ES2577539T3 - Promotor de la formación de neuritas - Google Patents

Abstract

La N-(1-acetilpiperidin-4-il)-4-fluorobenzamida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para uso en la promoción de la neuritogénesis del tejido ocular.

Description

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Las condiciones de cultivo se ajustaron a una concentración de dióxido de carbono de 5%, una concentración de aire de 95%, una humedad de 100%, y una temperatura de 37º C.

B) Tinción cultivo

Después de las 48 horas de después de la adición, las células del nervio trigémino de conejo se sumergieron y se fijaron en solución de formaldehído neutro tamponado al 10% a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las muestras fijadas se tiñeron con fluorescencia utilizando el anticuerpo antineurofilamento 200 (Sigma-Aldrich), que reconoce específicamente los neurofilamentos que constituyen los cuerpos de las células nerviosas y neuritas, y las células teñidas se examinaron bajo un microscopio de fluorescencia (Olympus).

Las células teñidas se incorporaron como imágenes desde el microscopio de fluorescencia a un ordenador.

C) Análisis de imágenes

Para evaluar el grado de neuritogénesis de las células del nervio trigémino de conejo cultivadas, los diámetros del cuerpo celular y las longitudes de las neuritas se midieron en las imágenes de las células teñidas capturadas por ordenador utilizando el software de análisis de imágenes (Image-Pro Plus Ver.4.5.1, Media Cybernetics). Las células que tenían una neuritas con una longitud de no menos de dos veces el diámetro del cuerpo celular se consideraron como célula de neuritogénesis, y se calculó la proporción (%) de las células al recuento total de células (Otori Y, Wei JY, Barnstable C J. Invest. Ophthalmol Vis Sci. (1998) 39, 972-981).

4. Resultados de las pruebas

La FIG. 1 es un gráfico que muestra la relación (%) de células de neuritogénesis a todas las células. La relación de células de neuritogénesis fue de 29,5±8,7% para el grupo de control, 63,3±5,2% para el grupo de adición del compuesto A 0,1 nM, y 70,0±17,6% para el grupo de adición de NGF. El análisis estadístico reveló un efecto promotor significativo sobre la neuritogénesis tanto en el grupo de adición del compuesto A a 0,1 nM como en el grupo de adición de NGF, comparados con el grupo control (N = 6, 5, 5 (dispuestos en el mismo orden), media±desviación estándar, * : p <0,005; prueba de comparación múltiple de Dunnett).

Estos resultados demostraron que el compuesto A tiene un efecto promotor sobre la neuritogénesis de las células del nervio trigémino de conejo cultivadas. Además, el compuesto A tiene un efecto promotor sobre la neuritogénesis de las células del nervio trigémino a concentraciones más bajas que lo hizo NGF (1 µg/ml), que es generalmente utilizado como un control positivo.

Ejemplo de prueba 2: Efecto promotor sobre la neuritogénesis de las células de la retina de conejo

Animales utilizados

Se utilizaron conejos japoneses blancos (4 días de edad, machos) comprados de Oriental Yeast Co., Ltd.

2.

Sustancia de prueba

Se utilizó el compuesto A.

3.

Procedimientos de prueba

1) Cultivo de células

Se sometió un conejo a perfusión cardíaca con solución salina fisiológica bajo anestesia con inyección de pentobarbital sódico (Dainippon Sumitomo Pharma), después de lo cual los ojos se extirparon y se aislaron las retinas. Las retinas aisladas se colocaron en una solución de papaína (1 mg/ml, Sigma-Aldrich Japón KK) suspendida en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS, Invitrogen), y se sometieron a digestión enzimática a 37º C durante 30 minutos. A partir de entonces, el medio L-15 de Leibovitz (L-15, Invitrogen) se utilizó para preparar los reactivos. Después de que la suspensión se dejara reposar, se descartó el sobrenadante, se añadió 3 ml de una solución de inhibidor de tripsina (2 mg / ml de inhibidor de tripsina, 0,004% de DNasa y 1 mg / ml de albúmina sérica bovina disuelta en L-15, pH 7,4), y se pipeteó. Después de que la solución se dejara en reposo, se descartó el sobrenadante, se añadieron otros 3 ml de la solución de inhibidor de tripsina, se pipeteó, y esta operación se repitió una vez más; se centrifugó a 120xg durante 5 minutos, y se eliminó el sobrenadante. Se añadió 2 ml de una solución de alta concentración del inhibidor de tripsina (10 mg / ml de inhibidor de tripsina, 10 mg / ml de albúmina de suero bovino disueltos en L-15, pH 7,4), y se pipeteó; la centrifugación se realizó a 120xg durante 5 minutos, y se descartó el sobrenadante. Las células se suspendieron en 10 ml de una solución de L-15 (Invitrogen) que contenía 0,05% de albúmina de suero bovino (BSA), y se añadió anticuerpo anti-macrófagos (concentración final de 1 µg/ml).

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Después de la incubación a temperatura ambiente durante 20 minutos, la centrifugación se realizó a 120xg durante 5 minutos, se descartó el sobrenadante, y las células se suspendieron en 20 ml de 0,05% de BSA / L-15, y se sembraron en una placa previamente revestida con un anticuerpo secundario (anticuerpo IgG de anti-ratón, Nippon Chemi-Con). Después de incubación a 37º C durante 40 minutos, la solución de células en suspensión se centrifugó a 120xg durante 5 minutos, mediante lo cual se recogieron las células. Las células se sembraron en una placa de cámara de 8 pocillos recubiertos con polilisina / laminina (Falcon) a alrededor de 3x103 células / pocillo; después de la siembra, las células se cultivaron durante 24 horas. Después de 24 horas de cultivo, se añadió cada uno de Compuesto A (concentración final 0,1 nM (0,026 ng / ml)) y NGF (concentración final 1 µg / ml) como control positivo

o PBS como control al medio de cultivo. Después de la adición, las células se cultivaron adicionalmente durante 48 horas. El medio de cultivo utilizado fue un Neurobasal que contenía el suplemento B27 (Invitrogen) (concentración final del 2% (v/v)), L-glutamina (Invitrogen) (concentración final de 1 mM) y citosina-1-β-D (+) arabinofuranósido (concentración final 10 µM). Las condiciones de cultivo se ajustaron a una concentración de dióxido de carbono de 5%, una concentración de aire de 95%, una humedad de 100%, y una temperatura de 37º C.

2) Tinción

Las células se tiñeron de la misma manera que en el ejemplo de prueba 1.

4. Resultados de la prueba

Los resultados se muestran en la FIG. 2. La FIG. 2 es una representación fotográfica de las células nerviosas de la retina teñidas con un anticuerpo antineurofilamento. Se observó neuritogénesis notable en las células con la adición

del compuesto A.

Ejemplo de Preparación 1 Gotas para los ojos

Compuesto A

0,026 µg

Polisorbato 80

0,1g

Fosfato diácido de sodio

0,1g

Cloruro de sodio

0,9 g

Cloruro de benzalconio

0,005 g

Hidróxido de sodio

cs

Agua purificada estéril

cs

Cantidad total 100 ml (pH 7,0)

Estos ingredientes se mezclan para obtener gotas para los ojos. Ejemplo de preparación 2 Ungüento para el ojo Compuesto A 1 µg Lanolina purificada 10 g Vaselina blanca 100 g Estos ingredientes se mezclan para obtener un ungüento para los ojos. Ejemplo de prueba 3: Efecto promotor de la neuritogénesis en las células nerviosas cultivadas del trigémino de

conejo

1.

Animales utilizados Se utilizaron conejos japoneses blancos (4 días de edad, machos) comprados de Oriental Yeast Co., Ltd.

2.

Sustancia de prueba. Se utilizó el compuesto A.

3.

Procedimientos de prueba

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Claims (1)

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