ES2587255T3 - Composiciones antioxidantes para reducir el estrés oxidativo atribuible al tratamiento con fármacos anticonceptivos hormonales - Google Patents

Abstract

Composición antioxidante que comprende levadura de selenio, vitamina B6, ácido alfa-lipoico, coenzima Q10, beta-caroteno y catequinas.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Composiciones antioxidantes para reducir el estres oxidativo atribuible al tratamiento con farmacos anticonceptivos hormonales

Campo de la invencion

[0001] La presente invencion se refiere a una composicion antioxidante como se describe en las reivindicaciones 115 para reducir el estres oxidativo en sujetos sometidos a tratamiento con farmacos anticonceptivos hormonales. Esta composicion ha resultado ser particularmente adecuada porque, ademas de ser sorprendentemente eficaz, se tolera sumamente bien por el cuerpo.

Estado de la tecnica

[0002] En los anos 50 se descubrio que la progesterona inhibe la ovulacion y que el problema de controlar los embarazos presentaba aspectos muy complejos y delicados, ya que se observaban efectos secundarios con el tiempo tales como fenomenos tromboticos, el desarrollo de ciertos tipos de tumores (es decir, de mama), asi como, a la inversa, una reduccion en otros tipos de tumores (es decir, de colon, rectal, de ovario). Un factor debatido durante mucho tiempo y finalmente demostrado es la presencia de estres oxidativo (EO) cuando se usa un tratamiento anticonceptivo (TA) [1, 2]. El EO realmente puede promover la aparicion de enfermedades cardiovasculares y episodios tromboticos y tambien esta presente cuando se usan bajas dosificaciones de estrogenos-progestina, y parece estar muy relacionado con el propio tratamiento anticonceptivo.

[0003] Aunque las razones de estos acontecimientos aun no se han esclarecido completamente, se mantiene el principio de conseguir el mejor compromiso entre una baja dosificacion y la eficacia.

[0004] En efecto, los intentos de optimizar la relacion beneficio/riesgo han variado desde altas dosificaciones de progestina a combinaciones de estrogenos con progestinas de diversos tipos.

[0005] En este sentido, se conocen sistemas de liberacion transdermica, sistemas de liberacion intrauterina (DIU, dispositivo intrauterino) y sistemas con depositos subcutaneos o intramusculares. En general, los diversos tipos de anticonceptivos disponibles actualmente se recetan basandose en el estado de salud y los habitos del estilo de vida (tales como el habito de fumar).

[0006] Sin embargo, incluso en el caso de mujeres sanas, se ha detectado un aumento en los fenomenos de oxidacion durante el ciclo menstrual que, aunque no alcanzan niveles tales como para clasificarse como EO, indican un aumento en los fenomenos oxidativos en la fase de maduracion del ovulo (fase estrogenica) y en la fase posterior de su posible implantacion (fase de progesterona).

[0007] Para comprender las implicaciones subyacentes a la aparicion de EO, se examinan con detalle los aspectos hormonales del ciclo menstrual.

Aspectos hormonales relacionados con el ciclo menstrual normal

[0008] Las hormonas esteroideas relacionadas con la funcion reproductora de las mujeres estan reguladas por un mecanismo central localizado en el nucleo arcuato del hipotalamo y el lobulo anterior de la glandula pituitaria, cuyas neuronas estan conectadas con las glandulas suprarrenales, el utero y los ovarios.

[0009] En resumen [3], las neuronas del nucleo arcuato liberan GnRH (hormona de liberacion de gonadotropina) cada hora de una manera cronometrada bajo estimulos noradrenergicos; por el contrario, las neuronas opioides, dopaminergicas y gabaergicas mantienen dichas neuronas en un estado inhibitorio.

[0010] Por lo tanto, es evidente que es el equilibrio entre estos “activadores” lo que crea el estimulo vectorial central en cuanto a la frecuencia y amplitud (un pico/hora con amplitud de aproximadamente 2 mUI/ml de LH).

[0011] Las GnRH alcanzan la glandula pituitaria anterior a traves de la denominada circulacion portal (en una forma espiral) enrollada alrededor de la glandula pituitaria y la estimulan liberando descargas de FSH (hormona estimuladora del foliculo) y LH (hormona luteinizante) relacionadas, por lo tanto, con la liberacion de GnRH; estas FSH y LH regulan la produccion de estradiol (E2) y progesterona (Pg) por el ovario.

(Pg).

[0012] El E2 es la hormona de la denominada fase proliferativa; permite la maduracion del foliculo ovarico y estimula la proliferacion y diferenciacion de las celulas endometriales.

[0013] Tanto las celulas de la mucosa como las de los vasos del endometrio aumentan en numero (y en volumen); ademas, el E2 induce la produccion de receptores de Pg en las celulas, de forma que se vuelven mas reactivas a su

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

presencia cuando el cuerpo luteo empieza a producirla.

[0014] La Pg es la hormona de la fase secretora, es decir, la fase que prepara para recibir el ovulo, y procede del cuerpo luteo que se forma a partir del estroma del foliculo ovarico vacio. Su accion limita el efecto proliferativo y estimula de forma mas precisa la diferenciacion de los vasos y la produccion de secreciones mas acordes con la implantacion del ovulo (blastocisto). En esta fase, la progesterona tambien estimula a las neuronas a nivel central (opioides, dopaminergicas y gabaergicas), lo cual inhibe la liberacion de GnRH.

[0015] Tanto el E2 como la Pg, junto con la FSH, modifican la produccion de LH por la pituitaria; esta modificacion se consigue reduciendo la frecuencia de picos de LH (un pico/3 horas en lugar de 1 pico/hora) y aumentando su amplitud (de 2 mUI/ml a 3-4 mUI/ml de LH).

[0016] De esta manera, el ultimo aspecto actua reduciendo la secrecion de LH si el ovulo no se ha implantado, de forma que los niveles de E2 y Pg se reducen y, por lo tanto, finaliza el ciclo con el flujo menstrual.

[0017] Sin embargo, si en lugar de esto se implanta el ovulo, las gonadotropinas corionicas (hGC) producidas por el trofoblasto y despues por la placenta que se formara, estimulan el cuerpo luteo para que continue produciendo E2 y Pg que actuan manteniendo las condiciones del utero adecuadas para el embarazo. Una vez formada, la placenta sera autosuficiente para producir los dos tipos de estrogenos.

[0018] Estos estrogenos tambien realizan actividades auxiliares, pero importantes, con fines reproductivos; en las trompas de Falopio, el E2 estimula la proliferacion y diferenciacion mientras que la Pg las reduce; el E2 aumenta la contractilidad del miometrio mientras que la Pg la reduce; el E2 aumenta la cantidad y fluidez del moco cervical (para facilitar el paso de los espermatozoides) mientras que la Pg las reduce, lo hace mas viscoso y altera su consistencia. Uno de los problemas mas debatidos, sin embargo, es la accion del E2 y la Pg sobre el estres oxidativo. Este dualismo, por el que uno tiene una accion opuesta a la otra, no parece ser factible, ya que los dos tienen una accion estimuladora sobre el uso de la energia celular y la induccion metabolica, aunque para tareas diferentes. Por lo tanto, en terminos puramente teoricos, los dos podrian ser pro-oxidantes, pero el equilibrio oxidativo depende de cuanto el estimulo de uno o la otra permite la produccion de antioxidantes endogenos. Por lo tanto, aun necesita esclarecerse el estado de la tecnica sobre este asunto particular y a continuacion se analizaran algunos aspectos importantes.

Estado del EO durante el ciclo menstrual normal

[0019] Como se muestra en la Figura 1, tanto el ciclo folicular como el luteal se subdividen esquematicamente en una fase temprana y una fase tardia. Esto permite diferenciar la progresion del estado del EO descrito por algunos autores [4] en forma esquematica.

[0020] Basandose en el analisis de las concentraciones locales (tejido endometrial) de GSH (glutation reducido), GSSG (glutation oxidado), GSHpx (enzima glutation peroxidasa) y finalmente MDA (malonil dialdehido), pudieron evaluarse los cambios en las condiciones oxidativas. Dichas condiciones despues se correlacionaron con niveles de hormonas (estradiol, progesterona), LH y FSH.

[0021] Estos datos demuestran que el pico en EO aparece en las fases intermedias del ciclo (folicular tardia y luteal temprana), es decir, en la maduracion del ovulo y la posible implantacion del ovulo. Esta fase se manifiesta por: a) un aumento en la produccion de GSHpx; b) una reduccion en GSH; c) un aumento en GSSG; y d) la estabilidad sustancial de MDA. Esto significa que segun aumenta el EO, hay una compensacion correspondiente de tal forma que la concentracion de MDA (que representa la peroxidacion de lipidos) se mantiene constante; en otras palabras, el sistema se mantiene en equilibrio.

[0022] El pico de EO corresponde al pico de estrogenos y LH, mientras que el pico de progesterona parece corresponder a la fase de recuperacion de EO.

[0023] A este respecto, debe indicarse que GSHpx es el sistema enzimatico que utiliza GSH como sustrato, permitiendo que se reduzcan hidroperoxidos de diversos tipos (H2O2, o de naturaleza lipidica tales como ROOH, etc.) formando H2O.

[0024] Hay dos tipos de GSHpx, particularmente GSHpx1 que se encuentra en el citoplasma de todas las celulas, incluyendo los eritrocitos, y GSHpx3 que se encuentra en los fluidos extracelulares, incluyendo el plasma. Los dos tipos de enzimas, aunque se forman a partir de cuatro subunidades identicas que contienen, cada una, una seleno- cisteina (SeCys), en realidad son diferentes. A este respecto, los anticuerpos policlonales contra GSHpx1 no reaccionan con GSHpx3. La GSHpx3 encontrada en el plasma se sintetiza principalmente por las celulas del tubulo proximal del rinon. Sin embargo, otras celulas tambien son capaces de sintetizarla (higado, pulmon, corazon, mama, intestino, cerebro, musculos) y secretarla [5].

[0025] La reaccion catalizada por GSH en relacion con los hidroperoxidos es la siguiente:

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

ROOH + 2 GSH = ROH +H2O + GSSG

[0026] Por lo tanto, un aumento de GSHpx corresponde, en terminos funcionales, a un aumento en la oxidacion de GSH; por lo tanto, en los sistemas biologicos, un aumento de la misma corresponde fisiologicamente a una reduccion de GSH con un aumento consiguiente en GSSG. Todo esto significa EO; por lo tanto, es erroneo considerar a las GSHpx (de cualquier tipo, 1 o 3) un indice de la capacidad antioxidante, en su lugar deben considerarse una expresion de una mayor necesidad de usar GSH para contrarrestar el EO.

[0027] Sin embargo, si un estado clinico se caracteriza por niveles reducidos de GSHpx, esto significa que sera mas dificil usar GSH para contrarrestar el EO.

[0028] Esto ocurre en la menopausia, por ejemplo, tanto en el endometrio como en el plasma, aunque tambien parece estar relacionado con una edad avanzada (una situacion tipica de la menopausia) y, por lo tanto, con una menor eficacia del sistema antioxidante.

[0029] Cuando se analizan los sistemas GSHpx, SOD (superoxido dismutasa) y CAT (catalasa) en el plasma durante el ciclo menstrual [6], se observa que los niveles de GSHpx de los eritrocitos aumentan en la fase folicular tardia y en luteal temprana con respecto a las otras fases, mientras que los niveles de SOD y CAT se mantienen esencialmente constantes (vease la Tabla 1 mostrada mas adelante). El analisis de las correlaciones con los niveles de E2 indica que los niveles de GSHpx estan correlacionados en el tiempo (simplificando mucho, un aumento de uno es simultaneo con un aumento de la otra).

[0030] Los niveles de FSH, LH, progesterona, testosterona y androstenodiona no muestran patrones que esten correlacionados en el tiempo con los de la GSHpx de los eritrocitos.

[0031] Segun lo afirmado y demostrado, la accion aislable de E2 no es antioxidativa, sino que, mas bien, es precisamente lo contrario [7] y corresponde a la activacion celular necesaria para el mayor requisito de energia en la fase secretora.

[0032] Si el ovulo no se ha fertilizado, la fase luteal tambien se caracteriza por una mayor actividad celular y proliferacion tisular, que precede al final del ciclo y el flujo menstrual, volviendo la mucosa uterina de nuevo a las condiciones del principio del ciclo.

[0033] Esta fase se expresa de forma diferente en terminos de actividad final (cambios en la viscosidad del moco, aumento del componente vascular, etc.), pero en terminos de oxidacion sigue siendo practicamente igual, siendo una fase proliferativa.

[0034] Esta fase esta dominada por la produccion de Pg que se combina con la de E2 y, por lo tanto, es la fase con la mayor expresion de esteroides estrogenicos-progestogenicos, despues de la fase de maduracion del ovulo.

Tabla I. Cambios en los niveles de enzimas relacionadas con la oxidacion en los eritrocitos

Variables

Fases del ciclo

Folicular inicial Folicular tardia Luteal inicial Luteal tardia

GSH (Ul/g Hb)

15,2 ± 0,38 16,7 ± 0,23 16,3 ±0,22 14,1 ± 0,31

SOD (UI/100 pg Hb)

1,3 ± 0,04 1,3 ± 0,02 1,2 ±0,03 1,3 ± 0,02

CAT (Ul/g Hb)

18,6 ± 3,24 20,6 ± 2,28 19,6 ±2,56 18,2 ± 3,12

[0035] Otra caracteristica de esta parte del ciclo es la produccion considerable del radical NOV NO^ es un mediador importante de la vasodilatacion, de la relajacion del miometrio, la accion antiagregacion y el estimulo angiogenico que se lleva a cabo por VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular) que estimula la NO sintasa [8], lo que significa que el NO^ parece mantenerse a traves de la autoinduccion de la NO sintasa.

[0036] Aunque esta ultima aparece en todas las fases menstruales, ya sea como eNOS (endotelial) o como iNOS (inducible), aumenta sustancialmente tras la estimulacion progestogenica [9]. Conjuntamente con este aumento, tambien se produce un aumento local de SOD. La SOD, que dismuta el O2^ (superoxido), impide que la reaccion NO^ + O2^ forme el ion ONOO- (peroxinitrito) que, ademas de tener un alto poder oxidante, elimina NO^ y restringe su disponibilidad. Pero todo dicho N disponible reacciona con O2^ (la reaccion entre los dos es, con mucha diferencia, la mas rapida del cuerpo (1 x 10-9 segundos) y al final produce EO.

[0037] La permeabilidad vascular del endometrio y su suministro regular de sangre tambien se mantienen por una hormona peptidica especifica, particularmente la relaxina (RLX).

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0038] RLX es un peptido con un PM de 6 kDa, que consiste en dos cadenas peptidicas, estabilizadas tanto internamente como entre si por puentes S-S [10]. Realmente, es una familia de hormonas (H1, H2, H3) de las que la forma circulante H2 es la que esta mas representada. La RLX se secreta principalmente por el cuerpo luteo e impide estrategicamente cambios en el flujo endometrial para evitar fenomenos de isquemia y reperfusion durante la fase proliferativa del ciclo y despues durante un posible embarazo, que podria activar procesos reactivos con la produccion de ROS y quimiotaxis.

[0039] La accion de la RLX se produce mediante la regulacion positiva de iNOS y eNOS y angiogenesis, de forma particular, pero no solamente, en el endometrio; esta accion se produce tanto en los vasos arteriales como en los vasos venosos (por lo tanto, tambien en vasos sin musculo liso).

[0040] Las concentraciones a las que la RLX es activa estan a niveles nanomolares y, por lo tanto, alcanzables durante la fase endometrial propiamente dicha de la implantacion del ovulo y el embarazo. Tambien es tipica de la RLX su accion angiogenica, realizada por la liberacion de VEGF y tambien bFGF (factor de crecimiento de fibroblastos basico).

[0041] Un aspecto importante de la accion de la RLX es la inhibicion de la adhesion de globulos blancos inflamatorios al endotelio y la agregacion plaquetaria. Esta actividad, junto con la regulacion positiva de la produccion de NO^, impide la generacion de ROS y la atraccion quimiotactica tipicas de una situacion de isquemia/reperfusion.

[0042] En general, por lo tanto, la RLX influye considerablemente en la perfusion y el suministro de sangre en el endometrio, manteniendo condiciones de flujo ideales en el mismo y realizando acciones antiinflamatorias y antitromboticas tipicas.

Accion de los estrogenos sobre la oxidacion de lipoproteinas

[0043] Un factor final a considerar es el efecto de los estrogenos sobre la oxidacion de lipoproteinas.

[0044] La mayoria de experimentos realizados in vitro o ex vivo han demostrado la capacidad antioxidante del E2 y que su efecto sobre la peroxidacion de lipidos es similar al del a-tocoferol o p-caroteno, pero de una manera mas clara que sus metabolitos estradiol y estrona.

[0045] Realmente, la mayoria de los experimentos realizados [11-12] se llevaron a cabo usando concentraciones mucho mayores que las fisiologicas, al menos del orden de 1-10 nmol/ml, que corresponden a 273 y 2730 ng/ml respectivamente. Estas concentraciones apenas se alcanzan cuando los estrogenos alcanzan un pico en la mitad del ciclo y solo durante periodos de tiempo limitados; por esta razon, unicamente pueden afirmar con dificultad una accion antioxidante protectora para LDL [13].

[0046] Sin embargo, en un experimento realizado en mujeres menopausicas, la administracion de E2 por via intraarterial o en forma de un parche transdermico (durante 3 semanas) ha demostrado claramente un retraso en la oxidacion de LDL (mayor tiempo de retraso o tiempo de oxidacion por Cu2+) del 11% y del 16% respectivamente, con una vuelta a las condiciones iniciales tras la interrupcion del tratamiento [12]. No obstante, sigue habiendo grandes dudas de que los niveles de E2 obtenidos por medio de las dos vias de administracion fueran realmente fisiologicos, ya que se determinaron unicamente en un punto; solo se tiene que considerar el pico sanguineo obtenido con la administracion intraarterial antes de que se estabilice su distribucion. Aparte de esto, no se detectaron diferencias en la actividad protectora de LDL entre los dos tipos de administracion a pesar de las diferencias considerables en los niveles (de 4 a 7 veces mayores con el parche).

[0047] A partir de los diversos estudios realizados se deduce que para observar un efecto antioxidante (independientemente del problema de los niveles), el E2 debe estar en contacto con el plasma, ya que si simplemente se anade a LDL no se observa actividad [11]. Este fenomeno se ha interpretado como que el E2 necesita activarse por un componente sanguineo, determinado como LCAT (lecitin-colesterol aciltransferasa), que esterifica el E2 con un acido graso; solo en estas condiciones puede ejercer un efecto protector hacia las lipoproteinas. La esterificacion parece tener lugar en el carbono C17, dejando libre el grupo hidroxilo en C3; este ester parece insertarse en la membrana de lipoproteinas con la parte hidrofila girada hacia la superficie exterior y la parte lipofila dentro de la membrana [14]. En teoria, una configuracion similar podria proteger a la membrana de la oxidacion, por consiguiente, por la oxidacion del ester de E2, pero sigue sin saberse si esto puede ser suficiente para proteger una LDL.

[0048] Por lo tanto, el problema se evaluo desde el punto de vista estequiometrico.

[0049] Los niveles de los esteres de E2 en las mujeres premenopausicas apenas son medibles y los niveles mas altos se encuentran en el fluido folicular a concentraciones de aproximadamente 0,1 pmol/l [15]. Todo esto significa que la relacion entre las lipoproteinas (LDL, HDL, VLDL) es muy alta ya que solo las LDL estan presentes en la sangre en una medida de al menos 0,6 pmol/l (correspondiente a 1,6 g/l para un pm de 2,6 x 106). Por lo tanto, la presencia de esteres de E2 en las lipoproteinas es muy pequena (una molecula de ester de E2 por miles de

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

lipoprotefnas) y, por lo tanto, no compatible con una accion antioxidante directa; el posible mecanismo de proteccion de LDL puede ser unicamente de tipo enzimatico (activacion de las enzimas antioxidantes presentes en las lipoprotefnas, tales como paraoxonasa, apoA, apoJ, GSHpx), pero esto no se sabe actualmente.

[0050] Con respecto a los tipos de esteres de E2, los aislados a partir del fluido folicular predominantemente estan insaturados, es decir, un 96% (linoleatos, araquidonatos, palmitatos) y solo un 4% estan saturados (estearatos) [15].

[0051] Se ha propuesto la hipotesis de que los esteres de E2 son un medio de mantener el E2 disponible como reserva, ya que su presencia es relativamente constante en los lipidos epiploicos y subcutaneos (aproximadamente 1 pmol/g de tejido) en mujeres premenopausicas, mientras que tienden a reducirse sustancialmente durante la menopausia [16].

[0052] Una de las consideraciones a hacer con respecto a su presencia en las lipoprotefnas es que, de esta manera, a diferencia de lo que ocurre con los estrogenos libres, no pueden eliminarse a traves de los rinones y se liberan al interior de las celulas a traves de la ruta del receptor de LDL. Debido a su liposolubilidad, los estrogenos libres pueden atravesar facilmente la membrana celular de una manera menos controlable.

[0053] Por lo tanto, en general, el significado estrategico de los esteres de E2 es, sin duda, no actuar como antioxidantes directos, sino, si acaso, ser antioxidantes indirectos y modular la liberacion de E2 para crear una reserva que se activara cuando sea necesario. El mecanismo para formar los esteres de hormonas esteroideas y su escasa presencia en la circulacion en una forma pero protegida (lipoprotefnas), sin unirse a albumina/globulina ni a SBP (proteinas de union a esteroides) o CBG (globulinas de union a corticosteroides), es una prueba de la necesidad de usarlos como reservas de esteroides listas para utilizarse cuando sea necesario.

[0054] El E2 se puede oxidar facilmente, mientras que los esteres de E2 en menos medida.

[0055] La presencia de MPO (mieloperoxidasa) y H2O2 (este ultimo tambien se secreta por las celulas endoteliales) induce la oxidacion de E2 que se comporta como un propagador de la oxidacion ademas de inducir la produccion de MPO por los neutrofilos [13].

[0056] Sin embargo, el aspecto oxidativo del E2 es muy particular.

[0057] Su comportamiento parece similar al que se produce durante la actividad fisica [17]; es decir, las LDL se oxidan y se captan mas facilmente de la circulacion por receptores hepaticos y se mantienen bajo control y parcialmente “dominadas” por el sistema antioxidante del musculo. Sin embargo, si el sistema antioxidante es insuficiente y sus niveles aumentan, experimentan captacion vascular (subendotelial) que desencadena el proceso de arteriosclerosis inflamatoria. De hecho, se someterian a la actividad de la MPO en el subendotelio.

[0058] Esto explica los niveles reducidos de colesterol y LDL en las mujeres premenopausicas, interpretados como una mayor eficacia de los receptores hepaticos de LDL y no como una mayor captacion de LDL, debido a que estan en condiciones parcialmente oxidadas (debe indicarse que existe un limite de oxidacion minimo disponible por encima del cual se desencadena la reaccion de los macrofagos).

[0059] Este equilibrio oxidativo casi nivelado puede describirse como compensable en condiciones fisiologicas de secrecion normal de estrogenos-progesterona (por lo tanto, durante un ciclo menstrual normal) pero puede cambiar hacia una pro-oxidacion cuando se usa una terapia anticonceptiva (TA).

[0060] El fenomeno es comprensible, ya que cualquier administracion oral de estrogenos-progestina produce un pico sanguineo de ambos (dependiendo del tipo de TA), que no es de dimensiones fisiologicas y, por lo tanto, la oxidacion “ligera y controlable” se transforma en EO.

[0061] Ahora se ha demostrado el hecho de que este EO se genere por un aumento en la cantidad de LDL oxidadas, o un aumento en los niveles sanguineos de Cu, o la regulacion positiva de iNOS [1] o por una combinacion de los mismos [1, 2]. El problema que surge es el del control del EO, pero para conseguir esto, primero es necesario comprender lo que esta ocurriendo en relacion con el EO en condiciones normales para tomar acciones para reducir el estres cuando se toma una terapia anticonceptiva.

[0062] Por lo tanto, se sintio la necesidad de encontrar un remedio eficaz, bien tolerado por el cuerpo y capaz de reducir el estres oxidativo atribuible al tratamiento con farmacos anticonceptivos hormonales. Por lo tanto, un objetivo de la presente invencion es proporcionar dicho remedio.

Sumario de la invencion

[0063] Este objetivo se consiguio por medio de la composicion antioxidante de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende levadura de selenio, vitamina B6, acido alfa-lipoico, coenzima Q10, beta-caroteno y catequina.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

[0064] En otro aspecto, la presente invencion se refiere al uso de dicha composicion para reducir el estres oxidativo atribuible al tratamiento con farmacos anticonceptivos hormonales.

[0065] En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un kit para la administracion de los antioxidantes de dicha composicion.

[0066] Como sera evidente tras la siguiente descripcion detallada, la composicion de la invencion sorprendentemente ha permitido reducir el estres oxidativo en individuos sometidos al tratamiento con farmacos anticonceptivos hormonales mediante una combinacion adecuada de componentes antioxidantes que muestran alta tolerancia por el cuerpo.

Breve descripcion de los dibujos

[0067] Las caracteristicas y ventajas de la presente invencion seran evidentes tras la siguiente descripcion detallada, los ejemplos de trabajo proporcionados con fines ilustrativos y no limitantes y la Figura 1 adjunta, en la que se presentan esquematicamente los acontecimientos significativos del ciclo menstrual.

Descripcion detallada de la invencion

[0068] Por lo tanto, la presente invencion se refiere a una composicion antioxidante que comprende levadura de selenio, vitamina B6, acido alfa-lipoico, coenzima Q10, beta-caroteno y catequinas. De hecho, se ha observado que la combinacion de estos componentes, sorprendente y ventajosamente permite reducir el estres oxidativo asociado con el consumo de farmacos anticonceptivos hormonales. Esta formulacion ventajosamente contiene todos los tipos de antioxidantes, es decir, sistemicos (selenio), citoplasmicos (vitamina B6), mitocondriales (acido alfa-lipoico, coenzima Q10), de membrana (beta-caroteno) y circulantes (catequinas).

[0069] Las catequinas son metabolitos antioxidativos derivados de plantas que pertenecen al grupo de los flavonoides. Se encuentran en varias especies vegetales, pero la fuente mas importante en la dieta humana son los diversos tes que proceden de la planta del te, Camellia sinensis. La hoja de te seca realmente contiene aproximadamente un 25% en peso de catequinas, aunque el contenido total puede variar significativamente de acuerdo con el tipo de planta, el sitio de crecimiento, las variaciones de luz, la estacion y la altitud. En particular, las catequinas estan presentes en todos los tipos de te, incluyendo el te blanco, te verde, te negro y te oolong (te azul), pero tambien estan presentes en el chocolate, frutas, verduras, vino y muchas otras especies vegetales. De acuerdo con una realizacion preferida de la invencion, dichas catequinas proceden del extracto de te verde.

[0070] Preferentemente, dicha composicion antioxidante comprende un 8-16% en peso de levadura de selenio, un 0,5-5% en peso de vitamina B6, un 1-10% en peso de acido alfa-lipoico, un 1-10% en peso de coenzima Q10, un 0,05-0,5% en peso de beta-caroteno y un 40-60% en peso de extracto de catequina, con respecto al peso de la composicion. Esta combinacion preferida ejerce una accion antioxidante completa y sinergica. En particular, en las proporciones indicadas, la accion antioxidante prevalente se considera atribuible a los antioxidantes circulantes.

[0071] Mas preferentemente, dicha composicion antioxidante comprende un 10-14% en peso de levadura de selenio, un 1-3% en peso de vitamina B6, un 3,5-6% en peso de acido alfa-lipoico, un 3,5-6% en peso de coenzima Q10, un 0,1-0,3% en peso de beta-caroteno y un 42-51% en peso de catequinas, con respecto al peso de la composicion. En este caso, la combinacion antioxidante en estos intervalos permite una expresion mas amplia de las categorias antioxidantes “no circulantes” y, por lo tanto, una accion convenientemente mas prolongada a lo largo del tiempo.

[0072] Incluso mas preferentemente, dicha composicion antioxidante comprende un 12-13% en peso de levadura de selenio, un 1,1-2% en peso de vitamina B, un 4-5,5% en peso de acido alfa-lipoico, un 4-5,5% en peso de coenzima Q10, un 0,2-0,3% en peso de beta-caroteno y un 45-48% en peso de catequinas, con respecto al peso de la composicion. En este caso, ademas de una mayor duracion de tiempo, tambien hay una accion mas potente proporcionada por una relacion ideal entre antioxidantes sistemicos, antioxidantes celulares, antioxidantes mitocondriales, antioxidantes de membrana y antioxidantes circulantes tales como catequinas.

[0073] En particular, dichas catequinas son galato de epigalocatequina (EGCG), epigalocatequina (EGC), galato de epicatequina (ECG) y epicatequina (EC). De acuerdo con una realizacion preferida adicional, al menos un 35% en peso con respecto al peso de las catequinas es EGCG. Las catequinas, ademas de presentar una buena actividad antioxidante, tambien han demostrado una buena biodisponibilidad que permite, particularmente en el caso de EGCG, alcanzar niveles tisulares de aproximadamente un 8-10% de los niveles sanguineos en los organos principales (corazon, cerebro, higado, utero, etc.).

[0074] De acuerdo con otra realizacion preferida, dicha vitamina B6 es piridoxina o una sal de la misma. Mas preferentemente, es clorhidrato de piridoxina.

[0075] En otro aspecto, la invencion se refiere a una composicion antioxidante para uso como un medicamento. En particular, dicha composicion antioxidante se usa para reducir el estres oxidativo atribuible al tratamiento con

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

farmacos anticonceptivos hormonales. Como se vera efectivamente por los ejemplos de trabajo que se presentan a continuacion, la composicion de la invencion ha demostrado un efecto sinergico sorprendente derivado de la combinacion oportuna de los diversos componentes que, por el contrario, no han demostrado ninguna eficacia por separado.

[0076] Preferentemente, dicha composicion antioxidante se administra por via oral.

[0077] Preferentemente, la composicion antioxidante de la invencion esta en forma de una forma de dosificacion unitaria que comprende 15,8-31,5 mg de levadura de selenio, 1-9,5 mg de vitamina B6, 2-19 mg de acido alfa- lipoico, 2-19 mg de coenzima Q10, 0,1-0,95 mg de beta-caroteno y 80-110 mg de catequinas.

[0078] Mas preferentemente, dicha dosis unitaria comprende 20-27,5 mg de levadura de selenio, 2-5,5 mg de vitamina B6, 7-11,8 mg de acido alfa-lipoico, 7-11,8 mg de coenzima Q10, 0,2-0,59 mg de beta-caroteno y 85-95 mg de catequinas.

[0079] De acuerdo con una realizacion preferida, la dosis unitaria comprende 24 mg de levadura de selenio, 2,44 mg de vitamina B6, 10 mg de acido alfa-lipoico, 10 mg de coenzima Q10, 0,5 mg de beta-caroteno y 90 mg de catequinas, donde aproximadamente un 40% es EGCG.

[0080] En un aspecto adicional, la presente invencion se refiere a un kit que comprende:

i) al menos una composicion antioxidante que comprende levadura de selenio, vitamina B6, acido alfa-lipoico, coenzima Q10 y beta-caroteno; y

ii) al menos una solucion acuosa que comprende catequinas,

para la administracion simultanea de los antioxidantes de la composicion como se ha descrito anteriormente.

[0081] Preferentemente, en dicho kit, dicha composicion antioxidante esta en forma de polvo para mejorar su conservacion a lo largo del tiempo.

[0082] Debe entenderse que todos los aspectos identificados como preferidos y ventajosos para la composicion antioxidante como se ha descrito anteriormente tambien deben considerarse, por consiguiente, preferidos y ventajosos para el kit de la presente invencion.

[0083] De acuerdo con una realizacion preferida, el polvo se mezcla con dicha solucion en el momento de la administracion. Ademas, dicha solucion preferentemente es te verde descafeinado.

[0084] En el presente documento, los ejemplos de trabajo de la presente invencion proporcionados a continuacion se proporcionan con fines ilustrativos y no limitantes.

EJEMPLOS

Ejemplo 1.

Determination del poder antioxidante de las composiciones de la invention por el ensayo de BAP (potential antioxidante biologico).

[0085] Se seleccionaron 10 mujeres eumenorreicas voluntarias. Las caracteristicas generales de las voluntarias se proporcionan a continuacion:

Caracteristicas

Valores medios ± DT*

Edad (anos)

28,2 ± 3,91

Peso (kg)

61,4 ± 3,78

Altura (m)

1,66 ± 0,04

Indice de masa corporal (IMC kg/m2)

22,5 ± 2,01

* DT = desviacion tipica

[0086] Las siguientes composiciones se han preparado como se indica en la Tabla 1.

5

10

15

20

25

30

35

40

Tabla 1. Composiciones de la invencion

Cantidad Composiciones

1A 1B 1C 1 D 1 E 1 F 1G

Catequinas

mg 99,5 93,5 90 84 106 88 102

Levadura de Se

mg 18 21 24 28 16 26 19

Vitamina B6

mg 5 4 2,4 7 1,5 8 3

Acido alfa-lipoico

mg 4 8 10 3 11 15 13

Coenzima Q10

mg 4 8 10 3 11 15 13

Beta-caroteno

mg 0,2 0,3 0,5 0,8 0,15 0,6 0,7

[0087] Se pidio a las voluntarias sanas que consumieran tres composiciones diferentes entre las preparadas anteriormente, es decir, 1A, 1B, 1C, de diferentes dosificaciones, con la intencion de determinar la combinacion mas eficaz en relacion con la actividad y duracion a lo largo del tiempo.

[0088] Las tres composiciones se analizaron y ensayaron con respecto a la actividad por el ensayo de BAP.

[0089] Las catequinas se suministraron en forma de un extracto de te verde, en el que dichas catequinas constituian aproximadamente un 60% en peso.

[0090] En las tres composiciones, desde la 1A a la 1C, se fue reduciendo progresivamente la cantidad de catequinas y piridoxina (en forma de clorhidrato) y al mismo tiempo se fueron aumentando las cantidades de acido alfa-lipoico, beta-caroteno, selenio y coenzima 10.

[0091] En otras palabras, en las diversas composiciones de A a C, se reducia la cantidad de antioxidantes solubles y se aumentaba la de antioxidantes liposolubles.

[0092] Las tres composiciones se administraron a las voluntarias durante tres dias sucesivos al final de su ciclo, empezando el tercer dia despues de inicio del flujo menstrual.

[0093] Durante este periodo no se permitio ninguna otra terapia. El experimento se realizo por la manana, habiendo permanecido las mujeres en ayunas desde la tarde previa, y solo se permitio el consumo de agua durante el periodo de las 7:00 a las 13:00.

[0094] La administracion de las composiciones siempre se realizo en el orden A, B, C.

[0095] El ensayo de BAP (distribuido por Diacron Srl, Grosseto, Italia) se realizo usando sangre extraida por un pinchazo en el dedo, recogida en microtubos heparinizados (0,15-0,2 ml de sangre); se realizaron cuatro extracciones: la basal, y 1 hora, 3 horas y 5 horas (respectivamente T1, T2 y T3) despues de la administracion de cada composicion.

[0096] Las diferencias entre los valores se calcularon basandose en el ensayo t y el analisis de varianza para contrastes ortogonales (ANOVA). Los resultados se proporcionan en la Tabla 2.

Tabla 2. Valores de BAP a los diversos tiempos de observacion despues del tratamiento con tres composiciones __________________diferentes de la invencion. Valores medios ± DT (desviacion tipica). ^_________________

Tiempos

Composiciones ANOVA

1A 1B 1C

Basal

1965 ± 250,4 1994 ± 178,2 1977 ± 172,8 A=B=C p > 0,05

T1 (despues de 1 h)

2415 ± 360,1a 2474 ± 312,7a 2605 ± 234,8a C>A=B p < 0,05

T2 (despues de 3 h)

2238 ± 266,5a 2453 ± 279,6a 2448 ± 207,3a B=C>A p < 0,05

T3 (despues de 5 h)

1915 ± 224,6 2223 ± 256,6a 2270 ± 190,7a B=C>A p < 0,05

a= ensayo t para datos interdependientes; TnVs Basal p< 0,05

[0097] Por los datos, puede verse que las tres composiciones aumentaban ventajosamente el poder antioxidante del plasma de forma significativa; las composiciones 1B y 1C adicionalmente proporcionaban una accion mas prolongada que la composicion 1A; despues de 1 hora, la composicion 1C mostro inesperadamente una accion

5

10

15

20

25

30

35

40

significativamente mejor que las otras.

[0098] A partir de las observaciones, por lo tanto, se demostro que las tres composiciones tenian un poder antioxidante considerable y, por lo tanto, eran biodisponibles, teniendo la composicion 1C una eficacia notable y mostrando una accion mas considerable y prolongada a lo largo del tiempo.

Ejemplo 2.

Determination del estres oxidativo (EO) durante el ciclo menstrual normal.

[0099] Para este ensayo se seleccionaron 20 mujeres eumenorreicas voluntarias. Eran voluntarias aparentemente sanas, no se estaban sometiendo a ninguna terapia y la mayoria de ellas eran nuliparas (14 de 20). El uso de cualquier terapia con suplementos de la alimentacion se considero un criterio de exclusion.

[0100] El EO durante el ciclo menstrual (Ciclo A) se analizo usando el ensayo d-ROMs [18], que permitia la evaluacion de hidroperoxidos en la sangre (plasma o suero), detectables despues de un pinchazo en un dedo, en sangre (0,15-0,2 ml) recogida en microcubetas heparinizadas. El ensayo se realizo empezando el primer dia posterior al final del flujo menstrual, posteriormente el tercer dia y despues cada tres dias (indicado como t1, t3, tn..., t27), hasta el cese completo del flujo menstrual. De esta manera, se determino la progresion del EO a lo largo del tiempo.

[0101] En las primeras 10 voluntarias, el protocolo tambien requirio que se evaluara el nivel de E2 a los tiempos t6, tg, t12, t15, t18, t21, asi como los niveles de Pg a t12, t18, t21 para determinar la correlacion del EO con las fases secretora y luteal del ciclo menstrual.

[0102] El E2 y la Pg se determinaron usando kits conocidos (Estradiol: N.° de catalogo KE2D1; Progesterona: TKPG1; Inter Medico Markham, Ontario-Canada). Los limites de deteccion fueron, respectivamente, 5 pg/ml para E2 y 0,1 ng/ml para Pg, con un coeficiente de variacion del 13,1% para E2 y del 6,5% para Pg. La sangre se recogio de la vena braquial en tubos de ensayo heparinizados (2 alicuotas de 5 ml).

[0103] Las caracteristicas generales de las voluntarias se proporcionan a continuacion:

Caracteristicas

Valores medios ± DT

Edad (anos)

30,8 ± 5,66

Peso (kg)

63,2 ± 6,66

Altura (m)

1,67 ± 0,07

Indice de masa corporal (IMC kg/m2)

22,6 ± 1,58

[0104] Todas las extracciones de sangre se realizaron por la manana entre las 8:00 y las 9:30, despues de un ayuno desde la tarde anterior al ensayo, determinandose los analisis el mismo dia. Se aconsejo a las voluntarias que evitaran comer en exceso el dia previo a los ensayos de laboratorio. Los valores para los resultados del ensayo d- ROMs y los niveles de E2 y Pg se recogen conjuntamente en la Tabla 3.

Tabla 3. Valores para el ensayo d-ROMs, E2, Pg a diversos tiempos en voluntarias sanas (media ± DT).

Ciclo A control

Tiempo dias t1 t3 ts tg t12 t15 t18 t21 t24 t27

(sin terapia)

Ensayo d-ROMs U. CARR. 284 ± 38,0 273 ± 47,0 284s ± 34,6 299a ± 31,3 336a + 66,8 378s ± 115,6 326a ± 66,4 315a ± 56,3 323a ± 51,1 276 ± 44,8

Estradiol gg 222b 195b 134b 157b 126

pg/ml ± ± ± ± ± ±

5

10

15

20

25

30

35

40

45

33,7 34,2 39,9 36,2 36,9 38,4

Progesterona ng/ml

1,7 ± 0,54 6,3c ± 3,0 13,0c ± 6,2

a ensayo t para datos interdependientes, p< 0,05 tn Vs ti; b ensayo t para datos interdependientes, p< 0,05 tn Vs t6 c ensayo t para datos interdependientes, p< 0,05 t12 Vs tn

[0105] A partir del examen de los datos se dedujo que el EO se produjo entre t6 y t24, y a t27 los niveles se redujeron dentro de los valores basales al inicio del ciclo. El aumento maximo asociado correspondia a un retraso de 3 a 6 dias con respecto al pico de estrogenos.

[0106] La elevacion en los niveles de Pg parecia tener el efecto de reducir el EO tras alcanzar su pico en la sangre (t2i), pero no antes.

[0107] Debe tenerse en cuenta que, en terminos del ensayo d-ROMs, el EO normalmente se define por valores > 300 CARR. U. Como se puede deducir a partir de los valores medios, el aumento en CARR. U con respecto a los valores al principio del ciclo alcanzo un estado de EO de ti2 a t24.

[0108] No se observaron correlaciones entre los niveles de E2 y los niveles del ensayo d-ROMs; esto indico que la situacion de una mayor oxidacion sistemica no se producia por el E2 solo, sino tambien por otros factores que, en las condiciones experimentales indicadas, no podian identificarse (refiriendose a los niveles de LH, FSH, relaxina, etc.).

[0109] En cualquier caso, se confirmo esta clara observacion ya que en la propia fase estrogenica, se observo que los valores de oxidacion sistemica aumentaban y despues se reducian con el aumento de progesterona.

Ejemplo 3.

Evaluation de la actividad de un anticonceptivo (TA) sobre los niveles de EO y los cambios en el EO despues del cotratamiento con dos tipos diferentes de producto antioxidante.

[0110] Para este ensayo se seleccionaron 10 mujeres eumenorreicas voluntarias, aparentemente sanas (una parte de las seleccionadas para el Ejemplo 2) y que no se estaban sometiendo a ninguna terapia.

[0111] Las caracteristicas generales de las voluntarias eran las mismas que en el Ejemplo 2.

[0112] Durante el periodo de ensayo entero, las voluntarias asistieron al centro cada tres dias por la manana entre las 8:00 y las 9:30 en ayunas desde la tarde anterior.

[0113] La sangre para la evaluacion del ensayo ROMs se extrajo de un dedo y se recogio en una cantidad de 0,10,2 ml en microcubetas que contenian heparina (10 gl de plasma bastaban para el analisis del ensayo d-ROMs).

[0114] Los analisis siempre se realizaron el mismo dia que la extraccion. Inmediatamente despues de extraer la sangre, se distribuyo un desayuno convencional.

[0115] Por lo demas, no se impuso ninguna otra restriccion aparte de evitar comer en exceso la tarde previa a la extraccion.

[0116] Se superviso a las voluntarias durante todo el ciclo menstrual y se realizaron comprobaciones de sangre empezando al principio del ciclo menstrual (L), posteriormente el dia 3 (t3) y despues cada tres dias hasta t27 durante la fase de flujo menstrual. El periodo de tiempo se identifico como Ciclo B.

[0117] Los resultados se recogen conjuntamente en la Tabla 4.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

Tabla 4. Valores de ensayos d-ROMs a diversos tiempos en voluntarias sanas (media ± DT)

Ciclo B Control

Tiempo en dias t1 t3 t6 t9 t12 t15 t18 t21 t24 t27

(sin terapia anticonceptiva)

Ensayo d- ROMs U. CARR. 248 ± 28,6 240 ± 26,5 255a ± 26,8 284a ± 22,8 276a ± 21,3 271a ± 25,9 267a ± 26,1 256 ± 23,8 249 ± 32,2 246 ± 30,2

* = ensayo t para datos interdependientes; tn Vs t1, p< 0,05 donde n = 6, 9, 12, 15, 18

[0118] Incluso en esta serie de datos, puedo verse que los niveles de hidroperoxido (en terminos de CARR. U.) como indices del estado oxidativo, aumentaban desde la comprobacion de sangre despues de 6 dias (t6) y se mantenian tal cual hasta el dia t18.

[0119] Los datos eran ligeramente diferentes de los obtenidos en el ejemplo 2 (los niveles pico para el ensayo d- ROMs eran inferiores), pero confirmaron que el EO se produce durante el pico de estrogenos en la fase de maduracion del ovulo, rediciendose unicamente durante la fase de progesterona (estrogenos y progesteronas combinados) hasta que se producia el siguiente flujo menstrual.

[0120] Tambien se deduce de estos datos que, durante la fase de estrogenos, se desencadeno un estado de EO controlado, es decir, hubo un aumento en la produccion de hidroperoxido, siendo esto un indice de una mayor oxidacion, que algunas veces excedia el nivel normal de EO. De hecho, con el ensayo d-ROMs, el estado de EO se determino como valores > 300 CARR.U. que, en las presentes condiciones experimentales, solo se encontraron esporadicamente.

[0121] Analizando los casos individuales, pudo verse que el mayor aumento en los valores del ensayo d-ROM se obtenia entre t9 y t15, es decir, tras el aumento de E2 (por lo tanto, de forma general ligeramente antes de los picos fisiologicos de FSH y LH; vease la Figura 1).

[0122] El hecho de que los niveles se mantuvieran altos hasta t21 significa que el aumento de progesterona asociado no podia cambiar sustancialmente el estado oxidativo, tendiendo este a desaparecer unicamente despues de que se redujeran los niveles de las dos hormonas.

[0123] Las mismas voluntarias despues siguieron dos ciclos de 28 dias de tratamiento anticonceptivo (TA) hormonal con etinilestradiol 50 gg combinado con levonorgestrel 125 gg (Microgynon®: 21 dias de tratamiento y 7 sin tratamiento).

[0124] Durante el segundo ciclo (Ciclo C), se sometieron de nuevo a un ensayo en serie para los hidroperoxidos, a los mismos tiempos en que los ciclos A y B previos, usando los mismos metodos de extraccion y un protocolo identico de salud e higiene.

[0125] Los resultados del ensayo d-ROMs se proporcionan en la Tabla 5.

Tabla 5. Valores del ensayo d-ROMs despues del tratamiento TA con Microgynon® durante 28 dias en voluntarias ___________________________________sanas (media ± DT)___________________________________

Ciclo C

Tiempo dias t1 t3 ts t9 t12 t15 t18 t21 t24 t27

(Terapia TA)

Ensayo d- ROMs U. CARR. 241 ± 22,3 392* ± 26,3 398* ± 26,6 400* ± 24,4 409* ± 41,9 440* ± 35,3 434* ± 36,8 423* ± 33,9 290* ± 53,7 252 ± 28,3

* = ensayo t para datos interdependientes p< 0,05 tn de Ciclo A Vs tn de Ciclo B

[0126] Examinando los datos fue evidente un aumento sustancial en los valores medios de d-ROMs, estando por encima de los valores normales (indicados anteriormente como <300 U. CARR.) lo cual demuestra la presencia de EO que empieza incluso despues del tercer dia de terapia TA.

[0127] Todos los casos analizados entre t3 y t21 (tiempo de consumo de pildoras de TA) estuvieron claramente por encima de los niveles normales. Teniendo en cuenta el hecho de que la TA se sustituye por una pildora inactiva el dia t21, fue logico que despues de tres dias de suspension (t24) fuera detectable una recuperacion del estado de EO, y concluyo a t27. A t27, ninguna de las voluntarias realmente estaba en un estado de EO.

[0128] Si estos datos se comparan con los del Ciclo B (sin terapia TA), esta claro que los valores de t3 a t24 eran significativamente mayores. Esto demostro claramente que el tratamiento con este farmaco anticonceptivo hormonal

5

10

15

20

25

30

35

era una fuente de EO.

[0129] En el cuarto ciclo de tratamiento consecutivo (Ciclo D), de nuevo basado en etinilestradiol 50 |jg combinado con levonorgestrel 125 jg (Microgynon®: 21 dias de tratamiento y 7 dias inactivos), despues se anadio una administracion diaria de una formulacion que tenia una actividad antioxidante reconocida y demostrada, conocida como ARd Stenovit® (AOst).

[0130] Esta formulacion comprendia compuestos con actividad antioxidante, proporcionandose su formulacion, como se usa en el presente ensayo, en la Tabla 6.

[0131] En experimentos previos, se demostro que la misma formulacion poseia una accion antioxidante, determinada basandose en el ensayo d-ROMs, tanto cuando se administraba a voluntarias sanas [19] en un experimento controlado doble ciego como cuando se administraba a pacientes afectadas por una arteriopatfa periferica [18].

Tabla 6. Composicion de la formulacion antioxidante (AOst).

Ingredientes

Cantidad (mg)

Levadura de selenio 0,2%

24,00

Vitamina C protegida 97,5%

30,77

Bioflavonoides de Citrus conc. 40%

75,00

Pidolato de zinc

25,00

Coenzima Q10

10,00

Clorhidrato de L-cisteina

12,61

Acetato de vitamina E conc. 50%

32,91

Clorhidrato de piridoxina

1,22

Acetato de vitamina A 50000 Ul/g

0,7

Beta-caroteno 10%

0,5

[0132] De hecho, esta formulacion antioxidante (AOst) comprendia los cuatro tipos de antioxidante, es decir, antioxidantes de membrana (Vit E y beta-caroteno), antioxidantes circulantes (Vit C L-bioflavonoides), antioxidantes celulares (coenzima Q y piridoxina) y antioxidantes sistemicos (selenio y L-cisteina) que son los componentes de GSH y GSHpx (respectivamente glutation y glutation peroxidasa).

[0133] En las voluntarias, AOst se administro en forma de viales bifasicos de 10 ml (a mezclar en el momento de administracion) al mismo tiempo que la pildora de TA. Los metodos experimentales de este ciclo (Ciclo D) fueron identicos a los de los Ciclos B y C anteriores.

[0134] Los resultados de los valores de hidroperoxido en sangre en serie se proporcionan en la Tabla 7.

Tabla 7. Valores del ensayo d-ROMs despues del tratamiento TA (Microgynon® durante 28 dias) combinado con ___________________________AOst en voluntarias sanas (media ± DT).___________________________

Ciclo D

Tiempo dias t1 t3 t6 t9 t12 t15 t18 t21 t24 t27

(Terapia TA + AOst)

Ensayo d-ROMs U. carr. 241 ± 22,3 391a ± 21,2 395a ± 20,0 398a ± 19,0 407a ± 39,5 438a ± 36,9 427a ± 36,7 423a ± 33,7 310a ± 80,4 257 ± 36,1

p < 0,05 ensayo t para datos interdependientes t1 Vs tn

[0135] Como puede verse por los valores medios a los diversos tiempos de medicion, el tratamiento con AOst que habia demostrado ser capaz de reducir los valores del ensayo d-ROMs en voluntarios sanos de ambos sexos [19], inesperadamente no podia actuar de forma alguna sobre el EO debido al tratamiento con farmacos anticonceptivos hormonales (TA).

[0136] Por lo tanto, pudo deducirse a partir de los resultados que el EO originado por la terapia TA se generaba por mecanismos bastante particulares, tales como para mantenerse practicamente sin alteraciones a pesar de la administracion de formulaciones antioxidantes demostradas.

5

10

15

20

25

30

35

40

[0137] Despues de un ciclo de eliminacion posterior, en el que las voluntarias continuaron unicamente el tratamiento con la misma TA, se sometieron a un ciclo de TA adicional (ciclo E) asociado con la composicion antioxidante de la invencion (AOinv), proporcionada especificamente en la Tabla 8.

Tabla 8. Composicion antioxidante de la invencion (AOinv)

Cantidad (mg)

Levadura de selenio*

24,00

Clorhidrato de piridoxina

2,44

Acido alfa-lipoico

10,00

Coenzima Q10

10,00

Beta-caroteno 10 %

0,5

Catequinas, siendo el 40 % EGCG

90,00

* Levadura de selenio valorada en selenio organico al 0,2 %

[0138] Las catequinas se suministraron en forma de extracto de te verde, constituyendo dichas catequinas un 60 % en peso.

[0139] La composicion de AOinv se administro al mismo tiempo que la pildora de TA. Dicha composicion estaba en forma de un kit, es decir, un polvo y 10 ml de solucion acuosa de te verde descafeinado en el que se disolvieron las catequinas, que debian mezclarse conjuntamente en el momento de consumo. Los metodos de extraccion y las sugerencias de salud e higiene para este ensayo fueron identicas a las de los ensayos previos.

[0140] Los resultados del tratamiento con la composicion de la invencion se proporcionan en la Tabla 9.

Tabla 9. Valores del ensayo d-ROMs (media ± DT) despues del tratamiento combinado de TA (Microgynon® durante _____________________________28 dias) y ^ AOinv durante 27 dias. __________________________

Ciclo E

Tiempo dias t1 t3 t6 t9 t12 t15 t18 t21 t24 t27

(Terapia TA + AOinv)

Ensayo d-ROMs U. CARR. 258 ± 18,4 352ab ± 39,8 340ab ± 34,1 318ab ± 28,9 320ab ± 34,2 314ab ± 30,3 322ab ± 30,8 329ab ± 25,2 277ab ± 15,0 244 ± 13,0

a ensayo t para datos interdependientes p<0,05 tn Vs ti b ensayo t para datos interdependientes p< 0,05 tn de Tabla 8 Vs tn de Tabla 9

[0141] Con la excepcion de los tiempos ti y t27, todos los valores del ensayo d-ROMs fueron significativamente menores que los obtenidos con el tratamiento anticonceptivo solo; es decir, se demostro que el tratamiento simultaneo con la composicion AOinv era, inesperadamente, sorprendente y significativamente eficaz para reducir el EO durante todo el periodo del ciclo en el que se usaba el farmaco anticonceptivo hormonal.

[0142] Estos resultados fueron incluso mas sorprendentes si se considera que se descubrio que el uso del producto antioxidante de eficacia demostrada y documentada, usando el mismo tipo de ensayo para determinar el estado de EO, era totalmente insatisfactorio.

Ejemplo 4.

Evaluation del efecto sinergico demostrado por el AOinv en comparacion con la action de catequinas solas

[0143] Para este ensayo se seleccionaron 64 voluntarias eumenorreicas aparentemente sanas, todas con tratamiento anticonceptivo durante al menos 6 meses con una baja dosificacion de C que contenia etinilestradiol 30 pg y drospirenona 3 mg (Yasmin®), que despues se subdividieron en dos grupos: un grupo de control y un grupo de tratamiento.

[0144] Los criterios de seleccion para todas las voluntarias excluyeron las terapias cronicas concomitantes, un estado premenopausico, el uso de cualquier tipo de suplemento de la alimentacion, el habito de fumar y el uso de bebidas alcoholicas fuertes, el consumo excesivo de te (>750 ml/dia), de chocolate (>50 g/dia) y un IMC > 25. El ultimo embarazo tenia que haberse producido no menos de dos anos antes del presente ensayo.

[0145] El grupo de control estaba bajo un regimen de TA asociado con el consumo controlado de te; el grupo de tratamiento estaba bajo un regimen con el mismo TA con el consumo simultaneo de la composicion de AOinv que se

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

proporciona en la Tabla 6.

[0146] El grupo de control (33 casos; edad media 35,9 ± 6,71 anos) que tomo la TA de acuerdo con el procedimiento estandar sugerido por el fabricante se sometio a un analisis para controlar el EO en tres momentos precisos:

- una primera determinacion para la seleccion, que tenia el objetivo de determinar si la TA habia generado EO;

- una segunda determinacion para evaluar el valor basal de EO;

- una tercera evaluacion despues de 8 semanas de terapia con C.

[0147] Como parte integral del protocolo experimental, se pidio a dicho grupo de control que consumiera dos tazas de te de 150 ml por la manana; una de ellas en el desayuno y la otra durante la manana. Ademas, se pidio que no se consumiera mas te durante el dia.

[0148] El tipo de te era identico para todas las voluntarias ya que se suministro a proposito para el uso en la investigacion experimental (3 cajas con 50 bolsas de te cada una).

[0149] El contenido de catequinas del te [21,23, 24] se proporciona en la Tabla 10.

Tabla 10. Contenido de catequinas en el te administrado al grupo de control

Tipo de catequina

mg/taza mg/dia total

EGCG

21,9 43,8

EGC

9,3 18,6

ECG

28,7 57,4

EC

10,0 20,0

Total

69,9 139,8

[0150] La peticion de consumir al menos dos tazas de te se debia a la eleccion de administrar una cantidad de catequinas que fuera definitivamente mayor que la de las voluntarias tratadas con la composicion AOinv. La administracion de te en las cantidades propuestas permitio aumentar los niveles de catequinas en sangre y el poder antioxidante relativo [21].

[0151] Las voluntarias del grupo de tratamiento (31 casos; edad media 36 ± 8,22 anos) siguieron el mismo esquema de terapia TA y supervision de EO, pero despues de la comprobacion basal (despues de la de la seleccion), ademas recibieron un tratamiento continuo con AOinv tambien durante 8 semanas consecutivas, despues de lo cual se comprobo de nuevo el EO. Se pidio a este grupo que evitara el consumo de te, o como maximo lo limitaran a una cantidad que no superara una taza/dia (150 ml), y que ademas evitaran el consumo de chocolate durante el periodo de investigacion de 8 semanas.

[0152] La accion antioxidante in vitro del te distribuido a las voluntarias de los dos grupos se determino despues de una evaluacion del poder de AO con el metodo de BAP (potencia antioxidante biologica) [25]. Para realizar el ensayo, se preparo una infusion de te sumergiendo una bolsa de te durante 5 minutos en 150 ml de agua hirviendo. El vial de AOinv reconstituido (polvo disuelto en 10 ml de solucion acuosa) tambien se llevo a 150 ml con agua hirviendo. La BAP se determino 10 minutos despues de su preparacion. Se compararon seis preparaciones de te, realizadas en tiempos diferentes, y se evaluaron por duplicado con seis preparaciones de AOinv tambien evaluadas por duplicado.

[0153] Los resultados in vitro demostraron que el poder antioxidante del te era mas eficiente que el de la composicion de AOinv; es decir, 3702 ± 347,3 pmol/l respectivamente de vitamina C para la infusion de te y 3121 ± 136,8 pmol/l de vitamina C para AOinv (p<0,05 ensayo t para datos independientes).

[0154] Durante el periodo experimental, se permitio a todas las voluntarias que bebieran cafe durante el dia de acuerdo con sus habitos. Todas las voluntarias se presentaron para el ensayo por la manana, entre las 8:00 y las 9:30, habiendo permanecido en ayunas desde la tarde previa. Se les aconsejo que evitaran comer en exceso la tarde anterior al analisis de sangre que se realizo de acuerdo con los metodos proporcionados en el Ejemplo 2.

[0155] El esquema para evaluar el EO consistia, como se ha indicado, en tres controles; el control para la seleccion, la medicion inicial y la medicion despues de 8 semanas.

[0156] Las mediciones se cronometraron de tal forma que no se produjeran, en ninguno de los casos, en los dias inmediatamente anteriores al flujo menstrual. Los resultados de medicion se proporcionan en la Tabla 11.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

[0157] Como puede verse a partir de los datos presentados, todas las voluntarias (tanto del grupo de control como del grupo de tratamiento) al principio del periodo de observacion estaban en situacion de EO. Ninguna voluntaria realmente tenia valores del ensayo d-ROMs considerados normales, es decir, < 300 Carr. U., como confirmacion adicional de que los farmacos anticonceptivos hormonales con baja dosis de estrogenos tambien producen EO.

Tabla 11. Valores del ensayo d-ROMs en voluntarias sanas, antes y despues del tratamiento combinado de anticonceptivo (Yasmin®) y te y/o AOinv, antes y despues de un periodo de 8 semanas (valores medios ± DT)

Tratamiento

Valores de ensayo d-ROMs (U. CARR.)

basal

Despues de 8 semanas

Grupo de control [TA + te]

385 ± 38,2 394 ± 46,9

Grupo de tratamiento [TA + AOinv]

389 ± 44,2 305 ± 23,3

P< 0,05 ensayo t para datos interdependientes Controles Vs tratados

[0158] Al final del periodo de 8 semanas, se observo que los valores del ensayo d-ROMs para el grupo tratado con AOinv eran significativamente menores que los del grupo de control, estando un alto porcentaje de casos dentro de los valores normales (75 %).

[0159] Esto no ocurria en el grupo de control, a pesar de que las voluntarias habian consumido una mayor cantidad de catequinas (con un cumplimiento del 98 % calculado contando las bolsas de te usadas).

[0160] Ademas, se observo que el consumo de cafe en los dos grupos de estudio era practicamente el mismo: la media era 1,1 tazas/dia para el grupo de control y 1,2 tazas/dia para el grupo de tratamiento. El consumo de te por las voluntarias del grupo tratado con AOinv fue insignificante en promedio (0,1 tazas/dia).

[0161] Estos resultados fueron sorprendentes, ya que demostraron que no eran las catequinas las que ejercian una accion limitante del EO durante el regimen de tratamiento con la TA de farmaco anticonceptivo hormonal, incluso a bajas dosificaciones, ya que se observo que las catequinas, aunque se habian administrado en mayores cantidades que las contenidas en AOinv, no podian actuar sobre el EO.

[0162] Se dedujo que los resultados sorprendentes eran atribuibles a la composicion antioxidante de la invencion que, mediante componentes especificos asociados de forma adecuada con la accion de la catequina, daban como resultado un efecto sinergico inesperado que permitia reducir significativamente el EO. Estos resultados eran incluso mas sorprendentes e inesperados cuando se consideraba que la evaluacion del poder antioxidante in vitro, como se ha indicado anteriormente, no recomendaba el uso de la composicion de la invencion en comparacion con el te verde solo.

[0163] Tambien debe indicarse que esta reduccion significativa conduce ventajosamente, por lo tanto, a una frecuencia reducida de episodios tromboticos superficiales, asi como de todos los acontecimientos cardiovasculares atribuibles al uso de farmacos anticonceptivos hormonales como fuente de EO.

Ejemplo 5.

Evaluacion del efecto sinergico demostrado por AOinv con respecto a la accion de los componentes solos, es decir, sin catequinas.

[0164] Este ensayo se realizo con 18 voluntarias (una parte de los casos del Ejemplo 3).

[0165] El objetivo del ensayo era verificar si los antioxidantes contenidos en el AOinv, sin extracto de te verde, eran sin embargo eficaces para reducir el EO producido por los farmacos anticonceptivos hormonales en uso (Yasmin®).

[0166] Por lo tanto, se formaron tres grupos de voluntarias [A, B, C], cada uno compuesto de seis sujetos seleccionados basandose en la edad, peso corporal y altura de tal forma que los tres grupos fueran tan homogeneos como fuera posible. Todas las voluntarias se sometieron a un mes de eliminacion de todos los tratamientos excepto el anticonceptivo. Las caracteristicas de las voluntarias se muestran a continuacion:

Caracteristicas*

Grupo A Grupo B Grupo C

Edad (Anos)

30,8 ± 3,43 32,7 ± 4,27 31,8 ± 5,81

Peso (kg)

63,3 ± 5,39 62,5 ± 2,66 63,3 ± 2,25

Caracteristicas*

Grupo A Grupo B Grupo C

Altura (m)

1,69 ± 0,06 1,68 ± 0,03 1,66 ± 0,04

Indice de masa corporal IMC (kg/m2)

23,4 ± 1,40 22,1 ± 1,52 23,0 ± 1,30

* Todas las variables generales se analizaron por ANOVA y se descubrio que los grupos no eran significativamente diferentes (p > 0,05).

[0167] Los tres grupos de voluntarias se trataron como se indica a continuacion:

El Grupo A se sometio a un tratamiento diario con AOinv;

El Grupo B se trato diariamente con te verde de acuerdo con los metodos proporcionados en el Ejemplo 4 (consumo por la manana de dos tazas de te, de 150 ml cada una; de nuevo, una en el desayuno y la otra durante la manana; ademas, se pidio que evitaran el consumo de cualquier otro te durante el dia);

El Grupo C se trato con la composicion antioxidante proporcionada en la Tabla 12, que correspondia a la composicion AOinv sin catequinas. Se pidio que este ultimo grupo no tomara te a lo largo de la duracion del ensayo.

Tabla 12. Composicion de AO administrada durante 8 semanas al Grupo C.

Ingredientes

Cantidad (mg)

Levadura de selenio conc. 0,2 %

24,00

Clorhidrato de piridoxina

2,44

Acido alfa-lipoico

10,00

Coenzima Q10

10,00

Beta-caroteno 10 %

0,5

[0168] Los tratamientos se iniciaron con la terapia anticonceptiva en curso y se continuaron sin interrupcion durante

15 8 semanas. Durante el periodo de ensayo, se dejo que todas las voluntarias bebieran cafe durante el dia de acuerdo

con sus habitos. Tambien se permitio que las voluntarias del Grupo C bebieran cafe si lo tenian como costumbre (siempre que no fuera un sustituto del te).

[0169] Antes de empezar a tomar las formulaciones antioxidantes y durante 8 semanas posteriormente, se 20 adquirieron los valores del ensayo d-ROMs.

[0170] Todas las voluntarias se presentaron para las comprobaciones de sangre entre las 8:00 y las 9:30 por la manana, en ayunas desde la tarde previa. Se les aconsejo que evitaran comer en exceso la tarde previa al analisis de sangre que se realizo de acuerdo con los metodos indicados en el Ejemplo 2.

25

[0171] Los resultados se proporcionan en la Tabla 13.

Tabla 13. Valores del ensayo d-ROMs para las voluntarias de los Grupos A, B y C antes y despues del tratamiento

con formulaciones antioxidantes. Valores medios ± DT.

Periodo

Grupos Contrastes ortogonales ANOVA

A

B C

basal

397 ± 9,9 389 ± 22,7 391 ± 13,5 A = B = C

despues de 8 semanas

315 ± 27,8 391 ± 29,2 401 ± 7,9 B = C > A p <0,05

30

[0172] El examen de los datos demostro claramente que el tratamiento con formulaciones de antioxidantes solos (Grupo C) o catequinas solas (Grupo B, Ejemplo 4) no podia afectar en absoluto al EO. Por lo tanto, se demostro que la eficacia significativa de la composicion AOinv para reducir el EO debido al tratamiento con farmacos anticonceptivos hormonales era el resultado de la combinacion de catequinas con componentes antioxidantes 35 adecuados para proporcionar un efecto sinergico inesperado y sorprendente.

5 -

10

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Referencias bibliograficas

[0173]

1) De Groote D, Perrier d’Hauterive S, Pintiaux A et al. Effect of oral contraception with ethinylestradiol and drospirenone on oxidative stress in women 18-35 years old. Contraception 2009; 80:187-193.

2) Pincemail J, Vanbelle S, Gaspard U et al. Effect of different contraceptive methods on the oxidative status in women aged 40-48 years from ELAN study in the province of Liege- Belgium. Human Reprod 2007; 22:23352343.

3) Loose D, Stancel G. Estrogens and progestins in: Goodman & Gilman’s The pharmacological basis of therapeutics 11th Ed 2006:1541-1553.

4) Zachara BA, Gromadzinska J, Wasowicz W, Zbroz. Red blood cell and plasma glutathione peroxidase activities and selenium concentration in patients with chronic kidney disease: a review. Acta Biochin Pol 2006; 53:663-677.

5) Serviddio G, Loverro G, Vicino M et al. Modulation of endometrial balance during the menstrual cycle: relation with sex hormones. J Clin Endocrinol Metab 2002; 87:2843-2848.

6) Massafra C, Gioia D, De Felice C et al. Effects of estrogens and androgens on erythrocyte antioxidant superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase activities during the menstrual cycle. J Endocrinol 2000; 167:447-452.

7) Santanan N, Shern-Brewer, McClatchey R et al. Estradiol as an antioxidant: incompatible with its physiological concentrations and function. J Lipid Res 1998; 39:2111-2118.

8) Fukumura D, Gohongi T, Kadambi A et al. Predominant role of endothelial nitric oxide synthase in vascular endothelial growth factor-induced angiogenesis and vascular permeability. Proc Soc Acad Sci USA 2001; 98:2604-2609.

9) Cameron IT, Campbell S. Nitric oxide in the endometrium. Human Repr Update 1998; 4:565-589.

10) Bani D. Relaxin as a natural agent for vascular health. Vase Health Risk Manag 2008; 4:515-524.

11) Sugioka K, Shimosegawa Y, Nakano M. Estrogens as natural antioxidants of membrane phospholipid peroxidation. FEBS 1987; 210:37-39.

12) Sack MN, Rader DJ, O Cannon R. Oestrogens and inhibition of oxidation of low-density lipoproteins in postmenopausal women. Lancet 1994; 343:269-270.

13) Chiang K, Parthasarathy S, Santanan N. Estrogen, neutrophils oxidation. Life Sci 2004; 75:2425-2438.

14) Larner JM, Pahuja SL, Shackleton CH et al. The isolation and characterization of estradiol-fatty acid esters in human ovarian follicular fluid. J Biol Chem 1993; 268:13893-13899.

15) Tikkanen MJ, VihmaV, Jauhiainen M et al. Lipoprotein-associated estrogens. Cardiovasc Res 2001; 56:184188.

16) Larner JM, Shackleton CH, Roitman E et al. Measurement of estradiol-17-fatty acid esters in human tissue. J Clin Endocrinol Metab 1992; 75:195-200.

17) Shern-Brewer R, Santanam N, Wetzstein C et al. Exercise and cardiovascular disease a new perspective. Arteriosc Thromb Vase Biol 1998; 18:1181-1187.

18) Cesarone MR, Belcaro G, Carratelli M etal. A simple test to monitor oxidative stress, lnt Angiol 1999; 18:127130.

19) Cornelli U, Terranova R, Luca S, et al. Bioavailability and antioxidant activity of some food supplements in men and women using the D-Roms test as a marker of oxidative stress. J Nutr 2001; 131:3208-3211.

20) Wolfram S. Effects of green tea and EGCG on cardiovascular and metabolic health. J Am Coll Nutr2007; 26:373S- 388S.

21) Warden BA, Smith LS, Beecher GR et al. Catechins are bioavailable in men and women drinking black tea throughout the day. J Nutr 2001; 131:1731 -1737.

22) Saganuma M, Okabe S, Oniyama M et al. Wide distribution of [3H](-)epigallocatechin gallate, a cancer preventive tea polyphenol, in mouse tissue. Carcinogenesis 1998; 19:1771-1776.

23) Schwedhelm E, Maas R, Troost R, Boger RH. Clinical pharmacokinetics of antioxidants and their impact on systemic oxidative stress. Clin Pharmacokinet 2003; 42:437-459.

24) Fernandez-Panchon MS, Villano D, Troncoso AM, Garcia-Parrilla MC. Antioxidant activity of phenolic compounds: from in vitro results to in vivo evidence. Crit Rev Food Sci 2008; 48:649-671.

25) Nakayama K, Terawaki H, Nakayama M et al. Reduction of serum antioxidative capacity during hemodialysis Clin Exp Nephrol 2007;11:218-225.

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   REIVINDICACIONES

   1. Composicion antioxidante que comprende levadura de selenio, vitamina B6, acido alfa-lipoico, coenzima Q10, beta-caroteno y catequinas.
2. 2. La composicion antioxidante de la reivindicacion 1, que comprende un 8-16 % en peso de levadura de selenio, un 0,5-5 % en peso de vitamina B6, un 1-10 % en peso de acido alfa-lipoico, un 1-10 % en peso de coenzima Q10, un 0,05-0,5 % en peso de beta-caroteno y un 40-60 % en peso de catequinas.
3. 3. La composicion antioxidante de la reivindicacion 2, que comprende un 10-14 % en peso de levadura de selenio, un 1-3 % en peso de vitamina B6, un 3,5-6 % en peso de acido alfa-lipoico, un 3,5-6 % en peso de coenzima Q10, un 0,1-0,3 % en peso de beta-caroteno y un 42-51 % en peso de catequinas.
4. 4. La composicion antioxidante de la reivindicacion 3, que comprende un 12-13 % en peso de levadura de selenio, un 1,1-2 % en peso de vitamina B6, un 4-5,5 % en peso de acido alfa-lipoico, un 4-5,5 % en peso de coenzima Q10, un 0,2-0,3 % en peso de beta-caroteno y un 45-48 % en peso de catequinas.
5. 5. La composicion antioxidante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dichas catequinas son galato de epigalocatequina (EGCG), epigalocatequina (EGC), galato de epicatequina (ECG) y epicatequina (EC).
6. 6. La composicion antioxidante de la reivindicacion 5, en la que al menos un 35 % en peso es EGCG con respecto al peso de catequina.
7. 7. La composicion antioxidante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que dichas catequinas estan en forma de extracto de te verde.
8. 8. La composicion antioxidante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en la que dicha vitamina B6 es piridoxina o una sal de la misma.
9. 9. La composicion antioxidante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para uso como un medicamento.
10. 10. La composicion antioxidante de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8 para reducir el estres oxidativo atribuible al tratamiento con farmacos anticonceptivos hormonales.
11. 11. La composicion antioxidante para uso de la reivindicacion 9 o 10, en la que una dosis unitaria de dicha composicion comprende 15,8-31,5 mg de levadura de selenio, 1-9,5 mg de vitamina B6, 2-19 mg de acido alfa- lipoico, 2-19 mg de coenzima Q10, 0,1-0,95 mg de beta-caroteno y 80-110 mg de catequinas.
12. 12. La composicion antioxidante para uso de la reivindicacion 11, en la que una dosis unitaria de dicha composicion comprende 20-27.5 mg de levadura de selenio, 2-5,5 mg de vitamina B6, 7-11,8 mg de acido alfa-lipoico, 7-11,8 mg de coenzima Q10, 0,2-0,59 mg de beta-caroteno y 85-95 mg de catequinas.
13. 13. La composicion antioxidante para uso de la reivindicacion 12, en la que una dosis unitaria de dicha composicion comprende 24 mg de levadura de selenio, 2,44 mg de vitamina B6, 10 mg de acido alfa-lipoico, 10 mg de coenzima Q10, 0,5 mg de beta-caroteno y 90 mg de catequinas, en la que aproximadamente un 40 % es EGCG.
14. 14. Un kit que comprende:

    i) al menos una composicion que comprende levadura de selenio, vitamina B6, acido alfa-lipoico, coenzima Q10 y betacaroteno; y

    ii) al menos una solucion acuosa que comprende catequinas,

    para la administracion simultanea de los antioxidantes de la composicion de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8.
15. 15. El kit de la reivindicacion 14, en el que dicha composicion i) esta en forma de polvo.