ES2588397T3 - Composiciones con actividad antibacteriana y de curación de heridas - Google Patents
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Abstract
Una composición que comprende ácido hialurónico y plata, en donde el ácido hialurónico tiene un peso molecular medio ponderado entre 130 y 230 kDa y en donde la plata está en forma metálica micronizada con una estructura porosa "esponjosa" con un tamaño de partícula medio entre 2 y 18 micrómetros y un área superficial no inferior a 5 m2/g o en forma metálica coloidal y la concentración de plata en forma metálica micronizada con una estructura porosa "esponjosa" o en forma coloidal, está comprendida entre 1 y 3% en peso de la composición total.
Description
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DESCRIPCION
Composiciones con actividad antibacteriana y de curacion de heridas Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a una composicion a base de plata y acido hialuronico, a una formulacion farmaceutica que comprende dicha composicion, a su uso en el tratamiento de lesiones cutaneas y heridas y a un aparato que comprende dicha composicion.
Antecedentes de la invencion
Las lesiones cutaneas agudas o cronicas de diverso origen se tratan mediante la aplicacion de dispositivos medicos para ayudar a la cicatrizacion de heridas, favorecer la revascularizacion, absorber el exudado y, en su caso, ejercer una accion antibacteriana /antimicrobiana.
Normalmente, el exudado es la consecuencia del aumento de permeabilidad de los capilares en el tejido inflamatorio. El exudado tiene la tarea de limitar el proceso patologico, evitando la difusion de microorganismos y bloqueando la accion de posibles antigenos peligrosos mediante un mecanismo inmunitario.
Por el contrario, en las lesiones cronicas el exudado se produce de una manera anormal y determina un bloqueo del proceso de reparacion de tejidos por la destruccion de las protemas de la matriz extracelular y de los factores de crecimiento, y por la inhibicion de la proliferacion celular. Clmicamente, la hiperexudacion puede determinar la maceracion de la piel perilesional y favorecer la infeccion, en particular, por las especies bacterianas Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Enterococcus faecium, Staphilococcus aureus y por hongos, tales como Candida albicans.
Ademas, la hiperproduccion de exudado da como resultado la necesidad de sustitucion continua de los vendajes para heridas. En estas situaciones, ni la incomodidad sentida por el paciente que ve a su calidad de vida empeorada por la constante necesidad de atencion medica ni el consiguiente aumento de los costos sanitarios debe subestimarse.
Hoy en dfa, numerosos dispositivos que contienen agentes antibacterianos estan disponibles en el mercado y tienen caractensticas diferentes dependiendo de la aplicacion a la que se destinan. Entre otros, espumas, adhesivos o no, a base de poliuretano e hidrocoloide (Contreet®) o a base de hidrofibra (Aquacel Ag); redes de multicapa de polietileno (Acticoat®). Deben mencionarse gasas que contienen polvos absorbentes. Estos productos se caracterizan por un soporte polimerico absorbente y un metal, en especial plata. Las propiedades antibacterianas de la plata son bien conocidas (Fraser, J. F. et al. ANZ J. Surg. 2004, 74, 139-212) y en general estan relacionadas con la forma oxidada de plata ionica. La plata inhibe la smtesis de protemas estructurales que componen la pared bacteriana evitando su formacion, y se une a las protemas enzimaticas de ADN bacteriano, lo que altera su funcionalidad. Sin embargo, dichos enlaces se producen de una manera inespedfica, es decir la plata actua tanto sobre las celulas bacterianas presentes en la herida como en torno a las celulas cutaneas/dermicas, lo que produce toxicidad de la plata para el paciente herido. De hecho, la plata inhibe la proliferacion de los queratinocitos y los fibroblastos (componentes fundamentales de la dermis y epidermis), lo que ralentiza la regeneracion del lecho de la herida sobre la que se aplica, y esto es perjudicial para completar la curacion de la lesion, de tal manera que a partir de los resultados de algunas pruebas in vitro en cultivos de queratinocitos, algunos van tan lejos como recomendar evitar la aplicacion de dispositivos a base de plata (Lam, P. K. et al. Br. J. Biomed. Sci., 2004, 61, 125-127). Ademas, la plata es un agente de sensibilizacion, sobre todo cuando se aplica durante penodos largos, tal y como ocurre en el caso de las ulceras de decubito, quemaduras o heridas de curacion lenta en general ("Chronic exposure to Silver or Silver salts, Industrial Hygiene and Toxicology" de Patty , Vol. 2, G. D. Clayton, F. E. Clayton, Eds. Wiley- Interscience, Nueva York, 3a Ed., 1981, pags. 1881-1894).
El acido hialuronico (AH) es un heteropolisacarido, es decir, un polfmero, que puede tener una amplia gama de pesos moleculares, generalmente correlacionados con diferentes efectos biologicos.
La multiplicidad de efectos biologicos del AH es bien conocida, y esta vinculada esencialmente a su naturaleza qmmica.
Las fracciones de alto P.M. (del orden de millones de Daltons) tienen muy alta viscosidad y encuentran aplicacion espedfica en la cirugfa ocular y tambien en los casos particulares de relleno de tejidos blandos, tanto para fines quirurgicos como dermocosmeticos; el efecto sobre la cicatrizacion de heridas, en cambio, es muy controvertido de tal modo que algunos autores han demostrado efectos muy positivos sobre la proliferacion celular por AH de alto P.M. medio, mientras que otros han puesto de relieve exactamente el efecto opuesto.
Se utilizan normalmente fracciones de peso molecular intermedio (500-750 kDa) (Brun et al. Osteoarthritis Cartilage, 2003, 11, 208-16) como viscocomplementos en artrosis y enfermedades de las articulaciones en general. Debido a que pueden generar soluciones con viscosidad que es muy similar a la del lfquido sinovial, de hecho, estas fracciones ejercen una accion de lubricacion mecanica. Por ultimo, el AH de bajo peso molecular (AH oligomerico,
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generalmente significa que tiene P.M. medio comprendido entre 1 y 10 kDa) tiene notable accion angiogenica; por lo tanto, favorece especialmente la revascularizacion de los tejidos en los que se aplica, favoreciendo la cicatrizacion de heridas. Ademas, el AH de bajo peso molecular tiene la capacidad conocida de estimulacion de la movilidad celular y de activacion de la migracion de fibroblastos, que es obviamente de gran importancia para los procesos de reparacion (West et al., Science, 1985, 228, 1324-6; Deed et al,. Int. J. Cancer, 1997, 71, 251-6). Por estas razones, el AH de bajo peso molecular se emplea como un componente de numerosos productos y dispositivos con accion de cicatrizacion de heridas.
El documento WO9635720 se refiere a una composicion que comprende sales de plata de esteres de acido hialuronico y varios metales incluida la plata, en donde el acido hialuronico tiene un peso molecular medio que oscila entre 30.000 y 760.000 Dalton.
El documento WO8705517 describe composiciones que comprenden acido hialuronico y varios metales incluida la plata, en donde el acido hialuronico tiene un peso molecular medio que oscila entre 50.000 y 13.000.000 Dalton.
El documento DE 102007044583 describe la utilizacion de una composicion que comprende anticuerpo hialuronico y plata coloidal sin especificar el P.M. del acido hialuronico.
El documento WO2010127647 describe un tratamiento con composiciones que comprende oxfgeno activo en un gel de hidrocoloide enriquecido con ozono, seguido opcionalmente de un tratamiento con una composicion de acido hialuronico y plata coloidal. No se especifica el P.M. del acido hialuronico en las composiciones descritas en la tecnica anterior.
El documento WO0218448 se refiere a composiciones que comprenden un derivado de acido hialuronico, espedficamente el compuesto percarboxilado obtenido por oxidacion del acido hialuronico con TMPO e hipoclorito sodico en presencia de bromuro sodico.
Barbucci R. et al. “Cu2+ and Ag+ complexes with a hyaluronane based hydrogel” Journal of Materials Chemistry, the Royal Society of Chemistry, Cambridge GB, vol. 12, n° 1, Octubre 2002 paginas 3084-3092 describe complejos de iones de cobre o plata con un hidrogel a base de acido hialuronico reticulado con 1,3-diaminopropano. Esta referencia tambien describe que los complejos que contienen una cantidad muy baja de antfgeno (superior a 0,0042 mg Ag/mg de gel) son citotoxicos.
Journal of Biomedical Materials Resarch parte A 15 de Sep. 2009 LNKD. Pubmed: 18671256, vol. 90, n° 4, 15 de septiembre, 2009 paginas 1177-1185 se refiere al efecto biologico del acido hialuronico sobre fibroblastos humanos. Esa referencia indica el acido hialuronico en el intervalo de P.M. 500-1.200 kDa adecuado para la proliferacion de fibroblastos. En esta referencia se recomienda acido hialuronico artificial, modificado (p. ej. incorporado en un hidrogel) para favorecer la propagacion y proliferacion, como acido hialuronico natural de bajo P.M. No favorecena suficientemente las uniones celulares de los fibroblastos.
Investigative Ophtalmology and Visual Science Junio de 1992 LNKD. Pubmed 8505213 vol. 34 n° 7, junio de 1993 paginas 2313-2315 describe los efectos del acido hialuronico sobre la proliferacion celular epitelial corneal. El P.M. del acido hialuronico utilizado en esta referencia es 860.000 Daltons.
El documento WO9503786 se refiere a una composicion para aerosol o espuma que comprende acido hialuronico o sus sales o derivados. Esta referencia describe que las fracciones de acido hialuronico de muy bajo P.M. (50 a 100.000) estimulan la reparacion tisular, mientras que las fracciones con P.M. Entre 500.000 y 730.000 no poseen actividad antinflamatoria y pueden utilizarse para sustituir fluidos endobulbares y en terapia para patologfas de articulaciones.
El documento WO2008031601 describe la composicion curativa que comprende plata y varios polfmeros hidrofilos para el recubrimiento de artfculos tales como cateteres y endoscopios con actividad antibacteriana y para reducir la adhesion bacteriana. El acido hialuronico se menciona entre otros polfmeros hidrofilos.
El documento DE102005008299 describe partfculas de plata muy porosas como agente antimicrobiano en una composicion grasienta util para el tratamiento de enfermedades de la piel tal como el eccema. El acido hialuronico se menciona, entre otras sustancias alternativas, como posible agente hidratante.
El documento WO2010051918 describe composiciones que contienen una combinacion de partfculas solidas de lfpidos (nanopartfculas y/o micropartfculas) con partfculas metalicas. Esta referencia describe que las nanopartfculas de lfpidos aumentan la actividad antibacteriana de las micropartfculas de plata pero es imperceptible acerca de las posibles ventajas en cuanto a la actividad antibacteriana superior y toxicidad inferior de una combinacion de micropartfculas de plata y de acido hialuronico, lo que se menciona solamente como “compuesto cosmetico activo” entre otros compuestos cosmeticos opcionales.
El documento DE102008031023 se refiere a una espuma para aplicacion topica que comprende una combinacion de partfculas de microplata y de un compuesto de origen natural (vegetal).
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Uno de los objetivos de la invencion es proporcionar una composicion para vendaje y curacion de heridas que es mas eficiente y menos toxica que los actualmente disponibles para el tratamiento de lesiones de la piel.
Otro objeto de la invencion es satisfacer la necesidad clmica de vendajes con un agente activo antifungico/antimicrobiano fuerte mientras se minimizan los efectos inhibidores sobre la regeneracion de tejidos y la toxicidad en los tejidos a tratar.
Compendio de la invencion
La presente invencion proporciona una composicion que comprende acido hialuronico y plata, en donde el acido hialuronico tiene un peso molecular medio ponderado entre 130 y 230 kDa y en donde la plata esta en forma metalica coloidal o en forma metalica micronizada con una estructura porosa "esponjosa" con un tamano de partfcula medio entre 2 y 18 micrometros, un area superficial no inferior a 5 m2/g y la concentracion de plata en dicha forma metalica micronizada con una estructura porosa "esponjosa" o en dicha forma coloidal entre 1 y 3% en peso.
La presente invencion tambien proporciona una formulacion farmaceutica que comprende dicha composicion y al menos un excipiente farmaceuticamente aceptable.
Tambien se describe el uso de dicha composicion como medicamento, en particular para el tratamiento topico de lesiones y/o heridas cutaneas superficiales y/o de cavidad pequena.
La presente invencion se refiere tambien a un aparato para dispensar dicha composicion en forma de un aerosol anhidro, una espuma o un gel hidrofilo, que son adecuadas para aplicacion cutanea.
Descripcion de las figuras
La figura 1 muestra la evaluacion (Experimento 1) de la proliferacion celular in vitro de los fibroblastos humanos cultivados en presencia de AH con diferentes fracciones de peso molecular medio ponderado que van desde 5.000
10.000 Da (muestra i) hasta 1.500.000-3.200.000 Da (muestra v).
La figura 2 muestra el efecto del AH con fracciones de peso molecular medio ponderado diferentes, es decir, 5.000
10.000 Da (muestra i), 10.000-15.000 Da (muestra ii) y 200.000 Da (muestra iii) sobre la expresion de fibronectina.
La figura 3 muestra el efecto del AH con fracciones de peso molecular medio ponderado diferentes, es decir, 5.000
10.000 Da (muestra i), 10.000-15.000 Da (muestra ii) y 200.000 Da (muestra iii) sobre la expresion de colageno de tipo I.
La figura 4 muestra los efectos sobre la proliferacion de fibroblastos sanos de composiciones de la invencion que comprenden plata coloidal metalica (A) y plata metalica micronizada (B) en comparacion con una referencia y una formulacion disponible en el mercado que comprende plata metalica coloidal que no comprende acido hialuronico (C) a concentraciones de 5 y 30 mg/ml despues de 3 o 5 dfas de cultivo.
La figura 5 muestra la actividad de las composiciones A-C sobre el crecimiento de la bacteria Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM).
Descripcion detallada de la invencion
Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresion "peso molecular medio ponderado" quiere decir calculado con el metodo de "viscosidad intrmseca" (Terbojevich et al., Carbohydr. Res., 1986, 363-377).
Como se emplea en la presente memoria, "estructura esponjosa" quiere decir un material completamente poroso, con estructura de celulas abiertas y/o celulas cerradas, con area superficial de 5 m2/g o superior.
La presente invencion se refiere a una composicion que comprende acido hialuronico y plata, en donde el acido hialuronico tiene un peso molecular medio ponderado entre 130 y 230 kDa y en donde la plata esta en forma metalica coloidal o en forma metalica micronizada con una estructura “esponjosa” porosa.
La composicion descrita en la presente memoria favorece la curacion de las lesiones de varios tipos (agudas, cronicas, ulceras de diversa etiologfa, quemaduras, llagas) eliminando infecciones bacterianas y/o fungicas y favoreciendo la cicatrizacion del tejido danado. Se descubrio sorprendentemente que estas ventajas se obtienen con una composicion que comprende acido hialuronico que tiene un peso molecular (P.M.) medio ponderado bien definido que, como se describe en la presente memoria, estimula la proliferacion de fibroblastos humanos, con la consiguiente deposicion de colageno y fibronectina, y es protector contra los danos y perjuicios que la plata puede producir en estas celulas.
La plata lleva a cabo la actividad antibacteriana de la composicion conocida en la tecnica, esta disponible en el mercado en forma de sales (p. ej., nitrato, sulfato, carbonato y otros, disponible p. ej. en Sigma Aldrich), o de metal coloidal, es decir, asociada a pequenas protemas que mejoran su estabilidad, o en forma metalica.
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Entre los diversos tipos de plata metalica, se descubrio sorprendentemente que la plata metalica micronizada es adecuada para el proposito de la invencion con las siguientes caractensticas:
- tamano medio de partfcula de 2-18 micrometros, preferiblemente 10 micrometros
microestructura "esponjosa" (SL) con gran porosidad lo que aumenta considerablemente el area superficial
(>5m2/g);
- alta pureza (preferiblemente> 99,5%);
(en lo sucesivo "plata metalica micronizada esponjosa").
Dicha peculiar estructura porosa "esponjosa" favorece una mayor liberacion, tanto inmediata como mantenida, de iones Ag (Ag+) en el lecho de la herida, lo que se traduce en una mayor actividad antimicrobiana y antifungica en comparacion con las formas de plata que se utilizan con mas frecuencia, como se demuestra por los resultados de los experimentos mas adelante.
En particular, plata metalica micronizada "esponjosa" como la comprendida en la composicion de la invencion no mancha la piel ni la ropa, ademas tras la exposicion a la luz solar, no tine la herida de marron cuando el exudado esta presente y es mas facil de manejar en la preparacion de formas farmaceuticas segun la invencion. El tamano de partfcula a microescala hace que la plata metalica micronizada "esponjosa" se pueda mezclar facilmente con otros componentes. La plata metalica coloidal, en cambio, debe someterse a un proceso de micronizacion en primer lugar, especialmente cuando se desea administrar en forma de pulverizacion, a fin de evitar obstrucciones debido a la formacion de grumos de polvo.
La plata utilizada para la composicion de la presente invencion puede ser plata metalica micronizada coloidal o "esponjosa", que se descubrio que tienen actividad antimicrobiana/antibacteriana comparable, aunque es preferible la plata metalica micronizada "esponjosa".
El acido hialuronico (AH) es un heteropolisacarido de cadena lineal compuesto de restos de acido D-glucuronico y N-acetil-D-glucosamina alternados, con el peso molecular medio ponderado que puede oscilar entre 400 y 3x106 Da, dependiendo de la fuente de extraccion o del metodo de preparacion empleado. El acido hialuronico, de hecho, se puede obtener por ejemplo, por extraccion a partir de crestas de gallo (patente europea EP 138 572 B1), por fermentacion, o por smtesis. Como ya se ha dicho, se sabe que el AH ejerce una multiplicidad de funciones en el cuerpo, que van desde el apoyo mecanico para las celulas de muchos tejidos tales como piel, tendones, musculos y cartflagos, hasta la hidratacion de los tejidos y la lubricacion de las articulaciones. Ademas, se sabe que el AH, mediante su receptor de membrana CD44, es capaz de modular muchos y diferentes procesos relacionados con la fisiologfa y biologfa celular, tales como la proliferacion celular, la migracion, la diferenciacion y la angiogenia.
Cada uno de estos efectos es esencialmente atribuible a las fracciones de AH con diferentes pesos moleculares, y especialmente la accion de reparacion de tejidos es muy evidente en fracciones de AH con un peso molecular ponderado bajo (AH oligomerico) y disminuye a medida que aumenta el peso molecular. Durante varios ensayos, en cambio, se descubrio sorprendentemente que una fraccion espedfica de AH con un P.M. medio ponderado comprendido en un intervalo entre 130 y 230 kDa, calculado con el metodo de "viscosidad intrrnseca" (Terbojevich et al., Carbohydr. Res., 1986, 363-377), que tiene por lo tanto un P.M. notablemente superior a los ya conocidos por su accion cicatrizante de heridas, tiene una extraordinaria eficacia hacia la proliferacion de fibroblastos humanos. Ademas, se descubrio que el AH con un peso molecular medio ponderado entre 130 y 230 kDa mejora sorprendentemente la actividad antimicrobiana/antifungica de la plata (forma metalica coloidal o forma metalica micronizada "esponjosa") con la que se asocia, reduciendo drasticamente su citotoxicidad. Dicha fraccion de AH, despues de las pruebas adecuadas, se selecciono para las composiciones objeto de la presente invencion, de las que se demuestra, mediante los experimentos descritos en la presente memoria, tanto la eficacia contra los patogenos durante los tratamientos habituales y la reduccion de toxicidad contra los fibroblastos humanos, con el consiguiente aumento de la actividad de curacion de heridas. Sorprendentemente, el AH utilizado en las composiciones de la presente invencion puede proceder de una fuente extractiva, fermentacion (de Streptococcus) o biosintetica (de Bacillus), preferiblemente de una fermentacion o de una fuente biosintetica, y tiene un P.M. medio ponderado comprendido entre 130 y 230 kDa, preferiblemente entre 145 y 210 kDa, e incluso mas preferiblemente entre 160 y 200 kDa; este ultimo por brevedad en adelante se define como AH de P.M. medio ponderado de 160-200 kDa. Se puede adquirir en numerosas empresas (por ejemplo, Lifecore Biomedical; QP Corp.; Seikagaku; Shiseido; Fidia Farmaceutici) que pueden proporcionar AH con las especificaciones deseadas relativas al P.M.
En contra de las expectativas, se descubrio que las fracciones de acido hialuronico que tiene un peso molecular medio ponderado notablemente mayor que el de las fracciones oligomericas tienen influencia positiva mas fuerte sobre la proliferacion de fibroblastos que el de las fracciones oligomericas. La composicion que comprende estas fracciones espedficas de AH y plata demuestra una mejora del efecto antibacteriano/antifungico y tambien una toxicidad reducida frente a los fibroblastos en comparacion con composiciones habituales a base de plata solo en pruebas espedficas.
Por ejemplo, con referencia a la tercera columna de la figura 4, la composicion de la invencion, que comprende estas
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fracciones espedficas de AH y plata, estimula el crecimiento de fibroblastos con respecto a la muestra de referencia, mientras que se observa una reduccion de fibroblastos con respecto a la referencia utilizando plata coloidal, sin AH, en una cantidad total tan baja como un tercio de la de la prueba con la composicion de la invencion.
Esto significa que la composicion de la presente invencion representa un progreso claro e impredecible sobre los ultimos adelantos de la tecnica, que es mas eficiente y menos toxica que las composiciones actualmente disponibles para el tratamiento topico de las lesiones cutaneas descritas.
En base a los resultados de los experimentos descritos mas adelante, se descubrio inesperadamente que la composicion de la invencion que comprende AH con un peso molecular medio ponderado de 160-200 kDa y plata metalica coloidal o micronizada "esponjosa" tiene las siguientes propiedades sorprendentes:
- una capacidad sin precedentes y notable por el AH con un peso molecular medio ponderado de 160-200 kDa para estimular la proliferacion de fibroblastos;
- actividad antibacteriana, relacionada con la presencia de plata coloidal o plata metalica micronizada "esponjosa", que es al menos comparable a la de los tratamientos convencionales contra microorganismos que se encuentran generalmente en las heridas infectadas;
- en particular cuando se utiliza plata metalica micronizada "esponjosa", la composicion de la invencion es mas activa que los tratamientos habituales contra el SARM, que es particularmente diffcil de contrastar;
- toxicidad muy baja o ausente para con fibroblastos cutaneos;
- actividad antibacteriana ejercida tambien en presencia de cantidades de plata inferiores al 50% de la formulacion disponible en el mercado, manteniendo al mismo tiempo la capacidad del AH para estimular la proliferacion de fibroblastos.
Por estas razones, la composicion de la invencion es especialmente ventajosa con respecto a las composiciones conocidas en la tecnica anterior y sobre las composiciones actualmente disponibles para el tratamiento de lesiones cutaneas y heridas emergentes, por ejemplo, de lesiones cutaneas y/o heridas de diverso origen (agudas, cronicas, ulceras de etiologfa diversa, quemaduras, llagas).
Preferiblemente, en la composicion de la invencion el acido hialuronico tiene un peso molecular medio ponderado entre 145 y 210 kDa.
Preferiblemente, en la composicion de la invencion el acido hialuronico tiene un peso molecular medio ponderado entre 160 y 200 kDa y la plata esta en forma metalica micronizada con una estructura porosa "esponjosa".
En la composicion de la invencion la plata en forma metalica micronizada con una estructura porosa "esponjosa" tiene un tamano de partfcula medio entre 2 y 18 micrometres y un area superficial no inferior a 5 m2/g.
Preferiblemente, en la composicion de la invencion el acido hialuronico tiene una concentracion entre 0,1 y 2% p/p de la composicion total, mas preferiblemente entre 0,1 y 0,5% p/p de la composicion total y, aun mas preferiblemente 0,2% p/p de la composicion total.
En la composicion de la invencion la plata en forma metalica coloidal o la plata en forma metalica micronizada con una estructura porosa "esponjosa" tiene una concentracion entre 1 y 3% p/p de la composicion total, preferiblemente de 2% p/p de la composicion total.
Una composicion segun la presente invencion puede estar en forma de polvos, soluciones o suspensiones, para administrarse en diversas formas, entre las que se prefieren gel hidrofilo, espuma, aerosol anhidro, ya que presentan algunas caractensticas especialmente deseadas. En particular, aerosol anhidro y espuma:
• son facilmente aplicables y sin operaciones especiales, ya que no necesitan ni cortar ni dar forma para adaptarse a la herida;
• puede aplicarse evitando el contacto con la herida, contribuyendo de esta manera a reducir las causas adicionales de contaminacion;
• son perfectamente adaptables al sitio en el que se van a aplicar, es decir, una herida superficial, plana o de todas formas con pequenas cavidades se beneficiaran de la aplicacion de una aerosol anhidro, que se distribuira facilmente de manera uniforme. De hecho, el polvo de acido hialuronico presente en el aerosol anhidro, en contacto con el exudado, forma inmediatamente un gel transparente que mantiene humeda la cavidad de la lesion en una medida que favorece la curacion de heridas y al mismo tiempo la divide del medio ambiente circundante, evitando contaminaciones adicionales; en una herida profunda, hueca, sera mas util aplicar una espuma en su lugar, que llena de forma homogenea y uniforme todo el lecho de la herida, favoreciendo el contacto rntimo tanto de la curacion de heridas (acido hialuronico) como del agente antibacteriano (plata) con la parte lesionada;
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• no requieren necesariamente ser cubierta con vendas, con la ventaja de simplificar la etapa de renovacion del vendaje.
En cuanto a la forma de hidrogel, encuentra aplicacion espedfica en caso de heridas no muy profundas ni con cavidades y con poco exudado; de hecho, el propio hidrogel proporciona el medio con la humedad correcta que es fundamental para el proceso de curacion.
La presente invencion proporciona una formulacion farmaceutica que comprende una composicion que comprende acido hialuronico y plata, en donde el acido hialuronico tiene un peso molecular medio ponderado entre 130 y 230 kDa y en donde la plata esta en forma metalica coloidal o en forma metalica micronizada con una estructura porosa "esponjosa" con un tamano medio de partroula entre 2 y 18 micrometros, un area superficial no inferior a 5 m2/g y la concentracion de plata en dicha forma metalica micronizada con una “estructura esponjosa” o en dicha forma coloidal entre 1 y 3% en peso, en combinacion con al menos un excipiente farmaceuticamente aceptable.
Preferiblemente, la formulacion farmaceutica de la presente invencion comprende ademas al menos un excipiente seleccionado de un agente de suspension, un vehuculo y un propulsor.
Mas preferiblemente, en la formulacion farmaceutica segun la presente invencion, el propulsor se selecciona de un grupo que consiste en mezclas de isobutano/n-butano/propano y n-butano.
Preferiblemente, la formulacion farmaceutica segun la invencion esta en forma de un aerosol anhidro, una espuma o un gel hidrofilo, que son adecuadas para aplicacion cutanea.
Preferiblemente, la formulacion farmaceutica segun la invencion esta en forma de un aerosol anhidro que establece como gel transparente en la cavidad de la lesion para favorecer la curacion optima de la herida humeda.
Mas preferiblemente, la formulacion farmaceutica segun la invencion esta en forma de un aerosol anhidro, que comprende acido hialuronico con un peso molecular medio ponderado entre 160 y 200 kDa con una concentracion de 0,2% p/p, plata metalica micronizada con una estructura porosa "esponjosa" con un tamano medio de partroula entre 2 y 18 micrometres, un area superficial no inferior a 5 m2/g a una concentracion de 2% p/p y n-butano como propulsor.
Mas preferiblemente, la formulacion farmaceutica segun la invencion esta en forma de un aerosol anhidro, que comprende acido hialuronico con un peso molecular medio ponderado entre 160 y 200 kDa con una concentracion de 0,2% p/p, plata metalica coloidal con una concentracion de 2% p/p y n-butano como propulsor.
Preferiblemente, la formulacion farmaceutica segun la invencion es en forma de espuma, que comprende acido hialuronico con un peso molecular medio ponderado entre 160 y 200 kDa con una concentracion de 0,2% p/p, plata en forma micronizada metalica con una estructura porosa "esponjosa" con una estructura porosa "esponjosa" con un tamano medio de partroula entre 2 y 18 micrometros, un area superficial no inferior a 5 m2/g o en forma metalica coloidal con una concentracion de 2% p/p y una mezcla de isobutano/n-butano/propano como propulsor.
Preferiblemente, la formulacion farmaceutica segun la invencion esta en forma de gel hidrofilo que comprende acido hialuronico con un peso molecular medio ponderado entre 160 y 200 kDa con una concentracion de 0,2% p/p, plata en forma micronizada metalica con una estructura porosa "esponjosa" con un tamano medio de partroula entre 2 y 18 micrometros, un area superficial no inferior a 5 m2/g o en forma metalica coloidal con una concentracion de 2% p/p y una mezcla de isobutano/n-butano/propano como propulsor.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a una composicion o una formulacion farmaceutica como se ha descrito anteriormente para su uso como medicamento.
En otra realizacion, la presente invencion se refiere a una composicion o una formulacion farmaceutica como se ha descrito anteriormente para su uso en el tratamiento topico de las lesiones y/o heridas cutaneas superficiales de cavidad pequena.
Preferiblemente, la formulacion farmaceutica para uso en el tratamiento topico de las lesiones y/o heridas cutaneas cavidad superficiales y/o de cavidad pequena esta en forma de un aerosol anhidro, que comprende acido hialuronico con un peso molecular medio ponderado entre 160 y 200 kDa con una concentracion de 0,2 % p/p, plata metalico micronizada con una estructura porosa "esponjosa", con un tamano medio de partroula entre 2 y 18 micrometros, un area superficial no inferior a 5 m2/g a una concentracion de 2% p/p y n-butano como propulsor.
Preferiblemente, la formulacion farmaceutica para uso en el tratamiento topico de las lesiones y/o heridas cutaneas superficiales y/o de cavidad pequena segun la invencion esta en forma de un aerosol anhidro, que comprende acido hialuronico con un peso molecular medio ponderado entre 160 y 200 kDa con la concentracion de 0,2% p/p, plata metalica coloidal con una concentracion de 2% p/p y n-butano como propulsor.
Preferiblemente, la formulacion farmaceutica para uso en el tratamiento topico de las lesiones y/o heridas cutaneas superficiales y/o cavidad pequena segun la invencion esta en forma de espuma, que comprende acido hialuronico
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con un peso molecular medio ponderado entre 160 y 200 kDa con concentracion de 0,2% p/p, plata en forma micronizada metalica con una estructura porosa "esponjosa" con un tamano medio de partfcula entre 2 y 18 micrometros, un area superficial no inferior a 5 m2/g o en forma metalica coloidal con una concentracion de 2% p/p y una mezcla de isobutano/n-butano/propano como propulsor.
Preferiblemente, la formulacion farmaceutica para uso en el tratamiento topico de lesiones y/o heridas cutaneas superficiales y/o de cavidad pequena segun la invencion esta en forma de gel hidrofilo que comprende acido hialuronico con un peso molecular medio ponderado entre 160 y 200 kDa con una concentracion de 0,2% p/p, plata en forma metalica micronizada con una estructura porosa "esponjosa" con un tamano medio de partfcula entre 2 y 18 micrometros, un area superficial no inferior a 5 m2/g o en forma metalica coloidal con una concentracion de 2% p/p y una mezcla de isobutano/n-butano/propano como propulsor.
En una realizacion, la presente invencion se refiere a un aparato para administrar la composicion como se ha descrito anteriormente en forma de un aerosol anhidro, una espuma para aplicacion cutanea o un gel hidrofilo.
Todos los experimentos mostrados en la presente solicitud se llevaron a cabo en fibroblastos sanos aislados a partir de biopsias de piel humana, a fin de reproducir con la mayor precision posible la situacion patologica encontrada cuando se aplica el producto final. Los ensayos de cultivo celular utilizaron un material tridimensional como soporte, para imitar con precision el lecho de la herida que, aunque danado, comprende una capa dermica mas profunda y una epidermica, mas superficial.
Los protocolos de investigacion y materiales utilizados se describen en la presente memoria.
Experimento 1: Evaluacion de la proliferacion celular in vitro de fibroblastos humanos cultivados en presencia de AH con diferentes P.M.
En base a lo que esta disponible en los ultimos adelantos de la tecnica, se preparan diferentes muestras de AH, y en particular:
i. AH con P.M. medio ponderado comprendido entre 5.000-10.000 Da, preparado segun el ejemplo 1 de la patente europea EP 868 437;
ii. AH con P.M. medio ponderado comprendido entre 10.000-15.000 Da, preparado segun el ejemplo 2 de la patente europea EP 868 437;
iii. AH con P.M. medio ponderado de 160.000-200.000 Da;
iv. AH con P.M. medio ponderado 1.000.000 Da, preparado segun el ejemplo 1 de la patente europea EP 535 200;
v. AH con P.M. medio ponderado 1.500.000-3.200.000 Da, Hyalubrix® (Migliore et al., Arthr. Res. Ther. 2009, 11, R183);
todos a la concentracion de 1 mg/ml de medio de cultivo.
Aislamiento de fibroblastos sanos de biopsias de piel humana: en resumen, despues de algunos lavados en solucion tampon de fosfato (PBS) adicionada con antibioticos, la biopsia se libera de tejido adiposo subcutaneo y se corta en pequenas tiras, que se someten a digestion enzimatica por la enzima dispasa durante 30 min. Al final del tratamiento, la piel se separa de la dermis subyacente, que se digiere con tripsina durante 10 min; las celulas se extraen a continuacion por centrifugacion.
Cultivo celular: las celulas se cultivan in vitro sembrando en medio de cultivo DMEM enriquecido con suero bovino fetal al 20% (FBS), 1% de penicilina/estreptomicina (P/S) y 1% de glutamina.
Analisis MTT: Este analisis determina cuantitativamente la presencia de actividad de succinato deshidrogenasa en celulas cultivadas; dicha actividad, presente solo en las mitocondrias de celulas viables, se utiliza normalmente como marcador para comprobar la actividad metabolica, la viabilidad y por tanto el crecimiento de las celulas cultivadas. La prueba se basa en la conversion del colorante azolico MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) de amarillo a azul por succinato-deshidrogenasa. La cantidad de colorante azul (formazan) determinada por espectrofotometna es proporcional a la presencia de succinato-deshidrogenasa en el cultivo celular y ademas es proporcional al numero de celulas viables.
Las celulas se incuban con una solucion de MTT de 0,5 mg/ml durante 3 h. Al final de la incubacion, el colorante se extrae de la celula con una solucion de extraccion (90% de isopropanol, 10% de DMSO) y se lee a la longitud de onda de 540/660 nm.
Procedimiento de operacion: como se ha dicho, los ensayos de proliferacion de celulas se llevaron a cabo utilizando cultivos tridimensionales y celulas precisamente de siembra Hyaff 11 no tejido (preparado segun el ejemplo 2 de la patente europea EP 618 817). Este es el procedimiento preferido cuando la intencion es imitar la proliferacion fibroblastica in vivo, y esto es en una dermis que consiste en una matriz extracelular tridimensional formado principalmente por acido hialuronico y colageno, en la que se insertan fibroblastos cutaneos.
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Se siembran fibroblastos aislados (60.000) segun lo anteriormente dicho en pequenas piezas de material no tejido (1x1 cm) fijado dentro de placas adecuadas, y se mantienen en cultivo durante 24 h. Despues, se anadieron diferentes muestras de AH para probar al medio de cultivo, y despues de 3 dfas de tratamiento, se llevo a cabo el analisis MTT para evaluar la proliferacion celular. La referencia consistio en fibroblastos no tratados con AH.
Resultados: como se muestra claramente en la figura 1, al contrario de lo descrito en los ultimos adelantos de la tecnica, las fracciones de bajo P.M. de AH no estimulan la proliferacion celular. La fraccion de peso molecular medio ponderado de 160-200 kDa, en cambio, tiene notable actividad proliferante, mientras que los P.M. superiores a un millon de Da resultan totalmente ineficientes, cuando no incluso toxicos.
La proliferacion y la viabilidad de los fibroblastos se confirman tambien por evaluacion cuantitativa de la expresion genica de colageno de tipo I (figura 3) y fibronectina (figura 2), segun el siguiente procedimiento.
Se aislaron y cultivaron fibroblastos como se ha descrito anteriormente, y se trataron durante 3 dfas con muestras i, ii, iii (se excluyeron los demas debido a su efecto negativo sobre la proliferacion celular); al final del tratamiento se llevo a cabo la PCR en tiempo real para evaluar la expresion genica de colageno tipo I y fibronectina: ARN celular se extrajo utilizando el metodo "Trizol", siguiendo las instrucciones del proveedor (reactivo TRIZOL, Techonologies LIFE, GIBCO BRL). En resumen, se lisaron celulas anadiendo 1,0 ml de Trizol y se analizo cuantitativamente el ARN total midiendo la absorbancia a 260 nm. Para amplificar cada gen, se seleccionaron cebadores adecuados utilizando el programa informatico Primer3 (Roche Molecular Diagnostics, Pleasanton, CA, EE. UU.). Se evaluo la expresion genica por PCR en tiempo real llevada a cabo con Rotor-gene TM5500 (Corbett Research, Sydney, Australia). Los resultados se resumen en las figuras 2 y 3: ellos confirman que el AH de P.M. medio ponderado 160-200 kDa determina un aumento significativo en la expresion genica de ambas protemas en comparacion con la referencia, y esto significa que los fibroblastos tratados son capaces de construir la matriz extracelular, esencial para completar la curacion de las heridas.
Conclusion: sorprendentemente, el AH de P.M. medio ponderado 160-200 kDa presento una accion extraordinariamente eficiente en la proliferacion de fibroblastos cutaneos. Dichos fibroblastos son viables y metabolicamente activos, ya que depositan matriz extracelular, por lo que son capaces de activar la reparacion de tejidos cutaneos lesionados.
Basandose en los inesperados resultados anteriores, se evaluan los efectos antimicrobianos y antifungicos de las formulaciones presentadas en la presente memoria utilizando un producto comercializado como referencia. Los microorganismos empleados son los que normalmente estan presentes en las heridas infectadas, es decir: E. coli, P. aeruginosa, E. faecium (resistentes a la vancomicina), S. aureus (resistente a la meticilina) y C. albicans.
Se prepararon formulaciones analfticas, que conteman plata, tanto en forma coloidal como metalica, en forma de polvo, para ser disueltas en el medio del experimento.
Experimento 2: Evaluacion de la actividad antimicrobiana/antifungica de los preparados.
Se realizaron pruebas in vitro, por lo tanto se prepararon formulaciones analfticas que conteman plata metalica coloidal o metalica micronizada en forma de polvos, de modo que pudieran disolverse o ponerse en suspension para evaluar su eficacia. La formulacion de referencia (R) esta disponible en el mercado en forma de polvo, asf como de aerosol anhidro (Katoxyn® , Deverge M & M).
Formulacion A
• 0,2% de AH sodio de P.M. 160-200 kDa
• 2% de plata metalica coloidal
• 4% de Syloid 244 (excipiente)
• caolrn ligero (excipiente) c.s.p. 100 Formulacion B
• 0,2% de AH sodio de P.M. 160 a 200 kDa
• 2% de plata metalica micronizado esponjosa (SL) 2% (MicroSilver BG™ Pharma)
• 4% de Syloid 244 (excipiente)
• caolrn ligero (excipiente) c.s.p. 100
probada frente a una composicion comercial patron (formulacion C - Katoxyn®) que consiste en
• 4,25% de plata metalica coloidal
• 1,5% de peroxido de benzoflo
• 1% de gluconato de calcio anhidro (excipiente)
• Silicato de aluminio (excipiente) c.s.p. 100
5 Microorganismos de ensayo: se preparo un cultivo lfquido de cada microorganismo siguiendo las instrucciones del proveedor. La incubacion duro 48 horas como mmimo, a fin de obtener un cultivo rico y viable; el tttulo de cada cultivo se determino aproximadamente por la escala de McFarland. Para algunos microorganismos se prepararon dos suspensiones de prueba inoculando en dos muestras de 100 ml de TSB (Tryptic Soy Broth; Millipore) una cantidad de cultivo lfquido que contiene aproximadamente 103 y aproximadamente 106UFC. Los inoculados se 10 sometieron a continuacion a recuento para determinar exactamente el contenido microbiano de las suspensiones a T=0.
Muestras de formulaciones: Se extrajeron dos muestras de aproximadamente 1 g de cada formulacion y se anadieron a suspensiones que contienen 103y 106CFU, o solamente 103CFU. Las muestras asf preparadas se incubaron y se mantienen en agitacion lenta y constante y rotacion vertical, a fin de maximizar el contacto mtimo del 15 producto con los microorganismos y para evitar el fenomeno de sedimentacion de polvo. Despues de 30 min de incubacion, se extrajo una alfcuota, en la que se llevo a cabo el recuento del contenido microbiano de las suspensiones por la tecnica de las membranas de filtrado, operando diluciones adecuadas en las muestras que conteman 106 CFU. Las membranas utilizadas para la filtracion se transfirieron al medio TSA (Tryptone Soy Agar - Biogenetics) y se incubaron durante al menos 5 dfas.
20 El recuento del contenido bacteriano en la suspension de ensayo se repitio despues de 12 h y 24 h.
Las tablas siguientes describen, para cada formulacion ensayada, los valores de reduccion logantmica de la concentracion de diversos microorganismos despues de diferentes tiempos de contacto.
Tabla 1 - Formulacion A
- E. coli ATCC 8739
- 12 horas 24 horas
- 3 x 103
- 3 3
- 4 x 105
- 5 5
- P. aeruginosa ATCC 15442
- 12 horas 24 horas
- 6 x 103
- 3 3
- 5 x 105
- 5 5
- E. faecium ATCC 700221
- 12 horas 24 horas
- 2 x 102
- 2 2
- C. albicans ATCC 10231
- 12 horas 24 horas
- 5 x 102
- 2 2
25 A partir de los datos, se puede inferir que el contenido de bacterias en todos los inoculos tratados con la formulacion A es practicamente nulo tanto despues de 12 h como de 24 h. Esto significa que la formulacion A actua como bactericida, y no como bacteriostatico. De hecho, la Farmacopea Europea define un bactericida para uso topico como un producto que, despues de 24 h en contacto con el microorganismo, reduce su contenido por lo menos 2 logaritmos de concentracion.
Tabla 2 - Formulacion B
- E. coli ATCC 8739
- 12 horas 24 horas
- 3 x 103
- 3 3
- 4 x 105
- 5 5
- P. aeruginosa ATCC 15442
- 12 horas 24 horas
- 6 x 103
- 3 3
- 5 x 105
- 5 5
- E. faecium ATCC 700221
- 12 horas 24 horas
- 2 x 102
- 2 2
- C. albicans ATCC 10231
- 12 horas 24 horas
- 5 x 102
- 2 2
La formulacion B tiene un perfil de actividad identico al de la formulacion A. Esto significa que la actividad sobre los microorganismos en este experimento de plata formulada junto con el acido hialuronico es cuali/cuantitativamente 5 identica ya sea en forma coloidal o en forma metalica micronizada "esponjosa".
Tabla 3 - Formulacion C
- E. coli ATCC 8739
- 12 horas 24 horas
- 3 x 103
- 3 3
- 4 x 105
- 5 5
- P. aeruginosa ATCC 15442
- 12 horas 24 horas
- 6 x 103
- 3 3
- 5 x 105
- 5 5
- E. faecium ATCC 700221
- 12 horas 24 horas
- 2 x 102
- 2 2
- C. albicans ATCC 10231
- 12 horas 24 horas
- 5 x 102
- 2 2
Parece evidente que tambien la formulacion C se reproducen los resultados observados con las formulaciones A y B, pero los datos obtenidos dan lugar a una imagen absolutamente inesperada, teniendo en cuenta algunas 10 diferencias fundamentales entre las diferentes formulaciones:
• A y B contienen una concentracion de plata (2%) claramente inferior (menos de la mitad) que la de C (4,25%)
• C contiene peroxido de benzoflo (PB); como todos los peroxidos, PB es un agente oxidante de por sf, que se utiliza
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muy a menudo en los preparados topicos contra el acne exactamente por su capacidad para matar los microorganismos debido a la ox^geno liberado del mismo. La actividad de la formulacion C se debe por tanto a la plata y al PB contenida en el mismo, en donde el PB actua por un lado como un activador de la oxidacion de la plata, y por otro lado como una fuente de agente antibacteriano, es decir, oxfgeno.
Conclusion: todas las formulaciones probadas pueden definirse, como por Farmacopea Europea, agentes bactericidas para uso topico. En terminos de reduccion del contenido bacteriano los tres preparados son cualitativa pero no cuantitativamente equivalentes, porque, absolutamente impredecible, las formulaciones A y B, que comprenden acido hialuronico con un P.M. medio ponderado igual a 160-200 kDa, contienen menos de la mitad de la plata presente en C.
Por lo tanto, las formulaciones A y B son mas eficientes que la formulacion C ya que provocan el mismo efecto antibacteriano/antifungico con una concentracion de plata notablemente inferior y sin ayuda de agentes activos adicionales (oxfgeno liberado de peroxido de benzoMo).
Experimento 2a: a la vista de los datos anteriores, se realiza una prueba adicional para evaluar el efecto de las composiciones A, B y C (definido anteriormente) frente a un microorganismo especialmente relevante, es decir, Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (SARM). SARM es una bacteria responsable de varias infecciones sean particularmente diffciles de tratar, en la medida en que a veces se denomina "Staphylococcus aureus multirresistente". De hecho, es resistente a los antibioticos p-lactamicos y a las cefalosporinas. Las infecciones por SARM son particularmente problematicas en los hospitales en donde los pacientes con heridas abiertas o que llevan dispositivos invasivos (p. ej., cateteres) corren un alto riesgo de contaminacion.
Procedimiento.
Almohadillas de los dedos esterilizadas se contaminan con SARM (108 UFC en un volumen de 30 microlitros); las areas contaminadas se dejan secar al aire durante 3 minutos, a continuacion el producto que va a ensayarse (composicion A, B o C) se aplica desde una distancia de unos 15 cm durante 5 segundos, con un intervalo de 3 segundos, dos veces. Cada formulacion se pone en contacto con los microorganismos durante 30 min, 3 h, 6 h o 15 h en una camara humedecida. Al final, las almohadillas de los dedos se sumergen durante 1 minuto en un medio neutralizante para bloquear la accion antimicrobiana y para recoger los microorganismos. Una muestra del medio neutralizante se diluyo adecuadamente y se sembro en un medio solido apropiado. Las UFC se cuantifican despues de 25 h de cultivo y los datos resultantes se dan a conocer en la figura 5. Es evidente que, en lmea con los resultados del experimento 1, la actividad de la composicion C es totalmente superponible a la de la composicion A. Sorprendentemente, la composicion B , que comprende plata metalica micronizada "esponjosa" y AH con un P.M. medio ponderado de 200 kD, tiene un efecto notablemente superior, reduciendo la poblacion microbiana mas sustancialmente tanto en 30 min como en puntos posteriores en el tiempo. Este aspecto es particularmente notable, teniendo en cuenta que la cantidad de plata de la composicion B es menos de la mitad de la de la formulacion C.
Conclusion: todas las formulaciones probadas son eficaces tambien contra Staphilococcus aureus resistente a la meticilina (SARM), pero la composicion B que comprende plata metalica micronizada "esponjosa" y AH con un P.M. medio ponderado de 160-200 kDa es sustancialmente mas eficiente. La actividad de la composicion que comprende plata metalica micronizada "esponjosa" y AH con un P.M. medio ponderado de 160-200 kDa es especialmente sorprendente, teniendo en cuenta que la cantidad de plata en esta composicion es menor que la mitad de la de la composicion disponible en el mercado.
En vista de los resultados del experimento 2 y 2a, el efecto citotoxico de las formulaciones se prueba frente a fibroblastos cutaneos, para comprobar si la presencia de plata anulaba el efecto ejercido por AH con P.M. medio ponderado de 160-200 kDa de peso sobre la proliferacion de fibroblastos, demostrado en el experimento 1.
Experimento 3: actividad de la formulacion de la invencion sobre la proliferacion de los fibroblastos sanos de biopsias de piel humana in vitro.
El aislamiento y el cultivo de fibroblastos se realizaron segun el procedimiento descrito en el experimento 1. La proliferacion celular se evaluo mediante el ensayo de marcaje con bromodesoxiuridina BrdU (Kit de bromodesoxiuridina, BioAssay™). En resumen, despues de la incorporacion de BrdU, las celulas se someten a marcaje con un anticuerpo anti-BrdU y se analizan mediante un lector adecuado.
Muestras: dada la sorprendente eficiencia de la formulacion B contra SARM, por conveniencia de la formulacion, se selecciono la formulacion B (basada en plata metalica micronizada "esponjosa" y AH con un peso medio de 160-200 kDa) para ser comparada con la formulacion C (producto comercializado), preparando muestras a diferentes concentraciones (5 mg/ml; 30 mg/ml) de la forma siguiente.
Se pesaron cantidades adecuadas de cada formulacion, se disolvieron en DMEM (medio de cultivo celular) que contema BrdU, y se mantuvieron en agitacion durante 10 min. A continuacion, la mezcla se centrifugo a 6.000 rpm durante 3 min. El sobrenadante asf obtenido se puso en contacto con las celulas cultivadas, evaluando la proliferacion de fibroblastos frente a celulas en DMEM con BrdU solamente (referencia).
Los resultados del experimento se resumen en la figura 4, donde la primera columna representa valores de la proliferacion celular despues de 3 dfas de incubacion, y el segundo despues de 5 d^as de incubacion.
Parece inmediatamente evidente que la formulacion B ejerce un efecto positivo sobre la proliferacion de fibroblastos en comparacion con la referencia, independientemente de la cantidad de ingredientes activos contenidos en ella. El 5 efecto evaluado frente a la referencia es mas sustancial para la muestra de 5 mg/ml y despues de 3 dfas de contacto, pero tambien se observa crecimiento celular significativo en la muestra de 30 mg/ml tanto a 3 como a 5 dfas, siempre en comparacion con la referencia.
En particular, con referencia a la tercera columna de la figura 4, se observa crecimiento de los fibroblastos con respecto a la muestra de referencia en una prueba utilizando 30 mg/ml de la composicion B (que comprende 2% p/p 10 de plata micronizada "esponjosa" y 0,2% de hialuronato sodico con un peso molecular medio ponderado de 160 -200 kDa). En cambio (figura 4, cuarta columna), se observa una reduccion de fibroblastos con respecto a la referencia utilizando 5 mg/ml de composicion C que comprende 4,25% de plata coloidal, es decir, una cantidad total inferior de plata (aproximadamente un tercio) con respecto a la cantidad utilizada en la prueba con la composicion B a 30 mg/ml.
15 Una vez mas, el AH de P.M. medio ponderado 160-200 kDa demuestra sus propiedades inesperadas en la proliferacion celular tambien cuando estan asociados con un agente antibacteriano/antifungico. Los datos de estos experimentos, de hecho, demuestran que el acido hialuronico de P.M. Medio ponderado 160-200 kDa protege los fibroblastos de la actividad citotoxica de la plata mientras que deja inalterada la actividad antimicrobiana de la plata micronizada o la plata coloidal. Los datos para la formulacion C, en cambio, muestran una tendencia opuesta; ya a la 20 concentracion de 5 mg/ml a los 5 dfas se tienen valores de proliferacion negativos en comparacion con la referencia, para indicar la inhibicion de la proliferacion de fibroblastos, mientras que con la muestra que contiene 30 mg/ml se observa una disminucion del numero de fibroblastos ya despues de 3 dfas de tratamiento, lo que indica claramente la toxicidad de la muestra. Solo la muestra de 5 mg/ml despues de 3 dfas de tratamiento todavfa tiene un numero de fibroblastos identicos a la referencia, pero dicho resultado es absolutamente irrelevante si se compara con la 25 formulacion B equivalente que, en las mismas condiciones de concentracion y tiempo de tratamiento, aumenta la proliferacion de fibroblastos en mas del 50%.
Tambien en vista de los datos experimentales descritos en la presente, la composicion de la invencion que comprende acido hialuronico y plata, en forma de aerosol anhidro, espuma cutanea o gel hidrofilo, es adecuada para tratamiento topico de las lesiones cutaneas y/o heridas de diverso origen (agudo, cronico, ulceras de etiologfa 30 diversa, quemaduras, ulceras) tambien con el exudado, y a continuacion se caracterizan por un alto riesgo de infeccion, por ejemplo, microorganismos tales como Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Staphilococcus aureus y Enterococcus faecium y los hongos tales como Candida albicans. El acido hialuronico utilizado tiene un peso molecular medio ponderado comprendido entre 130 y 230 kDa, preferiblemente comprendido entre 145 y 210 kDa, e incluso mas preferiblemente comprendido entre 160 y 200 kDa. Su concentracion en la composicion final 35 puede oscilar entre 0,1 y 2% en peso (p/p), preferentemente entre 0,1 y 0,5% p/p y aun mas preferiblemente es igual a 0,2% p/p. La plata, que puede ser en forma metalica coloidal o en forma metalica micronizada "esponjosa", prefiriendose esta ultima forma, en vista de las ventajas anteriores. La concentracion de plata en la composicion final puede estar comprendido entre 1 y 3% p/p; siendo la concentracion preferida igual al 2% p/p. En cuanto a las formas farmaceuticas, el hidrogel es particularmente util para lesiones y/o heridas cutaneas bastante superficiales; el 40 aerosol seco encuentra uso particular, con lesiones y/o heridas cutaneas planas o en pequenas cavidades, mientras que la espuma cutanea es adecuada para aplicacion en las lesiones y/o heridas cutaneas en cavidades.
En caso de aerosol anhidro y espuma cutanea, la composicion segun la invencion comprende propulsores como n-butano o una mezcla que consiste en n-butano, isobutano y propano; en particular, n-butano es preferible en la formulacion de aerosol anhidro, mientras que la mezcla de n-butano, isobutano y propano es el propulsor preferido 45 para la espuma cutanea.
A tftulo ilustrativo, en la presente memoria se proporcionan formulaciones y metodo de preparacion de las formas farmaceuticas seleccionadas, que sin embargo pueden modificarse segun el conocimiento del experto en la tecnica de formulacion.
Aerosol anhidro que comprende Ag metalica coloidal: 100 g de producto contienen
- Componentes
- Cantidad Funcion
- Hialuronato de sodio (AH de sodio) P.M. 160-200 kDa
- 0,20
- Plata metalica coloidal 2,0
- 2,0 Antibacteriana
- Dioxido de silicio (Syloid 244)
- 4,0 Agente de suspension
- Caolm ligero
- c.s.p. 100 Vehmulo
- n-butano 1,3
- Propulsor
Acido hialuronico micronizado y tamizado se mezcla por dilucion progresiva con plata coloidal previamente micronizado. La premezcla obtenida se mezcla por dilucion progresiva con dioxido de silicio. La mezcla asf obtenida se mezcla por ultimo con caolm ligero hasta homogeneidad.
5 El producto intermedio obtenido de la manera descrita anteriormente se somete a continuacion a la distribucion en cilindros presurizados.
Aerosol anhidro que comprende Ag metalica micronizada "esponjosa": 100 g de producto contienen
- Componentes
- Cantidad Funcion
- Hialuronato de sodio (AH de sodio) P.M. 160-200 kDa
- 0,20
- Plata metalica micronizada (MicroSilver BGtm Pharma)
- 2,0 Antibacteriana
- Dioxido de silicio (Syloid 244)
- 4,0 Agente de suspension
- Caolm ligero
- c.s.p. 100 Vehmulo
- n-butano 1,3
- Propulsor
Acido hialuronico micronizada y tamizado se mezcla por dilucion progresiva con plata metalica micronizada 10 esponjosa, que tiene ya un tamano de partmula de micrometros. La premezcla obtenida se mezcla por dilucion progresiva con dioxido de silicio. La mezcla asf obtenida se mezcla por ultimo con caolm ligero hasta homogeneidad.
El producto intermedio obtenido de la manera descrita anteriormente se somete a continuacion a distribucion en cilindros presurizados.
Espuma cutanea a base de plata metalica coloidal: 100 g de producto contienen
- Componentes
- Cantidad (g)
- Hialuronato de sodio (AH de sodio) P.M. 160-200 kDa
- 0,20
- Plata metalica micronizada (MicroSilver BGIM Pharma)
- 2,0
- Glicerol
- 6,0
- Macrogliceridos de caprilocaproilo (Labrasol)
- 10,0
- Lecitina de soja hidrogenada
- 0,3
- Polisorbato 80
- 2,0
- Alcohol bendlico
- 0,5
- Sorbato potasico
- 0,1
- Acetato de a-tocoferol
- 0,1
- Agua purificada
- c.s.p. 100
- Isobutano, n-butano, propano
- Mezcla propulsora
Se anade con agitacion una dispersion de plata coloidal previamente micronizada en Labrasol a una solucion que comprende hialuronato de sodio y glicerol y se mezcla hasta homogeneidad. Se anaden sorbato de potasio, alcohol bendlico, polisorbato 80, acetato de alfa-tocoferilo, lecitina de soja hidrogenada y se agitan hasta que se disuelve. Se anade agua purificada hasta alcanzar el volumen final y se agita hasta homogeneidad. La preparacion 5 obtenida se filtra y se somete a distribucion en recipientes presurizados.
Espuma cutanea a base de plata metalica micronizada "esponjosa": 100 g de producto contienen:
- Componentes
- Cantidad (g)
- Hialuronato de sodio (AH de sodio) P.M. 160-200 kDa
- 0,20
- Plata metalica micronizada (MicroSilver 6GIM Pharma)
- 2,0
- Glicerol
- 6,0
- Macrogliceridos de caprilocaproilo (Labrasol)
- 10,0
- Lecitina de soja hidrogenada
- 0,3
- Polisorbato 80
- 2,0
- Alcohol bendlico
- 0,5
- Sorbato potasico
- 0,1
- Acetato de a-tocoferol
- 0,1
- Agua purificada
- c.s.p. 100
- Isobutano, n-butano, propano
- Mezcla propulsora
Se anade con agitacion una dispersion de plata metalica micronizada "esponjosa" en Labrasol a una solucion que comprende hialuronato de sodio y glicerol y se mezcla hasta homogeneidad. Se anaden sorbato de potasio, alcohol 10 bendlico, polisorbato 80, acetato de alfa-tocoferilo, lecitina de soja hidrogenada y se agita hasta que se disuelva. Se anade agua purificada hasta alcanzar el volumen final y se agita hasta homogeneidad. La preparacion obtenida se filtra y se somete a distribucion en recipientes presurizados.
Gel hidrofilo que comprende plata coloidal metalico: 100 g de producto contienen:
- Componentes
- Cantidad (g)
- Hialuronato de sodio (AH de sodio) P.M. 160-200 kDa
- 0,20
- Plata metalica coloidal
- 2,0
- Carbomer 974P
- 1,5
- Glicerol
- 10,0
- Propilenglicol
- 6,675
- Trietanolamina
- 1,325
- PEG 400
- 6,675
- p-hidroxibenzoato de metilo
- 0,2
- p-hidroxibenzoato de propilo
- 0,02
- Agua purificada
- c.s.p. 100
Se disuelven en agua purificada a 80°C p-hidroxibenzoato de metilo y p-hidroxibenzoato de propilo. Despues de enfriar la solucion a temperatura ambiente, se agrega hialuronato de sodio y se mezcla hasta disolucion completa. A continuacion, se disuelve PEG 400 y se anade Carbomer 974P mantenimiento en agitacion hasta que se obtienen 5 dispersion homogenea e hidratacion completa de este ultimo. A continuacion se anade trietanolamina hasta que se obtiene la gelificacion de la fase acuosa. Por ultimo, en agitacion, se anaden glicerol, propilenglicol y plata coloidal previamente micronizada y se mezclan hasta homogeneidad.
Gel hidrofilo que comprende plata metalica micronizada "esponjosa": 100 g de producto contienen:
- Componentes
- Cantidad (g)
- Hialuronato de sodio (AH de sodio) P.M. 160-200 kDa
- 0,20
- Plata metalica micronizada (MicroSilver 6GIM Pharma)
- 2,0
- Carbomer 974P
- 1,5
- Glicerol
- 10,0
- Propilenglicol
- 6,675
- Trietanolamina
- 1,325
- PEG 400
- 6,675
- p-hidroxibenzoato de metilo
- 0,2
- p-hidroxibenzoato de propilo
- 0,02
- Agua purificada
- c.s.p. 100
10 Se disuelven en agua purificada a 80°C p-hidroxibenzoato de metilo y p-hidroxibenzoato de propilo. Despues de enfriar la solucion a temperatura ambiente, se agrega hialuronato de sodio y se mezcla hasta disolucion completa. A continuacion, se disuelve PEG 400 y se anade Carbomer 974P mantenimiento en agitacion hasta que se obtienen dispersion homogenea e hidratacion completa de este ultimo. A continuacion se anade trietanolamina hasta que se obtiene la gelificacion de la fase acuosa. Por ultimo, en agitacion, se agregan glicerol, propilenglicol y plata metalica 15 micronizada "esponjosa" y se mezcla hasta homogeneidad.
En resumen, se descubrio que una formulacion que comprende AH con un peso molecular medio ponderado entre 130 y 230 kDa, preferiblemente 145 a 210 kDa y mas preferiblemente 160 a 200 kDa, con plata en la concentracion de 2% p/p es capaz de eliminar bacterias potencialmente patogenas y puede utilizarse de manera eficaz en terapia topica para el tratamiento de lesiones cutaneas y heridas que se originan, por ejemplo, a partir de lesiones cutaneas 20 y/o heridas de diverso origen en forma de aerosol anhidro o espuma cutanea o gel hidrofilo. La plata en la composicion de la invencion puede estar en forma metalica coloidal o en forma metalica micronizada "esponjosa", con un tamano medio de partfcula entre 2 y 18 micrometros, un area superficial no inferior a 5 m2/g, prefiriendose esta ultima forma, en vista de su actividad sorprendentemente mayor frente a las infecciones por SARM.
Claims (15)
- 510152025303540REIVINDICACIONES1. Una composicion que comprende acido hialuronico y plata, en donde el acido hialuronico tiene un peso molecular medio ponderado entre 130 y 230 kDa y en donde la plata esta en forma metalica micronizada con una estructura porosa “esponjosa” con un tamano de partfcula medio entre 2 y 18 micrometros y un area superficial no inferior a 5 m2/g o en forma metalica coloidal y la concentracion de plata en forma metalica micronizada con una estructura porosa "esponjosa" o en forma coloidal, esta comprendida entre 1 y 3% en peso de la composicion total.
- 2. La composicion segun la reivindicacion 1, en donde el acido hialuronico tiene un peso molecular medio ponderado entre 145 y 210 kDa.
- 3. La composicion segun la reivindicacion 1, en donde el acido hialuronico tiene un peso molecular medio ponderado entre 160 y 200 kDa.
- 4. La composicion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el acido hialuronico tiene una concentracion entre 0,1 y 2% p/p de la composicion total.
- 5. La composicion segun la reivindicacion 4, en donde el acido hialuronico tiene una concentracion entre 0,1 y 0,5% p/p de la composicion total.
- 6. La composicion segun la reivindicacion 5, en donde el acido hialuronico tiene una concentracion del 0,2% p/p de la composicion total.
- 7. La composicion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la plata tiene una concentracion de 2% p/p de la composicion total.
- 8. Una formulacion farmaceutica que comprende la composicion segun cualquiera de las reivindicaciones anteriores, y al menos un excipiente farmaceuticamente aceptable.
- 9. La formulacion farmaceutica segun la reivindicacion 7, en donde al menos un excipiente se selecciona de un agente en suspension, un vehuculo y un propulsor.
- 10. La formulacion farmaceutica segun la reivindicacion 9, en la que el propulsor se selecciona de un grupo que consiste en mezclas de isobutano/n-butano/propano y n-butano.
- 11. La formulacion farmaceutica segun la reivindicacion 8, en forma de aerosol anhidro, espuma o gel hidrofilo que son adecuados para aplicacion cutanea.
- 12. La formulacion farmaceutica segun la reivindicacion 11 en forma de aerosol anhidro, que comprende acido hialuronico con un peso molecular medio ponderado entre 160 y 200 kDa con una concentracion de 0,2% p/p, plata en forma micronizada metalica con una estructura porosa “esponjosa” o en forma metalica coloidal en concentracion de 2% p/p y n-butano como propulsor.
- 13. La formulacion segun la reivindicacion 11-12 en forma de un aerosol anhidro adecuado para formar un gel transparente tras la aplicacion en la cavidad de la lesion.
- 14. La formulacion farmaceutica segun la reivindicacion 11 en forma de espuma, que comprende acido hialuronico con un peso molecular medio ponderado entre 160 y 200 kDa con una concentracion de 0,2% p/p, plata en forma micronizada metalica con una estructura porosa “esponjosa” o en forma metalica coloidal en concentracion de 2% p/p y una mezcla de isobutano/n-butano/propano como propulsor, o en forma de un gel hidrofilo, que comprende acido hialuronico con un peso molecular medio ponderado entre 160 y 200 kDa en una concentracion de 0,2% p/p, plata en forma micronizada metalica con una estructura porosa “esponjosa” o en forma metalica coloidal, en concentracion de 2% p/p.
- 15. La composicion segun las reivindicaciones 1-7 o la formulacion segun las reivindicaciones 8-14 para su utilizacion como medicamento en el tratamiento topico de lesiones y/o heridas cutaneas superficiales y/o de cavidad pequena.
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