ES2583552T3 - Presentación en la superficie bacteriana y cribado de péptidos que contienen puentes tioéter - Google Patents

Abstract

Una célula anfitriona grampositiva capaz de modificar de forma postraduccional un polipéptido de interés a un polipéptido que contiene residuos deshidratados o puentes tioéter, donde la célula anfitriona comprende un vector de expresión que comprende una construcción de ácido nucleico que codifica un péptido de fusión que comprende, del extremo N al extremo C, por lo menos los siguientes elementos secuenciales: (a) Una secuencia señal N terminal de lantibióticos a la que pueda reconocer una lantibiótico deshidratasa, y preferentemente también una lantibiótico ciclasa. (b) Una secuencia de aminoácidos de interés que se modificará de forma postraduccional a un polipéptido que contiene residuos deshidratados o puentes tioéter. (c) Un dominio transmural celular hidrófilo. (d) Un motivo de reconocimiento de sortasas. (e) Un dominio transmembranario hidrófobo. Y (f) Un dominio C terminal cargado de anclaje a la membrana. Y donde la célula anfitriona es una bacteria láctica que contiene las correspondientes enzimas de biosíntesis de lantibiótico y el transportador de lantibióticos.

Description

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DESCRIPCION

Presentacion en la superficie bacteriana y cribado de peptidos que contienen puentes tioeter

Esta descripcion se refiere al campo de la ingenierfa y el cribado de protefnas en busca de peptidos terapeuticamente relevantes. De forma mas especffica, se refiere a la presentacion en la superficie celular de protefnas heterologas modificadas de forma postraduccional. La presentacion heterologa de protefnas o de peptidos en la superficie de un microorganismo (por ejemplo, una bacteria) es un instrumento de investigacion util y se ha asociado con una amplia gama de aplicaciones interesantes. Vincular la funcion de la protefna o del peptido con el gen que lo codifica permite la seleccion u optimizacion de peptidos con las propiedades deseadas a partir de grandes bibliotecas combinatorias. Se han desarrollado diversos formatos de presentacion que incluyen presentacion en ribosomas, presentacion en fagos, presentacion en la superficie bacteriana y presentacion en levaduras. Probablemente, la presentacion en fagos es el sistema mas conocido.

Una de las aplicaciones mas interesantes de la presentacion en la superficie celular es la seleccion de ligandos de alta afinidad a partir de grandes bibliotecas para moleculas diana terapeuticamente interesantes. Hasta ahora, solo se han presentado peptidos lineales, peptidos cfclicos unidos por disulfuro y peptidos acoplados a un nucleo organico. Esto ha dado lugar a la identificacion de diversos peptidos utiles, entre ellos peptidos (principales) terapeuticamente eficaces. Sin embargo, se ha reconocido que la susceptibilidad proteolftica y la inestabilidad de estos peptidos es una desventaja importante para las aplicaciones terapeuticas. La introduction postraduccional de una estructura cfclica en los peptidos, por ejemplo un puente de tioeter, podrfa soslayar estos problemas de estabilidad. Sin embargo, actualmente todavfa es diffcil introducir de forma eficaz dichas estructuras en peptidos sinteticos, en especial en los peptidos grandes.

La presente descripcion pretende aportar un nuevo sistema de presentacion que permite la presentacion en la superficie celular de peptidos que contienen deshidroaminoacidos o tioeteres. Para este fin, se creo una construction singular de acido nucleico recombinante que codifica un peptido de fusion que comprende, ademas de la secuencia peptfdica que se desea ciclar, una combination de elementos funcionales especfficos. Sorprendentemente, se descubrio que se podfan producir y presentar facilmente estructuras cfclicas en la superficie de una celula anfitriona que expresara la construccion y contuviera la maquinaria biosintetica y de exportation para lantibioticos, tales como L. lactis. Mas especfficamente, la descripcion presenta la secuencia de un acido nucleico aislado que codifica un peptido de fusion que comprende, del extremo N al extremo C, por lo menos los siguientes elementos:

(a) Una secuencia serial N terminal de lantibioticos.

(b) Una secuencia de aminoacidos de interes que se modificara de forma postraduccional a un polipeptido que contiene residuos deshidratados o tioeteres.

(c) Un dominio transmural celular hidrofilo.

(d) Un motivo de reconocimiento de sortasas.

(e) Un dominio transmembranario hidrofobo.

(f) Un dominio C terminal cargado de anclaje a la membrana.

Otros aspectos de la descripcion se refieren a un vector de expresion que comprende el acido nucleico aislado, una celula anfitriona que comprende el vector de expresion y una biblioteca de celulas anfitrionas que comprenden diversas celulas anfitrionas. La descripcion tambien se puede aplicar para producir (una biblioteca de) celulas anfitrionas que expresan peptidos que contienen residuos deshidratados.

La construccion especffica de acido nucleico permite aprovechar un sistema anfitrion bacteriano para la modification enzimatica postraduccional del peptido codificado asf como para la presentacion del peptido modificado (ciclado). Otros sistemas de presentacion conocidos en la tecnica tales como la presentacion en fagos pueden, en teorfa, ser adecuados para expresar y presentar peptidos que pueden ciclarse por medios qufmicos, por ejemplo la desulfuration asistida por bases de peptidos con puentes disulfuro (Galande et al. 2003 Biopolymers 71, 534-551). Sin embargo, se observo que las condiciones alcalinas reducen fuertemente la viabilidad y la infectividad de los fagos. Por el contrario, la presente descripcion permite utilizar celulas anfitrionas grampositivas altamente robustas, en particular bacterias lacticas, que pueden soportar condiciones adversas, por ejemplo durante el cribado. Ademas, el cierre del anillo por medios qufmicos carece de especificidad estereoqufmica y regional; un peptido determinado con dos residuos L-Cys que forman un puente disulfuro producirfa una mezcla de tres peptidos diastereomeros que contienen lantionina, siendo la configuration de las lantioninas LL, LD y DL. Por el contrario, la maquinaria enzimatica de la lantionina unicamente produce estereoisomeros DL y, en el caso de multiples anillos, solo un patron anular. Ademas, no es necesario realizar etapas de reaction de coste creciente con rendimiento no definido, ya que la modificacion y la presentacion son intrfnsecas al sistema bacteriano. Aun mas, el tamano de las bacterias (lacticas) es suficientemente grande para utilizar analisis por FACS para el cribado.

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La presente invencion aporta una celula anfitriona grampositiva capaz de modificar de forma postraduccional un polipeptido de interes a un polipeptido que contiene residuos deshidratados o puentes tioeter, donde la celula anfitriona comprende un vector de expresion que comprende una construccion de acido nucleico que codifica un peptido de fusion que comprende, del extremo N al extremo C, por lo menos los siguientes elementos secuenciales:

(a) Una secuencia senal N terminal de lantibioticos a la que pueda reconocer una lantibiotico deshidratasa, y preferentemente tambien una lantibiotico ciclasa.

(b) Una secuencia de aminoacidos de interes que se modificara de forma postraduccional a un polipeptido que contiene residuos deshidratados o tioeteres.

(c) Un dominio transmural celular hidrofilo.

(d) Un motivo de reconocimiento de sortasas.

(e) Un dominio transmembranario hidrofobo. Y

(f) Un dominio C terminal cargado de anclaje a la membrana.

Y donde la celula anfitriona es una bacteria lactica que contiene las correspondientes enzimas de biosfntesis de lantibioticos y el transportador de lantibioticos.

Se ha descrito que las enzimas que sintetizan lantibioticos estan organizadas en un complejo unido a la membrana (Siegers et al. 1996. J. Biol. Chem. 271,12294-12301; Kiesau et al. 1997. J. Bacteriol. 179,1475-1481; Sahl et al. 1998. Annu. Rev. Microbiol. 52:41-7). Este complejo esta compuesto por el transportador de lantibioticos (LanT), la enzima deshidratante (LanB; tambien llamada deshidratasa) y la ciclasa (LanC). En el caso de algunos lantibioticos, una enzima bifuncional (LanM) realiza ambos pasos de deshidratacion y ciclacion. El peptido senal N terminal de lantibioticos, en los prepropeptidos sintetizados en ribosomas, es una senal de reconocimiento para las enzimas del lantibiotico, comenzando por la enzima deshidratante o la enzima que realiza la deshidratacion y la formacion del anillo. Se cree que el peptido senal se une al complejo del lantibiotico para poner al prepropeptido en estrecha proximidad con las enzimas del lantibiotico. Los complejos enzimaticos sugieren que es necesario que las enzimas deshidratante y de formacion del anillo esten unidas al transportador debido a que, de otra forma, se exportarfa un prepropeptido de lantibiotico sin sufrir modificacion o, como alternativa, se acumularfa en la celula un peptido modificado.

En la mayorfa de los casos, la traslocacion del lantibiotico depende por completo del transportador de lantibioticos especffico. Se demostro que la alteracion del transportador de nisina (NisT) provoca la acumulacion de prenisina completamente modificada dentro de las celulas (Qiao et al. 1996. FEMS Microbiol. Lett. 144, 89-93). Kuipers et al. demostraron anteriormente que el transportador de lantibioticos NisT puede excretar lantibioticos no modificados y fusiones del peptido senal con peptidos no lantibioticos y que la combinacion de una enzima deshidratante y el transportador de lantibioticos, en ausencia de la ciclasa, tambien es funcional (2004. J. Biol. Chem. 279, 22176-22182).

La combinacion especffica anterior y el orden relativo de los seis elementos distintos en una protefna de fusion unica no se conoce o no se puede derivar de la tecnica anterior.

El documento WO2006/062398, a nombre del primer inventor, describe varios peptidos senal de lantibioticos y sus usos, por ejemplo en protefnas de fusion para producir un peptido de interes que se deshidratara de forma postraduccional mediante una deshidratasa. De acuerdo con el documento WO2006/062398, el peptido senal y el peptido que se desea modificar estan precedidos por una senal de exportacion que no es de lantibioticos, como la senal de exportacion SEC. La senal de exportacion y el peptido senal se pueden separar mediante una secuencia de anclaje celular, por ejemplo un motivo de reconocimiento de LPTX-sortasas. El documento WO2006/062398 no describe los elementos (c), (e) y (f).

Moll et al. Antonie van Leeuwenhoed Vol. 97. n.° 4, 2010, pag. 319-333 es una revision sobre la ingenierfa microbiana de deshidroaminoacidos y lantioninas en peptidos no lantibioticos. En ella se ensena en general que la ingenierfa microbiana de las lantioninas en peptidos puede permitir la generacion de bibliotecas singulares y los sistemas de presentacion concomitantes. No se menciona nada sobre como se pueden conseguir tecnicamente dichas bibliotecas de peptidos que contienen lantioninas, y mucho menos sugiere la estrategia singular de la presente descripcion que implica la presentacion de peptidos con una estructura anular introducida de forma postraduccional. En su lugar, el experto habrfa optado por una estrategia mas convencional, como la presentacion en fagos de peptidos que contienen disulfuro seguida del cierre qufmico del anillo.

Moll et al. (2009) Drug Discovery Today: Technologies Vol. 6, n.° 1-4 pag. e13-e18 describe una tecnologfa de estabilizacion biologica para farmacos peptfdicos mediante la introduction enzimatica de puentes tioeter. Esto se hace mediante protefnas de fusion que comprenden un peptido senal de la nisina con el peptido que se desea modificar.

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Rink et al. (2010) J. of Pharmac. And Toxic. Methods, Vol. 61, n.° 2 pag. 210-218 se refiere a la estabilizacion de peptidos farmaceuticos mediante introduccion de D-aminoacidos y ciclacion. Un peptido de interes se fusiona geneticamente de forma directa o a traves de un espaciador, a un peptido senal de lantibioticos. No se menciona nada acerca de la presentacion en la superficie celular de peptidos ciclados de forma postraduccional.

Leenhouts et al. (1999) Antonie van Leeuwenhoek, Vol. 76, n.° 1-4, pag. 367-376 describe varios metodos para anclar protefnas a la pared celular, que incluyen el motivo de anclaje LPXTG. Tambien ensena que una cola cargada y dominios hidrofobos pueden actuar como una detencion temporal para posicionar al motivo de anclaje para la escision proteolftica. Como en el documento WO2006/062398, los elementos se comentan en combinacion con la secuencia senal Sec y la exportacion mediada por SEC. Leenhouts no dice nada acerca de la combinacion de ningun motivo de anclaje con un elemento que deba reconocer la maquinaria de lantibioticos.

El documento WO2005/012491 describe protefnas de fusion para la expresion en superficie de protefnas biologicamente activas en bacterias, tales como Lactobacilli. El documento WO2005/012491 no describe al menos el elemento (a), es decir no describe una secuencia senal N terminal de lantibioticos a la que pueda reconocer una lantibiotico deshidratasa.

Para practicar la presente descripcion se puede utilizar cualquier tipo de secuencia senal de lantibioticos, a condicion de que por lo menos una lantibiotico deshidratasa pueda reconocerla, y preferentemente tambien una ciclasa que pueda formar un puente de lantionina. En una realizacion, un peptido senal en un polipeptido de la descripcion porta un motivo consenso senal de lantibioticos que se puede obtener de la alineacion de secuencias de aminoacidos de peptidos senal de lantibioticos conocidas. Las secuencias de aminoacidos de peptidos senal de lantibioticos estan disponibles en bases de datos publicas. Por ejemplo, las tablas 1A y 1B del documento WO2006/062398, a nombre del primer inventor, muestran ejemplos de alineaciones de peptidos senal de lantibioticos. Un experto sera capaz de obtener un motivo consenso a partir de las secuencias alineadas, por ejemplo utilizando programas informaticos de alineacion disponibles de forma publica o comercial, tales como AlignX de Vector NTI. AlignX realiza alineaciones de multiples secuencias, con secuencias de protefnas y de acidos nucleicos, utilizando el algoritmo ClustalW. Traza graficos de homologfa, complejidad de la secuencia, arboles filogeneticos y homologfa de matrices de puntos. AlignX acepta archivos de texto convencionales de secuencia, ricos en caracterfsticas, tales como archivos de GenBank, EMBL y GenPept. En una realizacion, el motivo consenso se obtiene a partir de las secuencias de la tabla 1 utilizando el algoritmo ClustalW. Es preferente que se obtenga un motivo consenso de peptido senal a partir de una alineacion de al menos 5, mas preferentemente al menos 10, lo mas preferentemente al menos 15 secuencias de peptido senal conocidas. El motivo consenso asf obtenido puede verificarse posteriormente para determinar la actividad de peptido senal, es decir, el reconocimiento por una lantibiotico deshidratasa y la deshidratacion de serina o treonina, utilizando metodos conocidos en la tecnica. La deshidratacion de una secuencia diana determinada, por ejemplo ITSISRASVA, se puede controlar utilizando Maldi-TOF MS.

La secuencia consenso de peptido senal puede comprender diversas secuencias consenso, por ejemplo el motivo consenso X1-D/E-E-V/L-S/T-D/E-X2-E-L-D/E, donde X1 es cualquier aminoacido hidrofobo y donde X2 es cualquier aminoacido. Por ejemplo, comprende la secuencia LEEVSEQELD. En otra realizacion, un peptido senal comprende un motivo consenso F-D/E/N-L-D/E/N-X3, donde X3 es L, I o V. Por ejemplo, comprende la secuencia LFDLDL o FNLDV. La senal puede contener tambien, por ejemplo, el consenso l/L-L/F-D/E/N-L-Q-D/N/A/S/T-L/M-D/E que comprende ILELQNLD. El peptido senal puede estar compuesto por la secuencia consenso, por ejemplo FNLDV, seguida de una secuencia espaciadora entre la secuencia consenso y el propeptido modificable. Esta secuencia espaciadora se necesita para poner la parte modificable al alcance del centro catalftico de las enzimas modificadoras de lantibioticos (Annechien Plat, Leon D. Kluskens, Anneke Kuipers, Rick Rink, Gert N. Moll (2010). El dominio N terminal y un espaciador son suficientes para la funcionalidad del peptido senal de la nisina. Appl. Environ. Microbiol. 77, 604-611).

Por otro lado, se ha comunicado para los lantibioticos mutacina (Chen P et al. FEMS Microbiol Lett. 2001;195(2):139), Pep5 (Neis S et al. FEMS Microbiol Lett. 1997; 149(2):249) y nisina (Van der Meer et al. (1994) J. Biol. Chem. 269, 3555-3562) que algunos de los residuos conservados del peptido senal son esenciales para la biosfntesis del lantibiotico, mientras que otros residuos son importantes para alcanzar velocidades optimas de biosfntesis.

En una realizacion preferente, una secuencia de acido nucleico codifica el peptido senal de un lantibiotico, por ejemplo el peptido senal de un lantibiotico seleccionado del grupo que consta de BacteriocinaJ46, Lacticina481, SalivaricinaB, Macedonina, EstreptococcinaAM49, EstreptococcinaAFF22, SalivaricinaG32, Salivaricina9, MutacinaIl, Variacina, MukA1, MukA2/A3, MukA'; Lacticina3147A1, EstafilococcinaC55a, ButirivibriocinaOR79, RuminococcinaA, BovicinaHJ50, Termofilina1277, CitolisinaLL, CitolisinaLS, Sublancina168, LiquenicidinaBeta, NukacinalSK-1, NukacinaKQU-131, SalivaricinaA4, SalivaricinaA5, SalivaricinaA2, SalivaricinaA, SalivaricinaA3, SaIivaricinaA1, PlantaricinaWb, HaloduracinaA2, Lacticinina3147A2, EstafilococcinaC55b, Gallidermina, EstafilococcinaT, Epidermina, NisinaZ, NisinaQ, NisinaF, NisinaA, EricinaA, EricinaS, Subtilina, NisinaU, Epicidina280, Pep5, EpilancinaK7, SWLP1, Estreptina, LiquenicidinaAIfa, Mersacidina, Actagardina, BHT-A2, SmbB, BHT-A1, SmbA, PIantaricinaASM1, PIantaricinaWa, HaIoduracinaA1, Mutacina1140/III, Mutacinal, MichiganinaA, Cinamicina, LactocinaS, AmfS (S. griseus), SapB, AmfS (S. avermitilis) RamS2, RamS1, LaberintopeptinaA1/A3, LaberintopeptinaA2 o un homologo de cualquiera de estos peptidos senal que permita el reconocimiento y la modificacion del peptido de interes situado despues mediante la(s) enzima(s) modificadora(s) de lantibioticos deseada(s). El homologo muestra al menos el 70%, preferentemente al menos el 80%, mas preferentemente al menos el 90%, como el 92%, el 95% o incluso el 98% de identidad de secuencia con la secuencia de una de las

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secuencias de peptidos senal mostradas en las tablas 1 y 2 del documento WO2006/062398, con una de las secuencias de peptidos senal mencionadas en Plat et al., (2010). Appl. Environ. Microbiol. 77, 604-611 o con los peptidos senal mencionados en Li, et al. (2010). Proc Natl Acad Sci USA. 107: 10430-5).

Por ejemplo, el peptido senal puede ser un peptido senal de lantibioticos truncado o mutado que sea todavfa capaz de inducir la modificacion postraduccional del peptido de interes. La senal no necesita tener la capacidad de inducir una traslocacion mediante un transportador de lantibioticos como LanT, dado que puede asumir esta funcion una senal de exportacion que no sea de lantibioticos que pueda estar presente en el polipeptido de la descripcion. En un aspecto especffico el peptido senal es el peptido senal de la nisina o una version truncada o mutada del mismo, en la que hasta 4 aminoacidos del extremo N o en la que uno cualquiera de hasta 5 aminoacidos del extremo C esten mutados.

La secuencia senal de lantibioticos va seguida de un peptido que se desea modificar. La modificacion implica deshidratacion, preferentemente seguida de ciclacion. La ciclacion la puede realizar la propia celula anfitriona, siempre y cuando este presente la maquinaria enzimatica correspondiente. Como alternativa, pueden participar peptidos deshidratados en la ciclacion mediante reaccion de deshidroaminoacidos a cistefna a un pH elevado.

Estara claro que el peptido de interes puede ser cualquier peptido cuya modificacion se desee mediante una enzima deshidratante y de formacion de anillos de lantibioticos. Normalmente, un peptido de interes se disena de forma que despues de la deshidratacion postraduccional de uno o mas residuos de serina o treonina, los residuos deshidratados se puedan acoplar a una cistefna (ya sea por una celula anfitriona o in vitro) de modo que se forme una estructura anular de tioeter. Por la presente, es posible introducir una estructura anular estabilizante esencialmente en cualquier posicion deseada en el peptido. Son de particular interes los peptidos con una actividad biologica, por ejemplo peptidos destinados al uso terapeutico, debido a que la introduccion de uno o mas anillos de tioeter en general aumenta la bioestabilidad del peptido. Ademas, se puede utilizar una estructura anular para modificar la actividad biologica, por ejemplo la afinidad de union al receptor o la especificidad enzimatica, de un peptido. El peptido de interes es, por ejemplo, una hormona, un inhibidor enzimatico, un activador enzimatico, un ligando receptor, un peptido inhibidor, una protefna lantibiotica, una protefna viral, una protefna eucariotica, un mutante de los mismos (por ejemplo, disenado especfficamente para permitir una modificacion en una posicion determinada), un imitador, un homologo o un fragmento funcional equivalente de los mismos.

Son ejemplos de dichos peptidos glucagon-(1-29), peptido inhibidor de la incretina/gastrina, enterostatina, nesfatina-1, angiotensina-(1-9), apelina 12, ACTH-(1-24), leptina 22-56, IL-1 a (223-250), IL-16 (208-240), peptido similar a glucagon 1, peptido similar a glucagon 2 (1-33), neuropeptido S, peptido inductor del sueno delta, peptido similar a galanina, hormona concentradora de la melanina, cerebelina, neuropeptido W-23, neuropeptido W-30, cinetensina, galanina, CART-(62-76), cortistatina 17, factor potenciador de la melanotropina, salusina-p, neuropeptido Y, factor natriuretico auricular, peptido natriuretico cerebral, peptido natriuretico de Dendroaspis, peptido natriuretico de tipo C-(32-53), peptido natriuretico de tipo C-(1-53), vasonatrina, calcitonina, C-procalcitonina, N-procalcitonina, osteocalcina, pTH (138), protefna relacionada con pTH-(1-40), preptina, osteoestatina (1-5), factor liberador de la hormona de crecimiento, ghrelina W3R5 1-5, hormona de crecimiento humana-(1-43), peptido receptor de KGF, pentapeptido inhibidor de la mitosis epidermica, musculo de atun de BPP, hirudina-(54-65), bradicinina, urotensina II, angiotensina A, inhibidor de la renina, angiogenina-(118-123), factor plaquetario 4-(58-70), endotelina 1-(11-21), endotelina grande-(19-37), timosina 64 (16-38), salusina-beta, aloferon 1, cortistatina 29, tuftsina, protefna C-reactiva-(174-185), CKS 17, pseudina 2, peptido antiinflamatorio 1, tetrapeptido de MSH caracterfstico, procolageno de tipo I, peptidos de union al receptor de trombina, fragmentos de trombospondina-1, fragmentos de laminina, peptido de reconocimiento del receptor de IFN-a 1, fragmentos de azurina, valorfina, nociceptina, casefna alfa 90-96, casomorfina beta, a-neoendorfina, exorfina de gluten A5, exorfina de gluten B5, exorfina de gluten C, dinorfina A, endorfina alfa, endorfina beta, hemopresina, galanina-(1-19), somatostatina, adrenomedulina, anexina A1, bombesina, potenciador de bradicinina B, potenciador de bradicinina C, cerulefna desulfatada, peptido relacionado con el gen de la calcitonina, colecistocinina, exendina 3, exendina 4, acetalina, sustancia P, factor liberador de corticotropina, deltorfina II, dermorfina, eglina c, eledoisina, endomorfina 1, endomorfina II, GMAP 16-41, GIP 6-30, helodermina, hemocinina I, hilambatina, intermedina, kasinina, alatostatina, calpastatina-(184-210), inhibidor de la trombina basado en cinogeno, kisspeptina, LL37, mastoparano, neuropeptido E1, melitina, peptido modulador de la morfina, a-melanotropina (MSH), peptido regulador neuroendocrino- 1/2, neurocinina A/B/C, neuroestatina, neuropeptido FF, neuropeptido Y, neurotensina, obestatina, oxitocina, agonista p518 del huerfano GPCR SP9155, pancreastatina, polipeptido pancreatico, peptido T, peptido YY, fisalemina, PACAP- 27, pneumadina, peptido liberador de prolactina, salusina-a, sauvagina, sciliorrinina l/ll, secretina, sustancia P, timosina a1, timosina 64, timosina 610, imitadores de rastro, urocortina l/ll/lll, urotensina l/lI, vasopresina, PHM-27, VIP, amilina, polimerizante antifibrina, GHRH, IGF-1, IGF-2, RELAXINA-1/2/3, peptido similar a la insulina-3/4/5/6, histatina-5, indolicidina, magainina I, peptido natriuretico de tipo C, vasonatrina, peptido inductor del sueno delta, alfa-dendrotoxina, equistatina, defensina I, urocortina, peptido cardioactivo pequeno A y B, ceratotoxina A, cerebelina, caribdotoxina, conopresina G, alfa-conotoxina E1, corazonina, leu-encefalina, met-encefalina, gonadoliberina II, acido tocinoico, peptido inhibidor de la corticotropina, factor liberador de corticotropina, peptido XY, factor de crecimiento de fibroblastos acido derivado del cerebro, factor de crecimiento de fibroblastos basico derivado del cerebro, hormona de crecimiento humana, factor liberador de la hormona de crecimiento, guanilina, molecula de adhesion intercelular, peptido antigenico gp120 de VIH, fragmento de peptido antigenico I (gp 41) de VIH, peptido antigenico 5 de VIH, inhibidores de la proteasa del VIH, factor de crecimiento similar a la insulina I, IGF Il 69-84, fragmento de interleucina, fragmento de interleucina II, Ieucocinina I, leucopirocinina, motilina, neuropeptido Y, endorfina, peptido relacionado con el oncogen ras, fragmentos

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de eritropoyetina, factor de crecimiento epidermico, factor de crecimiento transformante, leucinostatinas, factor de crecimiento nervioso, exorfinas del gluten, pardaxina, tirocidina, peptido desgranulador de mastocitos, factor de necrosis tumoral, peptidos RGD, timopoyetina, taquicinina, cecropina, cualquier polipeptido viral o un peptido obtenido utilizando cebadores semialeatorizados en los cuales esten presentes residuos de serina/treonina y -si se desea- de cistefna.

El peptido tambien puede ser un lantibiotico (mutante de uno mencionado anteriormente), una (mutante de) bacteriocina no lantibiotica, por ejemplo de bavaricina MN, enterocina P, mesentericina Y105, pediocina PA-1, lactacina F, lactococcina G, plantaricina EF, plantaricina JK, lactococcina A, lactococcina 972, plantaricina A, curvacina A, divercina V41, enterocina A, muntcidina, sakacina P, leucocina A, carnobacteriocina B2, closticina 574, circularina A, microcina J25, gassericina A o AS48. El lantibiotico o bacteriocina puede comprender o no su propio peptido serial. Naturalmente, si comprende su propio peptido serial ademas del peptido serial de lantibioticos como se definio anteriormente, la distancia entre el peptido senal al que reconocera la deshidratasa y los residuos que se desea modificar se vuelve relativamente grande. Por este motivo, puede ser preferente eliminar su propio peptido senal de forma que en la construccion completa del polipeptido solo este presente una senal de lantibioticos. En determinadas situaciones, por ejemplo si el peptido senal propio es pequeno, como es por ejemplo el caso para la circularina A, microcina J25, gassericina A y AS48, la presencia de una secuencia senal adicional puede no afectar de forma negativa a la modificacion del peptido de interes. Incluso se puede prever que la presencia de peptidos senal distintos (por ejemplo peptido senal de lantibioticos asf como peptido senal de bacteriocinas) sea ventajosa debido a que esto permite el reconocimiento y modificacion mediante distintas enzimas modificadoras.

Una construccion de acido nucleico proporcionada en el presente documento se caracteriza adicionalmente por la presencia, a 3' de la secuencia del peptido codificado que se desea modificar, de una secuencia que codifica un dicho dominio transmural celular. Este dominio puede atravesar por ejemplo la capa de peptidoglucanos de una celula anfitriona grampositiva y asf asegura que la secuencia de aminoacidos modificada se presenta en la superficie celular de la celula anfitriona. Se pueden obtener dominios espaciadores muy adecuados a partir del dominio espaciador de la pared celular de una proteinasa de envoltura celular multidominio de una bacteria lactica, o basandose en el mismo. Normalmente, dicho dominio espaciador contiene varias repeticiones de tramos de aminoacidos similares o incluso identicos. En una realizacion, dicho dominio espaciador de la pared celular comprende la secuencia de aminoacidos de un dominio espaciador de la pared celular de la protefna A (PrtA) de Staphylococcus aureus, prtH de Lactobacillus helveticus, prtP de Lactococcus lactis, scpA de Streptococcus pyogenes o csp de Streptococcus agalactiae, o un analogo funcional o fragmento de los mismos capaz de atravesar la pared celular de la celula anfitriona en la cual se presentara (Siezen, 1999. Multi-domain, cell-envelope proteinases of lactic acid bacteria. A. van Leeuwenhoek 76:139155). En un aspecto especffico, la construccion de acido nucleico incluye solo las regiones codificantes de la protefna A de Staphylococcus o de una protefna G estreptococica que son responsables de atravesar la pared celular y del anclaje en la membrana (vease, por ejemplo, Navarre y Schneewind, 1999. Surface proteins of Gram-positive bacteria and mechanism of their targeting to the cell wall envelope. Microbiol. Molecul. Biol. Rev. 63:174-229).

El dominio transmural celular va seguido de un motivo de sortasa. La sortasa, una enzima implicada en el enlace covalente de algunas protefnas de superficie de Staphylococcus aureus con el peptidoglucano, desempena un papel fundamental en la presentacion de protefnas de superficie y en la virulencia de este importante patogeno humano (Marraffini et al., 2006: Microbiol. Mol. Biol. Rev. 70:192-221). El enlace covalente viene determinado por una senal de clasificacion denominada “motivo de reconocimiento de sortasas” o “motivo de sortasas”, seguido de un dominio hidrofobo formado por unos 20 aminoacidos y una cola de aminoacidos cargados positivamente. Los motivos de sortasas son conocidos en la tecnica, vease (1999) Microbiol Mol Biol Rev 63:174-229, pmid:10066836 o documento US 7.238.489. Este mecanismo se ha comunicado en muchas bacterias grampositivas. El motivo optimo puede depender de la celula anfitriona que se desee utilizar. La Fig. 1C muestra la secuencia de consenso de un motivo de sortasas para L. lactis (panel A) y S. aureus N315 (panel B). En una realizacion, el motivo de reconocimiento de sortasas comprende la secuencia de aminoacidos LPXTG, en la que X puede ser el aminoacido D, E, A, N, Q o K, preferentemente en la que dicho motivo de reconocimiento de sortasas consiste en LPKTG.

El motivo de sortasas esta seguido, de forma opcional a traves de una secuencia espaciadora, por un dominio hidrofobo capaz de atravesar la bicapa lipfdica de la celula anfitriona. El dominio transmembranario tiene normalmente una longitud de 20 a 30 aminoacidos. Los residuos preferentes incluyen Ala, Pro, Gly, Phe, Leu, Ile, Val, Met. En una realizacion, el dominio transmembranario comprende la secuencia PAFG, FGFL, LGVIV, VIWIL, ILMGV o GVLGL. En un aspecto especffico, comprende la secuencia PAFGFLGVIVVILMGVLGL.

La modificacion y exportacion de la construccion senal es en varios aspectos altamente sorprendente:

1) La modificacion de este polipeptido inmovilizado en posicion C terminal es sorprendente. No hay comunicaciones anteriores sobre la modificacion de peptidos inmovilizados en posicion N o C terminal mediante enzimas de lantibioticos. El polipeptido se ancla a la membrana mediante el segmento hidrofobo cercano a su extremo C. Esto significa que el extremo C no esta libre y que el peptido esta fijo. En la nisina nativa 8 posiciones estan deshidratadas y estan instalados 5 anillos. Por lo tanto, o bien el peptido tiene que moverse a lo largo de la enzima o la enzima a lo largo del peptido. Esta modificacion es sorprendente ya que el movimiento del peptido y de las enzimas modificadoras uno a lo largo del otro podrfa verse estorbado por la inmovilizacion C terminal debida al anclaje a la membrana. De hecho, el estorbo esta teniendo lugar dado que esta completamente ausente

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un pico de masa con 8 deshidrataciones, lo que contrasta con la nisina nativa que esta deshidratada 8 veces, y solo la Ser33 escapa a la deshidratacion en el 10% de los casos (Post-translational modification of nisin. The involvement of NisB in the dehydration process. Karakas Sen A, et al. EurJ Biochem. 1999 261:524-32.) A pesar de este estorbo, sorprendentemente todavfa se produce una deshidratacion de 7, 6 y 5 veces (Fig. 7C).

2) La exportacion es sorprendente debido a la longitud del polipeptido. En la bibliograffa cientffica, el peptido mas grande modificado por enzimas de lantibioticos tiene 48 aminoacidos (Production of dehydroamino acid-containing peptides by Lactococcus lactis. Rink R, et al. Environ Microbiol. 2007 73:1792-6). La presente construccion modificada y exportada tiene 186-210 aminoacidos de longitud, lo que es casi 4 veces mas largo que el peptido modificado por enzimas de lantibioticos mas largo comunicado hasta ahora.

3) La exportacion no resulta bloqueada por el segmento hidrofobo cercano al extremo C. El peptido serial de la nisina es hidrofilo y si esta presente una senalpeptidasa, el peptido serial se encuentra de vuelta en el medio, es decir, no permanece unido a la membrana o a la pared celular. Esto indica que el transportador de nisina forma un canal acuoso. Esto contrasta con otros peptidos senal, por ejemplo los peptidos senal sec y tat, que tienen segmentos que son tan hidrofobos que permanecen en la membrana. En este ultimo caso, las senalpeptidasas son necesarias para liberar el peptido o protefna transportado en el medio. Con la construccion utilizada que tiene una secuencia hidrofoba cercana al extremo C, cabrfa esperar que esta secuencia hidrofoba que ancla al polipeptido en la membrana bloquee el transporte a traves del transportador de lantibioticos. De forma inesperada, la exportacion del polipeptido no se ve bloqueada en absoluto por el anclaje de membrana hidrofobo sino que tiene lugar a traves de un sistema de transporte de lantibioticos. Dado que la sortasa que reconoce el motivo LPXTG se localiza en el exterior de la membrana celular, es igualmente sorprendente que el polipeptido sea aparentemente sustrato para la accion de la sortasa, que acopla el polipeptido a la pared celular.

4) La exportacion del polipeptido intacto se ve sorprendentemente potenciada por la combinacion del transportador de lantibioticos, el segmento hidrofobo cercano al extremo C y los aminoacidos cargados muy C- terminales KRKQREE. Como se demostro de forma clara en el ejemplo 4, los truncamientos C terminales ocasionan la degradacion. Esto probablemente se debe a una exportacion ineficaz, que permite a las peptidasas intracelulares degradar el polipeptido impidiendo su transporte intacto.

El mismo extremo C de la sustancia protefnica codificada consta de una cola cargada para el anclaje a la membrana.

En una realizacion, dicho dominio de anclaje a la membrana cargado tiene una longitud de al menos cuatro residuos de aminoacido, preferentemente donde al menos el 50% de los residuos son aminoacidos cargados positivamente, mas preferentemente residuos Lys o Arg.

Puede ser ventajoso que el peptido de fusion comprenda uno o mas motivos de secuencia adicionales. Por ejemplo, se puede introducir al menos un sitio de escision proteolftica entre los elementos (b) y (c) de forma que el peptido modificado se pueda liberar despues de la modificacion postraduccional y presentacion en superficie. En la tecnica se conocen sitios de escision utiles, e incluyen un sitio de reconocimiento de proteasas factor Xa, como la secuencia de aminoacidos IEGR.

Un aspecto adicional se refiere a un vector de expresion que comprende una construccion de acido nucleico de acuerdo con la descripcion. Preferentemente, el vector esta disenado para la expresion de la construccion en una celula anfitriona grampositiva. Por ejemplo, comprende uno o mas de los siguientes elementos: las secuencias del promotor inducible NisA, el peptido senal de la nisina, nisina y el motivo de anclaje a la pared celular LPXTG de la proteasa PrtP de L. lactis.

Tambien se abarca una celula anfitriona grampositiva que comprende dicho vector de expresion y que es capaz de modificar de forma postraduccional dicho polipeptido de interes a un polipeptido que contiene residuos deshidratados o puentes tioeter. La celula anfitriona es por ejemplo una bacteria lactica, preferentemente seleccionada de Lactococcus lactis, Bacillus subtllis, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus epidermis, Staphylococcus gallinarium, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Staphylococcus warneri, Streptococcus salivarius, Lactobacillus sakei, Lactobacillus plantarum, Carnobacterium piscicola, Enterococcus faecalis, Micrococcus varians, Streptomyces OH-4156, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces griseoluteus, Butyrivibrio fibriosolvens, Streptoverticillium hachijoense, Actinoplanes linguriae, Ruminococcus gnavus, Streptococcus macedonicus, Streptococcus bovis, que contienen las enzimas de biosfntesis y el transportador de lantibioticos correspondientes, por ejemplo NisB, C, T o SpaB, C, T. De particular interes es una biblioteca de celulas anfitrionas que comprende diversas celulas anfitrionas de acuerdo con la descripcion, en la que cada miembro de dicha biblioteca presenta en su superficie celular un polipeptido diferente que contiene residuos deshidratados o puentes tioeter. La biblioteca se utiliza de forma muy ventajosa para cribar nuevos peptidos cfclicos utiles, como nuevas etiquetas de afinidad cfclicas, peptidos cfclicos biologicamente activos, tales como farmacos peptfdicos, ligandos de receptores, peptidos inhibidores cfclicos. De forma ventajosa, la construccion de una biblioteca implica el uso de codones degenerados incorporados durante la sfntesis de oligonucleotidos que incluyen mezclas de nucleotidos en cada posicion. Por ejemplo, el conjunto completo de aminoacidos convencionales se codifica utilizando los codones NNK o NNS, donde N es A, T, C o G y K = G o T y S = C o G, excluyendo asf los codones de terminacion TAA o TGA. Las celulas anfitrionas que expresan las etiquetas de afinidad candidatas se pueden poner en contacto con un ligando inmovilizado para seleccionar secuencias de union de alta afinidad. Por lo tanto, tambien se proporciona un

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metodo para la identificacion de un polipeptido que contiene residuos deshidratados o tioeteres, capaz de unirse a una entidad diana de interes, cuyo metodo comprende los pasos de (a) proporcionar una biblioteca como se describe anteriormente; (b) seleccionar a partir de la biblioteca al menos una celula anfitriona que presente un polipeptido que contiene residuos deshidratados o tioeteres, capaz de unirse a la entidad diana de interes; y (c) identificar la secuencia polipeptfdica presentada en dicha al menos una celula anfitriona seleccionada.

En un aspecto especifico, la biblioteca comprende diversas secuencias de etiquetas de afinidad cfclicas candidatas, por ejemplo variantes de la etiqueta estreptavidina cfclica (etiqueta Strep). Se proporciona un metodo para la identificacion de una etiqueta de estreptavidina cfclica (etiqueta Strep) que comprende un puente tioeter capaz de unirse a la biotina, cuyo metodo comprende los pasos de (a) proporcionar una biblioteca de celulas anfitrionas que comprende diversas celulas anfitrionas grampositivas que comprenden un vector de expresion de acuerdo con la descripcion y capaces de modificar de forma postraduccional un polipeptido de interes a un polipeptido que contiene puentes tioeter, donde el polipeptido comprende la secuencia de aminoacidos Ser/Thr-(Xaa)n- Cys o Cys-(Xaa)n-Ser/Thr, en la que Xaa es cualquier aminoacido y n es 1-5, preferentemente n es 3; (b) seleccionar a partir de la biblioteca al menos una celula anfitriona que presente un peptido con puentes tioeter con afinidad por la estreptavidina (etiqueta Strep) utilizando estreptavidina inmovilizada; y (c) identificar la secuencia polipeptfdica presentada en dicha al menos una celula anfitriona seleccionada. Por ejemplo, despues de dos rondas de seleccion magnetica (MACS) utilizando microesferas magneticas recubiertas de estreptavidina, las bacterias seleccionadas se pueden sembrar en placas para su analisis.

La celula anfitriona tambien puede utilizarse como un sistema indicador para evaluar la actividad de la enzima biosintetica o del transportador de lantibioticos, donde la expresion eficaz en la superficie celular de un peptido que contiene puentes tioeter se utiliza simplemente como lectura. La expresion en la superficie celular se puede detectar mediante metodos conocidos en la tecnica, que incluyen deteccion de anticuerpos e inmovilizacion a un soporte solido.

Leyendas de las figuras

Figura 1A: Organizacion genetica de los vectores de presentacion utilizados en el presente estudio. P^a, promotor inducible de nisina; senal, peptido senal de la nisina; NisA, secuencia codificante de pronisina; FXa, sitio de reconocimiento del factor Xa; etiqueta Strep, secuencia de reconocimiento de estreptavidina; 3C, secuencia de reconocimiento de la proteasa del rinovirus humano. Espaciador de pared celular y anclaje a la pared celular de la proteasa PrtP de L. lactis (aminoacidos 1789-1912); (a) una secuencia senal N terminal de lantibioticos; (b) una secuencia de aminoacidos de interes que se modificara de forma postraduccional a un polipeptido que contiene residuos deshidratados o puentes tioeter; (c) un dominio transmural celular hidrofilo; (d) un motivo de reconocimiento de sortasas; (e) un dominio transmembranario hidrofobo; y (f) un dominio C terminal cargado de anclaje a la membrana. Los productos (poli)peptfdicos correspondientes se denominan con identico nombre sin la “p” precedente.

Figura 1B: Organizacion genetica de las variantes de pTB5 truncadas, aa## indica la numeracion de aminoacidos del anclaje a la pared celular de la proteasa PrtP de L. lactis, (a) una secuencia senal N terminal de lantibioticos; (b) una secuencia de aminoacidos de interes que se modificara de forma postraduccional a un polipeptido que contiene residuos deshidratados o puentes tioeter; (c) un dominio transmural celular hidrofilo; (d) un motivo de reconocimiento de sortasas; (e) un dominio transmembranario hidrofobo; y (f) un dominio C terminal cargado de anclaje a la membrana.

Figura 1C: Secuencias consenso de motivos LPXTG. Panel superior: consenso para Lactococcus lactis; panel inferior: consenso para Staphylococcus aureus N315.

Figura 2. Expresion de la construccion del peptido de fusion. A) Gel de SDS-PAA al 12% tenido con Coomassie y B) analisis de Western con anticuerpos antisenal de nisina de extractos celulares de L. lactis NZ9000 con los plasmidos: 1, pTB5, no inducido; 2, pTB5 inducido; 3, pTB5/plL3BTC, no inducido; 4, pTB5/plL3BTC, inducido.

Figura 3: Localizacion en la superficie celular de la construccion del peptido de fusion. ELISA de celulas enteras con celulas de L. lactis NZ9000 para la deteccion de la protefna de fusion prenisina-anclaje presentada en superficie. Se permitio la union de anticuerpos antisenal de nisina de conejo a celulas lactococicas que presentaban TB5. Se anadio anti-IgG de conejo caprino conjugado a fosfatasa alcalina y se genero un color mediante la adicion de p-nitrofenilfosfato. Barras blancas, celulas no inducidas; barras grises, celulas inducidas.

Figura 4: Presentacion de prenisina modificada en la superficie celular. Paneles AB: Dos analisis paralelos en gel SDS- PAA de extractos celulares de L. lactis NZ9000 con o sin enzimas modificantes. 1, pTB5, no inducido; 2, pTB5 inducido; 3, pTB5/plL3BTC, no inducido; 4, pTB5/plL3BTC, inducido; 5, prenisina. Panel A) gel de SDS-PAA al 12% tenido con Coomassie. Panel B) gel de SDS-PAA al 12% con una superposicion de una cepa de L. lactis NZ9000 sensible a la nisina con tripsina 0,1 mg/ml. El halo en la calle 4 del gel B en el sitio de la banda de protefna dependiente de induccion tenida con Coomassie prueba que la parte de prenisina de la protefna de fusion esta modificada por NisB y NisC. Panel C): Analisis de celulas lactococicas que presentan nisina activa, con un cultivo superpuesto de una cepa de L. lactis sensible a la nisina con tripsina (panel izquierdo), o con una cepa de L. lactis que produce NisP (panel derecho). NisP escinde de forma especffica la senal de la nisina produciendo nisina activa. La inhibicion del crecimiento, vista como un halo (cfrculos/cercos blancos en la figura C), de esta cepa demuestra de forma clara que NisB y NisC modificaron de forma correcta la prenisina y formaron al menos los anillos A, B, y C de TB5 (TB5 esta en la figura 4C indicado como N15).

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Figura 5: Presentacion en la superficie celular de cAng-(1-7) modificado por NisBC.

A. ELISA de celulas enteras con celulas de L. lactis NZ9000 para la deteccion de la protefna de fusion senal- angiotensina(1-7) presentada en superficie. Se permitio la union de anticuerpos antisenal de nisina de conejo a celulas lactococicas que presentaban TB2. Se anadio anti-IgG de conejo caprino conjugado a fosfatasa alcalina y se genero un color mediante la adicion de p-nitrofenilfosfato. Barras blancas, celulas no inducidas; barras grises, celulas inducidas.

B Gel de SDS-PAA al 12% tenido con Coomassie, y analisis de Western con anticuerpos antiangiotensina-(1-7) cfclica con extractos de protefna total de L. lactis NZ9000 con plasmido: calle 1, pTB2; calle 2, pTB2 y plL3BTC.

C La espectrometrfa MALDI-TOF del peptido de fusion angiotensina-(1-7)-anclaje con puentes tioeter TB3 muestra deshidratacion unica. El fragmento peptfdico relevante

(STKDFNLDLVSVSKKDSGASPRIEGRDRVSIHCGGGWSHPQFEKEALFQ) se muestra de forma esquematica. El pico de masa de 5398,83 corresponde al fragmento de TB3 N terminal con deshidratacion unica.

D: Espectrometrfa MALDI-TOF que no muestra adicion de CDAP al peptido de fusion angiotensina-(1-7)-anclaje con puentes tioeter TB3. Las dos figuras superiores muestran un cambio de masa claro de 25 Da para el peptido de control que es indicativo de la adicion de CDAP a este peptido. No se encontro cambio de masa para TB3 (las dos figuras inferiores), lo que indica la ausencia de un residuo de cistefna libre y demuestra asf la presencia de un puente tioeter en TB3.

Figura 6: Espectrometrfa MALDI-TOF del peptido de fusion nisina-anclaje TB1. A) TB1 purificado. B) TB1 purificado tratado con tripsina. C) Area recuadrada de B con mas detalle. Parte de nisina de TB1. El numero de deshidrataciones se indica con -7, -6 etc. D) Sobrenadante de L. lactis NZ9000 (plL3BTC/pNZe3) tratado con tripsina. El numero de deshidrataciones se indica con -8, -7, etc. En las figuras A y B el fragmento peptfdico relevante se muestra de forma esquematica.

Figura 7: Presentacion del peptido de union a estreptavidina seleccionado RND-X3-1. pRND-X3-1 se presenta en la Fig. 1A. ELISA de celulas enteras con L. lactis NZ9000(plL3BTC) que presenta RND-X3-1 con y sin coincubacion con biotina. El peptido presentado se detecto con estreptavidina conjugada a HRP, con ABTS/H202 como solucion de sustrato. El experimento se repitio en mas de tres experimentos independientes con diferencias <15%.

Figura 8: El analisis espectrometrico MALDI-TOF de la adicion de 1-ciano-4-dimetilaminopiridinio tetrafluoroborato (CDAP) al peptido con puentes tioeter seleccionado por estreptavidina (vease ejemplo 7). Para el analisis se inserto en pRND-X3-1 un codon de terminacion de la traduccion entre el peptido y la secuencia de anclaje (Fig. 1A) y el plasmido resultante se denomino pTB9 (Fig. 1A). La parte N terminal delante del codon de terminacion codifica asf el peptido senal de la nisina, MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPR, fusionado a un peptido modificable ISNMVCNMKTATCHCSIHVSK. Se aplico puntualmente medio de cultivo de celulas que contienen el plasmido pTB9 que codifica esta construccion con el codon de terminacion y que contienen plL3BTC sobre la placa diana de MALDI y se analizo mediante Maldi TOF. Un experimento de control con un peptido de control que contiene una cistefna libre muestra un claro cambio de masa de 25 Da para el peptido de control que es indicativo de la adicion de CDAP al peptido de control. El presente experimento muestra la produccion de un peptido con una masa de 4572,94 Da, que corresponde al peptido deshidratado cuatro veces (masa teorica promedio sin metionina N terminal: 4570,346 Da). Muy probablemente, la penultima serina en este peptido relacionado con nisina escapo a la deshidratacion, de forma analoga al caso de la Ser29 en la propia nisina. En presencia de CDAP, no se encontro cambio de masa de 25 Da para el peptido TB9 seleccionado, lo que indica la ausencia de un residuo de cistefna libre y demuestra asf la presencia de un puente tioeter.

Seccion experimental

EJEMPLO 1: Vector de expresion para la presentacion en la superficie celular de peptidos que contienen tioeter y residuos deshidratados en Lactococcus lactis.

Objetivo: Este ejemplo atane a la construccion de un vector de expresion para la presentacion en superficie de peptidos que contienen tioeter en Lactococcus lactis. El organismo anfitrion L. lactis aporta la maquinaria de biosfntesis y exportacion de nisina para la introduccion de puentes tioeter en el peptido deseado y su exportacion. El peptido se fusiona de forma traduccional con un motivo de anclaje a la pared celular LPXTG, tal como el de la proteasa PrtP de L. lactis. Este mecanismo de anclaje necesita procesamiento mediante una sortasa para el anclaje covalente del peptido al peptidoglucano de la pared celular bacteriana. De este modo, el peptido y el ADN codificante se unen permitiendo la seleccion/cribado de peptidos modificados de forma postraduccional con las propiedades deseadas. La nisina se utilizara como un peptido modelo para el desarrollo y la demostracion del sistema de presentacion.

Materiales y metodos

El motivo de anclaje a la pared celular LPXTG de la proteasa PrtP de L. lactis se fusiono de forma traduccional mediante PCR al gen nisA en pNZE3, un derivado del vector de expresion lactococico pNG8048. Las partes

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relevantes del vector de presentacion comprenden las secuencias del promotor inducible NisA, el peptido senal de la nisina, nisina y el motivo de anclaje a la pared celular LPXTG de la proteasa PrtP de L. lactis. El vector de presentacion se electroporo a L. lactis NZ9000(plL3BTC). Esto ultimo proporciona las enzimas de biosfntesis de nisina NisB, NisC, y el transportador NisT. La produccion de la protefna nisina-anclaje se analizo mediante SDS- PAGE, y transferencia de Western utilizando anticuerpos antisenal de nisina.

Resultados: Se construyo un vector de presentacion lactococico con la secuencia nisina- anclaje correcta bajo el control del promotor NisA. Este vector de presentacion se denomino pTB5. Se cultivaron celulas de L. lactis NZ9000 (pOBTC/pTB5) en ausencia o presencia de nisina para permitir la produccion de TB5. Se digirio con lisozima un numero igual de celulas y se solubilizaron en tampon de muestras de SDS-PAGE. Se separaron las protefnas en los extractos celulares mediante SDS-PAGE y se visualizaron mediante tincion de Coomassie (Fig. 2, panel izquierdo). La comparacion de los extractos celulares de los cultivos no inducidos e inducidos mostro la presencia de una banda de protefna de aproximadamente 26-28 kDa en el cultivo inducido. El analisis por transferencia de Western con anticuerpos antisenal de nisina demostro que esta protefna es la protefna de fusion nisina-anclaje TB5, como se observa mediante la fuerte senal inmunorreactiva (Fig. 2, panel del lado derecho). El peso molecular observado de TB5 difirio del peso molecular teorico calculado de 18 kDa. Esta diferencia en la migracion se debe muy probablemente a la union covalente de fragmentos de peptidoglucano a TB5. La senal inmunorreactiva medible pero menos fuerte en los cultivos no inducidos se debe a una pequena filtracion del promotor de nisina. En conjunto, las celulas lactococicas que contienen al vector de presentacion construido, pTB5, dirigieron la produccion de TB5 cuando se indujeron con nisina.

EJEMPLO 2: Los anticuerpos antipeptido senal demuestran la ubicacion en superficie celular de la protefna de fusion prenisina-anclaje TB5 unida a la pared celular.

Objetivo: La presentacion de TB5 en la superficie celular de L. lactis se evaluo con un ELISA de celulas enteras utilizando anticuerpos antisenal de nisina.

Materiales y metodos

Se cultivaron celulas de L. lactis NZ9000(pTB5) y L. lactis NZ9000(plL3BTC/pTB5) con y sin nisina para la induccion de TB5. Despues de la produccion, las celulas se recogieron mediante centrifugacion y se lavaron tres veces con solucion salina tamponada con fosfato, pH 7,4 (PBS). Se incuba un numero igual de celulas que presentaban TB5 con una solucion de anticuerpo antisenal de nisina de conejo diluido 1000 veces, en un volumen final de 1 ml de PBS mas BSA al 0,5%, a temperatura ambiente durante 1 hora con rotacion.

Despues de lavar tres veces con PBS, se visualizo el TB5 presentado mediante la incubacion con anti-IgG de raton caprino conjugado con fosfatasa alcalina (1:10000) y p-nitrofenil fosfato (0,5 mg/ml) como sustrato. Se determino la absorbancia a 410 nm, que es una medida del numero de TB5 presentados.

Resultados

Los resultados resumidos en la Fig. 3 mostraron una respuesta de color positiva para las celulas de L. lactis NZ9000(plL3BTC/pTB5) inducidas. Se observo un nivel de respuesta de color inferior para el cultivo de lactis no inducido. Esto demostro que la senal de la nisina es accesible en la superficie celular de L. lactis.

EJEMPLO 3: Antes de la presentacion en la superficie celular, la protefna de fusion prenisina-anclaje se ha modificado de forma intracelular mediante NisB y NisC. La modificacion mediante la protefna de fusion prenisina- anclaje modificada por NisB y NisC, se demostro mediante la actividad antimicrobiana frente a celulas superpuestas, despues de la escision del peptido senal.

Objetivo: El ejemplo 2 muestra que se produce TB5, dando como resultado la presentacion de prenisina en la superficie celular lactococica. En este ejemplo la modificacion de la nisina por NisB y NisC se evaluo con una superposicion de una cepa de L. lactis sensible a la nisina. La inhibicion del crecimiento de esta cepa indico que NisB y NisC modificaron de forma correcta el TB5 y formaron al menos sus anillos A, B y C.

Materiales y metodos

Una placa de agar GM17 con un gel de SDS-PAA lavado de forma extensa o aplicaciones puntuales de celulas de L. lactis NZ9000 productoras de pTB5 se cubrio con la cepa de L. lactis MG1363 o NZ9000 diluida 200 veces en agar de cobertura al 0,5% con tripsina 0,1 mg/ml. Se necesita tripsina para la escision de la senal de la nisina, produciendo nisina activa. Las placas de agar se incubaron durante una noche a 30 °C.

Resultados

La Fig. 4 mostro dos analisis en gel SDS-PAA similares de extractos celulares de L. lactis NZ9000, con y sin enzimas modificantes. El gel tenido con Coomassie (Fig. 4A) mostro que se produjo TB5 en los cultivos inducidos independientemente de la presencia de las enzimas de modificacion. Solo TB5/ BtC inhibio el crecimiento de la

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cepa indicadora, observado como una zona de aclarada (halo) en la superposicion (Fig. 4B). Esto indico que NisB y NisC modificaron de forma correcta a TB5, produciendo nisina activa. Se obtuvieron resultados similares con el analisis de superposicion en celulas enteras (Fig. 4C). Se encontro nisina activa para las celulas lactococicas productoras de tB5 que contenfan modificacion en las enzimas de transporte. Dado que la senal de la nisina solo es accesible para la tripsina desde el exterior, la nisina activa se presenta en la superficie celular lactococica. Ademas, la escision especffica de la senal de la nisina mediante NisP, dio como resultado la inhibicion del crecimiento, lo que sugiere que la nisina inmovilizada tiene todavfa actividad antimicrobiana.

Resumiendo, NisB y NisC modificaron de forma correcta la protefna de fusion nisina-anclaje TB5, dado que se observo nisina activa con una cepa sensible a la nisina en una superposicion sobre gel de SDS-PAA y sobre celulas enteras. Por lo tanto, la porcion de anclaje de TB5 proporciono las senales para la union covalente de TB5 a la capa de peptidoglucano, presentando de este modo nisina activa sobre la superficie celular lactococica.

EJEMPLO 4: Es necesario el anclaje completo a la membrana para la presentacion estable del peptido modificado por NisB y NisC.

Objetivo: liberacion de construcciones truncadas de prenisina-anclaje para facilitar los analisis por espectrometrfa de masas.

Metodos

186 aminoacidos de la protefna completa: MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLC

TPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVSKIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDG

TTGTSDKGGGQGTPAPAPGDIGKDKGDEGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSTDDTTDRNGQLTSGKGALPKTGETTE

R-PAFGFLGVIVVILMGVLGLKRKQREE

Se prepararon cuatro variantes truncadas, vease Fig. 1B; pTB5-tr1

Cola de membrana cargada inmediatamente anterior (KRKQREE)

MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVS

KIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDGTTGTSDKGGGQGTPAPAPGDIGKDKGD

EGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSTDDTTDRNGQLTSGKGALPKTGETTERPAFGFLG

VIWILMGVLGL

179 aminoacidos

pTB5-tr2

Secuencia LPKTG inmediatamente anterior

MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVS

KIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDGTTGTSDKGGGQGTPAPAPGDIGKDKGD

EGSQPSSGGNIPTNPATTTSTSTDDTTDRNGQLTSGKGA

150 aminoacidos

pTB5-tr3

MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVS

KIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDGTTGTSDKGGGQGTPAPAPGDI

105 aminoacidos

pTB5-tr4

MSTKDFNLDLVSVSKKDSGASPRITSISLCTPGCKTGALMGCNMKTATCHCSIHVS

KIEGRGQSLKTKVAAAVEAAKTVGKGDGT

85 aminoacidos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Se expresaron variantes truncadas de prenisina-anclaje TB5. Se precipitaron los peptidos en el sobrenadante mediante precipitacion por TCA y se analizaron con SDS PAGE.

Resultados

-Actividad antimicrobiana

Con las variantes truncadas 2,3,4 parece haber algun efecto del sobrenadante sobre el crecimiento de la cepa indicadora MG1363. Esto indica que los peptidos se modifican y liberan. Con estas variantes existe tambien algo de autoinduccion. No se encontro inhibicion del crecimiento con la variante truncada 1. Esta variante contiene la parte transmembranaria de membrana y probablemente permanece al menos en gran parte asociada con la celula.

-En el gel de SDS PAA, se observo una banda que migra de forma identica para todas las variantes truncadas. Esta banda peptfdica parecio migrar al peso molecular de la banda peptfdica unica de la nisina A, se observo en el sobrenadante precipitado con TCA, como se muestra en el gel de SDS-PAA tenido con Coomassie. El analisis de superposicion demostro que este peptido inhibfa el crecimiento de la cepa indicadora. La produccion de esta banda de nisina fue mayor cuando la protefna truncada era mas corta (datos no presentados).

Conclusion

La parte de anclaje de TB5 estabiliza la protefna de fusion de prenisina-anclaje TB5. En ausencia de esta parte se produce degradacion y se libera nisina activa.

EJEMPLO 5: Presentacion en superficie de analogos cfclicos de la angiotensina

Objetivo: Demostrar la presentacion en superficie y modificacion de la angiotensina-(1-7). La presentacion en superficie se evaluo con un ELISA de celulas enteras. La modificacion de la angiotensina-(1-7) se demostro con anticuerpos inducidos de forma especffica contra la angiotensina-(1-7) cfclica, con hemocianina de lapa californiana (HLC) como protefna portadora.

Materiales y metodos

La secuencia codificante de la angiotensina(1-7) (DRVSHIC) se fusiono de forma traduccional con la secuencia del peptido senal de la nisina, separados mediante una secuencia de reconocimiento de factor Xa (IEGR). Esto dio como resultado el vector de presentacion en superficie de la angiotensina-(1-7) pTB2 (Fig. 1A). Se cultivaron celulas de L. lactis NZ9000 y NZ9000 (plL3BTC) con pTB2 con y sin induccion de TB2. Se recogieron celulas a partir de estos cultivos de produccion, se lavaron con PBS y finalmente se suspendieron de nuevo en PBS hasta una DO600 “ 20-30. El ELISA de celulas enteras se realizo como se describio en el ejemplo 2.

Ademas, la produccion de la protefna peptido senal de la angiotensina-(1-7)-anclaje se analizo mediante SDS- PAGE y transferencia de Western utilizando anticuerpos antiangiotensina-(1-7) cfclica.

Resultados

Las celulas de los cultivos inducidos generaron una respuesta de color positiva para el TB2 modificado, asf como para el TB2 no modificado (Fig. 5A). Esto demostro que el peptido senal era accesible desde el exterior y por lo tanto la angiotensina-(1-7) se presentaba en la superficie celular lactococica.

El analisis por SDS-PAGE de los extractos celulares de celulas L lactis que presentaban TB2 mostro claramente una banda de protefna que migraba a alrededor de la banda marcadora de 24,9 kDa. El analisis de Western con anticuerpos antiangiotensina-(1-7) cfclica identifico esta banda de protefna como TB2 (Fig. 5B). Los anticuerpos de angiotensina-(1-7) cfclica utilizados se indujeron en raton frente a angiotensina(1-7) cfclica purificada con HLC como protefna portadora. En ELISA convencional, estos anticuerpos eran por lo menos 104 veces mas especfficos para la angiotensina-(1-7) cfclica que para su equivalente lineal. Por lo tanto, los anticuerpos antiangiotensina-(1-7) cfclica reconocfan de forma especffica la angiotensina-(1-7) modificada. La transferencia de Western mostro de forma clara una senal inmunorreactiva de los anticuerpos de angiotensina-(1-7) cfclica con TB2 modificado (Fig. 5B, calle 2), mientras que no se encontro senal con TB2 no modificado (Fig. 5B, calle 1)). Esto indico que la angiotensina-(1-7) presentada estaba modificada por NisB y NisC. El analisis MaIdi TOF muestra que la angiotensina-(1-7) presentada esta deshidratada (Fig. 5C) y ciclada (Fig. 5D).

EJEMPLO 6: Analisis por espectrometrfa de masas del TB1 modificado

Objetivo: Demostrar la modificacion de la nisina en TB1 mediante analisis por MALDI-TOF

Materiales y metodos

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

Para facilitar la purificacion y el analisis se construyo el vector pTB1 de presentacion en la superficie lactococica. El plasmido pTB1 codificaba una secuencia de reconocimiento de la proteasa 3C de rinovirus humano (proteasa PreScission, GE Healthcare), para liberar la parte N terminal que codifica el peptido senal, la nisina y la etiqueta Strep Il de la superficie celular lactococica. La secuencia de la etiqueta Strep II se incluyo para fines de purificacion.

Se extrajeron celulas de L. lactis NZ9000 que presentaban TB1 con acido tricloroacetico al 16% durante 30 min en hielo. Las celulas se lavaron dos veces con 1 ml de acetona, se secaron en speed vac, y se suspendieron de nuevo en 0,25 ml de Tris-HCI 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, 1 mg de lisozima y 0,1 mg de mutanolisina. Se realizo la digestion de la pared celular a 37 °C durante 1 h. Se recogieron las celulas mediante centrifugacion y se lavaron dos veces con PBS. Las celulas se suspendieron de nuevo en 1 ml de tampon de escision de proteasas PreScission (Tris-HCI 50 mM, pH 7,0, NaCI 150 mM, EDTA 1 mM, DTT 1 mM) con 40 U de proteasa PreScission (GE Healthcare) y se incubaron a 4 °C durante 24-48 h con rotacion.

Despues de la digestion con la proteasa se recogio el sobrenadante y la parte N terminal etiquetada con Strep del peptido TB1 se purifico utilizando el kit de purificacion en columna de centrifugacion Strep-tactin (IBA, GmbH), de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se precipitaron los peptidos del eluato con TCA al 10% y se disolvieron en agua.

Se registraron los espectros de masas con un espectrometro de masas de desorcion e ionizacion mediante laser asistida por matriz-tiempo de vuelo (MALDI-TOF) Voyager DE PRO en el modo lineal.

Resultados

La parte N terminal purificada de TB1 se analizo mediante MALDI-TOF (Fig. 6). El espectro de la Fig. 6A muestra un pico de masa alrededor de 7975 Da, que correspondfa a la parte N terminal de TB1 de longitud completa indicada de forma esquematica en la figura. Este pico desaparecio cuando la muestra se trato con tripsina, aunque emergio un pico de masa alrededor de 3389 Da (Fig. 6b). Este ultimo pico de masa correspondfa a la parte de nisina de TB1. El hecho de que este fragmento apareciera demuestra ya la modificacion de la nisina, dado que esta protegida frente a la digestion por tripsina. La Fig. 6C muestra un analisis mas detallado del pico de masa de la nisina a partir de TB1. Por lo menos los picos de masas de deshidratacion de siete y seis veces estan presentes claramente en el espectro de la nisina de tB1. En comparacion con la nisina segregada, esta ausente el pico de deshidratacion de 8 veces (Fig. 6D).

Conclusion: Estos datos demuestran que la nisina en TB1 esta modificada y contiene al menos 7 deshidrataciones.

EJEMPLO 7:

Objetivo:

Seleccion del peptido de union a estreptavidina mediante presentacion y cribado Materiales y metodos

Para demostrar la prueba de principios de la presentacion y cribado, se realizaron experimentos orientados a la seleccion de un peptido de union a la estreptavidina a partir de una biblioteca que contiene ISXXXCNMKTATCFICSIFIVSK, donde X es cualquier aminoacido. Tres aminoacidos aleatorizados se flanquearon con una serina y una cistefna, lo que permite la deshidratacion catalizada por enzimas de la serina y el acoplamiento catalizado por ciclasas de la deshidroalanina resultante a cistefna. El uso de codones NNS para la construccion de bibliotecas permite todos los aminoacidos posibles en cada posicion entre la serina y la cistefna, produciendo una biblioteca con una diversidad de protefnas teorica de 8000 variantes. El tamano estimado de la biblioteca fue de unos 11000 clones independientes. La construccion que codificaba esta biblioteca de presentacion de peptidos tioeter lactococicos se denomino pRND-X3 (Fig. 1A). Los inventores cribaron la biblioteca en busca de ligantes a la estreptavidina. Despues de dos rondas de seleccion magnetica (MACS) utilizando microesferas magneticas recubiertas de estreptavidina, las bacterias seleccionadas se sembraron en placa para su analisis.

Resultados

El analisis de los clones seleccionados produjo de forma exclusiva una unica secuencia: S-MNV-C (pRND-X3-1), que era conocida como un motivo con puentes disulfuro, pero no como un motivo ciclado con tioeteres. La ausencia de variacion de la secuencia entre los peptidos seleccionados analizados se debe probablemente a las restricciones conformacionales que impone el puente tioeter, combinadas con los requerimientos para la union a la estreptavidina. Las celulas lactococicas que presentaban este polipeptido que contiene MNV generaron una respuesta de color positiva en un ELISA de celulas enteras, demostrando asf la union a la estreptavidina. Ademas, la union se suprimio en presencia de biotina, lo que demostro la especificidad para el sitio de union a la biotina (Fig. 7). El analisis con MaIdi TOF revelo que no se anadio CDAP al peptido que contiene MNV, lo que excluye la presencia de una cistefna no modificada, demostrando asf la presencia de un puente tioeter (Fig. 8). Por lo tanto, un peptido con puentes tioeter con afinidad por la estreptavidina se puede seleccionar facilmente a partir de la biblioteca de presentacion de peptidos tioeter lactococicos.

Conclusion: la biblioteca lactococica de peptidos con puentes tioeter presentados en la superficie celular se puede cribar de forma satisfactoria en busca de un ligando especffico.

Claims (15)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   50

   55

   60

   65

   REIVINDICACIONES

   1. Una celula anfitriona grampositiva capaz de modificar de forma postraduccional un polipeptido de interes a un polipeptido que contiene residuos deshidratados o puentes tioeter, donde la celula anfitriona comprende un vector de expresion que comprende una construccion de acido nucleico que codifica un peptido de fusion que comprende, del extremo N al extremo C, por lo menos los siguientes elementos secuenciales:

   (a) Una secuencia senal N terminal de lantibioticos a la que pueda reconocer una lantibiotico deshidratasa, y preferentemente tambien una lantibiotico ciclasa.

   (b) Una secuencia de aminoacidos de interes que se modificara de forma postraduccional a un polipeptido que contiene residuos deshidratados o puentes tioeter.

   (c) Un dominio transmural celular hidrofilo.

   (d) Un motivo de reconocimiento de sortasas.

   (e) Un dominio transmembranario hidrofobo. Y

   (f) Un dominio C terminal cargado de anclaje a la membrana.

   Y donde la celula anfitriona es una bacteria lactica que contiene las correspondientes enzimas de biosfntesis de lantibiotico y el transportador de lantibioticos.
2. 2. Celula anfitriona de acuerdo con la reivindicacion 1, en la que dicha secuencia senal de lantibioticos es una secuencia senal de la nisina.
3. 3. Celula anfitriona de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en la que dicho dominio transmural celular se obtiene del dominio transmural celular de una proteinasa de envoltura celular multidominio de una bacteria lactica.
4. 4. Celula anfitriona de acuerdo con la reivindicacion 3, en la que dicho dominio transmural celular comprende la secuencia de aminoacidos de un dominio transmural celular de prtH de Lactobacillus helveticus, prtP de Lactococcus lactis, scpA de Streptococcus pyogenes o csp de Streptococcus agalactiae o un analogo funcional o fragmento de los mismos.
5. 5. Celula anfitriona de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho motivo de reconocimiento de sortasas comprende la secuencia de aminoacidos LPXTG, en la que X puede ser el aminoacido D, E, A, N, Q o K, preferentemente en la que dicho motivo de reconocimiento de sortasas consiste en LPKTG.
6. 6. Celula anfitriona de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho dominio transmembranario hidrofobo tiene una longitud de 20 a 30 aminoacidos.
7. 7. Celula anfitriona de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que dicho dominio de anclaje a la membrana cargado tiene una longitud de al menos cuatro residuos de aminoacido, preferentemente donde al menos el 50% de los residuos son aminoacidos cargados positivamente, mas preferentemente residuos Lys o Arg.
8. 8. Celula anfitriona de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la sustancia protefnica comprende adicionalmente, entre los elementos (a) y (b) o entre los elementos (b) y (c), al menos un sitio de escision proteolftica, preferentemente donde el sitio de escision es un sitio de reconocimiento de la proteasa factor Xa, mas preferentemente la secuencia de aminoacidos IEGR, entre los elementos (a) y (b).
9. 9. Celula anfitriona de acuerdo con la reivindicacion 8, que comprende un sitio de reconocimiento de la proteasa 3C de rinovirus humano, preferentemente la secuencia de aminoacidos EALFQGP, entre los elementos (b) y (c).
10. 10. Celula anfitriona de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la secuencia de aminoacidos de interes es un peptido terapeuticamente relevante, preferentemente seleccionado del grupo que consta de una hormona, un inhibidor enzimatico, una activador enzimatico, un ligando receptor, un peptido inhibidor, una protefna lantibiotica y una protefna viral.
11. 11. Celula anfitriona de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, seleccionada de Lactococcus lactis, Bacillus subtilis, Streptococcus pyogenes, Staphylococcus epidermis, Staphylococcus gallinarium, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans, Staphylococcus warnen, Streptococcus salivarius, Lactobacillus sakei, Lactobacillus plantarum, Carnobacterium piscicola, Enterococcus faecalis, Micrococcus varians, Streptomyces OH-4156, Streptomyces cinnamoneus, Streptomyces griseoluteus, Butyrivibrio fibriosolvens, Streptoverticillium hachijoense, Actinoplanes linguriae, Ruminococcus gnavus, Streptococcus macedonicus, Streptococcus bovis.
12. 12. Celula anfitriona de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende NisB, C y T o SpaB, C y T.

    10

    15
13. 13. Una biblioteca de celulas anfitrionas que comprende diversas celulas anfitrionas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en la que cada miembro de dicha biblioteca presenta en su superficie celular un polipeptido diferente que contiene residuos deshidrogenados o puentes tioeter.
14. 14. Un metodo para la identificacion de un polipeptido que contiene residuos deshidrogenados o tioeteres capaz de unirse a una entidad diana de interes, cuyo metodo comprende las etapas de

    (a) Proporcionar una biblioteca de acuerdo con la reivindicacion 13.

    (b) Seleccionar de la biblioteca al menos una celula anfitriona que presente un polipeptido que contiene residuos deshidrogenados o puentes tioeter capaz de unirse a la entidad diana de interes. E

    (c) Identificar la secuencia polipeptfdica presentada en dicha al menos una celula anfitriona seleccionada.
15. 15. Uso de una celula anfitriona de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, como un sistema indicador para evaluar la actividad de la enzima biosintetica o del transportador de lantibioticos.