ES2582160T3

ES2582160T3 - Detección del cáncer a través del aliento que comprende un conjunto de sensores que comprenden nanopartículas conductoras recubiertas

Info

Publication number: ES2582160T3
Application number: ES10705440.5T
Authority: ES
Inventors: Hossam Haick; Peng Gang; Orna Adams
Original assignee: Technion Research and Development Foundation Ltd
Current assignee: Technion Research and Development Foundation Ltd
Priority date: 2009-01-09
Filing date: 2010-01-10
Publication date: 2016-09-09
Anticipated expiration: 2030-01-10
Also published as: WO2010079490A1; CN102326078A; EP2376913B1; US8597953B2; EP2376913A1; WO2010079491A1; US20110269632A1; EP3101422A1; EP3101422B1; US20110277538A1; WO2010079490A8; US9696311B2; CN102326078B

Abstract

Un conjunto de sensores para detectar compuestos orgbnicos volatiles indicativos de cancer, comprendiendo el conjunto de sensores nanoparticulas de oro (Au) conductoras recubiertas con un revestimiento organico, en el que las nanoparticulas de Au tienen una distribucion del tamano de particulas estrecha con un tamano de particula medio de 5 nm, un tamafio de particula en el intervalo de 1-10 nm y una anchura de la curva de distribucibn a la mitad del valor mbximo (FWHM) de menos de o igual al 40 % del tamano de particula medio, y en el que el espesor del revestimiento organico de dichas nanoparticulas de Au esta en el intervalo de 0,2-4 nm.

Description

Deteccibn del cbncer a travbs del aliento que comprende un conjunto de sensores que comprenden nanopartlculas conductoras recubiertas.

CAMPO DE LA INVENCION

La presente invencibn se refiere a un conjunto de sensores de nanopartlculas de oro conductoras recubiertas con un revestimiento organico para detectar el cbncer.

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ANTECEDENTES DE LA INVENCION

El anblisis de aliento se ha reconocido como una tbcnica fiable para diagnosticar ciertas afecciones medicas a travbs de la deteccibn de compuestos orgbnicos volbtiles (VOC) en el aliento exhalado. El diagnostico se realiza 15 normalmente recogiendo muestras de aliento en un recipiente seguido de mediciones posteriores de VOC especificos usando espectrometria de masas.

La composicion de los VOC en aliento exhalado depende de los procesos metabblicos celulares e incluye, entre otros, hidrocarburos saturados e insaturados, compuestos que contienen oxigeno, compuestos que contienen 20 azufre, y compuestos que contienen nitrogeno. En individuos sanos, la composicibn proporciona una firma quimica distinta con una variabilidad relativamente estrecha entre muestras de un unico individuo y muestras de diferentes individuos.

En el aliento exhalado de pacientes con cbncer, se encontraron niveles elevados de ciertos VOC incluyendo, 25 compuestos alcano C4-C20 volbtil, alcanos monometilados especificos, asi como derivados de benceno (Phillips y col., Cancer Biomark., 3(2), 2007, 95). Por lo tanto, la composicibn de VOC en el aliento exhalado de pacientes con cbncer difiere de la de individuos sanos y, por lo tanto, puede usarse para diagnosticar el cbncer. Una ventaja adicional para el diagnostico del cbncer a travbs del aliento es la no invasividad de la tbcnica que tiene el potencial para la investigacion a gran escala.

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Actualmente se han aplicado dispositivos de deteccibn de gas para la deteccibn de VOC en muestras de aliento de pacientes de cbncer. Dichos dispositivos realizan una deteccibn de olor a travbs del uso de un conjunto de sensores de reaccibn cruzada junto con mbtodos de reconocimiento de patrones. A diferencia del modelo de "cerradura", cada sensor en el dispositivo de nariz electrbnica es ampliamente sensible a una diversidad de olores. En esta 35 arquitectura, cada analito produce una huella clara de un conjunto de sensores de amplia reaccibn cruzada. Esta configuracibn puede usarse para ampliar considerablemente la diversidad de compuestos a los que una matriz dada es sensible, para aumentar el grado de identificacibn de componentes y, en casos concretos, realizar un anblisis de los componentes individuales en medios (bio) quimicos multicomponentes complejos. Despubs, pueden aplicarse algoritmos de reconocimiento de patrones a todo el conjunto de sefiales, obtenidas simultbneamente de todos los 40 sensores en la matriz, con el fin de obtener informacibn sobre la identidad, y la concentracion del vapor expuesto para el conjunto de sensores.

Los dispositivos de deteccibn de gas usados hasta ahora comprenden una diversidad de conjuntos de sensor, incluyendo polimeros conductores, compuestos de polimero no conductor/negro de humano, semiconductores de 45 oxido de metal, tinte fluorescente/sistemas polimbricos, sensores de microbalanza de cuarzo recubiertos con metalo- porfirinas, dispositivos de onda acustica de superficie recubiertos con polimero, y tintes quimiosensibles (Mazzone, J. Thoracic One., 3(7), 2008, 774). Di Natale y col. (Biosen. Bioelec., 18, 2003, 1209) desvelaron el uso de ocho sensores de gas de microbalanza de cuarzo recubiertos con diferentes metaloporfirinas para analizar la composicibn del aliento de pacientes con cbncer de pulmbn. Chen y col. (Meas. Sci. Technol., 16, 2005, 1535) usaron un par de 50 sensores de onda acustica de superficie (SAW), uno recubierto con una pelicula fina de poliisobutileno (PIB), para detectar VOC como marcadores para cbncer de pulmbn. Machado y col. (Am. J. Respir. Crit. Care Med., 171,2005, 1286) demostraron el uso de un dispositivo de deteccibn quimica gaseosa que comprende un sistema de sensor de polimero de carbono con 32 sensores separados para diagnosticar ebneer de pulmbn. Mazzone y col. (Torax, 62, 2007, 565) desvelaron un conjunto de sensores colorimetricos compuesto por compuestos quimicamente sensibles 55 impregnados en un cartilago desechable para analizar muestras de aliento de individuos con cbncer de pulmbn y otras enfermedades de los pulmones. Los resultados presentados en estas divulgaciones aun tienen que proporcionar la precisibn o consistencia requerida para su uso clinico.

Los sensores basados en peliculas compuestas por nanoparticulas recubiertas con un revestimiento orgbnico

("NPCOC") se aplicaron como quimiorresistores, microbalanza de cristal de cuarzo, sensores electroqui'micos y similares. Las ventajas de los NPCOC para aplicaciones de deteccibn surgen de sefiales de deteccibn mejoradas que pueden manipularse fbcilmente a traves de la variacion de las nanoparticulas y/o el tamano de los agregados, la distancia entre parti'culas, la composicibn y la periodicidad. Puede conseguirse adicionalmente una mejor 5 selectividad a traves de la modificacibn de las caracterlsticas de union de la pelicula de recubrimiento, asi como las moleculas enlazadoras. Se demostro que la morfologia y el espesor de las redes de NPCOC inducian una notable influencia sobre la respuesta del detector, donde los cambios en la permitividad indujeron un descenso en la resistencia de peliculas mbs finas de NPCOC (Joseph y col., J. Phys. Chem. C, 112, 2008, 12507). El conjunto tridimensional de estructuras de NPCOC proporciona un marco adicional para las amplificaciones de serial. Otras 10 ventajas surgen del acoplamiento de nano-estructuras a sustratos en estado sblido que permiten una fbcil integracion de matrices, respuestas rbpidas, y aparatos portbtiles accionados por baja energia.

Algunos ejemplos para el uso de NPCOC para aplicaciones de deteccion se desvelan en las Patentes de Estados Unidos N° 5.571.401, 5.698.089, 6.010.616, 6.537.498, 6.746.960, 6.773.926; las Solicitudes de Patente N° WO 15 00/00808, FR 2.783.051 US 2007/0114138; y en Wohltjen y col. (Anal. Chem., 70, 1998, 2856), y Evans y col. (J. Mater. Chem., 8, 2000, 183). En particular, el documento US 6.773.926 desvela conjuntos de sensores para detectar un analito quimico en un fluido, cuyo conjunto incluye una pluralidad de parti'culas que tienen un nucleo metblico (por ejemplo, oro) y un ligando acoplado a dicho nucleo. Contrariamente a la presente invencibn, las parti'culas del documento US 6.773.926 se polidispersan en el intervalo de de 1 a 100 nm.

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La publicacibn de solicitud de patente intemacional numero WO 99/27357 desvela un articulo de fabrication adecuado para su uso en la determination de si o en que cantidad esta presente una especie quimica en un entorno diana, cuyo articulo comprende una multiplicidad de particulas en una orientation de bloqueo, teniendo dichas particulas un nucleo de metal conductor o aleacion de metal conductora, en cada una de dicha particula teniendo tal 25 nucleo de 0,8 a 40,0 nm de dimension maxima, y en dicho nucleo una membrana de ligando del espesor de 0,4 a 4,0 nm, que es capaz de interactuar con dichas especies de tal forma que se altera una propiedad de dicha multiplicidad de particulas.

La patente de Estados Unidos N° 7.052.854 desvela sistemas y mbtodos para el analisis de diagnostico ex vivo 30 usando conjunto basados en nanoestructuras que comprenden una nanoparticula, un medio para detectar un analito/biomarcador diana, y un marcador sustituto. La tecnologia de sensor se basa en la deteccibn del marcador sustituto que indica la presencia del analito/biomarcador diana en una muestra de un fluido corporal.

El documento EP 1.215.485 desvela sensores quimicos que comprenden una pelicula de nanoparticulas formada en 35 un sustrato, comprendiendo la pelicula de nanoparticulas una red de nanoparticulas entrelazada a traves de molbculas de enlazador que tienen al menos dos unidades de enlazador. Las unidades de enlazador son capaces de unirse a la superficie de las nanorparticulas y al menos una unidad de potentiation de la selectividad que tiene un sitio de unibn para unir de forma reversible una molbcula de electrolito. Se detecta un cambio de propiedad fisica de la pelicula de nanoparticulas a traves de un medio de deteccion.

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El documento WO 2009/066293 de uno de los inventores de la presente invencion desvela un aparato de deteccion para detectar compuestos volbtiles y no volbtiles, el aparato comprende sensores de nanoparticulas cubicas recubiertas con un revestimiento orgbnico. Se desvelan adicionalmente metodos de uso del mismo en la deteccion de ciertos biomarcadores para diagnosticar diversas enfermedades y trastornos, incluyendo el cbncer.

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Existe una necesidad insatisfecha de un conjunto de sensores de respuesta rapida basados en una diversidad de sensores que proporcionan una mejor sensibilidad, asi como selectividad para VOC especificos indicatives de cancer.

50 SUMARIO DE LA INVENCION

La presente invencibn proporciona un conjunto de sensores para detectar compuestos orgbnicos volatiles (VOC) indicatives de diversos tipos de cancer. El conjunto de sensores comprende nanoparticulas de oro (Au) conductoras recubiertas con un revestimiento orgbnico donde las nanoparticulas de Au estbn caracterizadas por una distribucion 55 del tamafio de particulas estrecha con un tamano de particula medio de 5 nm, un tamano de particula en el intervalo de 1-10 nm y una anchura de la curva de distribucion a la mitad del valor maximo (FWHM) de menos o igual al 40 % del tamano de particula medio, y donde el espesor del revestimiento orgbnico esta en el intervalo de 0,2-4 nm. La presente invencibn tambien proporciona un sistema que comprende el conjunto de sensores junto con un analizador de aprendizaje y reconocimiento de patrones, y metodos de uso del mismo en el diagnostico de diversos tipos de

cancer a traves del aliento.

La invencibn se basa en parte en el hallazgo inesperado de que un conjunto de sensores que comprenden nanoparticulas conductoras recubiertas con un revestimiento organico en el que las nanoparticulas estan 5 caracterizadas por una distribucibn del tamafio de partlculas estrecha proporciona mejores sensibilidades para detectar VOC. No se observo previamente que el uso de nanoparticulas con una distribucibn del tamafio de partlculas bien definida y estrecha mejora la eficacia de la transferencia de electrones para proporcionar una serial mejorada a relaciones de ruido. Se induce adicionalmente un aumento de la sensibilidad para el ajuste del espesor del revestimiento organico.

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De acuerdo con un aspecto, la presente invencion proporciona un conjunto de sensores para detectar VOC indicativos de cancer que comprende nanoparticulas de oro conductoras recubiertas con un revestimiento organico, teniendo las nanoparticulas una distribucibn del tamafio de partlculas estrecha con un tamafio de partlcula medio de aproximadamente 5 nm y un tamafio de partlcula en el intervalo de aproximadamente 1-10 nm, y una anchura de la 15 curva de distribucibn a la mitad del valor maximo (FWHM) de menos o igual al 40 % del tamafio de partlcula medio, y en el que el espesor del revestimiento orgbnico esta en el intervalo de aproximadamente 0,2-4 nm.

De acuerdo con otro aspecto, la presente invencibn proporciona un sistema para detectar un patrbn de VOC indicativos de cancer que comprende un conjunto de sensores que conforman nanoparticulas de oro conductoras 20 recubiertas con un revestimiento orgbnico, teniendo las nanoparticulas una distribucibn del tamafio de partlculas estrecha con un tamafio de partlcula medio de aproximadamente 5 nm y un tamafio de partlcula en el intervalo de aproximadamente 1-10 nm, y una anchura de la curva de distribucibn a la mitad del valor maximo (FWHM) de menos o igual al 40 % del tamafio de partlcula medio, y en el que el espesor del revestimiento orgbnico estb en el intervalo de aproximadamente 0,2-4 nm, y que comprende adicionalmente un analizador de aprendizaje y reconocimiento de 25 patrones en el que el analizador de aprendizaje y reconocimiento de patrones recibe salidas de sefial de sensor y las compara con los datos almacenados.

En una realizacion, las nanoparticulas tienen un tamafio de partlcula en el intervalo de aproximadamente 2-8 nm. En otra realizacion, las nanoparticulas tienen un tamafio de partlcula en el intervalo de aproximadamente 3-6 nm.

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En una realizacibn particular, el espesor del revestimiento organico estb en el intervalo de aproximadamente 0,6- 2 nm.

En diversas realizaciones, el revestimiento de las nanoparticulas conductoras comprende una monocapa o multiples 35 capas de compuestos orgbnicos, en las que los compuestos organicos pueden ser molbculas pequefias, monomeros, oligomeros o pollmeros, preferiblemente, el revestimiento orgbnico se selecciona entre el grupo que consiste en alquiltioles con cadenas C3-C24, alquiltiolatos co-funcionalizados, arenotiolatos, (^mercaptopropil)tri- metiloxisilano, sulfuros de dialquilo, xantatos, oligonucleotidos, polinuclebtidos, peptidos, protelnas, enzimas, polisacbridos, fosfollpidos, y combinaciones de los mismos. Cada posibilidad representa una realizacibn separada 40 de la invencion.

En otras realizaciones, los sensores de nanoparticulas de oro conductoras recubiertas con un revestimiento organico estan en una configuracion seleccionada entre el grupo que consiste en cables 1D, pellculas 2D, y conjuntos 3D. Cada posibilidad representa una realizacibn separada de la invencibn.

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Aun en otras realizaciones, el sistema de la presente invencibn comprende adicionalmente un aparato para recoger muestras de aliento. En realizaciones especlficas, el sistema de la presente invencibn comprende un aparato para recoger la respiracion alveolar. En otra realizacibn, el sistema de la presente invencibn comprende adicionalmente al menos uno de un concentrador de respiracion y una unidad de deshumidificacion.

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En realizaciones particulares, el sistema de la presente invencibn comprende adicionalmente al menos uno de un quimiorresistor, quimiocondensador, microbalanza de cristal de cuarzo (QCM), resonador de onda acustica en bloque (BAW) y de onda acustica de superficie (SAW), celda electroquimica, resonancia de plasmones superficiales (SPR), y espectroscopio bptico. Cada posibilidad representa una realizacibn separada de la invencibn.

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El analizador de aprendizaje y reconocimiento de patrones puede utilizar diversos algoritmos, incluyendo, pero sin limitacion, redes neuronales artificiales, percepcion multicapa (MLP), red neuronal de regresibn generalizada (GRNN), sistemas de inferencia difusa (FIS), mapa autoorganizado (SOM), funcibn de base radial (RBF), algoritmos geneticos (GAS), sistemas neuro-difusos (NFS), teoria de resonancia adaptativa (ART) y algoritmos estadisticos,

incluyendo, pero sin limitation, anblisis de componentes principales (PCA), minimos cuadrados parciales (PLS), regresion lineal multiple (MLR), regresibn de componentes principales (PCR), anblisis de funcibn discriminante (DFA), incluyendo anblisis discriminante lineal (LDA), y anblisis de conglomerados, incluyendo vecino mas cercano.

5 De acuerdo con otro aspecto mas, la presente invencion proporciona un metodo de diagnbstico del cbncer en un sujeto, comprendiendo el metodo las etapas de: (a) proporcionar un sistema que comprende un conjunto de sensores de acuerdo con la presente invencibn, y que comprende adicionalmente un analizador de aprendizaje y reconocimiento de patrones en el que el analizador de aprendizaje y reconocimiento de patrones recibe salidas de serial de sensor y las compara con los datos almacenados, (b) exponer el conjunto de sensores a una muestra de

10 aliento exhalado, y (c) usar algoritmos de aprendizaje y reconocimiento de patrones para determinar la presencia de un patrbn de compuestos orgbnicos volbtiles indicativos de cancer en la muestra, en el que los VOC indicatives de cancer en una muestra de aliento se seleccionan entre el grupo que consiste en 4-metil-octano, 2-etil-1-hexanol, 2- etil-4-metil-1-pentanol, 2,3,4-trimetil-pentano, 2,3-dimetil-hexano, fluoruro de trimetilsililo, dimetil-silanodiol, 3-etil-3- metil-2-pentanona, 2-metil-4,6-octadiin-3-ona, 2-propil-1-pentanol, decano, trimetil benceno, etil benceno, heptanol,

15 isopreno, hexano, undecano y 6,10-dimetil-5,9-dodecadien-2-ona.

Incluido dentro del alcance de la presente invencibn se encuentra el diagnbstico de diversos canceres incluyendo, pero sin limitacibn, canceres de pulmbn, cerebro, ovario, colon, prostata, rifion, vejiga, mama, oral y de piel. Cada posibilidad representa una realization separada de la invencibn.

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De acuerdo con realizaciones particulares, la presente invencibn proporciona un metodo de diagnbstico del cbncer seleccionado entre el grupo que consiste en cbncer de pulmbn, cbncer de mama, cbncer de colon, cbncer de cabeza y cuello, y cancer de prostata. Cada posibilidad representa una realizacibn separada de la invencibn.

25 En ciertas realizaciones, el metodo desvelado en el presente documento tambien proporciona la discrimination entre muestras de aliento de pacientes que tienen diferentes tipos de cancer. En realizaciones particulares, la presente invencibn proporciona la discrimination entre muestras de aliento de pacientes que tienen diferentes fases de un unico tipo de cbncer.

30 Realizaciones adicionales y el alcance completo de aplicabilidad de la presente invencibn se harbn evidentes a partir de la descripcion detallada dada en lo sucesivo en el presente documento. Sin embargo, se ha de apreciar que la descripcibn detallada y los ejemplos especificos, si bien indican realizaciones preferidas de la invencibn, se dan unicamente a modo de ilustracion.

35 BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Abundancia media de 33 VOC que se encontraron en muestras de aliento de individuos sanos (triangulos) y pacientes con cbncerde pulmbn (circulos) segun se midio por GC-MS.

Figura 2. (A) llustracibn esquembtica de un conjunto de sensores. (B) Micrografia electronica de

40 transmision de nanoparticulas de oro que indica que las nanoparticulas tienen una distribucibn de tamano

estrecha con un dibmetro medio de aproximadamente 3,5 nm. (C) Representacibn esquembtica de nanoparticulas de oro recubiertas con un revestimiento orgbnico.

Figura 3. Respuesta de resistencia diferencial relativa ARIRb del sensor numero 8 con respecto a los biomarcadores mbs comunes que estbn presentes en las muestras de aliento de pacientes de cancer de

45 pulmbn (es decir, vapores de decano [+], trimetil benceno [0], etil benceno [■], y heptanol [A]) y vapor de

agua [•] a concentraciones de 0,001-0,05 P/P°.

Figura 4. Respuestas de resistencia diferencial relativa A RIRb (eje y izquierdo), y nivel de ruido (eje y derecho) a diversos espesores de pelicula (promedio) de nanoparticulas de oro recubiertas con ligandos de dodecanotiol tras la exposicion a decano a 0,05 P/P°.

50 Figura 5. Respuesta de peliculas de nanoparticulas de oro recubiertas con ligandos de hexanotiol que

tienen diferentes distribuciones de tamano con respecto a hexano a 0,001 P/P°.

Figura 6. Respuestas de resistencia diferencial relativa, AR/Rb de los sensores N° S2 y S3 (6A) y los sensores N° S6 y S8 (6B) a muestras de aliento de individuos sanos tipicos (H) y pacientes con cancer de pulmbn (LC).

55 Figura 7. Patrones de respuesta de 90 muestras de aliento de las cuales 64 son muestras de aliento

obtenidas de pacientes de ebneer de pulmbn (lineas discontinuas) y 26 son muestras de aliento obtenidas de individuos sanos (lineas continuas). (7A) Patrones de respuesta usando todo el conjunto de sensores. (7B) Patrones de respuesta usando los sensores numero S1, S4, S6, S7 y S8.

Figura 8. Datos en el espacio de componentes principales de un conjunto de sensores que tiene 9

sensores que se expusieron al aliento de pacientes de cancer de pulmdn (triAngulos) y el aliento de individuos sanos (cuadrados).

Figura 9. Datos en el espacio de componentes principales de un conjunto de sensores que tlene 9 sensores que se expusieron al aliento de pacientes de cancer de mama (•) y el aliento de individuos sanos 5 (0).

Figura 10. Datos en el espacio de componentes principales de un conjunto de sensores que tiene 9 sensores que se expusieron al aliento de colon pacientes de cancer (x) y el aliento de individuos sanos (0). Figura 11. Datos en el espacio de componentes principales de un conjunto de sensores que tiene 9 sensores que se expusieron al aliento de pacientes de cancer de cabeza y cuello (■) y el aliento de 10 individuos sanos (0).

Figura 12. Datos en el espacio de componentes principales de un conjunto de sensores que tiene 9 sensores que se expusieron al aliento de pacientes de cancer de prostata (◄) y el aliento de individuos sanos (0).

Figura 13. GC-MS de VOC metabolicos de 4 celulas de cancer de pulmon diferentes in vitro; (13A) pico 1; 15 (13B) pico 2; (13C) pico 3; y (13D) pico 4. Los datos se basan en un anAlisis por GC-MS de carcinoma

pulmonar de celulas escamosas (8 pacientes; □), adenocarcinoma (2 pacientes; A), carcinoma bronquioalveolar (1 paciente; V), y carcinoma de cblulas no pequeflas (1 paciente; o), como se indicd por Chen y col. (Cancer, 110(4), 2007, 835).

Figura 14. Datos en el espacio de componentes principales de un conjunto de sensores que tiene 9 20 sensores que se expusieron a mezclas de VOC que simulan 4 cblulas de cancer de pulmon diferentes:

carcinoma pulmonar de celulas escamosas (circulos), adenocarcinoma (pentAgonos), carcinoma bronquioalveolar (V), y carcinoma de cblulas no pequeflas A). Se usaron isopreno, hexano, decano y undecano como los cuatro biomarcadores.

Figura 15. Datos en el espacio de componentes principales de un conjunto de sensores que tienen 9 25 sensores que se expusieron a mezclas de VOC que simulan 4 celulas de cancer de pulmon diferentes:

carcinoma pulmonar de cblulas escamosas (circulos), adenocarcinoma (^), carcinoma bronquioalveolar (pentAgonos), y carcinoma de celulas no pequeflas (triangulos). Se usaron isopreno, hexano, trimetil benceno y undecano como los cuatro biomarcadores.

Figura 16. Caracteristicas clinicas de 68 pacientes de cAncer (22 con cAncer de pulmdn, LC cuadrados; 17 30 con cAncer de colon, CC estrellas; 15 con cAncer de mama, BC rombos; y 14 con cAncer de prostata, PC

triAngulos) y 18 controles sanos (circulos). No se aplicaron criterios de inclusibn/exclusibn en este grupo de voluntaries. El conjunto de sensores no se vio influenciado por los factores de desviacion (tal como el genera, la edad o los hAbitos de fumar). Las nanoparticulas de Au se revistieron con (16A) 2-etilhexanotiol, (16B) decanotiol, y (16C) 2-mercaptobenzoxazol.

35 Figura 17. GrAficos PCA de las respuestas de resistencia del conjunto de sensores a muestras de aliento

de (17A) cAncer de pulmon (LC) y controles sanos, (17B) cAncer de colon (CC) y controles sanos, (17C) cAncer de mama (BC) y controles sanos, (17D) cancer de prostata (PC) y controles sanos y (17E) todos los pacientes de cAncer y controles sanos.

40 DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La presente invencion proporciona un conjunto de sensores que comprende nanoparticulas de oro conductoras recubiertas con un revestimiento orgAnico donde las nanoparticulas estAn caracterizadas por una distribucibn del tamaflo de particulas estrecha. El espesor del revestimiento orgAnico estA adaptado para proporcionar mejores 45 sensibilidades para compuestos orgAnicos volAtiles particulares indicativos de diversos tipos de cAncer. La presente invencion tambien proporciona un sistema que comprende el conjunto de sensores junto con un analizador de aprendizaje y reconocimiento de patrones que utiliza diversos algoritmos para permitir la identificacion de volAtiles particulares de una mezcla de volAtiles. Se desvelan adicionalmente mbtodos de uso de los mismos para fines de diagnostico, pronbstico y monitorizacibn.

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El conjunto de sensores, de acuerdo con los principios de la presente invencion estA diseflado para detectar compuestos orgAnicos volAtiles indicativos de cAncer. Tras la adsorcibn de un analito, la pelicula/conjunto de nanoparticulas conductoras recubiertas con un revestimiento orgAnico (NPCOC) puede aumentar, o agregarse. En estas peliculas finas de NPCOC puede generarse un cambio relativo en la constante de permitividad de la pelicula 55 tras la adsorcibn del analito. La respuesta introducida tras la exposicion del analito se determina por la naturaleza de la interaccion entre la especie de analito (huesped) y el revestimiento molecular de las nanoparticulas. Ahora se desvela por primera vez que, el uso de nanoparticulas con una distribucibn de tamaflo estrecha recubiertas con un revestimiento orgAnico de espesor variable permite la deteccion de biomarcadores de cAncer en el aliento con una precision muy alta. Dentro del alcance de la presente invencion se encuentra la deteccibn de VOC con una

sensibilidad de menos de una parte por millbn (ppm), y mbs preferiblemente menos de 100 partes por billbn (ppb).

Sin desear quedar ligado a teoria o mecanismo de accion alguno, se contempla que los sensores compuestos por nanopartfculas que tienen una distribucion de tamafio estrecha son mas sensibles a la adsorcibn de analitos. Esto 5 puede atribuirse al empaquetamiento compacto de las nanopartfculas que las hace susceptibles a cambios estructurales muy pequenos que se producen tras la adsorcibn de analitos. Estos cambios estructurales de los conjuntos de nanopartfculas afectan a las propiedades electronicas para inducir respuestas electronicas. Se contempla que puede inducirse una respuesta de deteccibn por cantidades muy pequefias de molbculas de analito de acuerdo con los principios de la presente invencibn. Puede conseguirse una sensibilidad adicional a traves de la 10 variacibn del espesor del revestimiento orgbnico.

Las nanopartfculas utilizadas en la presente invencibn tienen un tamano de partfcula que varfa de aproximadamente 1 nanometro (nm) a aproximadamente 10 nanometros, preferiblemente de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 8 nm. El tamafio de partfcula medio de las nanopartfculas es de aproximadamente 5 nm con una 15 distribucibn del tamafio de partfculas estrecha, donde el tamafio de partfcula varfa preferiblemente de aproximadamente 3 nm a aproximadamente 6 nm.

La distribucibn del tamafio de las nanopartfculas, de acuerdo con los principios de la presente invencibn, es estrecha. La expresion "distribucibn del tamafio de partfculas estrecha", como se usa en el presente documento, se 20 refiere a una distribucibn en la que mbs del 90 % de las partfculas tienen un tamafio de partfcula en el intervalo de 0,2-2 veces el tamafio de partfcula medio (o promedio). Preferiblemente, mas del 95 % de las partfculas tienen un tamafio de particula dentro de este intervalo. Incluso mbs preferiblemente, mbs del 99 % de las partfculas tienen un tamafio de partfcula dentro de este intervalo. Por lo tanto, para un tamafio de partfcula medio de 5 nm, una distribucibn de tamafio estrecha se refiere a una distribucibn en la que mbs del 90 %, 95 % o del 99 % de las 25 partfculas tienen un tamafio de partfcula en el intervalo de 1-10 nm.

La distribucibn del tamafio de nanopartfcula normalmente se define en cuanto al tamafio de partfcula medio y la anchura de la distribucibn. La anchura de la curva de distribucibn a la mitad del valor mbximo se denomina anchura a media altura (FWHM). La relacion entre la FWHM y el tamafio de partfcula medio se usa como una medicibn de la 30 amplitud o la estrechez de la distribucibn. Por ejemplo, una distribucibn que tiene un valor FWHM que es mayor que el tamafio de partfcula medio se considera relativamente amplio. Como se ha analizado anteriormente, las nanopartfculas usadas en la presente invencibn tienen una distribucibn del tamafio de partfculas estrecha. La FWHM de acuerdo con la presente invencibn es menor de o igual al 40 % del tamafio de partfcula medio. Las nanopartfculas son basicamente de forma esfbrica o esferoidal.

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De acuerdo con los principios de la presente invencibn, el tamafio de partfcula medio, como se usa en el presente documento, se refiere al diametro de partfcula promedio que puede determinarse, por ejemplo, usando microscopfa electronica de transmision (TEM). El tamafio de partfcula medio puede determinarse adicionalmente usando otras tecnicas conocidas por los expertos en la tbcnica, incluyendo, pero sin limitacion, fraccionamiento de flujo de 40 sedimentacion, espectroscopfa de correlacion fotonica, dispersion de luz, dispersion de electrones, centrifugacibn por disco, y similares.

Otra caracterfstica importante de la presente invencibn es el espesor del revestimiento organico que afecta a la sensibilidad a la adsorcibn de diferentes analitos de biomarcador. El revestimiento organico tiene un espesor en el 45 intervalo de aproximadamente 0,2 nm a aproximadamente 4 nm. En algunas realizaciones, el conjunto de sensores comprende sensores que tienen nanopartfculas de una unica especie recubiertas con diversos compuestos organicos, donde el espesor del revestimiento orgbnico varfa de aproximadamente 0,6 nm a aproximadamente 2 nm. El conjunto de sensores tambien puede comprender sensores que tienen nanopartfculas de una unica especie recubiertas con diversos compuestos orgbnicos, donde el espesor del revestimiento organico varia de 50 aproximadamente 0,2 nm a aproximadamente 2 nm para algunas nanopartfculas y de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 4 nm para otras nanoparticulas. El conjunto de sensores tambien puede comprender sensores que tienen nanopartfculas de diversas especies.

La presente invencibn tambibn proporciona un sistema para detectar al menos un patrbn de VOC indicatives de 55 cancer que comprende un conjunto de sensores que comprende nanopartfculas de oro conductors recubiertas con un revestimiento organico donde las nanopartfculas de oro estan caracterizadas por una distribucibn de tamafio estrecha, donde el tamafio de partfcula de las nanopartfculas varfa de aproximadamente 1 nm a aproximadamente 10 nm con un tamafio de partfcula medio de aproximadamente 5 nm, y una anchura de la curva de distribucibn a la mitad del valor mbximo (FWHM) de menos o igual al 40 % del tamafio de partfcula medio, y donde el espesor del

revestimiento org£nico varia de aproximadamente 0,2 nm a aproximadamente 4 nm, y que comprende adicionalmente un analizador de aprendizaje y reconocimiento de patrones donde el analizador de aprendizaje y reconocimiento de patrones recibe salidas de serial de sensor y las compara con los datos almacenados.

5 El revestimiento de las nanoparticulas conductors comprende una monocapa o multiples capas de compuestos organicos, en el que los compuestos organicos pueden ser moldculas pequenas, mondmeros, oligomeros o polimeros (preferiblemente cadenas polimericas cortas). En realizaciones particulares, los compuestos organicos se seleccionan entre el grupo que consiste en alquiltioles con cadenas C3-C24, alquiltiolatos co-funcionalizados, arenotiolatos, (Y-mercaptopropil)tri-metiloxisilano, sulfuros de dialquilo, xantatos, oligonucledtidos, polinucleotidos, 10 peptidos, proteinas, enzimas, polisacdridos, fosfolipidos, y combinaciones de los mismos. Cada posibilidad representa una realizacion separada de la invention.

Otros compuestos organicos adecuados como agentes de recubrimiento incluyen, pero sin limitacion, alquenil tioles, alquinil tioles, cicloalquil tioles, heterociclil tioles, heteroaril tioles, tiolatos de alquenilo, tiolatos de alquinilo, tiolatos 15 de cicloalquilo, tiolatos de heterociclilo, tiolatos de heteroarilo, sulfuros de alquenilo, sulfuros de alquinilo, sulfuros de cicloalquilo, sulfuros de heterociclilo, sulfuros de heteroarilo, disulfuros de alquenilo, disulfuros de alquinilo, disulfuros de cicloalquilo, disulfuros de heterociclilo, disulfuros de heteroarilo, sulfitos de alquenilo, sulfitos de alquinilo, sulfitos de cicloalquilo, sulfitos de heterociclilo, sulfitos de heteroarilo, sulfatos de alquenilo, sulfatos de alquinilo, sulfatos de cicloalquilo, sulfatos de heterociclilo, sulfatos de heteroarilo, alquenil aminas, alquinil aminas, cicloalquil aminas, 20 heterociclil aminas, heteroaril aminas, carboxilatos de alquenilo, carboxilatos de alquinilo, carboxilatos de cicloalquilo, carboxilatos de heterociclilo, y carboxilatos de heteroarilo.

Un grupo "alquilo" se refiere a un hidrocarburo alifatico saturado, incluyendo grupos alquilo de cadena lineal, de cadena ramificada y ciclicos. El grupo alquilo puede tener 1-12 carbonos designados aqui como alquilo CrCi2, 2-6 25 carbonos designados aqui como alquilo C2-C6, 2-4 carbonos designados aqui como alquilo C2-C4, 3-24 carbonos designados aqui como alquilo C3-C24. El grupo alquilo puede estar sin sustituir o sustituido por uno o mas grupos seleccionados entre halogeno, haloalquilo, acilo, amido, ester, ciano, nitro y azido.

Un grupo "cicloalquilo" se refiere a un sistema anular no aromatico mono o multiciclico. El grupo cicloalquilo puede 30 tener 3-10 atomos de carbono, o 5-10 atomos de carbono. Los grupos cicloalquilo monociclicos ejemplares incluyen ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo y similares. Un alquilcicloalquilo es un grupo alquilo como se define en el presente documento, unido a un grupo cicloalquilo como se define en el presente documento. El grupo cicloalquilo puede estar sin sustituir o sustituido con uno cualquiera o mas de los sustituyentes definidos anteriormente para alquilo.

35

Un grupo "alquenilo" se refiere a un grupo hidrocarburo alifatico que contiene al menos un doble enlace carbono- carbono que incluye grupos alquenilo de cadena lineal, de cadena ramificada y ciclicos. El grupo alquenilo puede tener 2-8 atomos de carbono (un alquenilo C2-8). El grupo alquenilo tambien puede tener 2-4 atomos de carbono en la cadena (un alquenilo C2^). Los grupos alquenilo ejemplares incluyen, pero sin limitacion, etenilo, propenilo, n- 40 butenilo, i-butenilo, 3-metilbut-2-enilo, n-pentenilo, heptenilo, octenilo, ciclohexil-butenilo y decenilo. Un alquilalquenilo es un grupo alquilo como se define en el presente documento, unido a un grupo alquenilo como se define en el presente documento. El grupo alquenilo puede estar sin sustituir o sustituido a travds de atomos de carbono disponibles con uno 0 mas grupos definidos anteriormente en el presente documento para alquilo.

45 Un grupo "alquinilo" se refiere a un grupo hidrocarburo alifatico que contiene al menos un triple enlace carbono- carbono que incluye de cadena lineal y de cadena ramificada. El grupo alquinilo puede tener 2-8 atomos de carbono en la cadena (un alquinilo C2-8), o 2-4 atomos de carbono en la cadena (un alquinilo C2-4). Los grupos alquinilo ejemplares incluyen, pero sin limitacion, etinilo, propinilo, n-butinilo, 2-butinilo, 3-metilbutinilo, n-pentinilo, heptinilo, octinilo y decinilo. Un alquilalquinilo es un grupo alquilo como se define en el presente documento, unido a un grupo 50 alquinilo como se define en el presente documento. El grupo alquinilo puede estar sin sustituir o sustituido a traves de atomos de carbono disponibles con uno o mas grupos definidos anteriormente en el presente documento para alquilo.

Un grupo "arilo" se refiere a un sistema anular aromatico monociclico o multiciclico. El grupo arilo puede tener 6-10 55 atomos de carbono. El arilo esta opcionalmente sustituido con al menos un "sustituyente del sistema anular" y combinaciones de los mismos como se define en el presente documento. Los grupos arilo ejemplares incluyen, pero sin limitacion, fenilo o naftilo. Un alquilarilo es un grupo alquilo como se define en el presente documento unido a un grupo arilo como se define en el presente documento. El grupo arilo puede estar sin sustituir o sustituido a traves de atomos de carbono disponibles con uno o mas grupos definidos anteriormente en el presente documento para

alquilo.

Un grupo "heteroarilo" se refiere a un sistema heteroarom^tico que contiene al menos un anillo hetero^tomo en el que el £tomo se selecciona entre nitrogeno, azufre y oxigeno. El heteroarilo contiene 5 o m£s atomos en el anillo. El 5 grupo heteroarilo puede ser monociclico, biciclico, triciclico y similares. Tambien se incluyen en esta definicion los anillos benzoheterociclicos. Los ejemplos no limitantes de heteroarilos incluyen tienilo, benzotienilo, 1-naftotienilo, tiantrenilo, furilo, benzofurilo, pirrolilo, imidazolilo, pirazolilo, piridilo, pirazinilo, pirimidinilo, piridazinilo, indolilo, isoindolilo, indazolilo, purinilo, isoquinolilo, quinolilo, naftiridinilo, quinoxalinilo, quinazolinilo, cinnolinilo, pteridinilo, carbolinilo, tiazolilo, oxazolilo, isotiazolilo, isoxazolilo y similares. El grupo heteroarilo puede estar sin sustituir o 10 sustituido a traves de atomos disponibles con uno o m£s grupos definidos anteriormente en el presente documento para alquilo.

Un "anillo heterociclico" o grupo "heterociclilo" se refiere a anillos de cinco miembros a ocho miembros que tienen de 1 a 4 heteroatomos, tales como oxigeno, azufre y/o, en particular, nitrogeno. Estos anillos de cinco miembros a ocho 15 miembros pueden estar saturados, completamente insaturados o parcialmente insaturados, siendo preferidos anillos completamente insaturados. Los anillos heterociclicos ejemplares incluyen, pero sin limitacion, piperidinilo, pirrolidinil pirrolinilo, pirazolinilo, pirazolidinilo, morfolinilo, tiomorfolinilo, piranilo, tiopiranilo, piperazinilo, indolinilo, dihidrofuranilo, tetrahidrofuranoilo, dihidrotiofenilo, tetrahidrotiofenilo, dihidropiranilo, tetrahidropiranilo, y similares. Un alquilheterociclilo es un grupo alquilo como se define en el presente documento unido a un grupo heterociclilo 20 como se define en el presente documento. El grupo heterociclilo puede estar sin sustituir o sustituido a travds de atomos disponibles con uno o mas grupos definidos anteriormente en el presente documento para alquilo.

Los "sustituyentes del sistema anular" se refieren a sustituyentes unidos a sistemas anulares aromaticos o no aromaticos, incluyendo, pero sin limitacion, H, halo, haloalquilo, alquilo (Ci-Ca), alquenilo (C2-Ca), alquinilo (C2-Ca), 25 arilo (C6-C10), acilo, amido, dster, ciano, nitro, azido, y similares.

Un grupo "halogeno" o "halo", como se usa en el presente documento, solo o como parte de otro grupo, se refiere a cloro, bromo, fluor y yodo. El termino "haloalquilo" se refiere a un grupo alquilo que tiene algunos o todos los hidrogenos independientemente reemplazados por un grupo haldgeno, incluyendo, pero sin limitacidn, triclorometilo, 30 tribromometilo, trifluorometilo, triidometilo, difluorometilo, clorodifluorometilo, pentafluoroetilo, 1,1 -difluoroetil bromometilo, clorometilo, fluorometilo, yodometilo, y similares.

Un grupo "acilo", como se usa en el presente documento, incluye grupos tales como, pero sin limitacion, formilo, acetilo, propionilo, butirilo, pentanoilo, pivaloilo, hexanoilo, heptanoilo, octanoilo, nonanoilo, decanoilo, undecanoilo, 35 dodecanoilo, benzoilo, y similares. Los grupos acilo actualmente preferidos son acetilo y benzoilo.

Un grupo "alcoxi" se refiere a un grupo -O-alquilo en el que R es alquilo como se ha definido anteriormente.

Un grupo "tio", como se usa en el presente documento, solo o como parte de otro grupo, se refiere a un grupo SH. 40 Las expresiones "alquiltio", "ariltio" o "arilalquiltio", como se usan en el presente documento, en solitario o como parte de otro grupo, se refieren a cualquiera de los grupos alquilo, arilalquilo o arilo anteriores unidos a un atomo de azufre.

Las expresiones "oligonucleotido" o "polinucleotido", como se usan en el presente documento, se refieren a ADN o 45 ARN de origen genomico o sintdtico, que pueden ser mono o bicatenarios, y representan la hebra sentido o antisentido.

Las expresiones "pdptido" y "proteina", como se usa en el presente documento, se refieren a un polimero de residuos aminoacidicos. Las expresiones se aplican a polimeros aminoaddicos en los que uno o mas residuos 50 aminoacidicos son un anaiogo quimico artificial de un aminoacido de origen natural correspondiente, asi como a polimeros de aminoacidos de origen natural. Pueden usarse muchas mas moleculas que satisfacen la definicidn de "revestimiento organico" en el mismo contexto.

De acuerdo con los principios de la presente invencion, el revestimiento organico esta caracterizado por la variacion 55 del espesor para proporcionar mejores sensibilidades a compuestos organicos volatiles especificos indicativos de cancer. Sin desear quedar ligando a teoria o mecanismo de accion alguno, una capa fina de revestimiento organico en el intervalo de aproximadamente 0,2-0,6 nm es mas adecuada para la deteccion de analitos que tienen una presion de vapor relativamente baja (<10 torr), que se adsorben principalmente sobre la superficie del revestimiento para inducir la serial de deteccion. Una capa relativamente gruesa de revestimiento organico en el intervalo de

aproximadamente 0,6-2 nm y, en otras realizaciones ejemplares, de 2-4 nm, es mbs adecuada para la deteccion de analitos que tienen una presion de vapor relativamente alta (>10torr). En este caso, las moleculas de anallto penetran mas profundamente en el nucleo del revestimiento para Induclr la serial de deteccion.

5 Los sensores de la presente invencion pueden fabricarse a traves de un proceso de auto-ensamblado para producir pellculas que comprenden NPCOC. El termino "auto-ensamblado", como se usa en el presente documento, se refiere a un proceso de organizacion de moleculas sin la intervencibn de una fuente externa. El proceso de auto- ensamblado tiene lugar en una solucibn/disolvente o directamente sobre el sustrato en estado solido. El tbrmino "pellcula", como se usa en el presente documento, corresponde a una configuracibn de montaje bien organizado de 10 NPCOC, preferiblemente en una configuracibn cubica centrada en el cuerpo (BCC) o cubica centrada en la cara (FCC). El uso de nanopartlculas con una distribucion de tamaflo estrecha permite un empaquetamiento mbs compacto de las nanopartlculas, dando como resultado de esta manera pellculas que son mbs susceptibles a cambios menores en las estructuras de pellcula tras la adsorcion de analitos. Por lo tanto, estas pellculas son mbs sensibles que las pellculas que tienen una distribucion del tamaflo de partlcula amplia.

15

La slntesis de NPCOC puede producirse mediante metodos conocidos en la tbcnica. Por ejemplo, las nanopartlculas de oro pueden sintetizarse usando el mbtodo de dos fases (Brust y col., J. Chem. Soc. Chem. Commun., 801, 1994, 2) con algunas modificaciones (Hostetler y col. Langmuir, 14 1998, 24). En resumen, AuCU' se transfiere de una solucibn acuosa de HAuCU'Xl-feO a una solucibn de tolueno por el reactivo de transferencia de fase TOAB. Despubs 20 de aislar la fase organica, a la solucion se le afladen tioles en exceso. La relacion molar de tioLHAuCU- XTH2O puede variar entre 1:1 y 10:1, dependiendo del tiol usado. Esto se realiza con el fin de preparar una solucibn mono- dispersa de nanopartlculas de oro en un tamano medio de aproximadamente 5 nm. Los procedimientos ejemplares inciuyen, pero sin limitacibn, relaciones molares de tiol:Au de 10:1 y 1:1 para nanopartlculas de oro recubiertas con dodecanotiol y butanotiol, respectivamente en un tamaflo medio de 5 nm. Despubs de una agitacion vigorosa de la 25 solucibn, se anade una solucibn acuosa del agente reductor NaBH4 en gran exceso. La reaccion se agita constantemente a temperatura ambiente durante al menos 3 horas para producir una solucibn de color pardo oscuro de las nanopartlculas de Au recubiertas con tiol. La solucibn resultante se somete adicionalmente a la eliminacibn del disolvente en un evaporador rotatorio seguido de multiples lavados usando etanol y tolueno.

30 Las nanopartlculas de color recubiertas con 2-mercaptobenzoazol pueden sintetizarse por un metodo de intercambio de ligandos a partir de las nanopartlculas de oro recubiertas con hexanotiol preparadas previamente. En una reaccion tlpica, se anade un exceso de tiol, 2-mercaptobenzoazol, a una solucibn de nanopartlculas de oro recubiertas con hexanotiol en tolueno. La solucibn se mantiene en agitacion constante durante algunos dlas con el fin de permitir la maxima conversion del ligando como sea posible. Las nanopartlculas se purifican a partir de 35 ligandos sin tiol mediante extracciones repetidas.

Sin desear quedar ligando a teorla o mecanismo de accion alguno, se contempla que la deteccion se produce a traves de agregacibn o engrosamiento de las nanopartlculas conductoras recubiertas con conjuntos de revestimientos organicos, a travbs de diversas interacciones qulmicas. Las interacciones inciuyen, pero sin 40 limitacibn, interacciones de union a hidrogeno, 71-71, huesped-anfitrion, van der Waals, electrostbticas, de transferencia de carga, antlgeno-anticuerpo, y combinaciones de las mismas. Los cambios en la permitividad normalmente se producen en pellculas finas que tienen regiones de discontinuidades en los quimiorresistores, los quimiocondensadores y celdas electroqulmicas que consisten en pellculas 2D o 3D de nanopartlculas metalicas.

45 Los metodos ejemplares para obtener conjuntos bi o tridimensionales bien ordenados de NPCOC inciuyen, pero sin limitacibn,

i. Deposicibn aleatoria de una solucibn de NPCOC sobre superficies sblidas. La deposicion se realiza mediante deposicibn por goteo, recubrimiento giratorio, recubrimiento por pulverizacibn u otras tecnicas

50 similares.

ii. Deposicibn mejorada de campo o inducida por interaccibn molecular de una solucibn de NPCOC sobre superficies sblidas.

iii. Tecnicas Langmuir-Blodgett o Langmuir-Schaefer. El sustrato se sumerge en vertical a traves de una monocapa bidimensional auto-organizada/bien ordenada de NPCOC en la interfaz de subfase de aire,

55 donde esta ultima se transfiere posteriormente sobre bste. Multiples inmersiones del sustrato a traves de la

monocapa 2D de NPCOC en la interfaz de subfase de aire, dan como resultado la fabricacion de las multicapas ordenadas tridimensionalmente de NPCOC.

iv. Tbcnicas de litografla suave, tales como impresibn por micro-contacto (mCP), moldeo de replica, micro- moldeo en capilares (MIMIC), y moldeo de micro-transferencia (mTM). Estos mbtodos se basan en

variaciones del auto-ensamblado y moldeo de replica de moleculas organicas y materiales polimericos, para fabricar NPCOC de una escala nanometrica a una escala mesoscopica (Whitesides y col., J. Mater. Chem. 7, 1069, 1997).

v. Pueden usarse diversas combinaciones de metodos de Langmuir-Blodgett o Langmuir-Schaefer con

5 tecnicas de litografia suave para producir peliculas Langmuir-Blodgett en patrones de NPCOC

molecularmente modificados que se transfieren sobre sustratos solidos.

vi. Impresion sobre sustratos en estado solido o flexibles usando una impresora de inyeccion designada para electronica impresa. Se usa una solucion que contiene los NPCOC como un material de carga (o "tinta") del cabezal de impresion de acuerdo con procedimientos bien conocidos en la tecnica como se

10 describe, por ejemplo, en Holland y col. (Ink Maker 8, 83, 2005).

De acuerdo con los principios de la presente invencion, el conjunto de sensores para detectar volatiles indicativos de cancer en muestras de aliento comprende una pluralidad de sensores entre 2 a 1000 sensores, mas preferiblemente entre 2 a 500 sensores, incluso mas preferiblemente entre 2 a 250 sensores, y mucho mas preferiblemente entre 2 a 15 125 sensores en cualquier conjunto. El conjunto de sensores puede comprender 9 sensores quimicamente sensibles o 14 sensores quimicamente sensibles.

En algunas realizaciones, la presente invencion proporciona un sistema en el que el conjunto de sensores de NPCOC se usa junto con uno cualquiera de un quimiorresistor, un quimiocondensador, una microbalanza de cristal 20 de cuarzo, un resonador de onda acustica en bloque (BAW) y de onda acustica de superficie (SAW), una celda electroquimica, una resonancia de plasmones superficiales (SPR), y un espectroscopio bptico. Cada posibilidad representa una realizacion separada de la invencion.

Las respuesta de deteccibn tras la exposicion de los sensores a un analito pueden inducirse a traves de un cambio 25 en uno cualquiera de la conductividad, la resistencia, la impedancia, la capacidad, la inductancia, o las propiedades opticas de uno o mas de los sensores.

Para una deteccibn electronicamente inducida, los contactos electricos de las peliculas de NPCOC que se depositaron sobre un sustrato sblido (por ejemplo, silice, silicio, cuarzo, etc.) para la integracion de conjuntos de 30 soporte y/o fbcil, pueden realizarse mediante metodos bien conocidos en la tbcnica. Los metodos adecuados para inducir contactos electricos incluyen, pero sin limitacion, fotolitografia, litografia de haz de electrones, haz de iones focalizados (FIB), evaporacion/pulverizacibn directa a traves de una mascara de sombra, contacto suave (estampacion), tecnicas de impresion por inyeccion de nanoparticulas conductoras, y otras tecnicas similares. Como alternativa, las peliculas de nanoparticulas pueden depositarse en contactos predefinidos que se fabricaron por uno 35 cualquiera de los metodos que se han descrito anteriormente en el presente documento. Los electrodos pueden ponerse en contacto en diversas geometrias de maneras bien conocidas por un experto en la tbcnica. Los electrodos pueden ponerse en contacto con una distancia de 15|im entre electrodos adyacentes. Como alternativa, los electrodos se ponen en contacto con una distancia de 100 pm entre electrodos adyacentes. La distancia entre dos electrodos adyacentes estb preferiblemente en el intervalo de 100 nm a 5000 pm.

40

La deteccibn puede detectarse a travbs de cambios en las propiedades bpticas de una red de sensores. La deteccibn tambien puede realizarse usando elipsometria espectroscopica. Esta tecnica mide el cambio en la polimerizacion tras el reflejo de luz polarizada desde una superficie. Sin desear quedar ligando a teoria o mecanismo de accibn alguno, la adsorcibn de moleculas de analitos induce cambios en el espesor de las capas de redes de 45 NPCOC. El cambio en el espesor o rugosidad induce cambios en la polarizacibn que pueden registrarse por la tecnica de elipsometria espectroscopica. La sefial obtenida se transporta postedormente a un analizador de aprendizaje y reconocimiento de patrones para generar un resuitado. De esta manera, no se requiere ningun contacto electrico. La agregacibn y/o engrosamiento de los NPCOC tras la adsorcibn de analitos convierte a esta tecnica en ventajosa para detectar volbtiles con una sensibilidad muy alta.

50

Dentro del alcance de la presente invencion se encuentran metodos para determinar al menos un patrbn de compuestos organicos volbtiles en una muestra de aliento donde los compuestos orgbnicos volbtiles son biomarcadores para el cbncer. Los metodos comprenden exponer el conjunto de sensores a una muestra de aliento exhalado y usar algoritmos de aprendizaje y reconocimiento de patrones con el fin de analizar la sefial de sensor e 55 identificar y cuantificar posiblemente los compuestos o patrones deseados indicativos de cbncer. Por lo tanto, en el presente documento se proporciona un sistema que comprende el conjunto de sensores de la presente invencion junto con un analizador de aprendizaje y reconocimiento de patrones. El analizador recibe salidas o patrones de sefial del conjunto de sensores y los analiza mediante diversos algoritmos de reconocimiento de patrones para producir una firma de salida. Mediante la clasificacibn de una firma desconocida usando una base de datos de firmas

almacenadas y conocidas, pueden identificarse los compuestos deseados. De acuerdo con los principios de la presente invencibn, la detection se obtiene a traves de la adsorcibn de compuestos organicos volbtiles para proporcionar cambios de serial que despues se transportan a un analizador de aprendizaje y reconocimiento de patrones para generar la identificacibn de los compuestos deseados.

5

Los algoritmos para el analisis de muestras incluyen, pero sin limitacion, anblisis de componentes principales, anblisis lineal de Fischer, algoritmos de red neuronal, algoritmos genbticos, reconocimiento de patrbn logico difuso, y similares. Despues de que se complete el anblisis, la informacion resultante puede mostrarse, por ejemplo, en una pantalla, transmitirse a un ordenador huesped, o almacenarse en un dispositivo de almacenamiento para una 10 recuperacion posterior.

Muchos de los algoritmos son algoritmos basados en redes neuronales. Una red neuronal tiene una capa de entrada, capas de procesamiento y una capa de salida. La informacion en una red neuronal se distribuye por todas las capas de procesamiento. Las capas de procesamiento estan constituidas por nodos que simulan las neuronas 15 mediante la interconexion de sus nodos.

Cuando una red neuronal se combina con un conjunto de sensores, los datos del sensor se propagan a travbs de las redes. De esta manera, se realizan una sene de multiplicaciones de matriz vectorial y los analitos desconocidos pueden identificarse y determinate fbcilmente. La red neuronal se entrena corrigiendo las salidas falsas o no 20 deseadas de una entrada dada. De forma similar al analisis estadistico que revela patrones subyacentes en una coleccion de datos, las redes neuronales localizan patrones coherentes una coleccion de datos, en base a criterios predeterminados.

Los algoritmos de reconocimiento de patrones adecuados incluyen, pero sin limitacion, anblisis de componentes 25 principales (PCA), anblisis discriminante lineal de Fisher (FLDA), modelado suave independiente de analogia de clases (SIMCA), K vecinos mas cercanos (KNN), redes neuronales, algoritmos genbticos, logica difusa, y otros algoritmos de reconocimiento de patrones. El anblisis discriminante lineal de Fisher (FLDA) y el anblisis discriminante canonico (CDA), asi como combinaciones de los mismos, pueden usarse para comparar la firma de salida y los datos disponibles de la base de datos. Como alternativa, se usa el analisis de componentes principales. 30 El analisis de componentes principales (PCA) implica una tecnica matembtica que transforma varias variables correlacionadas en un numero menor de variables no correlacionadas. El numero menor de variables no correlacionadas se conoce como componentes principales. El primer componente principal o autovector representa la mayor variabilidad en los datos posible, y cada componente sucesivo representa la mayor variabilidad restante posible. El objetivo principal del PCA es reducir la dimensionalidad del conjunto de datos de identificar nuevas 35 variables subyacentes.

El anblisis de componentes principales compara la estructura de dos o mas matrices de covarianza de manera jerarquica. Por ejemplo, una matriz puede ser identica a otra, excepto que cada elemento de la matriz se multiplica por una unica constante. Por lo tanto, las matrices son proporcionales entre si. Mas particularmente, las matrices 40 comparten autovectores idbnticos (o componentes principales), pero sus autovalores difieren en una constante. Otra relacion entre matrices es que comparten componentes principales en comun, pero sus autovalores difieren. La tecnica matembtica usada en el anblisis de componentes principales se denomina autoanblisis. El autovector asociado al mayor autovalor tiene la misma direccion que el primer componente principal. El autovector asociado al segundo mayor autovalor determina la direccibn del segundo componente principal. La suma de los autovalores 45 equivale a la traza de matriz cuadrada y el numero maximo de autovectores equivale al numero de fijas de esta matriz.

En el presente documento se proporcionan metodos de uso del conjunto de sensores para diagnosticar cancer. Los metodos incluyen la deteccion de compuestos organicos volatiles como biomarcadores de cbncer a partir del aliento 50 directamente exhalado por el sujeto en el conjunto de sensores de la presente invencion. Como alternativa, el conjunto de sensores puede exponerse al espacio vacio de un recipiente en el que se ha depositado el aliento exhalado. Otras posibilidades incluyen exhalar en una bolsa inerte y despubs exponer el aliento recogido al conjunto de sensores de la presente invencion. Por lo tanto, el sistema de la presente invencibn puede comprender adicionalmente un aparato colector de aliento para recoger muestras de aliento, particularmente muestras de 55 respiracion alveolar. Aparatos colectores de aliento ejemplares dentro del alcance de la presente invencibn son aquellos aprobados por la American Thoracic Society/European Respiratory Society (ATS/ERS); (Silkoff y col. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 171,2005, 912). La respiracion alveolar normalmente se recoge de los individuos usando el metodo fuera de linea. Sin embargo, se entenderb que la recogida de aliento directamente al dispositivo w's-b-v/'s el mbtodo en linea se incluye por la presente invencibn. A veces no es necesario concentrar previamente o

deshumidificar la muestra antes de la medicion. Cuando se requiere una mejor discriminacion entre muestras de aliento de "control" y de "cancer", se usa un concentrador de respiracion y/o una unidad de deshumidificacion.

Los concentradores de aliento usados junto con la presente invencibn incluyen, pero sin limitacion,

5

I. Microextraccion en fase solida (SPME) - La tecnica SPME se basa en una fibra revestida con un liquido (polimero), un solido (sorbente), o combinacion de los mismos. El revestimiento de fibra extrae los compuestos de la muestra por absorcion (cuando el revestimiento es liquido) o por adsorcion (cuando el revestimiento es solido). Despues, la fibra SPME se inserta directamente en el dispositivo de detection para

10 su desorcion y anblisis posterior (Ouyang, y col., Anal. Bioanal. Chem., 386, 2006, 1059; Coelho y col., J.

Chromatography B, 853, 2007, 1).

II. Tubos adsorbentes - Los tubos adsorbentes estbn hechos tipicamente de vidrio y contienen diversos tipos de material adsorbente solido (sorbentes). Los sorbentes usados cornunmente incluyen carbon activado, gel de silice, y polimeros porosos orgbnicos, tales como resinas Tenax y Amberlite XAD. Los

15 tubos adsorbentes estbn fijados a bombas de muestreo de aire para la recogida de muestras. Una bomba

con un caudal calibrado en ml/min extrae un volumen predeterminado de aire a travbs del tubo adsorbente. Los productos quimicos se atrapan sobre el material adsorbente a lo largo de todo el periodo de muestreo. Esta tbcnica se desarrollo por el US National Institute for Occupational Safety and Health (NIOSH).

III. Concentraciones criogbnlcas - La condensation criogenica es un proceso que permite la recuperation

20 de compuestos orgbnicos volatiles (VOC) para su reutilizacibn. El proceso de condensacion requiere

temperaturas muy bajas, de manera que los VOC puedan condensarse. Tradicionalmente, se han usado refrigerantes de clorofluorocarbono (CFC) para condensar los VOC. Actualmente, se usa nitrogeno liquido en el proceso de condensacion criogenica (menos de -160 °C).

25 Un deshumidificador usado junto con la presente invencibn puede incluir los siguientes ejemplos no limitantes:

I. Extraer el aire humedo sobre bobinas refrigeradas en frio - usando este enfoque, la humedad del aire se condensas en gotas segun pasa a traves de bobinas refrigeradas en frio en un recipiente. Despues, el aire "seco" se lleva a su temperatura original y se devuelve al dispositivo de deteccibn.

30 II. Gel de silice - es una forma amorfa de dibxido de silicio, que se produce sintbticamente en forma de

granulos o perlas duras irregulares. Una estructura microporosa de cavidades de enclavamiento da un area superficial muy elevada (800 metros cuadrados por gramo). Esta estructura unica considera el gel de silice como un desecante de alta capacidad. Las moleculas de agua se adhieren a la superficie del gel de silice debido a su baja presion de vapor en comparacion con el aire circundante. Cuando se alcanza un equilibrio 35 de presibn, la adsorcion cesa. Por lo tanto, cuanto mayor es la humedad del aire circundante, mayor es la

cantidad de agua que se adsorbe antes de alcanzar el equilibrio. El gel de silice es ventajoso como una sustancia de secado, ya que el proceso de secado requiere que no haya ninguna reaccibn quimica ni ningun subproducto o efecto secundario.

III. Carbono activado - Se forma procesando carbon con respecto a una sustancia de carbon

40 extremadamente porosa. Debido a su alto grado de microporosidad, el carbon activado posee un area

superficial muy grande disponible para reacciones quimicas. Puede obtenerse suficiente activation unicamente de la alta brea superficial, aunque un tratamiento quimico adicional a menudo mejora las propiedades de adsorcibn del material.

IV. Tamices moleculares desecantes - Son metal alumino-silicatos cristalinos altamente porosos y

45 sinteticamente producidos. Se clasifican por las muchas cavidades internas de diametros precisos,

concretamente, 3 A, 4 A, 5 A y 10 A. La adsorcibn de produce unicamente cuando las moleculas que se van a adsorber tienen dibmetros mbs pequefios que las aberturas de las cavidades. Las moleculas de alta polaridad se absorben mejor en los tamices moleculares. Los tamices moleculares adsorben las moleculas de agua y otros contaminantes de liquidos y gases que descienden a niveles muy bajos de 50 concentraciones, con frecuencia a 1 ppm.

En una realizacibn particular, el metodo descrito en el presente documento se usa para discriminar entre diferentes tipos de cancer. Los estudios de cromatografia de gases unida a espectrometria de masas (GC-MS) han mostrado que los alcanos C4-C20 volbtiles y ciertos alcanos monometilados, asi como derivados de benceno parecen estar 55 elevados en diversos casos de cancer. Los compuestos de interes se encuentran generalmente en el intervalo de 1- 20 ppb en el aliento humano sano, pero puede observarse en composiciones de mezcla distintivas a niveles elevados en el intervalo de 10-100 ppb en el aliento de pacientes de cbncer. Los niveles de estos biomarcadores son elevados incluso en las fases tempranas de la enfermedad, ya que reflejan un cambio en la quimica del cuerpo humano. Este cambio aparece independientemente del tamario del tumor. Adembs, los biomarcadores de una

enfermedad especifica (por ejemplo, cancer de pulmbn) poseen composiciones de mezcla/patrones distintivos que difieren de las composiclones/patrones de los biomarcadores de otras enfermedades. Los compuestos orgbnicos volatiles que pueden usarse como biomarcadores para el diagnostico de cancer incluyen, pero sin limitacion, 4-metil- octano, 2-etil-1-hexanol, 2-etil-4-metil-1-pentanol, 2,3,4-trimetil-pentano, 2,3-dimetil-hexano, fluoruro de trimetilsililo, 5 dimetil-silanodiol, 3-etil-3-metil-2-pentanona, 2-metil-4,6-octadiin-3-ona, 2-propil-1-pentanol, decano, trimetil benceno, etil benceno, heptanol, isopreno, hexano, undecano y 6,10-dimetil-5,9-dodecadien-2-ona.

Como se contempla en el presente documento, el uso de los matodos de la presente invencibn permite la discriminacibn entre diferentes tipos de cancer. En algunas realizaciones, el sistema de la presente invencion 10 proporciona el diagnbstico de un unico tipo de cancer en diferentes fases. En otras realizaciones, el sistema de la presente invencibn proporciona la discriminacibn entre muestras de aliento obtenidas de pacientes de cancer de pulmbn en diferentes fases (o tamafios tumorales) de la enfermedad.

El tbrmino "cancer”, como se usa en el presente documento, se refiere a un trastorno en el que una poblacion de 15 cblulas se ha vuelto, en grados variables, insensible a los mecanismos de control que normalmente rigen la proliferacibn y la diferenciacibn. Cancer se refiere a diversos tipos de neoplasmas y tumores malignos, incluyendo tumores primarios, y metastasis tumoral. Los ejemplos no limitantes de canceres que pueden detectarse por el conjunto de sensores y el sistema de la presente invencibn son canceres de cerebro, ovario, colon, prostata, rifion, vejiga, mama, pulmbn, oral y de piel. Los ejemplos especificos de canceres son: carcinomas, sarcomas, mielomas, 20 leucemias, linfomas y tumores de tipo mixto. Las categorias particulars de tumores incluyen trastornos linfoproliferativos, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de prbstata, cancer cervical, cancer endometrial, cancer de huesos, cancer de higado, cancer de estomago, cancer de colon, cancer pancreatico, cancer de la tiroides, cancer de cabeza y cuello, cancer del sistema nervioso central, cancer del sistema nervioso periferico, cancer de piel, cancer de rifion, asi como metastasis de todos los anteriores. Los tipos particulars de tumores 25 incluyen carcinoma hepatocelular, hepatoma, hepatoblastoma, rabdomiosarcoma, carcinoma esofagico, carcinoma tiroideo, ganglioblastoma, fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, tumor de Ewing, leimiosarcoma, rabdoteliosarcoma, carcinoma ductal invasivo, adenocarcinoma papilar, melanoma, carcinoma pulmonar de cblulas escamosas, carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma (bien diferenciado, moderadamente diferencial, deficientemente diferenciado o no 30 diferenciado), carcinoma bronquioalveolar, carcinoma de cblulas males, hipernefroma, adenocarcinoma hipernefroideo, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, tumor testicular, carcinoma de pulmbn, incluyendo carcinoma de pulmbn de cblulas pequefias, de cblulas no pequefias y de cblulas grandes, carcinoma de vejiga, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, retinoblastoma, neuroblastoma, carcinoma de colon, carcinoma rectal, neoplasias malignas 35 incluyendo todos los tipos de leucemia y linfoma, incluyendo: leucemia mielogena aguda, leucemia mielocitica aguda, leucemia linfocitica aguda, leucemia mielogena cronica, leucemia linfocitica crbnica, leucemia mastocitica, mieloma multiple, linfoma mieloide, linfoma de Hodgkin, linfoma no Hodgkin.

El cancer a diagnosticar puede seleccionarse entre el grupo que consiste en cbncer de pulmbn, cbncer de cabeza y 40 cuello, cancer de mama, cbncer pancreatico, linfoma, mieloma, leucemia, cbncer de rifibn, cbncer de ovario, cbncer de hueso, cbncer de higado, cbncer de prbstata, cbncer de piel, cbncer de colon, y cbncer de tiroides. De acuerdo con realizaciones ejemplares, el cbncer a diagnosticar se selecciona entre cbncer de mama, cbncer de rifibn. Cada posibilidad representa una realizacibn separada de la invencibn.

45 Debido a las dimensiones en miniatura del conjunto de sensores (en el intervalo de 10-100 nanometros a unos pocos micrbmetros), podria instalarse en cualquier dispositivo electrbnico incluyendo, pero sin limitacion, un reloj o un telbfono movil. La integracion del conjunto de sensores en un dispositivo electrbnico usado comunmente permite que se use como un sistema de alerta para el inicio del cbncer.

50 Como se usa en el presente documento y en las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "una", y "el/la" incluyen referencias plurales a menos que el contenido dicte claramente otra cosa. Por lo tanto, por ejemplo, la referencia a "un revestimiento orgbnico" incluye una pluralidad de dichos revestimientos orgbnicos y equivalentes de los mismos para los expertos en la tecnica, y asi sucesivamente.

55 Los principios de la presente invencibn se demuestran por medio de los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1: Recoqida de aliento exhalado

Despues de una exhalacidn profunda, los sujetos inhalaron hasta la capacidad pulmonar total a traves de una boquilla que contema un cartucho en el puerto de aspiracion, con el fin de retirar mds del 99,99 % de los contaminantes ambientales de VOC del aire inhalado durante la inspiracidn. Despuds, los sujetos exhalaron contra 5 10-15 cm de presion de H2O para asegurar el cierre del velo para excluir el arrastre de gas. El gas exhalado se recogio a traves de un puerto de exhalacidn separado de la boquilla en una bolsa de muestreo de gas Mylar no reactiva (adquirida en Eco Medics), que se limpio previamente con gas N2. Se realizaron al menos cinco analisis en el aliento exhalado de cada sujeto. Se usd un total de 90 muestras de aliento en las que 26 se obtuvieron de individuos sanos y 64 se obtuvieron de pacientes de cancer de pulmdn. Los pacientes fueron previamente 10 diagnosticados clinicamente usando diversos metodos de diagnostico, incluyendo biopsia con broncoscopio, exploracion por tomografia computerizada (CT) y puncidn pulmonar. Ninguno de los pacientes de edneer de pulmdn habia recibido quimioterapia y/u otro tratamiento antes de que se recogieran las muestras de aliento.

Eiemplo 2: Andlisis de aliento exhalado por GC-MS 15 “

Las muestras de aliento exhalado de sujetos con cancer de pulmdn y de individuos sanos se recogieron en bolsas de muestras Mylar y se analizaron con cromatografia de gases-espectroscopia de masas (GC-MS) en combinacion con microextraccion en fase sdlida (SPME). La tecnica SPME se usa para concentrar previamente los VOC en las muestras de aliento. Se insertd un soporte de SPME manual con una fibra de extraccion recubierta con: 1) 20 Polidimetilsiloxano (PDMS), 2) Polidimetilsiloxano-Divinilbenceno (PDMS/DVB), o 3) Polidimetilsiloxano-Carboxeno (PDMS/Carboxeno) (adquiridos en Sigma-Aldrich) en la bolsa Mylar. Se concentraron entre 500 y 1.000 cm3 de cada muestra de aliento a traves del metodo SPME con un periodo de extraccidn de 2 horas, y se administrd a GC-MS usando un soporte de SPME manual. La fibra extraida en el soporte de SPME manual se insertd en el inyector GC que funciond usando el modelo sin fraccionamiento. El perfil de temperatura de la estufa fue: 60 °C, 2 min, 8 °C/min 25 a 100 °C, 15 °C/min a 120 °C, 8 °C/min a 180 °C, 15 °C/min a 200 °C, 8 °C/min a 225 °C. Se usd una columna capilar H5-5MS al 5 % Fenil Metil Siloxano (30 m de longitud, 0,25 mm de d.i., 0,25 pm de espesor). La presidn de columna se ajusto a 8,22 psi (56,67 kPa), y el flujo inicial fue de 1,0 ml/min. Finalmente, las estructuras moleculares de los VOC se determinaron a traves del conjunto modular estandar.

30 El andlisis por GC-MS identified 33 VOC comunes (Tabla 1) que se habian sintetizado o catabolizado en muestras de aliento de individuos sanos y de pacientes de edneer de pulmdn. De los cuales, se encontraron 11 VOC especificos (Tabla 2) unicamente en el aliento de pacientes de edneer de pulmdn y no en el aliento de individuos sanos, con al menos una confianza del 83 %. La figura 1 muestra la relacion de abundancia promedio de 33 VOC (el nombre correspondiente puede encontrarse en la Tabla 1) en muestras de aliento de individuos sanos (controles; 35 triangulos) y en muestras de aliento de pacientes de cancer de pulmdn (circulos). Los compuestos detectados son en su mayor parte alcanos C4-C20 lineales y monometilados, ademds de ciertos derivados de benceno. Los compuestos que se observaron en muestras de aliento de individuos sanos y pacientes de edneer de pulmdn, estaban presentes no solo en diferentes concentraciones, sino tambidn en composiciones de mezcla distintivas. La figura 1 muestra claramente que los VOC detectados en muestras de aliento de individuos sanos forman un unico 40 patron que difiere del patrdn de los VOC en muestras de aliento de pacientes con edneer de pulmdn. Se descubrid que casi todos los VOC estaban en concentraciones mds altas en muestras de pacientes de edneer de pulmdn, con las excepciones de VOC1, VOC11, VOC14, VOC25 y VOC26.

Tabla 1. VOC que se detectaron en muestras de aliento obtenidas de individuos de control y pacientes de edneer de 45______________________________________________pulmdn____________________________________

Simbolo: VOC Simbolo VOC Simbolo VOC

VOC1: Hidrazina- carboxamida VOC 12 Benceno, 1 -metil-2-(1- metiletil)- VOC22 Undecano, 4,7-dimetil-

VOC2: Hidrazina, metil- VOC13 Benceno, 1-metil-3-(1- metiletil)- VOC23 2,4,6-Tris(1,1 -dimetil-etil )-4- metilciclohexa-2,5-dien-1 - ona

VOC3: Alcohol etilico VOC 14 1,3,5-Cicloheptatrieno VOC24 Octano,2,6,6-trimetilo

VOC4: o-Xileno VOC15 Hexano, 3-metilo VOC25 2-Butanona

VOC5: Benceno, 1-metil-4- (1 -metiletilo) VOC 16 Pentano, 3-etil- VOC26 Hidrazina

VOC6: Etilbenceno VOC17 1,3,5,7-Ciclooctatetraeno VOC27 1,3-Pentad ieno

VOC7: Estireno VOC18 Biciclof4,2,0locta-1,3,5-trieno VOC28 Pentano, 3,3-dimetil-

VOC8: Tolueno VOC19 Hexano, 2,3,4-trimetil- VOC29 Hexano, 3,3-dimetil-

VOC9: £ter dimetilico VOC20 Fenol, 2,6-bis(1,1-dimetiletil)- 4-metil-, metilcarbamato VOC30 Hexano, 2-metil-

VOC 10: Hidroxitolueno butilado VOC21 Heptano, 2,4dimetilo VOC31 Hexano, 3-etil-

VOC 11: dihidrazida carbon ica VOC32 Hexano, 2,2,3-trimetil-




: VOC33 Ciclopropano, etilideno

Tabla 2, VOC que se detectaron unicamente en muestras de aliento de pacientes de cancer de pulmon

VOC Nombre: Promedio de abundancia Desviacibn estandar Porcentaje de pacientes

Octano, 4-metil-: 0,8913% 0,8648 % 100%

1-Hexanol, 2-etil-: 0,3324 % 0,2378 % 91,7%

1-Pentanol, 2-etil-4-metil-: 0,3758 % 0,2795 % 91,7%

Pentano, 2,3,4-trimetil-: 0,4054 % 0,4231 % 91,7%

Hexano, 2,3-dimetil-: 1,5288 % 1,0017 % 91,7 %

Fluoruro de trimetilsililo: 1,3335% 0,8325 % 83,3 %

Silanodiol, dimetil-: 0,7075% 0,5258 % 83,3 %

2-Pentanona, 3-etil-3-metil-: 0,8339 % 0,3319% 83,3 %

4,6-Octadiin-3-ona, 2-metil-: 0,1650% 0,0976 % 83,3 %

2-Propil-1-pentanol: 0,7412% 0,8930 % 83,3 %

5,9-Dodecadien-2-ona, 6,10-dimetil-, ___________________________________: 0,5493 % 0,3297 % 83,3 %

Eiemplo 3: Sintesis v recubrimiento de nanoparticulas de oro 5

Las nanoparticulas de oro que tenlan un tamano medio de aproximadamente 5 nm se recubrieron con una diversidad de alcanotiolatos que tenlan longitudes de cadena de C4-C18 y alcanotiolato co-funcionalizado (por ejemplo, 11-mercapto-1-unedecanol). Las nanoparticulas de oro se sintetizaron usando el mbtodo de dos fases estandar de acuerdo con Brust y col. (J. Chem. Soc., Chem. Com., 801, 1994, 2), con algunas modificaciones de 10 acuerdo con Hostetler y col. (Langmuir, 1998, 14, 24). En resumen, AuCI4' se transfirib en primer lugar de una solucibn acuosa de HAuCU-x^O (25 ml, 31,5 mM) a una solucibn de tolueno por el reactivo de transferencia de fase TOAB (80 ml, 34,3 mM). Despues de aislar la fase organica, el exceso de los tioles se aftadib entonces a la solucion. La relacion molar de tiol:HAuCI4-xH20 vario entre 1:1 y 10:1 dependiendo del tipo de tiol, con el fin de preparar una solucion monodispersada de nanoparticulas de oro en un tamano medio de 5 nm. Por ejemplo, las relaciones 15 molares de tiol:Au fueron de 10:1 y 1:1 para nanoparticulas de oro recubiertas con dodecanotiol y butanotiol, respectivamente, a un tamafto medio de 5 nm. Despues de la agitacibn vigorosa de la solucion durante 10 min, se aftadib una solucion acuosa del agente reductor NaBH4 en gran exceso (25 ml, 0,4 M, enfriada con hielo). La reaccion se agitb a temperatura ambiente durante al menos 3 horas, lo que produjo una solucion de color pardo oscuro de las nanoparticulas de oro recubiertas con tiol. La solucion resultante se sometio a una eliminacion del 20 disolvente en un evaporador rotatorio y se siguio de multiples lavados usando etanol y tolueno.

Las nanoparticulas de oro recubiertas con 2-mercaptobenzoazol se sintetizaron por el metodo de intercambio de ligando de las nanoparticulas de oro recubiertas con hexanotiol preparadas previamente. En un exceso de reaccion tipico de tiol entrante, se afiadio 2-mercaptobenzoazol (7 pg) a una solucion de nanoparticulas de oro recubiertas 25 con hexanotiol en tolueno (3 mg/ml, 5 ml). La solucibn estuvo en agitacibn constante durante algunos dias para permitir una conversibn de ligandos maxima. Las nanoparticulas se purificaron de ligandos libres de tiol mediante extracciones repetidas.

Las nanoparticulas de oro se caracterizaron usando microscopia electronica de transmision (TEM). Se prepararon 30 muestras para TEM por deposicibn por goteo 5:1 de una solucibn de nanoparticulas diluida en tolueno sobre moliendas de cobre recubiertas con carbono de malla 200. Las imbgenes TEM (Modelo CM120, Philips, Paises Bajos) de las nanoparticulas de oro se obtuvieron a 120 kV. Las micrografias electrbnicas de transmision de las nanoparticulas de oro confirmaron la distribucibn de tamafto estrecha de las nanoparticulas con un dibmetro medio de aproximadamente 5 nm.

Eiemplo 4: Fabricacibn de sensores

Los electrodos interdigitados en primer lugar se modelan o depositan sobre la parte superior de la oblea de silicio dopada por p degenerativa que tiene una pelicula de Si02 300 nm (de espesor), usando un proceso de litografia o la evaporation de metal a traves de una mascara de sombra. Se muestra una ilustracibn esquembtica del dispositivo en la figura 2(A). El dibmetro de los electrodos en espiral es de aproximadamente 3000 pm, y las anchuras de los 5 electrodos de metal son aproximadamente 20 pm cada vez.

En particular, las nanoparticulas de oro funcionalizadas (vease la tabla 3) que tenfan un dibmetro medio de aproximadamente 5 nm (figura 2(B) y figura 2(C)), se dispersaron en cloroformo por sonicacion, seguido de una gota de deposition de una solution de nanoparticulas de oro en el electrodo. Aunque aun recubierto con una solution, el 10 sustrato se soplb con una corriente de N2 seco. Este proceso se repitib varias veces para producir la resistencia deseada, preferiblemente de 20 K£2 a 5 Mil. En otros ejemplos, se prepararon resistencias de pelicula de 5 MU a 80 MU. El dispositivo se seco durante 2 horas en una campana de gases a una temperatura ambiente, y despues se calento a 50 °C en un homo de vacio durante una noche.

15 Tabla 3. Compuestos usados para revestir las nanoparticulas de oro del conjunto de sensores

Sensor N°: Moleculas funcionales S5 2-Etilhexanotiol

S1: 4-metoxi-toluenotiol S6 2-Mercaptobenzoazol

S2: 11 -mercapto-1 -undecanol S7 Hexanotiol

S3: Decanotiol S8 Terc-dodecanotiol

S4: 1-Butanotiol S9 3-Metil-1-butanotiol

Eiemplo 5: Respuesta del coniunto de sensores a biomarcadores particulares indicativos de cancer de pulmbn

Los sensores desarrollados del ejemplo 4 se montaron en una placa de circuitos PTFE personalizada que tenia 10 20 sitios de sensor separados. Despues, la placa se monto sobre una cbmara de ensayo de acero inoxidable que tenia un volumen de menos de 100 cm3. Se uso un conmutador multifuncibn Agilent 34980 controlado por USB para escoger el sensor activo y medir la resistencia correspondiente en un momento dado. Todo el sistema se controlb por un programa Labview personalizado.

25 Para probar la sensibilidad de los sensores a los biomarcadores indicativos de cancer de pulmon, se realizaron mediciones de la respuesta a biomarcadores particulares usando un sistema burbujeador personalizado de acuerdo con Peng y col. (Nano Letters, 8(11), 2008, 5). La respuesta se midio como ARIRb, donde Rb es la resistencia inicial del sensor en ausencia de analito, y AR es el cambio de resistencia en estado estable corregido inicial tras la exposicion del sensor a un analito.

30

En primer lugar, se examino la respuesta del conjunto de sensores de nanoparticulas de oro a los diferentes biomarcadores de cancer de pulmon a concentraciones entre 0,001P/P°y 0,05 P/P° (P° es la presion de vapor saturada del analito correspond iente a temperatura ambiente). La figura 3 muestra la respuesta de un sensor de nanoparticulas de oro recubierto con terc-dodecanotiol (sensor numero 8) a diversos analitos. En particular, los 35 analitos que se usaron incluyen biomarcadores de decano, trimetil benceno, etil benceno y heptanol. Como puede observarse a partir de la figura, la respuesta del sensor fue rapida tras la exposicion al vapor de analito. Adembs, la respuesta fue completamente reversible tras cambiar de nuevo a vapor de analito nulo (aire purificado, seco). Sobre todo, el sensor fue sensible a una gran diversidad de concentraciones de vapores de analito con excelente relacion senal-ruido (tipicamente, mbs de 10).

40

Tambien se ensayo la respuesta del sensor al vapor de agua se ensayo. Esta caracteristica es significativa, ya que el aliento exhalado contiene una alta concentracion de vapores de agua que pueden impedir las mediciones de VOC indicativos de cancer debido a sus concentraciones relativamente bajas en muestras de aliento. La figura 3 muestra claramente que las respuestas a biomarcadores de cbncer de pulmbn son mucho mayores que la repuesta a loa 45 vapores de agua que indican la alta sensibilidad del sensor a los biomarcadores de cbncer de pulmbn incluso en presencia de altas concentraciones de vapores de agua.

Eiemplo 6: El efecto de la distribucion del tamafio de nanoparticulas v el espesor del revestimiento orqanico sobre la respuesta electrbnica 50

Con el fin de determinar el efecto del espesor del revestimiento orgbnico sobre las respuestas de resistencia diferenciales relativas ARIRb, se usaron nanoparticulas de Au que tenian un diametro medio de aproximadamente 5,2 nm que se revistieron con ligandos de dodecanotiol en diversos grosores. Las nanoparticulas de Au recubiertas

con dodecanotiol se expusieron a decano a 0,05 P/P°y se midieron los valores AR/Rb. La figura 4 muestra que los niveles de serial dependen en gran medida del espesor del revestimiento orgbnico con las bajas respuestas obtenidas para espesores por encima de 10 nm. El ruido calculado muestra un patron similar al de la serial, indicando que el descenso de la senal en grosores por encima de 10 nm no se debe a un aumento del nivel de ruido.

5

Con el fin de determinar el efecto de la distribucibn del tamano de nanoparticulas en la serial de los sensores, se usaron nanoparticulas de Au con hexanotiol que tenian un tamarlo de nucleo medio de aproximadamente 3,6 nm y tamanos que varian de aproximadamente 2 nm a aproximadamente 18 nm. Una cantidad igual de una solucion de nanoparticulas de Au con hexanotiol se aplico en electrodos interdigitados separados (donde cada electrodo se 10 separa de su electrodo adyacente en 10 pm) y se expuso a diferentes analitos, tales como hexano, heptano, decano, metil benceno, tolueno, etanol, etc. Los sensores se expusieron simultbneamente a un analito determinado a una concentracibn dada. La figura 5 muestra el efecto de la distribucion del tamano sobre la serial de deteccion y/o sobre las relaciones senal-ruido de quimiorresistores basados en nanoparticulas de Au esfbricas recubiertas con hexanotioles. Un aumento en la distribucion del tamano disminuye las relaciones seflal-ruido y adicionalmente 15 disminuye la respuesta del sensor.

Por lo tanto, la utilizacibn de nanoparticulas que tienen una distribucibn de tamarlo estrecha proporciona serlales de deteccibn mejoradas con mas de 10 veces la serial de deteccion obtenida de una distribucibn de tamano mas amplia de nanoparticulas (tamarlo de nanoparticulas en el intervalo de 2-18 nm). Los sensores compuestos por 20 nanoparticulas con una distribucibn de tamarlo estrecha son, por lo tanto, ventajosos para detectar VOC indicatives de cancer con sensibilidades muy altas. El espesor del recubrimiento puede optimizarse adicionalmente con respecto a un espesor particular, de acuerdo con los compuestos organicos usados, para mejorar las senales de deteccibn.

25 Eiemplo 7: Respuesta del coniunto de sensores a muestras de aliento de individuos sanos v pacientes con ebneer de pulmon

Se ensayb la respuesta del conjunto de sensores a muestras de aliento de individuos sanos y pacientes con ebneer de pulmon. Se usaron en estos experimentos una fuente de vacio y dos interruptores en los que un lado se conecto 30 a la cbmara de pruebas, y el otro lado se conectb a la fuente de vacio ("interruptor de vacio") o la muestra de aliento ("interruptor de muestra"). En un experimento tipico, las serlales de los elementos del conjunto de sensores se recogieron durante 5 minutos de entorno de vacio abriendo el interruptor de vacio y cerrando el interruptor de muestra, seguido de 5 minutos de exposicion a muestras de aliento que se recogieron como se ha descrito en el Ejemplo 1 anteriormente en el presente documento, despubs seguido de otros 5 minutos de entorno de vacio. Las 35 dos ultimas etapas se repitieron tres veces para evaluar la reproducibilidad. El anblisis de datos de las senales que se recogieron de todos los sensores en el conjunto, se realizo usando anblisis de componentes principales estbndar y de conglomerados.

Las figuras 6A y 6B muestran las respuestas de resistencia diferenciales relativas, AR/Rb de los sensores N° S2, S3 40 y los sensores N° S6, S8, respectivamente a muestras de aliento que se recogieron en una bolsa. Las muestras de aliento se obtuvieron de pacientes de cancer de pulmon y de individuos sanos (controles) tipicos. Las respuestas observadas fueron rapidas (1-10 segundos), completamente reversibles con una reproducibilidad extremadamente buena para todas las muestras. En particular, el sensor N° S2 y el sensor N° S3 mostraron un descenso significativo de la resistencia, mientras que el sensor N° S6 y el sensor N° S8 mostraron un pequerlo aumento en la resistencia. 45

En general, se observaron dos tipos de respuestas. La primera es una disminucion relativamente grande de la quimiorresistencia como ocurrio, por ejemplo, en S2, S3, S5 y S9. La segunda es un aumento relativamente pequeno de la quimiorresistencia como ocurrio, por ejemplo, en S1, S4, S6, S7 y S8. Sin desear quedar ligando a teoria o mecanismo de accion alguno, los cambios en la resistencia tras la exposicion al analito pueden atribuirse al 50 engrosamiento debido a un aumento de distancia de tunel interparticula que puede aumentar la resistencia o a un aumento en la permitividad de la matriz orgbnica que rodea las nanoparticulas de metal que pueden disminuir la resistencia debido a un descenso en la energia de activacibn y una reduccibn de barreras de pozo potenciales entre las nanoparticulas de metal.

55 Se calculo la respuesta media obtenida durante los 3 primeros minutos de exposicion a una muestra dada en todos los ciclos. Las figuras 7A-7B muestran los patrones en un espacio multi-sensor para todas las muestras de aliento, incluyendo 64 muestras de aliento de pacientes de cancer de pulmon y 26 muestras de aliento de individuos sanos. La respuesta a muestras de aliento de ebneer de pulmon fue significativamente diferente de la obtenida para muestras de aliento de individuos sanos. Aunque ciertos sensores proporcionaron cierto solapamiento entre las

muestras, el patron de muestras "sanas" fue inequivocamente diferente del patrbn de muestras de "cancer de pulmon". Ademas, se uso el anblisis de componentes principales (PCA) para analizar todas las respuestas del conjunto de sensores. La figura 8 muestra la respuesta en el espacio de los componentes principales de un conjunto de sensores de 9 sensores (ejemplo 4) expuesto a muestras de aliento de pacientes de cancer de pulmbn y de 5 individuos sanos. Puede observarse a partir de la figura 8 que no hay ningun solapamiento en los patrones obtenidos de muestras de pacientes de cancer de pulmon y de individuos sanos. Por lo tanto, un conjunto de sensores de 9 sensores, junto con algoritmos de reconocimiento de patron, proporciona respuestas con buena discriminacibn entre patrones de aliento de pacientes con cbncer de pulmon y de individuos sanos.

10 Ejemplo 8: Respuesta del conjunto de sensores a muestras de aliento obtenidas de individuos sanos v de pacientes con cancer de mama, cbncer de colon, cbncer de cabeza v cuello, y cbncer de prostata

La respuesta del conjunto de sensores a muestras de aliento de individuos sanos y pacientes con diferentes tipos de cbncer se ensayb de forma similar al procedimiento descrito en el ejemplo 7 anteriormente en el presente 15 documento. Particularmente, se obtuvieron muestras de aliento de pacientes que padecian diferentes tipos de canceres para determinar la sensibilidad de los sensores a diferentes y distintivos patrones de VOC. Los diferentes concerns ensayaron fueron cancer de mama, cancer de colon, cbncer de cabeza y cuello, y cancer de prostata. Las figuras 9-12 muestran la respuesta en el espacio de los componentes principales de un conjunto de sensores de 9 sensores al exponerse a muestras de aliento de pacientes con cancer de mama (figura 9), cbncer de colon (figura 20 10), cancer de cabeza y cuello (figura 11), y cbncer de prbstata (figura 12) ensayado cada uno frente a muestras de aliento de individuos sanos.

Usando unicamente dos componentes principales, el conjunto de sensores de la presente invencion fue capaz de discriminar entre patrones de cbncer y patrones sanos. De forma importante, la discriminacibn se obtuvo para 25 diversos tipos de cbncer. Esto demuestra claramente la aplicabilidad del conjunto de sensores y el sistema de la presente invencibn para su uso clinico en el diagnostico de diversos tipos de cancer.

Ejemplo 9: Discriminacion entre cblulas de cbncer de pulmon diferentes

30 Para determinar la viabilidad de usar el conjunto de sensores de la presente invencion para el diagnostico de cbncer de pulmbn en diferentes estadios de progresion, se usaron muestras que contenian 4 VOC a diferentes relaciones. De acuerdo con Chen y col. (Cancer, 110(4), 2007, 835), las relaciones de estos cuatro VOC (isopreno, hexano (o hexanal), decano (o trimetil benceno) y undecano) indican diferentes fases de la enfermedad del cancer de pulmbn. Por ejemplo, puede usarse una mezcla de 51,5 ppb de isopreno, 15,1 ppb de hexano (o hexanal), 12,5 ppb de 35 decano (o trimetil benceno) y 7,2 ppb de undecano para aliento de cancer de pulmbn simulado de carcinoma pulmonar de cblulas escamosas. Las figuras 13A-13D muestran los resultados del anblisis por GC-MS de 4 VOC metabolicos que simulan 4 cblulas de cbncer de pulmbn diferentes, concretamente, carcinoma pulmonar de cblulas escamosas, adenocarcinoma, carcinoma bronquioalveolar, y carcinoma de cblulas no pequenas in vitro.

40 Despues, se prepararon diferentes relaciones de los 4 VOC y se expusieron usando un sistema generador de gas al conjunto de sensores en base a nanoparticulas de Au recubiertas con las moleculas orgbnicas como se describe en el ejemplo 4. Se realizaron dos simulaciones principales. En la primera simulacibn, se usaron isopreno, hexano, decano y undecano como los cuatro biomarcadores. La figura 14 muestra los datos en el espacio de componentes principales del conjunto de sensores que se expuso a 4 mezclas diferentes de los cuatro biomarcadores que simulan 45 cblulas de cbncer de pulmbn seleccionadas entre carcinoma pulmonar de cblulas escamosas, adenocarcinoma, carcinoma bronquioalveolar, y carcinoma de cblulas no pequeftas. Es evidente a partir de estos resultados que el conjunto de sensores de 9 sensores es capaz de discriminar entre las diferentes mezclas de VOC basicamente si ningun solapamiento entre las cuatro condiciones.

50 En la segunda simulacibn, se usaron isopreno, hexano, trimetil benceno y undecano como los cuatro biomarcadores. La figura 15 muestra los datos en el espacio del componente principal del conjunto de sensores que se expuso a 4 mezclas diferentes de los cuatro biomarcadores que simulan cblulas de cancer de pulmbn seleccionadas entre carcinoma pulmonar de cblulas escamosas, adenocarcinoma, carcinoma bronquioalveolar, y carcinoma de cblulas no pequefias. El conjunto de sensores de 9 sensores fue capaz de discriminar entre las diferentes mezclas de VOC 55 donde el unico solapamiento es entre carcinoma bronquioalveolar y carcinoma de cblulas no pequenas. Puede obtenerse una separacibn adicional a travbs del uso de 3 componentes principales o a travbs de un ajuste del revestimiento orgbnico.

Por lo tanto, se muestra claramente que, un conjunto de sensores que comprende nueve sensores de

nanoparticulas de oro recubiertas con alcanotiolatos proporciona alta sensibilidad a los biomarcadores de diversos cbnceres, y puede usarse junto con algoritmos de reconocimiento de patrones para proporcionar una total discriminacion entre muestras de aliento de individuos sanos y muestras de aliento de pacientes que padecen uno cualquiera de cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de cabeza y cuello, cancer de colon y cancer de prostata.

5 Ademas, los resultados presentados en el presente documento muestran que el conjunto de sensores de la presente invencibn proporciona discriminacion entre mezclas de VOC que simulan diferentes fases (o tamafios tumorales) de cbncer de pulmbn. Por lo tanto, el conjunto de sensores de la presente invencion puede usarse clinicamente, para un diagnostico temprano de cancer de pulmbn, asi como otros tipos de cbncer.

10 Eiemplo 10: Poblacion de ensavo

Se tomaron muestras de aliento de 68 voluntarios con edades de 30-75, que no habian ingerido cafb o alcohol durante al menos 1 hora y 12horas, respectivamente, despues del consentimiento firmado. Los voluntarios se dividieron como se indica a continuation: 22 pacientes de cbncer de pulmbn primario, 17 pacientes de cancer de

15 colon primario, 15 pacientes de cbncer de mama primario, y 14 pacientes de cbncer de prbstata primario. Ademas, se usaron 18 individuos sanos que coincidieron en edad y estilo de vida con los pacientes de cancer de ensayo como controles. Todos los pacientes de cbncer se ensayaron directamente despubs de un diagnbstico mediante mbtodos clinicos convencionales (por ejemplo, biopsia por broncoscopio, exploration por tomografia computerizada, puncion pulmonar, colonoscopia, mamografia, etc.) y antes de la quimioterapia y/u otro tratamiento contra el cbncer.

20 No se realizo ninguna recogida de aliento en los 4 dias siguientes a la biopsia. Las caracteristicas clinicas de la poblacibn de estudio para pacientes de cancer y voluntarios sanos se enumeran en la Tabla 4. Se tomaron muestras de aliento adicionales de 59 voluntarios sanos, con edades de 20-79, para estudiar el efecto de diversos factores de desviacion. Todos los experimentos se aprobaron por, y se realizaron de acuerdo con las directrices del comite del Technion para la supervision de experimentos con seres humanos (Haifa, Israel).

El aliento exhalado se recogio de manera controlada a partir de la poblacion de ensayo del ejemplo 10. El aire inhalado se limpio de contaminantes ambientales inhalando repetidamente hasta la capacidad pulmonar total 5 durante 5 minutos a traves de una boquilla (adquirida en Eco Medics) que contenia un cartucho de filtro en el puerto de aspiracion, eliminando de esta manera mas del 99,99 % de los VOC exogenos del aire durante la inspiracibn. Inmediatamente despues del lavado pulmonar, los sujetos exhalaron a traves de un puerto de exhalacibn separado de la boquilla contra 10-15 cm de presibn de H2O para asegurar el cierre del velo para excluir el arrastre de gas. El aliento exhalado contenia una mezcla de aire alveolar y aire del espacio muerto respiratorio. Los sujetos exhalaron 10 en el colector de aliento que autombticamente cargo el aire del espacio muerto en una bolsa separada y la respiracion alveolar en una bolsa de muestreo Mylar de 750 ml (fluoruro de polivinilo, adquirida en Eco Medics) en un proceso de una unica etapa. Las bolsas Mylar se reutilizaron y se limpiaron minuciosamente antes de cada uso con N2(g) fluido (99,999 % de pureza) durante 5-8 minutos (el anblisis por GC-MS junto con tbcnicas de pre- concentracibn mostro que este proceso de purification elimina >99 % de los contaminantes y/o los VOC de las 15 bolsas Mylar). Se recogieron al menos dos bolsas de cada individuo para su anblisis posterior. Todas las bolsas se analizaron en dos dias desde el momento de la recogida del aliento para asegurar la precisibn de los resultados.

Eiemplo 12: Fabrication del coniunto de sensores

20 Se preparo un conjunto de sensores compuesto por 14 quimiorresistores de reaccibn cruzada basados en compuestos de nanoparticulas de Au de 5 nm revestidas con diferentes compuestos orgbnicos. Las nanoparticulas se sintetizaron mediante un metodo de dos fases modificado como se describe en el ejemplo 3. Los compuestos organicos que se usaron para revestir las nanoparticulas son: dodecanotiol, 4-metoxi-toluenotiol, hexanotiol, 11- mercapto-1-undecanol, decanotiol, octadecanotiol, terc-dodecanotiol, 1-butanotilo, 2-etilhexanotiol, 3-metil-1- 25 butanotiol, 2-mercaptobenzoxazol, 11-mercapto-1-undecanol, 2-mercaptobencil alcohol, y 3-Metil-1-butanotiol (todos adquiridos en Sigma-Aldrich).

Se depositaron diez pares de electrodos de oro interdigitados circulares por un evaporador de haz de electrones TFDS-870 (Vacuum Systems & Technologies Ltd., Israel) en obleas de silicio de calidad de dispositivo recubiertas 30 con oxido termico a 300 nm (adquirido en Silicon Quest International Inc., Santa Clara, CA). El dibmetro externo del area de electrodo circular fue de 3000 pm; el espacio entre dos electrodos adyacentes y la anchura de cada electrodo fueron 20 pm ambos. Las nanoparticulas de Au recubiertas se dispersaron en cloroformo por sonicacion y se depositaron por goteo sobre los electrodos. Aun todavia recubierto con solucibn, el sustrato se sopld con N2 seco. Este proceso se repitio varias veces para producir una resistencia deseada de aproximadamente 1 M£1 El 35 dispositivo se seco durante 2 horas a una temperatura ambiente y despues se puso en un homo de vacio a 50 °C durante una noche. Despues, los sensores se montaron sobre una placa de circuitos PTFE personalizada para formar el conjunto de sensores de 14 sensores.

Eiemplo 13: Ensavos de aliento 40

Antes de la exposicibn del conjunto de sensores del ejemplo 12 a muestras de aliento, se examinaron las respuestas de cada sensor al aliento de pacientes de cbncer de pulmbn, cbncer de colon, cbncer de mama y cbncer de prostata, asl como al aliento de controles sanos (figuras 16A, 16B y 16C). Los sensores de la presente invention respondieron rapidamente a las muestras de aliento de todos los pacientes de cbncer. Las respuestas fueron 45 completamente reversibles. La mayor parte de los sensores mostraron un limite de deteccibn de 1-5 ppb. Adembs, las nanoparticulas de Au que se revistieron con 4-metoxi-toluenotiol, 2-mercaptobenzoxazol, o 11-mercapto-1- undecanol mostraron limites de deteccibn de 2-10 ppb tras la exposicidn a acetaldehfdo (un VOC prometedor para cancer de pulmbn; Smith y col., Rapid Commun. Mass Spectrom., 17, 2003, 845) y formaldehido (un VOC prometedor para cbncer de mama; Ebeler y col., J. Chromatog. B, 702, 1997, 211), muy por debajo del nivel de 50 concentration de estos VOC en aliento exhalado de pacientes de cbncer (Peng y col., Nature Nanotechnol., 4, 2009, 669).

La respuesta del conjunto de 14 sensores a muestras de aliento de pacientes sanos, de cbncer de pulmbn, cancer de colon, cbncer de prostata y cancer de mama se analizo usando anblisis de componentes principales (PCA). Las 55 figuras 17A-17E muestran los primeros dos componentes principales (PC1 y PC2) para cada sujeto, lo que representa >88 % de varianza. Se obtuvo una buena separation entre patrones sanos y con cancer, para cada tipo de cancer por separado (figuras 17A-17D) y tambien para todos los tipos de cbncer en un unico grbfico (figura 17E). Cabe destacar que estos resultados se consiguieron sin ningun tratamiento previo (concentracibn previa o deshumidificacion) de las muestras de aliento. Por lo tanto, un conjunto de sensores que comprende 14 sensores de

nanoparticulas de oro recubiertas con un revestimiento organico proporciona alta sensibilidad a biomarcadores indicativos de diversos tipos de cancer. El conjunto de sensores junto con algoritmos de reconocimiento de patrones proporciona una discriminacion completa entre muestras de aliento de controles sanos y muestras de aliento de pacientes que padecen uno cualquiera de cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de colon y cancer de 5 prostata.

Tabla 4: Caracteristicas clinicas de 68 pacientes de cancer y 18 controles sanos. La relacion total entre varones y mujeres es de -1:1.

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: Control sano (1) NSCLC = (2) SqCLC = (3) AC = Ade (4) Carcinom (5) IDC = Cai

Claims

I. Un conjunto de sensores para detectar compuestos orgbnicos volatiles indicativos de cancer, comprendiendo el conjunto de sensores nanoparticulas de oro (Au) conductoras recubiertas con un revestimiento

5 organico, en el que las nanoparticulas de Au tienen una distribucion del tamano de particulas estrecha con un tamano de particula medio de 5 nm, un tamafio de particula en el intervalo de 1-10 nm y una anchura de la curva de distribucibn a la mitad del valor mbximo (FWHM) de menos de o igual al 40 % del tamano de particula medio, y en el que el espesor del revestimiento organico de dichas nanoparticulas de Au esta en el intervalo de 0,2-4 nm.

10 2. El conjunto de sensores de acuerdo con la reivindicacibn 1, en el que las nanoparticulas de Au tienen

un tamano de particula en el intervalo de 3-6 nm.
3. El conjunto de sensores de acuerdo con la reivindicacibn 1, en el que el espesor del revestimiento organico esta en el intervalo de 0,6-2 nm.

15
4. El conjunto de sensores de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que el revestimiento organico comprende una monocapa o multiples capas de compuestos organicos seleccionados entre molbculas pequenas, monomeros, oligomeros y polimeros, preferiblemente en el que el revestimiento organico se selecciona entre el grupo que consiste en alquiltioles con cadenas C3-C24, alcanotiolatos co-funcionalizados, arenotiolato, (y-

20 mercaptopropil)tri-metiloxisilano, dialquilo disulfuros, xantatos, oligonuclebtidos, polinuclebtidos, peptidos, proteinas, enzimas, polisacaridos, fosfolipidos, y combinaciones de los mismos.
5. El conjunto de sensores de acuerdo con la reivindicacion 1, en el que las nanoparticulas de Au conductoras recubiertas con un revestimiento organico estan en una configuration seleccionada entre cables 1D,

25 peliculas 2D, y conjuntos 3D.
6. El conjunto de sensores de acuerdo con la reivindicacion 1, que comprende adicionalmente al menos uno de un quimiorresistor, quimiocondensador, microbalanza de cristal de cuarzo, resonador de onda acustica en bloque (BAW) y onda acustica de superficie (SAW), celda electroquimica, resonancia de plasmones superficiales

30 (SPR), y espectroscopio bptico.
7. Un sistema para detectar un patron de compuestos organicos volatiles indicativos de cancer, comprendiendo el sistema:

35 (i) un conjunto de sensores para detectar compuestos organicos volatiles indicativos de cancer de acuerdo

con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, y

(ii) un analizador de aprendizaje y reconocimiento de patrones, en el que el analizador de aprendizaje y reconocimiento de patrones recibe sefiales de salida de sensor y las compara con los datos almacenados.

40 8. El sistema de acuerdo con la reivindicacion 7, en el que el analizador de aprendizaje y reconocimiento

de patrones comprende al menos un algoritmo seleccionado entre el grupo que consiste en algoritmos de redes neuronales artificiales, anblisis de componentes principales (PCA), percepcibn multicapa (MLP), red neuronal de regresion generalizada (GRNN), sistemas de inferencia difusa (FIS), mapa autoorganizado (SOM), funcion de base radial (RBF), algoritmos geneticos (GAS), sistemas neuro-difusos (NFS), teoria de resonancia adaptativa (ART), 45 regresion de minimos cuadrados parciales (PLS), regresion lineal multiple (MLR), regresibn de componentes principales (PCR), analisis de funcibn discriminante (DFA), anblisis discriminante lineal (LDA), analisis de conglomerados, y vecino mas cercano, preferiblemente en el que al menos un algoritmo es anblisis de componentes principales (PCA).

50 9. El sistema de acuerdo con la reivindicacibn 7 u 8, que comprende adicionalmente un aparato para

recoger dichas muestras de aliento, preferiblemente en el que el aparato estb disenado para recoger respiracibn alveolar.
10. El sistema de acuerdo con la reivindicacibn 9, que comprende adicionalmente al menos uno de un

55 concentrador de respiracibn y una unidad de deshumidificacibn.

II. Un metodo de diagnostico de cbncer en un sujeto, comprendiendo el metodo las etapas de: proporcionar un sistema de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10;

exponer el conjunto de sensores a una muestra de aliento exhalado; y

usar algoritmos de aprendizaje y reconocimlento de patrones para determinar la presencia de un patron de compuestos organicos volatiles indicativos de cancer en la muestra, en el que los compuestos organicos

volatiles indicativos de cancer se seleccionan entre el grupo que consiste en 4-metil-octano, 2-etil-1-

5 hexanol, 2-etil-4-metil-1-pentanol, 2,3,4-trimetil-pentano, 2,3-dimetil-hexano, fluoruro de trimetilsililo, dimetil-

silanodiol, 3-etil-3-metil-2-pentanona, 2-metil-4,6-octadiin-3-ona, 2-propil-1-pentanol, decano, trimetil benceno, etil benceno, heptanol, isopreno, hexano, undecano y 6,10-dimetil-5,9-dodecadien-2-ona.
12. El metodo de acuerdo con la reivindicacion 11, para diferenciar entre diferentes tipos de cancer o 10 diferentes fases de un unico tipo de cancer.
13. El metodo de acuerdo con la reivindicacibn 11 o 12, en el que el cancer se selecciona entre el grupo

que consiste en canceres de pulmbn, cabeza y cuello, mama, prbstata, colon, ovario, rifibn, vejiga, oral, y de piel,

preferiblemente en el que el cancer es cancer de pulmbn.