ES2582866T3 - Procedimiento para la detección de aberraciones cromosómicas - Google Patents

Procedimiento para la detección de aberraciones cromosómicas Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la detección de varias regiones diferentes de cromosomas o ADN en una célula para la detección de aberraciones cromosómicas estructurales, presentando las aberraciones cromosómicas al menos dos regiones de puntos de ruptura dentro de un cromosoma, basadas en fragmentos de ácidos nucleicos marcados de forma directa o indirecta (sondas), caracterizado por que - una primera sonda marcada con un marcador A (sonda A) y una segunda sonda marcada con un marcador B (sonda B) flanquean una región de punto de ruptura 1 que forman señales de fusión A-B y - dos tercera y cuanta sondas (sondas C) marcadas con un marcador C flanquean una región de punto de ruptura 2 que forman las señales de fusión C-C, modificándose las señales de fusión antes mencionadas, en el caso de una aberración cromosómica, en señales de fusión A-C y señales de fusión B-C, las señales de fusión antes mencionadas se modifican, en el caso de una aberración cromosómica, en señales de fusión A-C y señales de fusión B-C.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento para la deteccion de aberraciones cromosomicas
La presente invencion se refiere a un procedimiento para la deteccion de varias regiones diferentes de cromosomas o ADN en una celula para la deteccion de aberraciones cromosomicas estructurales, presentando las aberraciones cromosomicas al menos dos regiones de puntos de ruptura dentro de un cromosoma, basadas en fragmentos de acidos nucleicos marcados de forma directa o indirecta (sondas) y a un preparado adecuado para este procedimiento.
Muchas enfermedades tumorales se basan en mutaciones cromosomicas estructurales tales como translocaciones, inversiones y duplicaciones de segmentos. La deteccion de estas modificaciones como marcador predictivo, de pronostico o de diagnostico diferencial tiene lugar, por norma general, mediante hibridaciones in situ (ISH) utilizando fragmentos de acidos nucleicos marcados por fluorescencia (ISH fluorescente (FISH)), las denominadas sondas, o sondas marcadas con haptenos que, a continuacion, son detectadas con anticuerpos y son visualizadas al microscopio optico mediante reacciones de color (ISH de campo claro (BrISH) - a ellas pertenecen tambien ISH cromogena (CISH) e ISH de plata (SISH)).
La ventaja de las FISH es en este caso que sin una complejidad en la realizacion del metodo pueden detectarse simultaneamente, pero de forma claramente diferenciable entre sf, multiples regiones genomicas. Para ello, fragmentos de acidos nucleicos que se dirigen a diferentes regiones genomicas, son marcados, es decir, acoplados con colorantes de fluorescencia diferentes que se diferencian entre sf en su espectro de absorcion y/o emision. Si sondas multicolores de este tipo se utilizan, p. ej., en preparados de cromosomas metafasicos o en preparados de nucleos celulares de interfase, entonces los distintos colores pueden ser representados de manera separada entre sf mediante el empleo de conjuntos de filtro de microscopio especfficos que conducen a intervalos, definidos con precision, de longitudes de onda de la luz para la excitacion de los colorantes en el preparado, asf como permiten el paso de intervalos, definidos con precision, de longitudes de onda de la luz emitida por los colorantes al analizador (el denominado conjunto de filtro pasabanda sencillo) o bien se representan al mismo tiempo las diferentes senales de fluorescencia de varios fragmentos (en el caso de dos colorantes de fluorescencia diferentes se habla en este caso de un conjunto de filtro pasabanda dual).
A la representacion simultanea se le han impuesto, sin embargo, claros lfmites, dado que las regiones de absorcion y emision de los colorantes se encuentran a menudo tan proximas que no pueden ser separadas una de otra por los conjuntos de filtro del microscopio. Ademas, dos senales de diferentes colores que se superponen conducen a la percepcion de colores mixtos (p. ej., rojo (o naranja) y verde proporcionan en este caso amarillo) que no se pueden diferenciar de senales del mismo color que son el resultado de otro fluorocromo y que no resultaron por solapamiento. Por estos motivos, en la FISH rutinaria se observan simultaneamente la mayona de las veces solamente dos colores (naranja/rojo y verde) o bien tres colores (naranja/rojo y verde simultaneamente con una coloracion opuesta del nucleo azul (DAPI)). Aproximadamente las mismas limitaciones que se establecen para la FISH son validas para la BrISH. En este caso, es estado conocido de la tecnica el uso de dos haptenos, la mayona de las veces elegidos del grupo biotina, dinitrofenilo (DNP) y digoxigenina y dos enzimas acopladas a anticuerpos, la mayona de las veces fosfatasa alcalina y peroxidasa (Carbone et al., J. Mol. Diagn. 2008, 10(6): 527-536; Hopman et al., Histochem. Cell Biol. 1997, 108(4-5) 291-298; Laakso et al., J. Pathol. 2006, 210(1):3-9; Mayr et al., Histopathology 2009, 55(6): 716-723; Tanner et al., Am. J. Pathol. 2000. 157(5): 1467-1472).
Las limitaciones mencionadas en el caso de la representacion simultanea tienen una influencia decisiva sobre las composiciones de las sondas para la deteccion de translocaciones e inversiones. En este caso existen, en principio, dos tecnicas decisivas y composiciones de sondas en la que se fundamentan. El principio de la formacion de senales de fusion (las denominadas estrategias de color dual-fusion dual) (documento WO 02093130, Dewald et al., Blood 1998, 91(9): 3357-3365; Dewald et al., Cancer Genet. Cytogenet. 2000, 116(2): 97-104; Wan et al., J. Clin. Pathol. 2003. 56(6): 471-474) o bien de senales de fusion que se separan (las denominadas estrategias de color dual-separacion o bien color dual-escision (van der Burg et al., Leukemia 1999, 13(12): 2107-2113; Boomer et al., Leukemia 2001, 15(1): 95-102; van der Burg et al., Leukemia 2004, 18(5): 895-908). En la subsiguiente representacion de estos dos principios y modelos de senales derivados se ha de tener en cuenta que una celula normal es, por norma general, diploide, es decir, cada uno de los alelos esta presente por duplicado. Dado que, por norma general, por las aberraciones solo se ve afectado uno de los dos alelos, junto a la senal aberrante se pueden visualizar, por norma general, tambien todavfa la senal normal del alelo no afectado por la aberracion. Para una mejor comprension, en lo que sigue se describe el modelo de senal de la senal normal, no siempre explfcitamente.
En el caso de las estrategias de color dual-fusion dual la region del punto de ruptura 1 es flanqueada proximal y distalmente por fragmentos de acidos nucleicos del mismo color (p. ej., naranja), la region del punto de ruptura 2, es decir, del participante reciproco en la translocacion, es flanqueada de forma proximal y distal por fragmentos de acidos nucleicos de un segundo color (p. ej., verde). La situacion normal, es decir, sin roturas cromosomicas en la region de los dos participates en la translocacion, se caracteriza en este caso por una senal verde y una senal naranja separada en el espacio.
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En el caso de una translocacion redproca se producen roturas dentro de los puntos de ruptura de los dos participantes en la translocacion, y la region proximal de uno de los participantes en la translocacion se fusiona con la region distal del otro participante, y viceversa. Por consiguiente, resultan dos pares de senales verde/naranja, denominadas tambien senales de fusion, dado que a menudo se solapan las senales de diferente color de modo que se visualiza una senal de color mixto. El inconveniente de estas tecnicas de sondas es que las senales de fusion solo se forman cuando los puntos de ruptura de los dos participantes en la translocacion se encuentran en la region de los fragmentos de acidos nucleicos marcados respectivos. En el caso de translocaciones que afectan solo a uno de los dos participantes, no se forman senales de fusion. En este caso, se produce unicamente la formacion de una senal adicional con el color de la senal que es caractenstico para el participante afectado por la translocacion. Es decir, p. ej., se forma una senal verde adicional cuando el punto de ruptura de la translocacion se encuentra en la region que fue cubierta por los acidos nucleicos marcados con el fluorocromo verde. Senales adicionales de este tipo pueden ser cubiertas, sin embargo, a menudo por otros nucleos celulares, encontrarse proximas en el caso de una de las otras senales del mismo color y, por consiguiente, no percibirse como senal adicional, o perderse por artefactos de corte de tejidos. En este caso, puede producirse un diagnostico falso, dado que no se percibe una translocacion que afecta a solo uno de los participantes en la translocacion.
En el caso de las estrategias de color dual-rotura la region de un punto de ruptura es flanqueada de modo proximal y distal por fragmentos de acidos nucleicos marcados de manera diferente o marcados con color (p. ej., naranja distal, verde proximal). La situacion normal, es decir, sin una ruptura cromosomica de esta region se caracteriza en este caso por una senal de fusion. En una situacion aberrante, es decir, cuando se produce una ruptura cromosomica entre los fragmentos de sondas, las senales se separan una de otra en el espacio. La diferencia entre la situacion normal y la situacion aberrante se caracteriza, por lo tanto, por la distancia de senales de distinto color.
El inconveniente de estas composiciones de sondas es que no son posibles afirmaciones sobre los participantes en la translocacion implicados. Ademas, condicionado por el eje de vision con el que el observador mira el nucleo celular en interfase, puede suceder que dos senales separadas en el espacio que, en relacion con el eje de vision, se encuentren superpuestas, sigan siendo percibidas como senal de fusion.
Junto a las aplicaciones de dos colores arriba mencionadas, se utilizan en los analisis de FISH tambien sondas de tres colores, cuatro colores y cinco colores. En este caso, junto a los colores de fluorescencia convencionales claramente mas intensos naranja/rojo y verde se utilizan los otros colores disponibles mas debiles, p. ej., oro o rojo o azul. Por lo tanto, en aplicaciones rutinarias se utilizan, por ejemplo, sondas de FISH de cuatro colores solo para la deteccion de deleciones o amplificaciones (documentos EP 1035215B1, WO 2007/028031, EP 0549709B1), ya que en este caso, la mayona de las veces en el caso de las marcaciones de las sondas, solo se puede recurrir a secuencias repetitivas para el refuerzo de las intensidades de color, p. ej., de azul y oro.
Las estrategias de FISH triples descritas por Fink et al. (Leuk. Res. 2009, 33(6): 843-846) se dirigen a la deteccion de sucesos de translocacion diferentes que pueden asociarse uno junto a otro en una region cromosomica (es decir, estan afectados diferentes genes que se encuentran en la vecindad). En este caso, para la correspondiente evaluacion de los modelos de senales se consideran en cada caso solo dos colores que detectan una aberracion individual, no jugando entonces papel alguno respectivo el tercer color.
En relacion con la BrISH utilizando mas de dos colores, Hopman et al. (Histochem. Cell Biol. 1997, 108(4-5):291- 298) describe una realizacion de una hibridacion in situ triple cromogena que, en general, fija como objetivo la deteccion de tres regiones cromosomicas repetitivas. De acuerdo con el estado actual de la tecnica, las translocaciones se detectan mediante BrISH solo utilizando dos haptenos y, por consiguiente, dos colorantes.
Asimismo, se desconoce el uso del metodo BrISH para la deteccion de inversiones e inserciones.
Las inversiones y, en particular, las pequenas inversiones no pueden ser detectadas con las tecnicas y procedimientos que se describen en las solicitudes de patente Wo 02093130A3 y WO 2005/111235 A2. El documento WO 2005/111235 A2 describe un procedimiento que presenta el uso de sondas de tres colores. Sin embargo, la region del cromosoma que es marcada por el 3er marcador de una sonda, no se ve afectada directamente por la modificacion, de modo que en el caso de una modificacion estructural del cromosoma se elimina la primera senal de fusion y, en este caso, se forma una nueva senal de disociacion y una nueva senal de fusion. Este suceso, en el caso de inversiones, en particular inversiones pequenas, no se puede diferenciar o solo se diferencia muy mal de una situacion normal.
El documento WO 02093130A3 da a conocer un procedimiento para la deteccion de translocaciones cromosomicas utilizando dos o bien cuatro marcadores/colorantes, en este caso, las sondas se hibridan en diferentes cromosomas. Este procedimiento se adecua solo de forma condicionada para la deteccion de inversiones. Ademas, el proceso de evaluacion es claramente mas complicado en virtud de la pluralidad de las senales que se pueden derivar de los cuatro marcadores/colorantes.
Ademas, el documento WO 2009/102446 A2 se refiere a procedimientos y composiciones especialmente para la deteccion de inversiones cromosomicas entre EML4 y ALK mediante FISH, pudiendo emplearse la hibridacion in situ de fluorescencia descrita en el mismo, en particular para fines diagnosticos y de pronostico, asf como para
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estrategias terapeuticas. Para el procedimiento de deteccion se emplean unicamente dos sondas para una estrategia de color dual-fusion sencilla.
Ademas, Osoegawa Atsushi et al. describen, en el marco de la publicacion cientffica “Incidentally proven pulmonary ALKoma” publicada en Intern. Med. 2010, un procedimiento para la deteccion de inversiones EML4-ALK mediante FISH que se basa en una estrategia de senal de disociacion o bien una estrategia de color dual-rotura con dos sondas.
Todos los metodos y composiciones de sondas para BrISH y FISH disponibles actualmente en relacion con inversiones, en particular, pero no limitadas a las mismas, en el caso de tumores tienen carencias. No existen composiciones de sondas y metodos y sus modelos de senales resultantes que permitan en cualquier caso el reconocimiento seguro de una inversion. En particular, en el caso de pequenas inversiones, es decir, inversiones de segmentos genomicos cortos (por ejemplo, regiones menores que 20 Mb), este suceso de aberracion no es reconocido la mayona de las veces.
Por lo tanto, es mision de la presente invencion proporcionar un procedimiento con el que se posibilite una deteccion mas segura de aberraciones cromosomicas estructurales, presentando las aberraciones cromosomicas al menos dos regiones de puntos de ruptura dentro de un cromosoma.
Para la solucion del problema, se propone un procedimiento del tipo mencionado al comienzo, en el que
- una primera sonda marcada con un marcador A (sonda A) y una segunda sonda marcada con un marcador B (sonda B) flanquean una region de punto de ruptura 1 que forman senales de fusion A-B y
- dos tercera y cuanta sondas (sondas C) marcadas con un marcador C flanquean una region de punto de ruptura 2 que forman las senales de fusion C-C, modificandose las senales de fusion antes mencionadas, en el caso de una aberracion cromosomica, en senales de fusion A-C y senales de fusion B-C.
La region del punto de ruptura 1 y la region del punto de ruptura 2 describen posibles puntos de ruptura dentro de un cromosoma.
El termino “flanquear” se entiende en este caso de modo que la sonda A y la sonda B se hibridan en cada caso en un lado de la region del punto de ruptura 1, y analogamente las sondas C se hibridan en cada caso en un lado de la region del punto de ruptura 2.
Es asimismo imaginable extender la sonda C a lo largo de la region del punto de ruptura 2 con el fin de obtener el mismo efecto, a saber la formacion de las senales de fusion C-C.
Por sondas se entienden fragmentos de acidos nucleicos que estan marcados con un determinado marcador.
El procedimiento de acuerdo con la invencion permite, con respecto a los metodos y composiciones conocidos arriba mencionados, por vez primera una deteccion inequvoca y/o incluso posible por vez primera de inversiones, en particular tambien inversiones genomicas pequenas, asf como tambien la diferenciacion inequvoca con translocaciones.
Preferiblemente, en el caso de los fragmentos de acidos nucleicos marcados (sondas) se trata de polinucleotidos, polinucleotidos modificados o fragmentos de acidos nucleicos modificados u oligonucleotidos u oligonucleotidos modificados.
Por ejemplo, para el experto en la materia son conocidos PNA y LNA para polinucleotidos modificados.
Preferiblemente, los fragmentos de acidos nucleicos presentan diferentes marcadores A, B y C, por consiguiente se forman tambien diferentes sondas A, B y C.
Para ello, se utiliza una combinacion a base de tres colorantes de fluorescencia diferentes en la FISH o tres moleculas informadoras diferentes en la BrISH para la marcacion de los fragmentos de acidos nucleicos (o en general polinucleotidos o tambien oligonucleotidos).
Preferiblemente, el marcador se elige del grupo de colorantes, sustratos colorantes, colorantes de quimioluminiscencia (p. ej., acridinio), radioisotopos, marcadores de espm, enzimas (p. ej., fosfatasa alcalina, peroxidasa de rabano picante, peroxidasa de soja y/o beta-galactosidasa), haptenos (p. ej., digoxigenina, biotina, 5(6)-carboxifluorescema, rodamina, bromodesoxiuridina, acetilaminofluoreno, trinitrofenol, derivado de trinitrofenol, estradiol y/o DNP), puntos cuanticos, perlas, aminohexilos, pirenos y colorantes de fluorescencia (p. ej., fluorescema, derivado de fluorescema, 5(6)-carboxifluorescema, cumarina, derivado de cumarina, rodamina, derivado de de rodamina, tetrametilrodamina, lisamina, rojo Texas, AMCA, TRITC, colorante IR, colorante Alexa, colorante Dyomics, ficoeritrina, azul cascada, verde Oregon 488, azul Padfico y/o verde rodamina).
El procedimiento de acuerdo con la invencion tambien se puede llevar a cabo mediante el metodo FISH utilizando tres colorantes de fluorescencia directamente incorporados para las regiones de emision verde, rojo y oro.
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Tambien mediante el metodo FISH, utilizando tres colorantes de fluorescencia incorporados directamente para las regiones de emision verde, rojo y oro, el procedimiento se puede llevar a cabo.
La evaluacion tiene lugar preferiblemente mediante analisis de senales de fluorescencia.
Preferiblemente, el procedimiento de acuerdo con la invencion se lleva a cabo mediante el metodo BrISH utilizando biotina, digoxigenina y DNP que se unen con fosfatasa alcalina acoplada a anticuerpos, peroxidasa acoplada a anticuerpos y beta-galactosidasa acoplada a anticuerpos.
Sorprendentemente, se comprobo que en el caso del procedimiento de acuerdo con la invencion se forman nuevas senales de fusion A-C y B-C, formandose las senales de fusion A-C o bien B-C a traves de un suceso de disociacion de dos colores de las senales de fusion A-B y a traves de un suceso de disociacion de un color de las senales de fusion C-C. Como modelo de senales que resultan con ello (bajo el uso/observacion/evaluacion simultaneos del tercer color/del tercer marcador) se pueden observar en este caso dos nuevas senales de fusion. Por consiguiente, el procedimiento de acuerdo con la invencion permite por vez primera y de manera sorprendente las detecciones arriba mencionadas de las aberraciones arriba mencionadas que no son posibles o solo lo son de forma insuficiente con el estado conocido de la tecnica. En este caso, una evaluacion simultanea del tercer color/tercer marcador junto a los otros dos colores/marcadores permite el reconocimiento por vez primera o inequvoco de la aberracion.
Tambien en el caso de inversiones genomicas, en particular, pero no limitadas a ellas, de inversiones pequenas con segmentos genomicos que estan afectados por la inversion, menores que 20 Mb, la separacion en el espacio de las senales puede ser tan pequena que siguen siendo percibidas como una senal de fusion. En estos casos, puede producirse un diagnostico erroneo, dado que una translocacion no es percibida como tal.
El procedimiento de acuerdo con la invencion es particularmente adecuado para la deteccion de inversiones y/o inserciones y/o duplicaciones.
Preferiblemente, para la deteccion de inversiones, inserciones y/o duplicaciones de segmentos genomicos cortos.
De manera particularmente preferida, los segmentos genomicos invertidos, insertados y/o duplicados se encuentran en la region menor que 20 Mb, preferiblemente menor que 15 Mb, de manera particularmente preferida menor que 10 Mb y todavfa mas preferiblemente menor que 5 Mb.
En el caso de inversiones de segmentos genomicos cortos resultan dos nuevas senales de fusion compuestas que, por ejemplo, en un analisis FISH en la interfase se pueden reconocer claramente mediante conjuntos de filtro adecuados habituales. Sin embargo, no se ha de excluir el hecho de que en el caso de regiones de puntos de ruptura mayores, las senales de fusion A-C o B-C se encuentren separadas en el espacio, de modo que las senales no pueden ser ya reconocidas ineqmvocamente como senales de fusion. Al menos, en estos casos se presenta entonces de forma separada una senal C.
Asimismo, es posible diferenciar, con ayuda del procedimiento de acuerdo con la invencion, inversiones de translocaciones.
Preferiblemente, el procedimiento de acuerdo con la invencion se emplea para la deteccion de inversiones, estando afectadas la inversion inv(2)(p22-p21p23) y/o los genes ALK y/o EML4.
En la FISH pueden percibirse en este caso basicamente al menos dos de los colorantes de fluorescencia simultaneamente mediante un correspondiente conjunto de filtro, lo cual permite un rastreo rapido y sencillo analogamente a las estrategias de sondas de dos colores arriba mencionadas, pero, ademas de ello, ofrece una seguridad diagnostica adicional.
En lo que sigue se describen con mas detalle las ventajas de una deteccion genomica de inversiones mediante las nuevas composiciones de sondas y las nuevas tecnicas ISH:
la deteccion segura o inequvoca de la inversion de segmentos genomicos cortos (regiones menores que 20 Mb) no es posible con composiciones de sondas habituales. Ademas, la deteccion de la inversion de segmentos genomicos mayores (regiones mayores que 20 Mb) es a menudo solo posible con dificultad. Estado conocido de la tecnica son en este caso diferentes conceptos de sondas. En el caso mas sencillo, se observa solo una de las dos regiones del punto de ruptura con una estrategia de color dual-rotura. En el caso de una inversion se produce en este caso una separacion en el espacio de las senales de fluorescencia. Esta separacion de senales se manifiesta, sin embargo, tambien en el caso de translocaciones redprocas habituales que implican a la region del punto de ruptura, de las que no es posible una diferenciacion con este concepto de sondas.
Otro inconveniente es que en el caso de sondas y tecnicas de color dual-rotura se produce tambien en un estado no re-organizado una separacion de la senal de fusion en senales de fluorescencia situadas proximas una junto a otra, pero perceptibles una de otra forma separada. Si el segmento genomico de la inversion per se es solo muy corto (p. ej., menor que 20 Mb) esto puede conducir a que la separacion de la senal en el espacio esperada solo sea no esencialmente mayor y, por consiguiente, pueda ser omitida. Con esta estrategia no es, por consiguiente, posible
una diferenciacion entre inversion y translocacion redproca, ademas, situaciones aberrantes pueden ser interpretadas erroneamente como no re-organizadas.
En el caso de una estrategia de color dual-fusion dual, la region del punto de ruptura proximal sena cubierta, p. ej., con fragmentos de acidos nucleicos marcados en verde, y la region del punto de ruptura distal sena cubierta, p. ej., 5 con fragmentos de acidos nucleicos marcados en naranja. En el caso de la inversion de un segmento genomico corto, p. ej., menor que 20 Mb, resultanan dos senales verdes situadas muy proximas una junto a otra y asimismo dos senales naranjas situadas muy proximas una junto a otra. En el caso de la superposicion de senales resultanan, por consiguiente, dos senales de fusion situadas muy proximas una junto a otra, que en virtud de su proximidad en el espacio, por ejemplo tambien en el caso de un conjunto de filtro pasabanda dual correspondiente, no podnan ser 10 percibidas a menudo con seguridad como dos senales de fusion separadas. En este caso, podna poner remedio, por ejemplo, tambien el uso de conjuntos de filtro pasabanda sencillos, espedficos para los dos colores de senales. Sin embargo, esto ralentizana el proceso de evaluacion y lo complicana. Ademas de ello, en el caso de segmentos de cromatina descondensada, tambien en el caso de alelos normales, se produce a menudo la formacion de senales alargadas a modo de un collar de perlas, de las que, en virtud de una inversion, dos senales separadas en el 15 espacio no se pueden diferenciar obligatoriamente. La interpretacion erronea de dos senales de fusion situadas proximas una junto a otra como solo una senal de fusion conducina a una afirmacion diagnostica falsa negativa.
La composicion de las sondas de la presente invencion combina, entre otros, tambien la estrategia de color dual- rotura para la deteccion de la rotura en una de las dos regiones del punto de ruptura con una estrategia de color sencillo-rotura utilizando un tercer marcador, p. ej. fluorocromo, en la FISH, p. ej., azul, que puede ser detectado de 20 forma separada de los dos primeros marcadores, p. ej., colorantes (p. ej. verde y naranja), para la deteccion de la ruptura en la segunda region del punto de ruptura. En el caso de una inversion se produce en este caso, por ejemplo en el caso de una aplicacion de FISH en el conjunto de filtro pasabanda dual, por norma general, una separacion perceptible de las senales de fusion en una senal verde y naranja separada en el espacio. Al mismo tiempo se produce, por ejemplo, perceptible en un segundo conjunto de filtro, espedfico para azul, por parte de la ruptura en la 25 segunda region del punto de ruptura, una separacion de la senal azul en dos senales separadas en el espacio. A diferencia de las estrategias habituales una inversion se caracteriza, por lo tanto, por dos sucesos perceptibles de manera diferente entre sf, lo cual conduce a una afirmacion diagnostica claramente mas segura, precisamente en el caso de modelos de senales no claros. Asf, en el caso de una separacion de senal verde-naranja no clara puede tener lugar una confirmacion a traves de la evaluacion en el conjunto de filtro pasabanda sencillo para la senal azul. 30 Si tambien en este caso se produce una senal azul adicional y se co-localizan en cada caso una senal azul con en cada caso una senal verde y una senal naranja, entonces esto se considera como confirmacion de la inversion. Sin embargo, si se presenta un modelo de senal azul normal, entonces la senal verde-naranja se considera asimismo como no aberrante. En el caso de una separacion inequvoca de la senal en una senal verde y una senal naranja, la evaluacion del modelo de senal azul sirve para la diferenciacion entre una inversion, en este caso se presenta una 35 senal azul adicional, y una translocacion con participates desconocidos en la translocacion, en este caso se presenta un modelo de senal azul normal.
Otro objeto de la invencion es un preparado de acuerdo con la invencion para la deteccion de varias regiones de cromosomas o ADN diferentes en una celula para la deteccion de aberraciones cromosomicas estructurales, presentando las aberraciones cromosomicas al menos dos regiones de punto de ruptura en un cromosoma, 40 basandose en fragmentos de acidos nucleicos (sondas) marcados de forma directa o indirecta, que comprende
- una primera sonda marcada con un marcador A (sonda A) y una segunda sonda marcada con un marcador B (sonda B) flanquean una region de punto de ruptura 1 que forman senales de fusion A-B y
- dos tercera y cuanta sondas (sondas C) marcadas en cada caso con un marcador C flanquean una region de punto de ruptura 2 que forman las senales de fusion C-C, modificandose las senales de fusion antes mencionadas,
45 en el caso de una aberracion cromosomica, en senales de fusion A-C y senales de fusion B-C.
Preferiblemente, el preparado de acuerdo con la invencion presenta sondas que estan marcadas con los marcadores arriba mencionados.
Con ayuda de los siguientes dibujos y ejemplos se describe con mayor detalle la invencion. Muestran:
Fig. 1: representacion esquematica de un procedimiento de acuerdo con la invencion para la deteccion de una 50 inversion
Fig. 2: esquema de modelos de senales en el caso de utilizar una sonda FISH triple “Sonda ZytoLight SPEC ALK/EML4 TriCheck™” de la razon social ZytoVision GmbH
Fig. 3: analisis por FISH para la deteccion de la inversion inv(2)(p22-p21p23) utilizando la sonda de FISH triple “Sonda ZytoLight SPEC ALK/EML4 TriCheck™”
55 Fig. 4: analisis de CISH para la deteccion de la inversion nv(2)(p22-p21p23) utilizando la sonda de FISH triple “Sonda ZytoDot 2C SPEC ALK/EML4 Tri-Check™” de la razon social ZytoVision GmbH
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45
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La Fig. 1 muestra una representacion esquematica de un procedimiento de acuerdo con la invencion para la deteccion de una inversion utilizando tres marcadores. Muestra el modelo de senales en el caso de la inversion inv(2)(p22-p21 p23) que afecta a los genes ALK y EML4. Los marcadores A y B de una sonda ISH triple flanquean en cada caso un lado de la region del punto de ruptura 1 (ALK) y el marcador C flanquea en cada caso un lado de la region del punto de ruptura 2 (EML4).
En la interfase de una celula normal (sin aberraciones, parte superior de la figura) se pueden reconocer dos senales de fusion consistentes en marcador A y marcador B y dos senales de marcador C. En una interfase afectada por una inversion (parte inferior de la figura) aparece una nueva senal de fusion A-C consistente en el marcador A y el marcador C asf como una nueva senal de fusion B-C consistente en el marcador B y el marcador C. Junto a estas estan senales de fusion y senales individuales del cromosoma normal.
La Fig. 2 muestra un esquema de modelos de senal en el caso de utilizar una sonda de FISH triple “Sonda ZytoLight SPEC ALK/EML4 TriCheck™” de la razon social ZytoVision GmbH. La sonda se compone de polinucleotidos marcados en verde (absorcion a 503 nm y emision a 528 nm) que estan orientados en 2p23 frente a secuencias situadas proximales a la region del punto de ruptura ALK, polinucleotidos marcados en naranja (absorcion a 547 nm y emision 572 nm) que estan orientados en 2p23 frente a secuencias situadas distales a la region del punto de ruptura ALK, asf como polinucleotidos marcados en azul (absorcion a 426 nm y emision a 480 nm) que estan orientados en la region 2p21 a las secuencias situadas distales y proximales en la region del punto de ruptura de EML4.
En el caso de utilizar conjuntos de filtro adecuados, las senales de hibridacion para el gen ALK (2p23) aparecen como senales de fluorescencia verdes y naranjas, las senales de hibridacion para el gen EML4 (2p21) aparecen como senales de fluorescencia azules.
En celulas normales o bien celulas sin re-organizaciones de ALK-EML4, en la interfase aparecen dos senales de fusion verde/naranja en el caso de utilizar un conjunto de filtro pasabanda dual adecuado y dos senales azules en el caso de utilizar un conjunto de filtro pasabanda sencillo adecuado (vease la Fig. 1).
Un locus 2p21-23 afectado por una inversion ALK-EML4 esta caracterizado por una senal verde separada y una senal naranja separada, asf como una senal azul adicional. En este caso, la senal verde separada y la senal naranja estan dispuestas en cada caso junto a una senal azul (vease la Fig. 2).
Un locus 2p21-23 afectado por una inversion ALK-EML4 con una delecion de secuencias 5'-ALK esta caracterizada por la perdida de una senal verde y por una senal azul adicional. En este caso, la senal naranja se encuentra junto a una senal azul (vease la Fig. 3).
Una senal verde separada y una senal naranja separada en combinacion con un numero normal de senales azules (vease la Fig. 4) representa una translocacion aLk sin inclusion de EML4 o, cuando las senales verde y naranja separadas se encuentran muy proximas una junto a otra, representan un locus 2p21-23 no re-organizado.
La Fig. 3 muestra un analisis de FISH para la deteccion de la inversion inv(2)(p22-p21p23) utilizando la sonda FISH triple “Sonda ZytoLight SPEC ALK/EML4 Triple Check™”. La sonda se compone de polinucleotidos marcados en verde (absorcion a 503 nm y emision a 528 nm) que estan orientados en 2p23 frente a secuencias situadas proximales a la region del punto de ruptura ALK, polinucleotidos marcados en naranja (absorcion a 547 nm y emision a 572 nm) que estan orientados en 2p23 frente a secuencias situadas distales a la region del punto de ruptura ALK, asf como polinucleotidos marcados en azul (absorcion a 426 nm y emision 480 nm) que estan orientados en la region 2p21 frente a secuencias situadas distales y proximales a la region del punto de ruptura de EML4. Con conjuntos de filtro adecuados se puede visualizar el modelo de senal.
La Fig. 4 muestra un analisis por FISH para la deteccion de la inversion inv(2)(p22-p21p23) utilizando la sonda de CISH triple “Sonda ZytoDot 2C SPEC ALK/EML4 Tri-Check™”. La sonda se compone de polinucleotidos marcados con digoxigenina que estan dirigidos en dos 2p23 frente a secuencias situadas proximales a la region del punto de ruptura de ALK. Polinucleotidos marcados con DNP, que estan dirigidos en 2p23 frente a secuencias situadas distales a la region del punto de ruptura de ALK, asf como polinucleotidos marcados con biotina que estan dirigidos en la region 2p21 frente a secuencias situadas distales y proximales a la region del punto de ruptura de EML4. La deteccion de las marcaciones tuvo lugar a traves de anticuerpos primarios (no marcados) (anti-DIG/anti-DNP/anti- BIO) que son detectados por anticuerpos conjugados por enzima polimerizados secundarios (polfmero HRP/polfmero AP/beta-GAL), asf como la reaccion enzimatica de los sustratos (AP-RED/HRP-GREEN/beta-GAL- BLUE) que conduce a la formacion de senales rojas, verdes y azules intensas permanentes que se pueden representar al microscopio optico, p. ej., con una lente seca 40x.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para la deteccion de varias regiones diferentes de cromosomas o ADN en una celula para la deteccion de aberraciones cromosomicas estructurales, presentando las aberraciones cromosomicas al menos dos regiones de puntos de ruptura dentro de un cromosoma, basadas en fragmentos de acidos nucleicos marcados de forma directa o indirecta (sondas), caracterizado por que
    - una primera sonda marcada con un marcador A (sonda A) y una segunda sonda marcada con un marcador B (sonda B) flanquean una region de punto de ruptura 1 que forman senales de fusion A-B y
    - dos tercera y cuanta sondas (sondas C) marcadas con un marcador C flanquean una region de punto de ruptura 2 que forman las senales de fusion C-C, modificandose las senales de fusion antes mencionadas, en el caso de una aberracion cromosomica, en senales de fusion A-C y senales de fusion B-C,
    las senales de fusion antes mencionadas se modifican, en el caso de una aberracion cromosomica, en senales de fusion A-C y senales de fusion B-C.
  2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, caracterizado por que en el caso de las sondas se trata de polinucleotidos, polinucleotidos modificados o fragmentos de acidos nucleicos modificados u oligonucleotidos u oligonucleotidos modificados.
  3. 3. Procedimiento segun la reivindicacion 2, caracterizado por que las sondas A, B y C son marcadores diferentes.
  4. 4. Procedimiento segun la reivindicacion 3, caracterizado por que el marcador se elige del grupo que comprende colorantes, sustratos colorantes, colorantes de quimioluminiscencia (p. ej., acridinio), radioisotopos, marcadores de espm, enzimas (p. ej., fosfatasa alcalina, peroxidasa de rabano picante, peroxidasa de soja y/o beta-galactosidasa), haptenos (p. ej., digoxigenina, biotina, 5(6)-carboxifluorescema, rodamina, bromodesoxiuridina, acetilaminofluoreno, trinitrofenol, derivado de trinitrofenol, estradiol y/o DNP), puntos cuanticos, perlas, aminohexilos, pirenos y colorantes de fluorescencia (p. ej., fluorescema, derivado de fluorescema, 5(6)-carboxifluorescema, cumarina, derivado de cumarina, rodamina, derivado de de rodamina, tetrametilrodamina, lisamina, rojo Texas, AMCA, TRITC, colorante IR, colorante Alexa, colorante Dyomics, ficoeritrina, azul cascada, verde Oregon 488, azul Padfico y/o verde rodamina).
  5. 5. Procedimiento segun la reivindicacion 3, caracterizado por que el procedimiento se lleva a cabo por el metodo de FISH utilizando tres colorantes de fluorescencia directamente incorporados para las regiones de emision verde, rojo y azul.
  6. 6. Procedimiento segun la reivindicacion 3, caracterizado por que el procedimiento se lleva a cabo por el metodo FISH utilizando tres colorantes de fluorescencia directamente incorporados para las regiones de emision verde, naranja/rojo y oro.
  7. 7. Procedimiento segun la reivindicacion 3, caracterizado por que el procedimiento se lleva a cabo por el metodo BrISH utilizando biotina, digoxigenina y DNP, que se unen con fosfatasa alcalina acoplada a anticuerpos, peroxidasa acoplada a anticuerpos y beta-galactosidasa acoplada a anticuerpos.
  8. 8. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, para la deteccion de inversiones, inserciones y/o duplicaciones.
  9. 9. Procedimiento segun una de las reivindicaciones precedentes, para la deteccion de inversiones, inserciones y/o duplicaciones de segmentos genomicos cortos.
  10. 10. Procedimiento segun la reivindicacion 9, caracterizado por que se detectan segmentos genomicos invertidos, insertados y/o duplicados en un intervalo menor que 20 Mb, preferiblemente menor que 15 Mb, de manera particularmente preferida menor que 10 Mb y todavfa mas preferiblemente menor que 5 Mb.
  11. 11. Procedimiento segun la reivindicacion 8, caracterizado por que son visibles en el modelo de senales las protemas de fusion A-C o B-C modificadas en un intervalo grande de puntos de ruptura como senal de fusion A-C y senal C / senal B o como senal de fusion B-C y senal C / senal A.
  12. 12. Procedimiento segun la reivindicacion 9, para la diferenciacion de inversiones y translocaciones.
  13. 13. Procedimiento segun la reivindicacion 8, para la deteccion de inversiones, estando afectadas la inversion inv(2)(p22-p21 p23) y/o los genes ALK y/o EML4.
  14. 14. Preparado para la deteccion de varias regiones de cromosomas o ADN diferentes en una celula para la deteccion de aberraciones cromosomicas estructurales, presentando las aberraciones cromosomicas al menos dos regiones de punto de ruptura dentro de un cromosoma, basandose en fragmentos de acidos nucleicos (sondas) marcados de forma directa o indirecta, que comprende
    - una primera sonda marcada con un marcador A (sonda A) y una segunda sonda marcada con un marcador B (sonda B) flanquean una region de punto de ruptura 1 que forman senales de fusion A-B y
    - dos tercera y cuanta sondas (sondas C) marcadas en cada caso con un marcador C flanquean una region de punto de ruptura 2 que forman las senales de fusion C-C,
    5 modificandose las senales de fusion antes mencionadas, en el caso de una aberracion cromosomica, en senales de fusion A-C y senales de fusion B-C.
  15. 15. Preparado segun la reivindicacion 14, caracterizado por que las sondas estan configuradas segun las reivindicaciones 2-7.
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