ES2588245T3

ES2588245T3 - Ulvano liasa, procedimiento de fabricación y utilizaciones

Info

Publication number: ES2588245T3
Application number: ES11736126.1T
Authority: ES
Inventors: William Helbert; Pi Nyvall-Collen; Yannick Lerat; Jean-François SASSI
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Pierre et Marie Curie Paris 6; Centre dEtude et de Valorisation des Algues SA CEVA
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Pierre et Marie Curie Paris 6; Centre dEtude et de Valorisation des Algues SA CEVA
Priority date: 2010-06-18
Filing date: 2011-06-16
Publication date: 2016-10-31
Anticipated expiration: 2031-06-16
Also published as: EP2582810B1; FR2961526A1; WO2011157966A1; FR2961526B1; PT2582810T; US20130230889A1; DK2582810T3; US8669089B2; EP2582810A1

Abstract

Ulvano liasa que tiene una actividad idurónico y glucurónico liasa extraída del microorganismo depositado el 17 de junio 2010 con el número I-4324 en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) 25 rue du docteur Roux, 75724 París Cedex 15, Francia, de 46 kD de secuencia SEQ ID N.º 4.

Description

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De acuerdo con la invención, estas ulvano liasas, sea cual sea su secuencia, pueden comprender además, en su extremo N-terminal, una secuencia señal o secuencia de dirección. Esta secuencia señal puede ser una de las secuencias señal conocidas por el experto en la materia para que la proteína, cuando es sintetizada en una célula huésped, sea dirigida hacia un orgánulo o una zona particular de la célula huésped. Puede tratarse, por ejemplo, de una secuencia señal encontrada en los sitios especializados en la predicción de péptidos señal, por ejemplo, http://www.cbs.dtu.dk/services/SignaIP/ [2] o también http://bmbpcu36.leeds.ac.uk/prot_analysis/Signal.htmL [3]. Pude tratarse, por ejemplo, de la secuencia SEQ ID N.º 3 de la lista de secuencias adjunta. Esta secuencia señal puede escindirse después de la síntesis de la proteína o no. Los procedimientos de escisión conocidos por el experto en la materia pueden utilizarse, por ejemplo, aquellos que implican proteasas específicas de un sitio de escisión. Se selecciona entonces una secuencia señal que presente dicho sitio. La presente describe ácidos nucleicos que codifican las ulvano liasas, concretamente la proteína SEQ ID N.º 1. Puede tratarse, por ejemplo, de un ácido nucleico que comprende o está constituido por la secuencia SEQ ID N.º 5 de la lista de secuencias adjunta.

La presente describe también un ácido nucleico que codifica la proteína de secuencia SEQ ID N.º 2 de la lista de secuencias adjunta. Puede tratarse, por ejemplo, de la secuencia SEQ ID N.º 6 de la lista de secuencias adjunta.

La presente describe también un ácido nucleico que codifica la proteína de secuencia SEQ ID N.º 3 de la lista de secuencias adjunta. Puede tratarse, por ejemplo, de la secuencia SEQ ID N.º 7 de la lista de secuencias adjunta.

La presente invención se refiere, también, a un ácido nucleico que codifica la proteína de secuencia SEQ ID N.º 4 de la lista de secuencias adjunta. Puede tratarse, por ejemplo, de la secuencia SEQ ID N.º 8 de la lista de secuencias adjunta.

Estas secuencias de ácidos nucleicos o genes de la presente invención son los primeros representantes de una nueva familia de genes que codifican polisacárido-liasas y representan también los primeros genes de enzimas conformes a la presente invención de degradación del ulvano.

La presente invención se refiere, también, a un vector que comprende un ácido nucleico que codifica una de las ulvano liasas de la presente invención: un ácido nucleico de secuencias SEQ ID N.º 8. El vector puede ser uno de los vectores conocidos por el experto en la materia para fabricar proteínas mediante recombinación genética. Se selecciona en general concretamente en función del huésped celular seleccionado. El vector puede seleccionarse, por ejemplo, entre los vectores enumerados en el catálogo http://www.promega.com/vectors/mammalian_express_vectors.htm [4] o http://www.qiagen.com/overview/qiagenes.aspx?gaw=PROTQIAgenes080 7&gkw=mammalian+expression [5], o también http://www.scbt.com/chap_exp_vectors.php?type=pCruzTM%20Expressio n%20Vectors [6]. Puede tratarse por ejemplo del vector de expresión descrito en el documento WO 83/004261 [7].

Los ácidos nucleicos de la presente invención o los vectores de la presente invención son utilizables concretamente para la fabricación por recombinación genética de las ulvano liasas de la presente invención. También, la presente invención se refiere, además, a una célula huésped que comprende una secuencia de ácido nucleico de acuerdo con la invención o un vector de acuerdo con la invención.

La célula huésped o huésped celular puede ser cualquier huésped apropiado para la fabricación de las ulvano liasas de la presente invención a partir de los ácidos nucleicos o de los vectores de la invención. Puede tratarse por ejemplo de E. coli, de Pischia pastoris, de Saccharomyces cerevisiae, de células de insectos, por ejemplo un sistemas de células de insectos-baculovirus (por ejemplo células de insecto SF9 que utilizan un sistema de expresión de baculovirus), de mamíferos.

También, la presente invención se refiere, también, a un procedimiento de fabricación de una ulvano liasa de acuerdo con la invención mediante recombinación genética utilizando un ácido nucleico o un vector de acuerdo con la invención. Los procedimientos de recombinación genética conocidos por el experto en la materia son utilizables, el origen marino o terrestre no influye en la posibilidad de recombinación y de expresión heteróloga.

Los inventores de la presente son, además, los primeros en haber aislado un microorganismo, nombrado por ellos 01-PN-2010, que produce las ulvano liasas de la presente invención. Se trata de una bacteria marina. Esta bacteria marina se encuentra, por ejemplo, en las heces de Aplysia punctata (Mollusca, Gastropoda). Los inventores depositaron esta bacteria de acuerdo con el Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de los microorganismos con fines del procedimiento en materia de patentes en la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) 25 rue du docteur Roux, 75724 París Cedex 15, Francia. El número de depósito de esta cepa en la CNCM es I-4324.

Los inventores purificaron, a partir de este microorganismo, las dos ulvano liasas de 30 kD y 46 kD descritas en la presente.

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Las secuencias de los péptidos obtenidos después de la incubación con tripsina no tenían ninguna homología significativa con secuencias de la técnica anterior en el banco TrEMBL a pesar del tamaño importante de los fragmentos peptídicos secuenciados.

5 Las proteínas, llamadas proteínas ulvanolíticas, de 30 kD aislada en el ejemplo 3 y de 46 kD aislada en el presente ejemplo se purificaron en gel de electroforesis como se representa en la figura 1 adjunta: gel de electroforesis de la proteína de 30kD (Gel A) y de la proteína 46 kD (Gel B). Las flechas indican las bandas que se escindieron y a continuación se utilizaron para la secuenciación de los péptidos mediante espectrometría de masa.

10 Tabla 1: Secuencias peptídicas obtenidas a partir de las proteínas ulvanolíticas de 30 kD y 46 kD mediante secuenciación de novo

Masa molecular

30 kD: 46 kD

Secuencias: SEQ ID N.º Secuencias SEQ ID N.º

PNDPNLK: 9 PNDPNLK 9

BILEVGNTGTFGSTGSA: 13 ILEVGNTGTFGSTGSYLMQAK 30

DLANPDNV: 11 DLANPDNV GTVDDR 31

ALLGGQVFNWNIPES: 14 QEMALLMQEVDWNIPE 32

BEQLNFR: 15 ------------------ADLYR 33

LELLDLELE: 16 WDNSTLPAADLYR 34

TGVGSYAR: 17 ADLYR 35

BPVYG-NQVQVSFDLWR: 18 YHDTNNMLTHSANLDDR 36

GGGGSNDPALCLYLAR: 19 LYENGELVDEFL 37

ACPSSGVFQ: 20

LLSGWG: 21

BVYDNTLV: 22

FGVTGPPT: 23

DLLGNTLD: 24

BDTDLPNPR: 25

ATGAG: 26

BSCYANYSESSLLGK: 27

BDDPNNPGQTLHYAWK: 28

BFWGLYNLTD: 29

Las secuencias en negrita corresponden a las secuencias comunes a las ulvano liasas de 30 y 46 kD de la presente invención. Los cuatro primeros péptidos son comunes para las dos proteínas. Estos datos confrontados con el banco 15 TrEMBL no permitieron identificar una secuencia homóloga que comprenda estas cuatro secuencias en una sola proteína.

Las secuencias subrayadas se emplearon para la construcción de los cebadores degenerados utilizados en el ejemplo siguiente. 20 Ejemplo 5: identificación de un gen codificante

5.1) Cebadores degenerados

25 Se sintetizaron seis cebadores degenerados sobre la base de las secuencias peptídicas comunes a las proteínas de 30 y 46 kD obtenidas a partir de la espectrometría de masa en las dos direcciones (Forward (Directo): F y Reverse (Inverso): R; tabla 2).

Se realizó una amplificación por PCR con todas las combinaciones posibles de los cebadores en 75 ng de ADN 30 genómico de 01-PN-2010 en medios de reacción de 25 l que contenían tampón GoTaq PCR 1x, MgCl2 1 mM, 0,2 mM de cada dNTP, 2 M de los cebadores Forward y Reverse, y 1,25 U de GoTaq (Promega). El programa de amplificación era de 94 °C durante 2 minutos, treinta y cinco ciclos de: 94 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s y 72 °C durante 1 min 30 s seguido por una etapa final a 72 °C durante 7 minutos. A continuación, las muestras se mantuvieron a 4 °C antes de la secuenciación. 35 De esta manera, los inventores obtuvieron un fragmento de 700 pb del gen de ulvano liasa

5.2) “Tail PCR”

40 El método de TAIL-PCR descrito en el documento Liu YG and Whittier RF 1995 Thermal Asymmetric Interlaced PCR: Automatable Amplification and Sequencing of Insert End Fragments from P1 and YAC Clones for Chromosome walking. Genomics 25: 674-681 [13] se realizó para obtener la secuencia de los extremos del gen de ulvano liasa.

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Claims

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