enlazadora de 2 a 7 aminoacidos. Se descubrio sorprendentemente que esta longitud de espaciador especifico permite una seleccion altamente eficaz del receptor de PDGF, que es activo como un dimero. Asi, tambien se proporciona un conjugado que comprende un compuesto de interes conjugado con un dominio de seleccion, dicho dominio de seleccion comprende la secuencia de aminoacidos XiSRNLIDX2-enlazador- X3SRNLIDX4, donde el par de Xi y X2 y el par de X3 y X4 puede formar un enlace (peptidico) de manera que se forme una estructura biciclica donde las secuencias SRNLID son parte de un anillo, y donde el enlazador es una secuencia de aminoacidos que consiste en 2 a 7 residuos de aminoacidos. Como se ha mencionado anteriormente, el enlazador puede consistir en 4 o 5 residuos de aminoacidos. Se pueden seleccionar del grupo de residuos Gly, Ala, Ser, Asp, Lys y Thr, preferiblemente al menos 3 de estos son un residuo de glicina. Enlaces preferidos consisten en la secuencia K(GS)mGG donde m es 1 o 2. Como un ejemplo especifico, el dominio de seleccion comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos CSRNLIDCKGsGgCSRNLIDCS o CSRNLIDCKGSGSGGCSRNlIdCS. En otra forma de realizacion, el enlazador consiste en 5 o 6 residuos de aminoacidos, preferiblemente seleccionados del grupo de residuos Asp, Gly, Ala, Ser y Thr. Se obtuvieron buenos resultados con un enlazador de 4 a 7 residuos, al menos 4, preferiblemente al menos 5, siendo un residuo de glicina. Otros enlaces adecuados incluyen una secuencia de 4 a 7 residuos, los residuos son seleccionados de residuos de Gly y Asp, por ejemplo [GnDm] donde n+m es de 4 a 7, donde n s 4 y M un numero entero entre 0 y 3. En una forma de realizacion especifica, el dominio de seleccion comprende o consiste en la secuencia de aminoacidos CSRNLIDC[GnDm] CSRNLIDC, donde n+m es de 4 a 7, donde n s 4 y M un numero entero entre 0 y 3. Por ejemplo, el dominio de seleccion consiste en o comprende la secuencia CSRNLIDCGGGDGGCSRNLIDC, CSRNLIDCGGDGGCSRNLIDC, CSRNLIDCGDDGGCSRNLIDC o CSRNLIDCGGGGGGCSRNLIDC.
[0027] El uso de la secuencia SRNLID como dominio de seleccion celular se conoce en la tecnica. La WO00/23113 divulga la conjugation de un peptido ciclico que comprende un peptido de reconocimiento de receptor (RRP) para una molecula portadora que es mayor de 5000 Dalton, por ejemplo albumina de suero. Un RRP ejemplar es la secuencia de union al receptor de PDGF XSRNLIDCX, donde X denota la ubicacion de ciclizacion. Se ensena que, en la estructura de peptido ciclico, multiples secuencias de RRP pueden estar presentes. Tambien se describe unir mas de uno (por ejemplo 5-15 peptidos ciclicos) a una molecula portadora. Hagens et al. (2007) Pharmaceutical Res. Vol. 24, pp. 566574, muestran la entrega del peptido ciclico CSRNLIDC conjugado con albumina a celulas estrelladas hepaticas. Asi, los conjugados del estado de la tecnica dependen todos de la union de RRPs a una molecula portadora. La construccion del conjugado de la invencion, donde las fracciones ciclicas no se fijan a una molecula portadora sino en lugar de la misma colocada en un motivo en tandem con una longitud de espaciador especifica de 2 a 7 aminoacidos no se ensena o sugiere en la tecnica. Se ha observado que esta estructura biciclica bien definida mejora la union de conjugado al receptor de PDGF dimerico en comparacion con un conjugado segun la WO00/23113, donde el numero y la orientation espacial de las secuencias de union al receptor multiple fijadas al portador son aleatorizadas y mucho menos controladas. La configuration en tandem que fija la distancia entre las dos fracciones ciclicas en un conjugado de la invencion se disena para interactuar optimamente con el receptor de PDGF dimerico. Ademas, la presencia de la molecula portadora relativamente grande puede reducir las interacciones receptoras por impedimento esterico.
[0028] El peptido biciclico se puede preparar quimicamente o a traves de tecnicas recombinantes que proporcionan metodos de production que son muy favorables para la industria farmaceutica. Ademas, la estructura biciclica puede ser directamente fijada a una entidad quimica (farmaco o trazador), polimerica (por ejemplo polietilenglicol, PEG), peptido pequeno o proteina que produzca un compuesto de peso molecular bajo especifico de celula que puede facilmente penetrar en los tejidos extravasculares.
En particular para fines de seleccion tumoral, esta penetration de tejido puede ser muy pertinente.
[0029] Resultados optimos fueron conseguidos con un enlazador que consistia en 3 a 5 residuos de aminoacidos.
En una forma de realizacion, el conjugado comprende la secuencia de aminoacidos CSRNLIDC-enlazador-CSRNLIDCS (BiPPB) donde el enlazador es una secuencia de aminoacidos de 2 a 7, preferiblemente 3 a 5, residuos de aminoacidos. Este peptido biciclico se usa adecuadamente como ligando de seleccion de peso molecular bajo con alta afinidad al receptor de PDGF (PDGF-R). El peptido se puede preparar bien por sintesis quimica o recombinante. El enlazador puede comprender uno o varios residuos de aminoacidos con una cadena lateral reactiva que se puede usar para la fijacion covalente de un compuesto de interes, como un marcador detectable, un farmaco y/o diagnostico. Aminoacidos reactivos adecuados incluyen lisina, serina y treonina, arginina, histidina, acido aspartico, acido glutamico, cisteina, asparagina, glutamina, tirosina, metionina y triptofano.
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[0030] La fraccion biologicamente activa puede tener cualquier tipo de actividad biologica util, incluyendo citocina, quimiocina, o actividad de prostaglandina. Puede ser de naturaleza proteinacea o no proteinacea. Por ejemplo, la fraccion es seleccionada del grupo seleccionado de farmacos, citocinas, quimiocinas, hormonas, prostaglandinas y similares. Ejemplos especificos incluyen PGE2, 15d-PGJ2, IL-10, IFNy, IFNy truncado. Fracciones proteinaceas pueden convenientemente ser fijadas al dominio de seleccion especifico de PDGF-R por fusion genetica, bien en el N- o C- termino. En una forma de realizacion, se conjuga al N-termino.
[0031] Un analogo o conjugado segun la invencion se puede acoplar a un nucleo y/o portador o molecula de entrega por metodos conocidos en la tecnica. Nucleos adecuados o portadores incluyen dendrimeros, liposomas y poKmeros naturales, sinteticos o semi-sinteticos (ramificados o lineales). Los dendrimeros se ha comprobado con exito que son utiles como aditivos en diferentes vias de administracion farmacologica porque pueden hacer que los farmacos aumenten su hidrosolubilidad, biodisponibilidad y biocompatibilidad. Vease, Chen et al., Journal of Pharmaceutical Sciences, Vol. 97 Issue 1, pg. 123 - 143. Como un ejemplo, la invencion proporciona un analogo de IFNy conjugado a un dendrimero o a un liposoma. El liposoma puede contener farmaco (anti-cancer).
[0032] En una forma de realizacion, un analogo de interferon o conjugado dirigido a PDGFR segun la invencion se modifica por medios convencionales para mejorar sus propiedades farmacologicas, como el aumento de la eficacia y/o la estabilidad. En una forma de realizacion, se modifica para mejorar la vida media por fijacion de al menos un polimero no antigenico, por ejemplo por un polimero seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicoles (PEGs) y derivados de los mismos. La PEGilacion es rutinariamente conseguida por incubacion de un derivado reactivo de PEG con la macromolecula diana. La fijacion covalente de PEG a un farmaco o proteina terapeutica puede "ocultar" el agente del sistema inmunologico del huesped (inmunogenicidad reducida y antigenicidad), aumentar el tamano hidrodinamico (tamano en la solucion) del agente que prolonga su tiempo circulatorio al reducir la depuracion renal.
[0033] Otro aspecto de la invencion se refiere a una secuencia de acidos nucleicos aislada que codifica un analogo de interferon proteinaceo segun la invencion o que codifica un conjugado dirigido a PDGFR proteinaceo como se describe en este caso por encima. La persona experta sera capaz de disenar y de construir una secuencia de acidos nucleicos adecuada por ejemplo un constructo de fusion que codifique la fraccion de seleccion y la fraccion biologicamente activa usando tecnologia del ADN recombinante estandar. La secuencia de acidos nucleicos aislada puede ser parte de un vector de expresion, por ejemplo un vector disenado para la produccion de proteina recombinante en una celula huesped bacteriana o mamifera. Tambien se proporciona una celula huesped que comprende una secuencia de acidos nucleicos o un vector segun la invencion, preferiblemente donde dicha celula huesped es una celula huesped bacteriana o mamifera. Un analogo o conjugado dirigido a PDGF descrito aqui ha mejorado las propiedades con respecto a la su distribucion en el cuerpo. Mas especificamente, permite dirigir un compuesto biologicamente activo de interes a una celula de interes mientras se mantiene la actividad biologica de este compuesto particular. Para lograr la especificidad de celula, estos mediadores estan equipados con un marcador de direccion que aumentara su concentration alrededor de receptores diana pertinentes en el tejido enfermo. Otra forma de realizacion por lo tanto se refiere a una composition farmaceutica que incluye un analogo de IFN o un conjugado dirigido a PDGF y un portador farmaceuticamente aceptable. Un aspecto especifico se refiere a una composicion farmaceutica que comprende un analogo dirigido a IFNy, preferiblemente un analogo de IFNy dirigido a PDGF que muestra efectos secundarios reducidos en comparacion con IFNy no dirigido. Una composicion farmaceutica ejemplar contiene un peptido que comprende o consiste en la secuencia CSRNLIDCK(GS)mGGCSRNLIDCSAAAAKFEVNNPQ VQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR donde m es 1 o 2, por ejemplo CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCSAAAAKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPES SLRKRKRSR. Otra composicion farmaceutica ejemplar comprende un conjugado que comprende una molecula biologicamente activa conjugada a un dominio de seleccion, dicho dominio de seleccion comprende la secuencia de aminoacidos CSRNLIDC-enlazador-CSRNLIDCS, donde el enlazador es una secuencia de aminoacidos de 2 a 7, preferiblemente 3 a 5, residuos de aminoacidos.
[0034] Tambien se proporciona el uso de un analogo de IFN (y) segun la invencion para la produccion de un medicamento para el tratamiento terapeutico o profilactico de una enfermedad seleccionada de cancer, enfermedades viricas, enfermedad fibrotica, enfermedad esclerotica y enfermedades inflamatorias cronicas o agudas. Enfermedades ejemplares incluyen glomerulosclerosis, fibrosis intersticial, fibrosis de pulmon (fibrosis pulmonar idiopatica), aterosclerosis, artritis reumatoide, enfermedad de Crohns, colitis ulcerosa, glomerulonefritis y sepsis.
[0035] Se sabe que IFNy tambien tiene actividad antivirica. Ya que la forma truncada de IFNy se demuestra que es bioactiva y se descubrio que muestra todas las actividades de IFNy nativo siempre que un dispositivo de rastreo se fije a la molecula, un analogo de la invencion esta dotado de actividad antivirica tambien. Las enfermedades ejemplares incluian infecciones provocadas por el virus de la gripe o el virus sincitial respiratorio humano (RSV). El RSV es un virus que causa infecciones del tracto respiratorio. Es la causa principal de infection del tracto respiratorio inferior y de las visitas hospitalarias durante la infancia e la juventud. A veces un bebe se puede infectar sintomaticamente mas de una vez, incluso dentro de una sola temporada de RSV. En los Estados Unidos, el 60% de los bebes se infectan durante su primera temporada de RSV, y casi todos los ninos se habran infectado con el virus a los 2-3 anos de edad. De los infectados con el RSV, 2-3% desarrollaran bronquiolitis, requiriendo hospitalization. Infecciones de RSV severas se han encontrado en aumento entre pacientes mayores. No hay vacuna. El tratamiento se limita a cuidado de apoyo,
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incluyendo oxigeno. En climas templados hay una epidemia anual durante los meses de invierno. En climas tropicales, la infeccion es mas comun durante el invierno.
[0036] La presente divulgacion por lo tanto tambien se refiere a un metodo para el tratamiento terapeutico o profilactico de una enfermedad seleccionada de cancer, enfermedad virica, enfermedad fibrotica, enfermedad esclerotica y enfermedades inflamatorias cronicas o agudas tales como glomerulosclerosis, fibrosis intersticial, fibrosis de pulmon, aterosclerosis, artritis reumatoide, enfermedad de Crohns, colitis ulcerosa, glomerulonefritis y sepsis, que comprende proporcionar a un sujeto con la necesidad del mismo una dosis terapeuticamente efectiva de un analogo de IFN segun la invencion. La enfermedad puede ser una enfermedad hepatica, preferiblemente una enfermedad hepatica cronica tal como cirrosis hepatica. El experto en la tecnica ajustara la dosis que se debe aplicar a la manera de aplicacion, tamano, peso, estado de salud, etc., del sujeto al que se le va a realizar la administracion. La administracion se puede realizar de cualquier manera conocida de por si para la administracion de un medicamento. Un analogo de IFNy segun la invencion se usa ventajosamente en una composition medicinal (terapeutica o profilactica) en una forma para la administracion intrapulmonar, por ejemplo por administracion intranasal o inhalation. Tambien se proporciona un dispositivo de inhalation que incluye un analogo de IFNy como ingrediente activo.
Leyenda de las figuras
[0037]
Figura 1: donation de IFNy mimetico de raton. Se estimularon esplenocitos con PHA y ARN fue aislado. RT y PCR utilizando cebadores especificos dieron un producto de PCR del tamano previsto. Expresion del constructo en celulas BL21 y production confirmada de transferencia de Western del mimetico.
Figura 2: IFNy mimetico recombinante muestra efectos anti-fibroticos en los fibroblastos 3T3 de raton. Las celulas se tinen para a-actina de musculo liso que es un marcador de fibrosis.
Figura 3: construction de pET39b-BiPPB que codifica un dominio de selection de receptor de PDGF bidclico. Figura 4: construccion de pET39b-BiPPB-IFNgamma que codifica un conjugado de IFNy dirigido a PDGFR.
Figura 5: construccion de pET39b-BiPPB- IFNy mimetico.
Figura 6: analisis de transferencia en mancha de IFNY-BiPPB y IFNy mimetico-BiPPB mostrando el acoplamiento de pPB-peptido a IFNy.
Figura 7: estudio de union en celulas LX2 de linea celular estrellada hepatica humana. Las celulas fueron manchadas para peptido de union a PDGFR. La coloration indica la union de constructos que contienen pPB a las celulas diana.
Figura 8: analisis de hemograma para estudiar los efectos secundarios del tratamiento en el modelo de raton con dano hepatico agudo.
WBC= recuento de globulos blancos.
LYM= linfocitos.
PLT= recuento de plaquetas.
RBC= recuento de globulos rojos. Para detalles vease el ejemplo 4.
Figura 9: analisis de PCR en tiempo real de los marcadores de fibrosis hepatica MMP13 y TIMP1. Para detalles vease el ejemplo 4.
Figura 10: efecto de IFNy mimetico-PEG-BiPPB en el modelo de raton con dano hepatico inducido por CCU agudo. Cuantificacion de a-SMA (A), colageno-I (B) y desmina (C) - coloracion de secciones de higado obtenidas de ratones normales tratados con aceite de oliva y ratones tratados con CCU recibiendo bien IFNy, IFNy mimetico, IFNy mimetico-PEG, IFNy mimetico-PEG-BiPPB (5 pg/raton) o PBS solo. La cuantificacion fue hecha utilizando el programa informatico de formation de imagenes Cell-D. Los datos representan la media ± SEM de 5 ratones por grupo. #P<0,05 frente al grupo de aceite de oliva tratado de PBS; *P<0,05; **P<0,01 frente al grupo de cCi4 tratado con PBS. Para detalles vease el ejemplo 6
Figura 11: analisis de PCR en tiempo real de marcadores para fibrosis hepatica en ratones, 3 dias despues de la administracion de CCU o aceite de oliva. Los ratones fueron tratados con diferentes compuestos como se indica y los niveles de colageno 1a1 (A), a-SMA (B), desmina (C) y TIMP1 (D) ARNm fueron medidos. Para detalles vease el ejemplo 6.
Figura 12: analisis de recuento de sangre en toda la sangre de ratones, 3 dias despues de la administracion de CCU o aceite de oliva. Los ratones fueron tratados con diferentes compuestos como se indica y el recuento de plaquetas (PLT: fig. A), recuento de globulos blancos (WBC, fig. B) y recuento de linfocitos (C) fueron medidos utilizando un contador Coulter. Para detalles vease el ejemplo 6.
Section experimental
[0038] La fibrosis hepatica se caracteriza por la acumulacion excesiva de los componentes de matriz extracelular que lleva a cicatrices hepaticas. Hasta la fecha, no hay terapia que haya tenido exito disponible para el tratamiento de la fibrosis hepatica. Las celulas estrelladas hepaticas (HSCs) y los fibroblastos son las celulas efectoras clave implicadas en la progresion de la enfermedad, que se activan por factores de crecimiento cruciales tales como el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) y el factor de crecimiento transformante beta (TGFp). Interferon gamma (IFNy) ha demostrado tener varios efectos beneficiosos in vitro e in vivo durante la fibrosis hepatica. Sin embargo, IFNy muestra una especificidad de especies estricta y tiene una vida media circulante corta que limita su uso clinico potencial.
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Ademas, IFNy tiene efectos adversos serios en el sistema inmunologico, en celulas endoteliales y en el sistema nervioso central (por ejemplo, causando depresiones) que llevan todos a la retirada frecuente de los pacientes de los ensayos clinicos y en consecuencia al fallo de estos ensayos. Para circunvenir estos inconvenientes, los presentes inventores han producido un peptido estable mimetico de IFNy que carece del sitio de reconocimiento de receptor extracelular y contiene una fraccion de senalizacion que interactua directamente en la cascada de senalizacion del IFNy aguas abajo, manteniendo asi las funciones potenciales del IFNy.
[0039] Para aumentar la especificidad de IFNy y el peptido mimetico de IFNy, IFNy y el peptido mimetico fusionados a BiPPB (peptido bidclico contra el receptor beta de PDGF) fueron generados, ya que la expresion del receptor de PDGF es altamente sobrerregulada durante el dano hepatico particularmente en HSCs.
[0040] Ejemplo 1: Clonacion de IFNy. Esplenocitos de raton fueron aislados de bazos frescos y fueron cultivados en presencia de PHA (fitohemaglutinina) para estimular la produccion de citocina. Despues de 24 horas de estimulacion, ARN fue aislado y ADNc fue sintetizado usando cebador antisentido especifico del gen seguido de amplificacion por PCR mediante fusion de polimerasa de DNA usando cebadores especificos sentido y antisentido de IFNy mimetico. El fragmento obtenido fue clonado en pET42a (vector de expresion procariotico) en el sitio PshAl/EcoRI y los clones positivos fueron controlados por restriccion de analisis de digestion. Vease la figura 1.
[0041] La secuencia de nucleotidos 5'->3' del interferon gamma de raton truncado (secuencia de referencia NCBI: NM_008337.2) (nt 457 - nt 572) es como sigue:
457 gcca agtttgaggt caacaaccca caggtccagc gccaagcatt caatgagctc atccgagtgg tccaccagct gttgccggaa tccagcctca ggaagcggaa aaggagtcgc tg 572 a. El ultimo nucleotido ha sido anadido para insertar el codon de terminacion antes de la cisteina, que es el aminoacido ultimo en la secuencia. La cisteina se retira de la secuencia para proporcionar el plegado apropiado del peptido y tambien para evitar plegado inapropiado debido a enlaces de disulfuro en la proteina de fusion (con BiPPB).
[0042] La secuencia de aminoacidos codificada es AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR* * denota codon de terminacion.
Clonacion de IFNY-BiPPB y IFNy mimetico-BiPPB. Una secuencia de acidos nucleicos que codifica el dominio de seleccion de PDGF bidclico BiPPB fue generada por amplificacion de dos fragmentos utilizando 4 cebadores (2 para cada fragmento) y luego ligadas utilizando sitio de restriccion Bam HI incorporado y luego clonadas en vector pET39b en el sitio ScaI/NotI. IFNy e IFNy mimetico fue amplificado por PCR utilizando cebador de fusion de peptido (sentido) y cebador antisentido de IFNy o IFNy mimetico. El fragmento amplificado fue digerido y ligado en el vector pET39b-BiPPB en el sitio NotI/XhoI y los clones positivos fueron controlados analisis de digestion de restriccion. Vease las figuras 4 y 5. Las secuencias de todos los constructos fueron ademas confirmadas por secuenciacion de ADN automatizada.
BiPPB
[0043] Secuencia de nucleotidos para BiPPB:
tgt tct aga aac ctc atc gat tgt aag gga tcc gga ggt tgt tca cgt aat cta ata gat tgt tca Secuencia de aminoacidos para BiPPB: CSRNLIDCKGSGGCSRNLIDCS (vease tambien la figura 3)
Interferon gamma (longitud total)
[0044] Secuencia de nucleotidos: interferon gamma de raton (secuencia de referencia NCBI: NM_008337.3) ggcggccgca 457 gcca agtttgaggt caacaaccca 481 caggtccagc gccaagcatt caatgagctc atccgagtgg tccaccagct gttgccggaa 541 tccagcctca ggaagcggaa aaggagtcg 569 ataa Secuencia de aminoacidos para IFNgamma de raton
MNATHCILALQLFLMAVSGCYCHGTVIESLESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRN
WQKDGDMKILQSQIISFYLRLFEVLKDNQAISNNISVIESHLITTFFSNSKAKKDAF
MSIAKFEVNNPQVQRQAFNELIRWHQLLPESSLRKRKRSRC
[0045] Secuencia de nucleotidos de la proteina fusionada (BiPPB-IFN gamma) tgt tct aga aac ctc atc gat tgt aag gga tcc gga ggt tgt tca cgt aat cta ata gat tgt tca gcggccgca Secuencia de interferon gamma (NM_008337.3).
[0046] Secuencia de aminoacidos para BiPPB-IFNgamma
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CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCSAAAMNA'mCILALQLFLMAVSGCYCKGTVIES
LESLNNYFNSSGIDVEEKSLFLDIWRNWQKDGDMKILQSQIISFYLRLFEVLKDNQ
AISNNISVIESHLITTFFSNSKAKKDAFMSIAKFEVNNPQVQRQAFNELIRWHQLL
PESSLRKRKRSRC
[0047] La cursiva denota BiPPB; el texto normal denota IFNgamma mimetico; la negrita denota enlazador o espaciador. Vease tambien figura 4.
Interferon gamma mimetico fusionado a BiPPB
[0048] Secuencia de nucleotidos de la proteina fusionada (BiPPB-IFN gamma mimetico) tgt tct aga aac ctc atc gat tgt aag gga tcc gga ggt tgt tca cgt aat cta ata gat tgt tca gcggccgca 457 gcca agtttgaggt caacaaccca caggtccagc gccaagcatt caatgagctc atccgagtgg tccaccagct gttgccggaa tccagcctca ggaagcggaa aaggagtcg 569 ataa
Secuencia de aminoacidos para BiPPB-IFNgamma mimetico
CSRNLIDCKGSGSGGCSRNLIDCSAAA
AKFEVNNPQVQRQAFNELIRWHQLLPESSLRKRKRSR*
[0049] Cursiva denota BiPPB; texto normal denota IFNgamma mimetico; negrita denota: enlazador o espaciador. Vease tambien figura 5.
[0050] Los acidos nucleicos fueron luego transformados en celulas BL21 (E. Coli) para la expresion usando induction de IPTG. La proteina expresada fue analizada por SDS-PAGE y analisis de transferencia de Western o analisis de transferencia de mancha utilizando anticuerpo anti-IFNy y/o anticuerpo anti-PPB (vease figura 6). La proteina expresada (con marcador His) fue luego purificada bajo condiciones nativas a traves de cromatografia en columna Ni-NTA. Laos marcadores fueron proteoliticamente divididos y ademas purificados usando cromatografia en columna de sefarosa.
[0051] Ejemplo 2: Efectos anti-fibroticos de IFNy mimetico dividido y activo: se evaluaron los efectos anti-fibroticos del peptido IFNy dividido mimetico en fibroblastos NIH3T3 de raton segun se evaluo por inmunocitoquimica (coloration a-SMA). En resumen, fibroblastos 3T3 fueron sembrados en placas de 24 pocillos en la densidad de 6 x 104 celulas/pocillo, despues de 24 horas, las celulas se mantuvieron en ayunas en 0,5% de FBS con medio durante toda la noche. Luego, las celulas fueron incubadas medio de inanition con compuestos diferentes (PDGF 50 ng/ml, TGFp 10 ng/ml, IFNy mimetico 1pg/ml, 50ng/ml PDGF + 1pg/ml IFNy mimetico y 10 ng/ml TGFp + 1pg/ml IFNy mimetico). Despues de 48 horas de incubation, las celulas fueron lavadas, fijadas con etanol:acetona (1:1) y manchadas para a- SMA (marcador de fibroblastos activados).
[0052] Ejemplo 3: Estudio de fijacion de BiPPB e IFNy mimetico-BiPPB en celulas LX2 humanas: se determino la union de BiPPB y mimetico-BiPPB en celulas LX2 (HSCs humano). En resumen, las celulas LX2 fueron colocadas en placas de 48 pocillos en una densidad celular de 3 x 104 celulas/pocillo. Despues de 24 horas, las celulas fueron privadas de alimento en medio (FBS) durante toda la noche. Luego, las celulas fueron incubadas con diferentes compuestos (BiPPB, PPB-HSA y BiPPB-IFNY mimetico) durante 2 horas a temperatura ambiente para la union. Despues de la union, las celulas fueron extensivamente lavadas con PBS, fijadas con etanol:acetona (1:1) y manchadas para PPB. Los resultados se presentan en la figura 7.
[0053] Ejemplo 4: Estudio del efecto in vivo en dano hepatico inducido por CCU agudo en ratones: IFNy recombinante, IFNy mimetico, IFNY-BiPPB de proteina de fusion recombinante y IFNy mimetico-BiPPB de proteina de fusion recombinante se evaluaron par efectos anti-fibroticos en modelo de raton con dano hepatico inducido por CCU agudo. El dia 1, a los animales se les dio una dosis intraperitoneal unica (1ml/kg) de tetracloruro de carbono (CCU) en aceite de oliva o aceite de oliva (controles n=6). Despues de 24 horas de inyeccion de CCU, en el dia 2 y 3, los animales fueron tratados con PBS (n=6), 50.000 U/ratones de IFNy (n=6), 50.000 U/ratones de IFNy mimetico (n=5), 50.000 U/ratones de IFNY-BiPPB (n=6), 50.000 U/ratones de IFNy mimetico-BiPPB (n=6). Luego, el dia 4, los animales fueron sacrificados y se realizaron recuentos de sangre y los efectos anti-fibroticos (vease Hemmann S, Graf J, Roderfeld M, Roeb. J Hepatol. 2007 May;46(5):955-75) fueron evaluados utilizando PCR cuantitativo. Los resultados se presentan en las Figuras 8 y 9.
[0054] Los datos presentados en la Fig. 8 demuestran que mimetico-BiPPB es mas eficaz que el IFNy no modificado en la atenuacion de la sobrerregulacion del recuento de globulos blancos (WBC) y recuento de linfocitos (lym) en la sangre completa asociada a fibrosis hepatica inducida por CCU (p<0,01). En cambio, la reduction en el recuento de plaquetas (PLT) asociada al tratamiento con IFNy (que es un efecto adverso bien conocido por IFNy) es menos severa cuando los animales reciben IFNy mimetico-BiPPB en vez de IFNy no modificado (p< 0,0025).
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[0055] Los datos presentados en la figura 9 muestran que IFNy mimetico-BiPPB esta dotado de actividad antifibrotica: atenua la sobrerregulacion inducida por CCU de las metaloproteinasas matriciales (MMP13). La proporcion MMP-13 frente a inhibidor de tejido de metaloproteinasas (TIPM1) es similar a la obtenida con IFNy nativo, pero mejor que IFNy mimetico (p<0,03), indicando que el acoplamiento de Bi-PPB a IFNy mimetico es beneficioso. Colectivamente los datos de la Fig. 8 y 9 muestran que IFNy mimetico-BiPPB es mas potente en comparacion con el IFNy nativo y tiene menos efectos secundarios.
Ejemplo 5:
[0056] Smtesis quimica de conjugados de interferon gamma mimetico: conjugado de IFNy mimetico-PEG-BiPPB: 0,111 pmol peptido de reconocimiento de PDGFR biciclico (BiPPB, 2223,2 Da, Genosphere Biotechnologies) fue acoplado con 0,337 pmol maleimida-PEG-succinimidilo carboxi metil ester (Mal-PEG-SCM, 2 KDa, Creative PEGworks) durante 3 horas. Luego, lisina (0,337 pmol) se anadio para bloquear grupos libres de Mal-PEG-SCM. Despues de 1 hora de reaccion, el producto sintetizado BiPPB-PEG-MAL (0,112 pmol) fue reaccionado con 0,56 pmol de IFNy mimetico- ATA (4689 Da, Genosphere Biotechnologies) en presencia de reactivo de desacetilacion durante toda la noche a temperatura ambiente. Finalmente, el conjugado de IFNy mimetico-PEG-BiPPB sintetizado (8828,2 Da) fue extensivamente dializado contra PBS utilizando 7 KDa dia-a-lizador G2 cassetes de dialisis (Thermo scientific).
[0057] Conjugado de IFNy mimetico-PEG: 0,107 pmol IFNy mimetico-ATA (4689 Da) fue reaccionado con 0,321 pmol de poli (etilenglicol)-succinimidil a-metilbutanoato (mPEG-SMB, 2 KDa, Nektar therapeutics) durante 2 horas y posteriormente el producto fue dializado extensivamente.
a) IFNy mimetico-PEG-BiPPB
[0058]
imagen1
Efecto en parametros fibroticos despues de la administracion intravenosa de IFNy mimetico-PEG-BiPPB en el modelo de raton con dano hepatico agudo
[0059] Analisis de parametros fibroticos en el nivel de la proteina:
Los ratones fueron intraperitonealmente inyectados con CCU en el dia 1 para inducir dano hepatico. El dia 2 y 3, los ratones fueron tratados con IFNy (5 ug/dosis), IFNy mimetico-PEG, IFNy mimetico-PEG-BiPPB (5pg/dosis) o PBS solo. El dia 4, los animales fueron sacrificados; los higados y diferentes organos fueron recogidos para posterior analisis. Secciones de higado fueron fijadas con acetona, secadas y rehidratadas con PBS. Luego, las secciones fueron incubadas anticuerpo primario (colageno, SMA y desmina) durante 1 hora. Luego, las secciones fueron bloqueadas 0,03% de H2O2 para actividad de peroxidasa endogena durante 30 min. Posteriormente, secciones fueron incubadas con anticuerpo anti-cabra de conejo conjugado con anticuerpo secundario HRP (1:100; DAKO) seguido de anticuerpo de
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anticonejo de cabra conjugado con HRP (1:100, DAKO) durante 30 min. La actividad de peroxidasa fue desarrollada utilizando AEC (Sigma) durante 20 min y nucleos fueron contratenidos hematoxilina (Fluka). Las secciones fueron montadas con gelatina Kaiser y visualizadas bajo el microscopio optico (Olympus). Para analisis cuantitativo, 27 imagenes de microscopio fueron capturadas y areas manchadas positivamente fueron cuantificadas utilizando el programa de formacion de imagenes Cell D de Olympus. Lo resultados se muestran en la figura 10
Analisis de parametros fibroticos en el nivel de expresion genica:
[0060] ARN total de tejidos de higado fue aislado utilizando un equipo RNeasy mini (Qiagen) segun las instrucciones del fabricante. La concentracion de ARN fue cuantificada por un espectrofotometro UV (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). El ARN total (1,6 pg) fue usado para transcription inversa en volumen total de 50 pl con el equipo de sintesis de ADNc (Promega). Todos los cebadores fueron comprados de Sigma-Genosys (Haverhill, UK). 10 Ng de ADNc fue usado para analisis de PCR en tiempo real cuantitativo. Las reacciones fueron realizadas utilizando mezcla de RCP SYBR Green (Applied Biosystems) segun las instrucciones del fabricante. Las muestras fueron analizadas por el sistema de detection de secuencia ABI 7900HT (Applied Biosystems). Finalmente, los numeros de ciclo de umbral (Ct) fueron calculados para cada gen y la expresion genica relativa fue calculada despues de la normalization para la expresion del gen de referencia GAPDH. Los resultados se muestran en la figura 11. El analisis de los efectos adversos se representa en la figura 12.
Ejemplo 7:
Efecto en los parametros fibroticos despues de la administracion intravenosa de IFNy mimetico-PEG-BiPPB en el modelo de raton de fibrosis hepatica avanzada establecido.
Analisis de parametros fibroticos en el nivel de la proteina:
[0061] Ratones balb/C machos (20-22g) fueron tratados con aceite de oliva o dosis en aumento de CCU (semana 1: 0,5 ml/kg; semana 2: 0,8 ml/kg y semana 3-8: 1 ml/kg preparado en aceite de oliva) dos veces por semana por inyecciones intraperitoneales durante 8 semanas. En la semana 7 y 8, los ratones fueron tratados con PBS, IFNy mimetico-PEG o IFNy mimetico-PEG-BiPPB (5pg/raton, tres veces por semana). Todos ratones fueron sacrificados en la semana 8; y muestras de sangre e higado fueron recogidas para mediciones posteriores. Las secciones de higado fueron manchadas para colageno I y desmina, CD68, 33D1 y MHC de clase II. Se ha observado que la forma truncada dirigida de IFNy (IFNy mim-biPPB) indujo reduction sustancial en los parametros fibroticos en este modelo de fibrosis hepatica cronica en ratones; tanto el colageno I como la coloration de desmina fue profundamente reducida en ratones de CCI4 tratados con IFNy mim-biPPB en comparacion con ratones CCU no tratados. En cambio, el tratamiento con IFNy mim no dirigido, carente del sitio de union al receptor, no indujo ningun efecto en estos parametros mientras que el raton de longitud total inducido por IFNy solo una reduccion pequena en el colageno I y la coloracion de desmina. El IFNy nativo (raton) indujo la infiltration de celulas inflamatorias (CD68+ macrofagos, neutrofilos, 33D1 + celulas dendriticas) al igual que expresion de MHCII aumentada. En cambio, IFNy mim-biPPB no indujo esta respuesta inflamatoria aumentada en los higados.
Ejemplo 8:
El analogo de IFNy truncado dirigido al receptor de PDGF es activo pero provoca menos efectos secundarios.
[0062] Un conjugado previsto de IFNy mimetico quimicamente acoplado a BiPPB fue sintetizado y caracterizado utilizando transferencia de Western y para sus efectos anti-fibroticos in vitro en los fibroblastos de raton 3T3. In vivo, el conjugado dirigido fue examinado en modelos de fibrosis hepatica de 4 dias (agudo) y 8 semanas (cronico) inducidos con CCl4 en ratones. Diferentes parametros fibroticos e infiltracion de celulas inflamatorias fueron evaluados en los higados utilizando inmunohistoquimica y analisis de expresion genica.
[0063] Resultados: el conjugado exitosamente sintetizado provoco la inhibition de la expresion de colageno en fibroblastos de raton inducidos por TGFbeta. In vivo, el peptido mimetico dirigido de IFNy (IFNy mim-biPPB) indujo la reduccion sustancial en los parametros fibroticos en ambos modelos de fibrosis hepatica aguda y cronica en ratones. El tratamiento con IFNy mim no dirigido, que carece de un dominio de union al receptor, no mostro ningun efecto y el IFNy de longitud total de raton no modificado mostro solo una reduccion moderada. Este IFNy de longitud total de raton indujo infiltracion de celulas inflamatorias (CD68+ macrofagos, neutrofilos, 33D1+ celulas dendriticas) al igual que aumento la expresion de MHCII. En cambio, IFNy mim-biPPB no indujo una respuesta inflamatoria (datos no mostrados).
Ejemplo 9:
Estudio con IFNy mimetico-PEG-BiPPB en el modelo de tumor subcutaneo en ratones
Materiales y metodos
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[0064] Macho normal C57BL/6 y ratones Balb/C pesando de 20 a 25 g fueron obtenidos de Harlan (Zeist, Paises Bajos). Se mantuvieron en un ciclo de luz/oscuridad de 12:12 y recibieron una dieta ad libitum normal. Todos los protocolos experimentales para estudios animales fueron aprobados por el Comite de Etica Animal de la universidad de Groningen. Para inducir tumores subcutaneos, celulas C26 fueron cultivadas en 3 matraces de 125-mm un dia antes de la inyeccion en animales para tenerlas en la fase de crecimiento. Las celulas fueron separadas por tripsinizacion, y la tripsina fue retirada por centrifugacion. El granulado celular fue resuspendido en PBS. Un total de 1 x 106 celulas (celulas B16 y C26) suspendidas en 100 pl de PBS fueron inyectadas en el costado de los ratones Balb/C subcutaneamente. El crecimiento tumoral fue seguido de medicion del tamano del tumor utilizando un calibrador Vernier digital. El volumen tumoral fue establecido utilizando la formula: a x b2 / 2, donde a denota la longitud tumoral y b denota el ancho tumoral. Los tumores C26 fueron inducidos en ratones como se describe. El tratamiento se comenzo en el dia 5 cuando el volumen tumoral alcanzo el rango de 50 a 100 mm3 porque este tamano tumoral ha demostrado ser un tamano de tumor optimo para el inicio del tratamiento. Animales (n=4 por grupo) fueron inyectados intravenosamente con seis dosis de vehiculo (PBS), IFNy mimetico-PEG (5 pg/dosis), IFNy mimetico-PEG-BiPPB (5 pg/dosis) en dias alternativos bajo anestesia (O2/isoflurano). El tamano tumoral fue medido bajo anestesia. Los animales con tumores C26 fueron sacrificados el dia 20 porque no se observo ningun efecto del tratamiento. Los animales fueron sacrificados con anestesia de gas (O2/isoflurano), y los tumores fueron aislados y fijados en isopentano frio para criosecciones.
[0065] Secciones de 4-pm de espesor de criostato fueron preparadas a partir de tejido congelado rapidamente y manchadas para CD31 segun los metodos de inmunoperoxidasa estandar. Se analizo la coloracion de CD31 (marcador de celulas endoteliales) para la determinacion del area de lumen de los vasos sanguineos y la densidad de los vasos sanguineos en secciones tumorales de tumores C26. Los resultados mostraron angiogenesis significativa en tumores no tratados y en tumores de ratones tratados con IFNy mimetico, mientras que los ratones tratados con IFNy mimetico- BiPPB mostraron una reduccion fuerte en la angiogenesis en sus tumores (datos no mostrados).
Ejemplo 10:
Efecto del IFNy truncado dirigido al receptor de PDGF en la fibrosis pulmonar.
Antecedentes y fundamentos para las terapias basadas en pacientes con IPF:
[0066] La fibrosis pulmonar idiopatica (IPF) es una enfermedad del pulmon parenquimal progresiva con una supervivencia media de solo 3-5 anos tras el diagnostico1,2. Ademas de la IPF, tambien otros tipos de fibrosis pulmonar tienen un mal pronostico, en particular la neumonia intersticial no especifica (NSIP) fibrosante y la fibrosis en fase final de por ejemplo diferentes enfermedades autoinmunes y alveolitis alergica extrinseca. Actualmente no existen terapias eficaces para la fibrosis pulmonar debido a una falta de comprension de los mecanismos de la enfermedad.
[0067] El (mio)fibroblasto tiene un papel central en todos los tipos de fibrosis de pulmon3. El dano continuo a los pulmones lleva al inicio de mecanismos de reparation desregulados con reclutamiento de fibroblastos y su transformation en miofibroblastos. Los miofibroblastos son las celulas efectoras clave en la fibrosis que producen cantidades excesivas de componentes de matriz extracelular tales como colagenos. Los miofibroblastos se cree actualmente que son el objetivo terapeutico mas importante para el tratamiento de la fibrosis pulmonar3. Los factores de crecimiento clave en la proliferation y la transformacion de los miofibroblastos son el factor de crecimiento transformante beta (TGFp), el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF), y la endotelina-1 y muchas nuevas terapias se han centrado en la inhibition de estos factores o sus receptores. Sin embargo, la mayor parte de los ensayos clinicos basados en la modulation del comportamiento de los miofibroblasto han mostrado resultados decepcionantes1. El interferon gamma (IFNy) es probablemente el mediador anti-fibrotico mas estudiado en ensayos clinicos de IPF. Media la detention del crecimiento de los miofibroblasto y la apoptosis a traves de una via dependiente de STAT-1 (transductores de senal y activadores de transcription-1), que es importante para la resolution de respuestas fibrogenicas4. A pesar de un inicio prometedor inicial, el gran ensayo INSPIRE llego a la conclusion de que IFNy no prolongo la supervivencia5. IFNy, sin embargo, fue administrado subcutaneamente y dado que los receptores de IFNy se encuentran en casi todas las celulas del cuerpo, tiene efectos secundarios limitantes de la dosis graves. Estos incluyen enfermedad tipo gripe y fatiga5. La administration inhalada puede parcialmente circunvenir este problema y actualmente se ha registrado una prueba para el estudio de los efectos de IFNy en aerosol en la IPF (vease
http://clinicaltrials.gov). Otra via para aumentar la concentration de IFNy dentro de los miofibroblastos, y asi la eficacia, es usar el concepto de focalizacion de farmaco: los farmacos se acoplan para portadores farmacologicos selectivos de celulas que son absorbidos especificamente por celulas diana, los farmacos se liberan dentro de esas celulas reduciendo asi los efectos secundarios sistemicos mientras que logran altas concentraciones locales en las celulas diana. Los miofibroblastos, por ejemplo, sobrerregulan especificamente los receptores de PDGF que se pueden usar para fines de focalizacion de farmaco6.
[0068] Aunque CCU induce la fibrosis hepatica, los pulmones tambien tienen baja expresion de actividad de citocromo P450 y CCL4 (que se vuelve compuesto toxico por esta enzima) es por lo tanto tambien ligeramente activado en el tejido pulmonar. Esto lleva a la activation de celulas profibroticas que a su vez expresan el receptor de PDGF, que inicia la actividad profibrotica. Este modelo se ha usado como un modelo de fibrosis pulmonar idiopatica (IPF, vease la ref. 8 y 9). Mientras se exploran los efectos antifibroticos de IFNy en el tejido de higado, un cambio significativo en el tejido de pulmon fue apreciado por los examinadores. El peso de los pulmones de los ratones tratados con CQ4 fue
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significativamente superior a los pulmones de los ratones normales (0,75 ± 0,05 % de peso corporal en los normales frente a 2,03 ± 0,15 % de peso corporal en los ratones no tratados con CCU; P< 0,01) aun este aumento fue significativamente reducido por el tratamiento con PPB-PEG-IFNy (1,53 ± 0,11 % de p. c.; P<0,05 vs ratones no tratados con CCl4). El examen microscopico revelo que los pulmones de los ratones tratados con CCU estaban afectados por alveolitis difusa, una condicion que puede preceder a la fibrosis, y los pulmones mostraron una tincion de colageno mejorada. Cuando estos ratones fueron tratados con IFNy acoplado a peptidos de reconocimiento del receptor de PDGF, se encontro una alveolitis significativamente reducida en los pulmones y una deposition de colageno reducida. Cabe destacar que estos efectos beneficiosos de IFNy dirigido se lograron despues de establecer la enfermedad pulmonar.
[0069] Por lo tanto se concluye el IFNy dirigido al receptor de PDGF es capaz de acumular en cualquier tejido con significativo expresion de receptor de PDGFp, y es capaz de ejercer un efecto antifibrotico en otros tejidos al igual que el ilustrado por su efecto en los pulmones. Los analogos de IFNy de la invention pueden asi utilizarse para el tratamiento de la fibrosis idiopatica y otras formas de fibrosis o esclerosis en otros tejidos caracterizados por expresion mejorada del receptor de PDGF.
Ejemplo 11:
Objetivo de IFNgamma truncado para varios receptores
[0070] En este experimento se muestra que un analogo de la invencion que comprende la fraction de serialization de IFNy murino (IFNy mim) y un dominio de selection de superficie celular puede ser eficazmente dirigido no solo al receptor de PDGF sino tambien a otros receptores de superficie celular. Los dominios de seleccion ejemplares evaluados incluyen lactosa (ligando para la asialoglicoproteina (ASGP)), manosa (ligando para el receptor de manosa (CD 206) y el tripeptido RGD (ligando para el receptor avp3 receptor de integrina). La secuencia de IFNy mim consistio en FEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR. Varios tipos de celulas y parametros diferentes para el analisis de la actividad de IFNy usados en el estudio. Las muestras de control fueron expuestas a INNy intacto murino. Para detalles vease la tabla por debajo.
Analogo de IFNy
Receptor diana Celulas usadas Parametro medido (detalles ver texto) Resultados
Lactosa-HSA- PEG-IFNYmim
Receptor de asialoglicoprotema(ASGP) Hepatocitos humanos (HepG2) Expresion de ICAM 1 Expresion mejorada vs INFy control
Mannosa-HSA- PEG-mimlFNY
Receptor de manosa (CD 206) Macrofagos RAW de raton Expresion de MHC ll Expresion igual vs INFy control
rgd-peg- IFNYmim
Receptor de avp3 Celulas endoteliales Ensayo de angiogenesis in vitro Efectividad mejorada vs INFy control
Experimentos con Lactosa-HSA-PEG-IFNY.
Sintesis
[0071] Lactosa-HSA (25 moleculas de lactosa acopladas a albumina de suero humano) fue conjugada a la molecula bifuncional de PEG (2KDa). Tras la dialisis, lactosa-HSA-PEG fue acoplado a IFNy truncado modificado por SATA derivado de raton. El producto sintetizado (Lac-HSA-PEG-IFNYmim) fue extensivamente dializado contra PBS.
Experimento en hepatocitos humanos:
[0072] Hepatocitos humanos (HepG2) fueron colocados en placas de 12 pocillos (1 x 105 celulas/pocillo). Las celulas se dejaron crecer en incubadora de 5%/37°C/CO2. Posteriormente, las celulas fueron incubadas con medio, IFNy de raton (1ug/ml), IFNy humano (1ug/ml), Lac-HSA-PEG-IFNY derivado de IFNy de raton (1ug/ml), Lac-HSA o Lac-HSA-PEG- IFNy (1ug/ml) despues de 2 horas de bloqueo con Lac-HSA. Despues de 24 horas de incubation, las celulas fueron lisadas, el ARN fue aislado y transcrito inversamente. El ADNc fue usado para el analisis de expresion de molecula de adhesion intercelular 1 (ICAM1), que se conoce por ser inducido en respuesta a IFNy. 18srRNA se uso un control de limpieza.
Resultados:
[0073] Como era de esperar, ni IFNy truncado de raton ni Lac-HSA indujo la expresion de ICAM1 en hepatocitos humanos, mientras que tanto IFNy como Lac-HSA-PEG-IFNY derivado de raton sobrerregulo la expresion de ICAM1 en hepatocitos humanos. Ademas, la expresion de ICAM1 inducida por Lac-HSA-PEG-IFNY fue casi completamente bloqueada por exceso de Lac-HSA.
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Conclusiones:
[0074] La especificidad de especies de IFNy fue confirmada al mostrar que IFNy (truncado) de raton era inefectivo en hepatocitos humanos. Sin embargo, esta citocina se convirtio en un compuesto bioactivo en celulas humanas despues del acoplamiento a la lactosa de fraccion diana, que se conoce por introducir hepatocitos via el receptor de asialoglicoproteina (ASGP). La especificidad para el receptor de ASGP fue mostrada por bloqueo de este receptor por Lac-HSA. Esto demuestra que la parte de senalizacion de IFNy (que no es especifica de especies) se puede entregar en el citoplasma de otras celulas diana que no sean fibroblastos via otro receptor diana que no sea el receptor de PDGF utilizando una fraccion de azucar en lugar de un peptido. La seleccion de hepatocitos es particularmente pertinente para el tratamiento de la hepatitis B y C y la sobrerregulacion de ICAM-1 es una respuesta fisiologica para mejorar la actividad antiviral. Este experimento sostiene el uso de IFNy truncado especifico de celula segun la invencion como un compuesto antiviral.
[0075] De forma similar, la manosa fue acoplada a IFNy de raton truncado segun tecnicas estandar (L. Beljaars et al J. of Hepatology 29: 579-588, 1998) y la bioactividad de este IFNy manosilado fue demostrada en los macrofagos de raton con expresion de MHC de clase II como parametros de lectura (metodos de rtPCR).
[0076] El peptido de union endotelial RGD- o su peptido de control RAG, que no enlaza a estas celulas, fueron tambien acoplados a IFNy de raton truncado segun metodos estandar. Los analogos resultantes fueron evaluados para su actividad biologica en cultivos de celulas endoteliales (H5V) midiendo la formacion de tubo que es un parametro que refleja la angiogenesis. La formacion de tubo por celulas H5V fue inhibida mas potentemente por RGD-IFNYmim en este ensayo (datos no mostrados).
[0077] Conclusiones: la modificacion de IFNy truncado de raton por conjugacion a una fraccion de seleccion (por ejemplo un oligosacarido o peptido) se puede realizar sin perturbar la bioactividad de la parte de senalizacion de esta citocina. La entrega de un analogo de IFNy que es defectuosa en la union a su receptor natural pero que en cambio puede enlazar a un receptor de superficie celular diferente mediando la asimilacion celular del analogo permite usos terapeuticos mas eficaces con menos efectos secundarios.
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8. Paakko P, Anttila S, Sormunen R, et al. Biochemical and morphological characterization of carbon tetrachloride- induced lung fibrosis in rats. Arch Toxicol 1996;70(9):540-52.
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Ejemplo 11:
Estudio de union de BiPPB a celulas cultivadas o primarias recientemente aisladas
[0079] Este ejemplo muestra que Bi-PPB bien producidas quimicamente o a traves de tecnicas recombinantes especificamente se enlazan al receptor de PDGFB. La especificidad receptora es demostrada por el bloqueo de la union
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con anticuerpos de receptor de antiPDGF-p especificos. BiPPB es no especifico de especies ya que enlaza a celulas de rata, raton y humano tipo mio-fibroblasto. La interaccion con el receptor requiere al menos dos peptidos ciclicos, ya que la forma monociclica no enlaza con el receptor diana.
Secuencia de BiPPB:
[0080] C(1)SRNLIDC(1)GGGDGGC(2)SRNLIDC(2): ciclizaciones de puente disulfuro Cys(1)-Cys(1) y Cys(2)-Cys(2) Metodos:
[0081] La union de BiPPB fue realizada en las celulas estrelladas hepaticas de rata aisladas recientemente primarias. Las celulas fueron sembradas en placas de 8 pocillos de cristal (Lab-Tek, Nunc, Naperville, IL) en 30.000 celulas/pocillo en el medio de cultivo. Despues de la incubacion durante toda la noche a 37°C/5%CO2, las celulas fueron lavadas con PBS y posteriormente incubadas con PPB (monociclico) etiquetado con FITC o BiPPB (biciclico: 10 pg/ml) a temperatura ambiente. Para bloquear la union, anti-PDGF-pR IgG se anadio a las celulas 1h antes del PPB acoplado aFITC o BiPPB. Despues de 2 h, las celulas fueron lavadas de 3 a 4 veces con PBS frio y fijadas con 4% de paraformaldehido. Los nucleos fueron contratenidos con DAPI y montado en citifluor (reactivo antidecoloracion) y visualizados bajo microscopio fluorescente.
[0082] Experimentos de union similares fueron realizados en miofibroblastos de humano recientemente aislados primarios, fibroblastos de raton 3T3 y celulas estrelladas hepaticas humanas (LX2). Para celulas estrelladas hepaticas humanas, la secuencia de BiPPB fue de la siguiente manera:
C(1)S R N L I D C(1) KGSGSGG C(2)S R N L I D C(2):
ciclizaciones de puente disulfuro Cys(1)-Cys(1) y Cys(2)-Cys(2)
[0083] Resultados: el PPB monodclico acoplado a FITC no mostro ninguna union ya que el receptor de PDGF requiere interaccion dimerica. BiPPB acoplado a FITC mostro union significativa al tipo de celula evaluada, que fue casi completamente bloqueado por el anticuerpo del receptor de PDGF, mostrando la especificidad del receptor de la union a estas celulas (datos no mostrados).

Claims (17)

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    REIVINDICACIONES
    1. Analogo de interferon gamma (IFNy), donde la fraccion que media la union a su receptor natural esta al menos funcionalmente interrumpida y donde el analogo comprende una fraccion de senalizacion capaz de mediar la actividad de IFNy intracelular, donde la fraccion de senalizacion comprende en el extremo C-terminal del analogo una secuencia seleccionada del grupo que consiste en:
    (a) la secuencia de aminoacidos KFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR;
    (b) la secuencia de aminoacidos YSVTDLNVQRKAIHELIQVMAELSPAAKTGKRKRSQ;
    (c) una secuencia de aminoacidos que muestra al menos 90% de identidad con (a) o (b) siempre que la actividad de senalizacion intracelular se mantenga;
    (d) la secuencia de aminoacidos (a) o (b) donde como mucho 5 residuos de aminoacidos son eliminados, adicionados o sustituidos, siempre que la actividad de senalizacion, por ejemplo translocacion nuclear, se mantenga;
    (e) la secuencia de consenso
    Vxxxx[V/I]Q[R/H][Q/K]A[F/V/I][N/H]ELI[R/Q] Vx[H/A][Q/E]L[L/S]P[E/A][S/A][S/A][L/K]xxKRKRS donde x es cualquier residuo de aminoacido; y
    (f) la secuencia Xaa1Xaa2Xaa3Xaa4 Val Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Gln Xaa10 Xaa11 Ala Xaa12 Xaa13 Glu Leu Ile
    Xaa14 Val Xaa15 Xaa16 Xaa17 Leu Xaa18 Pro Xaa19 Xaa20 Xaa21
    Xaa , Xaa , Xaa Xaa Xaa Xaa
    13
    Xaa
    es cualquier residuo de aminoacido Xaa5 Xaa7 es Pro o Leu Xaa8 es Gln o Asn
    Xaa9 Val, Ile o Leu
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    Xaa es Asn o Thr
    Xaa16 Xaa17,
    Xaa22 Xaa23Lys Arg Lys Arg Ser Xaa24 Xaa25, donde Xaa18 Xaa19 Xaa20 Xaa21 Xaa22 Xaa23 Xaa24 y Xaa25
    Xaa es Arg, His o Lys Xaa12 es Phe, Val o Ile Xaa15 es Val, Ile o Met
    dicha fraccion de senalizacion esta provista en su N-termino, opcionalmente via un enlazador, con al menos un dominio de seleccion capaz de union a un receptor de superficie celular diferente del receptor de IFNy, donde dicho dominio de seleccion puede enlazar con el receptor de PDGFp, el receptor de manosa6-fosfato/factor- II de crecimiento tipo insulina (M6P/ IGF2R), el receptor de asialoglicoproteina (ASGP) o el receptor de manosa (CD 206).
  2. 2. Analogo segun la reivindicacion 1, donde la fraccion de senalizacion comprende la secuencia de aminoacidos
    kfevnnpqvqrqafnelirvvhqllpesslrkrkrsr o ysvtdlnvqrkaiheliqvmaelspaaktgkrkrsq.
  3. 3. Analogo segun la reivindicacion 1 o 2, donde el dominio de seleccion es el peptido de adhesion celular RGD.
  4. 4. Analogo segun la reivindicacion 1 o 2, donde el dominio de seleccion es un oligosacarido, preferiblemente manosa(-6- fosfato) o lactosa, conjugado a una molecula portadora.
  5. 5. Analogo segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el dominio de seleccion comprende dos copias de la secuencia de aminoacidos X1SRNLIDX2, donde X1 y X2 indican fracciones que juntas pueden formar un enlace (peptidico) de manera que se forme una estructura ciclica donde la secuencia SRNLlD es parte del anillo y donde las dos copias estan separadas por una secuencia enlazadora de 2 a 7 aminoacidos.
  6. 6. Analogo segun la reivindicacion 5 donde el dominio de seleccion comprende la secuencia de aminoacidos CSRNLlDC-enlazador-CSRNLlDCS, donde el enlazador es una secuencia de aminoacidos de 3 a 7, preferiblemente 4 o 5, residuos de aminoacidos.
  7. 7. Analogo segun la reivindicacion 5 o 6, donde el enlazador se selecciona del grupo que consiste en (i) las secuencias K(GS)mGG donde m es 1 o 2 y (ii) las secuencias de la formula general [G n D m] donde n+m es de 4 a 7, donde n s 4 y M un numero entero entre 0 y 3.
  8. 8. Analogo segun la reivindicacion 7, donde el dominio de seleccion consiste en o comprende la secuencia
    csrnlidcgggdggcsrnlidc, csrnlidcggdggcsrnlidc, csrnlidcgddggcsrnlidc o csrnlidcggggggcsrnlidc.
  9. 9. Conjugado que comprende un compuesto de interes conjugado a un dominio de seleccion, dicho dominio de seleccion comprende la secuencia de aminoacidos X1SRNLlDX2-enlazador-X3SRNLlDX4, donde el par de X1 y X2 y el par de X3 y X4 pueden formar un enlace, preferiblemente un enlace peptidico, de manera que se forme una estructura biciclica donde las secuencias SRNLlD forman cada una parte de un anillo, y donde el enlazador es una secuencia de aminoacidos de 2 a 7, preferiblemente de 3 a 5, residuos de aminoacidos.
  10. 10. Analogo o conjugado segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes, provisto de al menos un polimero no- antigenico, preferiblemente seleccionado del grupo que consiste en polietilenglicoles y derivados de los mismos.
  11. 11. Secuencia de acidos nucleicos aislada que codifica un analogo proteinaceo o conjugado segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes.
  12. 12. Vector de expresion que incluye una secuencia de acidos nucleicos aislada segun la reivindicacion 11.
    5
  13. 13. Celula huesped que comprende una secuencia de acidos nucleicos segun la reivindicacion 11 o un vector segun la reivindicacion 12, preferiblemente donde dicha celula huesped es una celula bacteriana o mamifera huesped.
  14. 14. Composicion farmaceutica que incluye un analogo o conjugado segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un 10 portador, adyuvante y/o excipiente farmaceuticamente aceptable.
  15. 15. Uso de un analogo o conjugado segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la produccion de un medicamento para el tratamiento terapeutico o profilactico de una enfermedad seleccionada de cancer, enfermedad fibrotica y enfermedad esclerotica.
    15
  16. 16. Analogo o conjugado segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para su uso en el tratamiento terapeutico o profilactico de una enfermedad seleccionada de cancer, enfermedad fibrotica y enfermedad esclerotica.
  17. 17. Analogo o conjugado segun la reivindicacion 16, para su uso en el tratamiento de una enfermedad hepatica, 20 preferiblemente una enfermedad hepatica cronica tal como la cirrosis hepatica.
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