ES2576195T3 - Cistatina C como antagonista de TGF-B y métodos relacionados con la misma - Google Patents
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Abstract
Un homólogo de Cistatina C, para inhibir la actividad biológica de la unión de TGF-ß con su receptor, en el que el homólogo de Cistatina C comprende: un fragmento de secuencia de aminoácidos que comprende al menos los últimos 45 aminoácidos C-terminales de la SEQ ID NO: 2 y en el que al menos 30 aminoácidos del extremo N-terminal de la SEQ ID NO: 2 están delecionados; o una secuencia de aminoácidos que difiere de la SEQ ID NO: 2 por la deleción de restos de aminoácido desde aproximadamente la posición 80 hasta aproximadamente la posición 93, en el que la deleción es suficiente para reducir o eliminar la actividad biológica del motivo inhibidor de cisteína proteinasa conservado de Cistatina C.
Description
5
15
25
35
45
55
65
El tamaño mínimo de un homólogo de proteína o fragmento del mismo de la presente invención es, en un aspecto, un tamaño suficiente para tener la actividad biológica necesaria, o suficiente para servir como antígeno para la generación de un anticuerpo o como una diana en un ensayo in vitro. En una realización, una proteína de la presente invención es de al menos aproximadamente o al menos aproximadamente de 40 aminoácidos de longitud,
- o de al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 60 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 65 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 70 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 75 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 80 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 85 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 90 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 95 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 100 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 105 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 110 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 115 aminoácidos de longitud,
- o al menos aproximadamente 120 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 125 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 130 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 140 aminoácidos de longitud, o al menos aproximadamente 145 aminoácidos de longitud, y así, en cualquier longitud entre 8 aminoácidos y hasta la longitud completa de una proteína de la invención o más larga, en enteros completos (por ejemplo, 8, 9, 10,...25, 26,...102, 103,...). No existe límite, diferente a un límite práctico, sobre el tamaño máximo de dicha proteína porque la proteína puede incluir una parte de una proteína, un dominio funcional, o un fragmento biológicamente activo o útil de la misma, o una proteína de longitud completa, más secuencia adicional (por ejemplo, una secuencia proteica de fusión), si se desea.
La presente descripción también se refiere a una composición que comprende al menos aproximadamente 500 ng, al menos aproximadamente 1 µg, al menos aproximadamente 5 µg, al menos aproximadamente 10 µg, al menos aproximadamente 25 µg, al menos aproximadamente 50 µg, al menos aproximadamente 75 µg, al menos aproximadamente 100 µg, al menos aproximadamente 250 µg, al menos aproximadamente 500 µg, al menos aproximadamente 750 µg, al menos aproximadamente 1 mg, o al menos aproximadamente 5 mg, de un homólogo de proteína CystC aislado que comprende cualquiera de los homólogos de CystC de la misma analizados en este documento. Dicha composición de la presente invención puede incluir cualquier vehículo con el que se asocie la proteína en virtud del método de preparación proteica, un método de purificación de proteínas, o una preparación de la proteína para su uso en un método in vitro, ex vivo, o in vivo de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, dicho vehículo puede incluir cualquier excipiente adecuado, tampón y/o vehículo de suministro, tal como un vehículo farmacéuticamente aceptable (analizado a continuación), que es adecuado para combinar con la proteína CystC de la presente invención de modo que la proteína pueda usarse in vitro, ex vivo o in vivo de acuerdo con la presente invención.
Los homólogos de una proteína descritos en este documento tales como homólogos de CystC, incluyendo agonistas y antagonistas peptídicos y no peptídicos de CystC, pueden ser productos de diseño de fármacos o selección y pueden producirse usando diversos métodos conocidos en la técnica. Dichos homólogos pueden mencionarse más particularmente como miméticos. Un mimético se refiere a cualquier compuesto peptídico o no peptídico que sea capaz de imitar la acción biológica de un péptido de origen natural, a menudo porque el mimético tiene una estructura básica que imita la estructura básica del péptido de origen natural y/o tiene las propiedades biológicas destacadas del péptido de origen natural. Los miméticos pueden incluir, aunque sin limitación: péptidos que tienen modificaciones sustanciales a partir del prototipo tal como ausencia de similitud de cadena lateral con el péptido de origen natural (dichas modificaciones, por ejemplo, pueden disminuir su susceptibilidad a la degradación); anticuerpos anti-idiotípicos y/o catalíticos, o fragmentos de los mismos; partes no proteicas de una proteína aislada (por ejemplo, estructuras de carbohidrato); o moléculas sintética u orgánicas naturales, incluyendo ácidos nucleicos y fármacos identificados a través de química combinatoria, por ejemplo. Dichos miméticos pueden diseñarse, seleccionarse y/o identificarse de otro modo usando una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Se describen diversos métodos de diseño de fármacos, útiles para diseñar o seleccionar miméticos u otros compuestos terapéuticos útiles en la presente invención en Maulik et al., 1997, Molecular Biotechnology: Therapeutic Applications and Strategies, Wiley-Liss, Inc.
Un agonista puede ser cualquier compuesto que sea capaz de imitar, duplicar o aproximarse a la actividad biológica de una proteína de origen natural o específica, por ejemplo, por asociación con (por ejemplo, unión a) o activación de una proteína (por ejemplo, un receptor) al cual se une la proteína natural, de modo que la actividad que se produciría con la proteína natural se estimula, induce, aumenta, o potencia. Por ejemplo, un agonista puede incluir, aunque sin limitación, una proteína, compuesto, o un anticuerpo que se une selectivamente a y activa o aumenta la activación de un receptor unido por la proteína natural, otros homólogos de la proteína natural, y cualquier producto adecuado de diseño de fármacos que se caracterice por su capacidad de agonizar (por ejemplo, estimular, inducir, aumentar, potenciar) la actividad biológica de una proteína de origen natural.
Un antagonista se refiere a cualquier compuesto o agente que sea capaz de actuar de un modo que sea antagonista (por ejemplo, contra, de forma inversa a, contrario a) a la acción del agonista natural, por ejemplo, por interacción con otra proteína o molécula de un modo que se disminuya la actividad biológica de la proteína o agonista de origen natural (por ejemplo, reduzca, inhiba, bloquee). Dicho compuesto puede incluir, aunque sin limitación, un anticuerpo que se una selectivamente a y bloquee el acceso a una proteína por su ligando natural, o reduzca o inhiba la actividad de una proteína, o producto de diseño de fármacos que bloquee la proteína o reduzca la actividad biológica
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controlada. Los vehículos de liberación controlada adecuados incluyen, aunque sin limitación, polímeros biocompatibles, otras matrices poliméricas, cápsulas, microcápsulas, micropartículas, preparaciones en bolo, bombas osmóticas, dispositivos de difusión, liposomas, lipoesferas, y sistemas de suministro transdérmico. Otros vehículos de la presente invención incluyen líquidos que, tras la administración a un paciente, forman un sólido o un gel in situ. Los vehículos preferidos también son biodegradables (es decir, bioerosionables). Cuando el compuesto es una molécula de ácido nucleico recombinante, los vehículos adecuados de suministro incluyen, aunque sin limitación, liposomas, vectores víricos y otros vehículos de suministro, incluyendo ribozimas. Los vehículos de suministro que contienen lípidos naturales incluyen células y membranas celulares. Los vehículos de suministro que contienen lípidos artificiales incluyen liposomas y micelas. Un vehículo de suministro de la presente invención puede modificarse para dirigirse a un sitio particular en un paciente, abordando de ese modo y haciendo uso de un compuesto de la presente invención en ese sitio. Modificaciones adecuadas incluyen la manipulación de la fórmula química de la parte lipídica del vehículo de suministro y/o la introducción en el vehículo de un agente de direccionamiento capaz de dirigir específicamente un vehículo de suministro a un sitio preferido, por ejemplo, un tipo celular preferido. Otros vehículos de suministro adecuados incluyen partículas de oro, conjugados moleculares de poli-L-lisina/ADN, y cromosomas artificiales.
Un vehículo farmacéuticamente aceptable que tiene capacidad de direccionamiento se menciona en este documento como un "vehículo de suministro". Los vehículos de suministro de la presente invención son capaces de suministrar una composición de la presente invención a un sitio diana en un paciente. Un "sitio diana" se refiere a un sitio en un paciente en el cual se desea suministrar una composición. Por ejemplo, un sitio diana puede ser cualquier célula que sea abordada por inyección o suministro directo usando liposomas, vectores víricos u otros vehículos de suministro, incluyendo ribozimas y anticuerpos. Ejemplos de vehículos de suministro incluyen, aunque sin limitación, vehículos de suministro que contienen lípidos artificiales y naturales, vectores víricos, y ribozimas. Los vehículos de suministro que contienen lípidos naturales incluyen células y membranas celulares. Los vehículos de suministro que contienen lípidos artificiales incluyen liposomas y micelas. Un vehículo de suministro de la presente invención puede modificarse para dirigirse a un sitio particular en un sujeto, dirigiendo de ese modo y haciendo uso de un compuesto de la presente invención en ese sitio. Las modificaciones adecuadas incluyen manipulación de la fórmula química de la parte lipídica del vehículo de suministro y/o la introducción en el vehículo de un compuesto capaz de dirigir específicamente un vehículo de suministro a un sitio preferido, por ejemplo, un tipo celular preferido, tal como una célula tumoral. Específicamente, direccionamiento se refiere a causar que el vehículo de suministro se una a una célula particular mediante la interacción del compuesto en el vehículo con una molécula sobre la superficie de la célula. Los compuestos de direccionamiento adecuados incluyen ligandos capaces de unirse selectivamente (es decir, específicamente) a otra molécula en un sitio particular. Ejemplos de dichos ligandos incluyen anticuerpos, antígenos, receptores y ligandos de receptores. La manipulación de la fórmula química de la parte lipídica del vehículo de suministro puede modular el direccionamiento extracelular o intracelular del vehículo de suministro. Por ejemplo, puede añadirse un agente químico a la fórmula lipídica de un liposoma que altera la carga de la bicapa lipídica del liposoma de modo que el liposoma se fusione con células particulares que tienen características particulares de carga.
Otro vehículo de suministro comprende un vector vírico. Un vector vírico incluye una molécula aislada de ácido nucleico útil en la presente invención, en que las moléculas de ácido nucleico se empaquetan en una cubierta vírica que permite la entrada del ADN en una célula. Pueden usarse varios vectores víricos incluyendo, aunque sin limitación, aquellos basados en alfavirus, poxvirus, adenovirus, herpesvirus, lentivirus, virus adenoasociados y retrovirus.
Una realización de la presente invención es el uso de los homólogos de CystC descritos en este documento, solos o en una composición para la regulación de la actividad de TGF-β incluyendo la inhibición de la actividad de TGF-β. En realizaciones donde se inhibe la actividad de TGF-β, dichos métodos pueden ampliarse a métodos para inhibir neoplasias tumorales (incluyendo neoplasias metastásicas) o una afección o enfermedad proliferativa o fibrótica, y particularmente neoplasias tumorales o afecciones o enfermedades proliferativas o fibróticas que están mediadas al menos en parte por la expresión o actividad de TGF-β, y/o por la regulación por catepsina B de la expresión o actividad de TGF-β. Los métodos que implican la inhibición de la actividad de TGF-β generalmente comprenden la administración a un paciente o, como alternativa, el contacto de una célula (aislada o in vivo), con homólogo de Cistatina C que tiene actividad biológica de Cistatina C o con una composición que comprende dichos agentes. Cuando la célula es una célula tumoral o el paciente tiene cáncer, el agente se administra preferiblemente en una cantidad eficaz para inhibir la actividad biológica de la actividad de TGF-β en la célula tumoral o en el microentorno de la célula tumoral.
Una composición que incluye un compuesto o agente regulador o proteína de la invención puede suministrarse a un cultivo celular o paciente mediante cualquier método adecuado. La selección de dicho método variará con el tipo de compuesto que se está administrando o suministrando (es decir, homólogo de la proteína, ácido nucleico), el modo de suministro (es decir, in vitro, in vivo, ex vivo) y el objetivo a conseguir mediante la administración/suministro del compuesto o composición. De acuerdo con la presente invención, un protocolo eficaz de administración (es decir, administración de una composición de un modo eficaz) comprende parámetros adecuados de dosis y modos de administración que provocan el suministro de una composición a un sitio deseado.
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Las vías de administración incluyen vías in vivo, in vitro, y ex vivo. Las vías in vivo incluyen, aunque sin limitación, administración intravenosa, administración intraperitoneal, administración intramuscular, administración intranodal, administración intracoronaria, administración intraarterial (por ejemplo, en una arteria carótida), administración subcutánea, suministro transdérmico, administración intratraqueal, administración subcutánea, administración intraarticular, administración intraventricular, inhalación (por ejemplo, aerosol), administración intracraneal, intraespinal, intraocular, aural, intranasal, oral, pulmonar, impregnación de un catéter, e inyección directa en un tejido. En una realización preferida de la presente invención, se administra una composición mediante una vía parenteral (por ejemplo, vía subcutánea, intradérmica, intravenosa, intramuscular e intraperitoneal). Las administraciones intravenosas, intraperitoneales, intradérmicas, subcutáneas e intramusculares pueden realizarse usando métodos convencionales en la técnica. El suministro aural puede incluir gotas para los oídos, el suministro intranasal puede incluir gotas para la nariz o inyección intranasal, y el suministro intraocular puede incluir colirios. El suministro por aerosol (inhalación) también puede realizarse usando métodos convencionales en la técnica (véase, por ejemplo, Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 189:11277-11281, 1992, que se incorpora en este documento por referencia en su totalidad). El suministro oral puede realizarse formando complejos de una composición terapéutica de la presente invención con un vehículo capaz de soportar la degradación por las enzimas digestivas en el intestino de un animal. Ejemplos de dichos vehículos, incluyen cápsulas de plástico o comprimidos, tales como los conocidos en la técnica. Las técnicas de inyección directa son particularmente útiles para suprimir el rechazo de injertos, por ejemplo, inyectando la composición en el tejido trasplantado, o para la administración específica de sitio de un compuesto, tal como en el sitio de un tumor.
Ex vivo se refiere a realizar parte de la etapa reguladora fuera del paciente, tal como transfectando una población de células retirada de un paciente con una molécula recombinante que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una proteína de acuerdo con la presente invención en condiciones tales que la molécula recombinante se expresa posteriormente por la célula transfectada, y devolviendo las células transfectadas al paciente. Las vías de administración in vivo y ex vivo de una composición a un cultivo de células hospedadoras pueden conseguirse por un método que incluye, aunque sin limitación, transfección, transformación, electroporación, microinyección, lipofección, adsorción, fusión de protoplasto, uso de agentes de transporte de proteínas, uso de agentes de transporte de iones, uso de detergentes para permeabilización, y mezcla simple (por ejemplo, combinación) de un compuesto en cultivo con una célula diana y/o proteína diana.
Diversos métodos de administración y vehículos de suministro descritos en este documento han demostrado ser eficaces para el suministro de una molécula de ácido nucleico a una célula diana, mediante lo cual la molécula de ácido nucleico transfectaba la célula y se expresaba. En muchos estudios, se consiguió suministro y expresión satisfactoria de un gen heterólogo en tipos celulares preferidos y/o usando vehículos preferidos de suministro y vías de administración de la presente invención.
Por ejemplo, el uso del suministro en liposomas, patente de Estados Unidos n.º 5.705.151, expedida el 6 de enero de 1998, de Dow et al. demostró el suministro intravenoso satisfactorio in vivo de una molécula de ácido nucleico que codifica un superantígeno y una molécula de ácido nucleico que codifica una citoquina en un vehículo de suministro de liposoma catiónico, mediante lo cual se expresaron las proteínas codificadas en tejidos del animal, y particularmente en tejidos pulmonares. Además, Liu et al., Nature Biotechnology 15:167, 1997, demostraron que el suministro intravenoso de liposomas catiónicos que contienen colesterol que contienen genes abordaban preferentemente tejidos pulmonares y mediaban de forma eficaz la transferencia y expresión de los genes in vivo. Varias publicaciones de Dzau y colaboradores demuestran el suministro in vivo y expresión satisfactorios de un gen en células del corazón, incluyendo miocitos cardíacos y fibroblastos y células de músculo liso vascular usando tanto ADN desnudo como suministro por liposoma de virus hemaglutinante de Japón, administrados tanto por incubación dentro del pericardio como por infusión en una arteria coronaria (suministro intracoronario) (véase, por ejemplo, Aoki et al., 1997, J. Mol. Cell, Cardiol. 29:949-959; Kaneda et al., 1997, Ann N.Y. Acad. Sci. 811:299-308; y von der Leyen et al., 1995, Proc Natl Acad Sci USA 92:1137-1141).
El suministro de numerosas secuencias de ácido nucleico se ha conseguido mediante la administración de vectores víricos que codifican las secuencias de ácido nucleico. Usando dichos vectores, se ha conseguido el suministro y expresión satisfactorios usando suministro ex vivo (véase, de muchos ejemplos, el vector retrovírico; Blaese et al., 1995, Science 270:475-480; Bordignon et al., 1995, Science 270:470-475), administración nasal (vector asociado a CFTR-adenovirus), administración intracoronaria (vector adenovírico y virus hemaglutinante de Japón, véase anteriormente), administración intravenosa (vector vírico adenoasociado; Koeberl et al., 1997, Proc Natl Acad Sci USA 94:1426-1431). Una publicación de Maurice et al. (1999, J. Clin. Invest. 104:21-29) demostró que un vector adenovírico que codifica un receptor β2 adrenérgico, administrado por suministro intracoronario, provocaba expresión en miocardio multicámara difusa del gen in vivo, y posteriores aumentos significativos en la función hemodinámica y otros parámetros fisiológicos mejorados. Levine et al., describen el suministro y expresión in vitro, ex vivo e in vivo de un gen a adipocitos humanos y adipocitos de conejo usando un vector adenovírico e inyección directa de las construcciones en tejido adiposo (Levine et al., 1998, J. Nutr. Sci. Vitaminol. 44:569-572).
En el área de suministro génico neuronal, se ha informado de múltiples transferencias génicas in vivo satisfactorias. Millecamps et al., informaron del direccionamiento de vectores adenovíricos a neuronas usando elementos potenciadores restrictivos de neuronas colocados cadena arriba del promotor para el transgén (promotor de
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