ES2585483T3

ES2585483T3 - Mejora molecular de la matriz extracelular y métodos de uso

Info

Publication number: ES2585483T3
Application number: ES09710120.8T
Authority: ES
Inventors: Kathleen Anne Derwin; Joseph Patrick Iannotti; Likang Chin; Anthony Calabro
Original assignee: Cleveland Clinic Foundation
Current assignee: Cleveland Clinic Foundation
Priority date: 2008-02-13
Filing date: 2009-02-13
Publication date: 2016-10-06
Anticipated expiration: 2029-02-13
Also published as: US20090204227A1; WO2009102967A2; US8080260B2; WO2009102967A3; EP2249891B1; EP2249891A4; EP2249891A2

Abstract

Una composición que comprende matriz extracelular derivada de ser humano o animal que tiene incorporada en su interior una red macromolecular que comprende macromoléculas de policarboxilato, poliamina o polihidroxifenilo que se han reticulado mediante enlaces dihidroxifenilo, estando dicha red macromolecular conectada dentro de dicha matriz extracelular derivada.

Description

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

DESCRIPCION

Mejora molecular de la matriz extracelular y metodos de uso Antecedentes de la invencion

El manguito de los rotadores comprende cuatro musculos que controlan el movimiento del hombro y sus tendones asociados por los que los musculos estan unidos a la cabeza humeral (el extremo del humedo que forma parte de la articulacion del hombro). Junto con la capsula articular, estos musculos y tendones forman un manguito que rodea la cabeza del humero. Los tendones son estructuras gruesas tipo cinta que tienen alta resistencia a la traccion. No solo mantienen juntos los musculos del hombro y el humero, sino que tambien transmiten fuerzas ejercidas por aquellos musculos para inducir el movimiento correspondiente del humero. En un sujeto sano, los tendones estan completamente unidos en un extremo a, y envuelven, una porcion de la superficie de la cabeza humeral. Cuando se produce el desgarro de un manguito de los rotadores, la capsula articular y uno o mas de los tendones llega(n) a separarse parcialmente o completamente de la cabeza humeral, creando tanto una condicion dolorosa como funcionalmente debilitante.

El actual tratamiento para los desgarros del manguito de los rotadores es suturar el tendon roto de nuevo al hueso de la cabeza humeral. Las suturas mantienen el tendon en contacto con el hueso, preferentemente durante un tiempo suficiente para que el tendon se consolide al hueso y forme un puente que restablecera la conexion tendon- hueso y restaurara la funcion normal. Las suturas que se usan poseen resistencia a la traccion suficiente para retener el tendon y el hueso juntos durante el proceso de consolidacion. Sin embargo, el tendon es un tejido fibroso que puede ser rasgado por las suturas. Comunmente, las suturas se alinearan con la estructura fascicular del tendon y la destrozaran bajo fuerza de traccion suficiente, arruinando asf la reparacion quirurgica antes de que se complete la consolidacion del tendon al hueso. Las suturas tambien pueden desgarrarse a traves del hueso bajo fuerza suficiente, particularmente en sujetos mayores que forman la mayor parte de los pacientes con desgarro del manguito de los rotadores y cuyos huesos tienden a ser mas osteoporoticos.

El documento WO 03/007787 A2 desvela MEC impregnada con HA como material de andamiaje para la reparacion de tejido.

En realidad, los desgarros del manguito de los rotadores afectan al 40 % o mas de aquellos por encima de la edad de 60 y cuesta a la econoirna de los EE.UU. aproximadamente 3 billones de dolares al ano. La tasa de fallo en las reparaciones de desgarros del manguito de los rotadores de grandes a considerables oscila del 20 al 90 %. Las altas tasas de volver a desgarrarse son un resultado de factores mecanicos (por ejemplo, tamano del desgarro, tecnica de reparacion, protocolo de rehabilitacion), ademas de factores biologicos (por ejemplo, edad, cronicidad del desgarro, calidad del tendon, enfermedad) que puede comprometer la capacidad intrmseca de los pacientes para consolidarse. Todos estos factores pueden tambien contribuir a la tendencia de las suturas a desgarrarse a traves de tendon y hueso antes de completarse la consolidacion, contribuyendo asf a la tasa de volver a desgarrarse. Por tanto, existe la necesidad de estrategias de reparacion que proporcionen resistencia adecuada, ademas de que estimulen y potencien el potencial de consolidacion.

Breve sumario de la invencion

Se proporciona una composicion que incluye matriz extracelular derivada de ser humano o de animal que tiene incorporada en su interior una red macromolecular que comprende macromoleculas de policarboxilato, poliamina o polihidroxifenilo que han sido reticuladas mediante enlaces dihidroxifenilo, estando dicha red macromolecular conectada dentro de dicha matriz extracelular derivada.

Tambien se proporciona un metodo de preparacion de una composicion implantable. El metodo incluye impregnar una matriz extracelular derivada de ser humano o animal con macromoleculas de hialuronano que tienen grupos laterales hidroxifenilo sustituidos en ella; y a partir de aqrn hacer reaccionar los grupos laterales hidroxifenilo para formar enlaces dihidroxifenilo, incorporando asf una red macromolecular reticulada de hialuronano que se conecta dentro de la matriz extracelular.

Tambien se proporciona un metodo de refuerzo de una reparacion de tejido, o de reparacion de un defecto o hueco de tejido. El metodo incluye proporcionar un parche que comprende una matriz extracelular derivada de ser humano o animal que tiene impregnada en su interior macromoleculas de policarboxilato o poliamina que tienen grupos laterales hidroxifenilo sustituidos en ella; hacer reaccionar los grupos laterales hidroxifenilo para formar enlaces dihidroxifenilo, incorporando asf una red macromolecular reticulada de dichas macromoleculas de policarboxilato o poliamina que se conecta dentro de la matriz extracelular; identificar un defecto o hueco de tejido apropiado en tejido animal o humano in vivo; y aplicar el parche para tanto reforzar la reparacion de tejido como cubrir el defecto o hueco de tejido.

Tambien se proporciona un parche para reforzar una reparacion de tejido, o reparar un defecto o hueco de tejido. El parche incluye una matriz extracelular derivada de ser humano o animal que tiene impregnada en su interior una red

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

macromolecular de macromoleculas de policarboxilato o poliamina que han sido reticuladas mediante enlaces dihidroxifenilo. La red macromolecular se incorpora y se conecta dentro de la matriz extracelular. En realizaciones preferidas, la matriz extracelular derivada es fascia lata y las macromoleculas son moleculas de hialuronano que han sido sustituidas con tiramina y reticuladas mediante enlaces ditiramina.

Breve descripcion de los dibujos

La FIG. 1 es un diagrama esquematico de un parche de matriz extracelular aplicado sobre un sitio de reparacion de hueso a tendon para reforzar la reparacion.

La FIG. 2 es una formula estructural de una molecula de hialuronano.

La FIG. 3 es un diagrama esquematico de una realizacion de una red macromolecular reticulada de dihidroxifenilo.

La FIG. 4 es un diagrama esquematico de un parche de matriz extracelular aplicado para reparar un defecto de tejido entre tendon y hueso, que conecta el hueco entre el tendon y el hueso en lo que de otro modo sena un desgarro irreparable.

La FIG. 5 es una serie de dos fotograffas que muestra la distribucion de HA en MEC de fascia (A) tratada con agua y (B) tratada con HA sustituido con tiramina seguido de reticulacion, como se describe en el Ejemplo 1.

La FIG. 6 es una serie de tres fotograffas que muestra secciones histologicas representativas de injertos de matriz extracelular de fascia tras la implantacion en el modelo de pared abdominal de la rata durante cuatro semanas (tincion con hematoxilina y eosina, 10X), en el que la fascia estuvo (A) sin tratar, (B) se trato con HA y (C) se trato con TS-HA, seguido de reticulacion, como se describe en el Ejemplo 4.

Descripcion detallada de realizaciones preferidas de la invencion

A continuacion se describen realizaciones de ejemplo y se ilustran en los dibujos. Estas realizaciones no pretenden ser limitaciones. Por ejemplo, pueden utilizarse uno o mas aspectos en otras realizaciones e incluso otros dispositivos o metodos.

Actualmente, estan siendo investigados los parches de matriz extracelular (“MEC”) para la reparacion del manguito de los rotadores basandose en el fundamento de que pueden proporcionar un andamiaje natural y mecanicamente robusto que refuerza la reparacion, grna la infiltracion de celulas del huesped y promueve la formacion de una conexion tendon-hueso funcional. La matriz extracelular es la parte extracelular que existe de forma natural de tejido animal o humano que puede proporcionar soporte estructural a las celulas, ademas de realizar diversas otras funciones. Los parches y metodos desvelados en el presente documento utilizan MEC derivada de ser humano o animal que se procesa y opcionalmente se corta dentro de un parche, y aumenta ex vivo para incorporar y conectar una matriz macromolecular reticulada para conferir propiedades beneficiosas. Mas generalmente, como se usa en el presente documento, una MEC derivada de ser humano o animal, o simplemente 'MEC derivada', es un material de matriz extracelular que se escinde y recoge de un animal o ser humano, y luego se procesa con o sin tratamientos qmmicos adicionales u otros tratamientos ex vivo para proporcionar un parche que puede usarse para reparar (o reforzar la reparacion de) un defecto o hueco de tejido en un animal o ser humano en necesidad de tal reparacion. El huesped animal o humano que es la fuente de la MEC derivada puede o puede no ser el paciente que va a recibir el parche, hecho de MEC derivada, para reparar un defecto o hueco de tejido.

La MEC derivada puede clasificarse en dos amplias categonas: MEC derivada viable y MEC derivada no viable. En el presente documento, la MEC derivada viable se refiere a MEC derivada de ser humano o animal como se ha descrito anteriormente, que no se ha tratado para eliminar o destruir celulas vivas presentes o suspensas en la MEC. Por consiguiente, la MEC derivada viable retendra celulas vivas del huesped de la MEC, que estaban presentes en su interior tras la recogida. La MEC derivada viable puede ser la eleccion preferida para preparar un parche de autoinjerto para auto-trasplante; es decir, si el defecto o hueco de tejido en necesidad de reparacion esta en el huesped del que se derivo la MEC. Alternativamente, la MEC derivada viable tambien puede preferirse en el caso de un huesped de MEC derivada que ha sido tipificado por tejido y es coincidente con el paciente en necesidad de la reparacion, para proporcionar un parche de aloinjerto para alotrasplante. La MEC derivada viable puede derivarse de un huesped vivo, y usarse inmediatamente (opcionalmente incluso intra-operatoriamente) para reparar un defecto o hueco de tejido, tanto en el huesped de MEC como en otro sujeto. Alternativamente, la MEC derivada viable puede tipificarse por tejido y guardarse en banco hasta que se necesite, dependiendo de la capacidad para preservarla en un estado viable. En otra alternativa, la MEC derivada viable puede derivarse (por ejemplo, donarse) de un huesped recien muerto, en el que las celulas presentes en la MEC todavfa no han muerto.

En el presente documento, la MEC derivada no viable se refiere a MEC derivada de ser humano o animal como se ha descrito anteriormente, que ha sido tanto tratada para eliminar o destruir celulas vivas presentes cuando se recoge de un huesped viable o recien muerto, como para eliminar los componentes de celulas necroticas presentes cuando se recoge de tejidos cadavericos despues de un periodo de tiempo tras la muerte. La MEC derivada no viable puede ser la opcion preferida en circunstancias en las que haya riesgo de induccion de una respuesta inmunitaria inaceptable o no deseable en el receptor de un parche hecho con la MEC derivada, basado en la presencia de celulas vivas extranas. Alternativamente, la MEC derivada no viable puede preferirse cuando se desea incorporar celulas espedficas de fuente y concentracion conocidas dentro del parche que va a formarse a partir de la MEC derivada, por ejemplo, celulas de autoinjerto. La MEC derivada no viable tambien puede preferirse debido a

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

que es generalmente mas facil de obtener en comparacion con la MEC derivada viable. Ademas de obtener MEC no viable de seres humanos o animales cadavericos, tambien puede prepararse tratando de otro modo MEC derivada viable con agentes apropiados o tecnicas para destruir y eliminar las presentes celulas vivas antes de uso.

Los parches descritos en el presente documento, hechos de o sustancialmente de MEC derivada, se aplican para reparar un defecto o hueco de tejido, o para reforzar tal reparacion. Como se usa en el presente documento, un defecto o hueco de tejido es un espacio entre tejidos de un paciente (animal o ser humano), o entre porciones adyacentes del mismo tejido, que se desea unir juntas. Un defecto o hueco de tejido puede estar formado de un desgarro o separacion de tejidos que una vez estuvieron unidos, tal como cuando un tendon se desgarra o se desprende del hueso asociado, o cuando se forma una perforacion (tanto traumaticamente como mediante una enfermedad u otro proceso natural) en el tejido, tal como una ulcera.

En el presente documento se desvelan parches hechos de MEC derivada y sus metodos de uso para reparar o reforzar la reparacion de un defecto o hueco de tejido. La fascia lata es una forma de MEC derivada util para preparar los parches descritos en el presente documento. La fascia lata puede derivarse de ser humano o animal. Es particularmente interesante para aplicaciones descritas en el presente documento, especialmente para reforzar reparaciones de tendon al hueso, debido a que sus propiedades qmmicas, estructurales y de material son similares al tendon. La fascia lata tiene asf buena resistencia a la traccion, una propiedad importante para retener juntos tejidos rasgados o perforados. En realizaciones preferidas, un parche usado para reforzar o reparar un defecto o hueco de tejido esta compuesto por, o principalmente por, fascia lata. Cuando se usa para reparar defectos en seres humanos, la fascia lata es preferentemente fascia lata humana, que esta facilmente disponible como tejido de aloinjerto de bancos de tejido. Alternativamente, la fascia lata de otros animales puede usarse en seres humanos, que incluye fascia lata derivada de, por ejemplo, cerdos o vacas.

La FIG. 1 ilustra esquematicamente un parche de MEC, tal como un parche de fascia lata como se prefiere en el presente documento, aplicado y cosido sobre un sitio de reparacion de tendon a hueso. En la realizacion ilustrada, el tendon se repara inicialmente directamente al hueso del que se ha rasgado. Esto puede hacerse por tecnicas convencionales, como por sutura. Posterior a esta reparacion inicial, el parche hecho de MEC derivada se aplica sobre la reparacion de tendon a hueso, y se une por separado a tejidos intactos localizados en lados opuestos del sitio de reparacion. De este modo, el parche proporciona refuerzo adicional a la reparacion y disminuye las fuerzas a la traccion experimentadas por las suturas del tendon al hueso en el sitio de reparacion. Asf, se apreciara que con el uso de un parche de MEC apropiado y metodo de fijacion quirurgica, las suturas en el sitio de reparacion (directamente unidas al tendon y hueso) pueden ser menos propensas a desgarrarse a traves de tanto el tendon como el hueso. Como consecuencia, el tendon sigue opuesto al hueso de un modo que soporte la consolidacion natural y la formacion de una conexion tendon-hueso funcional. Debido a que la MEC de fascia lata tiene propiedades mecanicas similares al tendon, tiene las propiedades de material inherente para resistir a las fuerzas fisiologicas experimentadas durante la consolidacion tendon-hueso.

Ademas de reforzar el sitio de reparacion, se desea crear y promover un entorno propicio para la rapida consolidacion, que debe reducir la cantidad de tiempo que las suturas deben sustentar la reparacion, y a su vez reducir la tasa de volver a desgarrarse. Sena beneficioso un entorno que inhibiera la migracion de celulas inflamatorias e indujera la migracion de celulas no inflamatorias. El acido hialuronico de alto peso molecular, tambien conocido como hialuronano y abreviado HA, cuya estructura basica se muestra en la FIG. 2, es una biomolecula ubicua que se sabe que desempena una funcion cntica en la morfogenesis con innumerables funciones. Durante tanto la morfogenesis como la cicatrizacion fetal, se cree que los niveles persistentemente altos de HA de alto peso molecular promueven un estado intermedio de adhesion celular que permite cambios en la forma de la celula y la motilidad y/o el mantenimiento en el estado no diferenciado. Las heridas fetales tendnan abundante HA, inflamacion minima y consolidacion sin formacion de cicatrices. Basandose en estas cualidades favorables, el HA se ha investigado ampliamente en estrategias de reparacion de tejido. Se sabe que el HA de alto peso molecular (>250 kDa) posee propiedades antiinflamatorias que conducen a la quiescencia celular y a la formacion reducida de fibrosis/cicatrices. El HA de alto peso molecular puede modular la inflamacion por interaccion directa con celulas inflamatorias o creando un entorno viscoso que limita la migracion de celulas inflamatorias y la difusion de citocinas. Sin embargo, cuando se degrada en fragmentos de peso molecular pequeno, se ha mostrado que el HA es pro- inflamatorio y angiogenico, estimulando la migracion celular, produccion de citocinas y formacion de tejido fibrotico. Por tanto, en terminos de eficacia terapeutica, el HA de alto peso molecular puede ser beneficioso tanto como un agente antiinflamatorio como una barrera protectora contra subproductos inflamatorios.

Segun una realizacion, el HA de alto peso molecular (por ejemplo, ~1 MDa) se incorpora dentro de la MEC derivada para aumentar la MEC y proporcionar un parche mejorado en comparacion con el uso de la MEC derivada sola. La MEC puede ser cualquier mEc derivada adecuada. Preferentemente, es MEC de fascia lata, y en el caso de reparar un defecto de tejido en un ser humano, preferentemente MEC de fascia lata humana. Alternativamente, la MEC derivada puede ser, por ejemplo, fascia lata de otros animales, o puede ser otros tipos de MEC, tales como MEC de dermis, MEC de la submucosa del intestino delgado, MEC de pericardio, etc. Todavfa adicionalmente puede ser una combinacion de materiales de MEC derivada. En realizaciones preferidas, el HA de alto peso molecular se incorpora dentro de la MEC derivada para preparar un producto de parche mejorado. El HA es preferentemente hialuronano sustituido con hidroxifenilo, mas preferentemente hialuronano sustituido con tiramina (TS-HA), que puede

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

impregnarse primero en la MEC, y luego inmovilizarse dentro de la MEC por reticulacion de los aductos, por ejemplo, los aductos de hidroxifenilo o tiramina, para formar reticulaciones, por ejemplo, enlaces dihidroxifenilo o ditiramina, produciendo as^ una red macromolecular de HA reticulado, como se muestra esquematicamente en la FIG. 3, incorporada dentro de la MEC derivada. Por reticulacion in situ dentro de la MEC, el HA impregnado se enmarana dentro de la MEC y la red macromolecular de HA reticulada resultante queda atrapada y conectada en su interior. Ademas, la reticulacion in situ permite el potencial de reticulacion directa de aductos unidos por HA, por ejemplo tiramina, con residuos de tirosina sobre protemas nativas dentro de la MEC derivada, para unir covalentemente la red de HA a estas protemas. Tales protemas pueden producirse naturalmente y ser retenidas en la MEC derivada, o pueden incorporarse por separado para lograr un efecto terapeutico deseado. Se ha mostrado que cuando aproximadamente el 5 % de los disacaridos presentes en las macromoleculas de hialuronano estan sustituidos con tiramina, esto permite que TS-HA se reticule discretamente (o gelifique). La estructura, y supuestamente la actividad biologica, del TS-HA reticulado se mantiene, como se demuestra por la union positiva de la protema de union a HA, como se muestra en la FIG 5 y se describe en mas detalle en los ejemplos mas adelante.

Los datos de los presentes inventores sugieren que la MEC de la fascia lata puede enriquecerse con TS-HA incorporado por al menos un orden de magnitud en comparacion con el HA natural ya presente en la MEC de la fascia lata, usando metodos de difusion. Ademas, se ha encontrado que la fascia enriquecida en TS-HA posee elevada densidad celular en comparacion con la fascia no tratada en un modelo de pared abdominal de la rata (descrito en los ejemplos mas adelante). Los datos de los ejemplos tambien sugieren que la fascia enriquecida con TS-HA inmovilizado esta asociada con inflamacion menos cronica que la fascia no tratada en el modelo de rata. Juntos, estos resultados indican que la incorporacion de una pequena concentracion (1-2% de peso de tejido basado en MEC) de HA de alto peso molecular dentro de la MEC de la fascia lata crea un medio que potencia la infiltracion celular y modula la inflamacion - condiciones favorables para la incorporacion de injerto y quizas no a diferencia de aquellos encontrados en el desarrollo fetal. Debe observarse que hasta ~1-2 % de carga (basado en la masa de tejido de la fascia inicial) ha sido obtenido mediante el metodo de difusion mencionado anteriormente y descrito mas completamente en el presente documento mas adelante. Sin embargo, se contempla que pueden obtenerse mayores tasas de carga de TS-HA mediante tecnicas de carga mas agresivas, por ejemplo, mediante vacm, centrifugacion o electroporacion. Los efectos anteriores, combinados con las propiedades de traccion de la fascia lata, soportan el uso de fascia enriquecida con TS-HA para la reparacion de tendon al hueso en general, y la reparacion del manguito de los rotadores en particular. Los presentes inventores esperan que el HA de alto peso molecular reduzca la inflamacion y promueva la migracion celular dentro de fascia, que promovena la integracion del parche de la fascia con los tejidos huesped subyacentes. Como tal, el parche de la fascia proporcionana refuerzo a la reparacion de tendon al hueso durante la consolidacion. Esto disminuina la aparicion de un nuevo desgarro tras la reparacion. Los anteriores efectos de combinar HA con fascia lata para reforzar una reparacion de tendon al hueso seran particularmente utiles en la reparacion del manguito de los rotadores debido a las altas fuerzas de traccion observadas en la articulacion del hombro durante las actividades posoperatorias y las malas tasas de consolidacion biologica.

Se cree que el enriquecimiento de HA potenciara la respuesta del huesped a fascia tal que el aumento de las reparaciones del manguito de los rotadores con un parche de la fascia enriquecido en HA mejorara los resultados de la reparacion con respecto a la reparacion solo con sutura convencional o aumento con un parche que solo comprende fascia nativa. Se cree adicionalmente que el enriquecer la MEC de fascia con hialuronano (HA) de alto peso molecular exogeno - una molecula conocida por desempenar una funcion cntica en la morfogenesis, reparacion de heridas y modulacion de la inflamacion - puede mejorar la capacidad de la fascia para promover la formacion de un puente tendon-hueso funcional en la reparacion del manguito de los rotadores, potenciando la infiltracion celular y modulando la inflamacion.

El HA exogeno puede combinarse con la fascia lata para producir una MEC mejorada del material de la fascia lata. La fascia lata puede obtenerse, por ejemplo, a partir de bancos de tejido como se ha descrito anteriormente, ademas de otras fuentes. La fascia lata normalmente se suministra en forma descelularizada como un material de MEC no viable. Es un material muy denso, y puede cargarse con HA a ~1-2 % de la masa de tejido de fascia inicial total usando metodos de difusion. El HA anadido se distribuye por toda la profundidad del andamiaje de la fascia, principalmente alrededor de haces de fascmulos grandes. Como se ha mencionado anteriormente, puede ser posible lograr mayor carga mediante tecnicas alternativas y mas agresivas, que incluyen vacm, centrifugacion o electroporacion.

Como se ha mencionado anteriormente, la fascia lata frecuentemente se obtendra de bancos de tejido y otras fuentes comerciales. Estas fuentes pueden aplicar tecnicas de procesamiento especiales o incluso patentadas para procesar la fascia lata antes de usarse. Todas estas tecnicas pueden tener el efecto de hacer que el aloinjerto de fascia lata parezca modestamente extrano al sistema inmunitario del implantado. Se cree que la incorporacion de pequenas cantidades de HA de alto peso molecular dentro de la fascia lata (~1-2 % de la masa total de la MEC) enmascarara protemas degradadas o danadas que surgen del procesamiento y asf reducira la respuesta inmunitaria del implantado y potenciara la integracion del parche.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

El HA no reticulado de alto peso molecular difunde rapidamente fuera de la fascia in vitro (por ejemplo, en el plazo de 1-72 horas). Si el HA difunde rapidamente fuera de la fascia, no estana presente para facilitar los efectos beneficiosos descritos anteriormente en un parche de fascia lata implantado (u otra MEC) durante el proceso de consolidacion. Por tanto, el HA impregnado en la MEC aumenta para atraparlo en su interior de manera que quedara en el parche durante al menos un periodo de tiempo durante el proceso de consolidacion del implante. El HA reticulado de alto peso molecular difunde fuera de la MEC de la fascia lata mas lentamente que el HA no reticulado de peso molecular correspondiente. Un material de HA reticulado que se ha encontrado particularmente util en la presente solicitud se prepara sustituyendo restos de tiramina sobre las cadenas de HA y entonces enlazando las tiraminas para formar enlaces ditiramina entre cadenas de HA, reticulando o gelificando asf las moleculas de HA impregnadas para atraparlas e incorporarlas dentro de la matriz de la fascia. La composicion y la qmmica del HA reticulado con ditiramina preferida se desvela en las patentes de EE.UU. N.° 6.982.298, 7.368.502 y 7.465.766, cuyos contenidos se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad.

Brevemente, segun las publicaciones incorporadas, puede prepararse un HA reticulado u otra red macromolecular de policarboxilato o poliamina mediante acoplamiento covalente de compuestos que contienen hidroxifenilo, que incluyen, pero no se limitan a, tiramina, mediante sus grupos amina primaria a grupos carboxilo sobre las macromoleculas de cadena larga mediante una reaccion mediada por carbodiimida. Los grupos hidroxifenilo pueden anadirse a las macromoleculas periodicamente o al azar a lo largo de su longitud mediante una reaccion qmmica. En el presente documento, la macromolecula de cadena larga es preferentemente HA, que tiene grupos acido carboxflico periodicos a lo largo de su longitud y se prefiere para facilitar varios efectos deseables (descritos anteriormente) mas alla del uso de MEC derivada no aumentada sola como parche usado para reparar defectos del tejido. Los grupos hidroxifenilo se proporcionan como parte de moleculas mas pequenas que tienen grupos amina primaria que pueden unirse a los atomos de carbono carboxilo de un grupo acido carboxflico sobre las macromoleculas de HA mediante la via carbodiimida. Las reacciones se describen en detalle en las publicaciones incorporadas anteriormente.

Cuando se sustituye sobre una molecula de HA, los compuestos que contienen hidroxifenilo adecuados incluyen aquellos que tienen una amina primaria libre que puede usarse para modificar los materiales de andamiaje que tienen multiples grupos CO2 o periodicos, que incluyen tirosina (acido 2-amino-3-(4-hidroxifenil)propionico) y tiramina (tirosamina o 2-(4-hidroxifenil)etilamina).

La segunda etapa en la preparacion de la red de HA reticulado es enlazar las macromoleculas sustituidas con hidroxifenilo mediante una estructura de enlace de dihidroxifenilo. En esta etapa, los grupos hidroxifenilo unidos a diferentes moleculas de HA se enlazan usando un reactivo de peroxido en presencia de una peroxidasa. De importancia, puede producirse algun enlace de dihidroxifenilo entre diferentes grupos hidroxifenilo unidos a la misma molecula. La peroxidasa en presencia de un peroxido diluido (preferentemente H2O2) es capaz de extraer el atomo de hidrogeno del hidroxilo fenolico de compuestos que contienen hidroxifenilo (tales como tiramina), dejando al oxfgeno del hidroxilo fenolico con un unico electron sin compartir, un radical libre extremadamente reactivo. El radical libre isomeriza a uno de los dos carbonos en la posicion orto equivalentes y entonces dos de tales estructuras se dimerizan para formar un enlace covalente que reticula eficazmente las estructuras, que despues de la enolizacion genera un dfmero de dihidroxifenilo, por ejemplo, un enlace dihidroxifenilo tal como un enlace ditiramina. Peroxidos adecuados incluyen peroxido de hidrogeno. La peroxidasa es preferentemente peroxidasa de rabano picante (HRP). Alternativamente, puede usarse cualquier otra enzima adecuada u otro agente que sea capaz de generar radicales libre para la reticulacion de macromoleculas de cadena larga que contienen grupos hidroxifenilo. Considerando la enzima peroxidasa en mas detalle, la peroxidasa puede tanto formar radicales hidroxifenilo requeridos para la reticulacion mediante la interaccion de grupos hidroxifenilo en el sitio activo enzimatico para crear directamente los radicales deseados, como mediante generacion de radicales superoxido, que entonces difunden de la enzima e interaccionan con grupos hidroxifenilo para generar los radicales deseados. Otros compuestos que tienen el potencial de producir el mismo efecto incluyen cualquier compuesto que contenga porfirina, que incluye la familia de peroxidasa, hemoprotemas, o los compuestos de clorina estructuralmente relacionados. Tambien pueden usarse varios otros iniciadores de radicales libres para reticular las macromoleculas de cadena larga modificadas con hidroxifenilo, como se describe en detalle en las publicaciones incorporadas anteriormente.

Volviendo a los parches de MEC derivada aumentados desvelados aqm, preferentemente las moleculas de HA de alto peso molecular que van a incorporarse en la fascia lata u otra MEC derivada adecuada tienen un peso molecular promedio de 250 kDa o mayor, mas preferentemente 500, 800 o 900 KDa o mayor, mas preferentemente 1 MDa o mayor. Preferentemente, la tasa de sustitucion de tiramina sobre las moleculas de HA es aproximadamente o inferior al cinco por ciento basado en los sitios de sustitucion disponibles como se desvela en las publicaciones anteriormente mencionadas. Se desea que la sustitucion de tiramina sobre las moleculas de HA se complete antes de impregnar la MEC derivada. Las macromoleculas de HA sustituidas del peso molecular deseado (preferentemente superior a 250 kDa como se observa anteriormente) se impregnan entonces dentro de la MEC derivada mediante una tecnica adecuada, tal como difusion pasiva como se observa anteriormente. Posteriormente, una vez se ha logrado el grado deseado de carga de TS-HA (por ejemplo ~1-2 %), la MEC impregnada con TS-HA se sumerge en una solucion que incluye peroxido de hidrogeno diluido y la enzima apropiada, por ejemplo HRP, para promover y facilitar la reaccion de reticulacion para generar enlaces dihidroxifenilo (por ejemplo, ditiramina),

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

para as^ conectar las macromoleculas de HA impregnadas para producir una red macromolecular conectada dentro de la MEC derivada. La sumersion descrita aqu puede hacerse tanto una vez el parche impregnado con TS-HA se ha cortado a las dimensiones deseadas para la reparacion prevista, como puede hacerse usando una hoja mas grande del material, que puede cortarse posteriormente al tamano segun se necesite para las reparaciones particulares.

Las bajas tasas de sustitucion de tiramina descritas anteriormente permiten que el HA se reticule de forma discreta mientras que mantiene la mayona de las moleculas de HA en su conformacion nativa como se demuestra por la union positiva de la protema de union a hialuronano (FIG. 5 descrita en los ejemplos mas adelante). Ademas de preservar el HA dentro de la MEC derivada, la reticulacion como se ha descrito anteriormente puede inhibir o suprimir la rotura de HA dentro de moleculas de peso molecular relativamente mas bajo.

Hasta ahora se ha descrito el parche de MEC derivada aumentado por HA, conjuntamente con la FIG. 1, como que se aplica sobre una reparacion quirurgica existente para unir o volver a unir tejidos rasgados o separados adyacentes. Como ya se ha explicado, en esta realizacion, el parche sirve para reforzar la reparacion quirurgica directamente en el defecto, con beneficios adicionales realizados como resultado de incorporar la red de HA macromolecular reticulada en el parche. En una realizacion alternativa, el parche desvelado en el presente documento tambien puede usarse como material de enlace en el caso en el que el hueco entre tejidos separados o rasgados, tales como un tendon y el hueso asociado, sea demasiado grande para repararse convencionalmente, por ejemplo, mediante sutura directa de los tejidos. Esto puede ocurrir, por ejemplo, cuando ya no hay tejido nativo suficiente para cerrar el desgarro o hueco para poner porciones opuestas en contacto para la sutura. En una realizacion mostrada esquematicamente en la FIG. 4, un parche de MEC derivada, preferentemente aumentado con HA impregnado y reticulado como se ha descrito anteriormente, se incorpora en la interfase hueso-tendon y se fija en ambos de sus extremos respectivos para conectar un hueco que de otro modo es demasiado ancho para ser reparado convencionalmente. En esta realizacion, el parche de MEC derivada se integrara el mismo en tanto el hueso como el tendon para actuar de conexion sustituta de tendon-hueso, esencialmente reparar lo que tradicionalmente habna sido un hueco o desgarro irreparable. Debido a que la fascia lata tiene propiedades muy similares al tendon, ya es muy adecuada para funcionar en esta funcion como la MEC derivada del parche. Ademas, el HA atrapado (reticulado) puede promover la integracion de fascia lata al hueso y/o al tendon por motivos ya tratados, que facilitana la formacion de un puente funcional.

Aunque la MEC impregnada con HA de la fascia lata se ha descrito principalmente con respecto a la reparacion del manguito de los rotadores, se apreciara que metodos similares y materiales como se describen aqrn tambien podnan adaptarse a otras reparacion de tendon del hueso, reparaciones de otros tejidos conjuntivos (tales como ligamentos o ligamento al hueso), reparaciones de tejido blando tales como reparacion de musculos lacerados o transferidos, ademas de otras reparaciones en las que un defecto o hueco de tejido se ha producido tanto mediante lesion (tal como una hernia) como quirurgicamente. En estos casos, una matriz de MEC derivada impregnada con HA e incorporada (mediante reticulacion), tal como fascia lata, que puede prepararse y suministrarse en forma de un parche que tiene dimensiones apropiadas, puede aplicarse sobre el defecto (por ejemplo, desgarro) tanto para formar un puente de tejido que puede incorporarse y remodelarse mediante la propia respuesta de consolidacion del implante dentro de tejido apropiado para completar la reparacion, como para reforzar una reparacion quirurgica entre los tejidos adyacentes mientras se consolida. La presencia del HA de alto peso molecular atrapado en la MEC derivada debe potenciar la respuesta de remodelacion del implante para incorporar la MEC derivada (por ejemplo, fascia) dentro de tejidos nativos, y debe suprimir una respuesta inflamatoria que puede interferir con la consolidacion.

Aunque el parche de MEC derivada que tiene HA impregnado y reticulado pueden reforzar un sitio de reparacion, la reparacion todavfa puede ser propensa a fallo antes de que se produzca la consolidacion biologica debido a las suturas que se desgarran tanto a traves del tendon como el hueso, o a traves del propio material de MEC (tal como la fascia lata). Por tanto, tambien son deseables etapas adicionales para inducir la integracion funcional en el sitio de reparacion tan rapidamente como sea posible, independiente de las suturas. La aplicacion de estas etapas puede ser deseable para reparaciones como se representa esquematicamente en las FIG. 1 y FIG. 4. Para este fin, se cree que un gel hecho de tiramina-colageno reticulado senan util, por ejemplo, si se inyecta entre el parche de MEC y el tejido subyacente que va a repararse, o entre el tendon del implantado y el hueso u otro tejido separado en el sitio de reparacion, mientras que se sutura o despues de que la sutura sea completa. Al igual que el HA, el colageno es una molecula de policarboxilato capaz de sustituirse con tiramina u otros grupos hidroxifenilo para facilitar el enlace ditiramina (dihidroxifenilo). Qrnmica apropiada se describe en detalle en las publicaciones incorporadas anteriormente. La forma del colageno que va a sustituirse con tiramina oscila de colageno recombinante altamente purificado a colageno que es un componente de un extracto de tejido tal como gelatina. Para preparar un gel de colageno adecuado para la presente solicitud, se usa preferentemente colageno que tiene un peso molecular promedio superior a 50 kDa, mas preferentemente 100 kDa. En esta realizacion, el colageno sustituido con tiramina (“TS-colageno”) se reticula preferentemente in situ entre los tejidos suturados opuestos que permiten que el TS- colageno penetre en tejidos opuestos a medida que se reticula. El TS-colageno se reticulana entonces (o gelificana) alrededor de los tejidos existentes y posiblemente se reticulana con residuos de tirosina existentes dentro de los tejidos de un modo similar a la integracion de TS-HA con protemas que pueden estar presentes dentro de la MEC de la fascia lata, o dentro de otra MEC derivada en el parche como se ha descrito anteriormente. El uso de TS-colageno

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

puede optimizar de este modo la integracion de los tejidos opuestos, sirviendo de tanto un pegamento como posiblemente de un agente inductivo para la reparacion.

Aunque la reticulacion de tanto el HA como el colageno descrito en el presente documento se logra preferentemente mediante enlaces ditiramina como se ha mencionado anteriormente y descrito mas completamente en las publicaciones incorporadas, se contempla que tambien pueden usarse otros enlaces dihidroxifenilo, por ejemplo, mediante sustitucion y enlace mediado por carbodiimida de aductos de hidroxifenilo adecuados sobre las cadenas de HA o de colageno. Esto tambien se describe adicionalmente en las publicaciones incorporadas. La incorporacion directa de celulas, biologfas y otros principios activos (tales como farmacos u otros compuestos terapeuticos) dentro de las redes macromoleculares de TS-HA o TS-colageno para inducir la consolidacion tambien se contempla como se describe en las publicaciones incorporadas.

Aunque los presentes metodos y parche se describen principalmente con respecto a aumentar la MEC de la fascia lata como la MEC derivada como se desvela en el presente documento, debe reconocerse que los metodos y composiciones descritos en el presente documento pueden aplicarse analogamente para incorporar TS-HA dentro de otros materiales de MEC ademas de la fascia, tal como dermis, submucosa del intestino delgado, pericardio, o incluso otros materiales de andamiaje derivados de biomateriales polimericos (es decir, materiales derivados de animal). Ademas, los metodos anteriores se han desvelado principalmente a proposito de impregnar e incorporar macromoleculas de HA dentro de la MEC derivada. Las moleculas de HA se reticulan enlazando aductos de hidroxifenilo, preferentemente tiramina, unidos a aquellas moleculas para generar una red de HA conectada que es retenida en la matriz de MEC derivada. La matriz de MEC reticulada resultante, por consiguiente, difunde fuera de la matriz mas lentamente, aumentando la duracion de tiempo durante la consolidacion cuando esta presente para producir efectos beneficiosos. Se contempla que otras macromoleculas de policarboxilato o poliamina distintas de HA, que se prestan ellas mismas a la sustitucion con aductos de hidroxifenilo, seguido de enlace mediante la qmmica anteriormente descrita, puede incorporarse en un parche de MEC derivada, tal como un parche de fascia lata, mediante metodos analogos como se desvela para HA para producir efectos deseables o terapeuticos correspondientes asociados a aquellas otras macromoleculas. Macromoleculas de policarboxilato o poliamina alternativas (distintas de HA) que pueden impregnarse dentro de una matriz de MEC derivada y luego reticularse mediante enlace de aductos de hidroxifenilo encima pueden incluir moleculas de o basadas en otros glucosaminoglicanos (tales como heparina) y protemas (tales como colagenos). Tales otras macromoleculas de policarboxilato o poliamina, que proporcionan o pueden proporcionar efectos deseables asociados, pueden incorporarse en la matriz de MEC derivada mediante metodos similares desvelados para HA en el presente documento y en las publicaciones incorporadas. En otra alternativa, las macromoleculas que ya poseen grupos laterales hidroxifenilo nativos pueden incorporarse en una matriz de MEC derivada y entonces reticularse para formar enlaces dihidroxifenilo entre grupos laterales hidroxifenilo nativos. En este caso, la etapa de sustituir grupos que contienen hidroxifenilo sobre la macromolecula puede omitirse, debido a que tales grupos ya estan presentes.

En resumen, en un amplio aspecto se desvela una matriz de MEC derivada que incorpora una red macromolecular reticulada conectada dentro de la MEC derivada, red que incluye macromoleculas de policarboxilato o de poliamina que han sido sustituidas con aductos de hidroxifenilo y reticuladas mediante enlaces dihidroxifenilo. En un aspecto preferido, la matriz de MEC es fascia lata, preferentemente MEC de fascia lata humana, y las moleculas de policarboxilato o de poliamina sustituidas con hidroxifenilo son moleculas de HA sustituidas con tiramina que se han reticulado mediante enlaces ditiramina, para conectar una red de HA macromolecular dentro de la matriz de la fascia lata derivada. La matriz resultante se corta o se forma dentro de dimensiones adecuadas que van a usarse como parche, tanto para reforzar la reparacion quirurgica de un defecto o hueco de tejido, como para reparar el defecto como en el caso de un hueco que es demasiado amplio para la reparacion basada en sutura convencional. Se contempla que es particularmente util un parche compuesto de MEC derivada de la fascia lata que incorpora HA en forma de un red macromolecular que se reticula mediante enlaces ditiramina y asf se conecta mecanicamente y se retiene dentro de la MEC en la reparacion de desgarros del manguito de los rotadores, ademas de otras reparaciones de tendon al hueso o tejido conjuntivo.

Aspectos y caractensticas todavfa adicionales de la invencion seran evidentes de los siguientes ejemplos, que se proporcionan a modo de ilustracion y no limitacion.

Ejemplo 1

Se obtuvo fascia lata humana acelularizada de la Musculoskeletal Transplant Foundation (Edison, NJ). Antes del transporte, la fascia se proceso segun un procedimiento publicado, como se desvela en el documento WO/2006/101885, fecha de publicacion de 28 de septiembre de 2006, con modificaciones, denominado despues en el presente documento “pre-procesamiento estandar”. Espedficamente, el proceso modificado usado por la Musculoskeletal Transplant Foundation comprendfa las siguientes etapas: (1) aislar fascia de un donante adecuado; (2) procesar la fascia que incluye inspeccion de defectos visuales, corte e impregnacion del tejido en solucion salina tamponada con fosfato (PBS) y aclarado de la misma con PBS esteril; (3) impregnar el tejido en una composicion de antibiotico y aclarar el mismo multiples veces en PBS esteril; (4) procesar el tejido cortando el tejido a tamano; y (5) congelar el tejido en PBS esteril a -20 °C y transporte sobre nieve carbonica.

5

10

15

20

25

30

35

40

El HA se impregno en fascia lata del siguiente modo. Se liofilizaron muestras de aproximadamente 4x4 cm de fascia lata durante al menos 24 horas. Tras la liofilizacion, las muestras individuales de la fascia se rehidrataron en una solucion al 0,75 % (peso/volumen) de TS-HA (correspondiente a un porcentaje en masa-volumen, de forma que la solucion incluye 0,75 g de TS-HA por 100 ml) (~1,5 ml/cm2) durante 24 horas a 37 °C en un agitador. El peso molecular de TS-HA usado fue 900 kDa - 1 MDa. La tasa de sustitucion de tiramina fue ~5 %. Despues de la impregnacion de la fascia con TS-HA, la fascia se aclaro del TS-HA en exceso con agua de alta pureza durante ~30 segundos y se seco dos veces por lavado. Para reticular el TS-HA, la fascia se sumergio en una solucion al 0,3 % de peroxido de hidrogeno durante ~30 segundos y se incubo durante la noche a 4 °C para permitir que la reaccion continuara. Posteriormente, la fascia se aclaro del exceso de peroxido de hidrogeno con agua de alta pureza durante ~30 segundos y se liofilizo. Las muestras no reticuladas se sumergieron en agua de alta pureza durante ~30 segundos, se incubaron durante la noche a 4 °C, se aclararon y se liofilizaron. Los controles de agua se trataron por incubacion en agua de alta pureza durante 24 horas a 37 °C en un agitador, se sometieron a peroxido de hidrogeno, y posteriormente se liofilizaron.

Se uso electroforesis en hidratos de carbono asistida por fluoroforo (FACE) para cuantificar el contenido de HA de las muestras de fascia tratadas, segun Calabro A. et al., Microanalysis of enzyme digests of hyaluronan and chondroitin/dermatan sulfate by fluorophore-assisted carbohydrate electrophoresis (FACE), Glycobiology 2000, 10(3), pp. 273-81; y Calabro A., Adaptation of FACE methodology for microanalysis of total hyaluronan and chondroitin sulfate composition from cartilage, Glycobiology 2000, 10(3): 283-293. Los resultados se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1.

Analisis de electroforesis en hidratos de carbono asistida por fluoroforo (FACE) del contenido de HA en fascia de 4x4 cm tratada por difusion (PRE-PROCESAMIENTO ESTANDAR).

Grupo de tratamiento: Contenido de TS-HA promedio (pg/mg) Intervalo (pg/mg) Tamano de la muestra

Tratado con agua: 0,07 ± 0,04 0,10-0,04 2 injertos, cada uno representado por el promedio de 4 submuestras

0,75 % con reticulacion: 14,2 ± 6,8 4,4-26,9 8 injertos, cada uno representado por el promedio de 2-5 submuestras

0,75 % sin reticulacion: 14,6 ± 3,2 10,14-18,4 6 injertos, cada uno representado por el promedio de 2-3 submuestras

Segun un enfoque alternativo, se pre-proceso fascia lata segun el metodo de la publicacion WO/2006/101885 (es decir, pre-procesamiento estandar), excepto que las muestras de fascia lata tuvieron 1x1 cm. Los tratamiento de difusion de la fascia lata se evaluaron basandose en soluciones de TS-HA que fueron 0,5, 0,75, o 1 % (peso/volumen). Se uso FACE para cuantificar el contenido de HA de las muestras de fascia tratadas, segun las publicaciones de Calabro anteriormente mencionadas. Los resultados se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2.

Analisis de electroforesis en hidratos de carbono asistida por fluoroforo (FACE) del contenido de HA en fascia de 1x1 cm tratada por difusion (PRE-PROCESAMIENTO ESTANDAR).

0,5 % con reticulacion: 2,5 ± 1,4 0,6-5,1 15

0,75 % con reticulacion: 6,9 ± 3,0 2,2-10,8 11

1 % con reticulacion: 12,1 ± 4,1 8,3-17,3 5

Segun otro enfoque alternativo, se preproceso fascia lata segun el metodo de la publicacion WO/2006/101885, con modificaciones. Espedficamente, se preparo fascia lata en masa y se transporto (denominado despues en el presente documento “pre-procesamiento en masa”). La fascia en masa es fascia que se procesa segun el documento WO/2006/101885, excepto que el tejido se somete a solo 4 horas de impregnacion en antibiotico en vez de las 24 horas completas. Tras la recepcion de la fascia lata en masa transportada, el proceso de impregnacion en antibiotico continuo internamente sometiendo la fascia a una impregnacion adicional de 20 horas antes de la congelacion y liofilizacion. Adicionalmente, la fascia en masa se limpio internamente del exceso de tejido conjuntivo suelto y grasa. La fascia lata en masa (~4x4 cm) se trato entonces usando 0,75 % (peso/volumen) de solucion de TS-HA. Se uso FACE para cuantificar el contenido de HA de las muestras de fascia tratadas, segun las publicaciones de Calabro anteriormente mencionadas. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

5

10

15

20

25

30

35

TABLA 3.

Analisis de electroforesis en hidratos de carbono asistida por fluoroforo (FACE) del contenido de HA en fascia de 4x4 cm tratada por difusion (PRE-PROCESAMIENTO EN MASA).

0,75 % con reticulacion: 10,4 7,6-13,2 2 injertos, cada uno representado por el promedio de 6 submuestras

Segun otro enfoque alternativo, se preproceso fascia lata segun el metodo de la publicacion WO/2006/101885, con modificaciones. Espedficamente, se trato fascia lata en masa que no se sometio a liofilizacion antes de la impregnacion en TS-HA (denominado despues en el presente documento “en masa, no liofilizada, pre- procesamiento”). En su lugar, la fascia se mantuvo hidratada en PBS a 4 °C hasta que se sometio a tratamiento con TS-HA. La fascia (~4x4 cm) se trato usando 0,75 % (peso/volumen) y 2 % (peso/volumen) de soluciones de TS-HA. Se uso FACE para cuantificar el contenido de HA de las muestras de fascia tratadas, segun las publicaciones de Calabro anteriormente mencionadas. Los resultados se muestran en la Tabla 4.

TABLA 4.

Analisis de electroforesis en hidratos de carbono asistida por fluoroforo (FACE) del contenido de HA en fascia de 4x4 cm tratada por difusion (EN MASA, NO LIOFILIZADA, PRE-PROCESAMIENTO).

0,75 % con reticulacion: 2,0 NA 1 injerto, cada uno representado por el promedio de 12 submuestras

2 % con reticulacion: 4,9 NA 1 injerto, cada uno representado por el promedio de 6 submuestras

En un metodo de analisis adicional, muestras de fascia tratadas con TS-HA (1x1 cm, difusion, pre-procesamiento estandar) se rehidrataron en 0,2 ml de solucion salina durante 5 minutos y se incorporaron en el compuesto Tissue- Tek(R) OCT. Se cortaron y tineron secciones congeladas longitudinales de cinco micrometros con protema de union a HA biotinilada (HABP, Calbiochem, San Diego, CA) y estreptavidina conjugada con Alexa Fluor(R) 488 (Molecular Probes, Carlsbad, CA) para visualizar la distribucion de TS-HA en el tejido. La tincion con HABP demostro la incorporacion de TS-HA a traves de la profundidad del tejido, principalmente alrededor de los haces de fasdculos grandes (FIG. 5). La flecha en la FIG. 5B indica la tincion de TS-HA. Se desea que el HA anadido se distribuya a traves de la fascia, en vez de estratificarse a una alta concentracion sobre la superficie, para promover beneficios mas uniformes de la incorporacion de HA, tales como la supresion de una respuesta inflamatoria. Ademas, la union de HABP demuestra que TS-HA sigue biologicamente activo despues de la reticulacion.

Ejemplo 2

Un metodo para la impregnacion de fascia lata con HA basado en vado es el siguiente. Fascia lata, pre-procesada segun tanto los metodos estandar como en masa, como se describe en el Ejemplo 1 anteriormente, se liofilizo durante al menos 24 horas. Tras la liofilizacion, la fascia se corto dentro de muestras de 3 cm de diametro y se rehidrato en agua de alta pureza durante ~10 minutos. Entonces se montaron muestras individuales de fascia lata sobre la plataforma de un sistema de filtracion modificado Millipore Steriflip®. El recipiente superior se lleno con ~10 ml de solucion de TS-HA y se aseguro al sistema de filtracion. Se aplico vado y la solucion de TS-HA se empujo a traves de la fascia lata. Esto se repitio para aumentar el numero de pases de solucion a traves de la fascia lata. Las concentraciones evaluadas fueron del 0,5, 0,75, 1 % (peso/volumen), y concentraciones crecientes. Se uso FACE para cuantificar el contenido de HA de las muestras de fascia tratadas, segun las publicaciones de Calabro anteriormente mencionadas. Los resultados se muestran en la Tabla 5.

TABLA 5.

Analisis de electroforesis en hidratos de carbono asistida por fluoroforo (FACE) de contenido de HA en fascia de 3 cm de diametro tratada a vado.

Grupo de tratamiento: Pre-procesamiento de la fascia Contenido de TS-HA promedio (pg/mg) Intervalo (pg/mg) Tamano de la muestra

0,5 %, 8 pases, con reticulacion: En masa 1,9 ± 0,5 1,4-2,3 3 injertos, cada uno representado por el promedio de 2 submuestras

0,75 %, 1 pase, con reticulacion: En masa 3,0 ± 1,0 1,8-4,5 6

1 %, 2 pases, con reticulacion: En masa 12,6 ± 5,1 6,7-16 3

1 %, 8 pases, con reticulacion: En masa 16,0 ± 8,4 7,4-24,2 3

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Analisis de electroforesis en hidratos de carbono asistida por fluoroforo (FACE) de contenido de HA en fascia de 3 cm de diametro tratada a vacm.

Concentraciones crecientes, 2 pases por concentracion, con reticulacion: Estandar 1,4 ± 0,8 0,7-2,3 3 injertos, cada uno representado por el promedio de 2 submuestras

Ejemplo 3

Un metodo para la impregnacion de fascia lata con HA basado en centrifugacion es el siguiente. Se recibio fascia lata, pre-procesada segun el metodo convencional como se describe en el Ejemplo 1 anterior, liofilizada, se corto en muestras de 1 cm de diametro, y se rehidrato en agua de alta pureza durante ~10 minutos. Se colocaron muestras individuales de la fascia dentro de un dispositivo de filtro centnfugo correspondiente a un tubo Centricon® de Millipore y se cubrieron con 1,5 ml de solucion de HA (para este ejemplo, no TS-HA). El tubo Centricon se centrifugo entonces a 5000 g durante ~1 hora. El “filtrado” de la solucion se dispuso de nuevo dentro del tubo Centricon y la centrifugacion se repitio una vez mas. La concentracion evaluada fue concentraciones crecientes (0,05^0,1^0,2^0,5% (peso/volumen)). Para visualizar la distribucion de HA en muestras de la fascia, las muestras se rehidrataron en 0,2 ml de solucion salina durante 5 minutos y se incorporaron en el compuesto Tissue- Tek® OCT. Se cortaron secciones congeladas longitudinales de cinco micrometres y se tineron con protema de union a HA biotinilada (HABP, Calbiochem, San Diego, CA) y estreptavidina conjugada con Alexa Fluor(R) 488 (Molecular Probes, Carlsbad, CA). La tincion con HABP demostro la incorporacion de HA a traves de toda la profundidad del tejido, similar a la FIG. 5.

Ejemplo 4

Se realizo un experimento para evaluar la respuesta del huesped a MEC de fascia enriquecida en TS-HA en un modelo de pared abdominal de la rata.

Diseno experimental. Se corto una fascia lata humana celularizada en muestras de 1x1 cm y se distribuyo dentro de tres grupos de tratamiento: TS-HA con reticulacion, HA sin reticulacion, o controles no tratados. Las muestras se trataron de una manera similar a como se describe en el Ejemplo 1. En la cirugfa, los injertos de la fascia se rehidrataron y se implantaron dentro de un defecto de espesor parcial de una vaina anterior de 6 ratas, n=2 por grupo, como se describe en la siguiente seccion. Se proporcionan detalles adicionales en la siguiente referencia: Valentin JE et al., Extracellular matrix bioscaffolds for orthopaedic applications. A comparative histologic study. J. Bone Joint Surg. [Am.] 2006;88(12):2673-86. A las cuatro semanas, las ratas se sacrificaron y el injerto y musculo de alrededor se recogieron por histologfa. La densidad celular dentro del injerto se cuantifico usando tecnicas de procesamiento de imagenes detalladas mas adelante. La inflamacion se evaluo cualitativamente por un patologo certificado por el colegio.

Modelo de defectos de la pared abdominal de rata. Se usaron ratas Lewis macho adultas (450-600 g). Las ratas se anestesiaron y se prepararon para cirugfa esteril. Mediante una incision de la lmea media ventral, se creo un defecto de 1x1 cm de espesor parcial en la vaina anterior adyacente a la lmea alba. Se elimino la vaina anterior y el musculo recto subyacente, la fascia transversal y el peritoneo se dejaron intactos. Se rehidrato un parche de mEc de fascia de 1x1 cm en solucion salina durante diez minutos y a continuacion se aseguro dentro del defecto usando cuatro suturas de esquina de 5-0 Prolene. El asegurar la fascia teoricamente permitio que el parche de MEC se sometiera a las fuerzas mecanicas suministradas por la musculatura de la pared abdominal nativa adyacente. Se cerro la incision de la piel y se dejo que los animales se recuperaran de la anestesia bajo una lampara calefactora antes de devolverse a las jaulas individuales durante la duracion del estudio.

Procesamiento y analisis histologico. En la eutanasia, se recogieron el injerto de la fascia y el musculo de alrededor, se fijaron en 4 % de paraformaldehudo y se procesaron rutinariamente para incorporacion en parafina. Se cortaron secciones longitudinales de cinco micrometros de espesor de cada muestra y se tineron con hematoxilina y eosina (H&E). Las imagenes de RGB de las secciones de H&E se adquirieron usando una camara digital Retiga 2000R CCD (1600x1200 pfxeles, Q-Imaging, Burnaby, B.C., Canada) unida a un microscopio vertical Leica DM 4000 (Heidelberg, Alemania) provisto de un objetivo 10X. La adquisicion de imagenes fue completamente automatizada usando una platina motorizada en X, Y, Z (Prior Scientific, Rockland, MA) dirigida por el controlador por Objective Imaging's Oasis 4i (Kansasville, MI) y el software Imagen-Pro 6.0 (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Las imagenes se capturaron de la longitud entera y la anchura de cada muestra y se tejieron dentro de un unico montaje Se uso Imagen-Pro para contar los nucleos tenidos con hematoxilina y determinar el area de tejido respectiva sobre tres secciones por rata. La inflamacion se evaluo cualitativamente por un patologo certificado por el colegio sobre una seccion por rata.

Resultados: Numero de celulas en MEC de fascia. A las cuatro semanas, el aspecto histologico de la fascia en todos los grupos presento caractensticamente una periferia altamente celular y menos celulas en la porcion central del

5

10

15

20

25

30

35

40

45

injerto (FIG. 6). Se indican el injerto de fascia y las capas de musculo subyacente (FIG. 6). Estuvo presente aumento de celularidad dentro de la fascia en los grupos tratados con HA (FIG. 6B-C) en comparacion con la fascia sin tratar (FIG. 6A). Se contaron las celulas de una region de interes manualmente seleccionada sobre las imagenes montadas que incluyeron el injerto de fascia entero (~4 mm2). Las densidades celulares se muestran en la Tabla 6. Debido al pequeno tamano de la muestra en este estudio, se usaron las seis medidas de las dos ratas para cada grupo para las comparaciones estadfsticas preliminares usando analisis de la varianza. A las cuatro semanas, la densidad celular dentro de injertos tratados con TS-HA (2859 ± 295 celulas/mm2) fue significativamente superior a la de injertos no tratados (2102 ± 545 celulas/mm2) (p=0,02). La densidad celular dentro de injertos tratados con HA no reticulado (2724 ± 662 celulas/mm2) puede tambien demostrar que es diferente de los injertos no tratados (p=0,06) cuando se evalua en un tamano mayor de la muestra.

TABLA 6.

Densidad celular dentro de los injertos de fascia despues de 4 semanas desde la implantacion en un modelo de pared abdominal de la rata.

Grupo de tratamiento: Numero de rata Seccion N.° 1 celulas/mm2 Seccion N.° 2 celulas/mm2 Seccion N.° 3 celulas/mm2 Promedio por rata DE por rata Promedio por grupo (n=2 ratas)

Control de agua: 1 2324 1537 1972 1944 394 2102

2: 2998 2213 1568 2260 716

TS-HA con reticulacion: 3 3255 2959 3109 3108 148 2859

4: 2664 2492 2677 2611 103

TS-HA sin reticulacion: 5 3752 2887 3155 3265 443 2724

6: 2089 2111 2350 2183 145

Resultados: Inflamacion cronica en MEC de fascia. Portaobjetos de cada una de las seis ratas se cegaron y se clasificaron en dos ocasiones separadas por un periodo de dos meses por un patologo certificado por el colegio. Los portaobjetos se clasificaron para “inflamacion cronica” en y alrededor del injerto, como se define principalmente por la presencia de linfocitos y celulas plasmaticas. Las clasificaciones se muestran en la Tabla 7. Hubo variabilidad en el grado de inflamacion observado en el grupo de tratamiento con HA sin reticulacion. Basandose en estas clasificaciones se sugiere que el tratamiento con TS-HA mas reticulacion esta asociado a la menor inflamacion cronica de los tres grupos. Sin embargo, debe observarse que la evaluacion se limito por una incapacidad para distinguir con certeza linfocitos de macrofagos. Observese que se considero que la Rata 5 terna el grado de inflamacion mas alto (TABLA 7) y el mayor numero de celulas (TABLA 6), mientras que la Rata a 4 tuvo la menor inflamacion, pero todavfa un alto numero de celulas. Este resultado sugiere que los tipos de celulas que constituyen los recuentos totales de celulas en cada grupo podnan ser diferentes y probablemente reflejar un intento por el patologo para distinguir inflamacion cronica (linfocitos y celulas plasmaticas) de macrofagos y celulas del estroma en las clasificaciones.

TABLA 7.

Clasificacion de inflamacion cronica. Los portaobjetos se clasificaron para linfocitos y celulas plasmaticas en y alrededor del injerto de la fascia; las clasificaciones se repitieron dos veces, 1 = maximo, 6=minimo.______________________________________________________________

Grupo de tratamiento: Numero de rata Clasificacion de inflamacion (2 repeticiones)

Control de agua: 1 2, 2

2: 3, 4

TS-HA con reticulacion: 3 4, 3

4: 6, 6

HA sin reticulacion: 5 1, 1

6: 5, 5

Discusion. Estos datos son importantes debido a que demuestran el uso del modelo de pared abdominal de la rata para evaluar la respuesta del huesped a andamiajes de MEC de fascia. Ademas, estos datos sugieren que el tratamiento con HA aumentara el numero total de celulas en MEC de fascia en comparacion con fascia sin tratar. Estos datos tambien proporcionan la base para la hipotesis de que la fascia enriquecida con TS-HA mas reticulacion se asociara a menos linfocitos y celulas plasmaticas, pero a numero similar de macrofagos y celulas gigantes en comparacion con fascia enriquecida con TS-HA sin reticulacion o fascia tratada con agua. Finalmente, estos datos demuestran la necesidad de identificacion positiva de tipos de celulas con el fin de interpretar definitivamente el efecto del tratamiento con HA sobre la respuesta del huesped.

Ejemplo 5

Se realizo un experimento para evaluar la liberacion in vitro de TS-HA de MEC de fascia enriquecida con TS-HA.

Diseno experimental. Se trato fascia lata humana pre-procesada estandar (4x4 cm) con TS-HA con o sin reticulacion usando los metodos de difusion descritos en el Ejemplo 1 (n=2 por grupo experimental). A partir de cada injerto, se corto una muestra de 0,8x1 cm. Las muestras de fascia se rehidrataron en 1,2 ml de PBS y se incubaron durante 72 horas a 37 °C en un agitador. Despues de las 72 horas, se liofilizaron trozos de la fascia y el contenido de TS-HA se 5 midio con FACE. El contenido de TS-HA inicial de las muestras incubadas se estimo a partir del promedio de varios trozos pequenos mostrados sobre el injerto de 4x4 cm entero que no se incubaron, usando FACE segun las publicaciones de Calabro anteriormente mencionadas.

Resultados: Liberacion in vitro de TS-HA de fascia tratada con TS-HA. El porcentaje promedio de liberacion de TS- 10 HA despues de 72 horas en PBS de fascia tratada con TS-HA con reticulacion fue del 73 % (n=2, con resultados de 70,1 % y 76,6% de liberacion). El porcentaje promedio de liberacion de TS-HA despues de 72 horas en PBS de fascia tratada con TS-HA sin reticulacion fue del 81 % (n=2 con, resultados del 82,8 % y 78,5 % de liberacion).

Discusion. Estos datos sugieren que la reticulacion ralentizara la liberacion de TS-HA de MEC de fascia en 15 comparacion con sin reticulacion. Experimentos adicionales y un mayor tamano de la muestra son deseables para determinar si tiempo de reticulacion mas largo (sumergimiento en solucion de peroxido con HRP) atrapara adicionalmente las moleculas de TS-HA en la MEC de fascia y ralentizara su liberacion a un grado incluso mayor.

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

REIVINDICACIONES

1. Una composicion que comprende matriz extracelular derivada de ser humano o animal que tiene incorporada en su interior una red macromolecular que comprende macromoleculas de policarboxilato, poliamina o polihidroxifenilo que se han reticulado mediante enlaces dihidroxifenilo, estando dicha red macromolecular conectada dentro de dicha matriz extracelular derivada.
2. La composicion de la reivindicacion 1, estando dicha matriz extracelular derivada del grupo que consiste en fascia lata, dermis, submucosa del intestino delgado y pericardio.
3. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo dichas macromoleculas macromoleculas de hialuronano.
4. La composicion de la reivindicacion 3, teniendo dichas macromoleculas de hialuronano aductos de tiramina sustituidos en ellas, comprendiendo dichos enlaces dihidroxifenilo enlaces ditiramina.
5. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 2-4, que comprende 1-2 por ciento en peso de macromoleculas de hialuronano basado en el peso de dicha fascia lata.
6. La composicion de cualquiera de las reivindicaciones 3-5, teniendo dichas macromoleculas de hialuronano un peso molecular promedio de 900 KDa o mayor.
7. Un metodo de preparacion de una composicion implantable, que comprende:

a) impregnar la matriz extracelular derivada de ser humano o animal con macromoleculas de hialuronano que tienen grupos laterales hidroxifenilo sustituidos en ellas; y

b) a partir de aqrn hacer reaccionar dichos grupos laterales hidroxifenilo para formar enlaces dihidroxifenilo, incorporando asf una red macromolecular reticulada de hialuronano que se conecta dentro de dicha matriz extracelular derivada.
8. El metodo de la reivindicacion 7, estando dicha matriz extracelular derivada seleccionada del grupo que consiste en fascia lata, dermis, submucosa del intestino delgado y pericardio.
9. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 7-8, comprendiendo dichos grupos laterales hidroxifenilo grupos laterales de tiramina, comprendiendo dichos enlaces dihidroxifenilo enlaces ditiramina.
10. El metodo de cualquiera de las reivindicaciones 7-9, comprendiendo dicha matriz extracelular derivada fascia lata, estando dicha fascia lata impregnada por dichas macromoleculas de hialuronano a una tasa de carga de 1-2 por ciento en peso basado en el peso de dicha fascia lata.
11. Un parche que comprende la composicion de cualquiera de las reivindicaciones 1-6 para su uso para reforzar una reparacion de tejido, o para reparar un defecto o hueco de tejido.
12. El parche de la reivindicacion 11, comprendiendo dicha matriz extracelular derivada fascia lata, comprendiendo dichas macromoleculas macromoleculas de hialuronano.
13. El parche de la reivindicacion 11, dichos enlaces dihidroxifenilo se obtienen reticulando grupos tiramina que estan sustituidos sobre dichas macromoleculas de hialuronano a una tasa de sustitucion de aproximadamente o inferior al 5 % basado en sitios de sustitucion disponibles.
14. El parche de la reivindicacion 11, en el que el uso comprende la aplicacion del parche sobre un defecto suturado o hueco para reforzarlo.
15. El parche de la reivindicacion 11, en el que el uso comprende disponer un gel de colageno entre dicho parche y tejidos huesped que rodean dicho defecto o hueco de tejido, siendo dicho gel de colageno proporcionado como colageno sustituido con tiramina reticulado.