ES2573229T3 - Inhibidores de proteasas de cisteína - Google Patents
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Abstract
Un compuesto de Fórmula II:**Fórmula** en donde R2 es la cadena lateral de leucina, isoleucina, ciclohexilglicina, O-metil treonina, 4-fluoroleucina o 3- metoxivalina; R3 es H, metilo o F; Rq es CF3 con la estereoquímica indicada y Rq' es H; o Rq y Rq' definen conjuntamente ceto; Q es en donde R4 es alquilo C1-C6; R5 es H, metilo o F; R6 es alquilo C1-C6; o una sal farmacéuticamente aceptable, un hidrato o un N-óxido del mismo.
Description
DESCRIPCION
Inhibidores de proteasas de cistema Campo de la invencion
Esta invencion se refiere a inhibidores de proteasas de cistema, especialmente a las de la superfamilia de la papaf- 5 na. La invencion proporciona compuestos novedosos utiles en la profilaxis o el tratamiento de trastornos que provie- nen de un desequilibrio de proteasas fisiologicas, tales como catepsina K.
Descripcion de la tecnica relacionada
La superfamilia de la papama de proteasas de cistema esta ampliamente distribuida en diversas especies que inclu- yen mairnferos, invertebrados, protozoos, plantas y bacterias. Numerosas enzimas catepsinas de mai^ero, que 10 incluyen las catepsinas B, F, H, K, L, O y S, se han incluido en esta superfamilia, y la regulacion inapropiada de su actividad se ha implicado en una variedad de trastornos metabolicos incluyendo artritis, distrofia muscular, inflama- cion, glomerulonefritis e invasion tumoral. Enzimas patogenas similares a la catepsina incluyen las gingipamas bac- terianas, las falcipamas de la malaria I, II, III y siguientes, y las proteasas de cistema de Pneumocystis carinii, Trypanosoma cruzei y brucei, Crithidia fusiculata, Schistosoma spp.
15 Una regulacion inapropiada de la catepsina K se ha implicado en varios trastornos que incluyen la osteoporosis, enfermedades gingivales tales como gingivitis y periodontitis, enfermedad de Paget, hipercalcemia por enfermedad maligna y osteopatfa metabolica. Debido a sus niveles elevados en los condroclastos de la membrana sinovial os- teoartntica, la catepsina K esta implicada en enfermedades caracterizadas por una degradacion excesiva del cartfla- go o la matriz, tales como osteoartritis y artritis reumatoide.
20 Es posible que el tratamiento de trastornos de los huesos y del cartflago, tales como osteoartritis y osteoporosis requiera una administracion durante toda la vida de un inhibidor de la catepsina K, frecuentemente a una poblacion de pacientes en fase geriatrica o cercana a la misma. Esto supone requisitos inusualmente elevados para facilitar la administracion de los farmacos destinados a tales trastornos. Por ejemplo, estan en marcha intentos de extender los regfmenes de dosificacion de los farmacos actuales contra la osteoporosis, de la clase bifosfonato, a regfmenes de 25 administracion semanales o mas extensos para ayudar a seguir el tratamiento. Sin embargo, incluso con una dosifi- cacion mejorada, siguen existiendo otros efectos secundarios de los bisfosfonatos. Los bisfosfonatos bloquean la renovacion osea en vez de atenuarla como hace un inhibidor de la catepsina K. Para tener los huesos sanos, es importante mantener el proceso de remodelacion que los bisfosfonatos bloquean completamente. Ademas, los bisfosfonatos tienen una semivida muy larga en el hueso, de modo que si se manifiestan efectos tales como osteone- 30 crosis de la mandfbula, es imposible eliminar el bisfosfonato del hueso. Por el contrario, los inhibidores de la catepsina K tienen normalmente un modo de accion de asociacion y disociacion rapidos, lo que significa que si se debe identificar un problema, se podna detener la dosificacion y no habna acumulacion del inhibidor en la matriz osea.
Por tanto, se desean farmacos alternativos contra la osteoporosis y la osteoartritis con propiedades farmacocineticas y/o farmacodinamicas superiores.
35 En la solicitud de patente internacional n° WO02/057270 se describen compuestos de formula IA:
en donde UVWXY corresponde ampliamente a P3 y P2 (estas expresiones se explican a continuacion) de inhibidores de dipeptidos de proteasas de cistema, Z es entre otros O, S, metileno o - NR-, R'i es alquilo, alquilarilo, etc. y Pi y Q son cada uno, entre otros, metileno. Aunque la descripcion generica en esta solicitud de patente postula una 40 gama muy amplia de sustituyentes en Pi y Q, ninguno esta individualizado o ejemplificado y no se facilita ninguna orientacion sobre su smtesis. De hecho - las unicas sugerencias de smtesis proporcionadas en el documento WO02/05720 no permiten en absoluto una sustitucion en Pi o Q. Se supone que los compuestos son utiles, entre otras cosas, para el tratamiento de infecciones por protozoos tales como tripanosomas.
El Ejemplo 9 del documento de solicitud de patente internacional n° WO2005/066180 da a conocer, entre otras co- 45 sas, un compuesto de formula IB:
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15
El compuesto es un inhibidor activo de la catepsina K, pero, como se muestra a continuacion, la modificacion adicio- nal de la estructura produce mejoras en lo referente a la farmacocinetica y/o la farmacodinamia, en particular una estabilidad mejorada en sangre completa y, por lo tanto, una mejor exposicion.
El documento WO2008/007127, que no se habfa publicado en la fecha de prioridad de la presente solicitud, describe compuestos de formula IC:
que se describen como inhibidores de proteasas de cistema, en particular, inhibidores de la catepsina K. Breve descripcion de la invencion
De acuerdo con la presente invencion, se proporciona un compuesto de Formula II:
en donde
R2 es la cadena lateral de leucina, isoleucina, ciclohexilglicina, O-metil treonina, 4-fluoroleucina o 3- metoxivalina;
R3 es H, metilo o F;
Rq es CF3 con la estereoqmmica indicada y Rq' es H; o Rq y Rq' definen conjuntamente ceto;
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en donde
R4 es alquilo C1-C6;
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R5 es H, metilo o F;
R6 es alquilo C1-C6;
o una sal farmaceuticamente aceptable, un hidrato o un N-oxido del mismo.
De acuerdo con un aspecto de la invencion, se proporcionan compuestos enantiomeros de formula:
en donde
R2 es la cadena lateral de leucina, isoleucina, ciclohexilglicina, O-metil treonina, 4-fluoroleucina o 3- metoxivalina;
R3 es H, metilo o F;
R4 es alquilo C1-C6, preferiblemente metilo;
R5 es H, metilo o F;
o una sal farmaceuticamente aceptable, un N-oxido o un hidrato de los mismos.
Una realizacion alternativa de la invencion comprende compuestos o sales farmaceuticamente aceptables, N-oxidos o hidratos de compuestos de formula IIb
en donde R2 y R3 son como se han definido anteriormente y Q es el resto N-alquil-piperazinil-tiazolilo definido en la formula IIa o el resto 4-(alquil C1-C4)sulfonilfenilo, tal y como se describe en el documento WO 07/006716, por ejem- plo un compuesto de formula:
La expresion "alquilo C1-C6" significa una cadena de alquilo que tiene entre uno y seis atomos de carbono (por ejemplo, un grupo alquilo C1-4, o un grupo alquilo C1-3). Los grupos alquilo pueden ser de cadena lineal o ramificada. Los grupos alquilo C1-6 adecuados incluyen, por ejemplo, metilo, etilo, propilo (por ejemplo, n-propilo e isopropilo), butilo (por ejemplo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo y terc-butilo), pentilo (por ejemplo, n-pentilo) y hexilo (por ejemplo, n-hexilo). Un grupo alquilo de particular interes es metilo.
Se apreciara que los compuestos de la invencion pueden existir como hidratos, tales como los de las formulas par-
ciales:
y la invencion se extiende a todas estas formas alternativas.
En una realizacion preferida de la invencion, R2 es la cadena lateral de leucina, isoleucina, O-metil treonina, 45 fluoroleucina o 3-metoxivalina.
Los valores actualmente preferidos de R2 incluyen los ilustrados por las estructuras parciales:
especialmente el valor de R2 correspondiente a la cadena lateral de L-leucina.
Las realizaciones del parrafo inmediatamente anterior se aplican ventajosamente a compuestos en los que R3 o R5 10 son fluoro.
15
Normalmente la variable R3 tal como metilo o fluoro, si esta presente, esta situada en la posicion meta con respecto al enlace amida bendlico, como se muestra a continuacion en la estructura parcial:
Un compuesto representativo de esta realizacion tiene la formula:
En ciertas realizaciones de la invencion, R5 es F, especialmente cuando R3 es H y/o R4 es metilo. Un compuesto representativo de esta realizacion tiene la formula:
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N-[1-(6-cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-fluoro-3-metil-butil]-4-[5-fluoro-2-(4-metil-
piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-benzamida;
N-[1-(6-cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-fluoro-3-metil-butil]-3-metil-4-[2-(4-metil-piperazin-
1-il)-tiazol-4-il]-benzamida;
N-[1-(6-cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-fluoro-3-metil-butil]-3-fluoro-4-[2-(4-metil-
piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-benzamida;
N-[1-(6-cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-fluoro-3-metil-butil]-3-metil-4-[5-metil-2-(4-metil-
piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-benzamida;
N-[1-(6-cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-fluoro-3-metil-butil]-3-metil-4-[5-fluoro-2-(4-metil-
piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-benzamida
N-[1-(6-cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-fluoro-3-metil-butil]-3-fluoro-4-[5-metil-2-(4-metil-
piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-benzamida;
N-[1-(6-cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-fluoro-3-metil-butil]-3-fluoro-4-[5-fluoro-2-(4-metil-
piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-benzamida;
y sales farmaceuticamente aceptables, hidratos y N-oxidos de los mismos.
Realizaciones preferidas de la invencion incluyen los compuestos de formula II indicados:
N-[1-6-cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-5]pirrol-4-carbonil)-3-fluoro-3-metil-butil]-4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-
tiazol-4-il]benzamida;
N-[2-(6-cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-6]pirrol-4-il)-1-ciclohexil-2-oxo-etil]-4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-
il]-benzamida
N-[1-(6-cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-6]pirrol-4-carbonil)-3-metil-butil]-4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-
il]benzamida
N-[1-(6-cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-metil-butil]-4-[5-metil-2-(4-metil-piperazin-1-il)- tiazol-4-il]-benzamida; o
una sal farmaceuticamente aceptable, un hidrato o un N-oxido de los mismos.
Realizaciones particularmente preferidas de la invencion incluyen el compuesto de formula II indicado N-[1-(6-cloro- 3-oxo-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-metil-butil]-3-fluoro-4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-benzamida; o una sal farmaceuticamente aceptable, un hidrato o un N-oxido del mismo.
Realizaciones particularmente preferidas de la invencion incluyen el compuesto de formula II indicado N-[1-(6-cloro- 3-oxo-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-metil-butil]-4-[5-fluoro-2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-benzamida; o una sal farmaceuticamente aceptable, un hidrato o un N-oxido del mismo.
Aspectos adicionales de la invencion incluyen una composicion farmaceutica que comprende un compuesto tal y como se ha definido anteriormente y un vetnculo o un diluyente farmaceuticamente aceptable del mismo.
Un aspecto adicional de la invencion es el uso de un compuesto tal y como se ha definido anteriormente para el tratamiento o la preparacion de un medicamento para el tratamiento de trastornos mediados por la catepsina K, tales como:
osteoporosis,
enfermedades gingivales tales como gingivitis y periodontitis,
enfermedad de Paget,
hipercalcemia por enfermedad maligna,
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enfermedad osea metabolica,
enfermedades caracterizadas por una degradacion excesiva del cartflago o la matriz, tales como osteoartritis y artritis reumatoide,
canceres oseos incluyendo neoplasia,
dolor, especialmente dolor cronico.
Los compuestos de la invencion pueden formar sales que forman un aspecto adicional de la invencion. Sales apro- piadas farmaceuticamente aceptables de los compuestos de Formula II incluyen sales de acidos organicos, especialmente acidos carboxflicos, incluyendo pero no limitados a acetato, trifluoroacetato, lactato, gluconato, citrato, tartrato, maleato, malato, pantotenato, isetionato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, butirato, digluconato, ciclo- pentanato, glucoheptanato, glicerofosfato, oxalato, heptanoato, hexanoato, fumarato, nicotinato, palmoato, pectinato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, tartrato, lactobionato, pivolato, canforato, undecanoato y succinato, acidos sulfonicos organicos tales como metanosulfonato, etanosulfonato, sulfonato de 2-hidroxietano, canforsulfona- to, 2-naftalensulfonato, bencenosulfonato, p-clorobencenosulfonato y p-toluensulfonato; y acidos inorganicos tales como clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, bisulfato, hemisulfato, tiocianato, persulfato, acidos fosforico y sulfonico.
Los compuestos de la invencion se pueden aislar en algunos casos en forma de hidrato. Los hidratos se preparan normalmente por recristalizacion en una mezcla de disolvente acuoso/organico usando disolventes organicos tales como dioxina, tetrahidrofurano o metanol. Los hidratos tambien se pueden generar in situ mediante la administracion a un paciente de la cetona correspondiente.
Los N-oxidos de compuestos de la invencion se pueden preparar por metodos conocidos por los expertos normales en la tecnica. Por ejemplo, los N-oxidos se pueden preparar mediante el tratamiento de una forma no oxidada del compuesto de la invencion con un agente oxidante (por ejemplo, acido trifluoroperacetico, acido permaleico, acido perbenzoico, acido peracetico, acido meta-cloroperoxibenzoico o similares) en un disolvente organico inerte adecua- do (por ejemplo, un hidrocarburo halogenado tal como diclorometano) a aproximadamente 0°C. Alternativamente, los N-oxidos de los compuestos de la invencion se pueden preparar a partir del N-oxido de un material de partida apro- piado.
Ejemplos de N-oxidos de la invencion incluyen los que tienen las estructuras parciales:
Los compuestos de la invencion en forma no oxidada se pueden preparar a partir de N-oxidos de los compuestos de la invencion correspondientes, mediante tratamiento con un agente reductor (por ejemplo, azufre, dioxido de azufre, trifenilfosfina, borohidruro de litio, borohidruro de sodio, bicloruro de fosforo, tribromuro o similares) en un disolvente organico inerte adecuado (por ejemplo, acetonitrilo, etanol, dioxano acuoso o similares) de 0 a 80°C.
Hay que senalar que las posiciones de los radicales en cualquier resto molecular utilizado en las definiciones pueden estar en cualquier parte de dicho resto, siempre que sean qmmicamente estables.
Los radicales utilizados en las definiciones de las variables incluyen todos los isomeros posibles a no ser que se indique lo contrario.
Cuando cualquier variable aparece mas de una vez en cualquier componente, cada definicion es independiente.
A menos que se mencione o se indique de otra manera, la denominacion qmmica de un compuesto incluye la mezcla de todas las formas estereoqmmicamente isomeras posibles que dicho compuesto puede poseer. Dicha mezcla puede contener todos los diastereomeros y/o enantiomeros de la estructura molecular basica de dicho compuesto. Todas las formas estereoqmmicamente isomeras de los compuestos de la presente invencion, tanto en forma pura como mezcladas entre sf, se entiende que estan incluidas dentro del alcance de la presente invencion.
Las formas estereoisomeras puras de los compuestos y productos intermedios que se han mencionado en la presente memoria, se definen como isomeros sustancialmente exentos de otras formas enantiomeras o diastereomeras de la misma estructura molecular basica de dichos compuestos o productos intermedios. En particular, la expresion "estereoisomericamente pura" se refiere a compuestos o productos intermedios que tienen un exceso de estere- oisomero de al menos 80% (es decir, un mmimo de 90% de un isomero y un maximo de 10% de los otros isomeros
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posibles) hasta un exceso estereoisomero del 100% (es dedr, 100% de un isomero y nada del otro), mas en particular, compuestos o productos intermedios que tienen un exceso estereoisomero desde 90% hasta 100%, incluso mas en particular que tienen un exceso estereoisomero desde 94% hasta 100% y lo mas particular que tienen un exceso estereoisomero desde 97% hasta 100%. Las expresiones "enantiomericamente puro" y "diastereomericamente puro" se deben entender de manera similar, pero teniendo entonces en cuenta el exceso enantiomerico y el exceso diaste- reomerico, respectivamente, de la mezcla en cuestion.
Los compuestos de la invencion se pueden preparar como sus estereoisomeros individuales haciendo reaccionar una mezcla racemica del compuesto con un agente de resolucion opticamente activo para formar una pareja de compuestos diastereoisomeros, separando los diastereomeros y recuperando el enantiomero opticamente puro. Aunque la resolucion de enantiomeros se puede llevar a cabo usando derivados diastereoisomeros covalentes de los compuestos de Formula (I), se prefieren los complejos disociables (por ejemplo, cristalinos; sales diastereoiso- meras). Los diastereomeros tienen propiedades ffsicas distintas (por ejemplo, puntos de fusion, puntos de ebullicion, solubilidades, reactividad, etc.) y se pueden separar facilmente aprovechando estas diferencias. Los diastereomeros se pueden separar por cromatograffa, por ejemplo HPLC o, preferiblemente, mediante tecnicas de separa- cion/resolucion basadas en diferencias de solubilidad. El enantiomero opticamente puro se recupera entonces, junto con el agente de resolucion, a traves de cualquier medio adecuado que no de lugar a racemizacion. Una descripcion mas detallada de las tecnicas aplicables a la resolucion de estereoisomeros de compuestos a partir de su mezcla racemica se puede encontrar en Jean Jacques Andre Collet, Samuel H. Wilen, Enantiomers, Racemates and Resolutions, John Wiley & Sons, Inc. (1981).
Aunque es posible que el agente activo se administre solo, es preferible presentarlo como parte de una formulacion farmaceutica. Tal formulacion comprendera el agente activo definido anteriormente junto con uno o mas vetncu- los/excipientes aceptables y opcionalmente otros ingredientes terapeuticos. El o los vetnculos deben ser aceptables en el sentido de ser compatibles con los otros ingredientes de la formulacion y no ser perjudiciales para el receptor.
Las formulaciones incluyen las adecuadas para una administracion rectal, nasal, topica (incluyendo bucal y sublingual), vaginal o parenteral (incluyendo subcutanea, intramuscular, intravenosa e intradermica), pero preferiblemente la formulacion es una formulacion administrada por via oral. Las formulaciones se pueden presentar conveniente- mente en forma de dosificacion unitaria, por ejemplo, comprimidos y capsulas de liberacion sostenida, y se pueden preparar a traves de cualquiera de los metodos bien conocidos en la tecnica de la farmacia.
Tales metodos incluyen la etapa de asociar el agente activo definido anteriormente con el vetnculo. En general, las formulaciones se preparan asociando de forma uniforme e mtima el agente activo con vetnculos lfquidos o vetnculos solidos finamente divididos, o ambos y despues, si es necesario, dando forma al producto. Se dan a conocer metodos para preparar una composicion farmaceutica que comprende introducir un compuesto de Formula II o su sal farmaceuticamente aceptable en conjunto o asociacion con un soporte o un vetnculo farmaceuticamente aceptable. Si la preparacion de formulaciones farmaceuticas implica la mezcla a fondo de excipientes farmaceuticos y el ingre- diente activo en forma de sal, entonces normalmente se prefiere usar excipientes que no son de naturaleza basica, es decir, acidos o neutros.
Las formulaciones para administracion oral en la presente invencion se pueden presentar como unidades discretas tales como capsulas, sellos o comprimidos, conteniendo cada una una cantidad predeterminada del agente activo; como polvo o granulos; como una solucion o una suspension del agente activo en un lfquido acuoso o un lfquido no acuoso; o como una emulsion lfquida de aceite en agua o una emulsion lfquida de agua en aceite, y como un bolo, etc.
Con respecto a composiciones para administracion oral (por ejemplo, comprimidos y capsulas), la expresion vetncu- lo adecuado incluye vetnculos tales como excipientes comunes, por ejemplo, agentes aglutinantes, por ejemplo jarabe, acacia, gelatina, sorbitol, tragacanto, polivinilpirrolidona (Povidona), metilcelulosa, etilcelulosa, carboximetil- celulosa de sodio, hidroxipropil-metilcelulosa, sacarosa y almidon; cargas y vetnculos, por ejemplo, almidon de mafz, gelatina, lactosa, sacarosa, celulosa microcristalina, caolm, manitol, fosfato dicalcico, cloruro de sodio y acido algrni- co; y lubricantes tales como estearato de magnesio, estearato de sodio y otros estearatos metalicos, acido estearico, estearato de glicerol, fluido de silicona, ceras, talco, aceites y sflice coloidal. Agentes aromatizantes tales como men- ta, aceite de gaulteria, aroma de cereza o similares tambien se pueden utilizar. Puede ser deseable anadir un agente colorante para hacer que la forma de dosificacion sea facilmente identificable. Los comprimidos tambien se pueden recubrir por metodos bien conocidos en la tecnica.
Un comprimido se puede preparar mediante compresion o moldeo, opcionalmente con uno o mas ingredientes acce- sorios. Los comprimidos se pueden preparar comprimiendo en una maquina adecuada el agente activo en forma de flujo libre tal como un polvo o granulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante, lubricante, diluyente inerte, conservante, tensioactivo o agente dispersante. Los comprimidos moldeados se pueden preparar moldeando en una maquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente lfquido inerte. Los comprimidos pueden estar opcionalmente recubiertos o ranurados y se pueden formular de manera que proporcionen una liberacion lenta o controlada del agente activo.
Otras formulaciones adecuadas para la administracion oral incluyen pastillas para chupar que comprenden el agente
activo en una base aromatizada, normalmente sacarosa y goma arabiga o tragacanto; pastillas que comprenden el agente activo en una base inerte tal como gelatina y glicerina, o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que comprenden el agente activo en un veldculo Kquido adecuado.
La dosificacion apropiada para los compuestos o formulaciones de la invencion dependera de la indicacion y del 5 paciente y se determina facilmente mediante ensayos convencionales en animales y se confirma con ensayos clini- cos en seres humanos. Las dosificaciones que proporcionan concentraciones intracelulares (para la inhibicion de proteasas fisiologicas de la superfamilia de la papama) del orden 0,01 a 100 jM, mas preferiblemente de 0,01-10 |jM, tal como 0,1-25 |jM, son normalmente deseables y factibles.
Los compuestos de la invencion se preparan a traves de una variedad de reacciones qmmicas en solucion y en fase 10 solida.
Los compuestos se preparan normalmente como elementos basicos que reflejan los restos P1, P2 y P3 del producto inhibidor final. Sin que por ello se desee estar ligado a la teona, o adjudicar modos de union provisionales para variables espedficas, los conceptos teoricos P1, P2 y P3 tal y como se emplean en este documento se proporcionan solo por comodidad y tienen sustancialmente el significado convencional de Schlecter & Berger e indican las porcio- 15 nes del inhibidor que se cree que llenan los subsitios S1, S2 y S3, respectivamente, de la enzima, en donde S1 es adyacente al sitio de escision y S3 esta distanciado del sitio de escision. Los compuestos definidos por la Formula II se entiende que estan dentro del alcance de la invencion, independientemente del modo de union.
En terminos generales, el elemento basico P1 tendra la formula:
20 en donde
PG es un grupo protector de N convencional o la amina libre;
los dos grupos Rb definen un cetal, tal como el bis metil cetal o juntos definen un cetal ciclico tal como 1,3- dioxolano;
y Rc es un grupo protector de hidroxi, o menos comunmente es H o representa la funcion ceto del inhibidor 25 del producto final, en los casos en que el elemento basico P1 es la cetona, que se alarga con P2 y P3.
P2 es normalmente una L-leucina, L-isoleucina, O-metil-L-treonina, L-3-hidroxivalina, 4-fluoroleucina o L- ciclohexilglicina protegida en N, y P3 comprende normalmente un grupo de terminacion, tal como un derivado de acido benzoico con el resto N-alquil-piperazinil-E ya introducido o provisto de un sinton para ello en la posicion para.
Los elementos basicos individuales, adecuadamente protegidos se pueden preparar primero y acoplarse entre sf 30 posteriormente, preferiblemente con la secuencia P2+P1 ^ P2-P1 seguida de acido N-alquil-piperazinil-tiazolil- benzoico*+P2-P1 ^ N-alquil-piperazinil-tiazolil-benzoato-P2-P2-P1, en donde * indica una forma activada, con el fin de minimizar la racemizacion en P2.
El acoplamiento entre dos aminoacidos, un aminoacido y un peptido, o dos fragmentos de peptido se puede llevar a cabo usando procedimientos de acoplamiento convencionales tales como el metodo de la azida, el metodo del anhf- 35 drido de acido carbonico-carboxflico mixto (cloroformiato de isobutilo), el metodo de carbodiimida (diciclohexilcarbo- diimida, diisopropilcarbodiimida o carbodiimida soluble en agua), el metodo del ester activo (ester de p-nitrofenilo, imido ester N-hidroxisucdnico), el metodo de reactivo K de Woodward, el metodo de carbonildiimidazol, reactivos de fosforo o metodos de oxidacion-reduccion. Algunos de estos metodos (especialmente el metodo de carbodiimida) se pueden mejorar mediante la adicion de 1-hidroxibenzotriazol o 4-DMAP. Estas reacciones de acoplamiento se pue- 40 den realizar en solucion (fase lfquida) o en fase solida.
Mas explfcitamente, la etapa de acoplamiento implica el acoplamiento por deshidratacion de un carboxilo libre de un reactivo con el grupo amino libre del otro reactivo, en presencia de un agente de acoplamiento para formar la union con un enlace amida. Descripciones de tales agentes de acoplamiento se encuentran en libros de texto generales sobre qmmica de peptidos, por ejemplo, M. Bodanszky, "Peptide Chemistry", 2a ed. rev., Springer-Verlag, Berlin, 45 Alemania (1993), de aqrn en adelante referido simplemente como Bodanszky, cuyos contenidos se incorporan como referencia en esta memoria. Ejemplos de agentes de acoplamiento adecuados son N,N'-diciclohexilcarbodiimida, 1- hidroxibenzotriazol en presencia de N,N'-diciclohexilcarbodiimida o N-etil-N'-[(3-dimetilamino)propil]carbodiimida. Un
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agente de acoplamiento practico y util es el hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-iloxi)tris(dimetilamino)fosfonio co- mercialmente disponible, ya sea por s^ mismo o en presencia de 1-hidroxibenzotriazol o 4-DMAP. Otro agente de acoplamiento practico y util, comercialmente disponible es tetrafluoroborato de 2-(IH-benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'- tetrametiluronio. Aun otro agente de acoplamiento practico y util es hexafluorofosfato de O-(7-azabenzotriazol-1-il)- N,N,N',N'-tetrametiluronio, comercialmente disponible.
La reaccion de acoplamiento se lleva a cabo en un disolvente inerte, por ejemplo, diclorometano, acetonitrilo o dime- tilformamida. Se anade un exceso de una amina terciaria, por ejemplo, diisopropiletilamina, N-metilmorfolina, N- metilpirrolidina o 4-DMAP para mantener la mezcla de reaccion a un pH de aproximadamente 8. La temperatura de la reaccion esta comprendida normalmente entre 0°C y 50°C, y el tiempo de reaccion esta comprendido normalmen- te entre 15 min y 24 h.
Los grupos funcionales de los aminoacidos constituyentes no naturales, generalmente se deben proteger durante las reacciones de acoplamiento para evitar la formacion de enlaces no deseados. Los grupos protectores que se pue- den usar se detallan en Greene, "Protective Groups in Organic Chemistry", John Wiley & Sons, Nueva York (1981) y "The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology", vol. 3, Academic Press, Nueva York (1981), en lo sucesivo referidos simplemente como Greene, cuyas descripciones se incorporan en esta memoria como referencia.
El grupo alfa-carboxilo del residuo C-terminal esta protegido generalmente como un ester que se puede escindir para proporcionar el acido carboxflico. Los grupos protectores que se pueden usar incluyen: 1) esteres de alquilo tales como metilo, trimetilsililo y terc-butilo, 2) esteres de aralquilo tales como bencilo y bencilo sustituido, o 3) esteres que se pueden escindir con una base suave o medios reductores suaves tales como esteres de tricloroetilo y de fenacilo.
El grupo alfa-amino de cada aminoacido que se va a acoplar esta protegido normalmente en N. Cualquier grupo protector conocido en la tecnica se puede utilizar. Ejemplos de tales grupos incluyen: 1) grupos acilo tales como formilo, trifluoroacetilo, ftalilo y p-toluenosulfonilo; 2) grupos carbamato aromaticos tales como benciloxicarbonilo (Cbz o Z) y benciloxicarbonilos sustituidos, y 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc); 3) grupos carbamato alifaticos tales como terc-butiloxicarbonilo (Boc), etoxicarbonilo, diisopropilmetoxicarbonilo y aliloxicarbonilo; 4) grupos carbamato de alquilo dclico tales como ciclopentiloxicarbonilo y adamantiloxicarbonilo; 5) grupos alquilo tales como trifenilmetilo y bencilo; 6) trialquilsililo tal como trimetilsililo; y 7) grupos que contienen tiol tales como feniltiocarbonilo y ditiasucci- nilo. El grupo protector de alfa-amino preferido es o bien Boc o Fmoc. Muchos derivados de aminoacidos adecua- damente protegidos para la smtesis de peptidos estan comercialmente disponibles.
El grupo protector de alfa-amino se escinde normalmente antes de la siguiente etapa de acoplamiento. Cuando se usa el grupo Boc, los metodos de eleccion son acido trifluoroacetico, puro o en diclorometano, o HCl en dioxano o en acetato de etilo. La sal de amonio resultante se neutraliza entonces o bien antes del acoplamiento o in situ con solu- ciones basicas tales como tampones acuosos, o aminas terciarias en diclorometano o acetonitrilo o dimetilformami- da. Cuando se utiliza el grupo Fmoc, los reactivos de eleccion son piperidina o piperidina sustituida en dimetilforma- mida, pero se puede utilizar cualquier amina secundaria. La desproteccion se lleva a cabo a una temperatura entre 0°C y la temperatura ambiente por lo general de 20 a 22°C.
Una vez que se ha completado la secuencia del inhibidor, cualquier grupo protector restante se elimina de cualquier manera que venga dictada por la eleccion de los grupos protectores. Estos procedimientos son bien conocidos por los expertos en la tecnica.
La primera etapa en la smtesis de los compuestos de la invencion, tales como los de la formula general II, es normalmente la preparacion en solucion de un elemento basico P1 funcionalizado, por ejemplo, tal y como se muestra en el esquema siguiente:
i) MsCI, Pyr ii) NaOAc, AC2O, DMF, 130 C iii) BFaxEt2O, EtaSiH, DCM iv) TBDPS-Cl, Im-H, DMF v) NaOMe vi) SO2CI2, Pyr, DCM vii) PPh3, MeOH, H2O, a continuacion EtaN, 50 C viii) B0C2O, EtaN ix) TBAF, THF x) Periodinano de Dess-Martin xi) metodo a: MeOH, TMOF, p-TsOH, a continuacion EtaN, B0C2O, a continuacion, cromatograffa y, 5 finalmente, MeOH, AcCI, metodo b: MeOH, AcCI, TMOF
Aunque el esquema anterior se ha ilustrado con una estrategia diferente de grupo protector empleando acetilo, mesi- lo, TBDPS y Boc, sera evidente que se pueden emplear otras permutaciones de grupos protectores convencionales, como describe Greene (ibid). Ademas, puede ser conveniente emplear el dimetil hemiacetal del grupo cetona durante el acoplamiento de los residuos P2 y P3 y para regenerar la funcion cetona en una etapa posterior.
10 El alargamiento del elemento basico con los elementos basicos P2 y P3 se lleva a cabo normalmente en presencia de un agente de acoplamiento adecuado, por ejemplo, hexafluorofosfato de benzotriazol-1-iloxitrispirrolidinofosfonio (PyBOP), hexafluorofosfato de O-benzotriazol-1-il-N,N,N',N'-tetrametil-uronio (HBTU), hexafluorofosfato de O-(7- azabenzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametil-uronio (HATU), clorhidrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (EDC) o 1,3-diciclohexilcarbodiimida (DCC), opcionalmente en presencia de 1-hidroxibenzotriazol (HOBT) y una
15 base tal como N,N-diisopropiletilamina, trietilamina, N-metilmorfolina y similares. La reaccion se lleva a cabo normalmente entre 20 y 30°C, preferiblemente a aproximadamente 25°C, y requiere de 2 a 24 h para completarse. Di- solventes de reaccion adecuados son disolventes organicos inertes, tales como disolventes halogenados organicos (por ejemplo, cloruro de metileno, cloroformo y similares), acetonitrilo, N,N-dimetilformamida, disolventes etereos tales como tetrahidrofurano, dioxano y similares.
20 Alternativamente, la etapa de acoplamiento por elongacion anterior se puede llevar a cabo convirtiendo en primer lugar el elemento basico P3/P2 en un derivado de acido activo tal como ester de succinimida y luego haciendolo
reaccionar con la amina de P1. La reaccion normalmente requiere de 2 a 3 horas para completarse. Las condiciones utilizadas en esta reaccion dependen de la naturaleza del derivado de acido activo. Por ejemplo, si se trata de un derivado de cloruro de acido, la reaccion se lleva a cabo en presencia de una base adecuada (por ejemplo trietilami- na, diisopropiletilamina, piridina y similares). Disolventes adecuados de la reaccion son disolventes organicos pola- 5 res tales como acetonitrilo, N,N-dimetilformamida, diclorometano o cualquier mezcla adecuada de los mismos.
Los elementos basicos P2 en forma de L-aminoacidos protegidos en N estan disponibles comercialmente, por ejemplo, L-leucina, L-isoleucina, L-ciclohexilglicina, O-metil-L-treonina y otros estan disponibles comercialmente con nu- merosas variantes de grupos protectores, tales como CBz, Boc o Fmoc. Otras variantes de R2 se preparan facilmen- te a partir de materiales de partida comercialmente disponibles. Por ejemplo compuestos en los que R2 es -
10 C(CHa)2OCHa se pueden preparar haciendo reaccionar el acido (S)-(+)-2-amino-3-hidroxi-3-metilbutanoico protegido
con CBz con 3,3-dimetoxi-hexahidro-furo(3,2b)pirrol para formar la unidad P2-P1 deseada. El alcohol de la cadena lateral P2 se puede metilar entonces usando yoduro de metilo bajo condiciones convencionales de hidruro de sodio, imidazol, THF para obtener el P2 deseado sin una racemizacion sustancial del centro alfa. Este resto P2-P1 puede avanzar entonces por la smtesis, tal y como se describe en esta memoria, es decir, retirando CBz y acoplando.
15 Una smtesis de elementos basicos de Fmoc y N-Boc-gammafluoroleucina se muestran en Truong et al., Synlett 2005 n° 8 1278-1280.
La preparacion de los elementos basicos P3 se describe en el documento WO05/66180 o se preparan facilmente por metodos analogos. Por ejemplo, el siguiente esquema muestra la preparacion de un tiazolilo sustituido con fluoro:
20 i. HOAC, Br2, TA, 2 h, 55% de rendimiento; ii. KF, 18-corona-6, CH3CN, 90°C, 16 h, 31% de rendimiento; iii. HOAC, Br2, 45°C, 4 h, 100% de rendimiento; iv. 4-metilpiperazin-1-carbotioamida, etanol, 70°C, 2 h, 74% de rendimiento, v. LiOH, THF, H2O, TA, 16 h, 79% de rendimiento.
Smtesis de acido 4-[5-fluoro-2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-benzoico
El material de partida, 4-acetilbenzoato de metilo, esta disponible comercialmente. La bromacion en la posicion a de 25 la cetona se consigue con bromo en acido acetico para proporcionar el ester metflico de acido 4-(2-bromo-acetil)- benzoico deseado. El tratamiento posterior del ester metflico de acido 4-(2-bromo-acetil)-benzoico con fluoruro de potasio en presencia de 18-corona-6 a 90°C, proporciona el ester metflico de acido 4-(2-fluoro-acetil)-benzoico despues de una cromatograffa en columna. La bromacion repetida en la posicion a de la cetona se consigue con bromo en acido acetico para proporcionar el ester metflico de acido 4-(2-bromo-fluoro-acetil)-benzoico deseado. La forma- 30 cion del tiazol se lleva a cabo normalmente por calentamiento del ester metflico de acido 4-(2-bromo-2-fluoro-acetil)- benzoico con 4-metilpiperazin-1-carbotioamida a 70°C durante 2 horas. Al enfriar, el ester metflico de acido 4-[5- fluoro-2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-benzoico precipita. La desproteccion del ester metflico se lleva a cabo utilizando una solucion de hidroxido de litio y el acido deseado, el acido 4-[5-fluoro-2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4- il]-benzoico se obtiene generalmente con un buen rendimiento como la sal diclorhidrato despues de reacciones adi- 35 cionales con acido clortndrico.
Los documentos WO05/066159 y WO05/065578 describen la preparacion de compuestos en los que las unidades P2 y P3 estan unidas entre sf a traves de un resto C(CF3), incluyendo aquellos en los que P3 es una bifenilsulfona. Un ejemplo de la preparacion de un elemento basico P2-P3 de este tipo, adecuado para la preparacion de compuestos de formula II, en donde Rq es trifluorometilo y Rq' es H, se muestra en el esquema 3.
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1) isopropilalcohol,
h2so4
2) pinacolborano, cloruro de [1,1 '-bis(difenilfosfino)- ferrocen]paladio(ll)
cloruro de [1,1 '-bis(difenilfosfino)- ferrocen]paladio(ll)
Esquema 3
La proteccion de la funcion acido del derivado de bromo (3a), preparado de acuerdo con el procedimiento descrito en Bioorg. Med. Chem Lett. 2006, 16, 1985, por reaccion con, por ejemplo, alcohol isopropHico en presencia de un acido tal como acido sulfurico, proporciona el ester correspondiente. Un derivado de tiazol deseado se puede aco- plar entonces al grupo aromatico del ester proporcionado utilizando, por ejemplo, condiciones de acoplamiento de Stille o Suzuki. Por ejemplo, el ester del derivado de bromo 3a puede reaccionar con un reactivo de borano tal como pinacolborano en presencia de cloruro de [1,1'-bis(difenilfosfino)ferrocen]paladio II para proporcionar el derivado de dioxoborolano correspondiente. La sustitucion posterior del grupo boronico por un derivado de tiazol deseado (3b) en presencia de cloruro de [1,1'-bis(difenilfosfino)ferrocen]paladio II proporciona entonces el derivado de biarilo (3c). Los derivados de tiazol (3b) se pueden preparar, por ejemplo, como se describe en J. Med. Chem. 2005, 48, 75207534. La eliminacion del grupo protector de acido, por ejemplo, mediante tratamiento con un acido tal como acido clorhfdrico en dioxano, proporciona el elemento basico P2-P3 listo para el acoplamiento con un elemento basico P1, para proporcionar los compuestos de la invencion. El documento WO07/006716 muestra la preparacion y el acoplamiento de elementos basicos P3 y P3-P2 de este tipo.
La expresion "grupo protector de N" o "protegido en N" tal como se utiliza en esta memoria, se refiere a aquellos grupos destinados a proteger el extremo N-terminal de un aminoacido o un peptido, o a proteger un grupo amino frente a reacciones indeseables durante los procedimientos sinteticos. Los grupos protectores de N comunmente utilizados se describen en Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis" (John Wiley & Sons, Nueva York, 1981), que se incorpora en esta memoria como referencia. Los grupos protectores de N incluyen grupos acilo tales como formilo, acetilo, propionilo, pivaloilo, t-butilacetilo, 2-cloroacetilo, 2-bromoacetilo, trifluoroacetilo, tricloroacetilo, ftalilo, o-nitrofenoxiacetilo, a-clorobutirilo, benzoflo, 4-clorobenzoHo, 4-bromobenzoflo, 4-nitrobenzoflo y similares; grupos sulfonilo tales como bencenosulfonilo, p-toluenosulfonilo y similares, grupos formadores de carbamato tales como benciloxicarbonilo, p-clorobenciloxicarbonilo, p-metoxibenciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, 2- nitrobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo, 3,4-dimetoxibenciloxicarbonilo, 4-metoxibenciloxicarbonilo, 2- nitro-4,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, 3,4,5-trimetoxibenciloxicarbonilo, 1-(p-bifenilil)-1-metiletoxicarbonilo, a,a-dimetil- 3,5-dimetoxibenciloxicarbonilo, benzhidriloxicarbonilo, t-butoxicarbonilo, diisopropilmetoxicarbonilo, isopropiloxicar- bonilo, etoxicarbonilo, metoxicarbonilo, aliloxicarbonilo, 2,2,2-tricloroetoxicarbonilo, fenoxicarbonilo, 4- nitrofenoxicarbonilo, fluorenil-9-metoxicarbonilo, ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo, ciclohexiloxicarbonilo, feniltiocarbonilo y similares; grupos alquilo tales como bencilo, trifenilmetilo, benciloximetilo y similares; y grupos sililo tales como trimetilsililo y similares. Grupos protectores de N preferidos incluyen formilo, acetilo, benzoflo, pivaloilo, t- butilacetilo, fenilsulfonilo, bencilo (bz), t-butoxicarbonilo (BOC) y benciloxicarbonilo (Cbz).
Los grupos protectores de hidroxilo y/o carboxilo tambien se revisan extensivamente en Greene ibid e incluyen ete- res tales como eteres de metilo, eteres de metilo sustituidos, tales como metoximetilo, metiltiometilo, benciloximetilo, t-butoximetilo, 2-metoxietoximetilo y similares, eteres de sililo tales como eteres de trimetilsililo (TMS), t- butildimetilsililo (TBDMS) tribencilsililo, trifenilsililo, t-butildifenilsililo, triisopropilsililo y similares, eteres de etilo sustituidos, como por ejemplo, eteres de 1-etoximetilo, 1-metil-1-metoxietilo, t-butilo, alilo, bencilo, p-metoxibencilo, dife- nilmetilo, trifenilmetilo y similares, grupos aralquilo tales como tritilo y pixilo (derivados de 9-hidroxi-9-fenilxanteno, especialmente el cloruro). Grupos ester protectores de hidroxi incluyen esteres tales como formiato, bencilformiato, cloroacetato, metoxiacetato, fenoxiacetato, pivaloato, adamantoato, mesitoato, benzoato y similares. Grupos carbo- nato protectores de hidroxilo incluyen metil vinilo, alilo, cinamilo, bencilo y similares.
Descripcion detallada de las realizaciones
Varias realizaciones de la invencion se describiran a continuation, solamente a modo de ilustracion haciendo refe- rencia a los siguientes Ejemplos.
Ejemplo 1
Preparation del elemento basico P1:
5 Etapa a)
1 (7,0 g, 28,5 mmol) (3-azido-3-desoxi-1,2-O-(1-metiletiliden)-a-D-alofuranosa, preparada como se describe en Tron- chet, Jean M. J.; Gentile, Bernard; Ojha-Poncet, Joelle; Moret, Gilles; Schwarzenbach, Dominique; Barbalat-Rey, Frangoise; Tronchet, Jeannine Carbohydrate Research (1977), 59(1), 87-93) se disolvio en piridina seca (50 mL) y la 10 solution se enfrio a 0°C. Cloruro de mesilo se anadio lentamente a la solution y se permitio que la solution se calen- tara hasta temperatura ambiente. La reaction se agito durante una noche y despues de 14 h se anadio MeOH (10 mL) seguido por EtOAc (150 mL). La solucion se lavo tres veces con H2SO4 (ac) 2 M (3 x 100 mL) y dos veces con NaHCO3 sat. (ac) (2 x 100 mL) y despues la fase organica se seco con Na2SO4, se filtro y se concentro al vado. Despues de colocar el producto durante una noche en una bomba de alto vado para eliminar los disolventes residuales, 15 se obtuvo el producto 2 como un aceite de color amarillo palido con rendimiento cuantitativo (11,5 g).
1H RMN (CDCl3, 400 MHz) 1,34 (s, 3H), 1,51 (s, 3H), 3,07 (s, 3H), 3,16 (s, 3H), 4,18 (d, 1 H, J = 3,1), 4,36 (dd, 1 H, J = 8,6, 3,2), 4,42 (dd, 1H, J = 12,0, 5,0), 4,67 (dd, 1H, J = 11,9, 2,3), 4,74 (d, 1H, J = 3,7), 5,11 (ddd, 1H, J = 8,6, 5,0, 2,3), 5,89 (d, 1H, J = 3,6).
Etapa b)
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El compuesto 2 (11,5 g, 28,5 mmol) se disolvio en DMF (50 mL). Se anadio NaOAc (23,4 g, 285 mmol) y Ac2O (48,6 mL, 0,514 mol) a la solucion, que se calento entonces a 125°C durante 86 h. Una parte del disolvente se elimino por evaporation rotatoria antes de la adicion de 500 mL de EtOAc. La solucion muy oscura se filtro a traves de Celite. La fase organica se lavo a continuacion con H2O (3 x 350 mL). La fase organica se seco con Na2SO4, se filtro y el disol- 25 vente se retiro por evaporacion rotatoria. Los productos crudos se purificaron mediante cromatograffa instantanea en columna (heptano:acetato de etilo 7:3 -> 2:1) proporcionando el compuesto 3 deseado con un rendimiento del 61% (5,70 g) y el compuesto 4 con un rendimiento del 22% (2,34 g).
Compuesto 3: 1H RMN (CDCh, 400 MHz) 1,34 (s, 3H), 1,53 (s, 3H), 2,09 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 3,94 (d, 1H, J = 3,4),
4,19 (dd, 1 H, J = 12,2, 5,0), 4,32 (dd, 1 H, J = 8,0, 3,3), 4,37 (dd, 1H, J = 12,3, 3,5), 4,73 (d, 1H, J = 3,6), 5,32-5,37
30 (m, 1H), 5,94 (d, 1H, J = 3,8).
Compuesto 4: 1H RMN (CDCh, 400 MHz) 1,34 (s, 3H), 1,51 (s, 3H), 2,10 (s, 3H), 3,10 (s, 3H), 4,11 (d, 1H, J = 3,6),
4,21 (dd, 1H, J = 12,8, 6,2), 4,32 (dd, 1H, J = 8,3, 3,2), 4,65 (dd, 1H, J = 12,7, 2,2), 4,73 (d, 1H, J = 3,5), 5,09 (ddd,
1H, J = 8,3, 6,1,2,3), 5,89 (d, 1H, J = 3,5).
Etapa c)
Se anadio trietilsilano (27,6 mL, 173 mmol) al compuesto 3 (5,70 g, 17,3 mmol) disuelto en DCM seco (40 mL). El matraz de fondo redondo se coloco bajo una atmosfera inerte (N2) en un bano de hielo, y se dejo enfriar, antes de la
adicion lenta de BF3.Et2O (23,1 mL, 173 mmol). La reaccion procedio lentamente y se agito durante 3 d^as. Despues de este tiempo, el material de partida estaba todav^a presente. La adicion lenta de NaHCO3 (sat, ac) (70 mL) estuvo seguida por la adicion de cucharadas de NaHCO3 solido hasta que ceso el desarrollo de gases. La fase acuosa se extrajo con DCM (150 mL) y se lavo con NaHCO3 (sat, ac) (70 mL) anadiendo posteriormente NH4Cl (sat, ac) (70 mL). La 5 fase organica se seco con Na2SO4, se filtro y se concentro al vado. El producto crudo se purifico mediante cromatografia instantanea en columna (heptano:acetato de etilo (2:1) para proporcionar un rendimiento del 41% (1,95 g) del compuesto 5. Se aislaron tambien 0,69 g de material de partida inalterado.
1H RMN (CDCl3, 400 MHz) 2,08 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 3,72 (dd, 1H, J = 10,0, 2,6), 3,95 (dd, 1H, J = 4,6, 2,1), 4,174,27 (m, 3H), 4,37 (dd, 1H, J = 12,1, 3,7), 4,52-4,57 (m, 1H), 5,26- 5,31 (m, 1H).
10 Etapa d)
Se anadio imidazol (1,46 g, 21,4 mmol) a una solucion del compuesto 5 (1,95 g, 7,14 mmol) en DMF (50 mL). TBDPSCl se anadio despues de un par de minutos y la reaccion se agito a temperatura ambiente durante una no- che. Se anadio acetato de etilo (200 mL) a la reaccion y la solucion se lavo con acido dtrico (ac) al 10% (3 x 50 mL) y 15 NaHCO3 (sat, ac) (50 mL). La fase organica se seco con Na2SO4, se filtro y se concentro al vado. El producto crudo se
purifico mediante cromatografia instantanea en columna (heptano:acetato de etilo (4:1) para proporcionar 6 con un rendimiento del 92% (3,39 g).
1H RMN (CDCl3, 400 MHz) 1,09 (s, 9H), 2,04 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 3,71 (dd, 1H, J = 4,3, 2,1), 3,78 (dd, 1H, J = 9,5, 2,2), 3,99 (dd, 1H, J = 9,6, 4,6), 4,12 (dd, 1H, J = 12,2, 5,1), 4,28- 4,33 (m, 2H), 4,36- 4,40 (m, 1H), 5,17- 5,22 (m, 20 1H), 7,37- 7,51 (m, 6H), 7,58- 7,74 (m, 4H).
Etapa e)
NaOMe (10 mL, 0,5 M en MeOH) se anadio a una solucion de 6 (3,39 g, 6,63 mmol) disuelto en MeOH (60 mL). La reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 h antes de neutralizar la solucion mediante la adicion de Dowex 25 50 WX8 (forma H+) hasta que se alcanzo un pH neutro. Las perlas se separaron por filtracion y el disolvente se retiro
por evaporation rotatoria seguida de alto vado. El producto 7 se obtuvo con un rendimiento cuantitativo (2,66 g).
1H RMN (CDCl3, 400 MHz) 1,08 (s, 9H), 3,64 (dd, 1H, J = 11,5, 5,5), 3,71 (dd, 1H, J = 11,4, 3,9), 3,73- 3,77 (m, 2H), 3,85- 3,90 (m, 1H), 3,95 (dd, 1H, J = 9,6, 4,7), 4,15 (dd, 1H, J = 6,1, 4,2), 4,39- 4,43 (m, 1H), 7,37- 7,51 (m, 6H), 7,58- 7,74 (m, 4H).
30 Etapa f)
El compuesto 7 (1,4 g, 3,27 mmol), se disolvio en cloroformo (10 mL) y piridina (4,77 mL, 58,9 mmol), se enfrio en un bano de hielo seco, acetona. Se anadio SO2O2 (1,56 mL, 19,6 mmol) y se retiro el bano a partir de entonces. La mezcla de reaccion se agito durante una noche y se volvio mas oscura con el tiempo. Despues de 16 h, la mezcla de 35 reaccion se diluyo con DCM (15 mL) y se lavo con acido dtrico al 10% (ac) (15 mL) y NaHCO3 (sat, ac) (15 mL). La fase organica se seco con Na2SO4, se filtro y se concentro al vado. El aceite marron se disolvio en MeOH (10 mL) y aprox. 0,5 mL de Nal (0,8% en MeOH:H2O (1:1)) se anadieron a la solucion que se agito durante 15 minutos. Despues, el disolvente se evaporo y el producto crudo se purifico mediante cromatografia instantanea en columna (hep-
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tano:acetato de etilo (4:1) para proporcionar un rendimiento del 68% de compuesto 8.
1H RMN (CDCh, 400 MHz) 1,10 (s, 9H), 3,80- 3,85 (m, 2H), 3,89 (dd, 1 H, J = 12,1, 5,8), 3,96 (dd, 1H, J = 9,7, 3,8), 4,00 (dd, 1H, J = 12,3, 2,6), 4,15 (ddd, 1H, J = 9,7, 5,9, 2,6), 4,32- 4,36 (m, 2H), 7,35- 7,52 (m, 6H), 7,58- 7,75 (m, 4H)
Etapa g)
Se anadio PPh3 (882 mg, 3,36 mmol) a una solution del compuesto 8 (1,04 g, 2,24 mmol) disuelto en MeOH (50 mL) y H2O (5 mL). La reaction se agito a temperatura ambiente durante una noche. LC-MS mostro que no habia material de partida pero muy poco producto ciclado. TEA (9,38 mL, 67,2 mmol) y H2O (5 mL) se anadieron a la solucion que se calento a 50°C. Despues de 4 h, LC-MS no mostro aminas sin ciclar. El disolvente se evaporo y se purifico el producto crudo mediante cromatograffa instantanea (heptano:acetato de etilo (3:2)) para proporcionar el producto 9 con un rendimiento del 54% (0,49 g). LRMS (M+H) 402.
1H RMN (CDCh, 400 MHz) 1,06 (s, 9H), 2,71 (dd, 1H, J = 11,1, 10,4), 3,18 (dd, 1H, J = 11,2, 7,0), 3,73 (d, 1H, J =
4,7), 3,78 (dd, 1H, J = 9,8, 3,5), 3,84 (dd, 1H, J = 9,8, 2,0), 3,95 (ddd, 1H, J = 10,2, 7,1,4,1), 4,16-4,19 (m, 1H), 4,66 (dd, 1H, J = 4,4, 4,4), 7,35-7,46 (m, 6H), 7,61-7,67 (m, 4H).
Etapa h)
Anhidrido de BOC (0,52 g, 2,40 mmol) se anadio a una solucion del compuesto 9 (0,48 g, 1,20 mmol) disuelto en 50 mL de MeOH:TEA (9:1). La reaccion se agito durante una noche y despues el disolvente se elimino mediante concentration a vacfo. El producto crudo se purifico mediante cromatograffa instantanea en columna (heptano:acetato de etilo (4:1-> 2:1)) para proporcionar el producto 10 con un rendimiento cuantitativo (0,60 g).
1H RMN (CDCh, 400 MHz) 1,07 (s, 9H), 1,24- 1,46 (m, 9H)*, 3,05 (dd, 1H, J = 10,4, 10,4), 3,56 (d, 1H, J = 9,7), 3,703,89 (m, 1H)*, 3,90- 4,15 (m, 2H)*, 4,24- 4,89 (m, 3H)*, 7,34- 7,47 (m, 6H), 7,59- 7,78 (m, 4H). * Indica rotameros.
Etapa i)
Se anadio fluoruro de tetrabutilamonio (1,79 mL, 1,79 mmol) a una solucion del compuesto 10 (0,60 g, 1,19 mmol) disuelto en THF (12 mL). La reaccion se agito a temperatura ambiente durante 3 h antes de eliminar el disolvente por concentration a vacio. El producto crudo se purifico mediante cromatograffa instantanea en columna (heta- no:acetato de etilo (1:1 -> 0:1) y se obtuvo un rendimiento del 94% (0,29 g) de compuesto 11.
1H RMN (CDCh, 400 MHz) 1,45- 1,52 (m, 9H)*, 3,16- 3,32 (m, 1H)*, 3,83- 4,22 (m, 5H)*, 4,41- 4,54 (m, 1H)*, 4,664,71 (m, 1H)*. * Indica rotameros.
Etapa j)
Se anadio periodinano de Dess-Martin (0,60 g, 1,42 mmol) a una solucion del compuesto 11 (0,34 g, 1,29 mmol) disuelto en DCM seco. La reaccion se agito bajo atmosfera de N2 durante 2 h, cuando se estimo que la reaccion se hada completado por tlc. La solucion se lavo 3 veces (3 x 20 mL) con una mezcla 1:1 de 10% de Na2S2O3 (ac) y 5 NaHCO3 (sat, ac). La fase organica se seco con Na2SO4, se filtro y se concentro al vado. El producto crudo se purifico mediante cromatografia instantanea (heptano:acetato de etilo (3:1) para proporcionar un rendimiento del 84% (284 mg) de compuesto 12.
1H RMN (CDCh, 400 MHz) 1,48 (s, 9H), 3,45 (dd, 1H, J = 11,3, 9,0), 4,01 - 4,17 (m, 2H), 4,19- 4,41 (m, 3H), 4,684,87 (m, 1H).
10 Etapa k)
Una solucion mezclada previamente de AcCl (42 ^L, 0,601 mmol) y MeOH (5 mL) se anadio a una solucion del compuesto 12 (263 mg, 1,01 mmol). Despues de agitar durante 2 h, se anadio AcCl adicional (0,98 mL, 14 mmol) y de nuevo despues de agitar durante 16 h, se anadio AcCl adicional (9,8 mL, 140 mmol). La reaccion se completo poco 15 despues, se concentro a vado y posteriormente cualquier disolvente residual se elimino mediante alto vado para proporcionar un rendimiento crudo del 103% (253 mg) de compuesto 13.
1H RMN (CDCla, 400 MHz) 3,34 (s, 3H), 3,40 (s, 3H), 3,76 (d, 1H, J = 10,6), 3,72- 3,90 (m, 1H), 4,15 (d, 1H, J = 10,4), 4,34 (d, 1H, J = 4,6), 4,50-4,60 (m, 1H), 4,69-4,75 (m, 1H), 4,83 (s, 1H).
Ejemplo 2
20 Acoplamiento de P-2 con L-Leu
Se anadio DIEA (304 ^L, 1,84 mmol) y BOC-Leu (117 mg, 0,506 mmol) al crudo 13 (112 mg, 0,460 mmol), se disol- vio en DMF (6 mL). El matraz de reaccion se enfrio en un bano de hielo durante 10 minutos antes de la adicion de HATU (193 mg, 0,506 mmol). La reaccion se agito durante 3 horas a temperatura ambiente antes de concentrar a 25 vado. El residuo crudo se disolvio en CHCl3 (15 mL) y se lavo con acido dtrico (ac) al 10% (10 mL) y NaHCO3 (sat, ac) (10 mL). La fase organica se seco con Na2SO4, se filtro y se evaporo. El producto crudo se purifico mediante croma- tografia instantanea (heptano:acetato de etilo (2:1-> 1:1) para proporcionar el producto 14 con un rendimiento del 62% (121 mg).
Eiemplo 3
30 Elemento basico P3
Acido 4-[5-metil-2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il1benzoico
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Etapa a) 4-Cianopropiofenona
Como se ha descrito para la preparacion de 4-cianoacetofenona (Synth. Commun 1994, 887-890), una mezcla de 4- bromopropiofenona (5,65 g, 26,4 mmol), Zn(CN)2 (1,80 g, 15,3 mmol) y Pd(PPh3)4 (2,95 g, 2,6 mmol) se calento a reflujo a 80°C en DMF desoxigenada (35 mL, almacenada sobre tamices moleculares de 4 A, burbujeada con Ar antes del uso) durante 18 h. La mezcla se repartio entre tolueno (100 mL) y NH4OH 2 N (100 mL). La fase organica se extrajo con NH4OH 2 N (100 mL), se lavo con NaCl acuoso saturado (2 x 100 mL), se seco y se concentro a vac- h. Una reaccion a escala 10 mmol se realizo de manera similar y los productos crudos se combinaron. La cromato- graffa instantanea (330 g de sflice, 6/1 de eter de petroleo - EtOAc) proporciono el compuesto deseado como un solido blanco (5,17 g, 89%).
1H RMN (CDCla) 8 ppm: 1,22 (t, 3H, J = 7,2 Hz), 3,00 (c, 2H, J = 7,3 Hz), 7,75 (d, 2H, J = 8,8 Hz), 8,03 (d, 2H, J = 8,4 Hz)
13C RMN (CDCla) 8 ppm: 7,8, 32,1, 116,1, 117,9, 128,3, 132,4, 139,7, 199,2 Etapa b) Acido 4-propionilbenzoico
4-Cianopropiofenona (4,67 g, 29,3 mmol) se calento a reflujo con NaOH 2 N (90 mL, 180 mmol) y dioxano (90 mL) a 95°C durante una noche. La mezcla se diluyo con agua (150 mL), se lavo con eter (75 mL), se acidifico a pH 2 con HCl concentrado, y se extrajo con eter (3 x 75 mL). La fase organica se lavo con NaCl acuoso saturado (3 x 75 mL), se seco y se concentro para proporcionar un solido amarillo (5,12 g, 98%).
1H RMN (CDCls + CD3OD) 8 ppm: 1,18 (t, 3H, J = 7,2 Hz), 2,99, (c, 2H, J = 7,1 Hz), 7,95 (d, 2H, J = 8,4 Hz), 8,08 (d, 2H, J = 8,8 Hz)
13C RMN (CDCls) 8 ppm: 7,9, 32,1, 127,7, 130,0, 134,0, 140,0, 168,0, 200,8 Etapa c) 4-Propionilbenzoato de metilo
El acido benzoico anterior (890 mg, 5 mmol), NaHCO3 (1,26 g, 15 mmol) y yodometano (935 pL, 15 mmol) en DMF (10 mL) se agitaron a TA durante una noche. La mezcla se diluyo con NaCl acuoso saturado (50 mL) y se extrajo con eter (3 x 50 mL). La fase organica se lavo con agua (50 mL), se seco y se concentro. La cromatograffa instantanea (90 g de sflice, 2/1 de eter de petroleo - EtOAc) proporciono un solido blanco (744 mg, 77%).
1H RMN (CDCls) 8 ppm: 1,24 (t, 3H, J = 7 Hz), 3,03 (c, 2H, J = 7 Hz), 3,95 (s, 3H), 8,0 y 8,12 (ABc, 4H)
Etapa d) 4-(2-Bromopropionil)benzoato de metilo
Jj—h—COOMe O '—'
4-Propionilbenzoato de metilo (744 mg, 3,87 mmol), tribromhidrato de pirrolidona (1,98 g) y 2-pirrolidinona (380 mg, 4,5 mmol) en THF (38 mL) se calentaron a 50°C bajo atmosfera de nitrogeno durante 3 h. La mezcla se enfrio, se filtro, se concentro a vado, y luego se volvio a disolver en eter (50 mL). La solucion de eter se lavo sucesivamente con agua (20 mL), Na2S2O5 saturado acuoso (20 mL), NaCl saturado acuoso (20 mL) y agua (20 mL), se seco y se concentro a vado para proporcionar un aceite amarillo (1,025 g) que se uso directamente en el acoplamiento de Hantzsch. Este material conterna 91% de la bromocetona deseada, 5% de la cetona de partida y 4% de 4-bromo-1- butanol, segun lo determinado por 1H RMN.
1H RMN (CDCls) 8 ppm: 1,92 (d, 3H, J = 7 Hz), 3,96 (s, 3H), 5,28 (c, 1H, J = 7 Hz), 8,07 y 8,14 (ABc, 4H)
Etapa e) Ester metflico de acido 4-[2-(4-terc-butoxicarbonilpiperazin-1-il)-5-metiltiazol-4-il]benzoico
Toda la a-bromocetona anterior y el ester terc-butflico de acido 4-tionocarbonilpiperazin-1-carboxflico (J. Med. Chem., 1998, 5037-5054, 917 mg, 3,73 mmol) se sometio a reflujo en 36 mL de THF a 70°C durante 2 h, bajo atmosfera de N2. El material precipitado se filtro y el filtrado se concentro a vado para proporcionar un solido amari- 5 llo. La cromatografia instantanea en columna (sflice, eter de petroleo 5/1 - EtOAc) proporciono 624 mg de solidos de color amarillo claro. La cromatografia del precipitado (sflice, 2/1 eter de petroleo - EtOAc) proporciono otros 32 mg de compuesto. El rendimiento total es del 44%.
1H RMN (CDCla) 5 ppm: 1,46 (s, 9H), 2,43 (s, 3H), 3,42, (m, 4H), 3,54 (m, 4H), 3,90 (s, 3H), 7,68 y 8,04 (ABc, 4H). Etapa f) Acido 4-[2-(4-ferc-butoxicarbonilpiperazin-1-il)-5-metiltiazol-4-il]benzoico
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El ester metilico anterior (564 mg, 1,35 mmol) se calento con 1,35 mL de NaOH 2 N, 5 mL de THF y 3,65 mL de agua a 60°C durante 4 h. La mezcla de reaccion se evaporo, se vertio en 20 mL de NaCl saturado acuoso y 20 mL de CH2Cl2, y despues se acidifico a pH 3 con acido dtrico al 5%, en un bano de hielo. Las capas se separaron y la fase organica se extrajo adicionalmente con 2 x 10 mL de CH2Cl2. Las fases organicas se combinaron, se lavaron 15 con agua (10 mL), se secaron y se concentraron a vado para proporcionar un solido amarillo claro (537 mg, 98%).
1H RMN (CDCla) 5 ppm: 1,48 (s, 9H), 2,47 (s, 3H), 3,47 (m, 4H), 3,57 (m, 4H), 7,74 y 8,12 (ABc, 4H).
13C RMN (CDCls) 5 ppm: 12,6, 28,3, 42,8, 48,1, 80,3, 119,1, 127,8, 128,2, 130,1, 140,5, 145,6, 154,6, 167,2, 171,4.
LCMS: (M + H)+ 404, (M - H)- 402.
Etapa g) Acido 4-[5-metil-2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]benzoico
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El ester terc-butilico de acido 4-[4-(4-carboxifenil)-5-metiltiazol-2-il]-piperazin-1-carboxilico (0,421 mmol) se disolvio en HCl 4 M en 1,4-dioxano, y se agito a temperatura ambiente durante 1 h. Despues, el disolvente se elimino a vac- to, y el residuo acido 4-(5-metil-2-piperazin-1-il-tiazol-4-il)-benzoico se suspendio en metanol (10 mL) y se trato con tampon AcOH/AcONa (pH ~5,5, 5 mL) y formaldeddo (0,547 mmol). La mezcla de reaccion se agito a temperatura 25 ambiente durante 1 h, despues se trato con NaCNBH3 (0,547 mmol) y se agito a temperatura ambiente durante una noche. Despues, el disolvente se elimino a vado, y el residuo se purifico mediante cromatografia en columna para proporcionar el compuesto del fitulo (0,403 mmol, 95%).
MS(ES) m/z 318 (100%, [M+H]+).
Ejemplo 4
Se anadio cloruro de acetilo (0,4 mL) gota a gota a una solucion del compuesto 14 (0,121 g, 0,288 mmol) en metanol (4 mL) a 0°C. La mezcla de reaccion se agito despues a temperatura ambiente durante una noche, y despues se concentro a vado. El residuo se volvio a disolver dos veces en DMF seca (5 mL) y se concentro hasta sequedad, despues se disolvio de nuevo en DMF (6 mL). Se anadio HCl de acido 4-[5-metil-2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-
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benzoico (112 mg, 0,316 mmol) y DIEA (190 jL, 1,15 mmol) a la solucion antes de enfriar a 0°C y se anadio HATU (120 mg, 0,316 mmol). La reaccion se agito durante 3 horas a temperatura ambiente antes de eliminar el disolvente por evaporacion rotatoria. La mezcla cruda se disolvio en CHCl3 (15 mL) y se lavo con acido cftrico (ac) al 10% (10 mL) y NaHCO3 (sat, ac) (10 mL). La fase organica se seco con Na2SO4, se filtro y se evaporo. El producto crudo se purifico mediante cromatograffa instantanea en columna (acetato de etilo:acetona 1:1 + 0,2% de TEA) para propor- cionar el producto como un aceite/solido incoloro con un rendimiento del 84% (150 mg). LRMS (M+H) 620.
RMN (CDCl3, 400 MHz) para el rotamero mayoritario (13:1 mezcla de rotameros): 0,98 (d, 3H, J = 6,5), 1,04 (d, 3H, J = 6,4), 1,55- 1,89 (m, 3H), 2,34 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 2,49- 2,54 (m, 2H), 3,25 (s, 3H), 3,43 (s, 3H), 3,45- 3,51 (m, 3H), 3,72 (d, 1H, J = 10,5), 3,91 (d, 1H, J = 10,5), 4,05- 4,15 (m, 1H), 4,46- 4,53 (m, 1H), 4,59 (dd, 1H, J = 5,2, 5,1), 4,74 (d, 1H, J = 5,6), 4,96-5,04 (m, 1H), 6,83 (d, 1H, J = 8,0), 7,68 (d, 2H, J = 8,3), 7,79 (d, 2H, J = 8,5).
Ejemplo 5
El compuesto 15 (137 mg, 0,220 mmol) se disolvio en 20 mL de TFA:H2O (97,5:2,5) y se agito durante 4 horas. El disolvente se elimino a vacfo y el producto crudo se absorbio previamente sobre sflice para purificarlo mediante cromatograffa instantanea en columna (EtOAc:acetona (1:2) con 0,2% de TEA) para proporcionar el producto (liofili- zado a partir de dioxano) en forma de un solido de color blanquecino con un rendimiento del 71% (90 mg).
RMN (CDCl3, 400 MHz) para el rotamero mayoritario (10:1 mezcla de rotameros): 0,98 (d, 3H, J = 6,5), 1,02 (d, 3H, J = 6,2), 1,58- 1,86 (m, 3H), 2,34 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 2,50- 2,54 (m, 2H), 3,44- 3,53 (m, 2H), 3,68 (dd, 1H, J = 10,4,
8.8) , 4,11 (d, 1H, J = 17,2), 4,29 (d, 1H, J = 17,3), 4,36- 4,44 (m, 1H), 4,59 (dd, 1H, J = 10,5, 7,1), 4,81 (d, 1H, J =
5.8) , 4,87-4,97 (m, 2H), 6. 83 (d, 1H, J = 7,9), 7,68 (d, 2H, J = 8,4), 7,79 (d, 2H, J = 8,5).
Ejemplo 6
N-r(S)-1-((3aS.6R.6aS)-6-cloro-3-oxo-hexahidro-furor3,2-51pirrol-4-carbonil)-3-metil-butil1-4-r2-(4-metil-piperazin-1-il)-
tiazol-4-illbenzamida
Etapa a)
CL
TO
o o
12
■cx
o
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A una solucion agitada de compuesto 12 crudo (aproximadamente 0,56 mmol) en ortoformiato de trimetilo (0,8 mL) y metanol (3 mL) se anadio monohidrato de acido p-toluenosulfonico (p-TsOH, 0,007 g, 0,037 mmol), despues se calento a 50°C durante una noche. La mezcla de reaccion se controlo despues mediante TLC (3:2 de hexano- acetato de etilo, tincion con ninhidrina). La mezcla de reaccion se calento a 60°C y se anadio un total de 21 mg de p- TsOH durante 4 h, lo que proporciono el cetal no protegido con Boc como el producto mayoritario (indicado por TLC). La mezcla de reaccion se enfrio despues a temperatura ambiente y se anadio trietilamina (0,32 mL, 2,24 mmol) seguido de dicarbonato de di-ferc-butilo (0,184 g, 0,84 mmol). La mezcla de reaccion se mantuvo a temperatura ambiente durante 2,5 h, despues se concentro a vacfo y se preabsorbio sobre sflice. La cromatograffa instanta-
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nea en columna del residuo (elucion en gradiente por etapas, acetato de etilo en hexano, 20-25%), seguida de con- centracion a vado de las fracciones adecuadas y la eliminacion del disolvente residual por secado adicional en una lmea de vado durante una noche, proporciono el producto 31 en forma de un solido blanquecino (0,069 g, 0,022 mmol, 40% en 2 etapas).
Datos de RMN (400 MHz, 298 K, CDCla): 1H, 8 1,47 (s, 9 H), 3,16 (m, 1 H), 3,30 (s, 3 H), 3,37 (s, 3 H), 3,72 (d, 1 H, J 9,3 Hz), 3,86 (m, 1 H), 3,98 (m, 1 H), 4,15 (m, 1 H), 4,44 (d, 1 H, J 5,4 Hz), 4,61 (m, 1 H).
Etapa b)
A una solucion agitada de compuesto 31 (0,074 g, 0,24 mmol) en metanol (2,7 mL) a 0°C se anadio gota a gota cloruro de acetilo (0,3 mL) durante 1 minuto. La mezcla de reaccion se controlo por TLC (hexano-acetato de etilo 3:2 y diclorometano-metanol 95:5, tincion con ninhidrina) y despues de 4,5 h, el material de partida se hada consumido completamente. La mezcla de reaccion se concentro despues a vado, a continuacion, se volvio a disolver en dioxa- no con unas pocas gotas de H2O y se liofilizo. El solido blanquecino amorfo obtenido y W-(ferc-butoxicarbonil)-L- leucina monohidrato (0,066 g, 0,26 mmol) se disolvio en DMF (3 mL) y se concentro a vado. Despues, el residuo se redisolvio en DMF (3 mL) y se anadio W-etildiisopropilamina (0,13 mL, 0,72 mmol). A esta solucion se anadio hexa- fluorofosfato de N-0-(7-azabenzotriazol-1-il)-W,W,W,W-tetrametiluronio (HATU, 0,12 g, 0,31 mmol) a 0°C. La mezcla de reaccion se mantuvo a 0°C durante 40 min, y 75 minutos adicionales a temperatura ambiente. La mezcla de re- accion se diluyo despues con acetato de etilo (25 mL), se lavo sucesivamente con acido dtrico ac. al 10% (3 x 15 mL) e hidrogenocarbonato sodico saturado ac. (3 x 15 mL) y luego se seco (sulfato de sodio), se filtro y se concentro a vado. La cromatograffa instantanea en columna sobre gel de sflice del residuo usando 2:1 de hexano-acetato de etilo como eluyente, seguido de concentracion a vado de las fracciones apropiadas, proporciono el compuesto 32b como un jarabe incoloro (0,089 g, 0,21 mmol, 88%) que se utilizo directamente en la siguiente etapa.
Etapa c
A una solucion del compuesto 32b (0,089 g, 0,21 mmol) en metanol (2,7 mL) a 0°C, se anadio gota a gota cloruro de acetilo (0,3 mL) durante 0,5 minutos. La mezcla de reaccion se agito despues a TA durante 5,5 h (supervisada con TLC:diclorometano-metanol 95:5, se tino utilizando molibdato de amonio-sulfato de cerio en acido sulfurico ac. al 10%), y despues se concentro a vado. El residuo se volvio a disolver en dioxano (5 mL) y se anadio una pequena cantidad de agua, y a continuacion se liofilizo la solucion. El solido incoloro amorfo obtenido y la sal HBr de acido 4- [2-(4-metil-piperazin-1-il)tiazol-4-il]benzoico (0,089 g, 0,23 mmol) se disolvio en DMF (3 mL) y a continuacion se anadio N-etildiisopropilamina (0,15 mL, 0,85 mmol) y despues la solucion se enfrio a 0°C y se anadio HATU (0,105 g, 0,275 mmol). La mezcla de reaccion se agito a 0°C durante 1 h y una 1 h adicional a temperatura ambiente (supervisada con TLC: diclorometano-metanol 95:5, visualizada con luz UV y tincion utilizando molibdato de amonio- sulfato de cerio en acido sulfurico ac. al 10%). La mezcla de reaccion se diluyo despues con acetato de etilo (25 mL), se lavo con 3:1 hidrogenocarbonato de sodio saturado/salmuera (3 x 20 mL), despues se seco (sulfato de sodio), se filtro y se concentro a vado. La cromatograffa instantanea en columna del residuo utilizando elucion en gradiente por etapas (metanol en diclorometano, 0-5%), seguida de concentracion a vado de las fracciones apropiadas y liofiliza- cion a partir de dioxano (5 mL) y unas pocas gotas de agua, proporciono el producto 32c como un solido amorfo incoloro (0,121 g, 0,20 mmol, 94%).
Etapa d)
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A 32c (0,114 g, 0,188 mmol) se anadio una solucion de 97,5:2,5 de TFA:agua (6 mL) a TA, la solucion obtenida se controlo por LC-MS y despues de agitar durante 2 h a temperatura ambiente la mezcla de reaccion se concentro a vado. El residuo se volvio a disolver en acetato de etilo (25 mL), se lavo con hidrogenocarbonato sodico saturado ac. (3 x 15 mL) y salmuera (1 x 15 mL), despues se seco (sulfato de sodio), se filtro y se concentro a vado. El residuo obtenido como un solido amorfo se disolvio en DMSO-acetonitrilo-agua-dioxano (aprox. 12 ml) y se purifico por HPLC preparativa-MS (Columna: Sunfire 19 x 100 mm (C-is), eluyente A: acetato de amonio 10 mM en agua, eluyen- te B: acetato de amonio 10 mM en 9:1 de acetonitrilo-agua, gradiente: 30% de B a 80% de B en 8 minutos, flujo: 20 mL/min). Las fracciones apropiadas se concentraron a vado. El residuo se volvio a disolver en dioxano con unas gotas de agua, se congelo y se liofilizo, proporcionando el compuesto 32d como un solido amorfo amarillo blanque- cino (0,055 g, 0,10 mmol, 52%). Una parte alfcuota del producto obtenido se disolvio en CDCl3 y se analizo por RMN, lo que indicaba que el producto salfa en la forma ceto (forma de hidrato indetectable) en una mezcla 9:1 de rotameros. Los datos de RMN se refieren al rotamero mayoritario. Cuando se analizo por HPLC-MS, la forma de hidrato es la forma mayoritaria.
Datos de RMN (500 MHz, 293 K, CDCls): 1H, 8 0,96 (d, 3 H, CH3-CH), 1,02 (d, 3 H, CH3-CH) 1,62-1,78 (m, 3 H, CH(CH3)2 y CH2CH(CHs)2), 2,37 (s, 3 H, CH3-N), 2,56 (m, 4 H, 2 x CH2-N), 3,59 (m, 4 H, 2 x CH2-N), 3,70 (m, 1 H, CHH-CHCl), 4,13 (d, 1 H, CHH-O), 4,31 (d, 1 H, CHH-O), 4,42 (m, 1 H, CHCl), 4,60 (m, 1 H, CHH-CHCl), 4,82 (m, 1 H, CHCl-CH), 4,90-4,96 (m, 2 H, CH-C=O y CHNH), 6,85-6,89 (m, 2 H, NH y tiazol-H), 7,78 (d, 2 H, Ar-H), 7,89 (d, 2 H, Ar-H). LR-MS: Calculado para C27H35ClN5O4S: 560,2. Encontrado: 560,3 [M+H], Calculado para C27H37ClN5OaS: 578,2. Encontrado: 578,3.
Ejemplo 7
N-[2-((3aS.6R.6aS)-6-Cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-81pirrol-4-il)-1-S-ciclohexil-2-oxo-etil1-4-[2-(4-metil-piperazin-1-
il)-tiazol-4-il1-benzamida
Etapa a) Ester terc-butflico de acido [2-((3aS,6R,6aS)-6-cloro-3,3-dimetoxi-hexahidro-furo[3,2-6]pirrol-4-il)-1-S- ciclohexil-2-oxo-etil1-carbamico (7a)
La sal HCl de (3aS,6R,6aS)-6-cloro-3,3-dimetoxi-hexahidro-furo[3,2-6]pirrol (13) (0,23 mmol) y Boc-ciclohexil-Gly-OH (64,4 mg, 0,25 mmol) se coevaporo a partir de DMF, se volvio a disolver en 3 mL de DMF, y se enfrio en un bano de hielo. Se anadio DIEA (160 pL, 0,92 mmol), seguido por HATU (108 mg, 0,28 mmol). Despues de 20 minutos, la mezcla se agito a TA durante 2 h 20 min, y se concentro a vado. El residuo se disolvio en EtOAc (10 mL), se lavo sucesivamente con acido dtrico al 10% (5 mL), NaHCO3 saturado (5 mL) y NaCl saturado (2 x 5 mL). La fase orga- nica se seco (Na2SO4) y se concentro. La cromatograffa instantanea en columna (sflice, 2/1 pentano - EtOAc) pro- porciono un solido blanco (86,6 mg, 84% de rendimiento).
LCMS [M+23]+ = 469
Etapa b) N-[2-((3aS,6R,6aS)-6-Cloro-3,3-dimetoxi-hexahidro-furo[3,2-6]pirrol-4-il)-1-S-ciclohexil-2-oxo-etil]-4-[2-(4- metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-benzamida (7b)
Se anadio cloruro de acetilo (0,25 mL) a una solution enfriada con hielo del ester terc-butflico de acido carbamico anterior (86,6 mg, 0,194 mmol) en metanol (2,20 mL). La mezcla se agito a TA durante 3 h 45 min y se evaporo. La liofilizacion a partir de dioxano-agua proporciono la sal HCl de amina desprotegida que despues se coevaporo prime- 5 ro a partir de DMF con la sal HBr de acido 4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)tiazol-4-il]benzoico (83 mg, 0,22 mmol) y despues se volvio a disolver en 2,5 mL de DMF. La mezcla se enfrio en un bano de hielo, se anadio DIEA (140 ^L, 0,80 mmol), seguido de HATU (83,8 mg, 0,22 mmol). Despues de 15 minutos, la mezcla se agito a TA durante 2,5 h. La mezcla se concentro, se disolvio en EtOAc (20 mL), se lavo sucesivamente con NaHCO3 saturado (10 mL) y NaCl saturado (2 x 10 mL). La fase organica se seco (Na2SO4) y se concentro. La cromatografia instantanea en columna 10 (sflice, CH2O2 - MeOH - Et3N)) proporciono solidos de color blanco (121,2 mg, 99% de rendimiento).
LCMS [M+1]+ = 632
Etapa c) N-[2-((3aS,6R,6aS)-6-Cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-b1pirrol-4-il)-1-S-ticlohexil-2-oxo-etil]-4-[2-(4-metil- piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-benzamida (7c)
15 El dimetoxi eter anterior (115 mg, 0,182 mmol) se desprotegio en una solucion de TFA-agua (97,5:2,5 v/v, 6,0 mL) mediante agitation a TA durante 2 h 15 min. La mezcla se concentro, se disolvio en EtOAc (25 mL), se lavo sucesivamente con NaHCO3 saturado (3 x 15 mL) y NaCl saturado (15 mL). La fase organica se seco (Na2SO4) y se eva- poro. El material crudo se purifico por HPLC-MS (columna Sunfire PrepC18 OBD 5 ^m 19 x 100 mm; gradiente de 60 a 80% de B en A, fases moviles A NH4OAc 10 nM en agua y B NH4OAc 10 nM en 90% de MeCN) para proporcionar 20 el compuesto final como un solido blanco (63 mg, rendimiento del 59%).
LCMS ES+ = 604 (hidrato) y ES+ = 586 (cetona)
1H RMN (500 MHz, CDCls) 5 ppm 7,90 y 7,78 (ABc, 2H cada uno, 6,89 (s, 1H), 6,83 (d, 1H, NH), 4,91 (m, 1H), 4,86 (m, 1H), 4,69 (m, 1H), 4,62 (dd, 1H), 4,40 (m, 1H), 4,32 y 4,14 (ABc, 1H cada uno), 3,72 (dd, 1H), 3,60 (m, 4H), 2,58 (m, 4H), 2,38 (s, 3H), 2,10 - 1,04 (m, 11 H)
25 Ejemplo 8
N-r(S)-1-((3aS,6R,6aS)-6-cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-b1pirrol-4-carbonil)-3-fluoro-3-metil-butil1-4-r2-(4-metil-
piperazin-1-il)-tiazol-4-il]benzamida
Etapa a)
Se anadio cloruro de acetilo (0,4 mL) gota a gota a una solucion del compuesto 11 (60 mg, 0,228 mmol) en metanol (4 mL) a 0°C. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 6 horas, se concentro, se disolvio nuevamente en 1,4-dioxano y se liofilizo durante una noche. El residuo se disolvio en 5 mL de DMF. Se anadio y- 5 fluoro-BOC-Leu-OH (Truong et al Synlett 2005 n° 8 1279-1280, 50 mg, 0,201 mmol) y DIEA (133 pL, 0,802 mmol) a la solucion antes de enfriar a 0°C y se anadio HATU (80 mg, 0,211 mmol). La reaccion se agito durante 3 horas a temperatura ambiente antes de concentrar el disolvente a vado. El producto se disolvio en EtOAc (20 mL) y se lavo con NaHCO3 (sat, ac) (10 mL). La fase organica se seco con Na2SO4, se filtro y se concentro a vado. El producto se purifico mediante cromatograffa instantanea (acetato de etilo) para proporcionar el producto 42 con un rendimiento 10 del 99% (79 mg).
Etapa b)
Se anadio cloruro de acetilo (0,4 mL) gota a gota a una solucion del compuesto 42 (79 mg, 0,199 mmol) en metanol (4 mL) a 0°C. La mezcla de reaccion se agito a temperatura ambiente durante 6 horas, se concentro, se disolvio 15 nuevamente en 1,4-dioxano y se liofilizo durante una noche. El residuo se disolvio en 5 mL de DMF. HBr de acido 4- [2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-benzoico (76 mg, 0,198 mmol). Se anadio DIEA (119 pL, 0,721 mmol) a la solucion antes de enfriar a 0°C y se anadio HATU (72 mg, 0,189 mmol). La reaccion se agito durante 3 horas a temperatura ambiente antes de eliminar el disolvente a vado. El producto se disolvio en CHCh (15 mL) y se lavo con NaH- CO3 (sat, ac) (10 mL). La fase organica se seco con Na2SO4, se filtro y se evaporo. El producto se purifico mediante 20 cromatograffa instantanea (cloroformo:etanol 7:3 + 0,1% de TEA) para producir 43 adecuadamente puro que se
podfa utilizar directamente en la siguiente etapa.
Etapa c)
El compuesto 43 (104 mg, 0,198 mmol) (no puro) se disolvio en 9 mL de DCM:DMSO (2:1). Se anadio TEA (111 pL, 25 0,797 mmol) seguido por SO3*piridina (48 mg, 0,299 mmol). La reaccion se agito a temperatura ambiente y se con-
trolo por LC-MS. Despues de 4 horas, se anadio otra porcion (48 mg) de SO3*piridina y despues de 4 horas mas, otra porcion. Despues de 22 horas (durante una noche) se anadio una porcion adicional y despues de 2 horas mas se anadio una porcion final. La solucion se vertio en un embudo de separacion con 40 mL de DCM y se lavo con 20 mL de NaHCO3 (sat, ac). La fase organica se seco con Na2SO4, se filtro y se concentro al vado. El producto se purifico 30 por HPLC semipreparativa en una columna Sunfire C18 con fases moviles A (90:10 de H2O:acetonitrilo, NH4Ac 10 mM) y B (10:90 de H2O: acetonitrilo, NH4Ac 10 mM) partiendo de 40-75% de B. El producto se obtuvo como un soli- do blancuzco con un rendimiento del 29% (30 mg).
RMN (CDCl3, 400 MHz): 1,37- 1,52 (m, 6H), 2,10- 2,30 (m, 2H), 2,37 (s, 3H), 2,58- 2,63 (m, 2H), 3,57- 3,62 (m, 2H), 3,73 (dd, 1 H, J = 10,5, 8,7), 4,10 (d, 1 H, J = 16,9), 4,28 (d, 1 H, J = 16,9), 4,43- 4,50 (m, 1H), 4,71 (dd, 1 H, J = 35 10,6, 6,9), 4,78 (d, 1H, J = 6,0), 4,87-4,93 (m, 1H), 4,95- 5,03 (m, 1H), 6,86 (s, 1H), 7,37 (d, 1H, J = 7,3), 7,73 (d, 2H,
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J = 8,3), 7,82 (d, 2H, J = 8,6). LRMS (M+H) 578. Ejemplo 9
Un elemento basico P3 alternativo
Sal HCl de acido 3-fluoro-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)-tiazol-4-il1benzoico Etapa a) 4-Bromo-3-fluorobenzoato de metilo (9a)
El acido 4-bromo-3-fluorobenzoico (2,46 g, 11,2 mmol) se disolvio en MeOH (9 mL) y tolueno (4 mL) y se enfrio en un bano de hielo. Se anadio (trimetilsilil)diazometano (11 mL, 2,0 M en hexanos, 22 mmol) gota a gota hasta que el color amarillo persistio. La solucion se agito a temperatura ambiente durante 40 minutos y despues se concentro a vado. Un segundo lote de acido carboxflico (2,43 g) se trato de manera similar. El producto crudo de los dos lotes se combino y se sometio a cromatograffa instantanea (sflice, 5/1 de pentano - EtOAc) para proporcionar el ester meffli- co como solidos de color blanco (4,92 g, 95% de rendimiento).
1H RMN (400 MHz, CDCla) delta ppm 7,77 (m, 1H), 7,71 (m, 1H), 7,64 (m, 1H), 3,93 (s, 3H).
Etapa b) 4-Acetoxi-3-fluorobenzoato de metilo (9b)
F
Cloruro de alilo (105 pL, 1,28 mmol) y TFA (20 pL, 0,26 mmol) se anadieron a una suspension de polvo de zinc (480 mg, 7,34 mmol) y bromuro de cobalto(II) anhidro (96,6 mg, 0,44 mmol) en MeCN (4 mL), en atmosfera de gas inerte. Despues de agitar a temperatura ambiente durante 10 min, el bromuro de arilo (1,003 g, 4,30 mmol disuelto en 5 mL de MeCN) procedente de (a) se anadio, seguido por anhffdrido acetico (0,45 mL, 4,79 mmol) y mas MeCN (1 mL). La mezcla se agito durante una noche, se inactivo con HCl 1 M (20 mL), y despues se extrajo con EtOAc (3 x 20 mL). La fase organica se lavo sucesivamente con NaHCO3 saturado acuoso (20 mL) y NaCl saturado (2 x 20 mL), se seco (Na2SO4) y se concentro. La cromatograffa instantanea (sflice, 6/1 a 4/1 de eter de petroleo - EtOAc) propor- ciono bromuro recuperado (161,1 mg, 16%) y la cetona deseada (solidos blancos, 305,5 mg, 36%).
RMN (CDCla) delta ppm: 1H (400 MHz) 7,94-7,86 (m, 2H), 7,80 (dd, 1H, J = 11,2, 1,6 Hz), 3,95 (s, 3H), 2,67 (d, 3H, J = 4,4 Hz); 19F (376 MHz) -109,2 (m); 13C (100 MHz) 195,4 (d , J = 3,7 Hz), 165,1 (d, J = 2,2 Hz), 161,6 (d, J = 255 Hz), 135,8 (d, J = 8,1 Hz), 130,7 (d, J = 2,9 Hz), 129,0 (d, J = 14 Hz), 125,2 (d, J = 3,6 Hz), 117,9 (d, J = 26 Hz), 52,7 (s), 31,4 (d, J = 7,3 Hz).
Etapa c) 4-(2-Bromoacetoxi)-3-fluorobenzoato de metilo (9c)
F
THF (10 mL) y 2-pirrolidinona (91 pL, 1,20 mmol) se anadieron a una mezcla de la cetona procedente de b) (198 mg, 1,01 mmol) y tribromhidrato de pirrolidona (532 mg, 1,07 mmol). Despues de calentar a 60-65°C durante 2 h, la mezcla se concentro a vacfo y despues se repartio entre EtOAc (20 mL) y Na2S2O3 saturado (10 mL). La fase acuosa se extrajo con EtOAc (10 mL). Las fases organicas se combinaron, se lavaron con NaCl saturado (2 x 10 mL), se seca- ron (Na2SO4) y se concentraron. La cromatograffa instantanea (sflice, 7/1 de eter de petroleo - EtOAc) proporciono solidos de color blanco (0,2634 g) que conternan 84% del bromuro deseado (como se determino por integracion de picos de 19F RMN).
RMN (CDCl3) 6 ppm: 1H (400 MHz) 7,93 (m, 1H), 7,88 (m, 1H), 7,79 (dd, 1H, J = 11,2, 1,6 Hz), 4,50 (d, 2H, J = 2,4 Hz), 3,94 (s, 3H); 19F (376 MHz) -108,4 (m).
Etapa d) 3-Fluoro-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)-tiazol-4-il]benzoato de metilo (9d)
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Se anadio EtOH (5,0 mL) a la bromocetona anterior (193 mg, 0,70 mmol) y amida de acido 4-metil-piperazin-1- carbotioico (113 mg, 0,71 mmol) y la mezcla se calento a 70°C durante 2h 15 min. Los precipitados se filtraron, se lavaron con EtOH fno, y se secaron a vado y se caracterizaron. El procedimiento se repitio a una escala mayor para 1,75 g de bromocetona (6,36 mmol).
RMN (1/1 CDCla- CD3OD) 8 ppm: 1H (400 MHz) 8,20 (m, 1H), 7,86 (dd, 1H, J = 8,4, 1,6 Hz), 7,76 (dd, 1H, J = 11,4, 1,8 Hz), 7,38 (d, 1H, J = 2,4 Hz), 4,23 (a, 2H), 3,95, (s, 3H), 3,65 ( a, 4H), 3,32 (a, 2H), 2,98 (s, 3H); 19F (376 MHz) - 114,0 (m). LCMS [M+H]+ = 336.
Los precipitados de ambas preparaciones se combinaron y se suspendieron en NaHCO3 saturado (50 mL). La mezcla se extrajo con EtOAc. La fase organica se lavo con agua, se seco (Na2SO4), y se evaporo para proporcionar el compuesto del tftulo en forma de solidos de color crema (1,76 g).
Etapa e) Sal HCl de acido 3-fluoro-4-[2-(4-metilpiperazin-1-il)-tiazol-4-il]benzoico (9e)
El ester metilico (1,76 g, 5,25 mmol) (9d) se calento a 80°C con HCl 6 M (40 mL) durante 5,5 h. Se anadio mas HCl 6 M (10 mL) y la mezcla se calento a 90°C durante 1 h 15 min. Despues de enfriar, la mezcla se evaporo a vado y se liofilizo a partir de agua para proporcionar el producto final en forma de solidos de color crema con un rendimiento cuantitativo.
RMN (DMSO-d6) 8 ppm: 1H (400 MHz) 11,60 (a, 1H), 8,18 (t, 1H, J = 8,0 Hz), 7,82 (dd, 1H, J = 8,4, 1,6 Hz), 7,72 (dd, 1H, J = 12,0, 1,6 Hz), 7,48 (d, 1H, J = 2,8 Hz), 4,11 (m, 2H), 3,58 (m, 2H), 3,49 (m, 2H), 3,19 (m, 2H), 2,80 (d, 3H, J = 4,4 Hz); 19F (376 MHz) -113,5 (m); 13C (100 MHz) 168,9, 166,0, 159,0 (d, J = 250 Hz), 143,4, 131,4 (d, J = 8 Hz), 129,8, 125,8 (d, J = 11 Hz), 125,6, 116,6 (d, J = 24 Hz), 111,1 (J = 15 Hz), 51,1, 45,0, 41,9. LCMS [M+H]+ = 322.
Ejemplo 10
N-[(S)-1-((3aS.6R.6aS)-6-Cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-b1pirrol-4-carbonil)-3-metil-butil1-3-fluoro-4-[2-(4-metil-
piperazin-1-il)-tiazol-4-il1-benzamida
Etapa a) N-[(S)-1-((3S,3aS,6R,6aS)-6-Cloro-3-hidroxi-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-metil-butil]-3-fluoro-4- [2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-benzamida
Este compuesto se preparo a partir de ester terc-butflico de acido N-[(S)-1-((3S,3aS,6R,6aS)-6-cloro-3-hidroxi- hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carboxflico mediante una serie de etapas de desproteccion (cloruro de acetilo, MeOH) y de acoplamiento mediado por HATU con Bocleucina inicialmente y, finalmente, sal HCl de acido 3-fluoro-4-[2-(4- metil-piperazin-1 -il)-tiazol-4-il]benzoico preparada como se ha descrito en el Ejemplo 9.
LCMS: [M+H]+ = 580; [M-H]- = 578. 19F RMN (376 MHz, CDCla + CD3OD) delta ppm -113,3 (m).
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Etapa b)
Se anadio trietilamina (20 jL) y complejo trioxido de azufre-piridina (20 mg, 0,125 mmol) a una solucion del alcohol (16,6 mg, 0,03 mmol) de (a) en 0,9 mL de CH2Cl2 y 0,45 mL de DMSO y se agito a TA. Despues de 2 h, se anadio mas trietilamina (10 jL) y complejo trioxido de azufre-piridina (10 mg) y la mezcla se agito durante una noche para completar la oxidacion a la cetona. La mezcla se diluyo con CH2Cl2 y se lavo con NaHCO3 saturado seguido de NaCl acuoso saturado. La fase organica se seco (Na2SO4) y se evaporo para proporcionar un aceite. El material crudo se purifico por HPLC-MS (columna Sunfire PrepC-is jm 19 x 100 mm; OBD 5 gradiente de 30 a 80% de B en A, fases moviles A NH4OAc 10 mM en agua y B NH4OAc 10 mM en 90% de MeCN) para proporcionar el compuesto del tttulo en forma de solidos blancos (4,4 mg).
RMN (CDCh) delta ppm: 1H (500 MHz, 2 rotameros observados, rotamero mayoritario descrito) 8,22 (m, 1H, fenil H5), 7,56-7,54 (m, 2H, fenil H2 y H6), 7,21 (m, 1H, tiazol), 6,81 (d, 1H, J = 8,5 Hz, NH), 4,94-4,85 (m, 2H, NHCHC=O y ClCCHO), 4,84 (d, 1H, J = 6,0 Hz, (O=C)NCHC=O)), 4,56 (dd, 1H, J = 10,5, 7,0 Hz), 4,42 (m, 1H, ClCH), 4,32 y 4,14 (ABq, 1H cada uno), 3,70 (dd, 1H, J = 10, 9 Hz), 3,59 (m, 4H), 2,57 (m, 4H), 2,37 (s, 3H, NMe), 1,8-1,6 (m, 3H, CH2CHMe2), 1,03 (d, 3H, J = 6,0 Hz, i-Pr), 0,96 (d, 3H, J = 6,5 Hz, i-Pr); 19F (376 MHz) -112,9 (m, rotamero mayoritario, 84%) y -113,2 (m, minoritario, 16%).
LCMS: masa molar monoisotopica 577,4 Da; ES+ = 578,4 (M+H)+, 596,5 [M+H2O+H]+.
Ejemplo 11
Un elemento basico P3/P2 alternativo
Etapa a) Ester isopropflico de acido (S)-2-[(S)-1-(4-bromo-fenil)-2,2,2-trifluoro-etilamino]-4-metil-pentanoico (11 a)
r
A una solucion agitada de acido (S)-2-[(S)-1-(4-bromo-fenil)-2,2,2-trifluoro-etilamino]-4-metil-pentanoico, preparado como se muestra Li, C. S. et al Bioorg. Med. Chem. Lett. 2006, 16, 1985, (1,80 g, 4,9 mmol) en alcohol isopropflico (100 mL), se anadio acido sulfurico concentrado (2 mL). La solucion resultante se calento a 80°C durante 4 horas. La mezcla de reaccion se dejo enfriar y despues se concentro a vach. El aceite resultante se disperso en CH2Cl2 (100 mL), se lavo con NaHCO3 saturado (2 x 50 mL), se seco (MgSO4) y se concentro a vach para proporcionar el compuesto del tftulo como un aceite marron (1,77 g, 88%). MS [M+H] 412.
Etapa b) Ester isopropflico de acido (S)-4-metil-2-{(S)-2,2,2-trifluoro-1-[4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)- fenil]-etilamino}-pentanoico (11b)
A una solucion agitada del bromoderivado 1 k (2,2 g, 5,36 mmol) en DMF (30 mL) se anadio bis(pinacolato) boro (2,0 g, 8,04 mmol), acetato de potasio (1,6 g 16,1 mmol) y cloruro de [1,1'-bis(difenilfosfino)ferrocen]paladio(II) en complejo 1:1 con CH2Cl2 (0,438 g, 0,54 mmol). La solucion resultante se sello en un tubo y se calento en un microondas a 160°C durante 20 minutos. La mezcla de reaccion se dejo enfriar a temperatura ambiente y despues se filtro a traves de una columna corta de sflice eluida con acetato de etilo (500 mL). La solucion resultante se concentro a
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vado y el producto crudo se purifico mediante cromatograffa de fase inversa en columna C18 (H2O:MeCN, gradiente de 50-100%) para proporcionar el compuesto del fftulo como un aceite marron (0,920 g, 38%). MS [M+H] 458.
Etapa c) Ester isopropflico de acido (S)-4-meffl-2-((S)-2,2,2-trifluoro-1-{4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-fenil}- etilamino)-pentanoico (11c)
A una solucion agitada del derivado de borolano 1 k (0,72 g, 1,57 mmol) en DMF:H2O (1:1, 20 mL) se anadio 1-(4- bromo-tiazol-2-il)-4-metil-piperazina (0,5 g, 1,89 mmol), carbonato de sodio (0,2 g, 1,89 mmol) y cloruro de [1,1'- bis(difenilfosfino)ferrocen]paladio (II) en complejo 1:1 con CH2Cl2 (0,129 g, 0,16 mmol). La solucion resultante se sello en un tubo y se calento en un microondas a 160°C durante 20 minutos. La mezcla de reaccion se dejo enfriar y despues se diluyo con CH2O2 (100 mL). La fase organica se separo, se seco (MgSO4) y se concentro a vado. El producto crudo se purifico mediante cromatograffa instantanea en columna (acetato de etilo:MeOH, 9:1) para proporcionar el compuesto del fftulo como un solido rojo oscuro (0,150 g, 13%). MS [M+H] 513. Tiempo de retencion 4,0 minutos 50-97 (NH3)2CO310 mM:MeCN 6 min Gradiente C12 Fase inversa.
Etapa d) Acido (S)-4-metil-2-((S)-2,2,2-trifluoro-1-{4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-fenil}-etilamino)-pentanoico; cloruro de hidrogeno (11d)
A una mezcla agitada de acido clorlffdrico 2 M y dioxano (1:1, 10 mL) se anadio ester isopropflico de acido (S)-4- metil-2-((S)-2,2,2-trifluoro-1-{4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-fenil}-etilamino)-pentanoico (0,15 g, 0,29 mmol), preparado como se describe por Palmer et al. en J. Med. Chem. 2005, 48, 7520-7534. La solucion se calento durante 20 horas a 100°C y despues se concentro a vado para proporcionar el compuesto del fftulo como un solido marron oscuro (0,14 g, 98%) que se puede acoplar al elemento basico P1 y la cetona regenerada por cualquiera de los metodos descritos anteriormente, normalmente sin purificacion adicional. MS M - H 469.
Ejemplo 11A
Un elemento basico P3 alternativo
i. AcOH, bromo, TA, 2 h, rendimiento del 55%; ii. KF, acetonitrilo, 18-corona-6, 90°C, 16 h; rendimiento del 31%; iii. AcOH, bromo, 45°C, 4 h, rendimiento del 100%; iv. Amida de acido 4-metil-piperazin-1-carbotioico, A, 2 h, rendimiento del 74%; LiOH, TA, 16 h, rendimiento del 100%.
Disponibilidad de materiales de partida -
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El 4-acetilbenzoato de metilo esta disponible en Aldrich; amida de acido 4-metil-piperazin-1-carbotioico - se encon- traron 11 proveedores en SciFinder (por ejemplo, Chem Pur Products Ltd en Alemania).
Etapa a) Ester metflico de acido 4-(2-bromo-acetil)-benzoico
o
OMe O
Se anadio bromo (8,4 mmol) a una solucion de ester metilico de acido 4-acetil-benzoico (8,4 mmol) en acido acetico (20 mL). La reaccion se agito a TA durante 2 h, tiempo durante el cual el color rojo desaparecio y se formo un preci- pitado blanquecino. El producto se recogio por filtracion y se lavo con metanol/agua fna (200 mL 1:1) para propor- cionar un polvo blanco (55%). 1H RMN (400MHz, CDCls) 3,98 (3H, s), 4,20 (2H, s), 8,02 (2H, d, J = 8Hz), 8,18 (2H, d, J = 8Hz).
Etapa b) Ester metflico de acido 4-(2-fluoro-acetil)-benzoico
A una suspension de fluoruro de potasio (3,11 mmol) en acetonitrilo (1 mL) se anadio 18-corona-6 (0,1 mmol) y la reaccion se calento a 90°C durante 30 minutos. Se anadio acido 4-(2-bromo-acetil)-benzoico (1,56 mmol) y la reaccion se calento a 90°C durante 16 h. La reaccion se diluyo con agua (10 mL) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 20 mL). El producto se purifico sobre sflice eluyendo con 5-15% de acetato de etilo en isohexano para proporcionar a una concentracion a vach de las fracciones deseadas, el producto del tftulo como un solido blanco (31%). 1H RMN (400MHz, CDCla) 3,98 (3H, s), 5,55 (2H, d, J = 50Hz), 7,95 (2H, d, J = 8Hz), 8,18 (2H, d, J = 8Hz).
Etapa c) Ester metflico de acido 4-(2-bromo-2-fluoro-acetil)-benzoico
A una suspension de acido 4-(2-fluoro-acetil)-benzoico (1,19 mmol) en acido acetico (5 mL) se anadio bromo (1,19 mmol). La reaccion se calento a 45°C durante 4 h, tiempo durante el cual se formo una solucion de color verde. La reaccion se concentro a vach y se destilo azeotropicamente dos veces con tolueno para producir el compuesto del tftulo como un solido verde (100%). El producto se uso crudo en la siguiente etapa. 1H rMn (400MHz, CDCh) 3,98 (3H, s), 7,04 (1H, s), 8,05 - 8,10 (4H, m).
Etapa d) Ester metflico de acido 4-[5-fluoro-2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-benzoico
Ester metflico de acido 4-(2-bromo-2-fluoro-acetil)-benzoico (1,18 mmol) y amida de acido 4-metil-piperazin-1- carbotioico (1,18 mmol) se disolvieron en etanol (10 mL). La reaccion se calento a reflujo durante 2 h. La reaccion se enfrio a TA haciendo que el producto precipitara. El producto se recogio por filtracion y se lavo con etanol frio. El producto se trato con bicarbonato de sodio acuoso para proporcionar el compuesto del tftulo como un aceite incoloro (74%). MS (ES+) 337 (M+H, 100%).
Etapa f) Diclorhidrato de acido 4-[5-fluoro-2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il1-benzoico
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A una solucion de ester metflico de acido 4-[5-fluoro-2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-benzoico (0,43 mmol) en tetrahidrofurano/agua (2,5 mL, 4:1) se anadio hidroxido de litio (0,5 mmol). La reaccion se agito a TA durante 16 h. La reaccion se concentro a vaco y se anadio acido clorlddrico (2 N, 3 mL) haciendo que el producto precipitara como un solido blanco. El producto se recogio por filtracion para proporcionar el producto del tftulo como un solido blanco (79%). MS (ES+) 322 (M+H, 100%).
Ejemplo 12
N-[1-(6-Cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3.2-b1pirrol-4-carbonil)-3-metil-butil1-4-[5-fluoro-2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-
ill-benzamida
Etapa a) Ester bendlico de acido 6-benciloxi-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carboxflico (12a)
Periodinano de Dess-Martin (12,5 g, 30 mmol) se disolvio en DCM (250 mL). El compuesto 10 procedente del docu- mento WO07/066180 (7,4 g, 20 mmol) en DCM (50 mL) se anadio a una solucion agitada de oxidante a TA bajo atmosfera de nitrogeno en 45 min. Una vez que se considero que la reaccion se habfa completado segun TLC, se anadio Na2S2O3 acuoso al 10% (200 mL) y la mezcla se agito a TA durante otros 15 minutos. El sistema de dos fases se transfirio a un embudo de separacion y se extrajo dos veces con EtOAc (200 mL y 100 mL, respectivamen- te). Las fases organicas combinadas se lavaron una vez con NaHCO3 acuoso saturado (100 mL) y salmuera (100 mL), se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el disolvente se evaporo a vaco, obteniendose el producto crudo 2 como un aceite claro (7,69 g); ESI+, m/z: 368 (M+ +1).
Etapa b) Ester bendlico de acido 6-benciloxi-3,3-dimetoxi-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carboxflico (12b)
El compuesto 12a (7,6 g) se disolvio en metanol seco (100 mL). Se anadio ortoformiato de trimetilo (30 mL) y pTsOH (0,2 g) a TA bajo una atmosfera de nitrogeno. La mezcla se calento a 60°C durante 8 horas. Una vez que la reaccion se considero completada segun TLC, se enfrio a TA y se concentro a vach. El producto crudo se purifico mediante cromatograffa en columna sobre gel de sflice eluyendo con acetato de etilo-heptano (1:4) para proporcionar despues de la concentracion a vaco, el cetal 12b como un aceite claro (5,9 g, 71% en 2 etapas); eS|+, m/z: 382 (M+ -OMe).
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Etapa c) Ester ferc-butilico de acido (3aS,6R,6aS)-6-hidroxi-3,3-dimetoxi-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carbox^lico (12c)
Una solucion de compuesto 12b (2,5 g, 6,4 mmol) en metanol (60 mL) y Pd(OH)2 (0,7 g) se agito a TA bajo atmosfe- ra de H2 durante 48 horas. La mezcla se filtro y se concentro a vach. El residuo (2,8 g, 14,8 mmol) se disolvio en 75 mL de una mezcla de dioxano/agua (2:1). Una solucion de Na2CO3 al 10% (25 mL) se anadio gota a gota a pH 9-9,5. La mezcla se enfrio a 0°C en un bano de hielo-agua y se anadio anlddrido de Boc en una porcion. La reaccion se agito a TA durante una noche y el pH de la mezcla se mantuvo a 9-9,5 mediante la adicion de mas solucion de Na2CO3 al 10%, si era necesario. La mezcla se filtro y el disolvente se elimino a vach. La mezcla acuosa se extrajo con 3 x 100 mL de EtOAc, las fases organicas combinadas se lavaron con 100 mL de agua y 100 mL de salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y el disolvente se evaporo a vach para proporcionar 3,79 g del carbamato como un aceite claro (89%), ESI+, m/z: 312 (M++Na).
Etapa d) Ester bendlico de acido (3aS,6R,6aS)-6-hidroxi-3,3-dimetoxi-hexahidro-furo[3,2-6]pirrol-4-carboxflico (12d)
A una solucion agitada de compuesto 12c (3,8 g, 13,13 mmol) en CH2Cl2 (100 mL) se anadio HCl 2 M en MeOH (50 mL). La solucion resultante se agito durante una noche y despues se concentro a vach y se destilo azeotropicamen- te con tolueno (3 x 100 mL). El residuo crudo se disolvio en CH2Cl2 (100 mL), se enfrio a 0°C y se anadio piridina (1,071 |jL, 13,13 mmol) seguido de la adicion gota a gota de CbzCl (1,875 jL, 13,13 mmol). La reaccion se agito a temperatura ambiente durante 2 horas, despues se lavo con HCl 2 M (2 x 50 mL), NaHCO3 saturado (2 x 50 mL), se seco (MgSO4) y se concentro. El residuo se purifico mediante cromatograffa instantanea en columna (5-100% de isohexano:EtoAc) para obtener el compuesto del tftulo como un aceite claro (2510 mg, 59%). MS M + H 324.
Etapa e) Ester bendlico de acido (3aS,6R,6aS)-6-metanosulfoniloxi-3,3-dimetoxi-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4- carboxflico (12e)
A una solucion agitada del compuesto 12d (500 mg, 1,55 mmol) en CH2Cl2 (20 mL) se anadio trietil amina (332 jL, 2,32 mmol) y cloruro de mesilo (266 mg, 2,32 mmol). Despues de agitar durante 30 minutos, la reaccion se lavo con NaHCO3 saturado (1 x 20 mL), HCl 2 M (1 x 20 m), se seco con MgSO4 y se concentro para proporcionar el compuesto del tftulo (655 mg, 99%) como un aceite de color amarillo. MS M + H 402.
Etapa f) Ester bendlico de acido (3aS,6S,6aS)-6-cloro-3,3-dimetoxi-hexahidro-furo[3,2-6]pirrol-4-carboxflico (12f)
A una solucion agitada del compuesto 12e (550 mg, 1,37 mmol) en DMF (30 mL) se anadio cloruro de litio (721 mg, 13,7 mmol). Despues de agitar durante 120 minutos a 120°C, la reaccion se concentro a vach. El residuo se diluyo con CH2Cl2 (50 mL), se lavo con agua (1 x 20 mL), se seco con MgSO4 y se concentro a vach. El residuo se purifico mediante cromatograffa instantanea en columna (5-66% de isohexano:EtOAc) para proporcionar el compuesto del
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tftulo (330 mg, 72%) como un aceite amarillo. MS M + H 342, 344.
Etapa g) Ester ferc-bufflico de acido [2-(6-cloro-3,3-dimetoxi-hexahidrofuro[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-metilbutil]- carbamico (12g)
Ester bendlico de acido 6-cloro-3,3-dimetoxi-hexahidro-furo[3,2-b1pirrol-4-carbox^lico (68 mg, 0,20 mmol) se despro- tegio mediante hidrogenacion catalftica usando paladio sobre carbono al 10% e hidrogeno a presion atmosferica. Despues de agitar durante 2 horas, la suspension se filtro a traves de Celite y el filtrado se evaporo en un evapora- dor rotatorio para proporcionar 6-cloro-3,3-dimetoxi-hexahidrofuro[3,2-b]pirrol crudo, que se acoplo con N-Boc- leucina utilizando HATU de la misma manera que en el metodo descrito en el Ejemplo 2, lo que proporciono el com- puesto del tftulo (78 mg, 93%). MS m/z 421,2 (M+H)+.
Etapa h) N-[2-(6-Cloro-3,3-dimetoxi-hexahidrofuro[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-metilbutil]-4-[5-fluoro-2-(4-metil-piperazin- 1-il)-tiazol-4-il]-benzamida (12h)
El ester terc-bufflico de acido [2-(6-cloro-3,3-dimetoxi-hexahidrofuro[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-metilbutil-carbamico (78 mg, 0,185 mmol) se desprotegio en condiciones acidas (cloruro de acetilo en metanol) como se describe en el Ejemplo 4, a continuacion, se acoplo el producto intermedio de clorhidrato de pirrol crudo con la sal HCl de acido 4-[5- fluoro-2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-benzoico usando las condiciones HATU como se describe en el Ejemplo 2, lo que proporciono el compuesto del tftulo (98 mg, 85%). MS m/z 624,2 (M+H)+.
1H-RMN (400MHz, CDCla): 7,91 (d, 2H), 7,81 (d, 2H), 6,85 (d, 1H), 5,00 (m, 1H), 4,75 (d, 1H), 4,60 (m, 1H), 4,50 (dt, 1H), 4,12 (d, 1H), 3,92 (d, 1H), 3,75 (m, 1H), 3,49 (m, 4H), 3,48 (m, 1H), 3,45 (s, 3H), 3,28 (s, 3H), 2,62 (m, 4H), 2,42 (s, 3H), 1,85 (m, 1H), 1,70 (m, 2H), 1,05 (d, 3H), 1,00 (d, 3H).
Etapa i) N-[1-(6-Cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-metilbutil]-4-[5-fluoro-2-(4-metil-piperazin-1-il)- tiazol-4-il]-benzamida (12i)
N-[2-(6-Cloro-3,3-dimetoxi-hexahidrofuro[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-metilbutil]-4-[5-fluoro-2-(4-etilpiperazin-1-il)-tiazol- 4-il]-benzamida (98 mg, 0,157 mmol) se hidrolizo en condiciones acidas como se describe en el Ejemplo 5. El resi- duo se purifico mediante cromatograffa HPLC preparativa (C8, gradiente de 10 - 90% de MeCN/H2O) lo que proporciono el compuesto del tftulo puro 41,8 mg (46%), como una mezcla de 2 rotameros, de ambos la cetona (27%) [MS m/z 578,1 (M+H)+] y el hidrato (73%) [MS m/z 596,1 (M+H2O+H)+].
Ejemplo 13
6-Cloro-4-(4-metil-2-[2.2.2-trifluoro-1-(4'-metanosulfonil-bifenil-4-il)-etilamino1-pentanoil}-tetrahidro-furo[3,2-b1pirrol-3-
ona
Etapa a 1-(6-Cloro-3,3-dimetoxi-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-il)-4-metil-2-[2,2,2-trifluoro-1-(4'-metanosulfonil-bifenil-4- il)-etilamino]-pentan-1-ona (13a)
El ester bendlico del acido 6-cloro-3,3-dimetoxi-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carboxflico (55 mg, 0,16 mmol) se des- protegio mediante hidrogenacion catalftica usando paladio sobre carbono al 10% e hidrogeno a presion atmosferica. Despues de agitar durante 2 horas, la suspension se filtro a traves de Celite y el filtrado se concentro. La amina obtenida se acoplo entonces con acido 4-metil-2-[2,2,2-trifluoro-1-(4'-metanosulfonil-bifenil-4-il)-etilamino]-pentanoico (76 mg, 0,17 mmol), preparado como se describe en el documento WO07/006716, usando las condiciones de HATU como se describe en el Ejemplo 2, lo que proporciono el compuesto del tftulo (101 mg, 50%).
Etapa b
El compuesto 13a (47 mg, 0,07 mmol) se hidrolizo en condiciones acidas como se describe en el Ejemplo 5. El resi- duo obtenido se purifico mediante cromatograffa en columna (EtOAc-P.eter 3:2), lo que proporciono el compuesto del tftulo puro (26 mg), [MS m/z 586,4.
Eiemplo 14
6-Cloro-4-[4-metil-2-(2.2.2-trifluoro-1-(4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il1-feniff-etilamino)-pentanoil1-tetrahidro-
furo[3.2-b1pirrol-3-ona
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Etapa a) 1-(6-Cloro-3,3-dimetoxi-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-il)-4-metil-2-(2,2,2-trifluoro-1-{4-[2-(4-metil-piperazin-1- il)-tiazol-4-il]-fenil}-etilamino)-pentan-1-ona (14a)
El grupo bencilo del ester bendlico de acido 6-cloro-3,3-dimetoxi-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carboxflico (35 mg, 0,10 mmol) se retiro por hidrogenacion catalftica usando paladio sobre carbono al 10% e hidrogeno a presion at- mosferica. Despues de agitar durante 2 horas, la suspension se filtro a traves de Celite y se concentro el filtrado. La amina obtenida se acoplo entonces con el acido del Ejemplo 11, etapa D (42 mg, 0,09 mmol) usando las condiciones HATU como se describe en el Ejemplo 2, lo que proporciono el compuesto del tftulo (45 mg).
Etapa b
El compuesto 14a (47 mg, 0,07 mmol) se hidrolizo en condiciones acidas, como se describe en el Ejemplo 5. El residuo obtenido se purifico mediante cromatograffa en columna (CH2Cl2-acetona 2:1 + 0,05% de DIEA) lo que proporciono el compuesto del tftulo puro (20 mg).
Ejemplo 15
Sintesis alternativa del elemento basico P1
Etapa i)
La etapa g) del Ejemplo 1 fue optimizada del modo siguiente: Una mezcla de las aminas monodclicas y bidclicas representadas anteriormente (aproximadamente 1,8 mmol) de la primera reaccion de la etapa g), se disolvio en acetato de etilo (25 mL) y se anadio trietilamina (1,5 mL). La solucion se calento a reflujo durante 3 h, vigilada por LC-MS, despues se anadio trietilamina adicional (1,5 mL) y la mezcla de reaccion se sometio a reflujo otras 15 h. La mezcla de reaccion se enfrio despues a aproximadamente 0°C y se anadio en una porcion cloroformiato de bencilo (0,38 mL, 2,7 mmol) y despues se dejo que alcanzara la TA. La reaccion se controlo por TLC (4:1 y 3:2 de hexano- acetato de etilo, visualizada con luz Uv y tincion con AMC) y despues de 4 h la mezcla de reaccion se diluyo con acetato de etilo (15 mL), se lavo sucesivamente con acido cftrico ac. al 10% (3 x 25 mL) e hidrogenocarbonato sodi- co saturado ac. (3 x 25 mL), despues se seco (sulfato de sodio), se filtro y se concentro. La cromatograffa instanta- nea del residuo (elucion en gradiente por etapas, acetato de etilo en hexano, 10-20%), seguida de una concentra- cion de las fracciones adecuadas y un secado a vado durante una noche, proporciono el producto como una espu- ma incolora (0,57 g, 1,06 mmol).
Datos de RMN (400 MHz, 298 K, CDCl3): 1H, 8 1,02 y 1,10 (2 s, 9H, C(CH3)3), 3,13 (m, 1H, CHH), 3,59 y 3,80 (2 m, 2 x 1H, CH2), 3,99-4,1,5 (m, 2H, CHH y CH), 4,34, 4,42, 4,46 y 4,68 (4 s a, 2H, mayoritario y minoritario CH), 4,84 (m, 1H, CH), 4,92-5,16 (m, 2H, CH2), 7,11-7,80 (m, 15 H, ArH).
Etapa ii)
A una solucion agitada del producto de la etapa i) (0,56 g, 1,05 mmol) en THF (6 mL) se anadio una solucion de fluoruro de tetrabutilamonio 1 M en THF (1,26 mL), y se agito a TA durante una noche. La mezcla de reaccion se concentro despues sobre sflice y una cromatograffa instantanea en columna del residuo (elucion en gradiente por etapas, acetato de etilo en hexano, 50-100%), seguida de una concentracion de las fracciones adecuadas y un se- 5 cado a vado durante una noche, proporciono el producto como un jarabe incoloro (0,27 g, 0,91 mmol, 87%).
Datos de RMN (400 MHz, 298 K, CDCla): 1H, 8 2,22 y 3,00 (2 d, 1H, Joh3 = 3,5 Hz, OH mayoritario y minoritario), 3,30 (m, 1 H, CHH), 3,89 (m, 1 H, CHH), 4,00-4,16 (m, 3H, 2 CHH y CH), 4,24 (d, 1H, CH), 4,43 y 4,54 (2 s a, 1H, H- 3 mayoritario y minoritario), 4,70 (m, 1H, CH), 5,08-5,23 (m, 2H, OC^Ph), 7,32-7,40 (m, 5H, Ar-H).
Etapa iii)
10
A una solucion agitada del producto de la etapa ii) (0,26 g, 0,88 mmol) en diclorometano (6 mL) se anadio periodina- no de Dess-Martin (0,41 g, 0,97 mmol) a TA. La reaccion se controlo por TLC (3:2 de acetato de etilo-hexano, visua- lizado por tincion con AMC) y despues de 3,5 h la mezcla de reaccion se diluyo con diclorometano (20 mL), se lavo con 1:1 de hidrogeno carbonato de sodio ac. saturado/tiosulfato de sodio al 10% ac. (3 x 20 mL), despues se seco 15 (sulfato de sodio), se filtro y se concentro. El residuo se volvio a disolver en metanol (5 mL) y se anadio ortoformiato de trimetilo (1,25 mL) y monohidrato de acido p-toluenosulfonico (0,03 g, 0,16 mmol). La mezcla de reaccion se mantuvo a 60°C durante una noche, despues se anadio diisopropiletilamina (0,5 mL) y la mezcla de reaccion se concentro. La cromatograffa instantanea (elucion en gradiente por etapas, acetato de etilo en hexano, 20-40%) del residuo, seguida de concentracion de las fracciones apropiadas y secado a vado durante el fin de semana, propor- 20 ciono el producto como un jarabe duro incoloro (0,27 g, 0,79 mmol, 89%).
Datos de RMN (400 MHz, 298 K, CDCl3): 1H, 8 3,08-3,47 (m, 7H, 2 x OCH3 mayoritario y minoritario y CHH), 3,80 (m, 2H, CH2), 3,98 (s a, 1H, CH), 4,25 (m, 1H, CHH), 4,45 (m, 1H, CH), 4,60 (t, 1H, CH), 5,04-5,26 (m, 2H, CH2), 7,29-7,42 (m, 5H, Ar-H)
Ejemplo Comparativo 1
25 N-[(S)-1-((3aS,6S,6aS)-6-cloro-3-oxo)-hexahidro-furo[3,2-6]pirrol-4-carbonil)-3-metil-butil]-4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-
tiazol-4-il]benzamida
i. Periodinano de Dess-Martin, DCM, 2 h, TA;
ii. Trimetilortoformiato, pTsOH, MeOH, 8 h, 60°C;
iii. Pd(OH)2, H2, MeOH, 48 h, TA;
5 iv. Boc2O, 10% de Na2CO3, 16 h, 0°C hasta TA;
v. HCl, CH2CH2/Py, CBzCl
vi. CH2CH2/Et3N MsCl
vii. DMF, LiCI
Este elemento basico se desprotegio en N a continuation y se llevo a traves del resto de la smtesis tal y como se 10 describe en el Ejemplo 5 para proporcionar N-[(S)-1-((3aS,6aS)-6R-cloro-3-oxo)-hexahidro-furo[3,2-jb]pirrol-4- carbonil)-3-metil-butil]-4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]benzamida.
Ejemplo Comparativo 2
N-[(1S)-1-((3aS,6aR)-3-oxo)-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-metil-butil]-4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-
il]benzamida
5
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15
20
25
30
El elemento basico P1 se sintetizo como se describe en el documento WO02/05720, acoplado a L-leucina protegida en N y el elemento basico P3 del Ejemplo 3 anterior, y se oxido para dar la cetona tal y como se muestra en el Ejemplo 4.
Ejemplo Comparativo 3
N-[(1S)-1-((3aS,6aR)-3-oxo)-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-metil-butil]-4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-
il]benzamida
La smtesis de este ejemplo comparativo se muestra en el Ejemplo 9 del documento WO05/66180.
Ejemplos biologicos
Determinacion de la actividad catalitica proteolitica de la catepsina K
Los ensayos adecuados para la catepsina K se llevaron a cabo utilizando una enzima recombinante humana, tal como la descrita en PDB.
ID BC016058 estandar; ARNm; HUM; 1699 BP.
DE catepsina K de Homo sapiens (picnodisostosis), ARNm (clon de ADNc MGC:23107 RX MEDLINE; RX PUBMED; 12477932.
DR RZPD; IRALp962G1234.
DR SWISS-PROT; P43235.
La catepsina K recombinante se puede expresar en una variedad de sistemas de expresion disponibles comercial- mente, que incluyen los sistemas de E. coli, Pichia y Baculovirus. La enzima purificada se activa mediante la elimi- nacion de la prosecuencia por metodos convencionales.
Las condiciones de ensayo estandar para la determinacion de las constantes cineticas, utilizaron un sustrato peptfdi- co fluorogenico, tfpicamente H-D-Ala-Leu-Lys-AMC, y se determinaron ya sea en Mes/Tris 100 mM, pH 7,0 que contema EDTA 1 mM y 2-mercaptoetanol 10 mM o fosfato de Na 100 mM, en EDTA 1 mM, 0,1% de PEG4000 pH 6,5 o acetato de Na 100 mM, pH 5,5 que contema EDTA 5 mM y cistema 20 mM, en cada caso, opcionalmente con DTT 1 M como estabilizador. La concentracion de enzima empleada era 5 nM. La solucion madre de sustrato se preparo como 10 mM en DMSO. Se realizaron escrutinios a una concentracion de sustrato fija de 60 pM y estudios cineticos detallados con diluciones dobles de sustrato desde 250 pM. La concentracion total de DMSO en el ensayo se mantuvo por debajo del 3%. Todos los ensayos se realizaron a temperatura ambiente. La fluorescencia del pro- ducto (excitacion a 390 nm, emision a 460 nm) se controlo con un lector de placas fluorescente de Labsystems Fluo- roskan Ascent. Las curvas de progreso del producto se generaron mas de 15 minutos despues de la generacion del producto AMC.
Determinacion de la Ki de la catepsina S
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
El ensayo emplea catepsina S humana expresada en baculovirus y el sustrato fluorescente Boc-Val-Leu-Lys-AMC disponible en Bachem en un formato de placa de 384 pocillos, en la que se pueden someter a ensayo en paralelo 7 compuestos del ensayo con un control positivo que comprende un compuesto de comparacion conocido de inhibidor de la catepsina S.
Diluciones del sustrato
Se anadieron 280 pl/pocillo de DMSO al 12,5% a las filas B - H de dos columnas de una placa de polipropileno de 96 pocillos profundos. Se anadieron 70 pl/pocillo de sustrato a la fila A. Se anadieron 2 x 250 pl/pocillo de tampon del ensayo (fosfato de Na 100 mM, NaCl l0o mM, pH 6,5) a la fila A, se mezclo y se diluyo de forma doble a lo largo de la placa hasta la fila H.
Diluciones de inhibidor
Se anaden 100 pl/pocillo de tampon de ensayo a las columnas 2-5 y 7-12 de 4 filas de una placa de polipropileno de fondo en V de 96 pocillos. Se anaden 200 pl/pocillo de tampon de ensayo a las columnas 1 y 6.
El primer compuesto del ensayo preparado en DMSO se anade a la columna 1 de la fila superior, por lo general con un volumen para proporcionar entre 10 y 30 veces la Ki aproximada, determinada inicialmente. La Ki aproximada se calcula a partir de una migracion preliminar en la que 10 pl/pocillo de boc-VLK-AMC 1 mM (dilucion 1/10 de la solu- cion madre 10 mM diluida en DMSo en tampon de ensayo) se administran a las filas de B a H y 20 pl/pocillo a la fila A de una placa de 96 pocillos de Microfluor®. Se anaden 2 pl de cada compuesto de ensayo 10 mM a un pocillo separado en la fila A, columnas 1-10. Se anaden 90 pl de tampon de ensayo que contiene DTT 1 mM y de catepsina S 2 nM a cada pocillo de las filas B-H y 180 pl a la fila A. Se mezcla la fila A con una pipeta multicanal y se diluye dos veces hasta la fila G. Se mezcla la fila H y se lee en el espectrofotometro fluorescente. Las lecturas son datos de Prism ajustados a la ecuacion de inhibicion competitiva, estableciendo S = 100 pM y Km = 100 pM para obtener una estimacion de la Ki, de hasta un maximo de 100 pM.
Se anade el segundo compuesto de la prueba a la columna 6 de la fila superior, el tercero a la columna 1 de la se- gunda fila, etc. Se anade 1 pl de compuesto de comparacion a la columna 6 de la fila inferior. Se mezcla la columna 1 y se diluye dos veces hasta la columna 5. Se mezcla la columna 6 y se diluye dos veces hasta la columna 10.
Usando una pipeta de 8 canales multietapa ajustada a 5 x 10 pl, se distribuyen 10 pl/pocillo de sustrato a la placa de ensayo de 384 pocillos. Se distribuye la primera columna de la placa de dilucion de sustrato en todas las columnas de la placa de ensayo, comenzando por la fila A. El espacio entre las puntas de la pipeta multicanal permitira saltar correctamente las filas alternas. Se distribuye la segunda columna a todas las columnas, comenzando en la fila B.
Empleando una pipeta de 12 canales multietapa ajustada a 4 x 10 pl, se distribuyen 10 pl/pocillo de inhibidor a la placa de ensayo de 384 pocillos. Se distribuye la primera fila de la placa de dilucion de inhibidor a las filas alternas de la placa de ensayo, comenzando en A1. El espacio entre las puntas de la pipeta multicanal permitira saltar correctamente las columnas alternas. De forma similar, se distribuye la segunda, la tercera y la cuarta fila a filas y columnas alternas, comenzando en A2, B1 y B2, respectivamente.
Se mezclan 20 ml del tampon de ensayo y 20 pl de DTT 1 M. Se anade suficiente catepsina S para proporcionar una concentracion final de 2 nM.
Usando un distribuidor tal como un Multidrop 384, se anaden 30 pl/pocillo a todos los pocillos de la placa de ensayo y se lee en un espectrofotometro de fluorescencia tal como un Ascent.
Las lecturas de la fluorescencia, (longitudes de onda de excitacion y emision de 390 nm y 460 nm, respectivamente, establecidas empleando filtros de paso de banda) que reflejan el grado de escision enzimatica del sustrato fluorescente, sin importar el inhibidor, se ajustan segun una tasa lineal para cada pocillo.
Las tasas ajustadas para todos los pocillos para cada inhibidor se ajustan a la ecuacion de inhibicion competitiva utilizando SigmaPlot 2000 para determinar los valores de V, Km y Ki.
Ki de la catepsina L
El procedimiento anterior con las siguientes modificaciones, se utiliza para la determinacion de la Ki para la catepsi- na L.
La enzima es catepsina L humana disponible comercialmente (por ejemplo, Calbiochem). El sustrato es H-D-Val- Leu-Lys-AMC disponible en Bachem. El tampon del ensayo es acetato de sodio 100 mM EDTA 1 mM, pH 5,5). La solucion madre en DMSO (10 mM en 100% de DMSO) se diluye hasta 10% en tampon de ensayo. La enzima se prepara a una concentracion 5 nM en tampon de ensayo mas ditiotreitol 1 mM, justo antes del uso. Se administran 2 pl de inhibidor 10 mM preparado en 100% en DMSO, en la fila A. 10 pl de sustrato 50 pM (= dilucion 1/200 de solu- cion madre de DMSO 10 mM, diluida en tampon de ensayo)
Estudios de inhibicion
5
10
15
20
25
Los inhibidores potenciales se examinan usando el ensayo anterior con concentraciones variables del compuesto del ensayo. Las reacciones se iniciaron mediante la adicion de enzima a soluciones tamponadas de sustrato e inhibidor. Los valores de Ki se calcularon de acuerdo con la ecuacion 1
en donde Vo es la velocidad de la reaccion, V es la velocidad maxima, S es la concentracion de sustrato con una constante de Michaelis Km, e I es la concentracion de inhibidor.
Los resultados se presentan como
A menos de 50 nanomolar
B 50-500 nanomolar
C 501-1000 nanomolar
D 1001 - 5000 nanomolar
E 5001 - 10,000 nanomolar
F mas de 10,000 nanomolar
TABLA 1
- Ejemplo
- Ki de catepsina K Ki de catepsina S Ki de catepsina L
- 5
- A E C
- 6
- A D C
- 7
- A D D
- 8
- A F D
- 10
- A D B
- 12
- A F D
- 13
- A F D
Los compuestos de formula II son, por tanto, potentes inhibidores de la catepsina K y todavfa son selectivos ante las catepsinas S y L, estrechamente relacionadas.
Los valores representativos de lotes espedficos de compuesto/enzima/momento del ensayo incluyen:
- Ejemplo
- Ki catepsina K Ki catepsina S Ki catepsina L
- 5
- 1,6 7500 880
- 6
- 1,5 4000 890
- 7
- 4,2 1700 1200
- 8
- 3,3 13000 2900
- 10
- 3,4 4700 490
- 12
- 1,8 11000 1600
Estabilidad metabolica
Los compuestos de la invencion y los ejemplos comparativos indicados se sometieron a ensayo para estudiar la estabilidad metabolica en un ensayo citosolico en el que los compuestos se incubaron con fracciones citosolicas hepaticas humanas disponibles comercialmente y la desaparicion del compuesto se superviso por HPLC o LC/MS. Las fracciones citosolicas de hngado humano agrupadas son menos propensas a representar individuos atfpicos que
la sangre de un unico individuo y se pueden almacenar congeladas, a diferencia de la sangre completa. Por lo tanto, el ensayo citosolico proporciona un banco de pruebas de ensayo consistente como gma de la estabilidad de un compuesto en el entorno in vivo, tal como cuando se expone a la sangre completa.
En resumen, los compuestos del ensayo (2 jM) se incuban en citosol agrupado de hngado humano (Xenotech LLC 5 Lenexa US, 1 mg/ml de protema en tampon fosfato 0,1 M, pH 7,4) a 37° centfgrados durante un penodo de una hora. Las incubaciones se inician mediante la adicion de cofactor NADPH 1 mM. Se tomaron submuestras a tiempos espedficos a 0, 20, 40 y 60 minutos y "precipitaron subitamente" por la adicion de 3 volumenes de acetonitrilo en- friado con hielo. Las muestras se centrifugaron a temperatura reducida y los sobrenadantes se separaron y se anali- zaron por LC-MS-MS.
10 Alternativamente, se realiza un ensayo de estabilidad analogo en sangre completa humana o de mono.
El ejemplo comparativo 3 emplea el epfmero con F hacia abajo de la unidad P1 del documento WO0566180. El ejemplo comparativo 2 emplea las unidades P1 y P2 preferidas del documento WO02/057270, junto con una unidad P3 dentro del alcance de las presentes reivindicaciones (que estan fuera del alcance del documento WO02/057270). El ejemplo comparativo 1 muestra el epfmero con Cl hacia abajo del compuesto del Ejemplo 6.
15 TABLA2
- Ejemplo
- ty2 minutos
- Ejemplo Comparativo 2
- ___l H o N fi h n h it N \ o o 72
- Ejemplo Comparativo 3
- 1 F __l ^ H O \ ^N-0 n 0 H ° S'\ 100-150
- Ejemplo Comparativo 1
- 1 Cl __[ ? H o \ 0 f| H 11 H 11 N \ |\L O O 24
- Ejemplo 6
- __1 Cl o \ 0 fl '^1 H If H Jl N \ O O >300
- Ejemplo
- ty2 minutos
- Ejemplo 5
- 1 Cl __l | H o \ S—\ 198
- Ejemplo 11
- y,° o ( rvH -r/ \ H o H VyN^ J 0 3 180
- Ejemplo 12
- F Cl. H i—\ /'Y /^T°\ —n \ JL) ° V 270
Sera evidente a partir del ejemplo comparativo 2 que P1 de la tecnica anterior del documento WO02/057270 propor- ciona compuestos con una semivida citosolica de un poco mas de una hora. El P1 con el fluoro hacia abajo amplia- mente ejemplificado en el documento WO05/66180 es algo mejor, con una semivida de mas de 11^ hora. Sin embar- 5 go, la sustitucion de cloro por el fluor hacia abajo del documento WO05/66180, reduce drasticamente la estabilidad, tal y como se ilustra mediante la comparacion del ejemplo comparativo 1 con el ejemplo comparativo 3. En contras- te, el epfmero con el cloro hacia arriba de la invencion (ejemplo 6) ha proporcionado un compuesto con una semivida de mas de 5 horas. Del mismo modo, con un componente P3 y P2 identico, el ejemplo comparativo 2 y el epfmero con el cloro hacia arriba de la invencion (ejemplo 5) demuestran claramente que el epfmero con el cloro hacia arriba 10 proporciona una semivida mucho mejor.
Permeabilidad
Este ejemplo mide el transporte de los inhibidores a traves de las celulas del canal gastroenterico humano. El ensa- yo utiliza las conocidas celulas Caco-2 con un numero de pases entre 40 y 60.
Transporte apical a basolateral
15 En general, cada compuesto se sometera ensayo en 2-4 pocillos. Los pocillos basolaterales y apicales contendran 1,5 mL y 0,4 mL de tampon de transporte (TB), respectivamente, y la concentracion estandar de las sustancias del ensayo es de 10 pM. Ademas, todas las soluciones y los tampones del ensayo contendran 1% de DMSO. Antes del experimento, las placas de transporte se recubren previamente con medio de cultivo que contiene 10% de suero durante 30 minutos, para evitar la union no espedfica al material plastico. Despues de 21 a 28 dfas de cultivo sobre 20 soportes de filtro, las celulas estan listas para los experimentos de permeabilidad.
La placa de transporte n° 1 comprende 3 filas de 4 pocillos cada una. La fila 1 se denomina lavado, la fila 2 "30 minutos" y la fila 3 "60 minutos". La placa de transporte 2 comprende 3 filas de 4 pocillos, una se denomina fila 4 "90 minutos", fila 5 "120 minutos" y la fila restante esta sin asignar.
El medio de cultivo de los pocillos apicales se retira y los insertos se transfieren a una fila de lavado (n° 1) en una 25 placa de transporte (placa n° 1) de las 2 placas sin insertos, que ya han sido preparadas con 1,5 mL de tampon de transporte (HBSS, HEPES 25 mM, pH 7,4) en las filas 1 a 5. En el escrutinio A ^ B el TB en el pocillo basolateral tambien contiene 1% de albumina de suero bovino.
Se anaden 0,5 mL de tampon de transporte (HBSS, MES 25 mM, pH 6,5) a los insertos y las monocapas de celulas
5
10
15
20
25
30
35
40
45
se equilibran en el sistema de tampon de transporte durante 30 minutos a 37°C en un agitador Polymix. Despues de equilibrar con el sistema de tampon, el valor de resistencia electrica transepitelial (TEER) se mide en cada pocillo mediante un instrumento con electrodos “chopstick” (palillos chinos) de EVOm. Los valores de TEER comprenden por lo general entre 400 a 1000 Q por pocillo (depende del numero de pases utilizado).
El tampon de transporte (TB, pH 6,5) se retira de la parte apical y el inserto se transfiere a la fila de 30 minutos (n° 2) y se anaden 425 pL de TB de nuevo aporte (pH 6,5), incluyendo la sustancia del ensayo al pocillo apical (donante). Las placas se incuban en un agitador Polymix a 37°C con una velocidad de agitacion baja de aproximadamente 150 a 300 rpm.
Despues de 30 minutos de incubacion, en la fila 2 las inserciones seran trasladadas a los nuevos pocillos (recepto- res) basolaterales previamente calentados, cada 30 minutos; fila 3 (60 minutos), 4 (90 minutos) y 5 (120 minutos).
Se toman muestras de 25 pL de la solucion apical despues de ~2 minutos y al final del experimento. Estas muestras representan muestras de donantes del comienzo y el final del experimento.
Se tomaran 300 pL de los pocillos basolaterales (receptores) en cada momento programado y se mide el valor posterior de TEER al final del experimento. A todas las muestras recogidas se anadira acetonitrilo hasta tener una concentracion final de 50% en las muestras. Las muestras recogidas se almacenaran a -20°C hasta su analisis por HPLC o LC-MS.
Transporte de basolateral a apical
En general, cada compuesto se sometera a ensayo en 2-4 pocillos. Los pocillos basolaterales y los apicales con- tendran 1,55 mL y 0,4 mL de TB, respectivamente, y la concentracion estandar de las sustancias sometidas a ensayo es de 10 pM. Ademas, todas las soluciones y tampones del ensayo contendran 1% de DMSO. Antes del experimento, las placas de transporte se recubren previamente con medio de cultivo que contiene 10% de suero durante 30 minutos para evitar la union no espedfica al material plastico.
Despues de 21 a 28 dfas de cultivo sobre soportes de filtro, las celulas estan listas para los experimentos de per- meabilidad. El medio de cultivo de los pocillos apicales se retira y los insertos se transfieren a una fila de lavado (n° 1) en una nueva placa sin insertos (placa de transporte).
La placa de transporte comprende 3 filas de 4 pocillos. La fila 1 se denomina "lavado" y la fila 3 es la "fila experimental". La placa de transporte se ha preparado previamente con 1,5 mL de TB (pH 7,4) en la fila de lavado n° 1 y con 1,55 mL de TB (pH 7,4), incluyendo la sustancia del ensayo, en la fila experimental n° 3 (lado donante).
Se anaden 0,5 mL de tampon de transporte (HBSS, MES 25 mM, pH 6,5) a los insertos en la fila n° 1 y las monoca- pas celulares se equilibran en el sistema de tampon de transporte durante 30 minutos, 37°C en un agitador Polymix. Despues de equilibrar con el sistema de tampon, el valor de TEER se mide en cada pocillo mediante un instrumento con electrodos “chopstick” de EVOM.
El tampon de transporte (TB, pH 6,5) se retira de la parte apical y el inserto se transfiere a la fila 3 y se anaden 400 pL de TB de nuevo aporte, pH 6,5 a los insertos. Despues de 30 minutos, se retiran 250 pL del pocillo apical (receptor) y se sustituyen por tampon de transporte de nuevo aporte. A partir de entonces, se retiraran 250 pL de muestras y se sustituyen por tampon de transporte de nuevo aporte, cada 30 minutos hasta el final del experimento a los 120 minutos, y finalmente se mide un valor posterior de TEER al final del experimento. Se tomara una muestra de 25 pL desde el compartimiento basolateral (donante) despues de ~2 minutos y al final del experimento. Estas muestras representan muestras de donantes del comienzo y del final del experimento.
A todas las muestras recogidas se anadira acetonitrilo hasta tener una concentracion final de 50% en las muestras. Las muestras recogidas se almacenaran a -20°C hasta su analisis por HPLC o LC-MS.
Calculo
Determinacion de la fraccion acumulada absorbida, FAcum, en funcion del tiempo. FAcum se calcula a partir de:
FAcum =
en donde CRi es la concentracion de receptor al final del intervalo i y Coi es la concentracion de donante al principio del intervalo i. Se debena obtener una relacion lineal.
La determinacion de los coeficientes de permeabilidad (Papp, cm/s) se calcula a partir de:
en donde k es la tasa de transporte (min-1) definida como la pendiente obtenida por regresion lineal de la fraccion acumulada absorbida (FAcum) como una funcion del tiempo (min), Vr es el volumen en la camara receptora (mL) y A es el area del filtro (cm2).
Compuestos de referencia tipicos:
- Categona de la absorcion en el hombre
- Marcadores % de absorcion en el hombre
- TRANSPORTE PASIVO
- Bajo (0-20%)
- Manitol 16
- Metotrexato 20
- Moderado (21-75%)
- Aciclovir 30
- Alto (76-100%)
- Propranolol 90
- Cafema 100
- TRANSPORTE ACTIVO
- Transportador de aminoacidos
- L-Fenilalanina 100
- EFLUJO ACTIVO
- PGP-MDR1
- Digoxina 30
5
Los resultados representativos para los compuestos de la invencion en este ensayo con Caco-2 incluyen valores de Papp de 5,2 x 106 para el compuesto del Ejemplo 10 y 10 x 106 cm/s para el compuesto del Ejemplo 12. Los compuestos de formula IB que comprenden un grupo trifluorometilo, como el Ejemplo 13, generalmente tienen valores de
- Papp 2-5 veces superiores.
- 10
- Abreviaturas
- DMF dimetilformamida DCM diclorometano
- TBDMS ferc-butildimetilsililo TA temperatura ambiente
- THF tetrahidrofurano Ac acetil
- TLC cromatograffa en capa fina DMAP dimetilaminopiridina
- EtOAc acetato de etilo
En toda esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que siguen, a menos que el contexto indique lo contrario, la palabra "comprenden" y variaciones tales como "comprende" y "que comprende", se entenderan que implican la inclusion de un numero entero, una etapa, un grupo de numeros enteros o un grupo de etapas, pero no la exclusion 15 de ningun otro numero entero, etapa, grupo de numeros enteros o grupo de etapas.
Claims (17)
- 51015REIVINDICACIONES
imagen1 1. Un compuesto de Formula II:en dondeR2 es la cadena lateral de leucina, isoleucina, ciclohexilglicina, O-metil treonina, 4-fluoroleucina o 3- metoxivalina;R3 es H, metilo o F;Rq es CF3 con la estereoqmmica indicada y Rq' es H; o Rq y Rq' definen conjuntamente ceto;Q esimagen2 en dondeR4 es alquilo C1-C6;R5 es H, metilo o F;R6 es alquilo C1-C6;o una sal farmaceuticamente aceptable, un hidrato o un N-oxido del mismo. - 2. El compuesto segun la reivindicacion 1, con la formula Ila:20
imagen3 en dondeR2 es la cadena lateral de leucina, isoleucina, ciclohexilglicina, O-metil treonina, 4-fluoroleucina o 3- metoxivalina;R3 es H, metilo o F;5101520253035R4 es alquilo C1-C6;R5 es H, metilo o F;o una sal farmaceuticamente aceptable, un hidrato o un N-oxido del mismo. - 3. El compuesto segun la reivindicacion 1 o 2, en el que R2 es la cadena lateral de leucina, isoleucina, O-metil treonina, 4-fluoroleucina o 3-metoxivalina.
- 4. El compuesto segun la reivindicacion 3, en el que R2 es la cadena lateral de 4-fluoroleucina o leucina, prefe- riblemente leucina.
- 5. El compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que R3 es fluoro o metilo, preferiblemen- te en la posicion meta en relacion con la amida bendlica.
- 6. El compuesto segun la reivindicacion 5, en el que R3 es fluoro.
- 7. El compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que R3 es H.
- 8. El compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que R5 es fluoro.
- 9. El compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que R5 es H.
- 10. El compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que R4 es metilo.
- 11. El compuesto segun la reivindicacion 1, seleccionado a partir deN-[1-6-cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-5]pirrol-4-carbonil)-3-fluoro-3-metil-butil]-4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]benzamida;N-[2-(6-cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-6]pirrol-4-il)-1-ciclohexil-2-oxo-etil]-4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-benzamidaN-[1-(6-cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-6]pirrol-4-carbonil)-3-metil-butil]-4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]benzamidaN-[1-(6-cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-metil-butil]-4-[5-metil-2-(4-metil-piperazin-1-il)- tiazol-4-il]-benzamida; ouna sal farmaceuticamente aceptable, un hidrato o un N-oxido del mismo.
- 12. El compuesto segun la reivindicacion 1, denominadoN-[1-(6-cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4-carbonil)-3-metil-butil]-3-fluoro-4-[2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]- benzamida; ouna sal farmaceuticamente aceptable, un hidrato o un N-oxido del mismo.
- 13. El compuesto segun la reivindicacion 1, denominado N-[1-(6-cloro-3-oxo-hexahidro-furo[3,2-b]pirrol-4- carbonil)-3-metil-butil]-4-[5-fluoro-2-(4-metil-piperazin-1-il)-tiazol-4-il]-benzamida; ouna sal farmaceuticamente aceptable, un hidrato o un N-oxido del mismo
- 14. El compuesto segun la reivindicacion 1, con la formula lib
imagen4 en dondeR2 es la cadena lateral de leucina, isoleucina, ciclohexilglicina, O-metil treonina, 4-fluoroleucina o 3- metoxivalina;510152025R3 es H, metilo o F;Q es el 4-(alquil Ci-C4)sulfonilfenilo;o una sal farmaceuticamente aceptable, un hidrato o un N-oxido del mismo. - 15. El compuesto segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para uso como medicamento.
- 16. Uso de un compuesto como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la preparacion de un medicamento para el tratamiento o la prevencion de un trastorno seleccionado a partir de:osteoporosis,enfermedades gingivales tales como gingivitis y periodontitis, enfermedad de Paget, hipercalcemia por enfermedad maligna, enfermedad osea metabolica,enfermedades caracterizadas por una degradacion excesiva del cartflago o la matriz, tales como osteoartritis y artritis reumatoide,canceres oseos que incluyen neoplasia,dolor.
- 17. El compuesto segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para uso en el tratamiento o la prevencion de un trastorno seleccionado a partir de:osteoporosis,enfermedades gingivales tales como gingivitis y periodontitis, enfermedad de Paget, hipercalcemia por enfermedad maligna, enfermedad osea metabolica,enfermedades caracterizadas por una degradacion excesiva del cartflago o la matriz, tales como osteoartritis y artritis reumatoide,canceres oseos que incluyen neoplasia,dolor.
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