ES2581391T3 - Patrones de tamaño para uso en análisis de ácidos nucleicos - Google Patents
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Abstract
Uso de un patrón de tamaño que determina el tamaño o tamaños de dos o más loci en una muestra que contiene ácido nucleico, cada uno de los loci tiene uno o más posibles tamaños conocidos, los posibles tamaños conocidos tienen un intervalo de tamaños definidos por el más grande y el más pequeño posibles tamaños conocidos, el patrón de tamaño incluye elementos patrón de tamaño, donde el tamaño de uno o más de esos elementos patrón de tamaño es seleccionado por ser: a) mayor que el más grande de los tamaños posibles conocidos para el locus; o b) menor que el más pequeño de los posibles tamaños conocidos para el locus; o c) diferente de cualquiera de los tamaños de los posibles tamaños conocidos para el locus; en los que el patrón de tamaño incluye un conjunto de uno o más elementos patrón de tamaño provistos con una unidad característica y uno o más aún conjuntos de uno o más elementos patrón de tamaño provistos con una unidad característica diferente, caracterizada porque cada uno de los dos o más loci están separados del loci adyacente que tiene la misma unidad característica por un único elemento patrón de tamaño, donde una unidad característica es una etiqueta.
Description
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DESCRIPCION
Patrones de tamano para uso en analisis de acidos nucleicos Campo tecnico
Esta invencion se refiere a las mejoras relacionadas con el analisis, particularmente de muestras que contienen acido nucleico.
Existen enfoques para el analisis de muestras que contienen acido nucleico, por ejemplo muestras de ADN forenses, que utilizan un patron de tamano para proporcionar puntos de referencia a partir de los cuales se puede determinar los tamanos de los elementos en la muestra analizar. El patron de tamano esta formado por una serie de elementos patron de tamano. Los elementos patron de tamano de un patron de tamano estan marcados con una etiqueta, siendo la identidad de la etiqueta diferente a las etiquetas utilizadas para las identidades desconocidas en la muestra que esta siendo testada. La solicitud de patente internacional WO01/92575 por ejemplo describe un numero de patrones de tamano.
El numero de etiquetas disponible esta restringido y por tanto hay una restriccion en el numero de loci que pueden ser considerados en un analisis.
Entre los objetivos potenciales de la invencion esta proporcionar un enfoque que incremente el numero de loci que pueden ser considerados en uno de los analisis de una muestra a analizar y/o incrementar el numero de muestras a analizar que pueden ser consideradas en una unidad de tiempo.
Un primer aspecto de la invencion es el uso de un patron de tamano para determinar el tamano o tamanos de dos o mas loci en una muestra que contiene acido nucleico, cada uno de los loci tiene uno o mas posibles tamanos conocidos, los posibles tamanos conocidos tienen un intervalo de tamanos definido por el mas grande y el mas pequeno posible tamano conocido,
el patron de tamano incluye elementos patron de tamano, donde el tamano de uno o mas de esos elementos patron de tamano se seleccionan por ser:
a) mayor que el mas grande de los posibles tamanos conocidos para el locus; o
b) menor que el mas pequeno de los posibles tamanos conocidos para el locus; o
c) diferente de cualquiera de los tamanos de los posibles tamanos conocidos para el locus
en el que patron de tamano incluye un conjunto de uno o mas elementos patron de tamano provistos con una unidad caractenstica y uno o mas conjuntos adicionales de uno o mas elementos patron de tamano provistos con una unidad caractenstica diferente, caracterizada porque cada uno de los dos o mas loci estan separados en tamano del loci adyacente que tiene la misma unidad caractenstica por un solo elemento patron de tamano,
donde una unidad caractenstica es una etiqueta.
Los loci pueden ser seleccionados desde los siguientes loci: VWA, D16S539, D2S1338, D8S1179, D21S11, D18S51, D19S433, TH01, FGA, D3S1358, D10S1248, D22S1045, D2S441, D1S1656, D12S391, TPOX, D14S1434, CSF1PO, D5S818, D7S820, D13S317 o SE33. El uso puede utilizar dos o mas de estos loci, preferiblemente cinco o mas de estos loci, mas preferiblemente ocho o mas de estos loci e idealmente once o mas de estos loci. Uno o mas de estos loci pueden usarse junto a uno o mas de otros loci.
El tamano o tamanos del locus pueden ser el tamano o tamanos para esa muestra fuera del conjunto de uno o mas posibles tamanos. El tamano o tamanos son preferiblemente el tamano o tamanos del alelo.
Se describe un patron de tamano, el patron de tamano que se usa en la determinacion del tamano o tamanos del alelo en un locus en la muestra que contiene acido nucleico, el locus tiene uno o mas posibles tamanos conocidos de alelo, los posibles tamanos conocidos de alelo que tienen un intervalo de tamanos definidos por el mas grande y el mas pequeno tamano posible conocido de alelos, el patron de tamano incluye uno o mas elementos patron de tamano, donde el tamano de uno o mas de estos elementos patron de tamano se selecciona por ser: mayor que el mas grande de los posibles alelos conocidos; o menor que el mas pequeno de los posibles alelos conocidos; o diferente de cualquiera de los tamanos de los posibles alelos conocidos. Preferiblemente el tamano de uno o mas de los elementos patron de tamano se selecciona por ser mayor que el mas grande de los posibles alelos conocidos y/o menor que el mas pequeno de los posibles alelos conocidos y/o diferente de cualquiera de los tamanos de los posibles alelos conocidos, teniendo en cuenta cualquier parte adicional de la secuencia que se adicionan a las partes de tamano variable del alelo(s), por ejemplo la secuencia flanqueante incluida en el extremo 5' y/o 3' del locus/loci amplificado de la muestra.
El locus y/o tamano o tamanos del locus incluyen una etiqueta como unidad caractenstica, por ejemplo un colorante. La misma unidad caractenstica puede ser utilizada para todos los tamano o tamanos del mismo locus. La misma
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unidad caractenstica puede ser utilizada para el patron de tamano y/o uno o mas, preferiblemente todos, de los elementos patron de tamano utilizados para determinar el tamano o tamanos de un locus que esta incluido en el tamano o tamanos del locus para ese locus.
La misma unidad caractenstica puede ser utilizada para dos o mas loci, particularmente donde el intervalo de tamanos definidos por el mas grande y el mas pequeno de los posibles tamanos conocidos para esos dos o mas loci no se solapen en tamano. La misma unidad caractenstica puede utilizarse para el patron de tamano y/o uno o mas, preferiblemente todos, de los elementos patron de tamano utilizado para determinar el tamano o tamanos de todos los loci que usan la misma unidad caractenstica.
Preferiblemente se proporcionan al menos cinco diferentes loci que cada uno incorporara una unidad caractenstica diferente del otro. Se proporcionan uno, dos, tres o mas diferentes loci que incorporan la misma unidad caractenstica para cada uno de cinco, potencialmente mas, unidades caractensticas diferentes.
Preferiblemente todos los canales y/o capilares en el instrumento de analisis se usan para las muestras a analizar con acido nucleico desconocido.
El patron de tamano puede incluir uno o mas de los elementos patron de tamano formados por acidos nucleicos.
Preferiblemente el patron de tamano incluye uno o mas de los elementos patron de tamano, donde el tamano de uno o mas de esos elementos patron de tamano se selecciona por ser: mayor que el mas grande de los posibles tamanos conocidos para cada locus que incluyen la misma unidad caractenstica que el patron de tamano, o menor que el mas pequeno de los posibles tamanos conocidos para cada locus que incluyen la misma unidad caractenstica que el patron de tamano; o diferente de cualquiera de los tamanos de los posibles tamanos conocidos para cada locus que incluyen la misma unidad caractenstica que el patron de tamano. Preferiblemente el patron de tamano incluye uno o mas de los elementos patron de tamano, donde el tamano de uno o mas de esos elementos patron de tamano se selecciona por ser: mayor que el mas grande de los posibles tamanos conocidos del alelo para cada locus que incluye la misma unidad caractenstica que el patron de tamano; o menor que el mas pequeno de los posibles tamanos conocidos del alelo para cada locus que incluye la misma unidad caractenstica que el patron de tamano; o diferente de cualquiera de los tamanos del alelo de los posibles tamanos conocidos del alelo para cada locus que incluye la misma unidad caractenstica que el patron de tamano. Preferiblemente el tamano de uno o mas de los elementos patron de tamano se selecciona por ser mayor que el mas grande de los posibles alelos conocidos y/o menor que el mas pequeno de los posibles alelos conocidos y/o diferente de cualquiera de los tamanos de los posibles alelos conocidos, teniendo en cuenta cualquier parte adicional de la secuencia que se adiciona a las partes de tamano variable del alelo(S), por ejemplo la secuencia flanqueante incluida en el extremo 5' y/o 3' del locus/loci amplificado de la muestra.
El patron de tamano puede incluir uno o mas elementos patron de tamano, donde el tamano de uno o mas de esos elementos patron de tamano no se selecciona por ser: mayor que el mas grande de los posibles tamanos conocidos para uno o mas, posiblemente cada, locus que incluye una unidad caractenstica diferente a la del patron de tamano; o menor que el mas pequeno de los posibles tamanos conocidos para uno o mas, posiblemente cada, locus que incluye una unidad caractenstica diferente a la del patron de tamano; o diferente de cualquiera de los tamanos de los posibles tamanos conocidos de uno o mas, posiblemente cada, locus que incluye una unidad caractenstica diferente a la del patron de tamano.
Uno o mas de los elementos patron de tamano pueden ser de un tamano que sea menor que el tamano mas pequeno de los posibles tamanos conocidos para uno de los locus y mayor que el tamano mas grande de los posibles tamanos conocidos del otro locus. Preferiblemente el tamano mas pequeno de uno de los locus es mayor en tamano que el tamano mas grande del otro locus. Preferiblemente uno de los locus y el otro locus utilizan la misma unidad caractenstica. Donde tres o mas loci se considera que utilizan la misma unidad caractenstica, preferiblemente uno o mas de los elementos patron de tamano pueden ser de un tamano que sea menor que el tamano mas pequeno de los posibles tamanos conocidos para uno de los locus y mayor que el tamano mas grande de los posibles tamanos conocidos del otro locus, con respecto a cada par de loci cuyos posibles intervalos de tamano conocidos sean contiguos.
Donde se considera que dos o mas loci usan la misma unidad caractenstica, preferiblemente se proporcionan uno o mas elementos patron de tamano que tienen un tamano menor que el tamano mas pequeno de los posibles tamanos conocidos de los dos o mas loci. Preferiblemente al menos dos de tales elementos patron de tamano son proporcionados asf.
Donde se considera que dos o mas loci usan la misma unidad caractenstica, preferiblemente se proporcionan uno o mas elementos patron de tamano que tienen un tamano mayor que el tamano mas grande de los posibles tamanos conocidos de los dos o mas loci. Preferiblemente al menos dos de tales elementos patron de tamano son proporcionados ast
Preferiblemente se considera que dos o mas loci usan la misma unidad caractenstica con respecto a cada una de las dos o mas unidades caractensticas diferentes. Preferiblemente para cada una de las dos o mas unidades caractensticas diferentes, se proporcionan uno o dos o mas de los elementos patron de tamano que tienen un
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tamano menor que el tamano mas pequeno de los posibles tamanos conocidos de los dos o mas loci y/o se proporciona uno o dos o mas elementos patron de tamano que tienen un tamano mayor que el tamano mas grande de los posibles tamanos conocidos de los dos o mas loci. Preferiblemente dos o mas loci se considera que usan la misma unidad caractenstica con respecto a cada una de las cinco unidades caractensticas diferentes. Preferiblemente para cada una de las cinco unidades caractensticas diferentes, se proporcionan uno o dos o mas de los elementos patron de tamano que tienen un tamano menor que el tamano mas pequeno de los posibles tamanos conocidos de los dos o mas loci y/o se proporcionan uno o dos o mas de los elementos patron de tamano que tienen un tamano mayor que el tamano mas grande de los posibles tamanos conocidos de los dos o mas loci.
Uno o dos o mas de los elementos patron de tamano pueden tener un tamano que sea menor que uno de los posibles tamanos conocidos para un locus y que sea mayor que uno de los posibles tamanos conocidos de ese locus. Uno o dos o mas de los elementos patron de tamano pueden ser de un tamano que encaje en un hueco dentro de los posibles tamanos conocidos para un locus.
El patron de tamano puede incluir un conjunto de uno o mas elementos patron de tamano provisto con una unidad caractenstica y uno o mas conjuntos adicionales de uno o mas elementos patron de tamano provistos con una unidad caractenstica diferente. El patron de tamano puede ser una composicion formada por dos o mas conjuntos de uno o mas elementos patron de tamano, estando provistos los conjuntos con unidades caractensticas diferentes. Un conjunto puede incluir dos o mas, preferiblemente 3 o mas, mas preferiblemente 5 o mas, e idealmente siete o mas elementos patron de tamano. El numero de elementos patron de tamano puede ser el mismo en cada conjunto o puede ser diferente. Cuatro, cinco, seis, siete o mas conjuntos de elementos patron de tamano pueden ser proporcionados, cada uno con una unidad caractenstica diferente.
El patron de tamano puede incluir al menos 10 elementos patron de tamano, preferiblemente al menos 15, mas preferiblemente al menos 20 e idealmente al menos 25. El patron de tamano puede incluir 36 elementos patron de tamano o menos y puede tener 30 elementos patron de tamano o menos.
Donde dos o mas loci son considerados, despues uno o mas elementos patron de tamano que son del mismo tamano pueden ser utilizados para dos o mas de los dos o mas loci considerados.
Uno o mas elementos patron de tamano que tienen el mismo tamano entre sf pueden ser mayores que el mas grande de los tamanos posibles conocidos para dos o mas de esos dos o mas loci que estan siendo considerados. Todos los elementos patron de tamano que tiene el mismo tamano entre sf pueden ser mayores que el mas grande de los tamanos posibles conocidos para todos de los dos o mas loci que estan siendo considerados.
Uno o mas de los elementos patron de tamano que tienen el mismo tamano entre sf pueden ser menores que el mas pequeno de los tamanos posibles conocidos para dos o mas de esos dos o mas loci que estan siendo considerados. Todos los elementos patron de tamano que tienen el mismo tamano entre sf pueden ser menores que el mas pequeno de los tamanos posibles conocidos para todos de los dos o mas loci que estan siendo considerados.
Uno o mas de los elementos patron de tamano que tienen el mismo tamano entre sf pueden ser diferentes en tamano de todos los posibles tamanos conocidos para dos o mas de esos dos o mas loci que estan siendo considerados. Todos los elementos patron de tamano que tienen el mismo tamano entre sf pueden ser diferentes en tamano de todos los posibles tamanos conocidos para todos de los dos o mas loci que estan siendo considerados.
Puede ser proporcionado un elemento patron de tamano que sea al menos 1 par de bases menor en tamano que el mas pequeno posible alelo conocido patron de tamano que se esta usando para calibrar. Preferiblemente el elemento patron de tamano es al menos 2 pares de bases menor, mas preferiblemente al menos 3 pares de bases menor y potencialmente 4 o mas pares de bases menor. Puede ser proporcionado un elemento patron de tamano que sea al menos 0,1 designaciones menores en tamano que el mas pequeno posible alelo conocido patron de tamano que esta siendo usado para calibrar. Preferiblemente el elemento patron de tamano es al menos 0,2 designaciones menor, mas preferiblemente al menos 0,3 designaciones menor y potencialmente 1 o mas designaciones menor.
Puede ser proporcionado un elemento patron de tamano que tenga al menos 1 par de bases mayor en tamano que el mas grande posible alelo conocido patron de tamano que esta siendo usado para calibrar. Preferiblemente el elemento patron de tamano es al menos 2 pares de bases mas grande, mas preferiblemente al menos 3 pares de bases mas grande y potencialmente 4 o mas pares de bases mas grande. Puede ser proporcionado un elemento patron de tamano el cual sea al menos 0,1 designaciones mayor en tamano que el mas grande posible alelo conocido patron de tamano que esta siendo usado para calibrar. Preferiblemente el elemento patron de tamano es al menos 0,2 designaciones mayor, mas preferiblemente al menos 0,3 designaciones mayor y potencialmente 1 o mas designaciones mayor.
Cuando se proporciona un elemento patron de tamano intermedio en el posible intervalo de tamanos de alelos conocidos para un locus y posible intervalo de tamano conocido para otro locus, es preferible que el elemento patron de tamano proporcionado sea al menos 1 par de bases mayor en tamano que el alelo mas grande del intervalo con los menores tamanos y al menos 1 par de bases menor en tamano que el alelo mas pequeno del intervalo con los tamanos mas grandes. El elemento patron de tamano puede ser al menos 2 pares de bases mayor y al menos 2
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pares de bases menor respectivamente. El elemento patron de tamano puede ser al menos 3 pares de bases mayor y al menos 3 pares de bases menor respectivamente. El elemento patron de tamano puede ser al menos 4 pares de bases mayor y al menos 4 pares de bases menor respectivamente. Cuando se proporciona un elemento patron de tamano intermedio en el posible intervalo de tamanos de alelos conocidos para un locus y el posible intervalo de tamanos conocidos para otro locus, es preferible que el elemento patron de tamano proporcionado sea al menos 0,1 designaciones mayor en tamano que el alelo mas grande del intervalo con los tamanos menores y al menos 0,1 designaciones menor en tamano que el alelo mas pequeno del intervalo con los tamanos mayores. El elemento patron de tamano debe ser al menos 0,2 designaciones mayor y al menos 0,2 designaciones menor respectivamente. El elemento patron de tamano debe ser al menos 0,3 designaciones mayor y al menos 0,3 designaciones menor respectivamente. El elemento patron de tamano debe ser al menos 1 designacion mayor y al menos 1 designacion menor respectivamente.
El termino locus puede ser remplazado por el termino componente y/o el termino loci puede ser remplazado por el termino componentes, o viceversa, en cualquiera de las afirmaciones contenidas aqrn.
La invencion puede tambien requerir el uso de uno o mas de los siguientes componentes:
a) uno o mas cebadores;
b) una o mas sondas;
c) una o mas unidades caractensticas, tales como etiquetas o colorantes;
d) uno o mas tampones;
e) uno o mas soluciones de HCl
f) uno o mas soluciones de EDTA
g) uno o mas marcadores de genero, tales como Amelogenina;
h) una o mas escalera alelicas;
i) uno o mas enzimas, tales como la Taq polimerasa;
j) uno o mas reactivos para uso en RCP;
k) uno o mas deoxinucleotido trifosfato;
l) una o mas soluciones que contienen iones Mg y/o iones Mn;
m) una o mas soluciones que contienen iones potasio.
De acuerdo con un segundo aspecto de la invencion se proporciona un metodo de analisis de una muestra que contiene acido nucleico para determinar el tamano o tamanos de unos dos o mas loci de la muestra, cada uno de los loci tiene uno o mas posibles tamanos conocidos, los posibles tamanos conocidos tienen un intervalo definido por los mas grandes y los mas pequenos posibles tamanos conocidos, el metodo incluye:
introducir un patron de tamano de al menos una parte de la muestra, el patron de tamano incluye uno o mas elementos patron de tamano;
realizar una separacion basada en el tamano en al menos una parte de la muestra; determinar las posiciones de los elementos patron de tamano detectados; utilizar los elementos patron de tamano para determinar el tamano o tamanos de los locus; donde el tamano de uno o mas de esos elementos patron de tamano es seleccionado por ser:
a) mayor que el mas grande de los tamanos posibles conocidos para el componente; o
b) menor que el mas pequeno de los tamanos posibles conocidos para el componente; o
c) diferente de cualquiera de los tamanos de los posibles tamanos conocidos para el componente;
en los que el patron de tamano incluye un conjunto de uno o mas elementos patron de tamano provistos con una unidad caractenstica y uno o mas conjuntos adicionales de uno o mas elementos patron de tamano provistos con una unidad caractenstica diferente, caracterizada porque cada uno de los dos o mas loci estan separados en tamano del loci adyacente que tiene la misma unidad caractenstica por un solo elemento patron de tamano, donde una unidad caractenstica es una etiqueta.
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El metodo puede incluir una o mas de las siguientes etapas: recogida de la muestra; preparacion de la muestra para la amplificacion; amplificacion de la muestra, por ejemplo usando RCP; realizacion de una separacion basada en el tamano usando electroforesis, por ejemplo en un capilar o canal, particularmente usando un instrumento de electroforesis de gel capilar.
El metodo puede incluir la adicion de uno o mas de los componentes de a) a m) del primer aspecto de la invencion. Los uno o mas componentes pueden ser anadidos durante la preparacion de la muestra por amplificacion y/o durante la amplificacion y/o en la preparacion para la separacion basada en el tamano.
Preferiblemente el metodo incluye el analisis de la muestra en al menos 1 canal o capilar de un instrumento. Preferiblemente todos los capilares o canales usados para analizar una muestra se utilizan para realizar una separacion basada en el tamano en la muestra. Preferiblemente ninguno de los capilares o canales usados para analizar una muestra se usan para realizar una separacion basada en el tamano en solo un patron de tamano.
El metodo puede determinar las posiciones de los elementos patron de tamano usando un laser. El laser puede causar fluorescencia de una unidad caractenstica de un elemento patron de tamano, particularmente un colorante.
La determinacion de las posiciones de los elementos patron de tamano puede incluir la generacion de un conjunto de datos que incluye datos de componentes que representan la posicion de la fluorescencia y el nivel de fluorescencia observado para cada capilar con relacion al mas pequeno de cada elemento patron de tamano y preferiblemente cada elemento patron de tamano y cada tamano o tamanos del alelo o alelos de un locus. El conjunto de datos puede incluir uno o dos componentes para el tamano o tamanos del alelo para cada locus analizado donde el origen de la muestra es de una unica persona. El conjunto de datos puede incluir uno o mas componentes para el tamano o tamanos del alelo para cada locus analizado donde el origen de la muestra es de mas de una persona. Antes de que los elementos patron de tamano sean utilizados para determinar el tamano o tamanos del locus o loci, la consistencia de la migracion del patron de tamano y/o los elementos patron de tamano durante la separacion basada en el tamano debe ser comprobada.
La determinacion de las posiciones de los elementos patron de tamano detectados puede proporcionar una posicion experimental para uno o mas, preferiblemente cada uno, de los elementos patron de tamano. El metodo puede incluir conocimientos previos de las posiciones teoricas de los elementos patron de tamano despues de que la separacion basada en el tamano ha sido realizada.
La posicion teorica de uno o mas elementos patron de tamano puede ser comparada con la posicion experimental de uno o mas elementos patron de tamano. Preferiblemente la posicion experimental y la posicion teorica para el mismo elemento patron de tamano son asf comparadas. La comparacion puede ser una comparacion directa de la posicion teorica y la posicion experimental para un elemento patron de tamano. La comparacion puede ser una comparacion basada en la posicion experimental de un elemento patron de tamano respecto a la posicion experimental de uno u otros mas elementos patron de tamano, por ejemplo cuando se compara con la posicion teorica de un elemento patron de tamano respecto a la posicion teorica de uno u otros mas elementos patron de tamano. Uno o dos o mas elementos patron de tamano cuyo tamano sea menor que el elemento patron de tamano que esta siendo comprobado pueden ser utilizados y/o uno o dos o mas elementos patron de tamano cuyo tamano sea mayor que el elemento patron de tamano que esta siendo comprobado pueden ser utilizados. Preferiblemente los elementos patron de tamano son aquellos inmediatamente menores y/o mayores en tamano que el elemento patron de tamano que esta siendo considerado. Idealmente los mismos elementos patron de tamano senan considerados en cada tal comparacion.
Una representacion grafica de las posiciones teoricas para dos o mas de los elementos patron de tamano puede ser comparada para sus ajustes con una representacion grafica de las posiciones experimentales para dos o mas de los elementos patron de tamano. La representacion grafica puede ser de la posicion de migracion frente al tamano. Una herramienta estadfstica puede ser utilizada para cuantificar el ajuste. Si el ajuste es inferior al umbral, el analisis puede ser parado o descartado o sometido a un metodo de analisis espedfico. Si el ajuste es superior al umbral, el analisis puede ser continuado y/o utilizado.
El metodo puede incluir la comprobacion de la consistencia de la migracion por diferentes unidades caractensticas por comparacion de las posiciones experimentales para un primer elemento patron de tamano y un segundo elemento patron de tamano, el primero y segundo elemento patron de tamano son del mismo tamano, pero difieren en terminos de la unidad caractenstica. Una pluralidad de primeros tamanos de elementos patron de tamano que difieren uno del otro en el tamano, pero se corresponden en el tamano a uno de los primeros patrones de tamano considerados. Se pueden proporcionar los primeros y segundos elementos patron de tamano que tengan un tamano mayor que el tamano mas grande posible conocido para uno o mas, preferiblemente todos los loci. Se pueden proporcionar los primeros y segundos elementos patron de tamano que tengan un tamano menor que el mas pequeno tamano posible conocido para uno o mas, preferiblemente todos los loci. Se pueden proporcionar los primeros y segundos elementos patron de tamano que tengan un tamano intermedio al mas grande posible tamano conocido para uno o mas, preferiblemente todos los loci y el mas pequeno posible tamano conocido para uno o mas, preferiblemente todos los loci. Los mismos primero y segundo elementos patron de tamano pueden ser utilizados para dos o mas, y preferiblemente todas, las unidades caractensticas usadas.
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Los elementos patron de tamano se usan para determinar el tamano o tamanos del locus o loci, si la consistencia de migracion del patron de tamano y/o los elementos patron de tamano durante la separacion basada en el tamano es aceptable.
Los elementos patron de tamano pueden ser usados indirectamente para determinar el tamano o tamanos del locus o loci. Los elementos patron de tamano pueden ser usados para determinar el nivel de migracion de uno u otros mas elementos de tamano conocido. Los elementos patron de tamano pueden ser usados para determinar la posicion de uno u otros mas elementos conocidos. El uno u otros mas elementos de tamano conocido pueden ser elementos de una escalera alelica.
Los elementos patron de tamano pueden ser usados para determinar el tamano o tamanos del locus o loci por comparacion de la posicion experimental del tamano o tamanos del locus con la relacion de posicion a un tamano definido por las posiciones experimentales de los elementos patron de tamano. La posicion puede ser convertida a un tamano por esta comparacion. La relacion puede ser una relacion correcta al reflejar diferencias en y/o la comparacion de la posicion experimental y la posicion teorica de uno o mas de los elementos patron de tamano.
Los elementos patron de tamano pueden ser usados directamente para determinar el tamano o tamanos del locus o loci.
Los elementos de tamano pueden ser usados para determinar el tamano o tamanos del locus o loci por comparacion de la posicion experimental del tamano o tamanos del locus con la relacion de posicion al tamano definido por las posiciones experimentales de los elementos patron de tamano. La posicion puede ser convertida a un tamano por esta comparacion. La relacion puede ser una relacion correcta al reflejar diferencias en y/o la comparacion de la posicion experimental y la posicion teorica de uno o mas de los elementos patron de tamano.
El tamano o tamanos del loci puede ser almacenado electronicamente y/o mostrado a un usuario, por ejemplo electronicamente y/o en forma impresa. La informacion almacenada puede incluir el tamano y/o cantidad del locus detectado, por ejemplo como un nivel asociado de fluorescencia. El tamano o tamanos del loci puede expresarse de una forma adicional, por ejemplo como un genotipo para el acido nucleico de una muestra.
El uno o mas tamanos posibles conocidos para un locus puede ser una suma del conocimiento publicado en el locus en el momento en el que el patron de tamano es elaborado y/o el metodo de preparacion es definido y/o la forma del patron de tamano es definida. El uno o mas posibles tamanos conocidos para un locus puede ser una suma de los conocimientos publicados en el locus el 15 de Junio de 2009. El uno o mas posibles tamanos conocidos pueden ser un conjunto de tamanos para ese locus. El conjunto de tamanos para uno o mas del loci que figuran en la Tabla 1 puede ser como se define en la Tabla 1, preferiblemente de acuerdo con la nomenclatura de Gill y colaboradores, Considerations from the European DNA profiling Group (EDNAP) concerning STR nomenclature, Forensic Science International, 87 (1997) (185-192) y/o potencialmente con la adicion de una parte de tamano adicional correspondiente a la secuencia flanqueante en el lado 5' y/o el lado 3' de la secuencia de repeticion corta en tandem introducida durante la amplificacion por los cebadores utilizados.
Varias realizaciones de la invencion seran descritas, a modo de ejemplo unico, y con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:
Figura 1 es una ilustracion de los alelos conocidos y los elementos sinteticos de la presente invencion para un locus;
Figura 2 es una ilustracion de los elementos sinteticos de la presente invencion en el contexto de un multiplex para el analisis simultaneo de unas series de loci usando cinco diferentes colorantes;
Figura 3 es una ilustracion de los resultados de analisis para el loci con colorante azul de la Figura 2, mostrando las posiciones de los elementos sinteticos y las posiciones de los alelos desconocidos de la muestra; y
Figura 4 es una ilustracion de los elementos sinteticos de la presente invencion en el contexto de un multiplex para el analisis simultaneo de unas series de loci, usando seis diferentes colorantes.
Por una variedad de razones, es util poder analizar muestras que contienen acido nucleico, incluyendo muestras que contienen ADN. Tales analisis son utiles en ciencias forenses y en situaciones medicas, por ejemplo.
El analisis se refiere frecuentemente a la consideracion de las identidades particulares presentes en una o mas identidades capaces de variacion. Un ejemplo de este enfoque es la consideracion de la identidad o identidades del alelo presente en una localizacion, locus, conocido por ser variable. Los alelos vanan en identidad debido a las variaciones en su tamano en muchos casos, tales como en STRs. Las variaciones en tamano son causadas por las variaciones en la forma de la repeticion de la secuencia corta en tandem, STR, de estos loci. La secuencia STR esta formada por repeticiones de series de 4 bases, con numero variable de cada una de las repeticiones. Sin embargo, otras variaciones aparte del numero y tipo de los 4 pares de bases presentes repetidas pueden ocurrir. La variacion en el numero de unidades presentes repetidas y/o otras bases presentes da lugar a diferentes tamanos de alelos. Considerando la identidad del alelo (para individuos homocigoticos) o identidades de los alelos (para individuos heterocigoticos) que estan presentes para un numero de loci diferente informacion significativa puede ser obtenida.
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Mientras que la invencion esta descrita con relacion al STRs, es aplicable para cualquier enfoque en el que se establezcan identidades desconocidas. Tales situaciones incluyen la consideracion de los productos PCR desde VTNRs y RAPDs, por ejemplo, donde el tamano vana tambien.
Cuando una muestra problema de un origen unico es analizada, solo uno o dos de estos alelos estaran presentes para cada locus.
Para revelar las identidades de los alelos en el analisis de la muestra, la electroforesis capilar es utilizada para separar los alelos en base a su tamano, despues de la amplificacion de la muestra usando -PCR. El resultado de la separacion basada en el tamano es que los alelos se encuentran en diferentes posiciones dentro del gel del capilar.
Las diferentes posiciones se hacen detectables al introducir etiquetas en los alelos previo a la separacion basada en el tamano. Las etiquetas pueden ser introducidas durante la amplificacion. Las etiquetas emiten fluorescencia en respuesta a la luz laser aplicada por el instrumento de deteccion. La posicion en el capilar en el que la fluorescencia es detectada y el nivel de fluorescencia da informacion sobre la identidad del alelo y el nivel en el que esta presente.
Los instrumentos y etiquetas estan disenados con referencia uno a otro. Una intencion comun es proporcionar una pluralidad de etiquetas que se exciten por la misma longitud de onda de la luz laser, pero que emitan a longitudes de onda que sean diferentes unas de otras. De esta manera, un laser unico puede ser usado por el instrumento, pero la deteccion separada de cada etiqueta puede ser prevista.
Este enfoque normalmente limita las etiquetas disponibles a un total de 5 disponibles para uso simultaneo en la mayona de los casos, o seis en desarrollos mas recientes.
Cuando se investiga la identidad de los alelos de esta manera, la posicion dentro del capilar atribuida a una emision debe ser establecida con precision. Para hacer esto, es conocido el uso de un patron de tamano en cada capilar que presenta una muestra problema y una escalera alelica en un capilar aparte. Las posiciones de los elementos patron de tamano conocidos que constituyen los patrones de tamano pueden entonces ser utilizados como puntos de referencia para determinar el tamano de las posiciones observadas en el analisis de las muestras que tienen alelos desconocidos. Esto se hace por comparacion de los elementos patron de tamano con la escalera alelica para establecer el alcance de la migracion de la escalera alelica. Las posiciones de los alelos en la escalera alelica son asf definidas. Estos alelos de tamano conocido pueden entonces ser utilizados para designar los tamanos de los alelos desconocidos en la muestra que esta siendo examinada.
Este enfoque utiliza una etiqueta para el patron de tamano y sus elementos patron de tamano y asf deja una menos, por ejemplo cuatro, etiquetas para la muestra a analizar y sus alelos desconocidos. Para obtener suficiente informacion en las muestras a analizar y sus alelos, unas series de diferentes loci que tienen alelos de identidad variable son consideradas. Donde los tamanos de los alelos desconocidos para diferentes loci puedan solapar una etiqueta diferente debe ser utilizada para los diferentes loci de modo que puedan ser distinguidos. Por otra parte, no hay forma de saber que locus y que alelo esta involucrado.
Este requisito, junto con el requisito para el patron de tamano para tener su propia etiqueta, limita el numero total de loci que pueden ser considerados en un analisis.
Uso de elementos sinteticos
La presente invencion proporciona un enfoque diferente para la forma y localizacion utilizadas para el suministro de patrones de tamano.
El enfoque puede ser ilustrado con respecto a un locus espedfico para el que esta siendo analizado. Para un locus espedfico, la investigacion y la experiencia han revelado la medida de los alelos observados para ese locus, junto con los datos de los alelos individuales observados para ese locus. Asf, para el locus HUMTH01, la medida de los alelos puede variar desde 4 a 13,3 (de acuerdo con la forma aceptada de nomenclatura de Gill y colaboradores. Considerations from the European DNA profiling Group (EDNAP) concerning STR nomenclature, Forensic Science International, 87 (1997) (185-192) y con ese locus que tiene los alelos individuales 4, 5, 6, 7, 8, 9, 9,3, 10, 11, y 13,3. La designacion esta basada en las repeticiones presentes de unidades de un numero de 4 bases; numeros enteros que representan repeticiones enteras de 4 bases; 0,1, 0,2 y 0,3 que representan bloques de 1, 2 y 3 bases, una repeticion incompleta. Esta posicion esta ilustrada en la Figura 1 con una lmea vertical que corresponde a la posicion de cada uno de los posibles alelos.
Como puede verse en la Figura 1, hay pequenos huecos entre los diversos alelos, un espacio mayor entre los alelos hacia la parte superior y huecos por encima y por debajo de los alelos de valores extremos. El enfoque de las invenciones para el patron de tamano hace uso de estos huecos.
Unas series de elementos sinteticos son proporcionadas para el patron de tamano para determinar el tamano de los alelos de un locus. Estos utilizan el mismo colorante u otra etiqueta es tambien usada para identificar los alelos de ese locus. Asf usaran la misma etiqueta que los elementos de la muestra a analizar con respecto a ese locus. Los alelos sinteticos son cuidadosamente elaborados para ser colocados en los huecos.
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Los huecos pueden ser utilizados en una amplia variedad de maneras, con una forma particularmente preferida para su uso considerando simultaneamente un gran numero de loci especificados a continuacion.
Como una ilustracion del elemento sintetico usado en un solo caso de locus, en el ejemplo, alelos sinteticos podnan proporcionarse en tamanos de 2,2, 3,2, 14,2 y 15,2. Estos elementos sinteticos se muestran en la Figura 1 como lmeas verticales punteadas.
Es importante que los elementos sinteticos no coincidan en tamano con cualquiera de los alelos esperados de la muestra problema. Por otra parte podnan posiblemente ocultar un alelo presente en la muestra problema o posiblemente dar una indicacion erronea de que un alelo esta presente en la muestra problema. Asf los elementos sinteticos son diferentes en terminos de su posicion despues de la separacion basada en el tamano; electroforesis.
Proporcionar el patron de tamano de esta manera significa que el colorante previamente utilizado para el patron de tamano puede ser empleado para otro uso. El otro uso puede, por ejemplo, ser marcar los alelos de uno o mas loci. Esto es beneficioso ya que el numero de colorantes disponibles es limitado. La provision de mas colorantes no es sencilla ya que necesitan ser detectados por el instrumento, comportarse de una manera coherente con los colorantes existentes y asf sucesivamente. El analisis simultaneo de mas loci permite obtener mas informacion sin requerir un analisis separado que ocupa mas tiempo y/o recursos.
En la Tabla 1 se definen los posibles tamanos para los loci enumerados, con esos loci se incluyen muchos de importancia para las investigaciones forenses. Este dato es consistente con el proporcionado en la base de datos de ADN de repeticion en tandem corto operado por Instituto Nacional de Estandares y Tecnologfa (NIST)/ Oficina de Normas de Cumplimiento de la Ley proporcionado por el Instituto Nacional de Justicia el 15 de Junio de 2009.
Un ejemplo de multiplex que usa el enfoque de la presente invencion se muestra en la Figura 2. Un multiplex hace posible que un gran numero de loci sean considerados simultaneamente.
El colorante azul (lmea superior) es usado para marcar los loci THO1, DIO y D 18. El mismo colorante puede ser utilizado para multiples loci mientras que el intervalo de tamanos de alelos encontrado para cada uno de estos loci sea distinto de uno a otro. Elementos sinteticos X son proporcionados en la parte inferior y parte superior del intervalo global de estos tres loci en los pares de bases 49 y 54 y los pares de bases 240 y 246. Elementos sinteticos Y son tambien proporcionados en localizaciones intermedias entre los diferentes loci, pares de bases 100 y 154.
El colorante verde (segunda lmea hacia abajo) es usado para los loci D8, D2p, DI y D21. Alelos sinteticos superior e inferior son proporcionados en los pares de bases 48 y 53 y en los pares de bases 248 y 254. Elementos sinteticos intermedios son proporcionados en los pares de bases 102, 140 y 186.
El colorante amarillo (tercera lmea hacia abajo) es usado para los loci D22, D16, D12 y D2q. Elementos sinteticos superior e inferior son proporcionados en los pares de bases 68 y 78 y en los pares de bases 258 y 268. Elementos sinteticos intermedios son proporcionados en los pares de bases 112, 156 y 204.
El colorante rojo (cuarta lmea hacia abajo) es usado para los loci vWA, FGA y FGA raros. Elementos sinteticos superior e inferior son proporcionados en los pares de base 88 y 96 y en los pares de bases 302 y 310. Elementos sinteticos intermedios son proporcionados en los pares de bases 154 y 246.
El colorante naranja (lmea de fondo) es usado para los loci D3 raros, D3, D19 y D19 raros. Elementos sinteticos superior e inferior son proporcionados en los pares de bases 70 y 78 y en los pares de bases 202 y 210. Un elemento sintetico intermedio es proporcionado al par de bases 142.
Mientras que los elementos sinteticos pueden ser proporcionados al final del intervalo para un loci dado, como se muestra arriba en la Figura 1 para un locus unico y Figura 2 para una serie de loci, sena posible proporcionar elementos sinteticos de tamanos intermedios dentro del intervalo de tamano del locus. Esto es posible como una manera alternativa o una manera adicional a lo descrito anteriormente.
Asf en el ejemplo TH01, los elementos sinteticos podnan ser proporcionados a los tamanos 2,2, 3,2, 5,2, 8,2, 11,2, 14,2 y 15,2. Los tamanos intermedios se seleccionan de manera que no se correspondan con ningun tamano de alelo.
Ya sea proporcionado en la parte superior o inferior del intervalo de alelos para un locus y/o dentro del intervalo de alelos para el locus, los alelos sinteticos son usados de manera equivalente para medir las identidades de las muestras problema.
Uso de los alelos sinteticos
El multiplex ilustrado arriba en relacion con la Figura 2, se puede utilizar como sigue.
Una muestra que contiene DNA, pero para la que las identidades de los alelos son desconocidas es recogida, preparada y puesta en contacto con los reactivos multiplex. Estos reactivos incluyen los cebadores para la
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amplificacion y los reactivos para la introduccion de los marcadores en los productos de amplificacion durante la amplificacion. Los reactivos para los diferentes loci comparten marcadores comunes segun el formato de la Figura 2. Los reactivos tambien incluyen el patron de tamano en la forma de elementos sinteticos previamente descritos.
Despues de la amplificacion, el producto amplificado se divide a fin de introducir una muestra en el principio de cada uno o en capilares mas separados proporcionados como parte de un instrumento. La electroforesis es entonces usada para lograr la separacion basada en el tamano con respecto a todos los capilares.
Despues de la electroforesis, el instrumento y su laser examinan los capilares para generar un conjunto de datos que represente la posicion de fluorescencia y el nivel de fluorescencia observado para cada capilar.
Dentro del conjunto de datos que representa la posicion de fluorescencia y el nivel de fluorescencia observado para cada capilar sena un componente de datos para cada uno de los elementos sinteticos. Estos se muestran en la Figura 3 para el capilar con colorante azul, con los elementos sinteticos mostrados como picos con lmea de puntos.
Ademas, si la muestra a analizar es de una unica persona, habna uno o mas componentes de datos para cada uno de los loci analizados que corresponde al alelo unico o dos alelos presentes y observados. La presencia de uno o dos componentes de datos dependera de sf o no la persona es heterocigotica u homocigotica con respecto a ese locus particular.
Si la muestra a analizar es de un origen mixto, entonces uno, dos o mas componentes de datos estaran presentes para cada locus analizado.
Como se muestra en la Figura 3, la persona que es la fuente de la muestra es homocigotica para el loci TH01 y D10 pero es heterocigotica para el locus D18.
El procesamiento de los componentes de datos esta basado en el patron de tamano. Con respecto a los componentes de datos que corresponden a un elemento sintetico del patron de tamano, el sistema tiene conocimiento sobre la posicion teorica de ese elemento sintetico. Esto se suma a la posicion experimental observada por el instrumento. Esto es verdad para cada elemento sintetico dentro de cada capilar, y por eso el sistema tiene conocimiento de la posicion teorica de cada uno de los elementos sinteticos en relacion unos con otros.
Como primer paso es posible usar las posiciones teoricas de los elementos sinteticos para confirmar que un capilar ha funcionado correctamente, en particular, la consistencia de la migracion puede ser comprobada. Esto puede conseguirse de una o mas formas.
En primer lugar, es posible considerar el ajuste entre un grafico de todas las posiciones teoricas despues de un tiempo de migracion dado y un grafico de todas las posiciones experimentales despues de un tiempo de migracion dado. El ajuste entre los graficos se puede considerar usando una o mas herramientas estadfsticas conocidas para considerar la buena calidad del ajuste.
En segundo lugar, es posible comparar las posiciones relativas de las posiciones experimentales frente a las posiciones relativas de las posiciones teoricas. La medida de los dos intervalos pueden ser diferente una de otra, pero las posiciones relativas dentro de los intervalos deben ser consistentes. Esto puede ser comprobado usando todas las posiciones y comparandolas y/o seleccionando alguna de las posiciones y comparandolas. Por ejemplo, la posicion teorica para un elemento sintetico puede ser utilizada junto con la posicion teorica del siguiente elemento sintetico mayor y el siguiente elemento sintetico menor para establecer que la posicion teorica es 0,6 de la separacion entre los elementos sinteticos mas alto y mas bajo. El proceso puede entonces ser aplicado a las posiciones experimentales para ver si la posicion 0,6 es correcta en las posiciones experimentales. La utilizacion de solo alguna de las posiciones potencialmente permite uno o mas de los elementos sinteticos que no han migrado consistentemente para ser identificados.
Si la migracion consistente es observada, entonces se puede suponer que se produzcan resultados fiables para la muestra a analizar considerada en ese capilar. Si la migracion inconsistente es observada, entonces los resultados para la muestra a analizar pueden ser descartados.
Como segundo paso, el patron de tamano puede ser usado para determinar la posicion de los alelos dentro de la muestra a analizar. Esto se puede lograr mediante el establecimiento de la posicion de un alelo desconocido en los resultados relativos a la posicion experimental de uno o mas de los elementos sinteticos. Por ejemplo, las posiciones experimentales del patron de tamano se pueden usar para definir una curva que exprese la posicion frente al tamano. Por lo tanto, la posicion del alelo puede ser comparada con el grafico para dar un tamano de alelo. Es posible hacer la comparacion y determinar los tamanos directamente del patron de tamano o indirectamente, utilizando el patron de tamano para procesar una escalera alelica, donde la escalera alelica se usa para designar los alelos en la muestra problema que esta siendo analizada.
Los elementos patron de tamano pueden ser utilizados en una variedad de formas. En primer lugar, los elementos patron de tamano asociados con un locus pueden ser utilizados en el procesamiento justo de ese locus.
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En segundo lugar, los elementos patron de tamano asociados con un numero de loci, que usan la misma unidad caractenstica, tal como un color de colorante, pueden ser utilizados en el procesamiento de justo esos loci que usan la misma unidad caractenstica.
En tercer lugar, es posible combinar los elementos de tamano provistos con una unidad caractenstica en combinacion con los elementos de tamano provistos con otra unidad caractenstica. Idealmente, todos los elementos de tamano con todas las unidades caractensticas diferentes podnan ser combinados, y de esta forma, se consigue una composicion patron de tamano. Cuando los elementos patron de tamano con una unidad caractenstica tienen un tamano posiblemente comun con o cerca de un alelo que usa una unidad caractenstica diferente, los dos pueden distinguirse basandose en las diferentes unidades caractensticas.
La comparacion de las posiciones teoricas y experimentales para uno o mas de los alelos sinteticos puede ser usada para asegurar que la grafica de la posicion experimental frente al tamano es un reflejo exacto del tamano.
El tamano y su asociado nivel de fluorescencia pueden entonces ser usados en el procesamiento subsiguiente, por ejemplo para definir un genotipo para la muestra a analizar. El genotipo puede ser usado como parametro de busqueda y/o ser almacenado en una base de datos de genotipos.
En una variacion adicional, es posible examinar los resultados y ver si los diferentes alelos asociados con los diferentes colorantes estan migrando correctamente. Se proporciona asf una comprobacion de la calibracion del cruce de colorantes.
Para proporcionar esta, un ejemplo diferente de un multiplex que usa el enfoque de la presente invencion se muestra en la Figura 4. En este caso seis colorantes son usados.
El colorante azul oscuro (lmea superior) es usado para marcar uno o mas loci. El mismo colorante puede ser usado para multiples loci donde el intervalo de tamano de alelos encontrado para cada uno de esos loci es distinto uno de otro. Elementos sinteticos X son proporcionados en la parte inferior y parte superior del intervalo general de los loci combinados. Elementos sinteticos Y son tambien proporcionados en localizaciones intermedias. Un elemento sintetico Z es proporcionado en una localizacion intermedia comun para todos los colorantes diferentes.
El colorante azul claro (segunda lmea hacia abajo) es usado para marcar uno o mas loci. El mismo colorante puede ser usado por multiples loci donde el intervalo de tamanos de alelos encontrados para cada uno de esos loci es distinto de uno a otro. Elementos sinteticos X son proporcionados en la parte inferior y parte superior del intervalo general de los loci combinados. Elementos sinteticos Y son tambien proporcionados en localizaciones intermedias. Un elemento sintetico Z como se describe arriba es proporcionado en una localizacion intermedia comun para todos los colorantes diferentes.
El colorante verde (tercera lmea hacia abajo) es usado para marcar uno o mas loci. El mismo colorante puede ser usado para multiples loci donde el intervalo de tamanos de alelos encontrado para cada uno de esos loci es distinto de uno a otro. Elementos sinteticos X son proporcionados en la parte inferior y parte superior del intervalo general de los loci combinados. Elementos sinteticos Y son tambien proporcionados en localizaciones intermedias. Un elemento sintetico Z como se describe arriba es proporcionado en una localizacion intermedia comun para todos los colorantes diferentes.
El colorante amarillo (cuarta lmea hacia abajo) es usado para marcar uno o mas loci. El mismo colorante puede ser usado para multiples loci donde el intervalo de tamanos de alelo encontrados para cada uno de esos loci es distinto de uno a otro. Elementos sinteticos X son proporcionados en la parte inferior y parte superior del intervalo general de los loci combinados. Elementos sinteticos Y son tambien proporcionados en localizaciones intermedias. Un elemento sintetico Z como se describe arriba es proporcionado en una localizacion intermedia comun para todos los colorantes diferentes.
El colorante rojo (tercera lmea hacia abajo) es usado para marcar uno o mas loci. El mismo colorante puede ser usado para multiples loci donde el intervalo de tamanos de alelo encontrado para cada uno de esos loci es distinto uno de otro. Elementos sinteticos X son proporcionados en la parte inferior y parte superior del intervalo general de los loci combinados. Elementos sinteticos Y son tambien proporcionados en localizaciones intermedias. Un elemento sintetico Z como se describe arriba es proporcionado en una localizacion intermedia comun para todos los colorantes diferentes.
El colorante naranja (lmea de fondo) es usado para marcar uno o mas loci. El mismo colorante puede ser usado para multiples loci donde el intervalo de tamanos de alelo encontrado para cada uno de esos loci es distinto uno de otro. Elementos sinteticos X son proporcionados en la parte inferior y parte superior del intervalo general de los loci combinados. Elementos sinteticos Y son tambien proporcionados en localizaciones intermedias. Un elemento sintetico Z como se describe arriba es proporcionado en una localizacion intermedia comun para todos los colorantes diferentes.
En general, en esta realizacion, los elementos sinteticos de tamano superior para cada color del colorante son del mismo tamano uno como el otro y son mas grandes en tamano que el alelo mas grande de cualquier color del
colorante. El tamano mas pequeno de los elementos sinteticos para cada color del colorante son tambien del mismo tamano uno como otro y son mas pequenos en tamano que el alelo mas pequeno de cualquier color del colorante. Los elementos sinteticos de tamano intermedio comun son tambien del mismo tamano uno como el otro y son diferentes en tamano de cualquiera de los alelos de cualquiera de los colores del colorante. Como resultado de los 5 elementos sinteticos que son del mismo tamano a traves de los diferentes colorantes, esos elementos sinteticos migranan a la misma velocidad y por lo tanto aparecenan en la misma posicion dentro de los resultados.
Una vez que la verificacion de la correcta migracion del colorante ha sido confirmada, el metodo puede continuar al segundo paso para determinar las posiciones de los alelos.
Ventajas
10 La provision de elementos sinteticos de esta manera proporciona ventajas al permitir considerar que un gran numero de loci utilicen un numero de etiquetas existentes. La provision de elementos sinteticos de esta manera proporciona mayores multiplex para ser considerados en el mismo periodo de tiempo y al mismo coste de proceso. Multiplex mas grandes ofrecen mayor resolucion entre las personas y/o mayor robustez en la resolucion.
TABLA 1
- Locus
- Alelos
- VWA
- 10, 11, 12, 13, 14, 15, 15.2, 16, 16.1, 17, 18, 18.1, 18.2, 18.3, 19, 19.2, 20, 21, 22, 23, 24, 25,
- D16S539
- 4, 5, 6, 7, 8, 8.3, 9, 9.3, 10, 11, 11.3, 12, 12.1, 12.2, 13, 13.1, 13.3, 14, 14.3, 15, 16,
- D2S1338
- 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19.3, 20, 21, 22, 23, 23.2, 23.3, 24, 25, 26, 27, 28,
- D8S1179
- 7, 8, 9, 10, 10.2, 11, 12, 12.3, 13, 14, 15, 15.1, 15.3, 16, 17, 17.1, 18, 19, 20,
- D21S11
- 12, 24, 24.2, 24.3, 25, 25.1, 25.2, 25.3, 26, 26.1, 26.2, 27, 27.1, 27.2, 27.3, 28, 28.1, 28.2, 28.3, 29, 29.1,29.2, 29.3, 30, 30.1, 30.2, 30.3, 31, 31.1, 31.2, 31.3, 32, 32.1, 32.2, 32.3, 33, 33,1, 33.2, 33.3, 34, 34.1, 34.2, 34.3, 35, 35.1, 35.2, 35.3, 36, 36.1, 36.2, 36.3, 37, 37.2, 38, 38.2, 39, 39.2, 40.2, 41.2,
- D18S51
- 7, 8, 9, 9.2, 10, 10.2, 11, 11.1, 11.2, 12, 12.2,12.3,13,13.1, 13.2, 13.3, 14, 14.2, 15, 15.1, 15.2, 15.3, 16, 16.1, 16.2, 16.3, 17, 17.1, 17.2, 17.3, 18, 18.1, 18.2, 19, 20, 20.1, 20.2, 21, 21.1, 21.2, 22, 22.1,22.2, 23, 23.1, 23.2, 24, 24.2, 25, 26, 27, 28.1,28.3, 39.2,
- D19S433
- 5.2, 6.2, 7, 8, 9, 10, 11, 11.1, 12, 12.1, 12.2, 13, 13.1, 13.2, 13.3, 14, 14.1, 14.2, 14.3, 15, 15.2, 16, 16.2, 17, 17.2, 18, 18.2, 19, 19.2,20,
- TH01
- 3, 4, 5, 5.3, 6, 6.1, 6.3, 7, 7.3, 8, 8.3, 9, 9.3, 10, 10.3, 11, 12, 13.3, 14,
- FGA
- 12.2, 13, 13.2, 14, 14.3, 15, 15.3, 16, 16.1, 16.2, 17, 17.1, 17.2, 18, 18.1, 19, 19.1, 19.2, 19.3, 20, 20.1,20.2, 20.3, 21, 21.1,21.2, 21.3, 22, 22.1,22.2, 22.3, 23, 23.1,23.2, 23.3, 24, 24.1, 24.2, 24.3, 25, 25.1, 25.2, 25.3, 26, 26.1,26.2, 26.3, 27, 27.1,27.2, 27.3, 28, 28.1,28.2, 29, 29.1, 29.2, 30, 30.2, 31, 31.2, 32, 32.1, 32.2, 33.1, 33.2, 34.1, 34.2, 35.2, 41.1, 41.2, 42, 42.1, 42.2, 43.1, 43.2, 44, 44.2, 44.3, 45, 45.1, 45.2, 46, 46.1, 46.2, 47, 47.2, 48, 48.2, 49, 49.1, 49.2, 50.2, 50.3, 51, 52.2
- D3S1358
- 8, 8.3, 9, 10,11, 12, 13, 14,14.3,15,15.1, 15.2,15.3, 16,16.2,17, 17.1, 17.2, 18, 18.1,18.2, 18.3, 19, 20,
- D10S1248
- 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
- D22S1045
- 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20,
- D2S441
- 8, 9, 10, 11, 11.3, 12, 12.3, 13, 13.3, 14, 14.3, 15, 16, 17,
- D1S1656
- 9, 10, 11, 12, 13, 13.3, 14, 14.3, 15, 15.3, 16, 16.3, 17, 17.1, 17.3, 18, 18.3, 19, 19.3, 20, 20.3, 21,
- D12S391
- 15, 16, 17, 17.3, 18, 18.3, 19, 19.3, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26,
- TPOX
- 4, 5, 6, 7, 7.3, 8, 9, 10, 10.1, 10.3, 11, 12, 13, 13.1, 14, 15, 16,
- CSF1PO
- 5, 6, 6.3, 7, 7.3, 8, 8.3, 9, 9.1, 9.3, 10, 10.1, 10.2, 10.3, 11, 11.1, 11.3, 12,12.1,13,14, 15,16,
- D5S818
- 6, 7, 8, 9, 10, 10.1, 11, 11.1, 12,12.3,13,14,15,16,17,18,
- D7S820
- 5, 5.2, 6, 6.2, 6.3, 7, 7.1, 7.3, 8, 8.1, 8.2, 8.3, 9, 9.1, 9.2, 9.3, 10, 10.1, 10.3, 11, 11.1, 11.3, 12, 12.1, 12.2, 12.3, 13, 13.1, 14, 14.1, 15, 16,
- D13S317
- 5, 6, 7, 7.1, 8, 8.1, 9, 10, 11, 11.1, 11.3, 12, 13, 13.3, 14, 14.3, 15, 16, 17,
- SE33
- 3, 4.2, 6.3, 7, 8, 8.1, 9, 9.2, 10, 11, 11.2, 12, 12.2, 13, 13.2, 14, 14.2, 14.3, 15, 15.2, 16, 16.2, 16.3, 17, 17.2, 17.3, 18, 18.2, 18.3, 19, 19.2, 20, 20.2, 20.3, 21,21.1,21.2, 22, 22.2, 23, 23.2, 24, 24.2, 25, 25.2, 26, 26.2, 27, 27.2, 28, 28.2, 29, 29.2, 30, 30.2, 31, 31.2, 32, 32.1, 32.2, 33, 33.2, 34, 34.2, 35, 35.2, 36, 36.2, 37, 38, 39, 39.2,
Claims (6)
- 51015202530354045REIVINDICACIONES1. Uso de un patron de tamano que determina el tamano o tamanos de dos o mas loci en una muestra que contiene acido nucleico, cada uno de los loci tiene uno o mas posibles tamanos conocidos, los posibles tamanos conocidos tienen un intervalo de tamanos definidos por el mas grande y el mas pequeno posibles tamanos conocidos, el patron de tamano incluye elementos patron de tamano, donde el tamano de uno o mas de esos elementos patron de tamano es seleccionado por ser:a) mayor que el mas grande de los tamanos posibles conocidos para el locus; ob) menor que el mas pequeno de los posibles tamanos conocidos para el locus; oc) diferente de cualquiera de los tamanos de los posibles tamanos conocidos para el locus;en los que el patron de tamano incluye un conjunto de uno o mas elementos patron de tamano provistos con una unidad caractenstica y uno o mas aun conjuntos de uno o mas elementos patron de tamano provistos con una unidad caractenstica diferente, caracterizada porque cada uno de los dos o mas loci estan separados del loci adyacente que tiene la misma unidad caractenstica por un unico elemento patron de tamano,donde una unidad caractenstica es una etiqueta.
- 2. Uso de un patron de tamano de acuerdo con la reivindicacion 1 en la que uno o mas de los elementos patron de tamano son de un tamano que encaja en un hueco dentro de los posibles tamanos conocidos para un locus.
- 3. Uso de un patron de tamano de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones en el que al menos se proporcionan cinco loci diferentes que incorporan una unidad caractenstica diferente unos de otros.
- 4. Uso de un patron de tamano de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones en el que se proporciona un el elemento patron de tamano que es al menos 1 par de bases menor en tamano que el mas pequeno posible alelo conocido del patron de tamano que se esta usando para calibrar y/o se proporciona un elemento patron de tamano que es al menos 1 par de bases mayor en tamano que el mas grande alelo posible conocido del patron de tamano que se esta usando para calibrar y/o se proporciona un elemento patron de tamano intermedio en el intervalo de tamano de los alelos posibles conocidos para un locus y el posible intervalo de tamano conocido para otro locus y se proporciona un elemento patron de tamano que sea al menos 1 par de bases mas grande en tamano que el alelo mas grande del intervalo con los tamanos mas pequenos y al menos 1 par de bases mas pequeno en tamano que el alelo mas pequeno del intervalo con los tamanos mas grandes.
- 5. Uso de un patron de tamano de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones en el que se proporciona un elemento patron de tamano que es al menos 4 pares de bases mas pequeno que el mas pequeno posible alelo conocido del patron de tamano que se esta usando para calibrar y/o puede ser proporcionado un elemento patron de tamano que sea al menos 4 pares de bases mas grande en tamano que el mas grande posible alelo conocido del patron de tamano que se esta usando para calibrar y/o se proporciona un elemento patron de tamano intermedio en el intervalo de tamanos de los posibles alelos conocidos para un locus y el posible intervalo de tamano conocido para otro locus y se proporciona un elemento patron de tamano que sea al menos 4 pares de bases mas grande en tamano que el alelo mas grande del intervalo con los tamanos mas pequenos y al menos 4 pares de bases mas pequeno en tamano que el alelo mas pequeno del intervalo con los tamanos mas grandes.
- 6. Un metodo para analizar una muestra que contiene acido nucleico para determinar el tamano o tamanos de dos o mas loci de la muestra, cada uno de los loci tiene uno o mas posibles tamanos conocidos, los posibles tamanos conocidos que tienen un intervalo definido por el mas grande y el mas pequeno de los tamanos posibles definidos, el metodo incluye:introducir un patron de tamano de al menos una parte de la muestra, el patron de tamano incluye uno o mas de los elementos patron de tamano;realizar una separacion basada en el tamano en al menos una parte de la muestra; determinar las posiciones de los elementos patron de tamano detectados; usar los elementos patron de tamano para determinar el tamano o tamanos del locus; donde el tamano de uno o mas de esos elementos patron de tamano se seleccionan por ser:a) mayor que el mas grande de los posibles tamanos conocidos para el locus; ob) menor que el mas pequeno de los posibles tamanos conocidos para el locus; oc) diferente de cualquiera de los tamanos de los posibles tamanos conocidos para el locus;en el que el patron de tamano incluye un conjunto de uno o mas elementos patron de tamano provistos con una unidad caractenstica y uno o mas aun conjuntos de uno o mas elementos patron de tamano provistos con una unidad caractenstica diferente, caracterizada porque cada uno de los dos o mas loci estan separados en tamano del loci adyacente que tiene la misma unidad caractenstica por un unico elemento patron de tamano, donde una unidad 5 caractenstica es una etiqueta.
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