ES2559106A1 - Método de activación de la expresión del gen Pitx2 para promover la regeneración muscular - Google Patents

Método de activación de la expresión del gen Pitx2 para promover la regeneración muscular Download PDF

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Abstract

La presente invención resuelve el problema de proporcionar nuevas terapias que resulten eficaces en el tratamiento de las distrofias musculares a través de la utilización de composiciones que comprendan un compuesto capaz de: a. aumentar la expresión del gen Pitx2 en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células; y/o b. reducir la expresión del miRNA-106b en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células.

Description

Método de activación de la expresión del gen Pitx2 para promover la regeneración muscular.
Campo técnico de la invención La presente invención se refiere al campo de la biotecnología, en particular a la utilización de la expresión del gen Pitx2 para el tratamiento o la prevención de las distrofias musculares.
Antecedentes de la invención La siguiente discusión de los antecedentes de la invención se proporciona meramente para ayudar al lector a comprender la invención.
El músculo esquelético tiene la capacidad de repararse y regenerarse debido a la presencia de células madre residentes, denominadas células satélite de músculo. En el tejido muscular maduro las células satélite constituyen una población pequeña, dispersa de células mitóticamente y fisiológicamente quiescentes, marcados por su expresión del factor de transcripción Pax7 (Figura 1). Las células madre satélite del músculo adulto son un linaje procedente de las células progenitoras miogénicas embrionarias Pax3/pax7+ que permanecen en el músculo adulto en un estado de quiescencia y después de una lesión se activan, proliferan y entran en el programa de diferenciación miogénica debido a la regulación positiva de los genes de determinación miogénica myf5, MyoD y myogenina formando así nuevos mioblastos que eventualmente se fusionan entre sí para generar nuevo tejido muscular (Figura 1).
Las distrofias musculares son un grupo de afecciones genéticas caracterizadas por trastornos degenerativos del músculo de carácter progresivo. Una de las características más graves en estas patologías consiste en la pérdida gradual de tejido muscular esquelético debido a una degeneración crónica acompañada por una regeneración deficiente. Sus formas más comunes en la infancia son las distrofias musculares de Duchenne (DMD) y Becker (BMD) y se caracterizan por ser trastornos hereditarios recesivos ligados al cromosoma X causados por mutaciones en el gen de la distrofina. La distrofina juega un papel estructural importante en la fibra muscular sirviendo de conexión entre la matriz extracelular y el citoesqueleto. La región N-terminal de esta proteína se une a la proteína del citoesqueleto actina, mientras que el extremo e-terminal es parte del complejo glicoprotéico asociado a la distrofina (DGC) que conecta con la membrana de la fibra muscular (sarcolema). A falta de distrofina, la tensión mecánica conduce a rupturas en el sarcolema
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causando una necrosis muscular progresiva, pérdida de la ambulación independiente al comienzo de la adolescencia, cardiomiopatía, insuficiencia respiratoria, y la muerte prematura en los individuos afectados.
5 En la actualidad no hay curación para las distrofias musculares y las terapias existentes son ineficaces. Aunque, es probable que las terapias génicas puedan proporcionar una cura para estas enfermedades existen importantes obstáculos que limitan su aplicación. Así, se han realizado enfoques potenciales que han ido desde las estrategias de aumento de genes usando vectores virales o plásmidos destinados a la restauración de la expresión de
10 distrofina, hasta la regulación positiva de genes que podrían utilizarse para superar la falta de expresión del gen desertado. Aunque algunos de estos enfoques han demostrado ser parcialmente eficaces, los resultados obtenidos hasta el momento han puesto de manifiesto sus numerosas limitaciones. En particular, la pérdida progresiva de la expresión del gen terapéutico observado después del tratamiento ha indicado claramente que la modificación
15 de la fibra madura por sí sola no es suficiente para mantener los efectos beneficiosos obtenidos por este enfoque terapéutico.
Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar nuevas terapias que resulten eficaces en el tratamiento de las distrofias musculares, especialmente mediante la identificación de nuevas
20 aproximaciones para mejorar la regeneración muscular en estos pacientes.
Breve descripción de la invención
La presente invención resuelve el problema de proporcionar nuevas terapias que resulten
25 eficaces en el tratamiento de las distrofias musculares a través de la utilización de composiciones que comprendan un compuesto capaz de:
a. aumentar la expresión del gen Pitx2 en las células madre satélite de músculo
de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del 30 compuesto en dichas células; yfo
b. reducir la expresión del miRNA-106b en las células madre satélite de músculo
de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células.
35 3
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Origen embrionario de las células satélite de músculo. (Buckingham and Vincent, Current Opinion in Genetics& Development, 2009)
Figura 2. A Y B) Sobreexpresión de Pitx2 en células satélite de ratón mediante transfección con el vector lentiviral bicistrónico LVX-Pitx2c-ZSGreen. C) La expresión de los miRNAs: miR-15b, miR-106b, miR-23b y miR-503 (qRT-PCR) esta disminuida en las células satélite que sobre-expresan Pitx2, tanto en las células en estadios tempranos de activavión (EPq) como en estadios más avanzados de activación (EPa) (qRT-PCR). D) La transfeccción con el vector lentiviral bicistrónico LVX-Pitx2c-ZSGreen conduce a una disminución de la expresión de los genes de control de ciclo celular ciclina D1 y ciclina D2 (q RT-PCR) indicando que, de forma similar a lo que ocurre en mioblastos, la via Pitx2-miRNAs controla proliferación en células satélite. E) Cuantificación por inmunohistoquímica del número de células en proliferación (Ki67+) en cultivos de células satélite sobre-expresando Pitx2.
Figura 3. A) La expresión de Myf5 (qRT-PCR) aumenta en las células satélite que sobreexpresan Pitx2 y B) la cuantificación por inmunohistoquímica muestra un aumento significativo de las células Myf5+. C) La sobreexpresión del miR-106b conduce a una
disminución de la expresión de Myf5 validándolo como target de este miRNA. O: Actividad normalizada de la luciferase de el 3'-UTR Myf5 luciferasa reporter (WT Myf5 3'-UTR), con el plásmido vacío (Vector) o co-transfectando con pre-miR-106b muestra la pérdida de la actividad luciferasa con el miR-106b. No hay pérdida de la actividad luciferasa cuando la miR-1 06b "seed sequence" fue mutada.
Figura 4. A) Análisis mediante qRT-PCR de sobreexpresión de Pitx2c en los músculos de ratones MDX inyectados con células satélite distroficas transfectadas con el vector lentiviral LVX-Pitx2c-ZS-Green vector en comparación con los músculo inyectados con células transfectadas con el lentivirus vacío (LVX-ZS-Green vector); porcentaje de fibras formadas "de novo" (ZS-Green + cells) en los músculos trasplantados después de 15 días e imagen representativa. B) La disminución de la expresión de miR-31 en los músculos trasplantados con células sobreexpresando Pitx2 conduce a un aumento en los niveles de expresión de dislrofina así como a un aumento significativo de las fibras que expresan dislrofina. C) Treadmill test muestra la mejora funcional de ratones DMDmdx injectados con células que sobreexpresan Pitx2. O) Análisis inmunohistoquímico de células en proliferación (Ki67+) después de 15 días del transplante celular. E) Análisis de expresión mediante qRT-PCR de
los miRNAS modulados por Pitx2 en el musculo de los ratones OMOmdx a los que se les realizó el trasplante celular con células que sobreexpresan Pitx2. F) Los niveles de expresión de las ciclinas 01 y 02 así como del factor de transcripción Myf5 estaban aumentados en los músculos trasplantados con células que sobreexpresan Pitx2 indicando
5 que la cascada molecular Pitx2-miRNAS está conservada en el sistema de trasplante "in vivo".
Descripción detallada de la invención
10 Definiciones Tal como se utiliza en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, el término "gen Pitx2" es un miembro de la familia de factores de transcripción bicoid homeodominio que juega un papel relevante en la mortogénesis (Referencia secuencia polinucieotidica del Genbank con número de acceso NM 000325 identificativa de Homo sapiens paired-like
15 homeodomain 2 (PITX2))
El término "aumento" o "aumentar" se refiere a aumentos por encima del nivel basal. Por ejemplo, los niveles basales son normales en los niveles in vivo antes de, o en ausencia de, la adición de un compuesto activador.
El término "reducción" o "reducir" o "inhibir" o "inhibición~ se refiere a reducciones por debajo del nivel basal. Por ejemplo, los niveles basales son normales en los niveles in vivo antes de, o en ausencia de, la adición de un compuesto inhibidor.
25 En esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a un número de términos que se definirán para tener los siguientes significados:
"Opcional" u "opcionalmente" significa que el suceso o circunstancia descrito posteriormente puede o no ocurrir, y que la descripción incluye casos en los que dicho evento o 30 circunstancia ocurre y casos en los que no.
Como se usa aquí, los términos "prevenir", "previniendo" y "prevención" se refieren a los métodos para evitar o impedir el desarrollo de una enfermedad o trastorno o retardar la recurrencia o la aparición de uno o más síntomas de un trastorno en un sujeto resultante de
35 la administración de un agente profiláctico.
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El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" pretende incluir la formulación utilizada
para estabilizar, solubilizar y ser mezclado de alguna manera con ingredientes activos que se administran a los animales vivos, incluyendo los seres humanos. Esto incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y retardantes de la absorción, y similares, compatibles con la administración farmacéutica. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea incompatible con el compuesto activo, tal uso en las composiciones está contemplado.
El término "enfermedad", como se usa aquí, pretende ser sinónimo generalmente, y se usa de manera intercambiable con los términos "trastorno" y "condición" (como en la condición médica), en que todos reflejan una condición anormal del cuerpo o de una de sus las partes que perjudica el funcionamiento normal y se manifiesta típicamente por signos distintivos y síntomas.
El término "terapia de combinación" significa la administración de dos o más agentes terapéuticos para tratar una afección o trastorno terapéutico descrito en la presente descripción. Dicha administración abarca la ca-administración de estos agentes terapéuticos
de una manera sustancialmente simultánea, tal como en una sola cápsula que tiene una relación fija de ingredientes activos o en múltiples cápsulas separadas para cada ingrediente activo. Además, tal administración también abarca el uso de cada tipo de agente terapéutico de una manera secuencial. En cualquier caso, el régimen de tratamiento proporcionará efectos beneficiosos de la combinación de compuestos en el tratamiento de las afecciones o trastornos descritos en la presente.
La frase "terapéuticamente eficaz" pretende calificar la cantidad de ingredientes activos utilizados en el tratamiento de una enfermedad o trastorno. Esta cantidad será la necesaria para lograr el objetivo de reducir o eliminar dicha enfermedad o trastorno.
El término "sujeto" se refiere a todos los mamíferos, incluyendo los seres humanos. Los ejemplos de sujetos incluyen, pero no se limitan a, seres humanos, vacas, perros, gatos, cabras, ovejas, cerdos, y conejos.
A lo largo de esta solicitud, se hace referencia a diversas publicaciones. Las descripciones de estas publicaciones en su totalidad se incorporan por referencia en esta solicitud a fin de describir más completamente el estado de la técnica a la que ésta pertenece. Las
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referencias descritas son también individualmente y específicamente incorporadas aquí como referencia por el material contenido en ellas que es discutido en la frase sobre la que se basa dicha referencia.
Descripción de la invención La presente invención aborda el problema de proporcionar nuevas terapias que resulten eficaces en el tratamiento de las distrofias musculares, aumentando la capacidad de regenerar el tejido perdido, como resultado de la distrofia muscular, de las células madre de músculo esquelético.
Con este propósito los autores de la presente invención han evaluado la contribución del gen Pitx2 en la regulación de la transcripción, específica de tejido, de distintos microRNAs durante la miogénesis. Los análisis de perfiles de expresión génica (microRNA-microarrays) en una línea celular de mioblastos (línea celular So18) ha llevado a identificar a los autores de la presente invención una serie de microRNAs (miRNAs) que son regulados diferencialmente en mioblastos Sol8 que sobreexpresan Pitx2 (ver figura 2). Los análisis de los efectos de dichos microRNAs en la proliferación de mioblastos y la identificación de sus supuestas dianas demuestran que Pitx2 regula un subconjunto de microRNAs que presenta un profundo efecto en la progresión del ciclo celular de mioblastos (miR15b, miR-23b, miR106b Y miR-503). Adicionalmente, los autores de la invención encontraron que esta vía Pitx2-miRNAs también regula la proliferación celular en células satélite aisladas del músculo esquelético de ratón (Figura 1). Estos resultados indican que Pitx2 actúa amplificando la población de mioblastos derivados de células satélite durante los procesos de diferenciación de la miogénesis regenerativa (Figura 3).
Adicionalmente, estos resultados demuestran que reducir la expresión de miRNA-106b en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células, amplifica la población de mioblastos derivados de células satélite durante los procesos de diferenciación de la miogénesis regenerativa (ver figuras 3 y 4).
Por consiguiente, un primer aspecto de la presente invención se refiere al uso de una composición (de aquí en adelante "composición de la presente invención") que comprende un compuesto capaz de
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aumentar la expresión del gen Pitx2, compuesto activador, en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células; y/o
reducir la expresión del miRNA-106b, compuesto inhibidor, en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células;
para la elaboración de un medicamento para promover la regeneración muscular.
Alternativamente, el primer aspecto de la invención se refiere a una composición que comprende un compuesto capaz de
aumentar la expresión del gen Pitx2, compuesto activador, en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células; y/o reducir la expresión del miRNA-106b, compuesto inhibidor, en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células;
para su uso en promover la regeneración muscular.
Por "aumenta la expresión del gen Pitx2" se entiende el aumento sobre la línea de base, o en comparación con a control, por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 16, 17> 18,
19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30, 31,32,33,34, 35, 36, 37, 38, 39,40 , 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49,50, 51 , 52, 53, 54,55, 56,57, 58, 59,60, 61 , 62, 63, 64,65 , 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90 , 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100%, o 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13,14,15,20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, o más veces.
Los compuestos activadores se pueden identificar mediante un método de cribado que permita identificar en un compuesto la capacidad de activar Pitx2, que comprende poner en contacto una célula, preferiblemente una célula madre satélite de músculo, con un compuesto que se sospecha que pueda activar Pitx2; ensayando el contenido de las células para determinar la cantidad yfo actividad biológica de Pitx2, y comparar la cantidad determinada yfo la actividad biológica de Pitx2a un nivel predeterminado, en el que un cambio de dicho importe yfo la actividad biológica de Pitx2 es indicativa de un compuesto
que activa Pitx2. En una realización preferida, la detección se realiza por RT-PCR
cuantitativa en tiempo real, usando cebadores específicos para cada isoforma.
En el contexto de la presente invención por células madre satélite de músculo se entiende
5
células madre, o pre-células musculares, que sirven para ayudar a la regeneración del
músculo esquelético adulto. A raíz de la proliferación (cuando las célula satélite se activan ) y
la diferenciación posterior (cuando comienzan a expresar factores de transcripción que las
comprometen hacia un linaje miogénico (mioblastos)), las células satélite se fusionan entre
sí o con las adyacentes fibras musculares dañadas, lo que aumenta el número de
1O
mionucleos en las fibras para el crecimiento y la reparación. La activación y proliferación de
células satélite es necesario a fin de satisfacer las necesidades de formación de nuevas
fibras musculares para regenerar el musculo. La diferenciación es necesaria para que las
células satélite puedan convertirse primero en mioblastos y tras el proceso de fusión, en
fibras.
15
Una realización preferida del primer aspecto de la invención, se refiere al uso de la
composición de la invención, donde dicho medicamento se usa para promover la
regeneración muscular en el tratamiento de una distrofinopatia o distrofia. Preferiblemente,
donde dicha distrofinopatia o distrofia se selecciona de la lista que consiste en la distrofia
20
muscular de Duchenne y la distrofia muscular de Becker.
Otra realización preferida del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus
realizaciones preferidas, se refiere al uso de la composición de la invención, donde dicho
compuesto, compuesto activador, es un polinucleótido de ADN (de aquí en adelante
25
polinucleótido de la invención) que comprende una secuencia seleccionada de la lista que
consiste en :
la secuencia polinucleotídica del Genbank con número de acceso NM_000325 o su
secuencia complementaria;
30
una secuencia que hibrida selectivamente con la secuencia de (a); y
una secuencia polinucleotídica de ADN que codifica para una secuencia
aminoacídica idéntica en al menos el 90%, 92%, 94%, 96%, 98% o 99% basándose
en la identidad de la totalidad de los aminoacidos de dicha secuencia, a la secuencia
aminoacídica del Genbank con número de acceso NP_000316.
35
En el contexto de la presente invención , la secuencia polinucleotídica del Genbank con
número de acceso NM_000325 (SEQ ID NO 1) se identifica como Homo sapiens paired-like
homeodomain 2 (PITX2), transcript variant 3, mRNA. Dicha secuencia nucleotídica se expone a continuación:
5 GTTAGGCCAACAGGGAAGCGCGGAGCCGCAGATCTGGTCCGTCGCTCGCCTGGGTGC CTGGAGCTGAGCTGCGGCAAGGCCCGGCTCCTGTTCGACCGCCCGAGGGGTGTGCGT GTGCGCGTTGCGGAGGGTGCGCTCAGAGGGCCGCGTCGTGGCTGCAGCGGCTGCTG CCGCCGCAGGGGATCTAATATCACCTACCTGTCCCTGTCACTCTTGACACTTCTCTGTC
10 AGGGCTGCCGCGTGGGGGGGGGGCGGGCAGAGCGCGGTCGGCGTTAGCTTTCCTTAT TGGAGGGGTTCTTGGGGGAGGGAGGGAGAGAAGAAGGGGGTCTTTGCCCACTCTTGT TTCGCTTTGGAGCTTGGAAGCCTGCTCCCTAAAGACGCTCTGAGTGGTGCCCTTCTGCC CACATCCCATGTCTTCGTTTGCCCGCTGACTTTCCGTCTCCGGACI 1 1 IICGCTTGAGC CTTCCGGAGGAGACGGGGGCAGCTTGGCTTGAGAACTCGGCGGGGGTTGCGTCCCCT
15 GGCTCTCCCCGCAGCGGGGAAACTCCGCGCCTAGAGCGCGACCCGGAGCGGGCAGC GGCGGCTACGGGGGCTCGGCGGGGCAGTAGCCAAGGACTAGTAGAGCGTCGCGCTC CCTCGTCCATGAACTGCATGAAAGGCCCGCTTCACTTGGAGCACCGAGCAGCGGGGAC CAAGCTGTCGGCCGTCTCCTCATCTTCCTGTCACCATCCCCAGCCGTTAGCCATGGCTT CGGTTCTGGCTCCCGGTCAGCCCCGGTCGCTGGACTCCTCCAAGCACAGGCTGGAGG
20 TGCACACCATCTCCGACACCTCCAGCCCGGAGGCCGCAGAGAAAGATAAAAGCCAGCA GGGGAAGAATGAGGACGTGGGCGCCGAGGACCCGTCTAAGAAGAAGCGGCAAAGGCG GCAGCGGACTCACTTTACCAGCCAGCAGCTCCAGGAGCTGGAGGCCACTTTCCAGAGG AACCGCTACCCGGACATGTCCACACGCGAAGAAATCGCTGTGTGGACCAACCTTACGG AAGCCCGAGTCCGGGTTTGGTTCAAGAATCGTCGGGCCAAATGGAGAAAGAGGGAGCG
25 CAACCAGCAGGCCGAGCTATGCAAGAATGGCTTCGGGCCGCAGTTCAATGGGCTCATG CAGCCCTACGACGACATGTACCCAGGCTATTCCTACAACAACTGGGCCGCCAAGGGCC TTACATCCGCCTCCCTATCCACCAAGAGCTTCCCCTTCTTCAACTCTATGAACGTCAACC CCCTGTCATCACAGAGCATGTTTTCCCCACCCAACTCTATCTCGTCCATGAGCATGTCG TCCAGCATGGTGCCCTCAGCAGTGACAGGCGTCCCGGGCTCCAGTCTCAACAGCCTGA
30 ATAACTTGAACAACCTGAGTAGCCCGTCGCTGAATTCCGCGGTGCCGACGCCTGCCTG TCCTTACGCGCCGCCGACTCCTCCGTATGTTTATAGGGACACGTGTAACTCGAGCCTGG CCAGCCTGAGACTGAAAGCAAAGCAGCACTCCAGCTTCGGCTACGCCAGCGTGCAGAA CCCGGCCTCCAACCTGAGTGCTTGCCAGTATGCAGTGGACCGGCCCGTGTGAGCCGC ACCCACAGCGCCGGGATCCTAGGACCTTGCCGGATGGGGCAACTCCGCCCTTGAAAGA
35 CTGGGAATTATGCTAGAAGGTCGTGGGCACTAAAGAAAGGGAGAGAAAGAGAAGCTAT ATAGAGAAAAGGAAACCACTGAATCAAAGAGAGAGCTCCTTTGATTTCAAAGGGATGTC 10
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CTCAGTGTCTGACATCTTTCACTACAAGTATTTCTAACAGTTGCAAGGACACATACACAA ACAAATGTTTGACTGGATATGACATTTTAACATTACTATAAGCTTGTTAIIIIIIAAGTTTA GCATTGTTAACATTTAAATGACTGAAAGGATGTATATATATCGAAATGTCAAATTAATTTT ATAAAAGCAGTTGTTAGTAATATCACAACAGTGIIIIIAAAGGTTAGGCTTTAAAATAAAG
5 CATGTTATACAGAAGCGATTAGGAIIIIICGCTTGCGAGCAAGGGAGTGTATATACTAAA TGCCACACTGTATGTTTCTAACATATTATTATTATTATAAAAAATGTGTGAATATCAGTTTT AGAATAGTTTCTCTGGTGGATGCAATGATGTTTCTGAAACTGCTATGTACAACCTACCCT GTGTATAACATTTCGTACAATATTATTGTTTTACTTTTCAGCAAATATGAAACAAATGTGTT
TTATTTCATGGGAGTAAAATATACTGCATACAAAAAAAAAAAAVVVVVVVV~AA
10 En el contexto de la presente invención, la secuencia aminoacídica con número de acceso NP _000316 (SEa ID NO 2) se identifica como. pituitary homeobox 2 isoform c [Hamo sapiens]. Dicha secuencia aminoacídica se expone a continuación:
15 MNCMKGPLHLEHRAAGTKLSAVSSSSCHHPQPLAMASVLAPGQPRSLDSSKHRLEVHTIS DTSSPEAAEKDKSQQGKNEDVGAEDPSKKKRQRRQRTHFTSQQLQELEATFQRNRYPDM STREEIAVWTNLTEARVRVWFKNRRAKWRKRERNQQAELCKNGFGPQFNGLMQPYDDMY PGYSYNNWAAKGLTSASLSTKSFPFFNSMNVNPLSSQSMFSPPNSISSMSMSSSMVPSAV TGVPGSSLNSLNNLNNLSSPSLNSAVPTPACPYAPPTPPYVYRDTCNSSLASLRLKAKQHS
20 SFGYASVQNPASNLSACQYAVDRPV
En el contexto de la presente invención, el grado de identidad de una secuencia aminoacídica se basa en la identidad de la totalidad de los aminoacidos de dicha secuencia .
25 En esta realización de la invención, dentro de los polinucleótidos de la invención se pueden incluir en ella nucleótidos sintéticos o modificados. Un número de tipos diferentes de modificación de polinucleótidos son conocidos en la técnica. Estos incluyen metilfostato y cadenas principales de fosforotioato, adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y 5 'de la molécula. Para los fines de la presente invención, se debe entender
30 que los polinucleótidos descritos en este documento pueden ser modificados por cualquier método disponible en la técnica.
los polinucleótidos de acuerdo con la invención se puede producir recombinantemente, sintéticamente o mediante cualquier medio disponible para los expertos en la técnica.
35 También pueden ser clonados por técnicas estándar. los polinucleótidos se proporcionan típicamente en forma aislada y/o purificada.
"
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Otra realización preferida del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, se refiere al uso de la composición de la invención, donde el compuesto es un polinucleótido de ADN que comprende una secuencia seleccionada de la lista que consiste en la secuencia polinucleotídica con número de acceso NM_000325 (SEO ID NO 1) o su secuencia complementaria o una secuencia polinucleotídica que codifica para una secuencia aminoacídica idéntica en al menos el 99%, basándose en la identidad de la totalidad de los aminoacidos de dicha secuencia, a la secuencia aminoacídica con número de acceso NP 000316.
En un aspecto preferido de la invención adicional, los polinucleótidos de la invención, tales como los expuestos anteriormente, pueden ser transportados, sin degradación, por vectores plasm ídicos o virales que incluyen un promotor de expresión del ácido nucleico en las células en las que es suministrado.
Así, en una realización adicional de la invención, los compuestos activadores de la invención pueden comprender cualquiera de los polinucleótidos de la invención descritos anteriormente o un plásmido o un vector capaz de transportar o suministrar dichos polinucleótidos, preferiblemente mediante un vector viral.
Los vectores virales son, por ejemplo, adenovirus, virus adenoasociados, virus herpes, virus vaccinia, virus de la polio, virus del SIDA, virus trófico neuronal, Sindbis y otros virus de ARN , incluyendo entre éstos, virus con la estructura del VIH. También se prefieren las familias virales que comparten las propiedades de estos virus que los hacen adecuados para su uso como vectores. Los retrovirus son virus de la leucemia murina de Maloney, MMLV, y retrovirus que expresan las propiedades deseables de MMLV como un vector. Los vectores retrovirales son capaces de llevar una carga útil genética más grande, es decir, un gen ° transgén marcador, que otros vectores virales, y por esta razón son un vector comúnmente usado. Sin embargo, no son tan útiles en células no proliferativas. Los vectores de adenovirus son relativamente estables y fáciles de trabajar, tienen títulos elevados, y se puede enviar en la formulación de aerosol, y pueden transfectar células que no se dividen. Los vectores virales de la viruela son grandes y tienen varios sitios para la inserción de genes, que son termoestables y pueden almacenarse a temperatura ambiente. Una realización preferida es un vector viral que ha sido diseñado con el fin de suprimir la respuesta inmunitaria del organismo huésped, provocados por los antígenos virales.
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Los compuestos activadores pueden comprender, además de los polinucleótidos descritos de la invención, plásmidos o vectores o los péptidos de la invención, por ejemplo, lípidos tales como los liposomas, tales como liposomas catiónicos (por ejemplo, DOTMA, DOPE,
OC-colesterol) o liposomas aniónicos.
Los liposomas pueden comprender además proteínas para facilitar la dirección a célula en particular, si se desea. La administración de una composición que comprende un compuesto y un liposoma catiónico que se puede administrar a la sangre aferente a un órgano diana. Además, el activador se puede administrar como un componente de una microcápsula que pueden ser dirigidos a tipos de células específicas, tales como cardiomiocitos, o donde la difusión del compuesto o la administración del compuesto de la microcápsula está diseñado para un tipo específico o una dosis.
Por lo tanto, otra realización preferida del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, se refiere al uso de la composición de la invención, en el que dicho compuesto es un vector o plásmido capaz de transportar o suministrar la secuencia de polinucleótidos, tal y como se define ésta en el contexto de la presente invención, a las células madre satélite de músculo. Preferiblemente dicho vector es un vector viral que codifica para la secuencia de polinucleótidos tal y como ésta queda definida arriba. Más preferiblemente dicho vector viral seleccionado de la lista que consiste en vectores adenovirales, lentivirales, retrovirales y adenoasociados.
Otra realización preferida del primer aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, se refiere al uso de la composición de la invención, en el que dicho medicamento comprende células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal tratadas, transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto definido en el primer aspecto de la invención o en cualquiera de sus realizaciones preferidas. Preferiblemente, dichas células tratadas, transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto, son células de origen autólogo. Más preferiblemente, dichas células transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto, son células madre satélite de músculo de un sujeto humano que padece una distrofinopatia o una distrofia.
Por otro lado y tal y como se ha comentado con anterioridad, las figuras 3 y 4 de la presente invención demuestran que reducir la expresión miRNA-106b en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del
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compuesto en dichas células amplifica la población de mioblastos derivados de células satélite durante los procesos de diferenciación de la miogénesis regenerativa.
Por consiguiente, un segundo aspecto de la presente invención se refiere a una composición que comprende un compuesto, compuesto inhibidor, capaz de reducir la expresión del miRNA-106b en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células, para la elaboración de un medicamento para promover la regeneración muscular.
En el contexto de la presente invención, por "inhibir o reducir la expresión del miRNA-106b" se entiende la reducción sobre la línea de base, o en comparación con a control, por 1, 2, 3,
4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13, 14,15,16,17,18,19,20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31,32,33,34, 35,36,37, 38, 39, 40 ,41, 42,43, 44,45,46,47,48, 49, 50, 51,52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64, 65 , 66, 67, 68, 69, 70, 71 , 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81 , 82,83, 84, 85,86,87,88, 89, 90 , 91 , 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, o 100%, 02,3,4, 5,6,7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 20,25,30, 35, 40, 45,50, o más veces.
Los compuestos inhibidores se pueden identificar mediante un método de cribado que permita identificar en un compuesto la capacidad de inhibir o reducir la expresión intracelular del miRNA-106b, que comprende poner en contacto una célula, preferiblemente una célula madre satélite de músculo, con un compuesto que se sospecha que pueda inhibir o reducir la expresión del miRNA-106b; ensayando el contenido de las células para determinar la cantidad y/o actividad biológica de la expresión del miRNA-106b, y comparar la cantidad determinada y/o la actividad biológica del miRNA-106b a un nivel predeterminado, en el que un cambio de dicho importe y/o la actividad biológica de la expresión de miRNA-106b es indicativa de un compuesto con la capacidad de inhibir o reducir la expresión intracelular del miRNA-106b. En una realización preferida, la detección se realiza por RT-PCR cuantitativa en tiempo real.
En una realización preferida del segundo aspecto de la invención, dicho medicamento se usa para promover la regeneración muscular en el tratamiento de una distrofinopatia.
En otra realización preferida del segundo aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, dicha distrofia o distronifopatia se selecciona de la lista que consiste en la distrofia muscular de Duchenne y la distrofia muscular de Becker.
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En aún otra realización preferida del segundo aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, dicho compuesto es un ARN de interferencia (ARNip) del miRNA-106b tal y como un oligonucleótido antisentido de RNA del miRNA-106b o un polinucleotido que exprese dicho oligonucleótido antisentido. Preferiblemente, dicho 5 compuesto es un oligonucleótido sintético antisentido de RNA del miRNA-106b que opcionalmente presenta modificaciones para incrementar su resistencia a las nucleasas. Más preferiblemente, dicho compuesto es un vector o plásmido capaz de transportar o suministrar dicho ARN de interferencia (ARNip) del miRNA-106b a las células madre satélite de músculo. Preferiblemente dicho vector es un vector viral y más preferiblemente se
10 selecciona de cualquiera de los mencionados en el primer aspecto de la presente invención.
En otra realización preferida del segundo aspecto de la invención o de cualquiera de sus realizaciones preferidas, dicho medicamento comprende células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal tratadas, transformadas, transfectadas o transducidas con el 15 compuesto tal y como se ha definido éste en el segundo aspecto de la invención o en cualquiera de sus realizaciones preferidas. Preferiblemente, dichas células tratadas, transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto, son células de origen autólogo. Más preferiblemente, dichas células transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto, son células madre satélite de músculo de un sujeto humano que padece
20 una distrofinopatia (una distrofia).
Por último, un tercer aspecto de la invención se refiere a un método de cribado de un compuesto capaz de promover la regeneración muscular que comprende:
25 1. Seleccionar compuestos a partir de una librería de compuestos;
2. Testar si alguno de dichos compuestos es capaz de:
a. aumentar la expresión del gen Pitx2 en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células; y/o
30 b. reducir la expresión del miRNA-106b en las células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal con respecto a la observada en ausencia del compuesto en dichas células; y
3. Seleccionar aquel o aquellos compuestos capaces de llevar a cabo el mencionado en cualquiera de los apartados anteriores.
En el contexto de la presente invención, los polinucleótidos de ADN de la invención, tales como los descritos anteriormente, que se suministran a las células, se pueden integrar en el gen ama de la célula huésped, normalmente a través de secuencias de integración. Estas secuencias están a menudo relacionadas con las secuencias virales, particularmente en sistemas basados en virus cuando se utilizan. Estos sistemas de integración virales también pueden ser incorporados en los ácidos nucleicos que se van a entregar usando un sistema de adición de ácido no nucleico basada de entrega, tal como un liposoma, de modo que el ácido nucleico contenido en el sistema de suministro puede integrarse en el genoma del hospedador.
Otras técnicas generales para la integración en el genoma del huésped incluyen, por ejemplo, sistemas diseñados para promover la recombinación homóloga con el genoma del huésped. Estos sistemas se basan típicamente en la secuencia de flanqueo del ácido nucleico a expresar que tiene una homología suficiente con una secuencia diana en el genoma de la célula huésped donde la recombinación entre el vector de ácido nucleico y el ácido nucleico diana tiene lugar, haciendo que el ácido nucleico suministrado sea integrado en el genoma del huésped. Estos sistemas y los métodos necesarios para promover la recombinación homóloga son conocidos por los expertos en la técnica .
Los compuestos activadores o inhibidores descritos en la presente memoria se pueden administrar en un vehículo farmacéuticamente aceptable y se puede enviar a las células del sujeto in vivo y I o ex vivo mediante una variedad de mecanismos bien conocidos en la técnica como se ha comentado anteriormente.
Si los métodos ex vivo se emplean, las células o los tejidos pueden eliminarse y mantenerse fuera del cuerpo según protocolos estándar bien conocidos en la técnica. Los compuestos activadores o inhibidores se pueden introducir en las células a través de cualquier mecanismo de transferencia de genes, tales como, por ejemplo, suministro de genes mediado por fosfato de calcio, electroporación, microinyección o proteoliposomas. Las células transducidas pueden entonces infundirse (por ejemplo, en un vehículo farmacéuticamente aceptable) o ser homotópicamente trasplantadas en el sujeto por métodos estándar para el tipo de célula o tejido. Los métodos estándar son conocidos para el transplante o infusión de varias células en un sujeto.
Los compuestos activadores o inhibidores de la presente invención se pueden utilizar en conjunto con otros métodos de tratamiento. 16
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Además, proporcionado en la presente memoria, se incluye un método para aumentar o mejorar el estado clínico y la percepción de bienestar de un sujeto con distrofia o con una distrofinopatia, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad eficaz de un compuesto activador inhibidor, lo que aumenta o mejora el estado clínico del sujeto tratado por un cierto período de tiempo.
Los métodos actuales de tratamiento incluyen también un método para aumentar la eficacia de otros agentes propuestos para la misma enfermedad, que comprende administrar a un sujeto en necesidad del mismo una cantidad eficaz de un compuesto activador o inhibidor, y, opcionalmente, un vehículo farmacéuticamente aceptable, aumentando así la eficacia del otro agente o agentes.
En cualquier caso, las composiciones que comprenden el compuesto activador o inhibidor se pueden administrar in vivo en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Por "farmacéuticamente aceptable" se entiende un material que no es biológicamente o de otro modo indeseable, es decir, el material puede administrarse a un sujeto, junto con el ácido nucleico o vector, sin causar ningún efecto biológico indeseable o interactuar de una manera perjudicial con cualquiera de los otros componentes de la composición farmacéutica en la que está contenido. El vehículo, naturalmente, se selecciona para minimizar cualquier degradación del ingrediente activo y para minimizar cualquier efecto secundario adverso en el sujeto, como es bien conocido para un experto en la técnica.
Las dosificaciones efectivas y los calendarios de administración de las composiciones que comprenden el compuesto activador o inhibidor descritos en este documento pueden ser determinadas empíricamente, y hacer tales determinaciones está dentro de la experiencia en la técnica. Los intervalos de dosificación para la administración de las composiciones son aquellos lo suficientemente grandes para producir el deseado efecto anti-hipertrófico en el trastorno. La dosificación no debe ser tan grande como para causar efectos secundarios adversos, tales como reacciones cruzadas no deseadas, reacciones anafilácticas, y similares. Generalmente, la dosificación variará con la edad, condición, sexo y extensión de la enfermedad en el paciente, la vía de administración, o si otros fármacos se incluyen en el régimen, y puede ser determinada por un experto en la técnica. La dosificación puede ser ajustada por el médico individual en caso de cualquier contraindicación. La dosis puede variar, y puede ser administrada en una o más administraciones de dosis diarias, durante
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uno o varios días. Se pueden encontrar orientaciones en la bibliografía para las dosificaciones apropiadas para las clases dadas de productos farmacéuticos.
El siguiente ejemplo sirve meramente para ilustrar la presente invención.
Ejemplos
Ejemplo 1. Pitx2 y regeneración muscular
10 En base a los resultados mostrados en las figuras, y teniendo en cuenta que, interesantemente, la expresión de Pitx2 está significativamente aumentada durante la regeneración muscular en ratón y disminuida en el modelo murino de Distrofia muscular de Duchenne (ratones DMDmdx), llevamos a cabo un aproximación experimental de trasplante de células "in vivo" para testar si Pitx2 podía mejorar la capacidad regenerativa de las
15 células satélite aisladas de músculos distróficos. Es importante señalar que la posibilidad de modificar la capacidad regenerativa de las propias células distróficas supone una ventaja significativa para su aplicación terapéutica en humanos (posibilidad de utilizar las células del paciente distrófico). Los resultados obtenidos permiten poner de manifiesto que la sobreexpresión Pitx2 mejora la regeneración muscular llevada a cabo por las células satélite
20 distróficas aumentando la regeneración muscular en ratones MDX. Así, nuestros resultados demuestran que el trasplante de células satélite distróficas sobreexpresando Pitx2 en ratones DMDmdx conduce a:
Un aumento en el número de miofibras formadas "de novo" (Figura 4A);
25 Reprime la expresión de miR-31 produciendo una restauración de la distrofina (Figura 48) Produciendo finalmente una mejora funcional del músculo muy significativa (Figura 4C).
30 Por lo tanto, estos análisis nos llevan a identificar a miR-31 como un miRNA regulado por Pitx2 durante la regeneración muscular Además, también hemos obtenido evidencias adicionales que muestra que la vía de Pitx2-miRNAs controlando la proliferación celular está también presente en nuestro modelo de trasplante celular "in vivo" en ratones DMDmdx (Figuras 4D-F). En conjunto, estos resultados colocan a Pitx2 como molécula reguladora de
35 diferentes miRNAs que desempeñan un papel fundamental en los circuitos moleculares que controlan la proliferación y/o diferenciación de las células satélite. Revelando el importante 18
papel de Pitx2 en la biología celular de las células satélite del músculo esquelético e identificando funciones desconocidas de Pitx2 modulando la miogénesis regenerativa en el musculo distrófico.
Ejemplo 2. Exposición detallada de los resultados de la invención.
En primer lugar, tal y como se muestra en la figura 2, apartados A) y B), la transfección con el vector lentiviral bicistrónico LVX-Pitx2c-ZSGreen resultó en la sobreexpresión de Pitx2 en células satélite de ratón. Adicionalmente, esta sobreexpresión, ver figura 2 apartado C), resultó en una expresión disminuida de los miRNAs: miR-15b, miR-106b, miR-23b y miR503 (qRT-PCR), tanto en las células en estadios tempranos de activavión (EPq) como en estadios más avanzados de activación (EPa) (qRT-PCR).
Por otro lado, tal y como se muestra en la figura 2 O), la transfección con el vector lentiviral bicistrónico LVX-Pitx2c-ZSGreen conduce a una aumento de la expresión de los genes de control de ciclo celular ciclina 01 y ciclina 02 (qRT-PCR) indicando que, de forma similar a lo que ocurre en mioblastos, la via Pitx2-miRNAs controla proliferación en células satélite.
En segundo lugar, tal y como se ilustra en la figura 3 A), la expresión de Myf5 (qRT-PCR) aumenta en las células satélite que sobreexpresan Pitx2, es más, la cuantificación por inmunohistoquímica, ver figura 3 apartado B), muestra un aumento significativo de las células Myf5+. Por otro lado, de acuerdo a la figura 3 apartado C), la sobreexpresión del miR-106b conduce a una disminución de la expresión de Myf5 validándolo como target de este miRNA. Más aún, se hicieron varios experimentos para calcular la actividad normalizada de la lucilerasa del 3'-UTR Myf5 lucilerasa reporter (WT Myf5 3'-UTR) transfectando con el plásmido vacío (Vector) o co-transfectando con pre-miR-106b. Tal y como se muestra en la figura 3 apartado O, únicamente co-transfectando con WT pre-miR106b se produce una represión de la expresión de Myf5 por miR-106b demostrando, por tanto, que Myf5 es un target directo para el miR-106b .. De hecho, no hay pérdida de la actividad luciferasa cuando la miR-106b "seed sequence" fue mutada, demostrando así la especifidad de unión del miR-106b a estas "seed sequence" del 3'UTR de Myf5 (ver figura 3 apartado D))
En tercer lugar, tal y como se muestra en la figura 4 apartado A), el análisis mediante qRT-PCR muestra la sobreexpresión de Pitx2c en los músculos de ratones MDX inyectados con células satélite distroficas transfectadas con el vector lentiviral LVX-Pitx2c-ZS-Green vector
en comparación con los músculo inyectados con células transfectadas con ellentivirus vacío (LVX-ZS-Green vector); porcentaje de fibras fonnadas "de novo" (ZS-Green + celis) en los músculos trasplantados después de 15 días e imagen representativa. Por otro lado, la figura 4 apartado B), muestra como la disminución de la expresión de miR-31 en los músculos 5 trasplantados con células que sobre-expresan Pitx2 conduce a un aumento en los niveles de expresión de distrofina así como a un aumento significativo de las fibras que expresan distrofina. Adicionalmente, los autores de la presente invención llevaron a cabo un Treadmill test, ver figura 4 apartado C), donde se muestra la mejora funcional de ratones DMDmdx injectados con células que sobreexpresan Pitx2. Por último, la figura 4 apartado F, muestra
10 como los niveles de expresión de las ciclinas D1 y 02 así como del factor de transcripción Myf5 estaban aumentados en los músculos trasplantados con células que sobreexpresan Pitx2 indicando que la cascada molecular Pitx2-miRNAS está conservada en el sistema de trasplante uin vivo".
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Claims (7)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Uso de una composición que comprende un compuesto polinucleotídico de AON que a su vez comprende una secuencia que consiste en la secuencia polinucleotídica
    5 SEO ID NO 1 o su secuencia complementaria, para la elaboración de un medicamento para promover la regeneración muscular.
  2. 2.
    El uso de la composición de la reivindicación 1, donde dicho medicamento se usa para promover la regeneración muscular en el tratamiento de una distrofinopatia .
  3. 3.
    El uso según la reivindicación 2, donde dicha distrofinopatia se selecciona de la lista que consiste en la distrofia muscular de Ouchenne y la distrofia muscular de Becker.
  4. 4.
    El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho compuesto es
    15 un vector o plásmido capaz de transportar o suministrar dicha secuencia de polinucleótidos a las células madre satélite de músculo ex vivo.
  5. 5. El uso según la reivindicación 4, en el que dicho vector es un vector viral que codifica para la secuencia de polinucleótidos definida en la reivindicación 1 .
  6. 6. El uso según la reivindicación 5, en el que dicho vector es un vector viral seleccionado de la lista que consiste en vectores adenovirales, lentivirales, retrovirales yadenoasociados.
    25 7. El uso según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde dicho medicamento comprende células madre satélite de músculo de un sujeto humano o animal tratadas, transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto definido en la reivindicación 1.
    30 8. El uso según la reivindicación 7, donde dichas células tratadas, transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto definido en la reivindicación 1, son células de origen autólogo.
  7. 9. El uso según la reivindicación 7 o 8, donde dichas células transformadas, transfectadas o transducidas con el compuesto definido en la reivindicación 1, son células madre satélite de músculo de un sujeto humano que padece una distrofinopatia.
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