ES2565035T3 - Métodos para evaluar mezclas de péptidos - Google Patents

Métodos para evaluar mezclas de péptidos Download PDF

Info

Publication number
ES2565035T3
ES2565035T3 ES07761581.3T ES07761581T ES2565035T3 ES 2565035 T3 ES2565035 T3 ES 2565035T3 ES 07761581 T ES07761581 T ES 07761581T ES 2565035 T3 ES2565035 T3 ES 2565035T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
sample
polypeptides
nmr
terminus
diethylamide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES07761581.3T
Other languages
English (en)
Inventor
Zachary Shriver
Ganesh Venkataraman
Jonathan C. Lansing
Corinne Bauer
Xiangping Zhu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Momenta Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Momenta Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=38561950&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=ES2565035(T3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Momenta Pharmaceuticals Inc filed Critical Momenta Pharmaceuticals Inc
Application granted granted Critical
Publication of ES2565035T3 publication Critical patent/ES2565035T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/94—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving narcotics or drugs or pharmaceuticals, neurotransmitters or associated receptors
    • G01N33/9493—Immunosupressants
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6806—Determination of free amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/02—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/15—Medicinal preparations ; Physical properties thereof, e.g. dissolubility
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6818—Sequencing of polypeptides
    • G01N33/6821—Sequencing of polypeptides involving C-terminal degradation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/24—Nuclear magnetic resonance, electron spin resonance or other spin effects or mass spectrometry
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/25125—Digestion or removing interfering materials

Abstract

Un método para ensayar una muestra de acetato de glatiramer, comprendiendo el método: (a) proporcionar la muestra de acetato de glatiramer, en donde se sospecha que la muestra comprende uno o más polipéptidos que tienen un resto dietilamida unido a un extremo C de los mismos; (b) determinar la cantidad de polipéptidos que tienen un resto dietilamida unido a un extremo C de los mismos en la muestra al detectar restos dietilamida cuando están presentes en el extremo C; (c) comparar la cantidad de polipéptidos que tienen el resto dietilamida unido a un extremo C de los mismos en la muestra con un valor de especificación farmacéutica predeterminado para el acetato de glatiramer, en donde el valor de especificación para el acetato de glatiramer tiene un intervalo de aproximadamente 7% en moles a aproximadamente 20% en moles de polipéptidos que tienen un resto dietilamida unido a un extremo C de los mismos; y (d) clasificar la muestra basándose en la cantidad de polipéptidos que tienen restos dietilamida unidos al extremo C de los mismos en la muestra, en donde la clasificación de la muestra comprende aprobar la muestra para uso farmacéutico.

Description

5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
DESCRIPCION
Metodos para evaluar mezclas de peptidos.
Campo tecnico
La materia divulgada ahora se refiere generalmente a metodos para caracterizar peptidos, mezclas de peptidos y mezclas de polipeptidos. Mas particularmente, la materia divulgada ahora se refiere a metodos para caracterizar mezclas complejas de peptidos o polipeptidos que comprenden acido glutamico, alanina, tirosina y lisina, incluyendo, pero no limitados a, metodos para identificar, aislar, cuantificar y purificar aminoacidos, peptidos, polipeptidos y combinaciones de los mismos, que tienen un grupo dietilamida en lugar de un grupo carboxilo presente en al menos un extremo de los mismos.
Antecedentes
El Copolfmero-1 es una mezcla compleja de polipeptidos preparada a partir de la polimerizacion de los aminoacidos acido glutamico, lisina, alanina y tirosina. El Copolfmero-i tambien se conoce como acetato de glatiramer (N° CAS 147245-92-9) y tiene la siguiente formula estructural:
(Glu, Ala, Lys, Tyr)x XCH3COOH
(C5H9NO^C3H7NO2^C6Hl4N2O2^C9HllNO3)x*C2H4O2 Vease Physician's Desk Reference, Thomson PDR, Montvale, Nueva Jersey, p. 3297 (2007).
El acetato de glatiramer (GA, por sus siglas en ingles) es el ingrediente activo de COPAXONE® (Teva Pharmaceutical Industries Ltd., Israel), que comprende las sales de acetato de polipeptidos sinteticos que contienen aminoacidos naturales: acido L-glutamico, L-alanina, L-tirosina y L-lisina, con una fraccion molar media presentada de 0,141, 0,427, 0,095 y 0,338, respectivamente. Id. El acetato de glatiramer se ha usado mucho en el tratamiento de la esclerosis multiple y se ha observado clmicamente que reduce la tasa de recidiva en personas con la forma recidivante-recurrente de la esclerosis multiple (RRMS, por sus siglas en ingles).
Pruebas analtticas que se pueden usar para caracterizar el acetato de glatiramer son beneficiosas para definir la estructura de esta mezcla de peptidos compleja y mezclas de peptidos complejas similares. Tales metodos analfticos son utiles para analizar las propiedades o la calidad de un lote particular de la mezcla, para analizar fases intermedias en la preparacion de acetato de glatiramer o para identificar y aislar componentes biorreactivos de una mezcla compleja o componentes distintivos del procedimiento para elaborar los mismos. Asf, existe una necesidad en la tecnica de pruebas analtticas que se puedan usar para caracterizar acetato de glatiramer y mezclas de peptidos complejas similares. La materia divulgada ahora se dirige, en todo o en parte, a estas y otras necesidades de la tecnica.
El documento WO 2006/029411 A2 describe una composicion que comprende una mezcla de polipeptidos, en donde cada polipeptido (a) es un copolfmero de los aminoacidos acido L-glutamico, L-alanina, L-tirosina y L-lisina y (b) puede estar en la forma de una sal farmaceuticamente aceptable; y en donde en la mezcla (i) los polipeptidos tienen un peso molecular medio en el intervalo de 13.500 a 18.500 daltons, (ii) de 13% a 38% de los polipeptidos tienen un grupo dietilamida en lugar de un grupo carboxilo presente en un extremo de los mismos y (iii) 68% de los polipeptidos tienen un peso molecular entre 7.000 y 41.000 daltons.
Breve sumario
La presente invencion se dirige a un metodo para ensayar una muestra de acetato de glatiramer segun se define mediante la reivindicacion independiente 1. Las reivindicaciones dependientes representan otras realizaciones de la invencion.
En algunas realizaciones, la materia ahora divulgada proporciona un metodo para detectar una modificacion de al menos un extremo C de uno o mas aminoacidos, peptidos, cadenas polipeptfdicas y combinaciones de los mismos en una muestra, comprendiendo el metodo: (a) proporcionar una muestra que se supone que contiene uno o mas aminoacidos, peptidos, cadenas polipeptfdicas y combinaciones de los mismos que tienen al menos un extremo C modificado; y (b) analizar la muestra mediante un metodo capaz de detectar una modificacion de al menos un extremo C de un aminoacido, peptido, cadenas polipeptfdicas y combinaciones de los mismos en la muestra. La muestra puede ser una mezcla de polipeptidos que incluye, pero no se limita a, el Copolfmero-1 o precursores polimericos del mismo (p. ej., los productos intermedios I, II y III mostrados en la Figura 1), el Copolfmero-1 derivado o precursores polimericos del mismo, el Copolfmero-1 fragmentado o precursores polimericos del mismo, el Copolfmero-1 fraccionado o precursores polimericos del mismo y combinaciones de los mismos.
La modificacion de al menos un extremo C puede incluir al menos un extremo C de los uno o mas aminoacidos, peptidos, cadenas polipeptfdicas y combinaciones de los mismos en la muestra que tienen un resto dietilamida unido a los mismos. El metodo capaz de detectar una modificacion de al menos un extremo C de una o mas cadenas polipeptfdicas en la muestra incluye, pero no se limita a, cromatograffa de ffquidos, cromatograffa ionica,
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
cromatograffa de gases, electroforesis capilar, espectrometna de masas, cromatograffa de Kquidos/espectrometna de masas, espectroscopfa de NMR, un metodo de deteccion de anticuerpos, espectroscop^a de Raman, espectroscopfa infrarroja, espectroscop^a de fluorescencia, espectroscopfa UV-Vis, electroforesis en gel y combinaciones de los mismos.
Los metodos ahora divulgados tambien pueden incluir despolimerizar o fragmentar la muestra, fraccionar la muestra y purificar la muestra.
En algunas realizaciones, la materia ahora divulgada proporciona un metodo para ensayar una muestra de Copolfmero-1, comprendiendo el metodo: (a) proporcionar una muestra de Copolfmero-1, en donde se supone que la muestra de Copolfmero-1 comprende uno o mas polipeptidos que tienen un resto dietilamida unido a un extremo C de los mismos; (b) determinar la presencia o la cantidad de polipeptidos que tienen un resto dietilamida unido a un extremo C de los mismos en la muestra de Copolfmero-1.
En algunas realizaciones, el metodo comprende ademas comparar la cantidad de polipeptidos que tienen un resto dietilamida unidos a un extremo C de los mismos en la muestra de Copolfmero-1 con un valor de referencia predeterminado, en donde el valor de referencia incluye, pero no se limita a, un valor de especificacion, un valor de control y un valor obtenido a partir de una medida directa de una muestra de referencia de Copolfmero-1, tal como acetato de glatiramer, o un precursor polimerico del mismo (p. ej., uno de los productos intermedios I, II y III mostrados en la Figura 1).
Habiendose indicado anteriormente en la presente memoria ciertos aspectos de la materia ahora divulgada, que son estudiados en todo o en parte por la materia ahora divulgada, otros aspectos se haran evidentes a medida que la descripcion avanza cuando se toma en conexion con los Ejemplos y Dibujos adjuntos como se describe mejor posteriormente en la presente memoria.
Breve descripcion de los dibujos
Habiendo descrito la materia ahora divulgada en terminos generales, se hara ahora referencia a los dibujos adjuntos, que no necesariamente estan dibujados a escala y en donde:
la Figura 1 es una ilustracion grafica no limitativa que muestra un procedimiento representativo para producir copolfmero-1, es decir, acetato de glatiramer;
la Figura 2 es una ilustracion grafica no limitativa que muestra etapas representativas de la digestion de polipeptidos con una enzima proteasa, p. ej., Glu-C, y la separacion de peptidos segun una realizacion de la materia ahora divulgada, en donde los peptidos que tienen un grupo dietilamida en el extremo C en lugar de un grupo carboxilo se afslan y a continuacion se analizan;
la Figura 3 es una ilustracion grafica no limitativa que muestra un aminoacido, p. ej., alanina, y un aminoacido, p. ej., alanina, que tiene un grupo dietilamida en el extremo C en lugar de un grupo carboxilo;
la Figura 4 es una ilustracion grafica no limitativa de un metodo para purificar polipeptidos, p. ej., acetato de glatiramer, que tienen un grupo dietilamida en el extremo C de un aminoacido en lugar de un grupo carboxilo;
la Figura 5 es una ilustracion grafica no limitativa que muestra el espectro de 1H NMR 1D a 600 MHz de una muestra de dipeptido Ala-Ala, en donde un aminoacido alanina tiene un grupo dietilamida en el extremo C en lugar de un grupo carboxilo;
la Figura 6 es una ilustracion grafica no limitativa que muestra el espectro de 1H NMR 1D a 600 MHz de una muestra de acetato de glatiramer. El recuadro muestra una expansion centrada en las resonancias de metilo de un resto dietilamida del extremo C;
la Figura 7 es una ilustracion grafica no limitativa que muestra el espectro de 1H NMR 1D de una muestra de acetato de glatiramer despues de la correccion inicial local y la integracion de senales seleccionadas;
las Figuras 8A y 8B son ilustraciones graficas no limitativas que muestran patrones de fragmentacion de MS/MS representativos de dietilamina generada por fragmentacion de una muestra de Copolfmero-1;
la Figura 8A es una ilustracion grafica no limitativa de un patron de fragmentacion de MS/MS representativo de dietilamina; y
la Figura 8B es una ilustracion grafica no limitativa de un ion con la misma masa que la dietilamina generado mediante fragmentacion en la fuente de una muestra de Copolfmero-1.
Descripcion detallada
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
La materia ahora divulgada se describira ahora mas a fondo en adelante con referencia a los Dibujos adjuntos, en los que se muestran algunas, pero no todas, las realizaciones de la materia ahora divulgada. Muchas modificaciones y otras realizaciones de la materia ahora divulgada indicadas en la presente memoria se le ocurriran al experto en la tecnica de la que trata la materia ahora divulgada teniendo las ventajas de las ensenanzas presentadas en las descripciones precedentes y los Dibujos asociados. Por lo tanto, se debe entender que la materia ahora divulgada no se limita a las realizaciones espedficas divulgadas y que estan destinadas a ser incluidas modificaciones y otras realizaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas. Aunque se emplean en la presente memoria terminos espedficos, se usan solamente en un sentido generico y descriptivo y no con propositos de limitacion.
Los terminos "un(a)" "uno" y "el(la)" se refieren a "uno o mas" cuando se usan en esta solicitud, incluyendo las reivindicaciones. Asf, por ejemplo, la referencia a "una muestra" incluye una pluralidad de muestras, a menos que el contexto sea claramente contrario (p. ej., una pluralidad de muestras), etc.
A lo largo de esta memoria descriptiva y las reivindicaciones, las palabras "comprenden", "comprende" y "que comprende(n)" se usan en un sentido no exclusivo, excepto cuando el contexto requiera otra cosa.
Se entendera que, aunque se hace referencia en la presente memoria a un numero de solicitudes de patente, patentes y otras referencias, tal referencia no constituye un reconocimiento de que cualquiera de estos documentos forme parte del conocimiento general comun de la tecnica.
I. Consideraciones generales
Los metodos ahora divulgados se pueden usar para caracterizar uno o mas peptidos, mezclas de peptidos y/o mezclas de polipeptidos, incluyendo, pero no limitados a, copolfmeros, tal como una mezcla de polipeptidos que comprende una poblacion heterogenea de polipeptidos que consiste en alanina, acido glutamico, tirosina y lisina, p. ej., Copolfmero-1, tambien denominado en la presente memoria acetato de glatiramer, u otras mezclas de polipeptidos que tienen propiedades similares. Segun se usa en la presente memoria, un "polipeptido" se refiere a un polfmero que comprende residuos de aminoacido que estan unidos entre sf con conexiones amida, que comunmente se denominan enlaces peptfdicos. La conexion peptfdica se forma a partir de un enlace entre un grupo carbonilo en el extremo C de un aminoacido y el grupo nitrogeno del extremo N de otro aminoacido. Cuando se conectan muchos aminoacidos usando estas conexiones peptfdicas, forman polipeptidos. El termino "mezcla", segun se usa en la presente memoria, por ejemplo, segun se usa en la expresion "una mezcla de polipeptidos", se refiere, en algunas realizaciones, a una mezcla de copolfmeros de los aminoacidos que comprenden acido L-glutamico, L- alanina, L-tirosina y L-lisina.
Segun se usan en la presente memoria, un "copolfmero", "copolfmero de aminoacidos" o "preparacion de copolfmero de aminoacidos" es una mezcla heterogenea de polipeptidos que consiste en una pluralidad definida de diferentes aminoacidos (que consiste tipicamente en entre 2-l0, p. ej., entre 3-6, aminoacidos diferentes). Un copolfmero se puede preparar a partir de la polimerizacion de aminoacidos individuales, o se puede producir recombinantemente. El termino "aminoacido" no se limita a aminoacidos naturales, sino que puede incluir derivados de aminoacido y/o analogos de aminoacido. Por ejemplo, en un copolfmero de aminoacidos que comprende aminoacidos tirosina, uno o mas de los aminoacidos puede ser una homotirosina. Ademas, un copolfmero de aminoacidos que tiene uno o mas enlaces no peptfdicos o peptidomimeticos entre dos residuos adyacentes se incluye dentro de esta definicion. Un copolfmero tfpicamente no es uniforme con respecto al peso molecular de cada especie de polipeptido dentro de la mezcla.
En una realizacion de la invencion, el copolfmero de aminoacidos es una mezcla de polipeptidos que comprende los aminoacidos Y, E, A y K; Y, F, A y K; V, Y, A y K; V, W, A y K; V, E, A y K o F, E, A y K. En otra realizacion de la invencion, el copolfmero de aminoacidos contiene cuatro aminoacidos diferentes, cada uno de una diferente de los siguientes grupos: (a) lisina y arginina; (b) acido glutamico y acido aspartico; (c) alanina y glicina; y (d) tirosina y triptofano. Un copolfmero espedfico segun esta realizacion de la presente invencion comprende una mezcla de polipeptidos que comprenden alanina, acido glutamico, lisina y tirosina. En una realizacion, el copolfmero comprende una mezcla de polipeptidos que consiste en los aminoacidos Y, E, A y K, tambien denominada Copolfmero-1 (Cop 1) o acetato de glatiramer. En otra realizacion, el copolfmero de aminoacidos contiene tres aminoacidos diferentes, cada uno de uno diferente de los tres grupos susodichos (a) a (d), p. ej., Y, A y K; Y, E y K; K, E y A; o Y, E y A.
En otra realizacion, el copolfmero de aminoacidos comprende aminoacidos que incluyen, pero no limitados a, alanina-acido glutamico-lisina-tirosina-alanina (AEKYA), alanina-acido glutamico-lisina-valina-alanina (AEKVA), alanina-acido glutamico-lisina-fenilalanina-alanina (AEKFA), alanina-lisina-tirosina-alanina-acido glutamico (AKYAE), acido glutamico-alanina-lisina-tirosina-alanina (EAKYA), alanina-lisina-valina-alanina-acido glutamico (AKVAE) y acido glutamico-alanina-lisina-valina-alanina (EAKVA), alanina-lisina-fenilalanina-alanina-acido glutamico (AKFAE) y acido glutamico-alanina-lisina-fenilalanina-alanina (EAKFA).
Los metodos ahora divulgados son adecuados para caracterizar mezclas de polipeptidos complejas preparadas mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. En algunos procedimientos para producir acetato de glatiramer, tales como el esquema de reaccion no limitativo proporcionado en la Figura 1 y procedimientos relacionados conocidos en la tecnica, se forman grupos dietilamida durante el procedimiento de fabricacion. En muchos
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
procedimientos, la copolimerizacion de N-carboxiantffdridos de L-alanina, acido L-glutamico, L-tirosina y L-lisina se inicia mediante la adicion de dietilamina. Sin querer limitarse por ninguna teoffa particular, se cree que durante este procedimiento, la dietilamina se une covalentemente al acido carboxffico C-terminal (despues de lo cual se denomina un grupo o resto dietilamida) y sigue unido al extremo de las cadenas polipepffdicas de los polipeptidos protegidos como resultado de la formacion de un enlace amida en el que de otro modo estaffa presente un grupo carboxilo. Los aminoacidos o las cadenas polipepffdicas que tienen un resto dietilamida en lugar de un grupo carboxilo en un extremo de los mismos tambien se denominan en la presente memoria "aminoacidos modificados" o "cadenas macromoleculares modificadas", respectivamente.
Los grupos dietilamida se pueden formar a partir de cualquiera de los cuatro aminoacidos usados para producir acetato de glatiramer. La despolimerizacion de la cadena, por ejemplo, mediante acido bromtffdrico/acido acetico, seguida por retirada de los grupos protectores y dialisis o ultracentrifugacion, no hidroliza completamente el resto dietilamida o lo retira de otro modo de la mezcla de polipeptidos. Como resultado, estan presentes dos tipos de residuos C-terminales en la mezcla de polipeptidos: residuos C-terminales de los cuatro aminoacidos naturales, es decir, lisina, tirosina, acido glutamico y alanina, que tienen un grupo carboxilo libre, y residuos C-terminales que tienen un grupo dietilamida en lugar de un grupo carboxilo libre.
II. Metodos para evaluar mezclas de polipeptidos complejas
La materia ahora divulgada proporciona metodos para evaluar o caracterizar uno o mas peptidos, mezclas de peptidos y mezclas de polipeptidos, incluyendo mezclas de polipeptidos complejas, tales como Copoffmero-1 y mezclas de polipeptidos complejas similares. En algunas realizaciones, el metodo incluye fraccionar la mezcla de peptidos o polipeptidos (p. ej., separar la mezcla en mezclas mas simples o enriquecer ciertas especies de la mezcla); detectar la presencia de ciertas macromoleculas y/o identificar las macromoleculas en la misma; y opcionalmente cuantificar la cantidad de las ciertas macromoleculas, incluyendo estructuras o macromoleculas de aminoacido modificadas, tales como peptidos o polipeptidos que tienen un resto dietilamida en lugar de un grupo carboxilo presente en al menos un extremo de los mismos. En algunas realizaciones, la etapa de cuantificacion puede incluir cuantificar la masa relativa o la cantidad molar de estructuras de aminoacido modificadas en un polipeptido o una mezcla de polipeptidos o la cantidad molar relativa de cadenas macromoleculares modificadas en una mezcla de polipeptidos .
Una realizacion de la materia ahora divulgada incluye un metodo para ensayar una muestra seleccionada del grupo que consiste en Copoffmero-1 o Copoffmero-1 fragmentado, fraccionado o derivado, es decir, un copoffmero que tiene un resto qmmico ligado en uno o mas residuos del copoffmero, o precursores polimericos (p. ej., los productos intermedios I, II y III mostrados en la Figura 1) del mismo, comprendiendo el metodo analizar la muestra mediante un metodo que incluye, pero no limitado a, espectroscopfa de masas (MS), cromatograffa de lfquidos-espectroscopfa de masas (LC-MS), espectroscopfa de resonancia magnetica nuclear (NMR), metodos de deteccion de anticuerpos, espectroscopfa de Raman y electroforesis capilar.
En algunas realizaciones, los metodos ahora divulgados incluyen despolimerizar parcialmente o completamente la muestra de polipeptidos mediante un metodo qmmico o enzimatico y a continuacion analizar la muestra parcialmente o completamente despolimerizada mediante un metodo que incluye, pero no se limita a, MS, LC-MS, nMr, metodos de deteccion de anticuerpos, espectroscopfa de Raman, electroforesis capilar, cromatograffa de ffquidos, cromatograffa de gases y cromatograffa ionica.
En algunas realizaciones, la materia ahora divulgada proporciona un metodo para detectar, identificar y/o cuantificar las cantidades molares relativas de aminoacidos modificados en un polipeptido o una mezcla de polipeptidos. En algunas realizaciones, el metodo puede incluir despolimerizar las moleculas de polipeptido mediante digestion enzimatica o qmmica. El metodo puede incluir determinar la cantidad molar de un resto dietilamida C-terminal en una mezcla de polipeptidos de acido glutamico, lisina, alanina y tirosina, tal como acetato de glatiramer. El metodo de analisis puede incluir cromatograffa de ffquidos, cromatograffa de gases, cromatograffa ionica, espectroscopfa de masas, cromatograffa de ffquidos-espectroscopfa de masas, NMR, metodos de anticuerpos, espectroscopfa de Raman y electroforesis capilar, preferiblemente espectroscopfa de NMR multidimensional.
En una realizacion, la materia ahora divulgada proporciona un metodo para analizar una muestra de Copoffmero-1 o un precursor polimerico del mismo (p. ej., producto intermedio-I, producto intermedio-II y producto intermedio III segun se muestran en la Figura 1), incluyendo el metodo poner en contacto un anticuerpo o una porcion de union a anffgeno del mismo, en donde el anticuerpo o porcion de union a anffgeno del mismo se une espedficamente bien a un resto estructural de dietilamida o bien a un peptido particular, con una muestra de Copoffmero-1 o un precursor polimerico del mismo, bajo condiciones que permiten la union, permitiendo de ese modo el analisis, por ejemplo, el analisis cuantitativo, del resto estructural dietilamida en la muestra de Copoffmero-1, o residuos de aminoacido o cadenas polipepffdicas que tienen un resto dietilamida en un extremo de los mismos. En otra realizacion, el metodo incluye determinar la presencia de un resto dietilamida al detectar un anticuerpo o una porcion de union a anffgeno del mismo unidos al resto dietilamida. En algunas realizaciones, el anticuerpo se puede absorber o ligar de otro modo, p. ej., mediante un grupo de conexion, a una superficie. En algunas realizaciones, el anticuerpo se puede marcar con un marcador, tal como una marcador fluorescente o un marcador radioisotopico.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
60
En otra realizacion, la muestra, p. ej., una muestra de CopoKmero-1, puede ser una muestra fraccionada por tamano. El metodo puede incluir ademas analizar una o mas fracciones de la muestra para detectar la presencia de un resto estructural dietilamida sin aislar la especie que incluye el resto dietilamida. En algunas realizaciones, la materia ahora divulgada incluye determinar la cantidad y/o la distribucion por tamano del resto estructural dietilamida. En otra realizacion, el metodo incluye ademas clasificar, seleccionar o descartar la muestra basandose, el menos en parte, en la determinacion del resto estructural dietilamida, p. ej., el porcentaje total de cadenas peptidicas que tienen un grupo dietilamida en el extremo C en lugar de un grupo carboxilo en un extremo de las mismas. En algunas realizaciones, esta determinacion se puede basar en un valor absoluto, mientras que, en otras realizaciones, esta determinacion se puede basar en una comparacion de la muestra bajo ensayo con un patron estandar.
En otra realizacion, la materia ahora divulgada proporciona un metodo para ensayar un patron de referencia para una composicion, p. ej., un farmaco, al analizar una muestra, p. ej., una composicion de peptidos mixtos, tal como el Copolfmero-1 o mas particularmente COPAXONE®, y determinar si un resto estructural dietilamida o una mezcla de restos estructurales dietilamida esta presente en el patron de referencia. En algunas realizaciones, el metodo ahora divulgado evalua un valor o parametro, en donde el valor o parametro representa la presencia, la distribucion por tamano y/o la cantidad de un resto estructural dietilamida. Mas particularmente, los metodos ahora divulgados se pueden usar para determinar la cantidad molar de un peptido o polipeptido que tiene un grupo dietilamida en lugar de un grupo carboxilo presente en el extremo C en una mezcla de polipeptidos de acido glutamico, lisina, alanina y tirosina, tal como acetato de glatiramer. En algunas realizaciones, el metodo no requiere el aislamiento de la especie que se evalua.
En una realizacion, la materia ahora divulgada proporciona un metodo para probar en una preparacion de un copolfmero, tal como Copolfmero-1, la presencia y/o la cantidad de modificaciones o grupos modificados en el extremo carboxilo de cadenas polipeptfdicas del copolfmero, p. ej., la presencia o la cantidad de un resto dietilamida en el extremo C de las mismas. El metodo incluye evaluar la cantidad de restos dietilamida, o residuos de aminoacido, peptidos o cadenas polipeptfdicas que tienen un resto dietilamida en un extremo de los mismos, en una preparacion de copolfmero de muestra y comparar la cantidad de restos dietilamida en la preparacion con un valor de referencia, p. ej., un valor de especificacion o un valor de control, o con un valor obtenido a partir de una medida directa de una preparacion de copolfmero de referencia. La preparacion de muestra puede ser, por ejemplo, Copolfmero-1 o un precursor polimerico del mismo, incluyendo Copolfmero-1 fragmentado, fraccionado o derivado, o precursores polimericos del mismo (p. ej., producto intermedio-I, producto intermedio-II y producto intermedio III segun se muestra en la Figura 1). El metodo tambien puede incluir una etapa de eliminacion (es decir, determinar el destino de) la preparacion basada en la evaluacion (p. ej., una etapa de determinacion de si la preparacion es adecuada o no para el uso farmaceutico, una etapa de determinacion de si la preparacion es adecuada o no para someter a etapas de procesamiento adicionales (p. ej., en un procedimiento de fabricacion para el copolfmero-1) o una etapa de aprobacion de la preparacion de muestra para uso farmaceutico basandose al menos parcialmente en la evaluacion).
En una realizacion, el valor de referencia es un valor predeterminado, p. ej., un valor de especificacion farmaceutico para el acetato de glatiramer, que, en algunas realizaciones, puede estar entre aproximadamente 7 y
aproximadamente 20 por ciento en moles de polipeptidos, p. ej., 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20
por ciento en moles de polipeptidos, incluyendo valores intermedios, p. ej., 7,5, 8,5, 9,5, 10,5 por ciento en moles y similares; en algunas realizaciones, entre aproximadamente 8 y aproximadamente 18 por ciento en moles de polipeptidos; en algunas realizaciones, entre aproximadamente 10 y aproximadamente 15 por ciento en moles de
polipeptidos, en algunas realizaciones, entre aproximadamente 12 y aproximadamente 14 por ciento en moles de
polipeptidos y, en algunas realizaciones, aproximadamente 13 por ciento en moles de polipeptidos.
En otra realizacion, el valor es un valor predeterminado correspondiente a la cantidad de polipeptidos que tienen un resto dietilamida en lugar de un grupo carboxilo en un extremo de los mismos en una preparacion de referencia, p. ej., una preparacion precursora de Copolfmero-1 (p. ej., producto intermedio-I, producto intermedio-II y producto intermedio III segun se muestra en la Figura 1). En algunas realizaciones, una preparacion precursora de Copolfmero-1 de referencia tiene entre aproximadamente 60% y aproximadamente 100%, p. ej., 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67,68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 98,5, 99, 99,5. 99,9 y 100%, de restos dietilamida (por ciento en moles de polipeptidos); en algunas realizaciones, entre aproximadamente 75% y aproximadamente 100%; y en algunas realizaciones, mas de aproximadamente 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95% de restos dietilamida (por ciento en moles de polipeptidos). El porcentaje total de cadenas peptfdicas que tienen un grupo dietilamida en un extremo de las mismas presente en la mezcla de polipeptidos bajo prueba se puede presentar como un porcentaje absoluto o como un porcentaje relativo a un patron de referencia, p. ej., una muestra de acetato de glatiramer que tiene propiedades conocidas. Estos valores tambien se pueden presentar de otros modos, p. ej., como % en moles de residuos, o porcentaje en peso (ppm), al aplicar factores de conversion apropiados conocidos en la tecnica.
En una realizacion, una cantidad de polipeptidos que tienen un resto dietilamida en un extremo de los mismos en una preparacion de muestra se puede evaluar mediante una tecnica que incluye, pero no se limita a 1H NMR unidimensional (1D).
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En otra realizacion, la materia ahora divulgada proporciona una preparacion de CopoKmero-1 (p. ej., una preparacion de acetato de glatiramer), que tiene entre aproximadamente 7% y aproximadamente 20% de restos dietilamida (por ciento en moles de polipeptidos), p. ej., 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, l5, 16, 17, 18, 19 y 20% de restos dietilamida (por ciento en moles de polipeptidos); en algunas realizaciones, entre aproximadamente 8% y aproximadamente 18% de restos dietilamida (por ciento en moles de polipeptidos); en algunas realizaciones, entre 10% y 15% de restos dietilamida (por ciento en moles de polipeptidos); en algunas realizaciones, entre 12% y 14% de restos dietilamida (por ciento en moles de polipeptidos); y, en algunas realizaciones, aproximadamente 13% de restos dietilamida (por ciento en moles de polipeptidos). En una realizacion, la preparacion de Copoffmero-1 es una preparacion farmaceutica, p. ej., una preparacion farmaceutica de acetato de glatiramer que tiene un peso molecular medio (maximo del pico) de menos de aproximadamente 13.000, 13.100, 13.200, 13.300 y/o 13.400 daltons, vease la Publicacion de Patente Internacional PCT N° WO 2006/029411, pagina 55, lmea 25, a pagina 56, lmea 8 y paginas 60-63.
La capacidad para caracterizar tales mezclas de polipeptidos se puede usar para verificar o asegurar la coherencia entre lotes o la calidad durante un procedimiento de preparacion y para verificar o evaluar la similitud de una mezcla de polipeptidos particular con un material de referencia desde una perspectiva de estructura-actividad, por ejemplo, para evaluar o asegurar la equivalencia biologica de una muestra bajo prueba y/o como parte de una prueba de liberacion.
II. Metodos generales para evaluar o caracterizar mezclas de polipeptidos complejas
En algunas realizaciones, los metodos ahora divulgados para caracterizar una mezcla de polipeptidos compleja incluyen una o mas de las siguientes etapas: fragmentar, o despolimerizar, los polipeptidos que comprenden la mezcla de polipeptidos compleja; separar los peptidos, polipeptidos o fragmentos de los mismos; detectar y/o cuantificar los peptidos, polipeptidos o fragmentos de los mismos; y purificar los peptidos, polipeptidos o fragmentos de los mismos. Realizaciones representativas no limitativas de estas etapas individuales se proporcionan posteriormente en la presente memoria.
A. Fragmentacion
En algunas realizaciones, las moleculas de polipeptido presentes en una mezcla compleja se pueden fragmentar o dividir en fragmentos menores de polipeptidos mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, incluyendo metodos qmmicos, enzimaticos o ffsicos. La division se refiere generalmente a la escision de un enlace qmmico dentro de una protema, un peptido o un polipeptido para producir “fragmentos” de protema, peptido o polipeptido. En algunas realizaciones, la fragmentacion de moleculas de protema, peptidos o polipeptidos en una mezcla compleja se puede efectuar usando agentes qmmicos incluyendo, pero no limitados a, un acido fuerte, p. ej., acido clorhffdrico 6 N, un acido debil, p. ej., acido formico al 70% a 40°C, hidroxilamina, una base fuerte, p. ej., hidroxido sodico 1 N, bromuro de cianogeno, acido yodosobenzoico o 2-nitro-5-tiocianobenzoato, seguido por el uso de una base alcalina. La fragmentacion qmmica tambien puede incluir agentes qmmicos usados para tecnicas de degradacion de Edman, tales como isotiocianato de fenilo y otros de estos agentes conocidos en la tecnica.
Ademas, el agente de fragmentacion puede ser una enzima proteolftica. La fragmentacion se puede efectuar usando una o mas proteasas, incluyendo tripsina, quimotripsina, elastasa, ficina, papama, pepsina, plasmina, termolisina, endopeptidasa, proteinasa K, bilis de buey, pectina de limon, peroxidasa de rabano picante, gluc-C, endo lys-C, carboxipeptidasa, calpama y subtilisina. El uso de mas de una enzima proteasa puede generar fragmentos solapados. El agente proteolftico puede estar libre en solucion, o inmovilizado en o sobre un soporte. Enzimas proteasa adecuadas para el uso con los metodos ahora divulgados se pueden aislar de cualquier organismo, incluyendo, pero no limitados a, Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus y Lactohacillus casei.
En otra realizacion, la protema, el peptido o el polipeptido se puede fragmentar usando una tecnica ffsica, incluyendo, pero no limitada a, ebullicion, ultrasonidos o cizalladura.
B. Separacion
En algunas realizaciones, los polipeptidos o polipeptidos fragmentados presentes en la mezcla compleja se pueden separar con lo que los polipeptidos o polipeptidos fragmentados se afslan en subpoblaciones de macromoleculas. La separacion se puede basar en una propiedad compartida por una clase de macromoleculas dentro de la mezcla compleja, por ejemplo, el tamano, la carga, la hidrofobia o cualquiera de las propiedades de las macromoleculas descritas en la presente memoria. Mas particularmente, las macromoleculas, o fracciones de macromoleculas, en una mezcla compleja se pueden aislar de las otras macromoleculas de la mezcla basandose en, por ejemplo, las velocidades de migracion a traves de un gel; el tamano; el peso molecular; la migracion en respuesta a un campo electrico aplicado; la carga; la hidrofobia; el punto de ebullicion, la solubilidad, p. ej., a traves de extraccion con disolvente; la precipitacion; la afinidad; la fosforilacion; o la presencia de residuos de aminoacido de baja abundancia, tales como tirosina. Segun esto, la separacion se puede basar en cualquier propiedad qmmica, ffsica o funcional compartida por una poblacion de macromoleculas dentro de la mezcla compleja.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
En algunas realizaciones, se puede usar una sola etapa de separacion. En otras realizaciones, se pueden usar una o mas etapas de separacion. Un experto normal en la tecnica puede usar cualesquiera tecnicas de separacion en cualquier combinacion y en cualquier orden para separar las macromoleculas deseadas del resto de las macromoleculas de la mezcla compleja. Ademas, las tecnicas de separacion se pueden realizar como un solo metodo unidimensional o como un metodo multidimensional. Las tecnicas de separacion se pueden realizar usando geles o metodos cromatograficos. La etapa de separacion, p. ej., un metodo de separacion electroforetico, se puede realizar bajo condiciones simples o desnaturalizantes (p. ej., dodecilsulfato sodico (SDS) o urea). Ejemplos de tecnicas de separacion no limitativas se proporcionan inmediatamente despues en la presente memoria. Los siguientes ejemplos se pueden usar segun los metodos ahora divulgados. Estos ejemplos se proporcionan para facilitar la comprension de los metodos ahora divulgados y se entiende que no limitan de ningun modo el alcance de la materia reivindicada.
1. Electroforesis en gel
Los metodos para la separacion se pueden basar en la movilidad de macromoleculas a traves de una matriz o un gel. La electroforesis en gel proporciona separacion y/o visualizacion de las macromoleculas y permite la determinacion de ciertas propiedades de una macromolecula, incluyendo su punto isoelectrico y/o peso molecular aproximado.
Para macromoleculas que son protemas, peptidos, polipeptidos o fragmentos de los mismos, la secuencia de aminoacidos, el numero de aminoacidos y/o los diferentes grupos R pueden dictar las propiedades de peso molecular y/o carga global (neta). Si la protema, el peptido, el polipeptido o el fragmento del mismo tiene mas aminoacidos cargados positivamente, de modo que la suma de las cargas positivas supere la suma de las cargas negativas, la protema, el peptido, el polipeptido o el fragmento del mismo tendra una carga positiva global y migrara hacia un electrodo cargado negativamente en un campo electrico. Las protemas, los peptidos, los polipeptidos o los fragmentos de los mismos que tienen una variacion de un aminoacido tienen una carga global diferente y asf son distinguibles electroforeticamente.
El dodecilsulfato sodico (SDS) es un detergente anionico que se une a la mayona de protemas o peptidos solubles en soluciones acuosa a lo largo de un amplio intervalo de pH. Las protemas o los peptidos se unen a cantidades de SDS en proporcion al tamano de la molecula de protema o peptido. Un gel de poliacrilamida con un contenido de acrilamida por encima de una densidad cntica restringe la migracion de las moleculas mayores a migrar tan rapidamente como las moleculas menores. Debido a que la relacion de carga a masa es casi la misma entre protemas o peptidos desnaturalizados con SDS, la separacion final de las protemas o los peptidos depende principalmente de las diferencias en el peso molecular (PM) de las protemas o los peptidos. La separacion de protemas o peptidos mediante electroforesis en gel SDS-PAGE se puede usar para determinar la abundancia relativa de protemas o peptidos en una muestra (p. ej., una muestra de una mezcla compleja), sus pesos moleculares aproximados y en que fracciones se pueden encontrar. Ademas, la pureza de las protemas o los peptidos en una muestra se puede valorar con esta tecnica. Se pueden usar diferentes procedimientos de tincion o afinidad para detectar protemas raras y caracterizar sus propiedades bioqmmicas. Tambien se pueden usar tecnicas especializadas tales como inmunotransferencia, electroforesis bidimensional e identificacion de peptidos.
2. Tamano
En algunas realizaciones, el metodo de separacion se puede basar en el tamano, el peso molecular o la masa molar y se puede efectuar usando cromatograffa de exclusion por tamano (SEC, por sus siglas en ingles), cromatograffa de penetracion en gel (GPC, por sus siglas en ingles) o cromatograffa de filtracion en gel (GFC, por sus siglas en ingles).
En la SEC, una fase movil que comprende un disolvente y una porcion de la protema, el peptido, el polipeptido o el fragmento de los mismos dispuesto en la misma fluye por una fase estacionaria. La fase estacionaria, a traves de una interaccion ffsica y/o qmmica con la protema, el peptido, el polipeptido o el fragmento del mismo, retiene temporalmente alguna porcion de la protema, el peptido, el polipeptido o el fragmento del mismo y de ese modo separa esa porcion de la protema, el peptido, el polipeptido o el fragmento del mismo de otras macromoleculas de la fase movil. La fase estacionaria comprende tipicamente geles basados en agarosa reticulados microporosos, geles de poli(metacrilato de metilo) modificados o sflice porosa. Las moleculas de protema, peptido o polipeptido que son mas pequenas que el tamano de los poros de las partmulas pueden entrar en los poros y por lo tanto tener un recorrido mas largo y un tiempo de transito mas largo que moleculas mayores que no pueden entrar en los poros. Asf, las moleculas mayores se eluyen antes en el cromatograma, mientras que las moleculas menores se eluyen despues.
Componentes de un sistema de SEC pueden incluir: una o mas bombas para mantener velocidades de flujo no pulsatiles constantes; tipos de columna para el intervalo de pesos moleculares de interes; y un sistema detector para detectar y/o cuantificar el resultado. Los sistemas detectores se pueden clasificar como sensibles a la concentracion masica o sensibles a la concentracion molar. Por ejemplo, un detector del mdice de refraccion mide el cambio en el mdice de refraccion a medida que cambia la concentracion de protema en la solucion. Otro grupo de metodos de
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
concentracion molar implica la entrada de luz ultravioleta, siendo la salida fluorescencia o absorcion por la protema. Otros metodos incluyen un detector de densidad y un detector de dispersion de luz evaporativo.
3. Procedimientos cromatograficos
Los metodos para la separacion se pueden basar en otros procedimientos cromatograficos, incluyendo: cromatograffa de gases (p. ej., cromatograffa de gases-ffquidos); cromatograffa de gases-solidos; cromatograffa ionica, cromatograffa de particion; cromatograffa de adsorcion; cromatograffa en capa fina y cromatograffa de fluidos supercnticos.
4. Electroforesis capilar:
Los metodos para la separacion se pueden basar en la migracion de las macromoleculas a traves de un medio en respuesta a un campo electrico aplicado (p. ej., electroforesis). En un ejemplo, se puede usar electroforesis capilar para separar macromoleculas tanto cargadas como no cargadas (p. ej., protemas y fragmentos de las mismas) que vanan en tamano.
La mayona de las moleculas de interes biologico se cargan y asf se pueden separar mediante metodos electroforeticos. Esta caractenstica es especialmente cierta para los grupos dietilamida de los fragmentos de peptido que, cuando se ponen en el entorno apropiado, se cargan. En una realizacion alternativa, se puede usar un tubo de sflice fundida que tiene una longitud que vana de aproximadamente 50 cm a aproximadamente 100 cm y un diametro interno que vana de aproximadamente 10 pm a aproximadamente 200 pm. Los electrodos que se pueden usar vanan de 10 a 50 kV. Para cuantificar la cantidad de cadenas pepffdicas o polipepffdicas que tienen un grupo dietilamida en un extremo de las mismas en una muestra, con o sin purificacion del extremo C segun se describe anteriormente usando un metodo como cromatograffa de afinidad, la muestra se separa mediante electroforesis capilar. Durante la separacion, el detector se puede usar para determinar la presencia de los grupos dietilamida y determinar la cantidad de cadenas pepffdicas o polipepffdicas que tienen un grupo dietilamida en un extremo de las mismas presente en la muestra.
La electroforesis capilar abarca una familia de tecnicas de separacion relacionadas que usan capilares de sflice fundida de luz estrecha para separar una mezcla compleja. Se usan altas intensidades de campo electrico para separar moleculas basandose en diferencias en la carga, el tamano y la hidrofobia. La introduccion de la muestra se efectua sumergiendo el extremo del capilar en un vial de muestra y aplicando presion, vado o voltaje. Dependiendo de los tipos de capilar y electrolitos usados, la tecnologfa de CE se puede dividir en varias tecnicas de separacion incluyendo, pero no limitadas a, electroforesis en la zona capilar (CZE, por sus siglas en ingles), electroforesis en gel capilar (CGE, por sus siglas en ingles), enfoque isoelectrico capilar (CIEF, por sus siglas en ingles), isotacoforesis (ITP, por sus siglas en ingles), cromatograffa electrocinetica (EKC, por sus siglas en ingles), cromatograffa capilar electrocinetica micelar (MECC o MEKC, por sus siglas en ingles), cromatograffa electrocinetica de microemulsiones (MEEKC, por sus siglas en ingles), electroforesis capilar no acuosa (NACE, por sus siglas en ingles) y electrocromatograffa capilar (CEC, por sus siglas en ingles).
5. Carga
Los metodos para la separacion se pueden basar en la seleccion de la carga, incluyendo cromatograffa de intercambio ionico y cromatograffa cationica. En la cromatograffa de intercambio ionico, sustancias cargadas se separan a traves de materiales de columna que tienen una carga opuesta. Los grupos ionicos de las columnas intercambiadoras estan unidos covalentemente a la matriz de gel y son compensados por pequenas concentraciones de iones conjugados presentes en el tampon. Cuando se anade una muestra a la columna, tiene lugar un intercambio con los iones conjugados unidos debilmente.
6. Hidrofobia
Los metodos para la separacion se pueden basar en la seleccion de la hidrofobia, incluyendo cromatograffa de interaccion hidrofoba, cromatograffa en fase inversa (RPC, por sus siglas en ingles) o RP-HpLC. Los compuestos se adhieren a columnas de HPLC en fase inversa en una fase movil muy acuosa y se eluyen de las columna de RP- HPLC con una fase movil muy organica. En la RP-HPLC, los compuestos se separan basandose en su caracter hidrofobo.
Las columnas de RP-HPLC mas comunes se rellenan con parffculas de sflice. Las cuentas o parffculas se caracterizan generalmente por el tamano de parffcula y de poro. En una realizacion, los tamanos de parffcula vanan generalmente de aproximadamente 3 pm a aproximadamente 50 pm, siendo las parffculas de 5 pm las mas ampliamente usadas para las protemas. El tamano de poro de las parffculas se mide en angstroms y generalmente vana de aproximadamente 100 A a aproximadamente 1.000 A. En una realizacion, la fase estacionaria esta constituida generalmente por longitudes variables de cadenas alqrnlicas hidrofobas que interactuan con el analito. Las columna disponibles comunmente para separar macromoleculas incluyen, pero no se limitan a, cadenas alqrnlicas que tienen longitudes C-4, C-8 o C-18. Una columna C-4 se usa generalmente para capturar protemas mayores y una columna C-18 se usa generalmente para capturar protemas pequenas o moleculas pequenas. En
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
general, se usan disolventes de fase inversa independientemente de la naturaleza hidrofila o hidrofila de las moleculas de protema.
7. Extracciones con disolvente
El metodo de separacion se puede basar en la extraccion con disolvente. La extraccion con disolvente implica repartir una macromolecula entre disolventes o un disolvente y una fase solida. Debido a que las macromoleculas que tienen diferentes solubilidades en las dos fases se distribuyen de forma diferente entre las dos fases, es posible la extraccion y/o el enriquecimiento de las macromoleculas. Una macromolecula se puede separar basandose en sus propias caracteffsticas hidrofobas/hidrofilas y las de las dos fases usadas. Los procedimientos de extraccion con disolvente pueden usar cualquier disolvente adecuado para el uso en la separacion de macromoleculas, tales como polipeptidos.
8. Precipitacion
El metodo de separacion se puede basar en procedimientos de precipitacion, lo que tambien depende de la solubilidad de las macromoleculas. Por ejemplo, protemas, peptidos o polipeptidos que son solubles en soluciones basadas en agua tienen aminoacidos hidrofilos sobre sus superficies que atraen e interaction con moleculas de agua. Esta solubilidad es una funcion de la intensidad ionica y el pH de la solucion. Las protemas, los peptidos y los polipeptidos tienen puntos isoelectricos a los que las cargas de sus grupos laterales de aminoacido se equilibran entre sf. Si la intensidad ionica de una solucion es bien muy alta o bien muy baja, las protemas, los peptidos o los polipeptidos tenderan a precipitar en su punto isoelectrico. Asf, la solubilidad tambien es una funcion de la intensidad ionica.
9. Afinidad
El metodo de separacion se puede basar en la seleccion por afinidad de un subgrupo de macromoleculas en la muestra. La seleccion por afinidad incluye inmunoafinidad usando anticuerpos policlonales y/o monoclonales y/o cromatograffa de afinidad con metal inmovilizado. El metodo de seleccion por afinidad tambien incluye: afinidad a cistema usando un reactivo acilante; o afinidad a histidina, carbohidratos y/o restos fosfato.
La cromatograffa de afinidad conffa en la union de la protema, el peptido o el polipeptido espedficamente a un ligando inmovilizado mientras que el resto de la protema, el peptido o el polipeptido pasa a traves de la columna. Se puede usar cualquier ligando, incluyendo cualquier ligando generado qmmicamente o una molecula biologica, tal como un azucar o una molecula de protema. Ligandos adecuados tambien incluyen anticuerpos monoclonales o policlonales.
10. Protemas fosforiladas
El metodo de separacion se puede basar en la seleccion de fosfopeptidos, incluyendo procedimientos que usan anticuerpos que reaccionan con aminoacidos fosforilados (p. ej., fosfotirosina y fosfoserina). Otros metodos incluyen usar columnas de cromatograffa de afinidad con metal inmovilizado (IMAC) cargadas con galio, cromatograffa de intercambio ionico o cromatograffa que contiene circonia.
11. Aminoacidos de baja abundancia
El metodo de separacion se puede basar en la seleccion de moleculas pepffdicas que comprenden ciertos aminoacidos de baja abundancia, tales como tirosina. Por ejemplo, se pueden seleccionar moleculas de protema, peptido o polipeptido que comprenden tirosina usando sales de diazonio. Las moleculas de protema, peptido o polipeptido que comprenden triptofano se pueden derivar con cloruro de 2,4-dinitrofenilsulfenilo a pH 5,0 y seleccionar con un anticuerpo reactivo con el 2,4-dinitrofenol. Metodos para separar moleculas de protema, peptido o polipeptido que comprenden histidina incluyen la acetilacion de grupos amino primarios y la seleccion en columnas de afinidad con metal inmovilizado (IMAC) cargadas con cobre.
C. Deteccion y/o cuantificacion
La deteccion y la cuantificacion (colectivamente denominadas en la presente memoria "etapa de evaluacion") es un analisis de la mezcla compleja o fracciones de la mezcla compleja, que da como resultado la generacion de datos cualitativos o cuantitativos referentes a la misma. La etapa de evaluacion puede incluir cualquiera de los procedimientos descritos posteriormente en la presente memoria, solos o en combinacion en cualquier orden y pueden incluir: electroforesis en gel; analisis de la composicion de aminoacidos; secuenciacion de aminoacidos (p. ej., secuenciacion N-terminal); analisis de azucares; secuenciacion de azucares; espectroscopfa de fluorescencia; espectrometffa de masas, tal como MALDI MS (desorcionion/izacion laser asistida por matriz-espectrometffa de masas, por sus siglas en ingles); MS/MS; NMR; MALDI TOF/TOF; ionizacion con electropulverizacion (ESI, por sus siglas en ingles); cuadrupolo; atrapamiento ionico; analisis de masas del sector magnetico o de resonancia ciclotronica ionica; analisis de digestion ortogonal; cuantificacion por CE y/o HPLC; espectroscopfa infrarroja; espectroscopfa UV-vis; espectroscopfa de absorcion atomica; espectroscopfa de Raman; espectroscopfa de rayos X; procedimientos termicos; potenciometffa; y/o microscopfa electronica. Mas particularmente, el metodo analftico
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
incluye, pero no se limita a, espectroscopfa de masas, cromatograffa de l^quidos-espectroscop^a de masas, NMR, metodos de deteccion de anticuerpos, espectroscopfa de Raman y electroforesis capilar.
1. Espectrometna de masas
La etapa de evaluacion puede incluir tecnicas de espectrometna espectral de masas o de masas en tandem (MS/MS, por sus siglas en ingles). En esta tecnica, los iones del polipeptido molecular originario se fragmentan en iones menores que se seleccionan y se fragmentan adicionalmente para dar informacion relativa a la naturaleza de la mezcla de peptidos. Para caracterizar un tipo de mezcla de peptidos por espectrometna de masas, a un tipo de peptido o un segmento particular de un tipo de peptido se le pueden dar cargas positivas y negativas, o se puede ionizar y volatilizar en un espectrometro de masas. Las moleculas de peptido volatizadas ionizadas o el segmento de las mismas se pueden analizar a continuacion mediante el espectrometro de masas, lo que produce un espectro de masas de la molecula de peptido o el segmento.
Un espectrometro de masas determina el peso de moleculas peptfdicas y segmentos de moleculas peptfdicas, cuando se analiza una molecula peptfdica o un segmento, la informacion proporcionada por espectrometna de masas se puede usar para inferir la secuencia de residuos de aminoacido en la molecula peptfdica o el segmento. Los espectrometros de masas tambien son suficientemente sensibles para proporcionar informacion acerca de modificaciones en residuos de aminoacido particulares de una molecula peptfdica o segmento. Metodos tales como ionizacion con desorcion laser asistida por matriz (MALDI) e ionizacion por electropulverizacion (ESI) y nanopulverizacion, GC/MS, LC/MS, MS/MS, LC MS/MS, SIMS, instrumentos con transformacion de Fourier, una espectrometna de masas con microsonda laser, instrumentos en fase gaseosa y de desorcion, espectrometna de masas que implica ionizacion electronica (EI), ionizacion qrnmica (CI), ionizacion de campos, desorcion de campos, bombardeo atomico rapido, desorcion plasmatica, desorcion termica, ionizacion electrohidrodinamica e ionizacion por termopulverizacion estan todos abarcados dentro del significado de espectroscopfa de masas.
2. Espectroscopfa de NMR
La etapa de evaluacion puede incluir espectroscopfa de resonancia magnetica nuclear (NMR). La NMR es un fenomeno que se produce cuando los nucleos de ciertos atomos se sumergen en un campo magnetico estatico y se exponen a un segundo campo magnetico oscilatorio. Algunos nucleos experimentan este fenomeno y otros no, dependiendo de si poseen un espm propiamente dicho. Asf, la espectroscopfa de NMR se puede usar para estudiar la estructura qrnmica de muchas moleculas que poseen una caractenstica de espm.
1 O 1 C A O A Q
Tecnicas de NMR adecuadas incluyen, pero no se limitan a, H, H, Na, N, C y O. Mas de 200 isotopos tienen momentos magneticos y se pueden estudiar usando NMR. La NMR se puede realizar en estados de solucion y solido y todos los tipos de experimentos de NMR estan dentro del alcance de la materia ahora divulgada incluyendo desacoplamiento de banda ancha, desacoplamiento fuera de resonancia, potenciacion nuclear de Overhauser (NOE, por sus siglas en ingles) y NMR bidimensional (NMR 2D). Ejemplos representativos de metodos de NMR incluyen, pero no se limitan a: experimentos monopulsatiles; espectroscopfa de desacoplamiento y diferencia de espm; experimentos multipulsatiles, incluyendo ecos simples, modulacion de J, transferencia poblacional, transferencia de polarizacion selectiva, transferencia de polarizacion no selectiva-INEPT, INEPT inversa, INEPT reenfocada; NMR 2D, incluyendo secuencia bidimensional basica, metodos que implican retirar el acoplamiento heteronuclear y/o homonuclear; HMQC de espectros detectados inversamente, experimentos de correlacion de desplazamiento homonuclear-COSY; variaciones en COSY, coherencia de multiples cuantos-INADEQUATE, secuencias de espm bloqueado-TOCSY, espectroscopfa bidimensional con disolvente suprimido, NMR tridimensional (NMR 3D); metodos que estudian conexiones a traves de enlaces; metodos que estudian conexiones a traves del espacio, p. ej., experimentos de NOE, incluyendo NOESY y ROESY; y metodos que miden las velocidades de relajacion, incluyendo la recuperacion de la inversion, la recuperacion de la saturacion y la saturacion progresiva.
Opcionalmente, los metodos de NMR ahora divulgados pueden incluir metodos para suprimir senales que surgen de disolventes, tampones y/o contaminantes, incluyendo, pero no limitados a, tecnicas de presaturacion o “flip-back”.
3. Espectroscopfa infrarroja
La etapa de evaluacion puede ser espectroscopfa infrarroja (espectroscopfa IR), incluyendo espectroscopfa infrarroja con transformacion de Fourier (FTIR). La espectroscopfa IR es un tipo de espectroscopfa que usa la porcion infrarroja del espectro electromagnetico y se puede usar para investigar la composicion de una muestra, asf como informacion qrnmica detallada sobre las estructuras de biomoleculas. Cuando se realiza de un modo con resolucion temporal, se pueden examinar los productos intermedios estructurales en reacciones biologicas. Para medir una muestra, un haz de luz infrarroja monocromatico se hace pasar a traves de la muestra y se registra la cantidad de energfa absorbida a diferentes frecuencias, o longitudes de onda de radiacion IR. La posicion de los picos de absorcion IR se puede relacionar con tipos espedficos de enlaces qmmicos que tienen frecuencias espedficas a las que vibran. Dentro del significado de la espectroscopfa infrarroja, la invencion tambien incluye todas las formas de espectroscopfa infrarroja incluyendo, pero no limitadas a, espectroscopfa infrarroja con reflexion interna, espectroscopfa infrarroja fotoacustica, espectroscopfa infrarroja cercana, espectroscopfa de reflectancia en el infrarrojo cercano, espectroscopfa infrarroja lejana y espectroscopfa infrarroja de emision.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
4. Electroforesis en gel
La etapa de evaluacion puede incluir electroforesis en gel. La descripcion de la etapa de electroforesis en gel que se analiza anteriormente se incorpora en la presente memoria mediante referencia con la intencion de aplicarla a la etapa de evaluacion
5. Espectroscopfa de emision
La etapa de evaluacion puede incluir espectroscopfa de emision, que abarca fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia moleculares. La fluorescencia y la fosforescencia se producen como resultado de la absorcion de fotones. La quimioluminiscencia se basa en los espectros de emision de especies excitadas formadas como resultado de una reaccion qmmica. Las medidas de la intensidad de las caractensticas de fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia permiten la determinacion cuantitativa de una especie organica e inorganica. Generalmente, los instrumentos tienen una fuente, filtros y/u otros dispositivos para separar o discriminar entre longitudes de onda, tales como un monocromador, detectores, celdillas y compartimentos. Algunos instrumentos que se pueden usar en la espectroscopfa de fluorescencia incluyen fluorometros, sensores de fluorescencia de fibra optica, espectrofluorometros y fosfonmetros.
6. Espectroscopfa UV-vis
La etapa de evaluacion puede incluir espectroscopfa UV-vis, que sondea las transiciones electronicas de moleculas a medida que absorben luz en las regiones UV y visible del espectro electromagnetico. Cualquier especie con un sistema extendido de enlaces dobles y sencillos alternativos absorbera luz UV y cualquier cosa con color absorbe luz visible, haciendo la espectroscopfa UV-vis aplicable a una amplia gama de muestras. Con respecto a la instrumentacion, la fuente de luz es habitualmente una lampara de hidrogeno o deuterio para medidas UV y una lampara de volframio para medidas visibles. Las longitudes de onda de estas fuentes de luz continuas se seleccionan con un separador de longitudes de onda, tal como un prisma o un monocromador de graffcula. Los espectros se obtienen al barrer el separador de longitudes de onda y se pueden realizar medidas cuantitativas a partir de un espectro o con una sola longitud de onda. Existe una variedad de metodos de espectroscopfa UV-vis. Estos metodos incluyen, pero no se limitan a: ultravioleta/visible molecular, espectroscopfa de absorcion, espectroscopfa ultravioleta, espectroscopfa de absorcion ultravioleta/visible.
7. Espectroscopfa de Raman
La espectroscopfa de Raman se puede usar para cuantificar la cantidad de cadenas pepffdicas o polipepffdicas que tienen un grupo dietilamida en un extremo de las mismas en una muestra. La ventaja de la espectroscopfa Raman es que el agua no da lugar a una senal de Raman. Las intensidades de Raman son directamente proporcionales a la concentracion de la especie medida. A este respecto, la espectroscopfa Raman se puede usar para determinar la concentracion de una especie particular presente.
Durante la excitacion de Raman, el cambio en los valores relativos de las areas de los picos de Raman que surgen de vibraciones moleculares se puede usar como una medida del porcentaje de diversas estructuras presentes dentro de una muestra, por ejemplo una muestra purificada. Durante la purificacion del extremo C como se describe anteriormente en la presente memoria usando un metodo de separacion, tal como cromatograffa de afinidad, el peptido C-terminal aislado se puede analizar usando espectroscopfa de Raman. Los picos de Raman correspondientes a los grupos que constituyen los grupos dietilamida son claramente evidentes durante la espectroscopfa de Raman. Se pueden usar diversos tipos de tecnicas de Raman para analizar los grupos dietilamida. Una muestra representativa incluye espectroscopfa de Raman convencional, espectroscopfa de Raman de resonancia y espectroscopfa de Raman mejorada superficialmente.
8. Metodos de deteccion de anticuerpos
Un anticuerpo espedfico para una estructura seleccionada (o espedfico para las otras estructuras de una muestra) se puede usar para determinar la presencia y/o la cantidad de una estructura seleccionada en una muestra, p. ej., una cantidad de cadenas pepffdicas o polipepffdicas que tienen un grupo dietilamida en un extremo de las mismas en una muestra de Copoffmero-1 o cOpAxONE®. Por ejemplo, un anticuerpo espedfico para los grupos de los peptidos C-terminales, N-terminales o internos modificados o no modificados esta facilmente disponible o se puede desarrollar mediante metodos conocidos en la tecnica.
Por ejemplo, para determinar la cantidad de cadenas pepffdicas o polipepffdicas que tienen presente un grupo dietilamida en un extremo de las mismas, con o sin purificacion de los peptidos C-terminales segun se describe anteriormente en la presente memoria usando un metodo de separacion, tal como cromatograffa de afinidad, los peptidos C-terminales purificados se pueden incubar con un anticuerpo preseleccionado durante un penodo de tiempo, p. ej., dos horas, a temperatura ambiente. El anticuerpo solo se unira a cadenas espedficas para la estructura modificada para la que se produda, p. ej., los peptidos C-terminales. El anticuerpo tambien puede incluir un marcador que emite fluorescencia cuando se expone a radiacion electromagnetica. Despues de un penodo de tiempo, p. ej., dos horas, los anticuerpos en exceso se separan por lavado y la muestra se purifica y opcionalmente se cuantifica.
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
A continuacion, la muestra purificada se expone a radiacion electromagnetica, lo que hace que los anticuerpos unidos emitan fluorescencia. La cantidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de grupos dietilamida presentes en los peptidos C-terminales.
D. Purificacion
La etapa de purificacion, denominada alternativamente en la presente memoria una etapa de enriquecimiento, produce una fraccion de macromoleculas que tiene una proporcion mayor de las macromoleculas seleccionadas. La fraccion de macromoleculas resultante de la etapa de purificacion puede incluir macromoleculas distintas a las macromoleculas seleccionadas. Cualquiera de los metodos de separacion descritos anteriormente se puede usar para la etapa de purificacion. La descripcion de la etapa de separacion divulgada anteriormente en la presente memoria se incorpora mediante referencia con la intencion de aplicar estas tecnicas a la etapa de purificacion.
En algunas realizaciones, la purificacion de las cadenas peptfdicas o polipeptfdicas que tienen un grupo dietilamida en un extremo de las mismas se puede alcanzar mediante cualquier metodo conocido en la tecnica. Un metodo de purificacion se muestra en la Figura 4. Mas particularmente, el Copolfmero-1 se puede tratar con un alcohol, dando como resultado la transesterificacion de los grupos carboxilato. Alternativamente, el copolfmero-1 se puede tratar con EDC/qmmica de aminas. El tratamiento con cualquiera de estas qmmicas da como resultado que se protejan los grupos carboxilato en el acido glutamico y el extremo C del polipeptido. Tambien se conocen en la tecnica otros metodos de purificacion. Por ejemplo, el Copolfmero-1 se puede tratar con una protema que se une a los grupos carboxilato, p. ej., biotina. Si se alcanza por medios qmmicos o biologicos, este copolfmero modificado se puede despolimerizar a continuacion mediante cualquier metodo conocido en la tecnica, tal como una digestion qmmica o enzimatica. Esta digestion produce tres tipos de estructuras peptidos N-terminales, peptidos internos y peptidos C- terminales.
Para purificar los peptidos C-terminales, se pueden usar metodos tales como tratamiento con anticuerpos o cromatograffa de afinidad. Los peptidos N-terminales, los peptidos internos y los peptidos C-terminales se ponen en una columna de cromatograffa de afinidad. Las condiciones y la columna se eligen de modo que los peptidos N- terminales y los peptidos internos modificados se unan a la columna. Los peptidos C-terminales se eluyen a traves de la columna con la fase movil. A continuacion, la fase movil se retira dando como resultados los peptidos C- terminales purificados. A continuacion, los peptidos C-terminales purificados se pueden cuantificar y analizar mediante cualquier metodo conocido en la tecnica.
Ademas, la etapa de purificacion puede incluir ligar la protema, o un fragmento de la misma, a un marcador de afinidad. Los marcadores de afinidad se pueden anadir al extremo N-terminal o C-terminal de la protema. Marcadores de afinidad incluyen: marcadores de histidina (His); marcadores de glutationa-S-transferasa (GST); marcadores de V5; marcadores de FLAG; marcadores de hemaglutinina (HA) de influenza; marcadores de Myc; marcadores de VSV-G; marcadores de tiorredoxina (Trx). Otros marcadores protemicos que tienen afinidad para un ligando incluyen: marcadores espedficos para lisina; biotina, estreptavidina, protema que se une a maltosa (MBP, por sus siglas en ingles); S-tag; dominio de union a DNA (DBD, por sus siglas en ingles) de Lex A; dominio de union a DNA de GAL4; virus del herpes simple (HSV, por sus siglas en ingles) y protema BPI 6.
III. Aplicacion de los metodos ahora divulgados para evaluar o caracterizar mezclas de polipeptidos complejas
Los metodos de fragmentacion, separacion, deteccion y/o cuantificacion y purificacion divulgados inmediatamente antes en la presente memoria se pueden aplicar a la caracterizacion de mezclas de polipeptidos complejas.
A. Fragmentacion seguida por MS o LC/MS
En una realizacion, el metodo actualmente divulgado incluyo detectar restos terminales no carboxflicos, es decir, grupos dietilamida, en una mezcla de polipeptidos usando despolimerizacion enzimatica seguida por deteccion por MS o LC-MS. En esta realizacion, el polipeptido o la mezcla de polipeptidos se despolimeriza, preferiblemente al anadir una o mas proteasas a la mezcla. Proteasas adecuadas incluyen tripsina, quimotripsina, elastasa y glu-C y mezclas de las mismas. La proteasa se puede seleccionar basandose en las propiedades de division de la proteasa espedfica. Por ejemplo, la tripsina divide el extremo C de lisina o arginina; la quimotripsina prefiere una cadena lateral aromatica en el residuo cuyo carbono carbomlico es parte del enlace peptfdico que se va a dividir; y Glu-C divide el extremo C del glutamato. La relacion enzima/CPX es preferiblemente aproximadamente 1:50 en peso.
Se pueden usar disolventes y tampones adecuados durante la etapa de despolimerizacion. Por ejemplo, para tripsina y Glu-C, soluciones preferibles incluyen bicarbonato amonico 50 mM; para la digestion con quimotripsina, soluciones preferibles pueden incluir Tris-HCl 10 mM y cloruro calcico 10 mM como tampon. Se pueden usar otros disolventes y tampones compatibles conocidos en la tecnica. La etapa de despolimerizacion, que tambien se denomina en la presente memoria etapa de digestion, avanza hasta que los polipeptidos se despolimerizan sustancialmente en peptidos individuales. Para proporcionar una despolimerizacion controlada, la etapa de despolimerizacion se puede producir a una temperatura elevada, por ejemplo entre aproximadamente 20°C y aproximadamente 40°C, a lo largo de un penodo de tiempo. En algunas realizaciones, con tripsina la despolimerizacion se produce a aproximadamente 37°C y para quimotripsina y Glu-C la temperatura de despolimerizacion es aproximadamente 25°C. La despolimerizacion avanza hasta que se produce una
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
despolimerizacion adecuada, en algunas realizaciones, durante al menos 12 horas y en algunas realizaciones aproximadamente 16 horas. La digestion se puede terminar despues de que se haya producido una digestion adecuada mediante metodos conocidos en la tecnica, tales como calentamiento y ajuste del pH. En algunas realizaciones, los polipeptidos se pueden desnaturalizar mediante calentamiento o adicion de un disolvente de desnaturalizacion antes de la despolimerizacion.
Despues de la despolimerizacion, los fragmentos de poffmero digeridos comprenden peptidos N-terminales, peptidos internos y peptidos C-terminales, segun se muestra en la Figura 2. Estos fragmentos de poffmero digeridos se pueden aislar a continuacion usando una tecnica de separacion. En algunas realizaciones, los peptidos se separan usando cromatograffa de ffquidos de alta resolucion en fase inversa (HPLC en fase inversa), en donde los fragmentos carboxiterminales se separan de los fragmentos no carboxiterminales, segun se muestra en la Figura 2.
En algunas realizaciones, las fases moviles usadas en la HPLC en fase inversa incluyen agua y acetonitrilo. Una pequena cantidad de un acido, tal como acido trifluoroacetico (TFA, por sus siglas en ingles), se puede anadir a las fases moviles tanto de agua como de acetonitrilo. Aunque sin querer limitarse por una teoffa, el ambiente acido suprime la interaccion de los grupos basicos de los peptidos o las protemas con silanoles superficiales del relleno de la columna. En algunas realizaciones, las fases moviles comprenden TFA aproximadamente al 0,05% en agua de calidad para HPLC y TFA aproximadamente al 0,04% en acetonitrilo de calidad para HPLC.
En algunas realizaciones, la columna de HPLC en fase inversa es una columna C-18 que tiene un relleno de octadecilsffice y con un diametro interno de 4,6 mm, una longitud de 150 mm, un tamano de parffcula de 3 pm y un tamano de poro de 120 A. Alternativamente, se puede usar cromatograffa de intercambio de cationes fuertes. El intercambio de cationes fuertes permite la separacion de los fragmentos carboxiterminales de los fragmentos no carboxiterminales.
Una vez que se afslan los fragmentos no carboxiterminales, se pueden identificar usando espectrometffa de masas (MS) o cromatograffa de ffquidos-espectrometffa de masas (LC-MS). La Figura 3 representa la alanina del peptido y el grupo dietilamida de la alanina. Al realizar el analisis, las cadenas pepffdicas o polipepffdicas que tienen un grupo dietilamida en un extremo de las mismas se pueden identificar por un cambio de masa resultante de 56,1 Da desde el peso molecular del peptido natural, tal como el mostrado en la Figura 3.
B. Deteccion y cuantificacion de cadenas pepffdicas o polipepffdicas que tienen un grupo dietilamida en un extremo de las mismas usando NMR
Otra realizacion de la invencion incluye un metodo para detectar y cuantificar aminoacidos no naturales, incluyendo aminoacidos que tienen grupos dietilamida C-terminales en un extremo de los mismos, en mezclas de polipeptidos, tales como acetato de glatiramer, utilizando NMR. La NMR es un fenomeno que se presenta cuando los nucleos de ciertos atomos se sumergen en un campo magnetico estatico y se exponen a un segundo campo magnetico oscilatorio. Algunos nucleos experimentan este fenomeno y otros no, dependiendo de si poseen una caracteffstica de espm. Las espectroscopia de NMR se puede usar para estudiar la estructura qmmica.
Por otra parte, la NMR se puede usar para muchas moleculas que poseen una caracteffstica de espm. Estas incluyen, pero no se limitan a, 1H, 2H, 23Na, 15N, 13C y 18O. Mas de 200 isotopos tienen momentos magneticos y se pueden estudiar usando NMR. La NMR se puede realizar en estados de solucion y solido y todos los tipos de experimentos de NMR se pueden aplicar a los metodos ahora divulgados incluyendo desacoplamiento de banda ancha, desacoplamiento fuera de resonancia, potenciacion nuclear de Overhauser (NOE) y NMR bidimensional (NMR 2D). Ejemplos representativos de metodos de NMR incluyen, pero no se limitan a: experimentos monopulsatiles; espectroscopia de desacoplamiento y diferencia de espm; experimentos multipulsatiles, incluyendo ecos simples, modulacion de J, transferencia poblacional, transferencia de polarizacion selectiva, transferencia de polarizacion no selectiva-INEPT, INEPT inversa, INEPT reenfocada; NMR 2D, incluyendo secuencia bidimensional basica, metodos que implican retirar el acoplamiento heteronuclear y/u homonuclear; HMQC de espectros detectados inversamente, experimentos de correlacion de desplazamiento homonuclear-COSY; variaciones en COSY, coherencia de multiples cuantos-INADEQUATE, secuencias de espm bloqueado-TOCSY, espectroscopia bidimensional con disolvente suprimido, NMR tridimensional; metodos que estudian conexiones a traves de enlaces; metodos que estudian conexiones a traves del espacio, es decir, experimentos de NOE, incluyendo NOESY y ROESY; y metodos que miden las velocidades de relajacion, incluyendo la recuperacion de la inversion, la recuperacion de la saturacion y la saturacion progresiva.
Opcionalmente, los metodos de NMR ahora divulgados pueden incluir metodos para suprimir senales que surgen de disolventes, tampones y/o contaminantes, incluyendo, pero no limitados a, tecnicas de presaturacion o “flip-back”.
En estas realizaciones, la mezcla de polipeptidos se puede analizar en su forma intacta o desnaturalizada, con o sin despolimerizacion. La despolimerizacion se puede llevar a cabo usando cualquiera de los metodos descritos anteriormente en la presente memoria.
Las mezclas de polipeptidos que se van a analizar pueden estar en muchas formas y muestras disponibles comercialmente de mezclas de polipeptidos, tales como acetato de glatiramer, ffpicamente estan disponibles en forma liofilizada. Para preparar inicialmente una muestra que incluye mezclas de polipeptidos, agentes portadores
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
farmacologicos, tales como manitol, se pueden retirar usando metodos conocidos, tales como intercambio de tampon. A continuacion, la muestra se puede redisolver en un disolvente, tal como D2O. La muestra se puede disolver en un tampon apropiado, tal como Tris(fosfato de tris-2,3-dibromo-1-propanol).
Se pueden realizar diferentes tipos de metodos de NMR sobre muestras para determinar las propiedades de los peptidos en las muestras y para identificar y cuantificar restos en las mismas. Multiples metodos de NMR, incluyendo metodos de NMR multidimensionales, se pueden realizar sobre muestras de pequena cantidad tanto para identificar especies como para cuantificar sus cantidades molares relativas. Ademas de la NMR de proton 1D, la espectroscopfa de correlacion heteronuclear bidimensional de un unico cuanto usando 1H y 13C (HSQC 2D) es util para determinar el acoplamiento directo carbono/proton y para la integracion, segun se explica posteriormente.
En algunas realizaciones, se puede usar espectroscopfa de correlacion total 2D (TOCSY) para determinar el acoplamiento proton/proton y para la integracion. Se puede usar espectroscopfa de correlacion 2D (COSY) para determinar el acoplamiento proton/proton y para la integracion. La espectroscopfa nuclear 2D de efecto Overhauser (NOESY) o la espectroscopfa rotacional de efecto Overhauser (ROESY) se pueden usar para determinar la interaccion proton/proton a traves del espacio. Tambien se pueden usar NOESY-HSQC 3D y ROESY-HSQC 3D para verificar las asignaciones de desplazamientos qmmicos.
En algunas realizaciones, se puede usar una combinacion de metodos de NMR para detectar o identificar las macromoleculas en una mezcla. Por ejemplo, en el siguiente ejemplo, se usaron 1H NMR 1D y TOCSY NMR 2D para identificar y cuantificar aductos de dietilamida.
Usando el espectro de 1H NMR 1D, se mide el area bajo cada pico con relacion a otros picos identificados para determinar el contenido molar relativo de especies individuales. Por lo tanto, usando esta tecnica analttica, se puede calcular el % en moles de cada especie identificada en el espectro de NMR. El % en moles de cada especie se puede calcular mediante comparacion de picos de la misma especie de polipeptido, mientras que las cantidades absolutas de cada especie se pueden determinar a traves del uso de una senal de referencia calibrada. Una senal de referencia puede proceder de otra molecula de la muestra o de una fuente de radiofrecuencia calibrada.
Segun esto, al usar bien la digestion enzimatica seguida por el metodo de MS o LC-MS segun se describe en la presente memoria o bien la NMR multidimensional como se describe en la presente memoria, es posible medir y cuantificar los niveles de aductos de dietilamida en una mezcla de polipeptidos .
Ejemplos
Los siguientes Ejemplos se han incluido para proporcionar una gma para un experto normal en la tecnica para poner en practica realizaciones representativas de la materia ahora divulgada. A la luz de la presente divulgacion y el nivel general de experiencia en la tecnica, los expertos pueden apreciar que los siguientes Ejemplos pretenden ser solamente ejemplares y que se pueden emplear numerosos cambios, modificaciones y alteraciones sin apartarse del alcance de la materia ahora divulgada. Los siguientes Ejemplos se ofrecen a modo de ilustracion y no a modo de limitacion.
Ejemplo 1
Analisis de aductos de dietilamida en acetato de glatiramer
Este ejemplo muestra un modo de detectar y cuantificar aductos de DEA en una preparacion de copolfmero mediante NMR.
Senales de NMR distintivas procedentes de aductos de dietilamida se determinaron a partir de Ala-Ala-dietilamida. El espectro de 1H NMR 1D se muestra en la Figura 5. La muestra se disolvio en 700 pl de Tris-d11 10 mM, pH 8 con sal sodica de 2,2-dimetil-2-silapentano-5-sulfonato-d6 4 mM (DSS-d6). Los desplazamientos qmmicos se determinaron con relacion al 1H del metilo de DSS. Los dos grupos metilo del resto dietilamida producen senales distintas a 1,26 y 1,09 ppm.
Muestras procedentes de un lote de acetato de glatiramer (COPAXONE®) se analizaron mediante 1H NMR 1D. Aproximadamente 0,700 ml de acetato de glatiramer formulado se liofilizaron hasta sequedad. El polvo se redisolvio en 0,700 ml de D2O y se liofilizo. El procedimiento de disolucion y liofilizacion se repitio tres veces. A continuacion, la muestra se redisolvio en 0,700 ml de Tris-d11 10 mM, pH 8 con DSS-d6 4 mM. La Figura 6 es el espectro de 1H NMR 1D para acetato de glatiramer con supresion de la senal de disolvente residual. Las senales grandes procedentes de 3,65-3,90 ppm surgen de manitol y la senal grande en 1,92 ppm es del acetato usado para formular el acetato de glatiramer. Las senales de 1H del metilo de los aductos de dietilamida son visibles a 1,25 y 1,10 ppm. Aunque se solapan con la cola de las senales de metilo de la alanina, el valor inicial es suficientemente suave para sustraer la caractenstica ancha y obtener un valor inicial localmente plano para la integracion (Figura 7). La senal procedente de la caractenstica a 3.00 ppm surge de la suma de He de lisina y Hp de tirosina. Cada residuo de lisina y cada residuo de tirosina tiene dos nucleos de 1H que dan lugar a esta senal. Asf, la senal a 3,00 ppm es proporcional a dos veces el contenido de lisina y tirosina. La senal de metilo de la dietilamida a 1,10 ppm es proporcional a tres veces el contenido de aducto de dietilamida, ya que cada grupo metilo tiene tres nucleos de 1H.
5
10
15
20
25
30
La cantidad de dietilamida se puede determinar a partir de la relacion de la senal de metilo de dietilamida a la senal de polipeptido a 3,00 ppm. A partir del analisis de aminoacidos, se encontro que este lote de acetato de glatiramer consiste en 33,7% de lisina y 9,1% de tirosina. Por lo tanto, la dietilamida representa (2 * [1,10 ppm integral] * ([mol %Lys] + [mol %Tyr])) / (3 * [3,00 ppm integral]) = (2 * 1,00 * 42,8 %) / (3 * 193,16) = 0,14% en moles de residuos. Alternativamente, este valor se puede traducir en masa total de aducto de dietilamida o % en moles de cadenas.
Se obtuvieron valores similares con multiples muestras de acetato de glatiramer procedentes de multiples lotes, bien con o bien sin manitol. Las muestras se almacenaron segun las instrucciones del fabricante antes del analisis.
Ejemplo 2
Analisis por LC/MS de dietilamina
Este ejemplo muestra un modo de detectar y cuantificar aductos de DEA en una preparacion de copolfmero mediante espectroscopfa de masas.
Se pueden presentar diversas modificaciones de residuos terminales en las cadenas polipeptfdicas del Copolfmero-1 a partir de diversas rutas de reaccion. Por ejemplo, se pueden presentar modificaciones de los residuos N- y C- terminales, tales como DEA en el extremo C. Estas modificaciones son un resultado directo del procedimiento de produccion del Copolfmero-1. Verificar estas modificaciones puede proporcionar informacion acerca del procedimiento. Si estas especies estan presentes en una cantidad significativa, puede ser necesario cuantificarlas como impurezas.
La evidencia espectral masica de la existencia de DEA se muestra en las Figuras 8A y 8B. Tambien se ha detectado DEA mediante NmR.
En referencia ahora a las Figuras 8A y 8B, la Figura 8A muestra un patron de fragmentacion por MS/MS de DEA representativo. El enlace amida entre la DEA y el grupo carboxflico de un peptido es fragil y se puede romper mediante colision con moleculas de gas, tal como nitrogeno. En la fragmentacion de la muestra, los compuestos se fragmentan en fragmentos menores en una fuente ionica y pueden generar algunos tipos de iones fragmentados, tales como iones DEA. Se genero un ion con la misma masa que DEA, 74,09, mediante fragmentacion en la fuente de una muestra de Copolfmero-1. La Figura 8B muestra que la fragmentacion por MS/MS de este ion genera el mismo patron que la DEA.
Aunque la materia precedente se ha descrito con algun detalle a modo de ilustracion y ejemplo con propositos de claridad de comprension, se entendera por los expertos en la tecnica que se pueden poner en practica ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Un metodo para ensayar una muestra de acetato de glatiramer, comprendiendo el metodo:
    (a) proporcionar la muestra de acetato de glatiramer, en donde se sospecha que la muestra comprende uno o mas polipeptidos que tienen un resto dietilamida unido a un extremo C de los mismos;
    (b) determinar la cantidad de polipeptidos que tienen un resto dietilamida unido a un extremo C de los mismos en la muestra al detectar restos dietilamida cuando estan presentes en el extremo C;
    (c) comparar la cantidad de polipeptidos que tienen el resto dietilamida unido a un extremo C de los mismos en la muestra con un valor de especificacion farmaceutica predeterminado para el acetato de glatiramer, en donde el valor de especificacion para el acetato de glatiramer tiene un intervalo de aproximadamente 7% en moles a aproximadamente 20% en moles de polipeptidos que tienen un resto dietilamida unido a un extremo C de los mismos; y
    (d) clasificar la muestra basandose en la cantidad de polipeptidos que tienen restos dietilamida unidos al extremo C de los mismos en la muestra, en donde la clasificacion de la muestra comprende aprobar la muestra para uso farmaceutico.
  2. 2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la muestra de acetato de glatiramer se selecciona del grupo que consiste en acetato de glatiramer, acetato de glatiramer fragmentado, acetato de glatiramer fraccionado y acetato de glatiramer derivado.
  3. 3. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que el valor de especificacion para el acetato de glatiramer tiene un intervalo de aproximadamente 8% en moles a aproximadamente 18% en moles de polipeptidos que tienen un resto dietilamida unido a un extremo C de los mismos.
  4. 4. El metodo segun la reivindicacion 3, en el que el valor de especificacion para el acetato de glatiramer tiene un intervalo de aproximadamente 10% en moles a aproximadamente 15% en moles de polipeptidos que tienen un resto dietilamida unido a un extremo C de los mismos.
  5. 5. El metodo segun la reivindicacion 4, en el que el valor de especificacion para el acetato de glatiramer tiene un intervalo de aproximadamente 12% en moles a aproximadamente 14% en moles de polipeptidos que tienen un resto dietilamida unido a un extremo C de los mismos.
  6. 6. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la determinacion de la cantidad de polipeptidos que tienen un resto dietilamida unido a un extremo C de los mismos en la muestra de Copoffmero-I comprende un metodo seleccionado del grupo que consiste en cromatograffa de ffquidos, cromatograffa ionica, cromatograffa de gases, electroforesis capilar, espectrometna de masas, cromatograffa de ffquidos/espectrometna de masas, espectroscopfa de NMR, un metodo de deteccion de anticuerpos, espectroscopfa de Raman, espectroscopfa infrarroja, espectroscopfa de fluorescencia, espectroscopfa UV-Vis, electroforesis en gel y combinaciones de los mismos.
  7. 7. El metodo segun la reivindicacion 6, en donde el metodo se selecciona del grupo que consiste en electroforesis capilar, espectrometna de masas, cromatograffa de ffquidos/espectrometna de masas, espectroscopfa de NMR, un metodo de deteccion de anticuerpos y espectroscopfa de Raman.
  8. 8. El metodo segun la reivindicacion 7, en donde el metodo es espectroscopfa de NMR y el metodo de NMR se selecciona del grupo que consiste en NMR unidimensional, NMR bidimensional y NMR tridimensional, 1H NMR, 13C NMR, 15N NMR y combinaciones de las mismas.
  9. 9. El metodo segun la reivindicacion 8, en donde el metodo de NMR comprende ademas cuantificar la senal de NMR para determinar una cantidad de cadenas polipepffdicas que tienen al menos un extremo C modificado.
  10. 10. El metodo segun la reivindicacion 9, que comprende cuantificar la senal de NMR mediante un metodo seleccionado del grupo que consiste en:
    (a) integrar uno o mas picos de NMR asignados al extremo C modificado;
    (b) someter a deconvolucion a uno o mas picos de NMR asignados al extremo C modificado; y
    (c) referir la senal de NMR asignada al extremo C modificado a una de una senal de NMR asignada a un copoffmero que comprende una mezcla de polipeptidos, una molecula de referencia anadida a la muestra, una muestra externa, una senal de radiofrecuencia calibrada y combinaciones de las mismas.
  11. 11. El metodo segun la reivindicacion 8, en donde el metodo de NMR comprende ademas poner en contacto la muestra con un desnaturalizante qmmico, por ejemplo, con un desnaturalizante qmmico seleccionado del grupo que consiste en urea y guanidina.
  12. 12. El metodo segun la reivindicacion 6 o 7, en donde el metodo es el metodo de deteccion de anticuerpos y el metodo de deteccion de anticuerpos se selecciona del grupo que consiste en inmunotransferencia, cromatograffa de afinidad y ensayo de inmunoabsorcion con enzimas ligadas.
  13. 13. El metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas fraccionar la muestra antes de determinar la 5 cantidad de polipeptidos que tienen un resto dietilamida unido a un extremo C de los mismos en la muestra de
    Copoffmero-I en la etapa (b).
  14. 14. El metodo segun la reivindicacion 13, que comprende fraccionar la muestra mediante un metodo seleccionado del grupo que consiste en cromatograffa de lfquidos, cromatograffa ionica, cromatograffa de afinidad, electroforesis capilar y combinaciones de las mismas.
    10 15. El metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas purificar la muestra antes de analizar la muestra en
    la etapa (b).
  15. 16. El metodo segun la reivindicacion 1, que comprende ademas fragmentar la muestra, por ejemplo, mediante despolimerizacion qmmica o mediante digestion enzimatica.
ES07761581.3T 2006-04-28 2007-04-30 Métodos para evaluar mezclas de péptidos Active ES2565035T3 (es)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US74601806P 2006-04-28 2006-04-28
US746018P 2006-04-28
PCT/US2007/067777 WO2007127977A2 (en) 2006-04-28 2007-04-30 Methods of evaluating peptide mixtures

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2565035T3 true ES2565035T3 (es) 2016-03-30

Family

ID=38561950

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES07761581.3T Active ES2565035T3 (es) 2006-04-28 2007-04-30 Métodos para evaluar mezclas de péptidos

Country Status (8)

Country Link
US (3) US8470603B2 (es)
EP (1) EP2013628B1 (es)
JP (1) JP5374363B2 (es)
CN (1) CN101479607B (es)
AU (1) AU2007244643B2 (es)
CA (1) CA2650653C (es)
ES (1) ES2565035T3 (es)
WO (1) WO2007127977A2 (es)

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8470603B2 (en) 2006-04-28 2013-06-25 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of evaluating diethylamide in glatiramer acetate
ES2449865T5 (es) 2008-04-16 2022-11-18 Momenta Pharmaceuticals Inc Análisis de composiciones de copolímeros de aminoácidos
EP2427199B1 (en) * 2009-05-08 2014-06-04 ScinoPharm Taiwan, Ltd. Methods of analyzing peptide mixtures
USRE49251E1 (en) 2010-01-04 2022-10-18 Mapi Pharma Ltd. Depot systems comprising glatiramer or pharmacologically acceptable salt thereof
US8643274B2 (en) 2010-01-26 2014-02-04 Scinopharm Taiwan, Ltd. Methods for Chemical Equivalence in characterizing of complex molecules
TWI613447B (zh) * 2010-05-07 2018-02-01 台灣神隆股份有限公司 分析胜肽混合物之方法
WO2012037430A1 (en) * 2010-09-17 2012-03-22 Abbott Laboratories Raman spectroscopy for bioprocess operations
EP2699317B1 (en) 2011-04-21 2016-08-10 Mapi Pharma Limited Random pentapolymer for treatment of autoimmune diseases
FR2975777B1 (fr) * 2011-05-26 2014-03-14 Arkema France Procede de caracterisation d'un copolymere d'ethylene et d'acetate de vinyle
WO2013009885A2 (en) * 2011-07-11 2013-01-17 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Evaluation of copolymer diethylamide
CN104098655B (zh) * 2013-04-09 2018-01-30 深圳翰宇药业股份有限公司 用于合成醋酸格拉替雷的质谱内标的多肽
CN105218646B (zh) * 2014-06-24 2018-09-21 深圳翰宇药业股份有限公司 一种用于检测醋酸格拉替雷样本的uplc方法
CN105223281B (zh) * 2014-06-24 2017-09-05 深圳翰宇药业股份有限公司 一种用于检测卡帕松制剂中醋酸格拉替雷浓度的色谱方法
CN105277606A (zh) * 2014-07-08 2016-01-27 山东绿叶制药有限公司 艾塞那肽有关物质的测定方法
FR3024775B1 (fr) * 2014-08-11 2018-05-11 Polyneuros Procede d'identification et de caracterisation de composes polypeptidiques
JP2016156807A (ja) * 2015-02-23 2016-09-01 株式会社堀場製作所 分析方法及び分析装置
CN112649538B (zh) * 2015-04-28 2024-03-29 深圳翰宇药业股份有限公司 多肽混合物高效液相色谱分析方法
WO2016176649A1 (en) * 2015-04-30 2016-11-03 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. Method of determining the molecular weight distribution of glatiramer acetate using multi-angle laser light scattering (malls)
US10794916B2 (en) 2015-05-06 2020-10-06 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of glycoprotein analysis
US20190079100A1 (en) * 2015-05-06 2019-03-14 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of glycoprotein analysis
WO2018106945A1 (en) 2016-12-07 2018-06-14 Progenity Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
JP2020515530A (ja) 2017-03-26 2020-05-28 マピ ファーマ リミテッド 進行型の多発性硬化症を治療するためのグラチラマーデポシステム
CN107421975B (zh) * 2017-07-17 2019-11-29 天津中医药大学 一种注射剂中甘油含量的检测方法
US20200306516A1 (en) 2017-08-14 2020-10-01 Progenity, Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with glatiramer or a pharmaceutically acceptable salt thereof
US20200200719A1 (en) * 2017-09-07 2020-06-25 Alembic Pharmaceuticals Limited Process For The Characterization Of Glatiramer Acetate
EP3765856B1 (en) * 2018-03-13 2023-09-27 Amgen Inc. Methods for the preparation of trypsin-resistant polypeptides for mass spectrometric analysis
US20200075128A1 (en) * 2018-09-03 2020-03-05 Scinopharm Taiwan, Ltd. Analyzing High Dimensional Data Based on Hypothesis Testing for Assessing the Similarity between Complex Organic Molecules Using Mass Spectrometry
RU2690186C1 (ru) * 2018-11-14 2019-05-31 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ФГБНУ ВИЛАР) Одновременное количественное определение глицерина и ацетата калия в водном растворе методом 1н ямр спектроскопии
JP2023501227A (ja) * 2019-10-29 2023-01-18 クアンタム－エスアイ インコーポレイテッド 配列決定のためにカートリッジを使用する方法およびデバイス
CA3223357A1 (en) * 2021-07-12 2023-01-19 Brigitte Elisa Anna Burm Improved substance quantification in complex mixtures
CN114441506B (zh) * 2022-04-08 2022-06-21 港湾之星健康生物(深圳)有限公司 量子磁光传感器

Family Cites Families (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL36670A (en) 1971-04-21 1974-09-10 Sela M Therapeutic basic copolymers of amino acids
US5800808A (en) * 1994-05-24 1998-09-01 Veda Research And Development Co., Ltd. Copolymer-1 improvements in compositions of copolymers
US6514938B1 (en) * 1998-09-25 2003-02-04 Yeda Research And Development Co. Ltd. At The Weizmann Institute Of Science Copolymer 1 related polypeptides for use as molecular weight markers and for therapeutic use
JP4931312B2 (ja) * 1999-12-13 2012-05-16 ステリックス リミテッド ステロイドスルファターゼのインヒビターとしてのハロゲン化スルファメート−、ホスホネート−、チオホスホネート−、スルホネート−、およびスルホンアミド−化合物
US20030153007A1 (en) 2001-12-28 2003-08-14 Jian Chen Automated systems and methods for analysis of protein post-translational modification
EP1725603A2 (en) * 2004-03-01 2006-11-29 Peptimmune, Inc. Methods and compositions for treatment of autoimmune diseases
KR20190072678A (ko) 2004-09-02 2019-06-25 제넨테크, 인크. 헤지호그 신호전달에 대한 피리딜 억제제
DK1797109T3 (en) * 2004-09-09 2016-04-11 Yeda Res & Dev MIXTURES OF POLYPEPTIDES, compositions containing them and methods for their preparation, and uses thereof
US8470603B2 (en) 2006-04-28 2013-06-25 Momenta Pharmaceuticals, Inc. Methods of evaluating diethylamide in glatiramer acetate

Also Published As

Publication number Publication date
US20090237078A1 (en) 2009-09-24
US8927292B2 (en) 2015-01-06
US20140011727A1 (en) 2014-01-09
WO2007127977A2 (en) 2007-11-08
CA2650653C (en) 2016-03-29
US8921116B2 (en) 2014-12-30
AU2007244643B2 (en) 2013-05-02
JP5374363B2 (ja) 2013-12-25
CN101479607A (zh) 2009-07-08
US20140080218A1 (en) 2014-03-20
AU2007244643A1 (en) 2007-11-08
US8470603B2 (en) 2013-06-25
EP2013628B1 (en) 2016-01-06
CN101479607B (zh) 2013-10-02
EP2013628A2 (en) 2009-01-14
CA2650653A1 (en) 2007-11-08
WO2007127977A3 (en) 2007-12-21
JP2009535627A (ja) 2009-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
ES2565035T3 (es) Métodos para evaluar mezclas de péptidos
ES2205437T3 (es) Procedimiento que permite caracterizar polipeptidos.
Cargile et al. Immobilized pH gradients as a first dimension in shotgun proteomics and analysis of the accuracy of pI predictability of peptides
ES2296996T3 (es) Marcaje de moleculas.
Kašička Recent advances in CE and CEC of peptides (2007–2009)
Ni et al. Analysis of isoaspartic acid by selective proteolysis with Asp-N and electron transfer dissociation mass spectrometry
Kašička Recent advances in capillary electrophoresis and capillary electrochromatography of peptides
Kašička Capillary electrophoresis of peptides
AU2004216642B2 (en) Polypeptide fingerprinting methods, metabolic profiling, and bioinformatics database
Brocca et al. Compaction properties of an intrinsically disordered protein: Sic1 and its kinase-inhibitor domain
Erard et al. Repeat peptide motifs which contain β‐turns and modulate DNA condensation in chromatin
Chang et al. Physical stability of protein pharmaceuticals
JP2009526998A (ja) 定量分析のための質量標識
US20030119069A1 (en) Labeling of protein samples
Conrotto et al. Proteomic approaches in biological and medical sciences: principles and applications
Chiappetta et al. Quantitative identification of protein nitration sites
Deaton et al. Pulsed‐field gradient NMR study of sodium dodecyl sulfate micelle–peptide association
Janini et al. Development of a two-dimensional protein–peptide separation protocol for comprehensive proteome measurements
Arakawa et al. Biophysical and biochemical analysis of recombinant proteins
JP2010078455A (ja) プロテオミクス解析におけるペプチド分離・同定方法
Asermely et al. Identification of a recombinant synaptobrevin–thioredoxin fusion protein by capillary zone electrophoresis using laser-induced fluorescence detection
Liao et al. Strategy combining separation of isotope-labeled unfolded proteins and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry analysis enables quantification of a wide range of serum proteins
Righetti et al. The “Invisible Proteome”: How to capture the low-abundance proteins via combinatorial ligand libraries
Roberson et al. Review of methods to assign the nuclear magnetic resonance peaks of reductively methylated proteins
Wang et al. Reconstructed protein arrays from 3D HPLC/tandem mass spectrometry and 2D gels: complementary approaches to Porphyromonas gingivalis protein expression