ES2573648T3 - Marcadores genéticos para la evaluación del riesgo de enfermedad cardiovascular - Google Patents

Marcadores genéticos para la evaluación del riesgo de enfermedad cardiovascular Download PDF

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Abstract

Método para una evaluación del riesgo cardiovascular en un sujeto, que comprende las etapas de determinar en una muestra aislada de dicho sujeto la presencia de polimorfismos en las posiciones 27 dentro de cada una de las secuencias de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1 a 12, en el que la presencia en la posición 27 de C en SEQ ID NO: 1, C en SEQ ID NO: 2, T en SEQ ID NO: 3, C en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, C en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, G en SEQ ID NO: 8, A en SEQ ID NO: 9, A en SEQ ID NO: 10, A en SEQ ID NO: 1, y G en SEQ ID NO: 12, constituyendo las cuatro últimas el haplotipo B de ALOX5AP, es indicativa de un riesgo de padecer un acontecimiento cardiovascular, en el que el acontecimiento cardiovascular se selecciona del grupo de infarto de miocardio, accidente cerebrovascular aterotrombótico, angina de pecho, revascularización coronaria debida a cardiopatía coronaria y arteriopatía periférica mortales o no mortales.

Description

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DESCRIPCION
Marcadores geneticos para la evaluacion del riesgo de enfermedad cardiovascular Campo de la invencion
La presente invencion se refiere al campo de enfermedades o trastornos cardiovasculares. Mas espedficamente, se refiere a marcadores y a metodos para determinar si un sujeto, particularmente un sujeto humano, esta en riesgo de desarrollar una enfermedad o trastorno cardiovascular, desarrollar un acontecimiento cardiovascular, tener una enfermedad o trastorno cardiovascular, o experimentar una complicacion de una enfermedad cardiovascular.
Antecedentes de la tecnica
Enfermedad cardiovascular (CVD) es un termino para enfermedades cardfacas y de los vasos sangumeos, incluyendo (entre otras) cardiopatfa isquemica (que es el tipo de CVD mas comun en los pafses industrializados; este trastorno se refiere a problemas con la circulacion de la sangre al musculo cardfaco), enfermedad cerebrovascular (se refiere a problemas con la circulacion de la sangre en los vasos sangumeos del cerebro) y enfermedad vascular periferica (que afecta a la circulacion principalmente en las piernas). Los sujetos con CVD pueden desarrollar varias complicaciones (denominadas a continuacion en el presente documento complicaciones de CVD) incluyendo, pero sin limitarse a, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, angina de pecho, accidentes isquemicos transitorios y arteriopatfa periferica mortales o no mortales.
Al comienzo del siglo veinte, la enfermedad cardiovascular era responsable del 10% de todas muertes en todo el mundo. Hoy en dfa representa aproximadamente el 30% de todas las muertes y el 80% de estas muertes se produce en pafses en vfas de desarrollo. La enfermedad cardiovascular es la principal causa de muerte en los EE.UU. y Europa. La enfermedad cardiovascular, ademas de ser la principal causa de muerte, es una enfermedad altamente prevalente que produce altos costes de atencion sanitaria.
Desde el punto de vista de la salud publica, la polttica que ha de desarrollarse en relacion con la enfermedad cardiovascular debe buscar reducir el riesgo para la poblacion de desarrollar enfermedad cardiovascular (Organizacion Mundial de la Salud. Informe sobre la salud en el mundo 2004 - Cambiemos el rumbo de la historia. Ginebra: Organizacion Mundial de la Salud; 2004). A este efecto, la estratificacion de la poblacion en relacion con su riesgo cardiovascular permitina el establecimiento de medidas preventivas para prevenir o retrasar el comienzo de la enfermedad. La estratificacion tambien ayudana en el establecimiento de un tratamiento para sujetos aquejados mejorando la eficacia (evitando la aparicion de acontecimientos y complicaciones cardiovasculares) y la rentabilidad (Organizacion Mundial de la Salud. Informe de salud en el mundo 2004 - Cambiemos el rumbo de la historia. Ginebra: Organizacion Mundial de la Salud; 2004; Bakhai A. The burden of coronary, cerebrovascular and peripheral arterial disease. PharmacoEconomics 2004; 22 (Supl 4):11-18.).
Desde el estudio del corazon de Framingham (Wilson PWF, D'Agostino RB, Levy D, et al. Circulation 1988; 97:18371847; Grundy Sm, Balady Gj, Criqui MH, et al. Circulation 1988; 97:1876-1887) se acepta que la existencia de factores de riesgo tales como dislipidemia (principalmente la elevacion del colesterol LDL), hipertension, diabetes, consumo de tabaco y estilo de vida sedentario son causas directas de la enfermedad coronaria. Estos factores de riesgo son comunes en la poblacion y el estudio INTERHEART ha mostrado que son universales, lo que significa que estos factores de riesgo son los mismos en casi todas las regiones geograficas y en todos los grupos raciales/etnicos en todo el mundo, tambien son constantes en hombres y mujeres.
La identificacion de estos factores de riesgo ha permitido a los cientfficos desarrollar estrategias preventivas y terapeuticas. Diferentes estudios (Sanz G, Fuster V. Nat Clin Pract Cardiovasc Med 2009; 2:101-110) entre otros, el MONICA de la OMS (Monitoring trends and determinants in cardiovascular disease, monitorizacion de tendencias y determinantes en enfermedad cardiovascular) (WHO MONICA Project Principal Investigators. J Clin Epidemiol. 1988; 41:105-14) y el estudio ARIC (Atherosclerosis Risk in Communities, riesgo de aterosclerosis en comunidades) (Rosamond WD, Chambless LE, Folsom A, et al. N Engl J Med. 1998; 339:861-7) han demostrado que se trata de medidas eficaces.
En los anos noventa del siglo veinte, se desarrollo el concepto de que la intensidad de las medidas preventivas-de tratamiento contra los factores de riesgo debe ajustarse a la gravedad del riesgo (Grundy Sc, Bazzarre T, Cleeman J, et al. Circulation 2000; 101:e3-e11). Este concepto se propuso por primera vez en el Adult Treatment Panel Report of the National Cholesterol Education Program (NCEP) y se conformo en su segundo informe. Se propuso un enfoque similar en la recomendacion conjunta de la Sociedad Europea de Cardiologfa, la Sociedad Europea de Arteriosclerosis y la Sociedad Europea de Hipertension (Word D, De Backer G, Faergeman O, Gram. I, Mancia G, Pyorala K. Atherosclerosis 1998; 140:199-270). La idoneidad de las medidas contra el riesgo es importante porque constituyen una herramienta importante para lograr un equilibrio apropiado entre eficacia, seguridad y coste de la terapia.
Antes de esta invencion, tal como se describe a continuacion en el presente documento, los medicos estimaban el
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riesgo de enfermedad cardiovascular del paciente en cinco y diez anos basandose en ecuaciones de regresion de multiples variables derivadas de las cohortes de Framingham en las que los niveles de factores de riesgo tradicionales (edad, colesterol total, colesterol-protemas de alta densidad, tension arterial sistolica, estado de tabaquismo) son ponderaciones asignadas (puntos) para predecir acontecimientos de cardiopatia coronaria (CHD), de manera separada para hombres y mujeres (Grundy Sm, Balady Gj, Criqui MH, et al. Circulation 1988; 97:18761887). Entonces se convertfa la puntuacion de riesgo calculada en una probabilidad absoluta de desarrollar CHD dentro del intervalo de tiempo.
Se han desarrollado diversas escalas/metodos para la estimacion del riesgo cardiovascular en Europea: la escala Prospective Cardiovascular Munster (escala cardiovascular prospectiva de Munster) (PROCAM), que estima el riesgo de complicaciones cardiovasculares, el proyecto European Systematic Coronary Risk Evaluation (proyecto europeo de evaluacion de riesgo coronario sistematico) (SCORE), que estima el riesgo de muerte cardiovascular y el Registre Gironi del Cor [un registro cardfaco desarrollado en Gerona] (REGICOR) que estima el riesgo de infarto de miocardio o angina de pecho.
Aunque se reconoce la utilidad de las escalas/metodos para calcular el riesgo cardiovascular y pese a todos los esfuerzos en la estimacion del riesgo cardiovascular en todos los pacientes (Greenland P, et al. Circulation 2001; 104:1863-1867), se produce un numero significativo de acontecimientos cardiovasculares en pacientes asintomaticos con un riesgo “intermedio” calculado usando las herramientas en uso hoy en dfa para la estimacion del riesgo cardiovascular (Greenland P, et al. Circulation 2001; 104:1863-1867, Smith sC Jr. Am J Cardiol 2006; 97 [Supl]:28A-32A, Marrugat J, et al. J Epidemiol Community Health 2007; 61:40-47).
Por tanto, los sujetos con riesgo cardiovascular intermedio se beneficianan mas del uso de pruebas que permitieran una estratificacion del riesgo mas precisa. Ademas, si estas pruebas fueran factibles, practicas y eficaces para una definicion mas precisa del riesgo cardiovascular y/o la motivacion para un cambio eficaz hacia un estilo de vida mas sano desde el punto de vista cardiovascular (Greenland P, et al. Circulation 2001; 104:1863-1867, Smith SC Jr. Am J Cardiol 2006; 97 [Supl]:28A-32A), esto significana una mejora significativa con respecto a la situacion actual.
Se han seguido varias estrategias para resolver esta limitacion de las escalas/metodos en uso hoy en dfa para calcular el riesgo cardiovascular.
En los ultimos anos diversos estudios han evaluado si anadir informacion sobre nuevos factores de riesgo tales como los descritos por Wang mejoran la capacidad de prediccion, pero los resultados han sido desalentadores (Wang TJ, Gona P, Larson MG, et al. N Engl J Med. 2006; 355(25):2631-9).
Una fuente adicional de informacion que puede mejorar la capacidad de prediccion de los algoritmos para determinar el calculo de riesgo cardiovascular es la variabilidad genetica del individuo. Se conoce bien que hay una agregacion familiar en la aparicion de enfermedad cardiovascular, lo que sugiere la presencia de factores geneticos que modulan la propension del individuo. En los ultimos anos, se ha estimado que la heredabilidad (proporcion de variabilidad fenotfpica atribuible a los genes) de mortalidad por cardiopatfa isquemica es desde 0,53 hasta 0,57 y que para el comienzo de un infarto de miocardio es de 0,56.
Tambien se conoce que la cardiopatfa isquemica no esta relacionada con un unico gen sino con muchos genes que determinan la propension genetica del individuo. En este contexto, cardiopatfa coronaria se define como una enfermedad compleja que implica multiples genes, multiples variantes geneticas en cada uno de estos genes y factores medioambientales, con interacciones complejas entre las que se determinara en ultima instancia la propension del individuo a esta enfermedad.
Avances tecnologicos recientes han permitido la publicacion de la secuencia del genoma humano, la disponibilidad de bases de datos publicas con millones de polimorfismos (SNP), la mejora de los metodos de genotipado con una reduccion del coste analftico y el conocimiento de los patrones de desequilibrio de ligamiento en el genoma humano. Como resultado de todos estos logros, hay un interes aumentado y oportunidades para estudiar la genetica de enfermedades incluso complejas.
Sin embargo, la identificacion y la seleccion de marcadores geneticos para constituir una combinacion espedfica de este tipo que mejoraran realmente la prediccion de riesgo cardiovascular no es una tarea facil. Se han realizado varios intentos. Ya hay algunos estudios de cohorte que han incluido una variante genetica en el cromosoma 9p21 en las funciones de riesgo, pero sin observar una mejora significativa en la capacidad de discriminacion de modelos predictivos (Paynter NP, Chassman DI, Palmen J, et al. Ann Intern Med 2009; 150:65-72). Otros estudios han incluido una puntuacion de riesgo genetico basandose en el numero de alelos de riesgo acumulados en un individuo con el fin de aumentar la magnitud de la asociacion observada. Morrison et al (Morrison AC, et al. Am J Epidemiol 2007; 166:28-35) compararon el area bajo la curva de rendimiento diagnostico (ROC) usando la puntuacion de riesgo cardiovascular desarrollada por miembros del estudio Atherosclerosis Risk in Communities (ACRS) frente al area obtenida combinando la puntuacion con la puntuacion de riesgo ACRS genetico (GRS). El area bajo la curva estaba aumentada de manera ligera pero no significativa tanto en la poblacion blanca desde 0,764 hasta 0,769 (ACRS frente a ACRS + GRS) como desde 0,758 hasta 0,769 en la poblacion negra.
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El documento WO 2012/142713 divulga un metodo de evaluacion del riesgo de padecer una enfermedad cardiovascular que comprende determinar un conjunto de SNP que comprende los SNP definidos por la presente SEQ ID NO: 1 a 7.
Por tanto, aunque se han realizado varios intentos para resolver la limitacion descrita anteriormente de las escalas/metodos en uso hoy en dfa para calcular el riesgo cardiovascular, este objetivo todavfa no se ha logrado.
Por consiguiente, existe la necesidad de nuevos marcadores, incluyendo nuevos marcadores geneticos y combinaciones espedficas de los mismos que predigan de manera satisfactoria y ventajosa quien, especialmente los que se ha predicho que tienen un riesgo moderado o intermedio segun las escalas/metodos en uso hoy en dfa, presenta en realidad un mayor riesgo de desarrollar enfermedad cardiovascular y/o complicaciones de enfermedad cardiovascular tales como (pero sin limitarse a) infarto de miocardio o angina de pecho o accidente isquemico transitorio o accidente cerebrovascular o arteriopatia periferica mortal o no mortal de manera que puedan implementarse medidas preventivas para mantener el riesgo en el nivel mas bajo posible.
Ademas de los sujetos clasificados como en riesgo moderado, existe otro grupo de sujetos en los que las escalas/metodos en uso hoy en dfa son incapaces de proporcionar una buena estimacion de su riesgo cardiovascular; las personas jovenes (hombres <45 anos y mujeres <65) porque debido a su juventud se les asigna un bajo riesgo cardiovascular, independientemente de la presencia de factores de riesgo cardiovascular clasicos en los sujetos (Cooney MT, Dudita AL, Graham IM. J Am Coll Cardiol 2009; 54:1209-1227).
Por tanto, pese a varios intentos para resolver la limitacion descrita anteriormente de las escalas/metodos en uso hoy en dfa para calcular el riesgo cardiovascular, este objetivo todavfa no se ha logrado. Por consiguiente, tambien existe la necesidad de nuevos marcadores, incluyendo nuevos marcadores geneticos y combinaciones de los mismos que puedan predecir de manera satisfactoria y ventajosa quien presenta un mayor riesgo de desarrollar enfermedad cardiovascular y/o complicaciones de enfermedad cardiovascular tales como (pero sin limitarse a) infarto de miocardio o angina de pecho o accidente cerebrovascular o accidente isquemico transitorio o arteriopatfa periferica mortal o no mortal en personas jovenes, de manera que puedan implementarse medidas preventivas para mantener el riesgo en el nivel mas bajo posible.
Sumario de la invencion
La presente invencion se define en las reivindicaciones adjuntas 1-9.
En un primer aspecto, la divulgacion proporciona un metodo que es adecuado para resolver las limitaciones de las escalas/metodos en uso hoy en dfa para calcular el riesgo cardiovascular, concretamente que un numero significativo de acontecimientos cardiovasculares se producen en pacientes con un riesgo intermedio calculado usando las herramientas en uso hoy en dfa para la estimacion del riesgo cardiovascular y que la estimacion del riesgo cardiovascular es inexacta en sujetos jovenes.
El metodo proporcionado segun la presente divulgacion resuelve las limitaciones mencionadas anteriormente mediante la evaluacion mejorada del riesgo cardiovascular o mediante la (re)clasificacion del sujeto en un estado de riesgo (mas apropiado) de tener una enfermedad o trastorno cardiovascular y/o complicaciones tales como (pero sin limitarse a) infarto de miocardio, angina de pecho, accidente cerebrovascular y/o arteriopatfa periferica mortales o no mortales en comparacion con los metodos en uso hoy en dfa y que comprende las etapas de determinar en una muestra aislada de dicho sujeto la presencia en al menos un alelo de polimorfismos en la posicion 27 dentro de las secuencias de acido nucleico de SEQ ID NO: 1 a 34, en el que la presencia en la posicion 27 de una C en SEQ ID NO: 1, C en SEQ ID NO: 2, T en SEQ ID NO: 3, C en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, C en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, G en SEQ ID NO: 8, A en SEQ ID NO: 9, A en SEQ ID NO: 10, A en SEQ ID NO: 11, G en SEQ ID NO: 12, A en SEQ ID NO: 13, C en SEQ ID NO: 14, G en SEQ ID NO: 15, A en SEQ ID NO: 16, A en SEQ ID NO: 17, G en SEQ ID NO: 18, C en SEQ ID NO: 19, T en SEQ ID NO: 20, A en SEQ ID NO: 21, G en SEQ ID NO: 22, C en SEQ ID NO: 23, C en SEQ ID NO: 24, G en SEQ ID NO: 25, C en SEQ ID NO: 26, A en SEQ ID NO: 27, C en SEQ ID NO: 28, G en SEQ ID NO: 29, T en SEQ ID NO: 30, T en SEQ ID NO: 31, C en SEQ ID NO: 32, C en SEQ ID NO: 33 y/o C en SEQ ID NO: 34 es indicativa de un riesgo de padecer un acontecimiento cardiovascular (infarto de miocardio agudo o angina de pecho o accidente cerebrovascular o accidente isquemico transitorio o arteriopatfa periferica mortal o no mortal) en los siguientes diez anos, que es mejor que la evaluacion de riesgo realizada por las escalas/metodos en uso hoy en dfa considerando solo los factores de riesgo clasicos.
“Evaluacion mejorada del riesgo cardiovascular” en el contexto de esta solicitud debe entenderse como una prediccion de la probabilidad de desarrollar un acontecimiento cardiovascular que se ajusta mejor que la evaluacion de riesgo realizada por escalas/metodos en uso hoy en dfa, tales como pero sin limitarse a puntuacion de riesgo de Framingham, puntuacion de riesgo de Framingham adaptada (tal como pero sin limitarse a Regicor), Score, HeartScore, Procam, Reynolds y QRisk, con el numero de acontecimientos que ha padecido (dentro del contexto de un estudio retrospectivo) o padecera un paciente particular. La mejora puede medirse como un aumento en el area bajo la curva rOc, o como un valor estadfstico c mayor tal como se mide por ejemplo calculando el mdice de
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concordancia usando la funcion rcorr.cens del paquete R H-misc.
“Evaluacion mejorada del riesgo cardiovascular” en el contexto de esta solicitud se usa de manera intercambiable con “evaluacion refinada del riesgo cardiovascular”.
“(Re)clasificacion del sujeto a un estado de riesgo (mas apropiado)” en el contexto de esta solicitud debe entenderse como una estratificacion mas precisa del individuo en una categona de riesgo superior o inferior de importancia clmica tal como se define por Nancy R. Cook (Cook NR. Use and miuse de the receiver operating characteristic curve in risk prediction. Circulation 2007; 115: 928-935. La bondad de la (re)clasificacion puede medirse mediante la mejora de reclasificacion neta (Pencina MJ, D'Agostino RB, Sr., Steyerberg EW. Extensions of net reclassification calculations to measure usefulness of new biomarkers. StatMed. 2011; 486 30(1):11-21, y/o mediante la mejora de discriminacion integrada (Chambless LE, Cummiskey CP, Cui G. Several methods to assess improvement in risk preciction models: Extension to survival analysis. Stat Med. 2011; 30(1):22-38.
Para calcular el numero de acontecimientos esperados en 10 anos en cada categona de riesgo y en cada cohorte, pueden usarse las estimaciones de Kaplan-Meier. Steyerberg EW, Pencina MJ. Reclasification calculations for persons with incomplete follow-up. Ann Intern. Med. 2010; 152(3):195-196, que se incluye en el presente documento como referencia en su totalidad. Para evaluar la bondad de ajuste de los modelos, puede usarse una version de la prueba de Hosmer-173. Vease tambien D'Agostino RB, Nam Bh. Evaluation of the Performance of Survival Analysis Models: Discrimination and Calibration Measures. Handbook of Statistics. 2003: Vol.23: 1-25, que se incluye en el presente documento como referencia en su totalidad y Newson R. Confidence intervals for Rank statistics: Somers' D and extensions. StataJournal. 2006; 6:309-334.
Cualquiera de los presentes metodos, tal como se describe por toda esta solicitud, esta en una realizacion preferida llevada a cabo ex vivo.
En una realizacion preferida, se determina la presencia de los siguientes alelos de polimorfismos: polimorfismos en la posicion 27 dentro de secuencias espedficas de acido nucleico, en particular la presencia en la posicion 27 de
una C en SEQ ID NO: 1, C en SEQ ID NO: 2, T en SEQ ID NO: 3, C en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, C en
SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, G en SEQ ID NO: 8, A en SEQ ID NO: 9, A en SEQ ID NO: 10, G en SEQ ID
NO: 12 yA en SEQ ID NO: 16.
En una realizacion preferida, se determina la presencia de los siguientes alelos de polimorfismos: polimorfismos en la posicion 27 dentro de secuencias espedficas de acido nucleico, en particular la presencia en la posicion 27 de
una C en SEQ ID NO: 1, C en SEQ ID NO: 2, T en SEQ ID NO: 3, C en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, C en
SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, G en SEQ ID NO: 8 y A en SEQ ID NO: 9, T en SEQ ID NO: 10, G en SEQ ID NO: 12 y A en SEQ ID NO: 16, formando las cuatro ultimas el haplotipo B de ALOX5AP y considerandose como un componente de riesgo genetico ademas de las otras 8 secuencias.
En un aspecto preferido, se determina la presencia de los siguientes alelos de polimorfismos: polimorfismos en la posicion 27 dentro de las secuencias espedficas de acido nucleico, en particular la presencia en la posicion 27 de una C en SEQ ID NO: 1, C en SEQ ID NO: 2, T en SEQ ID NO: 3, C en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, C en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7 y G en SEQ ID NO: 8.
En un aspecto preferido, se determina la presencia de los siguientes alelos de polimorfismos: polimorfismos en la posicion 27 dentro de las secuencias espedficas de acido nucleico, en particular la presencia en la posicion 27 de una C en SEQ ID NO: 2, T en SEQ ID NO: 3, C en SEQ ID NO: 5 y G en SEQ ID NO: 8.
Estas realizaciones, es decir combinaciones espedficas de SNP son aspectos preferidos de esta divulgacion descrita a continuacion.
En otro aspecto, la invencion se refiere a metodos para la reclasificacion de la probabilidad de que un individuo presente un infarto de miocardio o angina de pecho o accidente cerebrovascular o accidente isquemico transitorio o arteriopatfa periferica mortal o no mortal en un periodo de diez anos y/o un periodo de larga duracion basandose en la presencia de los polimorfismos enumerados en las reivindicaciones en combinacion con uno o mas factores de riesgo convencionales, en los que la contribucion relativa de los polimorfismos se facilita como una puntuacion de riesgo genetico.
“Acontecimiento cardiovascular” en el contexto de esta solicitud se usa de manera intercambiable con “complicacion, enfermedad o trastorno cardiovascular”.
“AHA” en el contexto de esta solicitud debe entenderse como American Heart Association (Asociacion estadounidense del corazon).
“GWAS” en el contexto de esta solicitud debe entenderse como estudios de asociacion del genoma completo.
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El termino “enfermedad” y “trastomo” se interpretaran en el contexto de esta solicitud de manera intercambiable.
En otro aspecto, la divulgacion se refiere a metodos para la reclasificacion de la probabilidad de que un individuo clasificado como que tiene un riesgo moderado padezca un acontecimiento cardiovascular (infarto de miocardio o angina de pecho o accidente cerebrovascular o accidente isquemico transitorio o arteriopatia periferica mortal o no mortal) en un periodo de diez anos y/o un periodo de larga duracion segun los metodos en uso hoy en dfa basandose en la presencia de uno o mas de los polimorfismos mencionados anteriormente en combinacion con uno o mas factores de riesgo convencionales, en los que la contribucion relativa de los polimorfismos se facilita como una puntuacion de riesgo genetico.
En otro aspecto, la divulgacion se refiere a metodos para la reclasificacion de la probabilidad de que un individuo joven padezca un acontecimiento cardiovascular (infarto de miocardio o angina de pecho o accidente cerebrovascular o accidente isquemico transitorio o arteriopatfa periferica mortal o no mortal) en un periodo de diez anos y/o un periodo de larga duracion calculado segun los metodos en uso hoy en dfa basandose en la presencia de uno o mas de los polimorfismos mencionados anteriormente en combinacion con uno o mas factores de riesgo convencionales, en los que la contribucion relativa de los polimorfismos se facilita como una puntuacion de riesgo genetico.
En aspectos adicionales, la divulgacion se refiere a metodos para la determinacion de la probabilidad de que un individuo presente un infarto de miocardio o angina de pecho o accidente cerebrovascular o accidente isquemico transitorio o arteriopatfa periferica mortal o no mortal en un periodo de diez anos o en un periodo de larga duracion basandose en la presencia de uno o mas de los polimorfismos mencionados anteriormente en combinacion con uno o mas factores de riesgo convencionales, en los que la contribucion relativa de los polimorfismos se facilita como una puntuacion de riesgo genetico.
En aspectos adicionales, la divulgacion se refiere a metodos para la determinacion de la probabilidad de que un individuo joven presente un infarto de miocardio o angina de pecho o accidente cerebrovascular o accidente isquemico transitorio o arteriopatfa periferica mortal o no mortal en un periodo de 10 anos o en un periodo de larga duracion basandose en la presencia de uno o mas de los polimorfismos mencionados anteriormente en combinacion con uno o mas factores de riesgo convencionales, en los que la contribucion relativa de los polimorfismos se facilita como una puntuacion de riesgo genetico.
En un aspecto adicional, la invencion se refiere a un programa informatico o un medio legible por ordenador que contiene medios para llevar a cabo cualquiera de los metodos de la invencion, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Aun en un aspecto adicional, la divulgacion se refiere a un kit que comprende reactivos para detectar la identidad del nucleotido en la posicion 27 dentro de una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 1 a 34.
Aun en un aspecto adicional, la divulgacion se refiere a un kit que comprende reactivos para detectar la identidad del nucleotido en la posicion 27 dentro de una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12 y 16.
Aun en un aspecto adicional, la divulgacion se refiere a un kit que comprende reactivos para detectar la identidad del nucleotido en la posicion 27 dentro de una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, y considerandose la siguiente SEQ ID NO: 9, 10, 12 y 16 como haplotipo B de ALOX5AP y considerandose los alelos AAAG en esas secuencias como un unico alelo de riesgo.
Aun en un aspecto adicional, la divulgacion se refiere a un kit que comprende reactivos para detectar la identidad del nucleotido en la posicion 27 dentro de una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 1, 2,
3, 4, 5, 6, 7 y 8.
Aun en un aspecto adicional, la divulgacion se refiere a un kit que comprende reactivos para detectar la identidad del nucleotido en la posicion 27 dentro de una secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 2, 3, 5 y 8.
Descripcion detallada de la invencion
La presente invencion tambien se explica adicionalmente mediante las siguientes figuras:
Figura 1: Analisis de CVD REGICOR, puntuacion de riesgo genetico, incidencia de acontecimientos cardiovasculares (a) y coronarios (b).
Figura 2: Tabla 1 - resumen de SNP
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Figura 3: Tabla G - Caractensticas fenotfpicas de los participates
Los autores de la presente solicitud han resuelto dos problemas identificados anteriormente en las escalas/metodos en uso hoy en dfa para el calculo del riesgo de que un sujeto desarrolle enfermedad cardiovascular, acontecimientos cardiovasculares y complicaciones cardiovasculares incluyendo, pero sin limitarse a, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, angina de pecho, accidentes isquemicos transitorios y arteriopatia periferica mortales y no mortales.
Por tanto, la presente solicitud tambien se refiere a un metodo para resolver la limitacion de las escalas/metodos mediante los cuales un numero significativo de acontecimientos cardiovasculares se producen en sujetos con un riesgo intermedio calculado usando las herramientas en uso hoy en dfa para la estimacion del riesgo cardiovascular y/o para resolver la limitacion de las escalas/metodos mediante los cuales los sujetos jovenes obtienen un riesgo cardiovascular bajo poco realista.
La presente solicitud resuelve la limitacion descrita anteriormente de las escalas/metodos usados hoy en dfa para calcular el riesgo cardiovascular proporcionando un metodo para reclasificar a los pacientes en un estado de riesgo mas apropiado. Se usa una combinacion particular (tal como se describio anteriormente) de marcadores geneticos, especialmente la combinacion tal como se enumera en la tabla 1 (vease la figura 2), seleccionada y evaluada por los inventores tras un analisis complejo y genuino de miles de posibles marcadores. De las diferentes posibilidades para obtener una puntuacion de riesgo genetico (GRS), los inventores han tenido exito en identificar una particular, mediante la cual esta combinacion proporciono los mejores resultados posibles. Para calcular la puntuacion de riesgo genetico, se considera el numero acumulado de alelo de riesgo de los SNP enumerados en la tabla 1 que estan presentes en cada individuo. Para cada una de las variantes estudiadas, cada individuo puede tener 0, 1 o 2 alelos de riesgo. Habiendose calculado el sumatorio de alelos de riesgo acumulados en el conjunto diferente de las variantes seleccionadas (n=34, 12, 9, 8 o 4), para cada individuo se facilito una puntuacion que podna ir desde 0 hasta 68, 24, 18, 16 u 8, respectivamente. Los inventores han generado nuevos algoritmos para la estimacion del riesgo cardiovascular. Esta estrategia innovadora permite la reclasificacion de los pacientes con valores de mejora de reclasificacion neta excelentes.
Todos los valores tal como se obtienen en la(s) funcion/funciones se adaptaran a la prevalencia regional o nacional, si es necesario.
Los terminos “polimorfismo” y “polimorfismo de un solo nucleotido” (es decir SNP) se usan en el presente documento de manera intercambiable y se refieren a una variacion de la secuencia de nucleotidos que se produce cuando un solo nucleotido en el genoma u otra secuencia compartida difiere entre miembros de especies o entre cromosomas emparejados en un individuo. Un SNP tambien puede designarse como una mutacion con frecuencia alelica baja mayor de aproximadamente el 1% en una poblacion definida. El polimorfismo de un solo nucleotidos segun la presente solicitud puede caer dentro de secuencias de genes codificantes, regiones de genes no codificantes o las regiones intronicas entre genes.
La lista de polimorfismos que se usan en este metodo de la presente invencion se facilita en la tabla 1, incluida en el presente documento como la figura 2.
El termino “enfermedad o trastorno cardiovascular”, tal como se usa en el presente documento, incluye enfermedades que afectan al corazon o los vasos sangumeos o a ambos o que estan asociadas con los sistemas cardiopulmonar y circulatorio incluyendo (pero sin limitarse a) isquemia, angina de pecho, estados edematosos, arteriosclerosis, cardiopatfa coronaria, oxidacion de LDL, adhesion de monocitos a celulas endoteliales, formacion de celulas espumosas, desarrollo de estna grasa, adherencia y agregacion de plaquetas, proliferacion de celulas de musculo liso, lesion por reperfusion, tension arterial alta, enfermedad trombotica, arritmia (auricular o ventricular o ambas); alteraciones del ritmo cardfaco; isquemia de miocardio; infarto de miocardio; aneurisma cardfaco o vascular; vasculitis, accidente cerebrovascular; arteriopatfa obstructiva periferica de una extremidad, un organo o un tejido; lesion por reperfusion tras isquemia del cerebro, el corazon u otro organo o tejido, choque endotoxico, quirurgico o traumatico; hipertension, valvulopatfa, insuficiencia cardfaca, tension arterial anomala; choque; vasoconstriccion (incluyendo la asociada con migranas); anomalfa vascular, inflamacion y/o insuficiencia limitada a un unico organo o tejido.
En una realizacion preferida, la enfermedad cardiovascular o el acontecimiento cardiovascular cuyo riesgo va a detectarse se selecciona del grupo de infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, angina de pecho, accidentes isquemicos transitorios, arteriopatfa periferica mortales y no mortales o una combinacion de los mismos.
El termino “muestra”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier muestra procedente de una fuente biologica e incluye, sin limitacion, cultivos celulares o extractos de los mismos, material de biopsia obtenido de un marnffero o extractos de los mismos, y sangre, saliva, orina, heces, semen, lagrimas u otros fluidos corporales o extractos de los mismos.
Cuando se usan modelos de prediccion, como por ejemplo, para tomar decisiones sobre el tratamiento, los riesgos
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predictivos se clasifican usando umbrales de punto de corte de riesgo. El termino “reclasificacion”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a la asignacion de una persona a otra categona de riesgo segun un nuevo modelo en comparacion con el modelo inicial de evaluacion de riesgo. Habitualmente se denomina reclasificacion al porcentaje de personas que estan reclasificandose.
El termino “mejora de reclasificacion neta (NRI)” tal como se usa en el presente documento, se refiere a la evaluacion de la mejora neta en la clasificacion de riesgo. La NRI se calcula como la suma de las diferencias en la proporcion de individuos que sube menos la proporcion que baja para los casos y la proporcion de individuos que baja menos la proporcion que sube para los no casos. Los componentes de NRI indican el beneficio neto de mejora de reclasificacion en casos y no casos. Los valores positivos y negativos representan el porcentaje neto de individuos con clasificacion mejorada o peor, respectivamente. En general, la mejora en la reclasificacion se indica mediante una NRI significativamente superior a 0.
El termino “terapia cardiovascular”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier tipo de tratamiento que da como resultado la mejora o reduce el riesgo de padecer cualquiera de las enfermedades cardiovasculares mencionadas anteriormente. Las terapias adecuadas para su uso en la presente invencion incluyen, sin limitacion, anticoagulantes, agentes antiplaquetarios, agentes tromboltticos, antitromboticos, agentes antianitmicos, agentes que prolongan la repolarizacion, agentes antihipertensores, vasodilatores, antihipertensores, diureticos, agentes ionotropicos, agentes antianginosos y similares.
Los ejemplos no limitativos de anticoagulantes incluyen acenocumarol, ancrod, anisindiona, bromindiona, clorindiona, cumetarol, ciclocumarol, sulfato sodico de dextrano, dicumarol, difenadiona, biscumacetato de etilo, etilidendicumarol, fluindiona, heparina, hirudina, liapolato sodico, oxazidiona, polisulfato de pentosano, fenindiona, fenprocumon, fosvitina, picotamida, tioclomarol y warfarina.
Los ejemplos no limitativos de agentes antiplaquetarios incluyen aspirina, un dextrano, dipiridamol (Persantin), heparina, sulfinpiranona (Anturane), clopidrogel y ticlopidina (Ticlid). Los ejemplos no limitativos de agentes trombolfticos incluyen activador de plasminogeno tisular (Activase), plasmina, pro-urocinasa, urocinasa (Abbokinase) estreptocinase (Streptase), anistreplasa/APSAC (Eminase).
En determinadas realizaciones en las que un paciente esta padeciendo una hemorragia o tiene una posibilidad aumentada de padecer hemorragia, puede usarse un agente que puede potenciar la coagulacion sangumea. Los ejemplos no limitativos de agentes que promueven la coagulacion sangumea incluyen antagonistas de agentes trombolfticos y antagonistas de anticoagulantes. Los ejemplos no limitativos de antagonistas de anticoagulantes incluyen protamina y vitamina K1.
Los ejemplos no limitativos de antagonistas de agentes trombolfticos incluyen acido aminocaproico (Amicar) y acido tranexamico (Amstat). Los ejemplos no limitativos de antitromboticos incluyen anagrelida, argatroban, cilstazol, daltroban, defibrotida, enoxaparina, fraxiparina, indobufeno, lamoparan, ozagrel, picotamida, plafibrida, tedelparina, ticlopidina y triflusal.
Los ejemplos no limitativos de agentes antiarntmicos incluyen agentes antiarntmicos de clase I (bloqueantes de los canales de sodio), agentes antiarntmicos de clase II (bloqueantes beta-adrenergicos), agentes antiarntmicos de clase III (farmacos que prolongan la repolarizacion), agentes antiarntmicos de clase IV (bloqueantes de los canales de calcio) y agentes antiarntmicos diversos.
Los ejemplos no limitativos de bloqueantes de los canales de sodio incluyen agentes antiarntmicos de clase IA, clase IB y clase IC. Los ejemplos no limitativos de agentes antiarntmicos de clase IA incluyen dispiramida (Norpace), procainamida (Pronestil) y quinidina (Quinidex). Los ejemplos no limitativos de agentes antiarntmicos de clase IB incluyen lidocama (Xylocaine), tocainida (Tonocard) y mexiletina (Mexitil). Los ejemplos no limitativos de agentes antiarntmicos de clase IC incluyen encainida (Enkaid) y fiecainida (Tambocor).
Los ejemplos no limitativos de beta-bloqueantes, conocidos de otro modo como bloquetantes beta-adrenergicos, antagonistas beta-adrenergicos o agentes antiarntmicos de clase II, incluyen acebutolol (Sectral), alprenolol, amosulalol, arotinolol, atenolol, befunolol, betaxolol, bevantolol, bisoprolol, bopindolol, bucumolol, bufetolol, bufuralol, bunitrolol, bupranolol, clorhidrato de butidrina, butofilolol, carazolol, carteolol, carvedilol, celiprolol, cetamolol, cloranolol, dilevalol, epanolol, esmolol (Brevibloc), indenolol, labetalol, levobunolol, mepindolol, metipranolol, metoprolol, moprolol, nadolol, nadoxolol, nifenalol, nipradilol, oxprenolol, penbutolol, pindolol, practolol, pronetalol, propanolol (Inderal), sotalol (Betapace), sulfinalol, talinolol, tertatolol, timolol, toliprolol y xibinolol. En determinadas realizaciones, el beta-bloqueante comprende un derivado de ariloxipropanolamina. Los ejemplos no limitativos de derivados de ariloxipropanolamina incluyen acebutolol, alprenolol, arotinolol, atenolol, betaxolol, bevantolol, bisoprolol, bopindolol, bunitrolol, butofilolol, carazolol, carteolol, carvedilol, celiprolol, cetamolol, epanolol, indenolol, mepindolol, metipranolol, metoprolol, moprolol, nadolol, nipradilol, oxprenolol, penbutolol, pindolol, propanolol, talinolol, tertatolol, timolol y toliprolol.
Los ejemplos no limitativos de agentes con capacidades hipolipemicas incluyen, sin limitacion, secuestrantes de
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acidos biliares tales como aminas cuaternarias (por ejemplo colestiramina y colestipol); acido nicotmico y sus derivados; inhibidores de HMG-CoA reductasa tales como mevastatina, pravastatina y simvastatina; gemfibrozil y otros acidos ffbricos, tales como clofibrato, fenofibrato, benzafibrato y cipofibrato; probucol; raloxifeno y sus derivados.
Los ejemplos no limitativos de agentes que prolongan la repolarizacion, tambien conocidos como agentes antiarntmicos de clase III, incluyen amiodarona (Cordarone) y sotalol (Betapace).
Los ejemplos no limitativos de bloqueantes de los canales de calcio, conocidos de otro modo como agentes antiarntmicos de clase IV, incluyen una arilalquilamina (por ejemplo, bepridil, diltiazem, fendilina, galopamilo, prenilamina, terodilina, verapamilo), un derivado de dihidropiridina (felodipino, isradipino, nicardipino, nifedipino, nimodipino, nisoldipino, nitrendipino), un derivado de piperazinida (por ejemplo, cinarizina, flunarizina, lidoflazina) o un bloqueante de los canales de calcio diverso tal como benciclano, etafenona, magnesio, mibefradilo o perhexilina. En determinadas realizaciones un bloqueante de los canales de calcio comprende un antagonista de calcio de dihidropiridina de accion prolongada (de tipo nifedipino).
Los ejemplos no limitativos de agentes antiarntmicos diversos incluyen adenosina (Adenocard), digoxina (Lanoxin), acecainida, ajmalina, amoproxano, aprindina, tosilato de bretilio, bunaftina, butobendina, acido capobenico, cifenlina, disopiranida, hidroquinidina, indecainida, bromuro de ipatropio, lidocama, lorajmina, lorcainida, meobentina, moricizina, pirmenol, prajmalina, propafenona, pirinolina, poligalacturonato de quinidina, sulfato de quinidina y viquidil.
Los ejemplos no limitativos de agentes antihipertensores incluyen simpaticolfticos, alfa/beta-bloqueantes, alfa- bloqueantes, agentes de anti-angiotensina II, beta-bloqueantes, bloqueantes de los canales de calcio, vasodilatadores y antihipertensores diversos.
Los ejemplos no limitativos de alfa-bloqueantes, tambien conocidos como bloqueantes alfa-adrenergicos o un agonista alfa-adrenergico, incluyen amosulalol, arotinolol, dapiprazol, doxazosina, mesilatos de ergoloide, fenspirida, indoramina, labetalol, nicergolina, prazosina, terazosina, tolazolina, trimazosina y yohimbina. En determinadas realizaciones, un bloqueante puede comprender un derivado de quinazolina. Los ejemplos no limitativos de derivados de quinazolina incluyen atfuzosina, bunazosina, doxazosina, prazosina, terazosina y trimazosina. En determinadas realizaciones, un agente antihipertensor es un antagonista tanto alfa como beta-adrenergico. Los ejemplos no limitativos de un bloqueante alfa/beta comprenden labetalol (Normodyne, Trandate).
Los ejemplos no limitativos de agentes anti-angiotensina II incluyen inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina y antagonistas del receptor de angiotensina II. Los ejemplos no limitativos de inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (inhibidores de la ACE) incluyen alacepril, enalapril (Vasotec), captopril, cilazapril, delapril, enalaprilat, fosinopril, lisinopril, moveltopril, perindopril, quinapril y ramipril. Los ejemplos no limitativos de bloqueantes del receptor de angiotensina II, tambien conocidos como antagonistas del receptor de angiotensina II, bloqueantes del receptor de ANG o bloqueantes del receptor de ANG-II tipo 1 (ARBS), incluyen angiocandesartan, eprosartan, irbesartan, losartan y valsartan. Los ejemplos no limitativos de simpaticolfticos incluyen simpaticolfticos de accion central o simpaticolfticos de accion periferica. Los ejemplos no limitativos de simpaticolfticos de accion central, tambien conocidos como simpaticolfticos del sistema nervioso central (SNC), incluyen clonidina (Catapres), guanabenz (Wytensin), guanfacina (Tenex) y metildopa (Aldomet). Los ejemplos no limitativos de un simpaticolftico de accion periferica incluyen agentes bloqueantes ganglionares, un agente bloqueante de neuronas adrenergicas, un gante bloqueante beta-adrenergico o un agente bloqueante alfa-adrenergico. Los ejemplos no limitativos de agentes bloqueantes ganglionares incluyen mecamilamina (Inversine) y trimetafan (Arfonad). Los ejemplos no limitativos de agentes bloqueantes de neuronas adrenergicas incluyen guanetidina (Ismelin) y reserpina (Serpasil). Los ejemplos no limitativos de bloqueantes beta-adrenergicos incluyen acenitolol (Sectral), atenolol (Tenormin), betaxolol (Kerlone), carteolol (Cartrol), labetalol (Normodyne, Trandate), metoprolol (Lopressor), nadanol (Corgard), penbutolol (Levatol), pindolol (Visken), propranolol (Inderal) y timolol (Blocadren). Los ejemplos no limitativos de bloqueantes alfa-adrenergicos incluyen prazosin (Minipress), doxazocin (Cardura) y terazosin (Hytrin).
En determinadas realizaciones, un agente terapeutico cardiovascular puede comprender un vasodilatador (por ejemplo, un vasodilatador cerebral, un vasodilatador coronario o un vasodilatador periferico). En determinadas realizaciones preferidas, un vasodilatador comprende un vasodilatador coronario. Los ejemplos no limitativos de vasodilatadores coronarios incluyen amotrifeno, bendazol, hemisuccinato de benfurodilo, benciodarona, cloracizina, cromonar, clobenfurol, clonitrato, dilazep, dipiridamol, droprenilamina, efloxato, tetranitrato de eritritilo, etafenona, fendilina, floredil, ganglefeno, herestrof bis(beta-dietilaminoetil eter), hexobendina, tosilato de itramina, kelina, lidoflanina, manitol hexanitrana, medibazina, nicorglicerina, pentaeritritol tetranitrato, pentrinitrol, perhexilina, pimefilina, trapidil, tricromilo, trimetazidina, fosfato de trolnitrato y visnadina.
En determinadas realizaciones, un vasodilatador puede comprender un vasodilatador de terapia cronica o un vasodilatador hipertensor de emergencia. Los ejemplos no limitativos de un vasodilatador de terapia cronica incluyen hidralazina (Apresoline) y minoxidil (Loniten). Los ejemplos no limitativos de un vasodilatador hipertensor de emergencia incluyen nitroprusiato (Nipride), diazoxida (Hiperstat IV), hidralazina (Apresoline), minoxidil (Loniten) y
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verapamilo.
Los ejemplos no limitativos de antihipertensores diversos incluyen ajmalina, acido gamma-aminobutmco, bufeniode, cicletainina, ciclosidomina, un tanato de criptenamina, fenoldopam, flosequinan, ketanserina, mebutamato, mecamilamina, metildopa, metil-4-piridil-cetona-tiosemicarbazona, muzolimina, pargilina, pempidina, pinacidil, piperoxano, primaperona, protoveratrina, raubasina, rescimetol, rilmenideno, saralasina, nitroprusiato de sodio, ticrinafeno, camsilato de trimetafano, tirosinasa y urapidil.
En determinadas realizaciones, un antihipertensor puede comprender un derivado de ariletanolamina, un derivado de benzotiadiazina, un derivado de 7V-carboxialquil(peptido/lactama), un derivado de dihidropiridina, un derivado de guanidina, hidracina/ftalazina, un derivado de imidazol, un compuesto de amonio cuaternario, un derivado de reserpina o un derivado de sulfonamida. Los ejemplos no limitativos de derivados de ariletanolamina incluyen amosulalol, bufuralol, dilevalol, labetalol, pronetalol, sotalol y sulfinalol. Los ejemplos no limitativos de derivados de benzotiadiazina incluyen altizida, bendroflumetiazida, benztiazida, bencilhidroclorotiazida, butiazida, clorotiazida, clortalidona, ciclopentiazida, ciclotazida, diazoxido, epitiazida, etiazida, fenquizona, hidroclorotizida, hidroflumetizida, meticlotiazida, meticrano, metolazona, paraflutizida, politizida, tetraclormetiazida y triclormetiazida. Los ejemplos no limitativos de derivados de N-carboxialquil(peptido/lactama) incluyen alacepril, captopril, cilazapril, delapril, enalapril, enalaprilato, fosinopril, lisinopril, moveltipril, perindopril, quinapril y ramipril. Los ejemplos no limitativos de derivados de dihidropiridina incluyen amlodipino, felodipino, isradipino, nicardipino, nifedipino, nilvadipino, nisoldipino y nitrendipino. Los ejemplos no limitativos de derivados de guanidina incluyen betanidina, debrisoquina, guanabenz, guanaclina, guanadrel, guanazodina, guanetidina, guanfacina, guanoclor, guanoxabenz y guanoxan. Los ejemplos no limitativos de hidrazinas/ftalazinas incluyen budralazina, cadralazina, dihidralazina, endralazina, hidracarbazina, hidralazina, feniprazina, pildralazina y todralazina. Los ejemplos no limitativos de derivados de imidazol incluyen clonidina, lofexidina, fentolamina, tiamenidina y tolonidina. Los ejemplos no limitativos de compuestos de amonio cuaternario incluyen bromuro de azametonio, cloruro de clorisondamina, hexametonio, bis(metilsulfato) de pentacinio, bromuro de pentametonio, tartrato de pentolinio, cloruro de fenactropinio y metosulfato de trimetidinio. Los ejemplos no limitativos de derivados de reserpina incluyen bietaserpina, deserpidina, rescinamina, reserpina y sirosingopina. Los ejemplos no limitativos de derivados de sulfonamida incluyen ambusida, clopamida, furosemida, indapamida, quinetazona, tripamida y xipamida. Generalmente se usan vasopresores para aumentar la tension arterial durante un choque, lo que puede producirse durante un procedimiento quirurgico. Los ejemplos no limitativos de un vasopresor, tambien conocido como un antihipotensor, incluyen metilsulfato de amezinio, amida de angiotensina, dimetofrina, dopamina, etifelmina, etilefrina, gepefrina, metaraminol, midodrina, norepinefrina, foledrina y sinefrina. Los ejemplos no limitativos de agentes para el tratamiento de la insuficiencia cardfaca congestiva incluyen agentes anti-angiotensina II, tratamiento de reduccion de poscarga-precarga, agentes diureticos e ionotropicos.
En determinadas realizaciones, un paciente animal, por ejemplo un ser humano, que no puede tolerar un antagonista de angiotensina puede tratarse con una terapia de combinacion. Tal terapia puede combinar la administracion de hidralazina (Apresoline) y dinitrato de isosorbida (Isordil, Sorbitrate).
Los ejemplos no limitativos de diureticos incluyen un derivado de tiazida o benzotiadiazina (por ejemplo, altiazida, bendroflumetazida, benztiazida, bencilhidroclorotiazida, butiazida, clorotiazida, clorotiazida, clortalidona, ciclopentiazida, epitiazida, etiazida, etiazida, fenquizona, hidroclorotiazida, hidroflumetiazida, meticlotiazida, meticrano, metolazona, paraflutizida, politizida, tetraclorometiazida, triclormetiazida), un organomercurial (por ejemplo, clormerodrina, meralurida, mercamfamida, mercaptomerina sodica, acido mercumalflico, mercumatilina sodica, cloruro de mercurio, mersalilo), una pteridina (por ejemplo, furtereno, triamtereno), purinas (por ejemplo, acefilina, 7-morfoilinometilteofillina, pamobrom, proteobromina, teobromina), esteroides incluyendo antagonistas de aldosterona (por ejemplo, canrenona, oleandrina, espironolactona), un derivado de sulfonamida (por ejemplo, acetazolamida, ambusida, azosemida, bumetanida, butazolamida, cloraminofenamida, clofenamida, clopamida, clorexolona, difenilmetano-4,4'-disulfonamida, disulfamida, etoxzolamida, furosemida, indapamida, mefrusida, metazolamida, piretanida, quinetazona, torasemida, tripamida, xipamida), un uracilo (por ejemplo, aminometradina, amisometradina), un antagonista ahorrador de potasio (por ejemplo, amilorida, triamtereno) o un diuretico diverso tal como aminozina, arbutina, clorazanilo, acido etacrmico, etozolina, hidracarbazina, isosorbida, manitol, metochalcona, muzolimina, perhexilina, ticrinafeno y urea.
Los ejemplos no limitativos de agentes ionotropicos positivos, tambien conocidos como cardiotonicos, incluyen acefillina, una acetildigitoxina, 2-amino 4-picolina, amrinona, hemisuccinato de benfurodilo, bucladesina, cerberosina, camfotamida, convalatoxina, cimarina, denopamina, deslanosido, digitalina, digitalis, digitoxina, digoxina, dobutamina, dopamina, dopexamina, enoximona, eritroflema, fenalcomina, gitalina, gitoxina, glicociamina, heptaminol, hidrastinina, ibopamina, un lantosido, metamivam, milrinona, nerifolina, oleandrina, ouabama, oxifedrina, prenalterol, proscilaridina, resibufogenina, escilareno, escilarenina, estrofantina, sulmazol, teobromina y xamoterol.
En realizaciones particulares, un agente ionotropico es un glucosido cardfaco, agonista beta-adrenergico o un inhibidor de fosfodiesterasa. Los ejemplos no limitativos de glucosidos cardfacos incluyen digoxina (lanoxina) y digitoxina (cristodigina). Los ejemplos no limitativos de agonistas beta-adrenergicos incluyen albuterol, bambuterol, bitolterol, carbuterol, clenbuterol, clorprenalina, denopamina, dioxetedrina, dobutamina (Dobutrex), dopamina
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(Intropin), dopexamina, efedrina, etafedrina, epinorepinefrina, fenoterol, formoterol, hexoprenalina, ibopamina, isoetarina, isoproterenol, mabuterol, metaproterenol, metoxifenamina, oxifedrina, pirbuterol, procaterol, protoquilol, reproterol, rimiterol, ritodrina, soterenol, terbutalina, tretoquinol, tulobuterol y xamoterol. Los ejemplos no limitativos de un inhibidor de fosfodiesterasa incluyen amrinona (Inocor).
Los agentes antianginosos pueden comprender organonitratos, bloqueantes de los canales de calcio, beta- bloqueantes y combinaciones de los mismos. Los ejemplos no limitativos de organonitratos, tambien conocidos como nitrovasodilatadores, incluyen nitroglicerina (nitro-bid, nitrostat), dinitrato de isosorbida (Isordil, sorbitrato) y nitrato de amilo (Aspirol, Vaporole). La endotelina (ET) es un peptido de 21 aminoacidos que tiene efectos fisiologicos y patofisiologicos potentes que parecen estar implicados en el desarrollo de la insuficiencia cardfaca. Los efectos de la ET estan mediados a traves de la interaccion con dos clases de receptores de la superficie celular. El receptor de tipo A (ET-A) esta asociado con vasoconstriccion y crecimiento celular, mientras que el receptor de tipo B (ET-B) esta asociado con vasodilatacion mediada por celulas endoteliales y con la liberacion de otras neurohormonas, tales como aldosterona. Se conocen en la tecnica agentes farmacologicos que pueden inhibir o bien la produccion de ET o bien su capacidad para estimular celulas relevantes. La inhibicion de la produccion de ET implica el uso de agentes que bloquean una enzima denomina enzima convertidora de endotelina que esta implicada en el procesamiento del peptido activo a partir de su precursor. La inhibicion de la capacidad de ET para estimular celulas implica el uso de agentes que bloquean la interaccion de ET con sus receptores. Los ejemplos no limitativos de antagonistas del receptor de endotelina (ERA) incluyen bosentano, enrasentan, ambrisentan, darusentan, tezosentan, atrasentan, avosentan, clazosentan, edonentan, sitaxsentan, TBC 3711, BQ 123 y BQ 788.
Los expertos en la tecnica reconoceran facilmente que el analisis de los nucleotidos presentes segun el metodo de la invencion en el acido nucleico de un individuo puede realizarse mediante cualquier metodo o tecnica capaz de determinar los nucleotidos presentes en un sitio polimorfico. Tal como es obvio en la tecnica, los nucleotidos presentes en los marcadores polimorficos pueden determinarse o bien partir de cualquier cadena de acido nucleico o bien a partir de ambas cadenas.
Una vez que se ha obtenido una muestra biologica de un sujeto (por ejemplo, un fluido corporal, tal como orina, saliva, plasma, suero o una muestra tisular, tal como una muestra de tejido bucal o una celula bucal) normalmente se lleva a cabo la deteccion de una variacion de secuencia o sNp de variante alelica. Puede emplearse practicamente cualquier metodo conocido por el experto en la tecnica. Quiza el metodo mas directo es determinar realmente la secuencia o bien del ADN genomico o bien del ADNc y comparar estas secuencias con los SNP de alelos conocidos del gen. Este puede ser un procedimiento bastante caro y que lleva mucho tiempo. No obstante, esta tecnologfa es bastante comun y se conoce bien.
Puede usarse cualquiera de una variedad de metodos que existen para detectar variaciones de secuencia en los metodos de la invencion. El metodo particular usado no es importante en la estimacion del riesgo cardiovascular ni en la seleccion del tratamiento.
Existen otros metodos disponibles comercialmente para la identificacion de SNP de alto rendimiento sin usar tecnologfas de secuenciacion directa. Por ejemplo, Veracode Tecnology de Illumina, qmmica de genotipado de SNP Taqman® y qmmica de genotipado de SNP KASPar.
Una variacion del metodo de determinacion de secuencias directo es el metodo Gene Chip(™) disponible de Affymetrix. Alternativamente, tambien estan disponibles comercialmente modos rigurosos y menos caros de determinar la variacion de secuencia de ADN. Por ejemplo, Perkin Elmer adapto su TAQman Assay(™) para detectar variacion de secuencia. Orchid BioSciences tiene un metodo denominado SNP-IT (™) (Tecnologfa de identificacion de SNP) que usa extension con cebador con analogos de nucleotidos marcados para determinar que nucleotido se produce en la posicion inmediatamente en 3' con respecto a una sonda de oligonucleotido, entonces se identifica la base extendida usando fluorescencia directa, un ensayo colorimetrico indirecto, espectrometna de masas o polarizacion de fluorescencia. Sequenom usa una tecnologfa de captura de hibridacion mas MALDI-TOF (desorcion/ionizacion mediante laser asistida por matriz - espectrometna de masas de tiempo de vuelo) para detectar genotipos de SNP con su sistema MassARRAY(™). Promega proporciona el READIT(™) SNP/Genotyping System (patente estadounidense n.° 6.159.693). En este metodo, se hibridan sondas de ADN o ARN con secuencias diana de acido nucleico. Las sondas que son complementarias a la secuencia diana en cada base se despolimerizan con una mezcla de enzimas patentada, mientras que las sondas que difieren de la diana en la posicion de consulta permanecen intactas. El metodo usa qmmica de pirofosforilacion en combinacion con deteccion de luciferasa para proporcionar un sistema de puntuacion de SNP altamente sensible y adaptable. Third Wave Technologies tiene el metodo Invader OS(™)que usa enzimas Cleavaseg patentadas, que reconocen y cortan solo la estructura espedfica formada durante el procedimiento Invader. Invader Os se basa en la amplificacion lineal de la senal generada por el procedimiento Invader, mas que en la amplificacion exponencial de la diana. El ensayo Invader OS no utiliza pCr en ninguna parte del ensayo. Ademas, hay varios laboratorios de analisis forenses de ADN y muchos laboratorios de investigacion que usan PCR espedfica de gen, seguida por digestion con endonucleasa de restriccion y electroforesis en gel (u otra tecnologfa de separacion por tamano) para detectar polimorfismos de longitud de fragmento de restriccion (RFLP).
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En diversas realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, la presencia o ausencia de los SNP se identifica mediante la amplificacion o no amplificacion de un producto de amplificacion a partir de la muestra. Las amplificaciones de polinucleotidos normalmente son dependientes del molde. Tales amplificaciones se basan generalmente en la existencia de una cadena de molde para obtener copias adicionales del molde. Los cebadores son acidos nucleicos cortos que son capaces de cebar la smtesis del acido nucleico en formacion en un procedimiento dependiente de molde, que se hibrida con la cadena de molde. Normalmente, los cebadores tienen de diez a treinta pares de bases de longitud, pero pueden emplearse secuencias mas largas. Los cebadores pueden proporcionarse en forma bicatenaria y/o monocatenaria, aunque generalmente se prefiere la forma monocatenaria. Con frecuencia, los pares de cebadores se disenan para hibridarse selectivamente con regiones distintas de un acido nucleico de molde, y se ponen en contacto con el ADN de molde en condiciones que permiten la hibridacion selectiva. Dependiendo de la aplicacion deseada, pueden seleccionarse condiciones de hibridacion de alta rigurosidad que solo permitiran la hibridacion con secuencias que son completamente complementarias con los cebadores. En otras realizaciones, la hibridacion puede producirse en rigurosidad reducida para permitir la amplificacion de acidos nucleicos que contienen uno o mas apareamientos erroneos con las secuencias de cebador. Una vez hibridado, el complejo molde-cebador se pone en contacto con una o mas enzimas que facilitan la smtesis de acido nucleico dependiente de molde. Se realizan multiples rondas de amplificacion, tambien denominadas “ciclos,” hasta que se produce una cantidad suficiente de producto de amplificacion.
Reaccion en cadena de la polimerasa
Se dispone de varios procedimientos dependientes de molde para amplificar las secuencias de oligonucleotidos presentes en una muestra de molde dada. Uno de los metodos de amplificacion mejor conocidos es la reaccion en cadena de la polimerasa. En la PCR, se usan pares de cebadores que se hibridan selectivamente con acidos nucleicos en condiciones que permiten la hibridacion selectiva. El termino “cebador”, tal como se usa en el presente documento, engloba cualquier acido nucleico que es capaz de cebar la smtesis de un acido nucleico en formacion en un procedimiento dependiente de molde. Los cebadores pueden proporcionarse en forma bicatenaria o monocatenaria, aunque se prefiere la forma monocatenaria. Los cebadores se usan en cualquiera de varios procedimientos dependientes de molde para amplificar las secuencias genicas diana presentes en una muestra de molde dada. Uno de los metodos de amplificacion mejor conocidos es la PCR, que se describe en detalle en las patentes estadounidenses n.os 4.683.195, 4.683.202 y 4.800.159. En la PCR, se preparan dos secuencias de cebador que son complementarias con regiones en cadenas complementarias opuestas de la secuencia del/de los gen(es) diana. Los cebadores se hibridaran para formar un complejo acido nucleico:cebador si la secuencia del/de los gen(es) diana esta presente en una muestra. Se anade un exceso de desoxirribonucleosido trifosfatos a una mezcla de reaccion junto con una ADN polimerasa, por ejemplo Taq polimerasa, que facilita la smtesis del acido nucleico dependiente de molde. Si se ha formado el complejo secuencia del/de los gen(es) diana:cebador, la polimerasa hara que los cebadores se extiendan a lo largo de la secuencia del/de los gen(es) diana anadiendo nucleotidos. Mediante la elevacion y disminucion de la temperatura de la mezcla de reaccion, los cebadores extendidos se disociaran del/de los gen(es) diana para formar los productos de reaccion, los cebadores en exceso se uniran al/a los gen(es) diana y a los productos de reaccion y se repite el procedimiento. Estas multiples rondas de amplificacion, denominadas “ciclos”, se realizan hasta que se produce una cantidad suficiente de producto de amplificacion.
El producto de amplificacion puede digerirse con una enzima de restriccion antes del analisis. Todavfa en otras realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, la presencia o ausencia del SNP se identifica hibridando la muestra de acido nucleico con un cebador marcado con un resto detectable. En otras realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, el resto detectable se detecta en un ensayo enzimatico, radioensayo, inmunoensayo o mediante deteccion de fluorescencia. En otras realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, el cebador se marca con un colorante detectable (por ejemplo, SYBR Green I, YO-PRO-I, naranja de tiazol, Hex, PicoGreen, Edans, fluorescema, FAM o TET). En otras realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, los cebadores se ubican en un chip. En otras realizaciones de cualquiera de los aspectos anteriores, los cebadores para amplificacion son espedficos para dichos SNP.
Otro metodo para la amplificacion es la reaccion en cadena de la ligasa (“LCR”). La LCR difiere de la PCR porque amplifica la molecula de sonda en lugar de producir un amplicon a traves de la polimerizacion de nucleotidos. En la LCR, se preparan dos pares de sondas complementarias, y en presencia de una secuencia diana, cada par se unira a cadenas complementarias opuestas de la diana de manera que esten en contacto. En presencia de una ligasa, los dos pares de sonda se uniran para formar una unica unidad. Mediante ciclos de temperatura, como en la PCR, las unidades ligadas vinculadas se disocian de la diana y entonces sirven como “secuencias diana” para la ligacion de pares de sondas en exceso. La patente estadounidense n.° 4.883.750 describe un metodo similar a la LCR para unir pares de sondas a una secuencia diana.
Amplificacion isotermica
Un metodo de amplificacion isotermica, en el que se usan endonucleasas de restriccion y ligasas para lograr la amplificacion de moleculas diana que contienen nucleotidos 5'-[[alfa]-tio]-trifosfatos en una cadena de un sitio de restriccion tambien puede ser util en la amplificacion de acidos nucleicos en la presente invencion. En una
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realizacion, se usa el metodo de amplificacion isotermica mediada por bucle (LAMP) para la tipificacion de polimorfismo de un solo nucleotido (SNP).
Amplificacion por desplazamiento de cadena
La amplificacion por desplazamiento de cadena (SDA) es otro metodo de llevar a cabo la amplificacion isotermica de acidos nucleicos que implica multiples rondas de desplazamiento y smtesis de cadenas, es decir, desplazamiento de mella. Un metodo similar, denominado reaccion en cadena de reparacion (RCR), implica hibridar varias sondas por toda una region seleccionada como diana para la amplificacion, seguido por una reaccion de reparacion en la que solo estan presentes dos de las cuatro bases. Las otras dos bases pueden anadirse como derivados biotinilados para una facil deteccion.
Amplificacion basada en la transcripcion
Otros procedimientos de amplificacion de acidos nucleicos incluyen sistemas de amplificacion basada en la transcripcion, incluyendo amplificacion basada en secuencias de acidos nucleicos. En la amplificacion basada en secuencias de acidos nucleicos, los acidos nucleicos se preparan para la amplificacion mediante extraccion convencional con fenol/cloroformo, desnaturalizacion con calor de una muestra clmica, tratamiento con tampon de lisis y columnas MiniSpin para aislamiento de ADN y ARN o extraccion de ARN con cloruro de guanidinio. Estas tecnicas de amplificacion implican hibridar un cebador, que tiene secuencias espedficas diana. Tras la polimerizacion, se digieren hforidos de ADN/ARN con ARNasa H mientras que las moleculas de ADN bicatenario se desnaturalizan con calor de nuevo. En cualquier caso, el ADN monocatenario se convierte completamente en bicatenario mediante la adicion del segundo cebador espedfico de diana, seguido por polimerizacion. Las moleculas de ADN bicatenario se transcriben entonces multiples veces mediante una polimerasa tal como T7 o SP6. En una reaccion dclica isotermica, los ARN se someten a transcripcion inversa dando ADN bicatenario, y se transcriben una vez mas con una polimerasa tal como T7 o SP6. Los productos resultantes, ya esten truncados o completos, indican secuencias diana espedficas.
Pueden usarse otros metodos de amplificacion segun la presente invencion. En una realizacion, se usan cebadores “modificados” en una smtesis dependiente de molde y enzimas similar a la PCR. Los cebadores pueden modificarse mediante marcaje con un resto de captura (por ejemplo, biotina) y/o un resto detector (por ejemplo, una enzima). En presencia de una secuencia diana, la sonda se une y se escinde catalfticamente. Tras la escision, la secuencia diana se libera intacta para unirse mediante la sonda en exceso. La escision de la sonda marcada senaliza la presencia de la secuencia diana. En otro enfoque, un procedimiento de amplificacion de acido nucleico implica sintetizar de manera dclica ARN monocatenario (“ARNmc”), ADNmc y ADN bicatenario (ADNbc) que pueden usarse segun la presente invencion. El ARNmc es un primer molde para un primer oligonucleotido de cebador, que se extiende mediante transcriptasa inversa (ADN polimerasa dependiente de ARN). Entonces se retira el aRn del duplex ADN:ARN resultante mediante la accion de la ribonucleasa H (ARNasa H, una ARNasa espedfica para ARN en duplex o bien con ADN o bien con ARN). El ADNmc resultante es un segundo molde para un segundo cebador, que tambien incluye las secuencias de un promotor de ARN polimerasa (ejemplificado mediante ARN polimerasa de T7) en 5' por su homologfa con el molde. Este cebador se extiende entonces mediante ADN polimerasa (ejemplificada mediante el fragmento “Klenow” grande de una ADN polimerasa I de E. coli), que da como resultado una molecula de ADN bicatenario (“ADNbc”), que tiene una secuencia identica a la del ARN original entre los cebadores y que tiene adicionalmente, en un extremo, una secuencia de promotor. Esta secuencia de promotor puede usarse por la ARN polimerasa apropiada para obtener muchas copias de ARN del ADN. Estas copias pueden volver a entrar entonces en el ciclo lo que conduce a una amplificacion muy rapida. Con la eleccion apropiada de enzimas, esta amplificacion puede realizarse de manera isotermica sin la adicion de enzimas en cada ciclo. Debido a la naturaleza dclica de este procedimiento, puede elegirse que la secuencia de partida este en forma o bien de ADN o bien de ARN.
Metodos para la separacion del acido nucleico
Puede ser deseable separar productos de acido nucleico de otros materiales, tales como el molde y el cebador en exceso. En una realizacion, los productos de amplificacion se separaran mediante electroforesis en gel de agarosa, agarosa-acrilamida o poliacrilamida usando metodos convencionales (Sambrook et al., 1989, vease a continuacion). Los productos de amplificacion separados pueden cortarse y eluirse del gel para su manipulacion adicional. Usando geles de agarosa de bajo punto de fusion, puede retirarse la banda separada calentando el gel, seguido por extraccion del acido nucleico. La separacion de acidos nucleicos tambien puede verse afectada por tecnicas cromatograficas conocidas en la tecnica. Hay muchos tipos de cromatograffa que pueden usarse en la practica de la presente invencion, incluyendo cromatograffa de adsorcion, particion, intercambio ionico, hidroxiapatita, tamiz molecular, fase inversa, columna, papel, capa fina y gases asf como HPLC. En determinadas realizaciones, se visualizan los productos de amplificacion. Un metodo de visualizacion tfpico implica la tincion de un gel con bromuro de etidio y la visualizacion de bandas bajo luz UV. Alternativamente, si los productos de amplificacion se marcan de manera integral con nucleotidos radiomarcados o marcados fluorometricamente, Los productos de amplificacion separados pueden exponerse a una pelmula de rayos X o visualizarse con luz que muestra los espectros de excitacion apropiados.
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Alternativamente, la presencia de las posiciones polimorficas segun los metodos de la invencion puede determinarse mediante hibridacion o falta de hibridacion con una sonda de acido nucleico adecuada espedfica para un acido nucleico polimorfico pero no con el acido nucleico mutado. Mediante “hibridar” quiere decirse un par que forma una molecula bicatenaria entre secuencias de polinucleotidos complementarias, o partes de las mismas, en diversas condiciones de rigurosidad. Por ejemplo, una concentracion de sal rigurosa normalmente sera de NaCl de menos de aproximadamente 750 mM y citrato de trisodio de menos de aproximadamente 75 mM, preferiblemente NaCl de menos de aproximadamente 500 mM y citrato de trisodio de menos de aproximadamente 50 mM, y mas preferiblemente NaCl de menos de aproximadamente 250 mM y citrato de sodio de menos de aproximadamente 25 mM. Puede obtenerse hibridacion de baja rigurosidad en ausencia de un disolvente organico, por ejemplo, formamida, mientras que puede obtenerse hibridacion de alta rigurosidad en presencia de formamida a al menos aproximadamente el 35%, y mas preferiblemente formamida a al menos aproximadamente el 50%. Las condiciones de temperatura rigurosas normalmente incluiran temperaturas de al menos aproximadamente 30°C, mas preferiblemente de al menos aproximadamente 37°C y lo mas preferiblemente de al menos aproximadamente 42°C. Los expertos en la tecnica conocen bien diversos parametros adicionales, tales como el tiempo de hibridacion, la concentracion de detergente, por ejemplo, dodecilsulfato de sodio (SDS) y la inclusion o exclusion de ADN portador. Se logran diversos niveles de rigurosidad combinando estas condiciones diversas segun sea necesario. En una realizacion preferida, la hibridacion se producira a 30°C en NaCl 750 mM, citrato de trisodio 75 mM y SDS al 1%. En una realizacion mas preferida, la hibridacion se producira a 37°C en NaCl 500 mM, citrato de trisodio 50 mM, SDS al 1%, formamida al 35% y ADN de esperma de salmon (ADNss) desnaturalizado 100 [mu]g/ml. En la realizacion mas preferida, la hibridacion se producira a 42°C en NaCl 250 mM, citrato de trisodio 25 mM, SDS al 1%, formamida al 50% y ADNss 200 [mu]g/ml. Variaciones utiles en estas condiciones resultaran facilmente evidentes para los expertos en la tecnica.
Para la mayona de las aplicaciones, las etapas de lavado que siguen a la hibridacion tambien variaran en rigurosidad. Las condiciones de rigurosidad del lavado pueden definirse mediante la concentracion de sal y mediante la temperatura. Como anteriormente, la rigurosidad de lavado puede aumentarse disminuyendo la concentracion de sal o aumentando la temperatura. Por ejemplo, una concentracion de sal rigurosa para las etapas de lavado sera preferiblemente de NaCl de menos de aproximadamente 30 mM y citrato de trisodio de menos de aproximadamente 3 mM, y lo mas preferiblemente NaCl de menos de aproximadamente 15 mM y citrato de trisodio de menos de aproximadamente 1,5 mM. Las condiciones de temperatura rigurosas para las etapas de lavado normalmente incluiran una temperatura de al menos aproximadamente 25°C, mas preferiblemente de al menos aproximadamente 42°C e incluso mas preferiblemente de al menos aproximadamente 68°C. En una realizacion preferida, las etapas de lavado se produciran a 25°C en NaCl 30 mM, citrato de trisodio 3 mM y SDS al 0,1%. En una realizacion mas preferida, las etapas de lavado se produciran a 42°C en NaCl 15 mM, citrato de trisodio 1,5 mM y SDS al 0,1%. En una realizacion mas preferida, las etapas de lavado se produciran a 68°C en NaCl 15 mM, citrato de trisodio 1,5 mM y SDS al 0,1%. Variaciones adicionales en estas condiciones resultaran facilmente evidentes para los expertos en la tecnica. Los expertos en la tecnica conocen bien las tecnicas de hibridacion y se describen, por ejemplo, en Benton y Davis (Science 196: 180, 1977); Grunstein y Hogness (Proc. Natl. Acad. Sci., USA 72:3961, 1975); Ausubel et al. (Actual Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001); Berger y Kimmel (Guide to Molecular Cloning Techniques, 1987, Academic Press, New York); y Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989.
Las moleculas de acido nucleico utiles para la hibridacion en los metodos de la invencion incluyen cualquier molecula de acido nucleico que muestre identidad sustancial como para poder hibridarse espedficamente con los acidos nucleicos diana. Los polinucleotidos que tienen “identidad sustancial” con una secuencia endogena normalmente son capaces de hibridarse con al menos una cadena de una molecula de acido nucleico bicatenario. Por “sustancialmente identica” se quiere decir una molecula de polipeptido o acido nucleico que muestra una identidad de al menos el 50% con respecto a una secuencia de aminoacidos o secuencia de acido nucleico de referencia. Preferiblemente, una secuencia de este tipo es identica en al menos el 60%, mas preferiblemente el 80% o el 85%, y mas preferiblemente el 90%, el 95% o incluso el 99% a nivel de aminoacido o de acido nucleico a la secuencia usada para la comparacion. La identidad de secuencia normalmente se mide usando software de analisis de secuencia (por ejemplo, Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, Centro de Biotecnologfa de la Universidad de Wisconsin Center, 1710 University Avenue, Madison, Wis. 53705, programas BLAST, BESTFIT, GAP o PILEUP/ PRETTYBOX). Un software de este tipo empareja secuencias identicas o similares asignando grados de homologfa a diversas sustituciones, deleciones y/u oras modificaciones. Las sustituciones conservativas normalmente incluyen sustituciones dentro de los siguientes grupos: glicina, alanina; valina, isoleucina, leucina; acido aspartico, acido glutamico, asparagina, glutamina; serina, treonina; lisina, arginina; y fenilalanina, tirosina. En un enfoque a modo de ejemplo para determinar el grado de identidad, puede usarse un programa BLAST, con una puntuacion de probabilidad de entre e<“3> y e<“100> lo que indica una secuencia estrechamente relacionada.
Puede usarse un sistema de deteccion para medir la ausencia, presencia y cantidad de hibridacion para todas las distintas secuencias simultaneamente. Preferiblemente, se usa un dispositivo de exploracion para determinar los niveles y patrones de fluorescencia.
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Metodo para reclasificar a los pacientes a un estado de riesgo mas apropiado.
Otro objeto de la presente divulgacion es la mejora de las escalas/metodos/funciones de riesgo cardiovascular en uso hoy en dia introduciendo en la funcion el riesgo conferido por la combinacion particular de marcadores de SNP tal como se expone en la tabla 1 asociados con un riesgo de enfermedad/trastorno cardiovascular y/o con un riesgo de complicaciones de enfermedad o acontecimiento cardiovascular incluyendo, pero sin limitarse a, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, angina de pecho, accidentes isquemicos transitorios, insuficiencia cardiaca congestiva, aneurisma aortico y muerte. Los factores de riesgo cardiovascular en uso hoy en dia incluyen, pero no se limitan a, la funcion de Framingham original, la funcion de Framingham adaptada (tal como pero sin limitarse a la funcion de REGICOR), funcion de PROCAM, funcion de SCORE y funcion de QRISK. La mejora de las funciones de Framingham, PROCAM, REGICOR y QRISK se muestra como las funciones 1a y 1b.
Funcion 1a (vease tambien la reivindicacion 5)
Esta ecuacion general puede usarse para calcular el riesgo coronario o cardiovascular usando los factores de riesgo y efectos de los factores de riesgo incluidos y definidos en las funciones de FRAMINGHAM (la original y/o la adaptada tal como pero sin limitarse a REGICOR), PROCAM y QRISK:
en la que,
prob(acontecimiento CRFp t, SNp t) = 1 - S
exp
^A:RFp*CRFp,i
+2 /Wj *SNPj,i -2 &RFp *CRFp -2 ^SNPj *SNPj j = 1 p = 1 j = 1
p =1
• prob(acontecimiento | CRF,SNP): probabilidad de presentar un acontecimiento coronario dada una combinacion
de factores de riesgo coronario (CRF) y caracteristicas geneticas (SNP).
a. acontecimientoi: acontecimiento coronario (infarto de miocardio o angina de pecho mortal y no mortal) en un periodo de 10 anos para un individuo “i”.
b. CRFpj: valor de cada factor de riesgo coronario “p” incluido en la ecuacion para un individuo “i”. La lista de factores de riesgo coronario incluidos en el modelo se muestra en la tabla A.
c. SNPji: numero de alelos de riesgo (0, 1,2) para una variante genetica espedfica “j” incluidos en la ecuacion para un individuo “i”. Las variantes actualmente incluidas en el modelo se muestran en la tabla B.
• S : supervivencia media libre de acontecimientos coronarios en la poblacion. Esta supervivencia se adaptara a las tasas regionales o nacionales.
• exp: exponenciacion natural.
P
^CRFp *CRFp i
• P=1 p donde
p
a. 2 funcion sumatoria a lo largo de los P factores de riesgo clasicos.
p=i
b. PCRF logaritmo de la razon de riesgo que corresponde al factor de riesgo coronario clasico “p”. Los valores de p para cada factor de riesgo coronario “p” se muestran en la tabla A.
c. CRFpj: valor de cada factor de riesgo coronario “p” incluido en la ecuacion para un individuo “i”. J
i ft
J=1 'SNPj
*SNPj,i
donde
J
a. 2 funcion sumatoria a lo largo de las J variantes geneticas.
j=1
b. PSNP logaritmo de la razon de riesgo que corresponde a la variante genetica “j”. El posible intervalo de
valores de p para cada variante genetica “j” se muestra en la tabla B.
c. SNPjj: numero de alelos de riesgo (0, 1,2) para una variante genetica espedfica “j” incluidos en la ecuacion para un individuo “i”.
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• CRFp: valor promedio para el factor de riesgo clasico “p” en la poblacion. Este valor promedio se adaptara a la prevalencia regional o nacional.
• SNPj: numero de copias de alelo de riesgo promedio para la variante genetica “j” en la poblacion.
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Este valor promedio se adaptara a la prevalencia regional o nacional.
Tabla A. Lista de factores de riesgo coronario incluidos en el presente modelo inventivo, logaritmo de la razon de riesgo, PCM? , para cada factor de riesgo clasico por sexo, intervalo de los valores promedio para el factor de riesgo
15 clasico “p” en la poblacion, y tasa de supervivencia media libre de acontecimientos coronarios en la poblacion (S ) (intervalo de posibles valores).
CRFp PCRFp para hombres PCRFp para mujeres CRFP
FRAMINGHAM (original o adaptacion)
Edad 0,048 0,338 35-74
Edad2 0 -0,003
Colesterol total (mg/dl)
<160 -0,659 -0,261 0-30
160 -<200 0 0 0-30
200 - <240 0,177 0,208 0-30
240 - <280 0,505 0,244 0-30
>280 0,657 0,53 0-30
Colesterol-HDL (mg/dl)
<35 0,497 0,843 0-30
35 - <45 0,243 0,378 0-30
45 - <50 0 0,198 0-30
50 - <60 -0,051 0 0-30
>60 -0,487 -0,430 0-30
Tension arterial
Optima -0,002 -0,534 0-30
Normal 0 0 0-30
Lfmite alto 0,283 -0,068 0-30
Hipertension I 0,522 0,263 0-30
Hipertension II 0,619 0,466 0-30
Diabetes 0,428 0,597 0-30
Tabaquismo 0,523 0,292 0-60
PROCAM
Edad 0,103 - 35-74
Colesterol-LDL (mg/dl) 0,013 - 100-250
Colesterol-HDL (mg/dl) -0,032 - 35-65
Trigliceridos (mg/dl) 0,317 - 100-200
Tension arterial sistolica (mmHg) 0,010 - 100-160
Antecedentes familiares de MI 0,382 - 1-45
Diabetes 0,399 - 0-30
QRISK
Log(edad/10) 4,474 3,925 35-74
Colesterol total/Col.- HDL 0,001 0,001 2-10
indice de masa corporal (kg/m2) 0,015 0,022 22-32
Antecedentes familiares de CVD 0,206 0,262 1-45
prematura
Tabaquismo 0,425 0,349 0-60
Puntuacion de Townsend de area de salida 0,034 0,017 -3-3
Tension arterial sistolica (mmHg) 0,005 0,004 100-160
Tratamiento para la hipertension 0,550 0,614 0-40
Interaccion con tratamiento de SBP*HTN -0,004 -0,007 ---
Supervivencia media S 0,951 (0,01-9,00) 0,978 (0,01-9,00)
Tabla B. Variantes actualmente incluidas en el presente modelo inventivo, logaritmo de la razon de riesgo (intervalo de posibles valores), PSM> y numero de copias de alelo de riesgo promedio (intervalo de posibles valores), SNPj,
para cada variante genetica.
5
SNPj
PSNPj
SNPj
rs17465637
0,1310 (0,0100 -0,5000) 1,48 (0,3-2,8)
Rs67258887
0,1310 (0,0100 -0,5000) 0,3 (0,15-1,4)
Rs9818870
0,1133 (0,0100 -0,5000) 0,36 (0,15-1,4)
Rs12526453
0,0953 (0,0100 -0,5000) 1,34 (0,3-2,8)
Rs1333049
0,2546 (0-0100 - 1,0000) 0,92 (0,3-2,8)
Rs1746048
0,0862 (0,0100 -0,5000) 1,74 (0,3-2,8)
Rs9982601
0,1655 (0,0100 -0,5000) 0,3 (0,15-1,4)
Rs10455872
0,2852 (0,0100 - 1,0000) 0,14 (0,1-1,4)
Rs17216473*
0,1310 (0,0100 -0,5000) 0,08 (0,05-0,5)
Rs10507391*
0,1310 (0,0100 -0,5000) 0,08 (0,05-0,5)
Rs9315051
0,0000 (0,0100 -0,5000) 1 (0,3-2,8)
Rs17222842*
0,1310 (0,0100 -0,5000) 0,08 (0,05-0,5)
Rs6922269
0,0000 (0,0100 -0,5000) 1 (0,3-2,8)
Rs17228212
0,1906 (0,0100 -0,5000) 0,6 (0,3-2,8)
R4769874
0,0000 (0,0100 -0,5000) 1 (0,3-2,8)
Rs9315050*
0,1310 (0,0100 -0,5000) 0,08 (0,05-0,5)
Rs9551963
0,0000 (0,0100 -0,5000) 1 (0,3-2,8)
Rs17222814
0,0000 (0,0100 -0,5000) 1 (0,3-2,8)
Rs3798220
0,4121 (0,0100 - 1,0000) 0,04 (0,05-0,5)
CD005
1,5000 (0,0100 -3,0000) 0,004 (0,001-0,01)
Rs17114036
0,1570 (0,0100 -0,5000) 1,82 (0,3-2,8)
Rs17609940
0,0677 (0,0100 -0,5000) 1,5 (0,3-2,8)
Rs12190287
0,0770 (0,0100 -0,5000) 1,24 (0,3-2,8)
Rs11556924
0,0862 (0,0100 -0,5000) 1,24 (0,3-2,8)
Rs4773144
0,0677 (0,0100 -0,5000) 0,88 (0,3-2,8)
Rs2895811
0,0677 (0,0100 -0,5000) 0,86 (0,3-2,8)
Rs3825807
0,0770 (0,0100 -0,5000) 1,14 (0,3-2,8)
Rs216172
0,0677 (0,0100 -0,5000) 0,74 (0,3-2,8)
Rs12936587
0,0677 (0,0100 -0,5000) 1,12 (0,3-2,8)
Rs46522
0,0583 (0,0100 -0,5000) 1,06 (0,3-2,8)
Rs974819
0,067 (0,0100 - 0,5000) 0,06 (0,01-0,5)
Rs4380028
0,0677 (0,0100 -0,5000) 1,2 (0,3-2,8)
Rs10953541
0,0677 (0,0100 -0,5000) 1,5 (0,3-2,8)
Rs2505083
0,0677 (0,0100 -0,5000) 0,84 (0,3-2,8)
* Todos estos SNP definen el haplotipo B de ALOX5AP que tiene un tamano de efecto definido mediante el valor de p 0,1310.
Funcion 1b (vease tambien la reivindicacion 6)
Esta ecuacion general puede usarse para calcular el riesgo coronario o cardiovascular usando los factores de riesgo 10 y efectos de los factores de riesgo incluidos y definidos en las funciones de Framingham (la original y/o la adaptada tal como pero sin limitarse a REGICOR), PrOcAM y QRISK:
5
10
15
20
25
30
35
40
45
exp
prob(acontecimiento | CRFp x, GRSt) = 1 - S -
S^CRip *CRFp,i +^grs*GRS; -£ A:Rip *CRFp - Airs *GRS
p = i p = i
en la que
• prob(acontecimientOi | CRFpi, GRSi): probabilidad de presentar un acontecimiento coronario dada una
combination de factores de riesgo coronario (CRF) y puntuacion de riesgo genetico (GRS).
a. acontecimientoi: acontecimiento coronario (infarto de miocardio o angina de pecho mortal y no mortal) en un periodo de 10 anos para un individuo “i”.
b. CRFpj: valor de cada factor de riesgo coronario “p” incluido en la ecuacion para un individuo “i”. La lista de factores de riesgo coronario incluidos en el modelo se muestra en la tabla C.
c. GRSi: puntuacion de riesgo genetico definida como el numero ponderado de alelos de riesgo (0, 1,2) para las variantes geneticas incluidas en la ecuacion para un individuo “i”. Las variantes actualmente incluidas en la puntuacion de riesgo genetico se muestran en la tabla B. Las ponderaciones son proporcionales a las betas de cada SNP incluido en la puntuacion (mostradas en la tabla B), y el intervalo de la GRS va desde 0 hasta dos veces el numero de SNP incluidos en la puntuacion.
• S : supervivencia media libre de acontecimientos coronarios en la poblacion. Esta supervivencia se adaptara a las tasas regionales o nacionales.
• exp: exponentiation natural.
imagen1
:donde
a. S funcion sumatoria a lo largo de los P factores de riesgo clasicos.
p=i
b. Acot logaritmo de la razon de riesgo que corresponde al factor de riesgo coronario clasico “p”. Los valores de p para cada factor de riesgo coronario “p” se muestran en la tabla C.
c. CRFpi: valor de cada factor de riesgo coronario “p” incluido en la ecuacion para un individuo “i”.
• Pgrs : logaritmo de la razon de riesgo que corresponde a un aumento de una unidad en el valor de la puntuacion
de riesgo genetico. El valor de este PGRS es de 0,104 con un intervalo de valores que van desde 0,010 hasta 0,500.
• CRF: valor promedio para el factor de riesgo clasico “p” en la poblacion. Este valor promedio se adaptara a la prevalencia regional o nacional.
• GRS : valor medio de la puntuacion de riesgo genetico en la poblacion.
Tabla C. Lista de factores de riesgo coronario incluidos en el presente modelo inventivo, logaritmo de la razon de riesgo, pcRF , para cada factor de riesgo clasico por sexo, intervalo de los valores promedio para el factor de riesgo
clasico “p” en la poblacion, y tasa de supervivencia media libre de acontecimientos coronarios en la poblacion (S) (intervalo de posibles valores).
CRFp PCRFp para hombres PCRFp para mujeres CRFP
FRAMINGHAM (original o adaptation)
Edad 0,048 0,338 35-74
Edad2 0 -0,003
Colesterol total (mg/dl)
<160 -0,659 -0,261 0-30
160 -<200 0 0 0-30
200 - <240 0,177 0,208 0-30
240 - <280 0,505 0,244 0-30
>280 0,657 0,53 0-30
Colesterol HDL (mg/dl)
<35 0,497 0,843 0-30
35 - <45 0,243 0,378 0-30
45 - <50 0 0,198 0-30
50 - <60 -0,051 0 0-30
>60 -0,487 -0,430 0-30
Tension arterial
Optima -0,002 -0,534 0-30
Normal 0 0 0-30
Lfmite alto 0,283 -0,068 0-30
Hipertension I 0,522 0,263 0-30
Hipertension II 0,619 0,466 0-30
Diabetes 0,428 0,597 0-30
Tabaquismo 0,523 0,292 0-60
PROCAM
Edad 0,103 - 35-74
Colesterol-LDL (mg/dl) 0,013 - 100-250
Colesterol-HDL (mg/dl) -0,032 - 35-65
Trigliceridos (mg/dl) 0,317 - 100-200
Tension arterial sistolica (mmHg) 0,010 - 100-160
Antecedentes familiares de MI 0,382 - 1-45
Diabetes 0,399 - 0-30
QRISK
Log(edad/10) 4,474 3,925 35-74
Colesterol total/Col.- HDL 0,001 0,001 2-10
indice de masa corporal (kg/m2) 0,015 0,022 22-32
Antecedentes familiares de CVD prematura 0,206 0,262 1-45
Tabaquismo 0,425 0,349 0-60
Puntuacion de Townsend de area de salida 0,034 0,017 -3-3
Tension arterial sistolica (mmHg) 0,005 0,004 100-160
Tratamiento para la hipertension 0,550 0,614 0-40
Interaccion con tratamiento de SBP*HTN -0,004 -0,007 ---
Supervivencia media S 0,951 (0,01-9,00) 0,978 (0,01-9,00)
Funcion 1c (vease tambien la reivindicacion 7)
El riesgo cardiovascular se calculara usando las siguientes ecuaciones usando la funcion de riesgo de SCORE: 5
Primera etapa: calcular la combinacion lineal de factores de riesgo
w = Pool * {colester-oli - 6) + fiSpB
* {SBp - \20) + Pfumador * actuali + £
j=
* (SNPj
SNPU)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
donde
colesterolf. nivel de colesterol para el individuo “i” en mmol/l.
f3Coi: logaritmo de la razon de riesgo que corresponde al colesterol (tabla E).
SBPj. tension arterial sistolica para el individuo "i” en mmHg.
Psbp: logaritmo de la razon de riesgo que corresponde a la tension arterial sistolica (tabla E). actualf. estado de tabaquismo actual para el individuo "i” (1: actual, 0: anterior/nunca).
Ptumador. logaritmo de la razon de riesgo que corresponde a la tension arterial sistolica (tabla E).
• ./=!
J
a. ^ funcion sumatoria a lo largo de las J variantes geneticas.
j=i
b. Asm. logaritmo de la razon de riesgo que corresponde a la variante genetica "j”. El posible intervalo de valores de p para cada variante genetica "j” se muestra en la tabla B.
c. SNPj,i. numero de alelos de riesgo (0, 1,2) para una variante genetica espedfica "j” incluidos en la ecuacion para un individuo "i”.
d. SNPj: numero de copias de alelo de riesgo promedio para la variante genetica "j” en la poblacion. Este valor promedio se adaptara a la prevalencia regional o nacional.
Segunda etapa: calcular la supervivencia de nivel inicial.
So(edad) = exp{-exp(a)*(edad - 20)p}
So(edad + 10) = exp{-exp(a)*(edad - 10)p}
donde
• a, p: parametros de forma y escala de la distribution de Weibull. Sus valores se muestran en la tabla F (parametros)
• exp: exponentiation natural
Tercera etapa: calcular la supervivencia en 10 anos S(edad) = {S0(edad)}exp(w)
S(edad + 10) = {S0(edad + 10)}exp(w)
S10(edad) = S(edad + 10) / S(edad)
Cuarta etapa: calcular la probabilidad de padecer el acontecimiento durante el seguimiento de 10 anos. Riesgo10(edad) = 1 - S10(edad)
Quinta etapa: calcular la probabilidad de padecer un acontecimiento cardiovascular durante el seguimiento de 10 anos como la suma del riesgo cardiovascular coronario y no coronario.
CVDRiesgo10 = [CHDRiesgo10(edad)] + [No-CHDRiesgo10(edad)]
Tabla E
5
10
15
20
25
30
35
40
45
CHD CDV No CHD
Fumador actual, Pfumador
0,71 0,63
Colesterol (mmol/l), Pcoi
0,24 0,02
Tension arterial sistolica (mmHg), Psbp
0,018 0,022
CHD: cardiopatia coronaria CVD: enfermedad cardiovascular
Tabla F
CHD CDV No CHD
Pafs
A p A p
Riesgo bajo
Hombres -22,1 4,71 -26,7 5,64
Mujeres -29,8 6,36 -31,0 6,62
Riesgo alto
Hombres -21,0 4,62 -25,7 5,47
Mujeres -28,7 6,23 -30,0 6,42
CHD: cardiopatfa coronaria CVD: enfermedad cardiovascular
Funcion 1d
El riesgo cardiovascular se calculara usando las siguientes ecuaciones usando la funcion de riesgo SCORE: Primera etapa: calcular la combinacion lineal de factores de riesgo
wi = Pool * {colesteroli - 6) + fiSpB * (SBp - U0) + fi^dor * actuali + Pgrs * (aRSi - GRS)
donde
• colesterolf. nivel de colesterol para el individuo “i” en mmol/l.
• Pco: logaritmo de la razon de riesgo que corresponde al colesterol (tabla E).
• SBPf. tension arterial sistolica para el individuo “i” en mmHg.
• Psbp: logaritmo de la razon de riesgo que corresponde a la tension arterial sistolica (tabla E).
• actual,■: estado de tabaquismo actual para el individuo “i” (1: actual, 0: anterior/nunca).
• Pfumador- logaritmo de la razon de riesgo que corresponde a la tension arterial sistolica (tabla E).
• Pgrs- logaritmo de la razon de riesgo que corresponde a un aumento de una unidad en el valor de la puntuacion de riesgo genetico. El valor de este Pgrs es de 0,104 con un intervalo de valores que van desde 0,010 hasta 0,500.
• GRS,■: puntuacion de riesgo genetico para el individuo “i” definida como el numero ponderado de alelos de riesgo
(0, 1, 2) para las variantes geneticas incluidas en la ecuacion para un individuo “i”. Las variantes actualmente
incluidas en la puntuacion de riesgo genetico se muestran en la tabla B. Las ponderaciones son proporcionales a las betas de cada SNP incluido en la puntuacion (mostradas en la tabla B), y el intervalo de la GRS va desde 0 hasta dos veces el numero de SNP incluidos en la puntuacion.
• GRS : valor medio de la puntuacion de riesgo genetico en la poblacion.
Segunda etapa: calcular la supervivencia de nivel inicial.
Sg(edad) = exp{-exp(a)*(edad - 20)p}
S0(edad + 10) = exp{-exp(a)*(edad - 10)p}
donde
• a, p: parametros de forma y escala de la distribucion de Weibull. Sus valores se muestran en la tabla F (parametros)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
• exp: exponenciacion natural
Tercera etapa: calcular la supervivencia en 10 anos
S(edad) = {So(edad)}exp(w)
S(edad + 10) = {S0(edad + 10)}exp(w)
S10(edad) = S(edad + 10) / S(edad)
Cuarta etapa: calcular la probabilidad de padecer el acontecimiento durante el seguimiento de 10 anos. R/esgo-i0(edad) = 1 - S10(edad)
Quinta etapa: calcular la probabilidad de padecer un acontecimiento cardiovascular durante el seguimiento de 10 anos como la suma del riesgo cardiovascular coronario y no coronario.
CVDR/esgo10 = [CHDRiesgow(edad)] + [No-CHDRiesgow(edad)]
Sorprendentemente, la combinacion de marcadores de SNP incluidos en la presente divulgacion y expuestos en la tabla 1 y aquellas combinaciones incluidas en las diferentes realizaciones y usando las funciones descritas en las funciones 1a a 1d anteriormente han demostrado ser capaces de reclasificar a los sujetos clasificados como que tienen riesgo moderado de padecer enfermedad cardiovascular y/o acontecimientos cardiovasculares y/o complicaciones cardiovasculares con una precision mayor que la obtenida usando los factores de riesgo clasicos solos y usando las escalas/funciones en uso hoy en dfa o funciones publicadas incluyendo informacion genetica.
Sorprendentemente, la combinacion de marcadores de SNP incluidos en la presente divulgacion y expuestos en la tabla 1 (figura 2) y aquellas combinaciones incluida en las diferentes realizaciones y usando las funciones descritas en las funciones 1a a 1d anteriormente han demostrado ser capaces de estimar de manera precisa el riesgo de que un sujeto padezca enfermedad cardiovascular y/o acontecimientos cardiovasculares y/o complicaciones cardiovasculares con una precision mayor que la obtenida usando los factores de riesgo clasicos solos y usando las funciones en uso hoy en dfa o funciones publicadas incluyendo informacion genetica.
Sorprendentemente, la combinacion de marcadores de SNP incluidos en la presente divulgacion y expuestos en la tabla 1 (figura 2) y aquellas combinaciones incluidas en las diferentes realizaciones y usando las funciones descritas en las funciones 1a a 1d anteriormente han demostrado obtener una validez mayor y una validacion superior en la prediccion de enfermedad cardiovascular y/o acontecimientos cardiovasculares y/o complicaciones de enfermedad cardiovascular que las obtenidas usando los factores de riesgo clasicos solos y usando las funciones en uso hoy en dfa o funciones publicadas incluyendo informacion genetica. Ademas, tambien se mejoro la reclasificacion.
Mediante el uso de las funciones descritas, se obtiene un riesgo personalizado para el desarrollo de cardiopatfa coronaria y/o acontecimientos cardiovasculares y/o enfermedad cardiovascular, en particular infarto de miocardio, angina de pecho, accidente cerebrovascular, accidente isquemico transitorio, arteriopatia periferica mortales y no mortales o una combinacion de los mismos. Segun la funcion usada FRAMINGHAM (original o adaptada), estudio PROCAM, QRISK y SCORE el riesgo definira a que estrato de riesgo pertenecen los sujetos. El metodo proporcionado actualizara (reclasificara) a aquellos sujetos incorrectamente clasificados con los metodos usados hoy en dfa para calcular el riesgo cardiovascular a un estrato de riesgo mas preciso. Como el tratamiento (preventivo y/o terapeutico) se adapta al nivel de riesgo, la reclasificacion implicara el uso de manera mas eficaz de las medidas preventivas y/o terapeuticas que disminuiran la incidencia y/o recurrencia de enfermedad cardiovascular y complicaciones de enfermedad cardiovascular tales como (pero sin limitarse a) infarto de miocardio, angina de pecho, accidente cerebrovascular, accidente isquemico transitorio, arteriopatfa periferica mortales y no mortales o una combinacion de los mismos.
Ejemplo 1
Se incluyo una cohorte basada en la poblacion prospectiva; la cohorte de REGICOR (Registre Gironi del Cor) originalmente inclrna 4.782 individuos de dos estudios transversales basados en la poblacion realizados en la provincia de Gerona, en el noreste de Espana, en 1995 y 2000 (Grau M, et al. Eur J Cardiovasc Prev Rehabit. 2007; 14:653-659). Esta es una poblacion con baja incidencia de infarto de miocardio y baja mortalidad por CHD (Masia R, et al. J Epidemiol Community Health. 1998; 52:707-715). Se seleccionaron participates con edades comprendidas entre 35 y 74 anos que no teman CVD y teman informacion de ADN y de seguimiento completo disponible para el presente estudio. Este estudio se aprobo por el comite etico local y todos los participates dieron su consentimiento informado por escrito. Todos los sujetos eran de ascendencia europea.
Seleccion de variante genetica, genotipado y generacion de puntuacion de riesgo de multiples loci
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Se seleccionaron 9 variantes geneticas, asociadas con CHD pero no con factores de riesgo clasicos, para generar una GRS de multiples loci tal como se describio anteriormente (Lluis-Ganelia C, et al. Rev Esp Cardiol. 2010; 63:925-933). Se seleccionaron variantes geneticas principalmente del catalogo GWAS del National Human Genome Research Institute (Hindorff LA, et al. Disponible en:
www.genome.gov/26525384) y estaban asociadas con CHD pero no con factores de riesgo cardiovascular segun los datos de este catalogo. Las variantes seleccionadas eran: rs17465637 en MICA3 (Samani NJ, et al. N Engl J Med. 2007; 357:443-453, Myocardial Infarction Genetics Consortium. Nat Genet. 2009; 41:334-341); rs6725887 en WDR12 (Myocardial Infarction Genetics Consortium. Nat Genet. 2009; 41:334-341); rs9818870 en MRAS (Erdmann J, et al. Nat Genet. 2009; 41:280-282); rs12526453 en PHACTR1 (Myocardial Infarction Genetics Consortium. Nat Genet. 2009; 41:334-341); rs1333049 cerca de CDKN2Al2B (Samani NJ, et al. N Engl J Med. 2007; 357:443-453, Myocardial Infarction Genetics Consortium. Nat Genet. 2009; 41:334-341, Helgadottir A, et al. Science. 2007; 316:1491-1493, McPherson R, et al. Science. 2007; 316:1488-1491); rs1746048 cerca de CXCL12 (Samani NJ, et al. N Engl J Med. 2007; 357:443-453, Myocardial Infarction Genetics Consortium. Nat Genet. 2009; 41:334-341); rs9982601 cerca de SCL5A3 (Myocardial Infarction Genetics Consortium. Nat Genet. 2009; 41:334-341); rs10455872 en LPA (Shiftman D, et al. Atherosclerosis. 2010; 212:193-196); y el HaploB (rs10507391, rs9315051, rs17216473, rs17222842) en ALOX5AP (hapB) (Helgadottir A, et al. Nat Genet. 2004;36:233-239).
Se obtuvo una GRS de multiples loci para cada individuo sumando el numero de alelos de riesgo (o haplotipo de riesgo) para cada una de las variantes geneticas. Se pondero esta GRS mediante el tamano de efecto estimado notificado para cada variante en el estudio CARDIoGRAM (CARDIoGRAM Consortium. Circ Cardiovasc Genet. 2010; 3:475-483).
Se obtuvo el ADN de los participates de REGICOR de la capa leucocitaria usando metodos normalizados (servicios L'ARS, Barcelona, Espana) y se genotiparon las muestras usando el chip Cardio inCode (Ferrer inCode, Barcelona, Espana) basandose en las tecnologfas Veracode y KASPar por el Centro Nacional de Investigacion Oncologica (CNIO, Madrid, Espana). El porcentaje global de concordancia del chip con la tecnologfa de referencia es del 99,9% y la sensibilidad analftica y la especificidad es superior al 98,6%. Tambien se obtuvo informacion genotfpica para los participates de Framingham mediante dbGaP para variantes genotipadas (chips Affymetrix 500K y 50K) e imputadas (HapMap CEU liberacion 22, construccion 36, imputado usando MACH version 1.00.15). Se excluyeron individuos con bajas tasas de genotipado correcto o incompatibilidades de sexo antes de la imputacion en esta base de datos. Ademas, se usaron altos niveles de ausencia (p<10-9), desviaciones altamente significativas del equilibrio de Hardy-Weinberg (p<10-6), o errores mendelianos (>100) para determinar que SNP incluir en la etapa de imputacion, y tambien se aplicaron como un criterio de control de calidad para los SNP seleccionados.
Seguimiento y definicion de fenotipo
Se contacto periodicamente por telefono o correo con todos los participates de REGICOR para determinar si hatan presentado cualquier acontecimiento cardiovascular hasta el final de 2007. Se identificaron los acontecimientos mortales de los registros de mortalidad regional y nacional. Se revisaron todos los acontecimientos notificados con historias clmicas de hospital o historias clmicas de atencion primaria. Un comite de acontecimientos clasifico los posibles acontecimientos de CVD tras la revision de todas las historias clmicas y las notas de los medicos usando criterios normalizados (Grau M, et al. Prev Med. 2010; 51:78-84).
En estos analisis se consideraron dos grupos de acontecimientos: a) acontecimientos de CHD incluido infarto de miocardio, angina de pecho, revascularizacion coronaria y muerte debida a CHD; y, b) acontecimientos cardiovasculares incluidos acontecimientos de CHD, mas accidente cerebrovascular aterotrombotico y arteriopatfa periferica.
Se definio el infarto de miocardio basandose en la definicion clasica de la OMS por la presencia de 2 de 3 criterios clmicos: nuevas ondas Q de diagnostico en ECG, molestia toracica isquemica prolongada y elevacion de biomarcadores en suero de necrosis miocardica. Se definio la angina de pecho por la presencia de molestia toracica isquemica con signos de isquemia en el ECG. Se consideraron injertos de revascularizacion coronaria o intervenciones coronarias percutaneas como procedimientos de revascularizacion. Se considero muerte por CHD tras revisar el registro de mortalidad cuando la causa mas probable de muerte era CHD y no podfa asignarse a ninguna otra causa.
Se definio el accidente cerebrovascular aterotrombotico como un deficit neurologico de inicio subito focal no embolico de origen vascular que persistio durante mas de 24 horas o un infarto isquemico que se documento en la autopsia. Se definio la arteriopatfa periferica por la presencia de smtomas de claudicacion y una prueba de diagnostico objetiva tal como un mdice tobillo-brazo patologico (<0,9) o una arteriograffa patologica o procedimiento de revascularizacion.
Estimacion del riesgo cardiovascular en 10 anos
La funcion de riesgo usada en este estudio fue la adaptacion REGICOR validada y calibrada de la funcion de FRAMINGHAM para la prevalencia de factores de riesgo e incidencia de acontecimiento coronario de la poblacion
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espanola (Marrugat J, et al. J Epidemiol Community Health. 2003; 57(8):634-638).
Se midieron todos los factores de riesgo cardiovascular requeridos para las funciones de riesgo usando metodos convencionales. Se considero que los participantes eran diabeticos si se les habfa diagnosticado diabetes o tratado con insulina o agentes hipoglucemicos orales o presentaban una glucemia mayor o igual a 126 mg/dl. Aquellos que notificaron tabaquismo >1 cigarrillo^a en el ano anterior se consideraron fumadores. Se recogieron todas las mediciones de lfpidos y tension arterial de nivel inicial necesarias y se usaron para estimar el riesgo de cada participante.
Analisis estadfstico
Se usaron metodos parametricos y no parametricos clasicos para comparar las caractensticas de diferentes grupos de individuos segun la presencia de un acontecimiento de CDV/cHd durante el seguimiento y dentro de los diferentes quintiles de la puntuacion de riesgo genetico (GRS).
Se sometio a prueba la asociacion entre las variantes geneticas individuales o la GRS de multiples loci y la incidencia de acontecimientos cardiovasculares o coronarios usando modelos de riesgo proporcionales Cox; se considero la GRS como una variable continua o se categorizo segun sus quintiles. Se ajustaron todos los modelos mediante la suma del producto de cada factor de riesgo clasico y se calculo su coeficiente estimado en las funciones de riesgo REGICOR en cada individuo. Se sometio a prueba la hipotesis de riesgos proporcionales usando la funcion cox.zph del paquete survival de R.
Se usaron dos diferentes estadfsticas para evaluar el valor potencial de incluir la GRS en la prediccion de riesgo:
a) para evaluar la bondad de ajuste de los modelos se uso una version de la prueba de Hosmer-Lemeshow que tiene en cuenta la correcta censura de los datos (D'Agostino RB, Nam BH. Handbook of Statistics. 2003; Vol 23:1-25);
b) para evaluar la reclasificacion se calculo la mejora de reclasificacion neta (NRI) (Pencina MJ, et al. Stat Med. 2091; 30:11-21) en toda la muestra y en el subgrupo de individuos que se considero que teman riesgo coronario intermedio segun la funcion de riesgo clasica. Se definieron tres categonas de riesgo (bajo, intermedio y alto) 04,9%, 5,0-14,9%, > 15%, respectivamente. Para calcular el numero de acontecimientos esperados en 10 anos en cada categona de riesgo, se usaron las estimaciones de Kaplan-Meier tal como propusieron Steyerberg y Pencina (Steyerberg EW, Pencina MJ. Ann Intern Med. 2010; 152(3):195-196). Se uso un metodo bootstrap para obtener intervalos de confianza para NRI para tener en cuenta la incertidumbre de las estimaciones de Kaplan- Meier.
Todos los analisis se llevaron a cabo usando el paquete estadfstico R (version 2.11.1).
Resultados
Descripcion de las poblaciones estudiadas
El numero de los participantes incluidos fue de 2.760 de la cohorte de REGICOR. Las caractensticas de los participantes en la cohorte, y mediante presencia de acontecimientos de CVD/ CHD se muestran en la tabla G (figura 3).
La razon de riesgo de acontecimiento de CVD/CHD se presenta para cada factor de riesgo cardiovascular en la tabla H. Como se esperaba, todos factores de riesgo clasicos, excepto el tabaquismo y los antecedentes familiares de CHD, se asociaron con un riesgo aumentado de acontecimientos de CVD y CHD en la cohorte de REGICOR.
Tabla H. Razon de riesgo de factores de riesgo clasicos para acontecimientos cardiovasculares y para acontecimientos coronarios.
Acontecimiento cardiovascular
Acontecimiento coronario
HR [IC del 95%] valor de p HR [IC del 95%] valor de p
Edad (10 anos) 1,94 [1,62-2,32] <0,001 1,98 [1,60-2,45] <0,001
Sexo (hombres) 1,85 [1,28-2,63] <0,001 1,89 [1,22-2,86] 0,002
o
Colesterol total (10 mg/dl) 1,06 [1,02-1,10] 0,005 1,05 [1,01-1,10] 0,027
o
Colesterol-HDL (10 mg/dl) 0,63 [0,54-0,74] <0,001 0,57 [0,47-0,69] <0,001
CD
BP sistolica (10 mmHg) 1,35 [1,25-1,45] <0,001 1,37 [1,25-1,50] <0,001
O'
BP diastolica (10 mmHg) 1,32 [1,13-1,55] 0,001 1,39 [1,16-1,69] 0,001
Diabetes 2,11 [1,41-3,14] <0,001 2,70 [1,72-4,23] <0,001
Fumador 1,10 [0,73-1,65] 0,638 1,23 [0,77-1,97] 0,383
Antecedentes familiares de CVD* 1,35 [0,86-2,14] 0,191 1,47 [0,86-2,49] 0,160
Riesgo coronariof__________________1,13 [1,11-1,16] <0,001______1,14 [1,12-1,17] <0,001
* CVD: Enfermedad cardiovascular.
f Se calculo el riesgo coronario usando la funcion calibrada de Framingham para la cohorte de REGICOR.
Las caractensticas de los participates dentro de cada quintil de la GRS se muestran en la tabla I. La puntuacion no se asocio con ninguno de los factores de riesgo clasicos incluidos en la funcion de riesgo calibrada de Framingham, excepto para los antecedentes familiares de CHD.
5
Tabla I. Descripcion de las caractensticas de los participates a traves de los quintiles de puntuacion de riesgo genetico.
a.
O
o
CD
LU
a.
Variables
N
Edad (anos)*
Sexo (hombres)f Colesterol total (10 mg/dl)* Colesterol-HDL (10 mg/dl)* SBP (mmHg)*
DBP (mmHg)*
Diabetesf
Tabaquismof
Antecedentes familiares de CHDf
Riesgo coronariof
Incidencia de acontecimientos cardiovasculares §
Incidencia de
acontecimientos coronarios§
Quintiles de puntuacion genetica
Q1
Q2 Q3 Q4 Q5 valor tendencia
de p
de p
552
544 582 582 510
54,0
53,2 54,2 54,1 53,9 0,550 0,645
(11,2)
(11,0) (11,1) (11,3) (11,1)
266
269 252 285 255 0,463 0,521
(48,2)
(48,6) (44,8) (49,0) (50,0)
222
227 227 230 224 0,048 0,189
(44,1)
(42,1) (41,8) (43,2) (42,0)
51
52 53 51 51 0,031 0,633
(12,5)
(13,1) (14,3) (12,9) (13,5)
133
131 133 133 132 0,539 0,696
(22,0)
(20,0) (20,2) (22,0) (19,4)
79
79
79
80 80 0,581 0,101
(10,4)
(10,8) (10,0) (10,4) (10,0)
70
79 90 83 62 0,357 0,831
(13,0)
(14,6) (16,4) (14,6) (12,4)
115
121 124 135 121 0,775 0,124
(21,2)
(21,9) (22,2) (23,5) (24,2)
45 (8,2)
61 (11,2) 76 (13,5) 74 (12,8) 68 (13,5) 0,033 0,001
3,4 (1,8-
3,2 (1,6- 3,6 (1,7- 3,5 (1,8- 3,4 (1,9- 0,427 0,312
6,5)
5,7) 6,5) 6,6) 6,1)
6,41
8,12 5,16 8,46 7,90 0,068 0,027
4,38
5,69 3,34 6,20 7,52 0,088 0,034
HDL: lipoprotema de alta densidad; SBP: tension arterial sistolica; DBP: tension arterial diastolica; CHD: cardiopatfa coronaria.
* media (desviacion estandar); f n (proporcion, %); f media (intervalo de confianza del 95%); § numero de casos/100 individuos en 10 anos.
10 La GRS ajustada para riesgo coronario mostro una asociacion estadfsticamente significativa con incidencia de CHD y CVD cuando se considero como una variable continua (tabla J). Se observo una asociacion lineal con un aumento de acontecimientos de CVD y CHD del 12% (IC del 95%: 1%; 24%) y de 15% (IC del 95%: 2%; 30%) por unidad de la GRS, respectivamente (tabla J). Esta asociacion permanecio estadfsticamente significativa con ajuste adicional para antecedentes familiares de CHD. Los participates en el quintil superior de GRS teman riesgo de CVD y CHD 15 aumentado 1,71 veces y 1,81 veces, respectivamente, en comparacion con el quintil inferior (valor de p para tendencia lineal <0,025 y 0,039) (tabla J).
Tabla J. Asociacion ajustada de multiples variables de la puntuacion de riesgo genetico con acontecimientos cardiovasculares y coronarios como una variable lineal y a traves de quintiles.
Puntuacion de riesgo genetico REGICOR
HR [IC del 95%] Valor de p
Acontecimientos cardiovasculares
Lineal 1,12 [1,01-1,24] 0,038
Quintiles Q1
Tendencia de p 1 0,025
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Q2 1,26 [0,69-2,30] 0,450
Q3 0,84 [0,44-1,57] 0,575
Q4 1,59 [0,92-2,78] 0,099
Q5 1,71 [0,97-3,03] 0,006
Lineal 1,15 [1,02-1,30] 0,027
Quintiles Tendencia de p 0,039
Acontecimientos
Q1 1 ---
coronarios
Q2 Q3 1,11 [0,54-2,28] 0,72 [0,34-1,54] 0,774 0,398
Q4 1,45 [0,76-2,79] 0,263
Q5 1,81 [0,94-3,48] 0,074
Se ajustaron todos los modelos mediante la suma del producto de cada factor de riesgo clasico y su coeficiente estimado en la funcion de riesgo REGICOR calibrada de Framingham. * HR [IC del 95%]: Razon de riesgo [intervalo de confianza del 95%].
En la figura 1 se presenta la distribucion de la puntuacion de riesgo genetico en participates de REGICOR segun la incidencia de acontecimientos cardiovasculares (a) y coronarios (b) durante el seguimiento. La puntuacion de riesgo genetico se representa en el eje de ordenadas (eje X) y se calcula como una suma acumulativa de todos los alelos de riesgo que porta una persona, ponderados mediante el efecto de cada SNP, y que teoricamente oscilan entre 0 y 18 copias.
La prueba de bondad de ajuste para los modelos para CHD mediante la prueba de Hosmer-Lemeshow indico que la calibracion era buena en la cohorte de REGICOR con y sin GRS (x2=4,39; valor de p=0,222 y x2=5,58; valor de p=0,232, respectivamente).
Analisis de mejora de prediccion de riesgo
La tabla K muestra la reclasificacion de riesgo lograda con la inclusion de GRS en la funcion de riesgo de Framingham para acontecimientos de CVD y CHD. Cuando se considero el subgrupo de riesgo intermedio, la NRI aumento en ambas cohortes y para ambos resultados. En el metanalisis, la NRI fue 10,32 [IC del 95%: 2,48; 18,17] y de 14,36 [IC del 95%: 5,14; 24,12] para acontecimientos de CVD y CHD para el grupo de riesgo intermedio, respectivamente. Los resultados de una GRS con los 4 SNP mas informativos (rs6725887, rs9818870, rs1333049 y haplotipo de LPA [rs3798220 y rs10455872]) fueron similares y se describen en la tabla L.
Tabla K. Reclasificacion de individuos basada en el riesgo de cardiopatfa coronaria previsto para 10 anos con y sin la puntuacion de riesgo genetico. Las categonas de riesgo se definieron usando recomendaciones nacionales. En REGICOR, los puntos de corte para riesgo bajo, intermedio y alto eran del 0-4,9%, 5-14,9% y >15%.
REGICOR
(/) (/) O CD ' s— £= 03
.9> 3
F ° E co O 03 (D > c ° o "2 y ro < o
Funcion clasica Casos Riesgo bajo Riesgo intermedio Riesgo alto
No casos Riesgo bajo Riesgo intermedio Riesgo alto
Funcion clasica + Puntuacion de riesgo genetico Riesgo bajo Riesgo intermedio Riesgo alto
imagen2
1669
imagen3
Funcion clasica + Puntuacion de riesgo genetico
</)
o
H—'
c
CD
o 0 H—'
c
o
o
<
Funcion clasica Casos Riesgo bajo Riesgo intermedio Riesgo alto
No casos Riesgo bajo Riesgo intermedio Riesgo alto______
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0
68
6
0 0
16
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642
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0
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25
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____________________________________________________________________Riesgo intermedio___________
NR| Acontecimiento cardiovascular 10,66 [3,90;17,43]
_______________________Acontecimiento coronario________________________14,52 [5,27;23,78]___________
Tabla L. Reclasificacion de individuos basada en el riesgo de cardiopatia coronaria previsto en 10 anos con y sin la puntuacion de riesgo genetico. Se definieron las categonas de riesgo usando recomendaciones nacionales. En REGICOR, los puntos de corte para riesgo bajo, intermedio y alto eran del 0-4,9%, 5-9,99%, 10-14,99 % y >15%.
Mas puntuacion genetica
Coronaria Vascular
Solo clasico
<=0,05 (0,05, 0,10] (0,10, 0,15] >0,15 <=0,05 (0,05, 0,10] (0,10, 0,15] >0,15
Casos (-Inf,0,05]
43,3 5,7 0,0 0,0 61,0 9,3 0,0 0,0
(0,05,0,10]
1,4 38,4 8,1 0,0 0,4 52,7 10,4 0,0
(0,10,0,15]
0,0 3,6 18,3 5,8 0,0 5,7 21,4 5,3
(0,15, Inf] Controles
0,0 0,0 0,0 16,3 0,0 0,0 5,5 19,7
(-Inf,0,05]
1695,0 89,3 0,0 0,0 1698,1 64,9 0,0 0,0
(0,05,0,10]
92,3 468,0 55,8 1,0 77,3 484,3 39,8 0,0
(0,10,0,15]
0,0 34,2 103,7 20,7 0,0 25,6 113,0 15,3
(0,15, Inf]
0,0 0,0 27,6 59,5 0,0 0,0 19,5 58,6
NRI
Coronaria Vascular
TODOS
9,95 [1,02;18,89] 18,22 [3,71;32,72]
Riesgo moderado (10-20%)
7,10 [-1,98;16,18] 16,37 [3,17;29,57]
Discusion
Siguiendo la declaracion de la AHA para la evaluacion del valor de marcadores de riesgo nuevos (Hlatky MA, et al. Circulation. 2009; 119:2408-2416), se ha validado la asociacion entre una GRS de multiples loci y la incidencia de acontecimientos de CVD y CHD en una cohorte basada en la poblacion prospectiva. Ademas, tambien se ha mostrado la capacidad de esta GRS cuando se anade a la funcion de riesgo calibrada de Framingham para mejorar la prediccion de acontecimientos de CVD y CHD, particularmente en aquellos individuos con riesgo intermedio.
Validacion prospectiva de la asociacion entre una puntuacion de riesgo genetico de multiples loci nueva y acontecimientos de CVD o CHD
Se notifica que una GRS de multiples loci, compuesta por variantes geneticas principalmente identificadas mediante GWAS y no relacionadas con factores de riesgo cardiovascular clasicos, esta lineal y directamente asociada con la incidencia de acontecimientos de CVD y CHD en la cohorte de REGICOR. Tambien se confirma que los tamanos de efecto para estas variantes son de aproximadamente el 10% de riesgo aumentado para CVD y CHD por unidad de la GRS y que eran independientes de los antecedentes familiares de CHD.
Este tamano de efecto es mas pequeno que el notificado en estudios de descubrimiento de casos-controles, lo que probablemente se debe a la tendencia de los estudios de casos-controles de sobreestimar el tamano real del efecto de las asociaciones notificadas. Esta sobreestimacion tambien podna explicarse por el efecto de la “maldicion del ganador” de los estudios de descubrimiento, o la inclusion de una definicion extrema de casos y controles en estos estudios.
De manera similar a los factores de riesgo de CVD clasicos (D'Agostino RB, et al. JAMA. 2001; 286(2):180-187), el tamano del efecto de la GRS parece ser comparable a traves de poblaciones con diferente riesgo absoluto. Ademas, este tamano de efecto es similar al de algunos factores de riesgo cardiovascular clasicos (Wilson PW, et al. Circulation. 1998; 97(18):1837-1847).
Los resultados son mejores que los notificados por Paynter et al en una cohorte prospectiva de 19.313 mujeres blancas inicialmente sanas en el Women's Genome Health Study (estudio de salud del genoma de la mujer (Paynter NP, et al. JAMA. 2010; 303:631-637). En ese estudio, los autores obtuvieron una GRS de multiples loci con 11 SNP asociados con CHD en GWAS, que no se asocio con la incidencia de CVD.
Valor incremental de la puntuacion de riesgo genetico para la prediccion de riesgo de CVD y CHD
El estudio es distintivo en el sentido de que solo se incluyo en la GRS aquellas variantes que eran independientes de factores de riesgo clasicos con el fin de incorporar informacion complementaria a la ya incluida en las funciones de riesgo (Thanassoulis G, et al. Circulation. 2010; 122:2323-2334). La inclusion de la GRS en las funciones de riesgo
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clasicas mejoro la clasificacion de los individuos en las diferentes categonas de riesgo, especialmente en aquellos individuos con riesgo intermedio.
La evaluacion de la mejora de los modelos predictivos debe considerar metricas de reclasificacion de riesgo tales como NRI.
Desde una perspectiva clmica, la baja sensibilidad de las funciones de riesgo ya se ha documentado de tal manera que el 50% de los acontecimientos de CHD se producen en la poblacion con riesgo coronario intermedio (Marrugat J, et al. J Epidemiol Community Health. 2007; 61:40-47). Por tanto, el grupo de riesgo intermedio puede beneficiarse el que mas de pruebas orientadas a estratificar el riesgo de CHD de manera mas precisa. Esto ayudara a seleccionar la poblacion objeto para medidas preventivas mas agresivas. En el estudio se observo que la GRS mejoro la clasificacion de individuos principalmente en las categonas de riesgo intermedio.
De acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio, la consideracion responsable en la practica clmica de la informacion proporcionada por la puntuacion de riesgo genetico podna ser:
Primero, identificar pacientes de riesgo cardiovascular alto. Estan disponibles diversas directrices para la prevencion primaria de enfermedad cardiovascular. Si cada persona pudiese recibir la terapia de prevencion para la que es candidata, los infartos de miocardio podnan reducirse en > 60%, los accidentes cerebrovasculares podnan reducirse en un 30% y la esperanza de la vida de cualquiera podna aumentarse en un promedio de 1,3 anos y con una calidad de vida mayor de la realmente experimentada, (Circulation 2008; 118:576). Segun el trabajo realizado por Vancheri F et al (Eur J Inter Med 2009; 20:601-606), en la practica clmica, una gran proporcion de medicos que lidian con prevencion cardiovascular primaria clasifican de manera insuficiente el nivel de riesgo de sus pacientes. Ademas, cuando se analizo la decision de comenzar el tratamiento farmacologico, en algunos casos se inicio el tratamiento en pacientes de riesgo alto (FRS >20%) mientras que en otros se inicio con FRS <20% resultando influida la decision por factores no directamente relacionados con el riesgo del paciente individual. Se cree firmemente que debe usarse el poder de reclasificacion de la puntuacion de riesgo genetico para identificar pacientes ubicados en el estado de riesgo moderado mediante las funciones de riesgo clasicas que debenan asignarse en el estado de riesgo alto y para los cuales debenan implementarse medidas preventivas. Especialmente cuando la mayona de los infartos de miocardio se producen en pacientes que se habfan clasificados previamente como de riesgo moderado. Por esta razon son muy alentadores los excelentes resultados de reclasificacion obtenidos con la puntuaciones de riesgo genetico de cuatro SNP en los pacientes de riesgo moderado-alto.
Segundo, comparar el riesgo cardiovascular sin y con la puntuacion de riesgo genetico. Se trata de un concepto similar al riesgo relativo promulgado por las directivas europeas sobre enfermedad cardiovascular (Eur J Cardiovas Prev Reha 2007; 14 (Supl 2):e1-e40). A pesar del valor de su riesgo absoluto, considerando los marcadores de riesgo genetico este valor podna ser significativamente mas alto. Esto es especialmente util, aunque no exclusivamente, para personas jovenes o cuando el desarrollo completo de los factores de riesgo clasicos no esta aun presente o cuando el riesgo no asociado con los factores de riesgo clasicos es muy relevante. En la misma lmea, se ha sugerido que funciones en 10 anos pueden subestimar la verdadera carga de riesgo, particularmente en individuos mas jovenes destacando la necesidad de modelos de prediccion de riesgo cardiovascular a largo plazo. Estos modelos a largo plazo tambien son valiosos para fines educativos ya que pueden usarse para ensenar a los pacientes como pueden modificarse sus riesgos si cumplen los objetivos del tratamiento. Es util destacar la gran utilidad de las puntuaciones geneticas en este campo. La puntuacion de riesgo genetico confirio un riesgo comparable a otros factores de riesgo establecidos tales como colesterol-LDL en plasma o tension arterial sistolica.
Tercero, adaptar la intensidad del tratamiento o los objetivos de tratamiento al nivel de riesgo. La intensidad de cualquier accion contra los factores de riesgo debe ajustarse a la gravedad del riesgo. La reclasificacion de los pacientes a riesgo moderado podna ayudar al medico a establecer tanto la intensidad como los objetivos del tratamiento.
Cuarto, mejorar el cumplimiento del tratamiento. En promedio, de una septima parte a la mitad de los pacientes no cumplen las pautas de tratamiento recetadas (Munger MA, et al. MedGenMed 2007; 9:58, Gamer JB Am J Cardiol 2010; 105:1495-1501). El conocimiento de una enfermedad basada en genetica ha demostrado aumentar el cumplimiento con los medicamentos (Umans-Eckenhausen MA, et al. Lancet 2001; 357:165-168). Las puntuaciones del riesgo genetico podnan usarse para el cumplimiento del tratamiento.
Conclusiones
Una puntuacion de riesgo genetico (GRS) de multiples loci basada en variantes geneticas no relacionadas con factores de riesgo cardiovascular clasicos esta directa y linealmente asociada con el riesgo de acontecimientos de CVD en dos poblaciones diferentes. Esta puntuacion genetica se ha validado y se ha documentado el valor incremental cuando se anade a marcadores de riesgo convencionales usando las cohortes de Regicor y Framingham. Estos resultados destacan el valor de esta puntuacion de riesgo genetico validada con respecto a otros marcadores geneticos publicados hasta ahora.

Claims (2)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    REIVINDICACIONES
    Metodo para una evaluation del riesgo cardiovascular en un sujeto, que comprende las etapas de determinar en una muestra aislada de dicho sujeto la presencia de polimorfismos en las posiciones 27 dentro de cada una de las secuencias de acido nucleico de SEQ ID NO: 1 a 12, en el que la presencia en la position 27 de C en SEQ ID NO: 1, C en SEQ ID NO: 2, T en SEQ ID NO: 3, C en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, C en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, G en SEQ ID NO: 8, A en SEQ ID NO: 9, A en SEQ ID NO: 10, A en SEQ ID NO: 1, y G en SEQ ID NO: 12, constituyendo las cuatro ultimas el haplotipo B de ALOX5AP, es indicativa de un riesgo de padecer un acontecimiento cardiovascular, en el que el acontecimiento cardiovascular se selecciona del grupo de infarto de miocardio, accidente cerebrovascular aterotrombotico, angina de pecho, revascularization coronaria debida a cardiopatfa coronaria y arteriopatfa periferica mortales o no mortales.
    Metodo de determination de la probabilidad de que un individuo presente un infarto de miocardio o angina de pecho mortal o no mortal en un periodo de 10 anos basandose en la presencia de 1 a P factores de riesgo clasicos y 1 a J polimorfismos en las posiciones 27 en las secuencias de nucleotidos de cada una de SEQ ID NO: 1 a 12, en el que se determina la presencia en la posicion 27 en cada una de SEQ ID NO: 1 a 12, en el que el alelo de riesgo en la posicion 27 es C en SEQ ID NO: 1, C en SEQ ID NO: 2, T en SEQ ID NO: 3, C en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, C en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, G en SEQ ID NO: 8, A en SEQ ID NO: 9, A en SEQ ID NO: 10, A en SEQ ID NO: 11 y G en SEQ ID NO: 12, constituyendo las cuatro ultimas el haplotipo B de ALOX5AP, y en el que se calcula la probabilidad usando la formula:
    imagen1
    en la que,
    - S es la supervivencia media libre de acontecimientos coronarios en la poblacion,
    imagen2
    p=1
    es la funcion sumatoria a lo largo de los P factores de riesgo clasicos,
    - PCm? es el logaritmo de la razon de riesgo que corresponde al factor de riesgo coronario clasico “p” que se muestra en la tabla A,
    - CRFp,i es el valor de cada factor de riesgo coronario “p” incluido en la ecuacion para un individuo “i”,
    - J es la funcion sumatoria a lo largo de las J variantes geneticas,
    j=1
    - Psnp es el logaritmo de la razon de riesgo que corresponde a la variante genetica “j” tal como se muestra en la tabla B,
    - SNPj i es el numero de alelos de riesgo (0, 1,2) para una variante genetica espedfica “j” incluidos en la ecuacion para un individuo “i”,
    - CRFp es el valor promedio para el factor de riesgo clasico “p” en la poblacion,
    - SNPj es el numero de copias de alelo de riesgo promedio para la variante genetica “j” en la poblacion.
    Metodo de determinacion de la probabilidad de que un individuo presente un infarto de miocardio o angina de pecho mortal o no mortal en un periodo de 10 anos basandose en la presencia de 1 a P factores de riesgo clasicos diferentes y 1 a Q variantes geneticas diferentes en el que dicha variante genetica es un polimorfismo que se determina en las posiciones 27 en todas las secuencias de nucleotidos de cada una de SEQ ID NO: 1 a 12, en el que el alelo de riesgo en la posicion 27 es C en SEQ ID NO: 1, C en SEQ ID NO: 2, T en SEQ ID NO: 3, C en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, C en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, G en SEQ ID NO: 8, A en SEQ ID NO: 9, A en SEQ ID NO: 10, A en SEQ ID NO: 11 y G en SEQ ID NO: 12, constituyendo las cuatro ultimas el haplotipo B de ALOX5AP, y en el que se calcula la probabilidad usando la formula:
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    exp
    1-S
    £ PcRFn *CRFpi+pGRs’,'ORSj-X PcRFp*CRFp-Pgrs*GRS
    p=i r p=i v
    en la que
    S : supervivencia media libre de acontecimientos coronarios en la poblacion, exp: exponenciacion natural,
    X^cRFp * CRFpi: donde
    p=1 P
    ^ funcion sumatoria a lo largo de los P factores de riesgo clasicos de la tabla C,
    r logaritmo de la razon de riesgo que corresponde al factor de riesgo coronario clasico “p”, los valores
    /-XRFp
    de R para cada factor de riesgo coronario “p” se muestran en la tabla C,
    CRFpj: valor de cada factor de riesgo coronario “p” incluido en la ecuacion para un individuo “i”,
    Rgrs: logaritmo de la razon de riesgo que corresponde a un aumento de una unidad en el valor de la puntuacion de riesgo genetico, el valor de este Rgrs es de 0,104 con un intervalo de valores que van desde 0,010 hasta 0,500,
    CRFp: valor promedio para el factor de riesgo clasico “p” en la poblacion,
    GRS : valor medio de la puntuacion de riesgo genetico en la poblacion.
    Metodo de determinacion de la probabilidad de que un individuo presente un infarto de miocardio o angina de pecho mortal o no mortal en un periodo de 10 anos basandose en la presencia de factores de riesgo clasicos diferentes y 1 a Q variantes geneticas diferentes en el que dicha variante genetica es un polimorfismo que se determina en las posiciones 27 en todas las secuencias de nucleotidos de cada una de SEQ ID NO: 1 a 12, en el que el alelo de riesgo en la posicion 27 es C en SEQ ID NO: 1, C en SEQ ID NO: 2, T en SEQ ID NO: 3, C en SEQ ID NO: 4, C en SEQ ID NO: 5, C en SEQ ID NO: 6, T en SEQ ID NO: 7, G en SEQ ID NO: 8, A en SEQ ID NO: 9, A en SEQ ID NO: 10, A en SEQ ID NO: 11 y G en SEQ ID NO: 12, constituyendo las cuatro ultimas el haplotipo B de ALOX5AP, y en el que se calcula la probabilidad usando las etapas de:
    (i) calcular la combinacion lineal de factores de riesgo Wi usando la funcion
    wi = Rcoi * {colimteroli - 6) + RSPB * {SBpi -Uty + R^or * actualt + £ rSNFj
    j=i
    * {SNp
    snpu )
    en la que
    colesterolf. nivel de colesterol para el individuo “i” en mmol/l,
    Rcoi- logaritmo de la razon de riesgo que corresponde al colesterol (tabla E),
    SBPf. tension arterial sistolica para el individuo “i” en mmHg,
    Rsbp: logaritmo de la razon de riesgo que corresponde a la tension arterial sistolica (tabla E), actual: estado de tabaquismo actual para el individuo “i” (1: actual, 0: anterior/nunca),
    Pfumador- logaritmo de la razon de riesgo que corresponde a la tension arterial sistolica (tabla E),
    XRsnpj*{SNPu- SNPi j): j = 1
    5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    j
    ^ funcion sumatoria a lo largo de las J variantes geneticas,
    j=1
    fls^ logaritmo de la razon de riesgo que corresponde a la variante genetica “j”, el posible intervalo de valores de p para cada variante genetica “j” se muestra en la tabla B,
    SNPjj: numero de alelos de riesgo (0, 1, 2) para una variante genetica espedfica “j” incluidos en la ecuacion para un individuo “i”,
    SNp : numero de copias de alelo de riesgo promedio para la variante genetica “j” en la poblacion,
    (ii) calcular la supervivencia de nivel inicial So para una edad dada usando la funcion So(edad) = exp{-exp(a)*(edad - 20)p}
    So(edad + 10) = exp{-exp(a)*(edad - 10)p} en la que
    a, p: parametros de forma y escala de la distribucion de Weibull en la que sus valores se muestran en la tabla F (parametros)
    exp: exponenciacion natural,
    (iii) calcular la supervivencia en 10 anos Si0(edad) usando la funcion S(edad) = {S0(edad)}exp(w)
    S(edad + 10) = {S0(edad + i0)}exp(w)
    Si0(edad) = S(edad + 10) / S(edad)
    (iv) calcular la probabilidad de padecer el acontecimiento durante el seguimiento de 10 anos Riesgov0(edad) usando la funcion,
    Riesgov0(edad) = 1 - S10 (edad) y
    (v) calcular la probabilidad de padecer un acontecimiento cardiovascular durante el seguimiento de 10 anos como la suma del riesgo cardiovascular coronario y no coronario usando la funcion
    CVDRiesgo10 = [CHDRiesgo^(edad)] + [No-CHDRiesgo^(edad)]
    Metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas determinar uno o mas factor(es) de riesgo de enfermedad o trastorno cardiovascular seleccionado(s) del grupo que consiste en edad, raza, sexo, mdice de masa corporal, tension arterial, estado de tabaquismo, nivel de colesterol-lipoprotemas de baja densidad (LDL) o -lipoprotemas de alta densidad (HDL), tension arterial sistolica, tension arterial diastolica, antecedentes de insuficiencia cardfaca, diabetes, insuficiencia renal, hipertrofia ventricular izquierda, antecedentes de consumo de alcohol, antecedentes de tabaquismo, antecedentes de ejercicio, dieta y antecedentes familiares de enfermedad o trastorno cardiovascular.
    Metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la muestra es una muestra de tejido oral, raspado, o lavado, o una muestra de lfquido biologico, preferiblemente saliva, orina o sangre.
    Metodo segun una cualquiera o mas de las reivindicaciones 1 a 6, en el que la presencia o ausencia del polinucleotido se identifica mediante la amplificacion o no amplificacion de un producto de amplificacion a partir de la muestra, en el que el producto de amplificacion se digiere preferiblemente con una enzima de restriccion antes del analisis y/o en el que el SNP se identifica hibridando la muestra de acido nucleico con un marcador de cebador que es un resto detectable.
    Programa informatico adaptado para llevar a cabo el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7
    o medio legible por ordenador que contiene medios para llevar a cabo un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.
  2. 9. Kit que consiste en reactivos para detectar la identidad del nucleotido en la posicion 27 dentro de una 5 secuencia de acido nucleico seleccionada del grupo de SEQ ID NO: 1 a 12, en el que los reactivos
    consisten en todos aquellos pares de cebadores espedficos para la amplificacion de una region que comprende al menos la posicion 27 dentro de cada una de las secuencias de acido nucleico de SEQ ID NO: 1 a 12.
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