TWI613447B - 分析胜肽混合物之方法 - Google Patents

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本發明係關於一種藉由質譜儀來對胜肽、胜肽混合物、多肽混合物及包含多肽成份之生物分子進行定性、比較及分類之分析方法。

Description

分析胜肽混合物之方法
本發明係關於一種藉由質譜儀來對胜肽、胜肽混合物、多肽混合物及包含多肽成份之生物分子進行定性、比較及分類之分析方法。更特定而言，本發明係提供一種對複雜的胜肽混合物、包含數種不同胺基酸之多肽混合物或包含多肽成份之生物分子進行定性及分類的分析/統計方法。
共聚物-1(Copolymer-1)係麩胺酸、離胺酸、丙胺酸及酪胺酸這四種胺基酸進行聚合製備而得之複雜的多肽混合物。共聚物-1亦被稱為醋酸格拉替雷(Glatiramer acetate)，並且係具有以下之結構式：
(Glu,Ala,Lys,Tyr)χ‧χCH3COOH
(C5H9NO4 .C3H7NO2 .C6H14N2O2 .C9H11NO3)χ .χC2H4O2
(Physician Desk reference,(2000))
醋酸格拉替雷(GA)為
Figure TWI613447BD00001
(Teva Pharmaceutical Industries Ltd.,Israel)之活性成份，其包含經合成之含有四種天然胺基酸的多肽混合物之醋酸鹽，其中該四種天然胺基酸為L-麩胺酸(L-glutamic acid)、L-丙胺酸(L-alanine)、L-酪胺酸(L-tyrosine)及L-離胺酸(L-lysine)，且其分別具有經報導過之0.141、0.427、0.095及0.338之平均莫耳分率。
Figure TWI613447BD00002
之平均分子量係介於4,700及11,000道耳吞之間。醋酸格拉替雷為經核准之用於治療多發性硬化症(MS)的藥物。美國專利第3,849,550及5,800,808號以及PCT國際申請案公開號第WO 00/05250號已記載了製備醋酸格拉替雷之方法。
歐洲專利申請案公開號第1 983 344 A1號已揭示了一種以胰蛋白酵素消化一單一多肽標準品並藉由MALDI-TOF來偵測其分裂之方法。PCT國際申請案公開號第WO 2008/135756號揭示了以胰蛋白酵素消化單一胜肽標準品，其提供了以串聯MS(tandem MS)來分析消化之後所產生的胜肽之技術。
相較於先前技術，本發明揭示了使用水解酵素將複雜多肽混合物(諸如：醋酸格拉替雷)之標準品消化(digest)成幾個胜肽片段，再藉由質譜儀進行一次質譜(MS)及二次質譜(MS/MS)分析該胜肽片段。標準樣品之質譜分析結果係用來作為與其他樣品比較之指紋(fringerprint)。對所得之該兩個樣品消化物之質量光譜進行比較，並將之當作是各自樣品之指紋。
將各個一次質譜分析所得之胜肽片段挑選出，並使之進行二次質譜分析(即所謂的MS/MS分析)，以將前體胜肽離子(precursor peptide ions)裂解成更小的片段。藉由軟體(諸如：Biotools)對自MS/MS分析所得之質量光譜進行分析，以得各胜肽片段之序列。該結果會揭示該一次質譜分析所偵測之胜肽離子的組成及序列。最後，以統計軟體(諸如：ClinProTool)分析該樣品消化物的質量光譜，可以藉由統計測試(t-檢定(t-test)、ANOVA等)所得之單變量峰排位法(univariate peak rankings)將之分類(諸如：2D峰分佈)。亦可藉由多變量統計法(諸如：主成分分析法(Principal Component Analysis；PCA))來完成不同樣品的分組及區分。此策略性方法係以統計法對不同產品之質量光譜進行比較，並基於所得之點的分類及位置來辨別樣品。
本發明係提供一種對胜肽或多肽混合物或包含多肽成份之生物分子之樣品進行定性、比較及分類的方法，其係藉由質譜儀及統計法來完成。
於一較佳實施態樣中，該方法包含：(a)將該樣品以一合適之酵素或化學品消化或分解成胜肽片段；(b)藉由質譜儀分析該胜肽片段，得一質量光譜；及(c)藉由統計法分析該質量光譜，以將不同樣品分類及區分。
於一較佳實施態樣中，該合適之酵素係於溶液中、或係固定於載體上。
於一較佳實施態樣中，該載體係選自由微米級或奈米級之顆粒、管柱內之塗層及於卡匣(cartridge)中之填料所組成之群。
於一較佳實施態樣中，該載體係磁性顆粒或非磁性顆粒。
於一較佳實施態樣中，該合適之酵素係胰蛋白酵素或任何其他能夠消化該樣品之酵素。更佳地，該酵素係溶解於溶液中、或係固定於顆粒上、或係固定於管柱之內表面上、或係固定於卡匣中之填料上。
於一較佳實施態樣中，使用來分解該樣品之該化學品係有機或無機之酸或鹼。
於一較佳實施態樣中，該樣品係一多肽混合物。
於一較佳實施態樣中，該樣品係共聚物混合物。
於一較佳實施態樣中，該樣品係克帕松(Copaxone)。
於一較佳實施態樣中，該質譜儀係能夠進行MS及MS/MS分析。
本發明亦提供一種以質譜儀分析一樣品之方法，其包含：(a)提供一胜肽標準品及一胜肽樣品；(b)以一合適之酵 素或化學品消化該胜肽樣品及該胜肽標準品；(c)對經消化之該胜肽樣品及該胜肽標準品進行質譜分析，以得兩個質量光譜；及(d)藉由統計法比較及分析該兩個質量光譜。
於一較佳實施態樣中，該統計法係主成分分析法(Principal Component Analysis；PCA)。
於一較佳實施態樣中，該樣品係多肽混合物。
於一較佳實施態樣中，該樣品係共聚物。
於一較佳實施態樣中，該共聚物之組成包含不超過10個胺基酸。
於一較佳實施態樣中，該共聚物係醋酸格拉替雷(Glatiramer acetate)。
於一較佳實施態樣中，該醋酸格拉替雷係藉由包含以下步驟之方法製備：(a)將酪胺酸、丙胺酸、麩胺酸γ-苄酯(γ-benzyl glutamate)及N-三氟乙醯離胺酸(N-trifluoroacetyl lysine)之N-羧基酸酐(N-carboxyanhydrides)進行聚合作用，以形成一經保護之多肽之混合物；(b)以混於醋酸中之氫溴酸之溶液將經保護之多肽去保護，以形成一三氟乙醯多肽(trifluoroacetyl polypeptides)之混合物；及(c)將該三氟乙醯多肽之混合物與氫氧化四丁基銨(tetrabutylammonium hydroxide)反應，以形成水性之多肽混合物，其中該多肽混合物中的每個多肽基本上係由丙胺酸、麩胺酸、酪胺酸及離胺酸所組成。
本發明提供一種在兩個高度複雜的大分子間評估化學相似性之方法。無需對樣品進行預處理，複雜的胜肽混合物之質量光譜係在該樣品中全部分子的平均結果，並且包含無法分辨的信號。為了得到再現且更明確界定之光譜以對兩個複雜混合物之組成進行比較，藉由化學反應或酵素反應使該樣品消化成更小之片段，然後使用具串聯MS功能之質譜儀對該經消化之樣品進行定性。
使用多變量統計法處理所得之質量光譜，進而將之分類。舉例來說，可進行主成分分析法(PCA)來將複雜的數據組分組，而該主成分分析法為簡單且非參數方法的多變量統計法。與多變數統計法結合在一起之質量光譜能夠提供複雜多肽分子的比較資訊。
為了幫助瞭解本發明，本文包含以下之實施例，其敘述了一系列之實驗結果。當然，以下與本發明相關之實施例不應被理解成是用來具體限定本發明。本發明在所屬技術領域具有通常知識者之視界內所做的各種改變，不論是已知的或後來發展出的，都可被視作落於本發明後附之申請專利範圍內。
實施例1經保護之共聚物-1的製備
將L-丙胺酸之N-羧基酸酐(4.0g，34.78 mmol)、L-麩胺酸γ-苄酯(γ-benzyl L-glutamate)(3.0 g,11.39 mmol)之N-羧基酸酐、N-三氟乙醯離胺酸之N-羧基酸酐(7.47g，27.97 mmol)及L-酪胺酸之N-羧基酸酐(1.6g，7.73 mmol)置於具磁攪拌器之單頸燒瓶內，接著加入無水的二氧陸圜(dioxane)(289 mL)來溶解該混合物，再加入經蒸餾而得之二乙胺(60 μL)，所得之混合物於室溫下以機械攪拌24小時。將丙酮(116 mL)加到該混合物內，並且將該溶液緩慢倒入丙酮(173 mL)及水(578 mL)之混合物內。攪拌該懸浮液並將之過濾。於真空下，將固體於不超過45℃之溫度下進行乾燥，得12.02g的經保護之共聚物-1(產率：94.7%)。
實施例2將聚[L-Ala,5-苄基-L-Glu,N6-TFA-L-Lys,L-Tyr]之苄基去保護得聚[L-Ala,L-Glu,N6-TFA-L-Lys,L-Tyr]
將12.02g的經保護之共聚物-1(實施例1所製得的)懸浮於72 mL之33%HBr/HOAc內。將該混合物於室溫下攪拌17小時，接著該溶液會變澄清。將該混合物以正庚烷(190 mL)萃取並清洗。將該混合物之下層轉移到水(240 mL)及正庚烷(120 mL)之混合物內，接著過濾沉澱物並將之乾燥，以得白色固體之三氟乙醯-格拉替雷(trifluoroacetyl-glatiramer)。
實施例3將聚[L-Ala,L-Glu,N6-TFA-L-Lys,L-Tyr]之三氟乙醯基去保護得聚[L-Ala,L-Glu,L-Lys,L-Tyr]
將9.5g的三氟乙醯-格拉替雷(實施例2所製得的)與水(120.2 mL)及40%的於水中之氫氧化四丁基銨(tetrabutylammonium hydroxide)(52.2 mL，3當量)於室溫下反應24小時，接著以醋酸(20 mL)調整該混合物之pH值到3~4，以得醋酸格拉替雷溶液，再以3千道耳吞膜(kilodalton membrane)進行超過濾(ultrafiltration)，以將低分子量之雜質移除。在經過兩個循環的連續水超過濾後，濃縮所得之產物，並將之凍乾，以得純白色固體之醋酸格拉替雷(共聚物-1)(4.7g，產率：60%)。
實施例4
胜肽標準品之消化及MS分析
以80mM NH4HCO3將克帕松(Copaxone)稀釋至0.04mg/100μl，並於57℃下，以胰蛋白酵素使之進行消化作用30分鐘。將1μl經消化之克帕松與1μl的MALDI基質α-CHC溶液之混合物乾燥並進行共結晶來進行MALDI/TOF/TOF(Autoflex III,Bruker Daltonics Corp.)分析，利用質譜儀上之反射型正電模式(reflective positive mode；RP)及直線型正電模式(linear positive mode；LP)來偵測胜肽，根據RP模式之高解析分析結果來選擇供TOF/TOF質譜分析用之前體離子(precursor ion)。該前體離子為提供胜肽碎片(fragments)之胜肽標準品，而該一次質譜分析所得的胜肽訊號以及二次質譜分析所得的胜肽碎片訊號係作為用來與其他樣品比較之指紋。
實施例5
分析其他胜肽之應用
依照上述實施例4之方法，亦對自上述實施例所合成出之共聚物-1及3-NCAs(N-羧基酸酐(N-carboxyanhydrides))、以及3個蛋白質標準品(細胞色素C(Cytochrom C)、溶菌酵素及HSA)進行偵測及分析。3-NCAs係由當量比為3.5：1.45：1.0之Lys、Glu及Tyr所組成，其相較於克帕松及共聚物-1，係缺少了丙胺酸這種胺基酸。。
實施例6
數據處理及統計分析
首先，藉由Flexanalysis及BioTools質譜儀軟體比較克帕松及共聚物-1樣品分別來自一次及二次質譜分析之訊號(第一圖至第九圖)。其次，使用ClinProTools軟體進行處理，基於使用統計法所得之單變量峰排位法將之分類(第十圖及第十二圖)。最後，使用主成分分析法(PCA)處理來自該參考品及標準品之質量光譜所得的分析結果(第十一圖及第十三圖)。該分析軟體如下：
Flexanalysis
Flexanalysis係購自Bruker Daltonics Inc.，用於圖譜分析及處理之軟體。
BioToolsTM
BioToolsTM係購自Bruker Daltonics Inc.且係支持以質譜儀為基礎之蛋白質體學的軟體，其被設計成用來判讀(interpretation)使用Bruker Daltonics ESI及MALDI儀器所測得的蛋白質消化物或胜肽之質量光譜。其亦充當作為資料庫檢索之界面。
ClinProTools
ClinProTools係購自Bruker Daltonics Inc.且主要係處理自MALDI/TOF儀器而得之蛋白質或胜肽之質量光譜的統計分析軟體。ClinProTools結合了多樣的數學運算法，以產生供統計及分類用之圖譜識別模型。
第一圖係經酵素消化之克帕松與共聚物-1兩者的質量光譜比較圖。
第二圖A係從經酵素消化之克帕松與共聚物-1上所記錄到之離子(m/z 452.44)之MS/MS光譜。
第二圖B係m/z 452.44的序列及片段離子。
第三圖A係從經酵素消化之克帕松與共聚物-1上所記錄到之m/z 509.385之MS/MS光譜。
第三圖B係m/z 509.385(1)的序列及片段離子。
第四圖A係從經酵素消化之克帕松與共聚物-1上所記錄到之m/z 603.515之MS/MS光譜。
第四圖B係m/z 603.515的序列及片段離子。
第五圖A係從經酵素消化之克帕松與共聚物-1上所記錄到之m/z 638.590之MS/MS光譜。
第五圖B係m/z 638.590的序列及片段離子。
第六圖A係從經酵素消化之克帕松與共聚物-1上所記錄到之m/z 674.880之MS/MS光譜。
第六圖B係m/z 674.880的序列及片段離子。
第七圖A係從經酵素消化之克帕松與共聚物-1上所記錄到之m/z 710.622之MS/MS光譜。
第七圖B係m/z 710.622的序列及片段離子。
第八圖A係從經酵素消化之克帕松與共聚物-1上所記錄到之m/z 745.568之MS/MS光譜。
第八圖B係m/z 745.568的序列及片段離子。
第九圖係經酵素消化之克帕松、共聚物-1、細胞色素C、溶菌酵素及HSA之質量光譜。
第十圖係依單變量峰排位之前兩個訊號峰之2D分佈，其係基於經酵素消化之克帕松、共聚物-1、細胞色素C、溶菌酵素及HSA之質量光譜的單變量統計分析而得。
第十一圖A係克帕松、共聚物-1、細胞色素C、溶菌酵素及HSA之PCA分析結果的3D圖案。
第十一圖B係克帕松、共聚物-1、細胞色素C、溶菌酵素及HSA之PC1與PC2相比之圖表。
第十二圖係依單變量峰排位之前兩個訊號峰之2D分佈，其係基於經酵素消化之克帕松、共聚物-1及3-NCAs之質量光譜的單變量統計分析而得。
第十三圖係克帕松、共聚物-1及3-NCAs之PC1與PC2相比之圖表。

Claims (10)

  1. 一種以質譜儀分析一多肽混合物之方法，其包含：(a)提供一多肽混合物標準品及一多肽混合物樣品；(b)以一合適之酵素或化學品消化該多肽混合物樣品及該多肽混合物標準品；(c)對經消化之該多肽混合物樣品及該多肽混合物標準品進行質譜分析，以得兩個質量光譜；及(d)藉由統計法比較及分析該兩個質量光譜；其中該多肽混合物係醋酸格拉替雷(Glatiramer acetate)。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該合適之酵素係於溶液中、或係固定於載體上。
  3. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該載體係選自由微米級或奈米級之顆粒、管柱內之塗層及於卡匣(cartridge)中之填料所組成之群。
  4. 如申請專利範圍第2項所述之方法，其中該載體係磁性顆粒或非磁性顆粒。
  5. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該合適之酵素係胰蛋白酵素或任何其他能夠消化該樣品之酵素。
  6. 如申請專利範圍第5項所述之方法，其中該酵素係溶解於溶液中、或係固定於顆粒上、或係固定於管柱之內表面上、或係固定於卡匣中之填料上。
  7. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中使用來分解該樣品之該化學品係有機或無機之酸或鹼。
  8. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該質譜儀係能夠進行MS及MS/MS分析。
  9. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該統計法係主成分分析法(Principal Component Analysis；PCA)。
  10. 如申請專利範圍第1項所述之方法，其中該醋酸格拉替雷係藉由包含以下步驟之方法製備：(a)將酪胺酸、丙胺酸、麩胺酸γ-苄酯(γ-benzyl glutamate)及N-三氟乙醯離胺酸(N-trifluoroacetyl lysine)之N-羧基酸酐(N-carboxyanhydrides)進行聚合作用，以形成一經保護之多肽之混合物；(b)以混於醋酸中之氫溴酸之溶液將經保護之多肽去保護，以形成一三氟乙醯多肽(trifluoroacetyl polypeptides)之混合物；及(c)將該三氟乙醯多肽之混合物與氫氧化四丁基銨(tetrabutylammonium hydroxide)反應，以形成水性之多肽混合物，其中該多肽混合物中的每個多肽基本上係由丙胺酸、麩胺酸、酪胺酸及離胺酸所組成。
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