ES2558440T3 - Biomarcador para el diagnóstico, predicción y/o pronóstico de insuficiencia cardiaca aguda y usos del mismo - Google Patents

Biomarcador para el diagnóstico, predicción y/o pronóstico de insuficiencia cardiaca aguda y usos del mismo Download PDF

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Abstract

Uso de MCAM como un biomarcador para diagnosticar, predecir y/o pronosticar la insuficiencia cardiaca agua (ICA) en un sujeto.

Description

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DESCRIPCION
Biomarcador para el diagnostico, prediccion y/o pronostico de insuficiencia cardiaca aguda y usos del mismo Campo de la invencion
La invencion se refiere a biomarcadores basados en protemas y/o peptidos y a agentes que se unen espedficamente a los mismos, para usar en la prediccion, diagnostico, pronostico y/o seguimiento de enfermedades o afecciones en sujetos. Mas en particular, la solicitud describe determinadas protemas y/o peptidos como nuevos biomarcadores para la insuficiencia cardiaca aguda; metodos para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la insuficiencia cardiaca aguda basados en la medicion de dichas protemas y/o peptidos biomarcadores; y kits y dispositivos para medir dichas protemas y/o peptidos y/o para llevar a cabo dichos metodos.
Antecedentes de la invencion
En muchas enfermedades y afecciones, un resultado favorable de tratamientos profilacticos y/o terapeuticos esta fuertemente correlacionado con la prediccion, diagnostico y/o pronostico tempranos y/o precisos de la enfermedad o afeccion. Por lo tanto, existe una necesidad continua de formas adicionales y preferiblemente mejoradas para la prediccion, diagnostico y/o pronostico tempranos y/o precisos de enfermedades y afecciones para guiar las elecciones de tratamiento.
La insuficiencia cardiaca es un problema de salud publica principal en los pafses desarrollados y es la causa de considerable morbilidad y mortalidad entre los adultos mayores. Normalmente es una enfermedad cronica caracterizada por la frecuente descompensacion recurrente que lleva al empeoramiento de problemas respiratorios. Ademas, 5 anos despues del diagnostico 50% de los pacientes de insuficiencia cardiaca habran muerto por la enfermedad.
La insuficiencia cardiaca aguda (ICA) es una incapacidad repentina del corazon para bombear de forma eficaz y donde ya no puede prever las demandas corporales de oxfgeno. La ICA es la causa de alrededor de 2 millones de hospitalizaciones anualmente en EE.UU. y Europa, y presenta una tasa de mortalidad de aproximadamente 20-40% en el espacio de un ano del alta del hospital en muchas poblaciones. Aproximadamente 90% de los ingresos de ICA son tfpicamente de pacientes con insuficiencia cardiaca cronica, el resto aproximadamente 10% son pacientes nuevos. Las senales clmicas de la enfermedad cardiaca y la ICA a menudo no son espedficas lo que puede hacer exigente el diagnostico inequvoco.
Un smtoma comun de la ICA es la dificultad para respirar (disnea). Sin embargo, normalmente solo una fraccion de las personas que presentan disnea tras el ingreso en el medico o en clmica, padecen ICA. Por lo tanto, un tratamiento rapido, adecuado y eficaz de la ICA requiere distinguir adecuadamente los pacientes con ICA de pacientes que tienen disnea debido a otras causas.
Actualmente, el diagnostico de la ICA se hace principalmente basandose en signos clmicos, tales como ECG, radiograffa de torax, etc. Un biomarcador usado con frecuencia para complementar estos criterios de diagnostico de ICA tal como en situaciones de urgencias, es el peptido natriuretico tipo B (BNP).Tfpicamente, el BNP menor que 100 pg/ml se considera como un criterio para “descartar” la insuficiencia cardiaca, mientras que el BNP mayor que 400 pg/ml se ve como un criterio de “inclusion” para la ICA. Aunque el BNP es sensible, su especificidad es relativamente baja, y es especialmente problematico debido a la “zona gris” entre 100-400 pg/ml. Por ejemplo, Chung et al. 2006 (Am Heart J 152(5): 949-55) han determinado que el punto de corte del BNP de 100 pg/ml tiene 100% de sensibilidad, pero solo 41% de especificidad para diagnosticar la ICA, mientras que el punto de corte de 400 pg/ml tiene 87% de sensibilidad y 76% de especificidad. Clerico et al (Clinical Chemistry (2007) 53(5) pag. 813822) compara la precision del diagnostico de los inmunoensayos del BNP y de la parte N-terminal del propeptido de BNP en la insuficiencia cardiaca cronica y aguda, y concluye que tanto los ensayos de BNP como de NT-proBNP tienen un grado alto de precision del diagnostico y de importancia clmica tanto para la insuficiencia cardiaca aguda como la cronica.
Los niveles de BNP tambien vanan con la edad, sexo, peso y otras afecciones medicas, haciendo de esta forma confuso el diagnostico. Es notable que los niveles de bNp tienden a ser elevados en pacientes con antecedentes medicos de insuficiencia cardiaca e insuficiencia renal. Por ejemplo, Chung et al. 2006 (vease antes) han mostrado que el rendimiento del BNP para el diagnostico de la ICA en pacientes que presentan disnea, es significativamente reducido en pacientes con antecedentes de insuficiencia cardiaca. En particular, aproximadamente 40% de los pacientes que presentan disnea no causada por la ICA, que teman antecedentes de insuficiencia cardiaca, presentaron valores de BNP por encima de 400 pg/ml, el punto de corte de ICA usado actualmente en clmica. Por consiguiente, las directrices de la Sociedad Europea de Cardiologfa (ESC) de 2008 tambien caracterizan el BNP como un biomarcador de la insuficiencia cardiaca en general mas que de la insuficiencia cardiaca aguda.
El documento WO 2008/131039 describe un metodo para evaluar el estado de la enfermedad cardiovascular usando una variedad de biomarcadores, incluyendo el BNP, mientras que el documento US 6.812.339 describe una serie de secuencias y polimorfismos de un solo nucleotido, incluyendo MCAM (SEQ ID NO: 11206).
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En vista de esto existe una necesidad constante de biomarcadores adicionales y preferiblemente espedficos para la ICA. Dichos nuevos marcadores de ICA pueden ser comparables o mejores frente a los marcadores previamente existentes, tal como frente al BNP, en una o mas de sus caractensticas, tales como, por ejemplo, en su sensibilidad y/o especificidad, en su fiabilidad en pacientes que presentan un smtoma que indica potencialmente ICA tal con disnea, en su fiabilidad en pacientes con antecedentes de insuficiencia cardiaca y otras comorbilidades frecuentes de la insuficiencia cardiaca tales como la insuficiencia renal, obesidad, enfermedad arterial coronaria, etc.
Ademas, subyacen varias causas en la insuficiencia cardiaca (aguda). Espedficamente, la disfuncion sistolica y disfuncion diastolica conducen al remodelado cardiaco y funcion cardiaca alterada, produciendo una disminucion del gasto cardiaco. Ambas disfunciones se caracterizan por defectos en la funcion de bombeo del corazon. La disfuncion sistolica se produce por una perdida de inotropfa intnnseca (contractilidad), lo mas probablemente debido a alteraciones en los mecanismos de transduccion de senales responsables de regular la inotropfa, y se caracteriza por defectos en el vaciado del corazon, en particular del ventnculo, de sangre durante la contraccion (es decir, la sfstole). La disfuncion diastolica se produce cuando el ventnculo se hace menos adaptable (es decir, “mas ngido”), lo que dificulta el llenado ventricular y como tal se caracteriza por defectos en el llenado del corazon, en particular el ventnculo, con sangre durante la relajacion (es decir, la diastole).
Como tal, la fisiopatologfa de la disfuncion sistolica y diastolica difiere, puesto que los mecanismos compensatorios intnnsecos que manejan ambas disfunciones difieren. Aunque la disfuncion sistolica y diastolica comparten smtomas comunes, la naturaleza del tratamiento difiere al menos parcialmente. Aunque tanto los beta bloqueantes como los inhibidores de ACE estan indicados para el tratamiento tanto de la disfuncion sistolica como de la diastolica, posiblemente en combinacion con diureticos, los farmacos inotropicos, por ejemplo, tales como la digoxina estan espedficamente indicados para el tratamiento de la disfuncion sistolica (y contraindicados para el tratamiento de la disfuncion diastolica) y, por ejemplo, los bloqueadores de canales de calcio estan espedficamente indicados para el tratamiento de la disfuncion diastolica (y contraindicados para el tratamiento de la disfuncion sistolica).
Puede estar claro que para el tratamiento adecuado es necesario el diagnostico, prediccion, pronostico y/o seguimiento precisos y fiables de la disfuncion sistolica y/o diastolica, asf como la diferenciacion entre ambas disfunciones. La presente invencion se dirige a las necesidades anteriores en la tecnica identificando biomarcadores para la ICA y mas preferiblemente la disfuncion sistolica, y parametros asociados con los mismos, y proporcionando usos de los mismos.
Resumen de la invencion
Habiendo llevado a cabo experimentos y ensayos extensos, los autores de la invencion han puesto de manifiesto que la molecula de adhesion celular del melanoma (MCAM, tambien conocida como CD146 o MUC18), representa un nuevo biomarcador particularmente ventajoso para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la insuficiencia cardiaca aguda (ICA).
En particular, en un estudio de 3 centros que implica la recogida de muestras prospectiva de sujetos que presentan disnea tras ingreso en urgencias, los autores de la invencion han identificado primero y posteriormente han validado la MCAM como un biomarcador que presenta un nivel significativamente alterado en pacientes disneicos que tienen ICA, cuando se comparan con pacientes disneicos que no tienen ICA. Ademas, los autores de la invencion tambien se han dado cuenta de que la MCAM puede ser un biomarcador util para el seguimiento del progreso de la ICA y/o se puede usar para predecir un suceso agudo, puesto que la cantidad de MCAM diferia significativamente entre pacientes disneicos con ICA tras el ingreso (es decir, antes del tratamiento) y tras el alta (es decir, despues de tratamiento).
Los datos actuales indican que el rendimiento del marcador MCAM es al menos equivalentes con el del BNP.
Ademas, para diferenciar entre pacientes disneicos con y sin ICA, el valor de la AUC (area bajo la curva de ROC; “ROC” significa caractensticas operativas del receptor) es ligeramente mayor para la MCAM (0,91) que para cada uno del BNP (0,88) y NT-proBNP (0,85). El valor de AUC es una medida combinada de sensibilidad y especificidad y un valor mas alto de AUC (es decir, que se aproxima a 1) en general indica un rendimiento mejorado del ensayo.
Ademas, como se ha mencionado antes, el marcador BNP de diagnostico tiene una “zona gris” problematica entre los valores de 100-400 pg/ml, en la que no se puede establecer un diagnostico exacto de ICA. El uso del nivel del marcador de MCAM en dichas muestras de la “zona gris” del BNP dio como resultado una clara distincion entre los pacientes disneicos con ICA y sin ICA.
Este rendimiento diagnostico general de la MCAM es, dependiendo del conjunto de datos usado, mejor o al menos equivalente al BNP y NT-proBNP, el patron referencial actual de biomarcadores para el diagnostico de la ICA en una poblacion con disnea aguda. En un solo punto de corte de concentracion o proporcion, la MCAM alcanza una precision de diagnostico de 84%, mientras que el BNP en su punto de corte de descarte (100 pg/ml) tiene solo una precision de 71%.
Considerado en conjunto, los autores de la invencion han identificado y validado la MCAM (CD146 o MUC-18) como un biomarcador adicional y mejorado para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la ICA, en particular en pacientes
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con antecedentes de insuficiencia cardiaca, o que padecen de otros trastornos que no son ICA, que producen disnea.
Por consiguiente, en un aspecto, la invencion proporciona un metodo para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la insuficiencia cardiaca aguda (ICA) en un sujeto, caracterizado porque la fase de examen del metodo comprende medir la cantidad de MCAM en una muestra del sujeto. Se entiende que los metodos de prediccion, diagnostico y/o pronostico de enfermedades o afecciones en general comprenden una fase de examen en la que se recogen los datos de y/o sobre el sujeto.
Por lo tanto, se proporciona un metodo para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la ICA en un sujeto que puede comprender las etapas de:
(i) medir la cantidad de MCAM en una muestra del sujeto;
(ii) comparar la cantidad de MCAM medida en (i) con un valor de referencia de la cantidad de MCAM, representando dicho valor de referencia una prediccion, diagnostico y/o pronostico conocido de ICA;
(iii) encontrar una desviacion o ausencia de desviacion de la cantidad de MCAM medida en (i) respecto al valor de referencia;
(iv) atribuir dicha desviacion o ausencia de desviacion encontrada a una prediccion, diagnostico y/o pronostico particular de ICA en el sujeto.
La MCAM proporciona una diferenciacion mejorada o incluso sustancialmente completa de fenotipos de ICA de disneicos sin ICA. Por lo tanto, los autores de la invencion contemplan que la MCAM tambien puede ser beneficiosa para establecer cribados de poblaciones para seleccionar sujetos que tienen o tienen riesgo de tener ICA. El uso de BNP para dicho cribado de poblacion es complicado en especial por el efecto de confusion de los antecedentes cardiacos (p. ej., patologfa de ICC) en la lectura del BNP, por lo tanto el BNP falla en el cribado debido a la falta de especificidad. Por lo tanto, en una realizacion, los metodos presentes de prediccion, diagnostico y/o pronostico de ICA en un sujeto se pueden usar para el cribado de poblaciones (tal como, p. ej., el cribado en una poblacion general o en una poblacion estratificada basada en uno o mas criterios, p. ej., edad, genero, ascendencia, ocupacion, presencia o ausencia de factores de riesgo de ICA, etc.).
Como se demuestra en la seccion experimental, los autores de la invencion han mostrado que la prediccion o diagnostico de ICA o un mal pronostico de ICA se pueden asociar en particular con un nivel elevado de MCAM. Por lo tanto, en una realizacion de los metodos de prediccion, diagnostico y/o pronostico como se ensenan en la presente memoria, una cantidad elevada de MCAM en la muestra del sujeto comparada con un valor de referencia que representa la prediccion o diagnostico de ausencia ICA o representa un buen pronostico para la ICA respectivamente, indica que el sujeto tiene o esta en riesgo de tener ICA o indica un mal pronostico para la ICA en el sujeto.
Ademas, los autores de la invencion han hecho ensayos con pacientes a los que se diagnostico insuficiencia cardiaca aguda tanto en el ingreso en el servicio de urgencias (SU) como en el alta del hospital, es decir, cuando se considero que los pacientes se habfan recuperado y estaban estables. La mayona de los pacientes mostraron una disminucion significativa de la MCAM tras el alta, comparados con los niveles en la etapa de ingreso. Se obtiene un cuadro similar cuando se comparan los niveles de bNp en el ingreso frente al alta. Estos datos apoyan la idea de que los niveles de MCAM son un reflejo del estado de la enfermedad y por lo tanto se podnan usar para el seguimiento y/o prediccion de un suceso agudo. Los autores de la invencion tambien han observado y verificado que los metodos que usan MCAM como un biomarcador, y en particular, pero sin la limitacion, los metodos para diferenciar entre pacientes disneicos con y sin ICA, pueden lograr una sensibilidad de 80% o mas y/o una especificidad de 80% o mas. Por lo tanto, en una realizacion de los metodos de prediccion, diagnostico y/o pronostico como se ensenan en la presente memoria, la sensibilidad y/o especificidad (y preferiblemente, la sensibilidad y especificidad) de los metodos es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70% o al menos 80%, p. ej., > 81%, > 82%, > 83%, > 84%, > 85%, > 86%, o > 87%, o > 90% o >95% (el sfmbolo " > " es sinonimo de las expresiones “al menos” o “igual o mas”), p. ej., entre 80% y 100%, o entre 81% y 95%, o entre 83% y 90%, o entre 84% y 89%, o entre 85% y 88%.
En otra realizacion de los metodos de prediccion, diagnostico y/o pronostico como se ensenan en la presente memoria, el sujeto puede presentar uno o mas smtomas y/o signos potencialmente indicativos de ICA. Por ejemplo, en una realizacion, el sujeto puede presentar disnea. Por lo tanto, en una realizacion, los metodos pueden ser para diferenciar entre sujetos que presentan disnea debido a la ICA y sujetos que presentan disnea debido a causas distintas o no relacionadas con ICA (tales como, p. ej., debido a la EPOC o neumoma).
En una realizacion adicional de los metodos de prediccion, diagnostico y/o pronostico como se ensenan en la presente memoria, el sujeto puede presentar uno o mas factores de riesgo para la ICA, tales como, por ejemplo, una predisposicion genetica o uno o mas factores de riesgo de desarrollo, medioambientales o conductuales, tales como p. ej., resistencia a la insulina (glucosa en sangre alterada), obesidad troncal, niveles altos en el suero de colesterol iipoprotemas de baja densidad (LDL), niveles bajos en el suero de colesterol lipoprotemas de alta densidad (HDL),
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niveles altos de trigliceridos en el suero y presion arterial alta (hipertension), infarto de miocardio previo, y/o una o mas comorbilidades tales como diabetes, enfermedad arterial coronaria, asma, EPOC y/o enfermedad renal cronica.
Por lo tanto, en diferentes realizaciones, los metodos presentes para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la ICA se pueden usar en individuos a los que todavfa no se les ha diagnosticado que tengan ICA (por ejemplo, cribado preventivo), o a los que se ha diagnosticado que tienen ICA o ICC, o que se sospecha que tienen ICA o ICC (por ejemplo, presentan uno o mas smtomas caractensticos de la ICA o ICC), o que tienen riesgo de desarrollar ICA o ICC (por ejemplo, predisposicion genetica; presencia de uno o mas factores de riesgo de desarrollo, medioambientales o conductuales). Los metodos tambien se pueden usar para detectar diferentes etapas del progreso o gravedad de la ICA. Los metodos tambien se pueden usar para detectar la respuesta de la ICA a los tratamientos profilacticos o terapeuticos y otras intervenciones. Los metodos se pueden usar ademas para ayudar al medico a decidir sobre el empeoramiento, estado existente, recuperacion parcial o recuperacion completa del paciente del suceso agudo (ICA), que da lugar al tratamiento adicional o a la observacion o al alta del paciente del SU. Los metodos de la presente invencion permiten al medico seguir el progreso de la enfermedad midiendo el nivel de MCAM en una muestra del paciente, en donde una disminucion del nivel de MCAM comparado con un nivel de MCAM previo (p. ej., en el momento del ingreso en el SU) indica que la afeccion del sujeto esta mejorando o ha mejorado, mientras que un aumento del nivel de MCAM comparado con el nivel de MCAM medido tras el ingreso en el Su indica que la afeccion del sujeto ha empeorado o esta empeorando y posiblemente podna dar como resultado un nuevo suceso de insuficiencia cardiaca aguda. La invencion proporciona ademas un metodo para el seguimiento de un cambio en la prediccion, diagnostico y/o pronostico de la iCa en un sujeto, que comprende:
(i) aplicar el metodo de prediccion, diagnostico y/o pronostico como se ha ensenado antes en la presente memoria al sujeto en uno o mas tiempos de medicion sucesivos, de modo que se determina la prediccion, diagnostico y/o pronostico de la ICA en el sujeto en dichos tiempos de medicion sucesivos;
(ii) comparar la prediccion, diagnostico y/o pronostico de ICA en el sujeto en dichos tiempos de medicion sucesivos determinados en (i); y
(iii) encontrar la presencia o ausencia de un cambio entre la prediccion, diagnostico y/o pronostico de ICA en el sujeto en dichos tiempos de medicion sucesivos determinados en (i).
Este aspecto permite el seguimiento de la afeccion del sujeto a lo largo del tiempo. Esto puede permitir, entre otros, predecir la aparicion de un suceso de ICA, o el seguimiento en dicho sujeto del progreso de la enfermedad, agravamiento de la enfermedad o alivio, reaparicion de la enfermedad, respuesta al tratamiento, respuesta a otros factores externos e internos, afecciones o factores estresantes, etc. Ventajosamente, el cambio en la prediccion, diagnostico y/o pronostico de la ICA en el sujeto se puede seguir en el transcurso de un tratamiento medico de dicho sujeto, preferiblemente un tratamiento medico dirigido a tratar la ICA. Dicha vigilancia puede estar comprendida, por ejemplo, en tomar la decision de si a un paciente (p. ej., un paciente disneico o con ICA) se le puede dar el alta o necesita mas hospitalizacion.
Tfpicamente, esto se hace midiendo el nivel de MCAM en un sujeto en diferentes tiempos de medicion durante la estancia en el SU, en donde una disminucion del nivel de MCAM en funcion del tiempo indica que la afeccion del sujeto esta mejorando o ha mejorado, mientras que un aumento del nivel de MCAM en funcion del tiempo indica que la afeccion del sujeto ha empeorado o esta empeorando y posiblemente podna dar como resultado un nuevo suceso de insuficiencia cardiaca.
Hay que indicar que en los presentes metodos de prediccion, diagnostico y/o pronostico, la medicion de la MCAM tambien se puede combinar con la evaluacion de uno o mas biomarcadores relevantes para la ICA.
Por consiguiente, tambien se describen en la presente memoria metodos en donde la fase de examen de los metodos comprende ademas medir la presencia o ausencia y/o la cantidad de uno o mas de otros marcadores utiles para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la ICA en la muestra del sujeto. En relacion con esto, se podna usar cualquier marcador de ICA adecuado conocido o todavfa desconocido. En una realizacion preferida, dicho marcador adicional de ICA se selecciona del grupo que consiste en: peptido natriuretico tipo B (BNP), propeptido natriuretico tipo B (proNBP), fragmento N-terminal del propeptido natriuretico tipo B (NTproBNP), y fragmentos de uno cualquiera de los mismos.
Por consiguiente, se describe un metodo para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la ICA en un sujeto, que comprende las etapas de:
(i) medir la cantidad de MCAM y la presencia o ausencia y/o la cantidad de dichos uno o mas de otros biomarcadores en una muestra del sujeto;
(ii) usar las mediciones de (i) para establecer un perfil del sujeto de la cantidad MCAM y la presencia o ausencia y/o la cantidad de dichos uno o mas de otros biomarcadores;
(iii) comparar dicho perfil del sujeto de (ii) con un perfil de referencia de la cantidad de MCAM y la presencia o ausencia y/o la cantidad de dichos uno o mas de otros biomarcadores, representando dicho perfil de referencia una
prediccion, diagnostico y/o pronostico conocido de ICA;
(iv) encontrar una desviacion o ausencia de desviacion del perfil del sujeto de (ii) respecto al perfil de referencia;
(v) atribuir dicha desviacion o ausencia de desviacion encontrada a una prediccion, diagnostico y/o pronostico particular de ICA en el sujeto.
5 En una realizacion, dicho otro marcador util para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la ICA se elige del grupo que consiste en el peptido natriuretico tipo B (BNP), propeptido natriuretico tipo B (proNBP), fragmento N-terminal del propeptido natriuretico tipo B (NTproBNP), y fragmentos de uno cualquiera de los mismos.
En realizaciones preferidas de los metodos de la presente invencion, la deteccion de la protema MCAM se hace en una muestra de plasma (es decir, una fraccion de muestra de sangre que no contiene celulas sangumeas), lo que 10 implica que se detecta la protema MCAM circulante, independientemente de si esta forma circulante corresponde o no a la forma soluble procesada por MMP o a un producto de degradacion de la forma de longitud completa o de dicha forma soluble de MCAM. En una realizacion preferida, la protema MCAM detectada no esta unida a membrana o a celula, independientemente de como se logra la liberacion de la MCAM en el plasma o suero in vivo.
Como se ha indicado antes, los presentes metodos pueden usar valores de referencia para la cantidad de MCAM 15 que se pueden establecer de acuerdo con procedimientos conocidos previamente usados para otros biomarcadores. Dichos valores de referencia se pueden establecer dentro (es decir, constituyendo una etapa de) o externamente a (es decir, no constituyendo una etapa de) los metodos de la presente invencion como se definen en la presente memoria. Por consiguiente, cualquiera de los metodos ensenados en la presente memoria puede comprender una etapa de establecer un valor de referencia para la cantidad de MCAM, representando dicho valor de referencia (a) 20 una prediccion o diagnostico de ausencia de ICA o un buen pronostico para la ICA, o (b) una prediccion o diagnostico de ICA o un mal pronostico para la ICA.
Un aspecto adicional proporciona un metodo para establecer un valor de referencia para la cantidad de MCAM, representando dicho valor de referencia:
(a) una prediccion o diagnostico de ausencia de ICA o un buen pronostico para la ICA, o 25 (b) una prediccion o diagnostico de ICA o un mal pronostico para la ICA,
que comprende:
(i) medir la cantidad de MCAM en:
(i a) una o mas muestras de uno o mas sujetos que no tienen ICA o que no estan en riesgo de tener ICA o que tienen un buen pronostico para la ICA, o
30 (i b) una o mas muestras de uno o mas sujetos que tienen ICA o que estan en riesgo de tener ICA o que
tienen un pronostico malo para la ICA, y
(ii) almacenar la cantidad de MCAM
(ii a) como medicion en (i a) como el valor de referencia que representa la prediccion o diagnostico de ausencia de ICA o que representa el pronostico bueno para la ICA, o
35 (ii b) como medicion en (i b) como el valor de referencia que representa la prediccion o diagnostico de ICA o
que representa el pronostico malo para la ICA.
Los metodos presentes pueden de otro modo usar perfiles de referencia para la cantidad de MCAM y la presencia o ausencia y/o la cantidad de uno o mas de otros biomarcadores utiles para predecir, diagnosticar y/o pronosticar ICA, que se pueden establecer de acuerdo con procedimientos conocidos previamente usados para otros biomarcadores. 40 Dichos perfiles de referencia se pueden establecer dentro (es decir, constituyendo una etapa de) o externamente a (es decir, no constituyendo una etapa de) los presentes metodos. Por consiguiente, los metodos ensenados en la presente memoria pueden comprender una etapa de establecer un valor de referencia para la cantidad de MCAM y la presencia o ausencia y/o la cantidad de dichos uno o mas de otros biomarcadores, representando dicho perfil de referencia (a) una prediccion o diagnostico de ausencia de ICA o un buen pronostico para la ICA, o (b) una 45 prediccion o diagnostico de ICA o un mal pronostico para la ICA.
Un aspecto adicional proporciona un metodo para establecer un perfil de referencia para la cantidad de MCAM y la presencia o ausencia y/o la cantidad de uno o mas de otros biomarcadores utiles para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la ICA, representando dicho perfil de referencia:
(a) una prediccion o diagnostico de ausencia de ICA o un buen pronostico para la ICA, o 50 (b) una prediccion o diagnostico de ICA o un mal pronostico para la ICA,
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que comprende:
(i) medir la cantidad de MCAM y la presencia o ausencia y/o la cantidad de dichos uno o mas de otros biomarcadores en:
(i a) una o mas muestras de uno o mas sujetos que no tienen ICA o no estan en riesgo de tener ICA o que tienen un buen pronostico para la ICA; o
(i b) una o mas muestras de uno o mas sujetos que tienen ICA o estan en riesgo de tener ICA o tienen mal pronostico para la ICA;
(ii)
(ii a) usar las mediciones de (i a) para crear un perfil de la cantidad de MCAM y la presencia o ausencia y/o la cantidad de dichos uno o mas de otros biomarcadores; o
(ii b) usar las mediciones de (i b) para crear un perfil de la cantidad de MCAM y la presencia o ausencia y/o la cantidad de dichos uno o mas de otros biomarcadores;
(iii)
(iii a) almacenar el perfil de (ii a) como el perfil de referencia que representa la prediccion o diagnostico de ausencia de ICA o que representa el pronostico bueno para la ICA; o
(iii b) almacenar el perfil de (ii b) como el perfil de referencia que representa la prediccion o diagnostico de ICA o que representa el pronostico malo para la ICA.
En una realizacion, dicho otro biomarcador util para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la ICA se puede elegir del grupo que consiste en el peptido natriuretico tipo B (BNP), propeptido natriuretico tipo B (proBNP), fragmento amino terminal del propeptido natriuretico tipo B (NTproBNP), y fragmentos de cualquiera de los mismos.
La invencion proporciona ademas un metodo para establecer un valor base o de referencia de MCAM en un sujeto, que comprende:
(i) medir la cantidad de MCAM en la muestra del sujeto en diferentes tiempos de medicion, en donde el sujeto no padece ICA, y
(ii) calcular el intervalo o valor medio del sujeto, que es el valor base o de referencia de MCAM para dicho sujeto.
En realizaciones preferidas de los metodos de la presente invencion, la deteccion de la protema MCAM se hace en una muestra de plasma, lo que implica que se detecta la protema MCAM circulante, independientemente de si esta forma circulante corresponde o no a la forma soluble o a un producto de degradacion de la forma de longitud completa o soluble. En una realizacion preferida, la protema MCAM detectada en los metodos de acuerdo con la presente invencion no esta unida a membrana o a celula, sino que es la forma de MCAM circulante plasmatica.
En realizaciones preferidas de uno cualquiera de los metodos anteriores, el sujeto puede ser humano. En realizaciones preferidas adicionales, el sujeto padece ICA que implica disfuncion sistolica. En realizaciones incluso mas preferidas, dicha disfuncion sistolica se caracteriza por una disminucion de la fraccion de eyeccion ventricular izquierda (FEVI), preferiblemente en donde dicha FEVI es menor que 55% o menor que 50% o menor que 45%, y/o por aumento de la presion de llenado cardiaco.
Los autores de la invencion han encontrado ademas que los niveles de MCAM se correlacionan con la fraccion de eyeccion ventricular izquierda (FEVI). Se ha mostrado que los sujetos con una FEVI reducida tienen niveles de MCAM alterados (en especial aumentados), comparado con sujetos con la FEVI normal. Puesto que la FEVI reducida es una caractenstica de la disfuncion sistolica, los niveles de MCAM se pueden usar para la prediccion, diagnostico, pronostico y/o seguimiento de la disfuncion sistolica.
En particular, en un estudio de 3 centros que implica la recogida de muestras prospectiva de sujetos que presentan disnea tras ingreso en urgencias, la MCAM estaba significativamente aumentada en pacientes disneicos (en especial en pacientes con ICA) que mostraban FEVI reducida indicativa de disfuncion sistolica, comparado con pacientes disneicos con FEVI y funcion sistolica conservada. La funcion sistolica puede indicar preferiblemente disfuncion sistolica del ventnculo izquierdo.
En otro aspecto, la invencion se refiere, por lo tanto, a un metodo para la prediccion, diagnostico, pronostico y/o seguimiento de la disfuncion sistolica en un sujeto, que comprende medir los niveles de MCAM en una muestra de dicho sujeto.
Ademas, en la poblacion anterior de pacientes de ICA con un predominio de pacientes con insuficiencia cardiaca con disfuncion sistolica, el valor del AUC (area bajo la curva de ROC; “ROC” significa caractensticas operativas del
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receptor) para diferenciar entre pacientes disneicos con y sin ICA, es ligeramente mayor para la MCAM (0,91) que para cada uno del BNP (0,88) y NT-proBNP (0,85). El valor de AUC es una medida combinada de sensibilidad y especificidad y un valor mas alto de AUC (es decir, que se aproxima a 1) en general indica un rendimiento mejorado de la prueba.
Los autores de la invencion han encontrado ademas que los niveles de MCAM se correlacionan con el estado de llenado cardiaco. En particular, los autores de la invencion han encontrado que los niveles de MCAM son mayores en sujetos con un aumento de la presion de llenado cardiaco, comparado con sujetos con presion de llenado cardiaco normal.
Tanto la disfuncion sistolica como la diastolica pueden producir acumulacion de lfquidos en un sujeto. Sin embargo, los sujetos con una disfuncion sistolica, son mas resistentes a la acumulacion de lfquidos y por lo tanto acumularan mas volumen comparado con pacientes con disfuncion diastolica antes de que se aparezcan smtomas como la disnea. Los autores de la invencion han encontrado que los niveles de MCAM se correlacionan con la acumulacion de lfquidos, y en particular el estado de llenado vascular o volumen o presion de llenado vascular como una medida de la homeostasis de Kquidos. En particular, los autores de la invencion encontraron que los niveles de MCAM son mas altos en sujetos con aumento de volumen o presion de llenado vascular y por lo tanto la MCAM es un marcador para la acumulacion de lfquidos en un sujeto. Como corolario, los niveles de MCAM estan asociados con la ganancia de peso debido al sobrellenado o con la perdida de peso debido al llenado menor o contraccion de volumen de un sujeto. Como tal, los autores de la invencion han encontrado que la MCAM es un marcador para determinar edema, cambios en el estado de volumen o deshidratacion de un sujeto. En particular, los niveles de MCAM estan correlacionados con el estado de llenado de un sujeto con defectos en la circulacion sangumea, tal como los causados por insuficiencia cardiaca, y defectos en la secrecion, tal como causados por disfuncion renal o insuficiencia renal. Por consiguiente, en una realizacion, la descripcion se refiere a un metodo como se describe en la presente memoria para la prediccion, diagnostico, pronostico y/o seguimiento de una homeostasis de lfquidos deteriorada en un sujeto, en donde al sujeto que la presenta, se le ha diagnosticado o tiene antecedentes medicos de insuficiencia cardiaca, en particular disfuncion sistolica.
Por lo tanto, se proporciona un metodo para la prediccion, diagnostico, pronostico y/o seguimiento de la disnea asociada con o causada por sobrecarga de volumen, que comprende medir los niveles de MCAM en una muestra de dicho sujeto. La sobrecarga de volumen puede ser indicativa de IC, preferiblemente IC debida a disfuncion sistolica, y puede estar en riesgo de descompensacion o estar descompensada en la ICA. El metodo puede diferenciar la disnea causada por sobrecarga de volumen tal como en la IC o ICA, de otras causas de disnea (p. ej., EPOC, neumoma).
Tambien se describe un metodo para la prediccion, diagnostico, pronostico y/o seguimiento de la IC, preferiblemente ICA, asociada o causada por la sobrecarga de volumen en un sujeto, que comprende medir los niveles de MCAM en una muestra de dicho sujeto. La sobrecarga de volumen puede ser debida a la disfuncion sistolica.
Por lo tanto, tambien se describe un metodo para la prediccion, diagnostico, pronostico y/o seguimiento de la IC, preferiblemente la ICA, asociada o causada por la disfuncion sistolica en un sujeto, que comprende medir los niveles de MCAM en una muestra de dicho sujeto.
La disfuncion sistolica se caracteriza por una disminucion de la fraccion de eyeccion del ventnculo izquierdo y/o derecho, mas en particular disminucion de la FEVI. Los autores de la invencion han encontrado que los niveles de MCAM estan correlacionados con la fraccion de eyeccion ventricular. Por lo tanto, se describe un metodo para la prediccion, diagnostico, pronostico y/o seguimiento de la fraccion de eyeccion ventricular en un sujeto, que comprende medir los niveles de MCAM en una muestra de dicho sujeto.
La fraccion de eyeccion ventricular (p. ej., FEVI) en un sujeto se puede decir que se ha reducido comparado con la normal, si dicha fraccion de eyeccion esta por debajo de la normal en cualquier grado, p. ej., una fraccion de eyeccion ventricular reducida puede significar menos de aproximadamente 45%, o menos de aproximadamente 50% o menos de aproximadamente 55%; por ejemplo, una fraccion de eyeccion ventricular reducida puede indicar entre aproximadamente 40% y aproximadamente 70%, preferiblemente entre aproximadamente 45% y aproximadamente 65%, o entre aproximadamente 50% y aproximadamente 60%, p. ej., menos de aproximadamente 55%. En un experimento ilustrativo pero no limitante, los niveles de MCAM proporcionaron diferenciacion particularmente satisfactoria entre la FEVI normal y reducida cuando el umbral entre dicha FEVI normal y reducida se establecio en 55%. Por lo tanto, en realizaciones, un umbral para la fraccion de eyeccion ventricular normal frente a reducida, en particular la FEVI, se puede establecer en un nivel entre aproximadamente 50% y aproximadamente 60%, p. ej., en 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% o 60%, y preferiblemente en 55%, en donde un valor por encima de dicho umbral refleja la fraccion de eyeccion normal y un valor por debajo de dicho umbral indica fraccion de eyeccion reducida.
La cafda o disminucion del gasto cardiaco debido a una disminucion de la fraccion de eyeccion ventricular promueve la retencion renal salina y de agua. Esta adaptacion adecuada expande el volumen sangumeo, elevando de esta forma la presion y volumen diastolico final. Por lo tanto, la disfuncion sistolica tambien se caracteriza por un aumento de la presion de llenado cardiaco. Por lo tanto, se proporciona tambien un metodo para la prediccion, diagnostico,
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pronostico y/o seguimiento del estado del llenado cardiaco en un sujeto, que comprende medir los niveles de MCAM en una muestra de dicho sujeto. El estado de llenado cardiaco puede estar representado por la presion de llenado cardiaco.
Por lo tanto, se proporciona un metodo para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la disfuncion sistolica en un sujeto, que puede comprender las etapas de:
(i) medir la cantidad de MCAM en una muestra del sujeto;
(ii) comparar la cantidad medida de MCAM medida en (i) con un valor de referencia de la cantidad de MCAM, representando dicho valor de referencia una prediccion, diagnostico y/o pronostico conocido de la disfuncion sistolica;
(iii) encontrar una desviacion o ausencia de desviacion de la cantidad de MCAM medida en (i) respecto al valor de referencia;
(iv) atribuir dicha desviacion o ausencia de desviacion encontrada a una prediccion, diagnostico y/o pronostico particular de disfuncion sistolica en el sujeto.
Las etapas anteriores se pueden aplicar, cambiando lo que se deba cambiar, a la disnea asociada o causada por la sobrecarga de volumen; a la IC o ICA asociada o causada por la sobrecarga de volumen; a la IC o ICA asociada o causada por la disfuncion sistolica; a la fraccion de eyeccion ventricular; o al estado de llenado cardiaco.
La MCAM proporciona una diferenciacion mejorada o incluso sustancialmente completa de la disnea causada por la sobrecarga de volumen tal como en la ICA, de otras causas de disnea. Por lo tanto, los autores de la invencion contemplan que la MCAM puede ser beneficiosa tambien para establecer cribados de poblaciones para seleccionar sujetos que tienen o tienen riesgo de tener descompensacion aguda. Se puede usar cualquiera de los metodos descritos en la presente memoria para el cribado de poblaciones (tal como, p. ej., el cribado en una poblacion general o en una poblacion estratificada basada en uno o mas criterios, p. ej., edad, genero, ascendencia, ocupacion, presencia o ausencia de factores de riesgo de ICA, etc.). En cualquiera de los metodos anteriores de la presente descripcion, el sujeto puede formar parte de una poblacion de pacientes que muestra signos de disnea.
Los autores de la invencion han encontrado que la MCAM se puede usar como un biomarcador espedfico para la disfuncion sistolica. Por lo tanto, en un aspecto, la descripcion se refiere al uso de los metodos como se describen en la presente memoria, para diferenciar entre disfuncion sistolica y diastolica.
En una realizacion se proporciona un metodo para diferenciar entre la disfuncion sistolica y la disfuncion diastolica en un sujeto, que comprende:
(i) medir la cantidad de MCAM en una muestra de dicho sujeto;
(ii) comparar la cantidad de MCAM medida en (i) con un valor de referencia de la cantidad de MCAM, representando dicho valor de referencia un umbral para el diagnostico de la disfuncion sistolica;
(iii) atribuir el diagnostico de disfuncion sistolica en dicho sujeto, si la cantidad de MCAM en dicha muestra de dicho sujeto supera dicho umbral.
Como se demuestra en la seccion experimental, los autores de la invencion han mostrado que la prediccion o diagnostico de disfuncion sistolica o un mal pronostico de la disfuncion sistolica se pueden asociar en particular con un nivel elevado de MCAM. Por lo tanto, en una realizacion de los metodos de prediccion, diagnostico y/o pronostico como se ensenan en la presente memoria, una cantidad elevada de MCAM en la muestra del sujeto comparada con un valor de referencia que representa la prediccion o diagnostico de ausencia de disfuncion sistolica o representa un buen pronostico para la disfuncion sistolica respectivamente, indica que el sujeto tiene o esta en riesgo de tener disfuncion sistolica o indica un mal pronostico para la disfuncion sistolica en el sujeto. Los niveles elevados de MCAM tambien pueden ser indicativos de la prediccion o diagnostico o mal pronostico de la disnea asociada con o causada por la sobrecarga de volumen; o de IC o ICA asociada o causada por la sobrecarga de volumen; o de IC o ICA asociada o causada por la disfuncion sistolica; o de fraccion de eyeccion ventricular reducida; o de aumento de presion de llenado cardiaco.
En una realizacion, el metodo para el seguimiento de la disfuncion sistolica comprende las etapas de:
(i) medir la cantidad de MCAM en muestras del sujeto de dos o mas tiempos de medicion sucesivos;
(ii) comparar la cantidad medida de MCAM entre las muestras medidas en (i);
(iii) encontrar una desviacion o ausencia de desviacion de la cantidad de MCAM entre las muestras comparadas en (ii);
(iv) atribuir dicha desviacion o ausencia de desviacion encontrada a un cambio en la disfuncion sistolica en el sujeto, entre dos o mas tiempos de medicion sucesivos.
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Las etapas anteriores se pueden aplicar, cambiando lo que se deba cambiar, a la disnea asociada o causada por la sobrecarga de volumen; a la IC o ICA asociada o causada por la sobrecarga de volumen; a la IC o ICA asociada o causada por la disfuncion sistolica; a la fraccion de eyeccion ventricular; o al estado de llenado cardiaco.
El seguimiento se puede aplicar en el transcurso de un tratamiento medico del sujeto.
En una realizacion de los metodos de prediccion, diagnostico, pronostico y/o seguimiento como se ensenan en la presente memoria, la sensibilidad y/o especificidad (y preferiblemente, la sensibilidad y especificidad) de los metodos es al menos 50%, al menos 60%, al menos 70% o al menos 80%, p. ej., > 81%, > 82%, > 83%, > 84%, > 85%, > 86%, o > 87%, o > 90% o > 95% (el sfmbolo " > " es sinonimo de las expresiones “al menos” o “igual o mas”), p. ej., entre 80% y 100%, o entre 81% y 95%, o entre 83% y 90%, o entre 84% y 89%, o entre 85% y 88%.
En otra realizacion de los metodos de prediccion, diagnostico, pronostico y/o seguimiento como se ensenan en la presente memoria, el sujeto puede presentar uno o mas smtomas y/o signos potencialmente indicativos de desequilibrio homeostatico de lfquidos, insuficiencia cardiaca aguda, insuficiencia cardiaca cronica, disfuncion sistolica o disfuncion o insuficiencia renal. Por ejemplo, en una realizacion el sujeto puede presentar disnea.
En una realizacion adicional de los metodos de prediccion, diagnostico, pronostico y/o seguimiento como se ensenan en la presente memoria, el sujeto puede presentar uno o mas factores de riesgo para las afecciones, smtomas y/o valores de parametros de acuerdo con la descripcion, tales como, por ejemplo, una predisposicion genetica o uno o mas factores de riesgo de desarrollo, medioambientales o conductuales, tales como p. ej., resistencia a la insulina (glucosa en sangre alterada), obesidad troncal, niveles altos en el suero de colesterol lipoprotemas de baja densidad (LDL), niveles bajos en el suero de colesterol lipoprotemas de alta densidad (HDL), niveles altos de trigliceridos en el suero y presion arterial alta (hipertension), infarto de miocardio previo, y/o una o mas comorbilidades tales como diabetes, enfermedad arterial coronaria, asma, EPOC y/o enfermedad renal cronica.
Por ejemplo, en pacientes que padecen llenado en exceso (sobrecarga de volumen) una disminucion del nivel de MCAM comparado con un nivel de MCAM previo (p. ej., en el momento del ingreso en el SU) indica que la afeccion del sujeto esta mejorando o ha mejorado, mientras que un aumento del nivel de MCAM comparado con un nivel de MCAM previo (p. ej., en el momento de ingreso en el SU) indica que la afeccion del sujeto ha empeorado o esta empeorando. Dicho empeoramiento podna dar como resultado posiblemente la recafda de las afecciones, smtomas y/o valores de parametros de acuerdo con la descripcion, tal como un nuevo suceso de insuficiencia cardiaca aguda.
En otro ejemplo, en pacientes que padecen llenado menor (contraccion de volumen), tal como por ejemplo pacientes en la unidad de cuidados intensivos, un aumento del nivel de MCAM comparado con un nivel de MCAm previo (p. ej., en el momento del ingreso en la UCI) indica que la afeccion del sujeto esta mejorando o ha mejorado, mientras que una disminucion del nivel de MCAM comparado con un nivel de MCAM previo (p. ej., en el momento de ingreso en la UCI) indica que la afeccion del sujeto ha empeorado o esta empeorando.
Por consiguiente, se proporciona ademas un metodo para el seguimiento de un cambio en la prediccion, diagnostico y/o pronostico de las afecciones, smtomas y/o valores de parametros de acuerdo con la descripcion en un sujeto, que comprende:
(i) aplicar el metodo de prediccion, diagnostico y/o pronostico como se ha ensenado antes en la presente memoria al sujeto en uno o mas tiempos de medicion sucesivos, de modo que se determina la prediccion, diagnostico y/o pronostico de las afecciones, smtomas y/o valores de parametros de acuerdo con la descripcion en el sujeto en dichos tiempos de medicion sucesivos;
(ii) comparar la prediccion, diagnostico y/o pronostico de las afecciones, smtomas y/o valores de parametros de acuerdo con la descripcion en el sujeto, en dichos tiempos de medicion sucesivos determinados en (i); y
(iii) encontrar la presencia o ausencia de un cambio entre la prediccion, diagnostico y/o pronostico de las afecciones, smtomas y/o valores de parametros de acuerdo con la descripcion en el sujeto en dichos tiempos de medicion sucesivos determinados en (i).
Este aspecto permite el seguimiento de la afeccion del sujeto a lo largo del tiempo. Esto puede permitir, entre otros, predecir la aparicion de las afecciones, smtomas y/o valores de parametros de acuerdo con la descripcion, o hacer el seguimiento en dicho sujeto del progreso de la enfermedad, agravamiento de la enfermedad o alivio, reaparicion de la enfermedad, respuesta al tratamiento, respuesta a otros factores externos e internos, afecciones o factores estresantes, etc. Ventajosamente, el cambio en la prediccion, diagnostico y/o pronostico en el sujeto se puede seguir en el transcurso de un tratamiento medico de dicho sujeto. Dicho seguimiento puede estar comprendido, por ejemplo, en tomar la decision de si a un paciente se le puede dar el alta, necesita un cambio de tratamiento o necesita mas hospitalizacion.
Debe apreciarse que en los presentes metodos de prediccion, diagnostico, pronostico y/o seguimiento, la medicion de la MCAM tambien se puede combinar con la evaluacion de uno o mas biomarcadores adicionales o parametros clmicos relevantes para las afecciones, smtomas y/o parametros de acuerdo con la descripcion.
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Por consiguiente, tambien se describen en la presente memoria metodos en donde la fase de examen de los metodos comprende ademas medir la presencia o ausencia y/o la cantidad de uno o mas de dichos otros biomarcadores en la muestra del sujeto. En relacion con esto, se podna usar cualquier marcador adecuado conocido o todavfa desconocido.
La disnea puede ser causada por la ICA, pero tambien esta presente en otros pacientes debido a causas distintas o no relacionadas con la ICA, tales como la EPOC o neumoma. Los metodos de diagnostico de acuerdo con la descripcion, funcionan particularmente bien en una poblacion de pacientes que muestra signos de disnea, que permiten el diagnostico espedfico de ICA basado en el nivel de MCAM. En una realizacion preferida de uno cualquiera de los metodos anteriores de la presente descripcion, el sujeto forma parte, por lo tanto, de una poblacion de pacientes que muestra signos de disnea.
En los metodos ensenados en la presente memoria, la cantidad de MCAM y/o la presencia o ausencia y/o la cantidad de uno o mas de otros biomarcadores se puede medir por cualquier tecnica adecuada, tales como las conocidas en la tecnica.
En una realizacion, la cantidad de MCAM y/o la presencia o ausencia y/o la cantidad de uno o mas de otros biomarcadores se pueden medir usando, respectivamente, un agente de union capaz de unirse espedficamente a la MCAM y/o a fragmentos de la misma, y un agente de union capaz de unirse espedficamente a dicho uno o mas de otros biomarcadores.
En una realizacion, el agente de union puede ser un anticuerpo, un aptamero, fotoaptamero, protema, peptido, peptidomimetico o una molecula pequena.
En una realizacion adicional, la cantidad de MCAM y/o la presencia o ausencia y/o la cantidad de uno o mas de otros biomarcadores se miden usando una tecnologfa de inmunoensayo, tales como tecnologfas de ELISA directo, ELISA indirecto, ELISA tipo sandwich, ELISA competitivo, ELISA multiplexado, radioinmunoensayo (RIA), ELISPOT, o usando un metodo de analisis de espectrometna de masas o usando un metodo de cromatograffa, o usando una combinacion de dichos metodos.
Otro aspecto describe el uso de un kit para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la ICA en un sujeto, comprendiendo el kit medios para medir la cantidad de MCAM en una muestra del sujeto.
Una realizacion proporciona el uso de un kit para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la ICA en el sujeto, comprendiendo el kit:
(i) medios para medir la cantidad de MCAM en una muestra del sujeto; y
(ii) un valor de referencia de la cantidad de MCAM o medios para establecer dicho valor de referencia, en donde dicho valor de referencia representa una prediccion, diagnostico y/o pronostico conocido de ICA.
El kit permite por lo tanto: medir la cantidad de MCAM en la muestra del sujeto por el medio (i); comparar la cantidad de MCAM medida por el medio (i) con un valor de referencia de (ii) o establecido por el medio (ii); encontrar una desviacion o ausencia de desviacion de la cantidad de MCAM medida por el medio (i) respecto al valor de referencia de (ii); y por consiguiente atribuir dicha desviacion o ausencia de desviacion encontrada a una prediccion, diagnostico y/o pronostico particular de ICA en el sujeto.
Una realizacion adicional proporciona el uso de un kit para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la ICA en un sujeto, comprendiendo el kit medios para medir la cantidad de MCAM en una muestra del sujeto y medios para medir la presencia o ausencia y/o la cantidad de uno o mas de otros biomarcadores utiles para predecir, diagnosticar y/o pronosticar ICA en la muestra del sujeto.
Una realizacion proporciona el uso de un kit para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la ICA en el sujeto, comprendiendo el kit:
(i) medios para medir la cantidad de MCAM en una muestra del sujeto;
(ii) medios para medir la presencia o ausencia y/o la cantidad de uno o mas de otros biomarcadores utiles para predecir, diagnosticar y/o pronosticar ICA en la muestra del sujeto;
(iii) opcionalmente, medios para establecer un perfil del sujeto de la cantidad de MCAM y la presencia o ausencia y/o la cantidad de uno o mas de otros biomarcadores; y
(iv) un perfil de referencia de la cantidad de MCAM y la presencia o ausencia y/o la cantidad de dichos uno o mas de otros biomarcadores, o medios para establecer dicho perfil de referencia, representando dicho perfil de referencia una prediccion, diagnostico y/o pronostico conocido de ICA.
Por lo tanto, dicho kit permite: medir la cantidad de MCAM y la presencia o ausencia y/o la cantidad de uno o mas de otros biomarcadores en la muestra del sujeto, respectivamente por los medios (i) y (ii); establecer (p. ej., usando
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medios incluidos en el kit o usando medios externos adecuados) un perfil del sujeto de la cantidad de MCAM y la presencia o ausencia y/o la cantidad de dichos uno o mas de otros biomarcadores basado en dichas mediciones; comparar el perfil del sujeto con el perfil de referencia de (iv) o establecido por los medios de (iv); encontrar una desviacion o ausencia de desviacion de dicho perfil del sujeto respecto a dicho perfil de referencia; y en consecuencia atribuir dicha desviacion o ausencia de desviacion encontrada a una prediccion, diagnostico y/o pronostico particular de ICA en el sujeto.
En una realizacion de los usos anteriores de los kits, dichos otros biomarcadores utiles para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la ICA se pueden seleccionar del grupo que consiste en el peptido natriuretico tipo B (BNP), propeptido natriuretico tipo B (proBNP), fragmento amino terminal del propeptido natriuretico tipo B (NTproBNP), y fragmentos de cualquiera de los mismos.
En una realizacion adicional de los usos anteriores de los kits, los medios para medir la cantidad de MCAM y/o la presencia o ausencia y/o la cantidad de uno o mas de otros biomarcadores pueden comprender, respectivamente, uno o mas agentes de union capaces de unirse espedficamente a la MCAM y/o a fragmentos de la misma, y uno o mas agentes de union capaces de unirse espedficamente a dicho uno o mas de otros biomarcadores.
En una realizacion, uno cualquiera de dichos uno o mas agentes de union puede ser un anticuerpo, un aptamero, fotoaptamero, protema, peptido, peptidomimetico o una molecula pequena.
En una realizacion, uno cualquiera de dichos uno o mas agentes de union puede estar ventajosamente inmovilizado sobre una fase o soporte solido.
En una realizacion adicional de los usos anteriores de los kits, los medios para medir la cantidad de MCAM y/o la presencia o ausencia y/o la cantidad de uno o mas de otros biomarcadores pueden usar una tecnologfa de inmunoensayo, tales como tecnologfas de ELISA directo, ELISA indirecto, ELISA tipo sandwich, ELISA competitivo, ELISA multiplexado, radioinmunoensayo (RIA), ELISPOT, o pueden usar una tecnologfa de analisis de espectrometna de masas o pueden usar una tecnologfa de cromatograffa, o pueden usar una combinacion de dichas tecnologfas.
Por lo tanto, una realizacion describe el uso de un kit para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la ICA que comprende:
(a) uno o mas agentes de union capaces de unirse espedficamente a la MCAM y/o a fragmentos de la misma;
(b) preferiblemente, una cantidad o concentracion conocida de MCAM y/o un fragmento de la misma (p. ej., para usar como controles, referencias y/o agentes de calibracion);
(c) preferiblemente, un valor de referencia de la cantidad de MCAM, o medios para establecer dicho valor de referencia.
Dichos componentes en (a) y/o (c) se pueden marcar de forma adecuada como se ensena en otra parte en esta memoria descriptiva.
Otra realizacion describe el uso de un kit para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la ICA que comprende:
(a) uno o mas agentes de union capaces de unirse espedficamente a la MCAM y/o a fragmentos de la misma;
(b) uno o mas agentes de union capaces de unirse espedficamente a uno o mas de otros biomarcadores utiles para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la ICA, preferiblemente en donde dichos otros biomarcadores se eligen del grupo que consiste en BNP, proBNP, NTproBNP y fragmentos de uno cualquiera de los mismos;
(c) preferiblemente, una cantidad o concentracion conocida de MCAM y/o un fragmento de la misma y una cantidad o concentracion conocida de dichos uno o mas de otros biomarcadores (p. ej., para usar como controles, patrones y/o agentes de calibracion);
(d) preferiblemente, un perfil de referencia de la cantidad de MCAM y la presencia o ausencia y/o la cantidad de dichos uno o mas de otros biomarcadores, o medios para establecer dichos perfiles de referencia.
Dichos componentes en (a), (b) y/o (c) se pueden marcar adecuadamente como se ensena en otra parte en esta memoria descriptiva.
Tambien se describen reactivos y herramientas utiles para medir la MCAM y opcionalmente uno o mas de otros biomarcadores relacionados con la ICA a los que se hace referencia en la presente memoria.
Por ejemplo, un aspecto adicional se refiere a una protema, polipeptido o matriz o micromatriz de peptidos que comprende
(a) MCAM y/o a fragmentos de la misma, preferiblemente, una cantidad o concentracion conocida de dicha MCAM
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y/o fragmento de la misma; y
(b) opcional y preferiblemente, uno o mas de otros biomarcadores utiles para prededr, diagnosticar y/o pronosticar la ICA, preferiblemente una cantidad o concentracion conocida de dichos uno o mas biomarcadores, y en donde dichos otros biomarcadores preferiblemente se eligen del grupo que consiste en: BNP, proBNP, NTproBNP y fragmentos de uno cualquiera de los mismos.
Otro aspecto se refiere a una matriz o micromatriz de agentes de union que comprende:
(a) uno o mas agentes de union capaces de unirse espedficamente a la MCAM y/o a fragmentos de la misma, preferiblemente, una cantidad o concentracion conocida de dichos agentes de union; y
(b) opcional y preferiblemente, uno o mas agentes de union capaces de unirse espedficamente a uno o mas de otros biomarcadores utiles para predecir, diagnosticar y/o pronosticar la ICA, preferiblemente una cantidad o concentracion conocida de dichos agentes de union, y preferiblemente en donde dichos otros biomarcadores preferiblemente se eligen del grupo que consiste en: BNP, proBNP, NTproBNP y fragmentos de uno cualquiera de los mismos.
Tambien se describen kits como se ha ensenado antes aqm, configurados como dispositivos portatiles, tales como, por ejemplo, dispositivos clfnicos, para usar en casa o en entornos clfnicos.
Por lo tanto, un aspecto relacionado proporciona un dispositivo de ensayo portatil capaz de medir la cantidad de MCAM en una muestra de un sujeto, que comprende:
(i) medios para obtener una muestra del sujeto,
(ii) medios para medir la cantidad de MCAM en dicha muestra, y
(iii) medios para visualizar la cantidad de MCAM medida en la muestra.
En una realizacion, los medios de las partes (ii) y (iii) pueden ser los mismos, proporcionando asf un dispositivo de ensayo portatil capaz de medir la cantidad de MCAM en una muestra de un sujeto, que comprende (i) medios para obtener una muestra del sujeto; y (ii) medios para medir la cantidad de MCAm en dicha muestra y visualizar la cantidad de MCAM medida en la muestra.
En una realizacion, dicho medio de visualizacion es capaz de indicar si la cantidad de MCAM en la muestra esta por encima o por debajo de un determinado nivel umbral y/o si la cantidad de MCAM en la muestra se desvfa o no de un valor de referencia de la cantidad de MCAM, representando dicho valor de referencia una prediccion, diagnostico y/o pronostico conocido de ICA (como se ensena en otra parte en esta solicitud). Por lo tanto, en una realizacion, el dispositivo de ensayo portatil puede comprender tambien de forma adecuada dicho valor de referencia o medios para establecer dichos valor de referencia.
En una realizacion, el nivel umbral se elige de modo que la cantidad de MCAM en la muestra por encima de dicho nivel umbral indica que el sujeto tiene o esta en riesgo de tener ICA o indica un mal pronostico para la ICA en el sujeto, y la cantidad de MCAM en la muestra por debajo de dicho nivel umbral indica que el sujeto no tiene o no esta en riesgo de tener ICA o indica un buen pronostico para la ICA en el sujeto.
En una realizacion, el dispositivo de ensayo portatil comprende un valor de referencia que representa la prediccion o diagnostico de ausencia de ICA o representa un buen pronostico para la ICA, o comprende medios para establecer dicho valor de referencia, y una cantidad elevada de MCAM en la muestra del sujeto comparada con dicho valor de referencia indica que el sujeto tiene o esta en riesgo de tener ICA o indica un mal pronostico para la ICA en el sujeto.
En otra realizacion, el dispositivo de ensayo portatil comprende un valor de referencia que representa la prediccion o diagnostico de ICA o representa un mal pronostico para la ICA, o comprende medios para establecer dicho valor de referencia, y una cantidad comparable de MCAM en la muestra del sujeto comparada con dicho valor de referencia indica que el sujeto tiene o esta en riesgo de tener ICA o indica un mal pronostico para la ICA en el sujeto.
En una realizacion adicional, los medios de medicion (y opcionalmente de visualizacion) del dispositivo de ensayo portatil pueden comprender un soporte solido que tiene un extremo proximal y distal, que comprende:
- una zona de aplicacion de la muestra en la proximidad del extremo proximal;
- una zona de reaccion distal a la zona de aplicacion de la muestra; y
- una zona de deteccion distal a la zona de reaccion;
- opcionalmente patrones de control que comprende la protema MCAM o fragmentos peptfdicos, en donde dicho soporte tiene una propiedad capilar que dirige un flujo de muestra fluida aplicado en la zona de aplicacion en una direccion desde el extremo proximal al extremo distal, y
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- opcionalmente comprende una fuente de fluido que mejora el flujo capilar de una muestra mas viscosa.
En una realizacion, la zona de reaccion puede comprender una o mas bandas de moleculas de union espedfica a la MCAM conjugadas con un agente de deteccion, cuyo conjugado de molecula de union espedfica a MCAM esta dispuesto en el soporte solido de modo que puede migrar con el flujo capilar de fluido;
y en donde la zona de deteccion comprende una o mas bandas de captura que comprenden una poblacion de moleculas espedficas de MCAM inmovilizadas sobre el soporte solido.
En una realizacion, la zona de reaccion puede comprender adicionalmente una o mas bandas de captura de moleculas de union espedfica a MCAM en una cantidad suficiente para prevenir que una cantidad umbral de conjugados de moleculas de union espedfica a MCAM migren a la zona de deteccion. En una realizacion alternativa, dicho dispositivo comprende adicionalmente medios para comparar la cantidad de conjugado de moleculas de union espedfica a MCAM capturado con un valor umbral.
La descripcion tambien proporciona un dispositivo de ensayo capaz de medir la cantidad de MCAM en una muestra de un sujeto que comprende:
(i) medios para medir la cantidad de MCAM en dicha muestra, y
(ii) medios para almacenar el valor de referencia en el dispositivo, y
(iii) medios de comparacion de la cantidad obtenida con el valor de referencia almacenado, y
(iv) medios para visualizar la cantidad de MCAM medida en la muestra.
En realizaciones preferidas de los kits y dispositivos de la presente descripcion, la deteccion de la protema MCAM se hace en una muestra de plasma, que implica que se detecta la protema MCAM circulante, independientemente de si esta forma en la circulacion corresponde o no a la forma soluble o a un producto de degradacion de la forma de longitud completa o soluble. En una realizacion preferida, la protema MCAM detectada por dichos kits o dispositivos no esta unida a membrana o a celula. Preferiblemente, el medio para detectar dicha protema MCAM o fragmento, es capaz de detectar tanto la protema de longitud completa, protema madura o como protema procesada o la forma de la misma circulante plasmatica. Mas preferiblemente, dicho medio para detectar la protema MCAM es reconocer espedficamente la forma circulante plasmatica de la MCAM como se define en la presente memoria.
Estos y otros aspectos y realizaciones preferidas se describen en las siguientes secciones y en las reivindicaciones adjuntas.
Breve descripcion de los dibujos
La figura 1 ilustra la secuencia de protema del biomarcador MCAM, tomada de NP_006491 (SEQ ID NO: 1). La protema se conoce como molecula de adhesion de celulas de melanoma (MCAM), o como MUC18 o CD146. El peptido senal y los dominios transmembrana y citoplasmatico estan indicados en letras minusculas. Tambien esta indicado el peptido cuantificado MASSterclass seleccionado (pept25 - negrilla, subrayado: SEQ ID NO: 2). Este peptido MASSterclass puede cuantificar tanto la forma de longitud completa como la soluble escindida de MCAM.
La figura 2 ilustra las secuencias de preproBNP y peptidos derivados: preproBNP (SEQ ID NO: 3), proBNP (SEO ID NO.4), NT-pro-BNP (SEQ ID NO: 5) y BNP madura (SEQ ID NO: 6).
La figura 3 ilustra que la MCAM muestra rendimiento comparable a los peptidos natriureticos tipo B en la diferenciacion de pacientes con ICA de los disneicos sin insuficiencia cardiaca aguda. La curva de eficacia diagnostica (caractensticas operativas del receptor) de BNP comparado con MCAM (A) y NT-proBNP comparado con MCAM (B) respectivamente para el diagnostico de la insuficiencia cardiaca causa de la disnea en el SU. En la tabla 1 mas adelante se dan la mediana del area bajo la curva (AUC) calculada e intervalos de confianza (IC) al 95%.
La figura 4 ilustra el valor complementario de MCAM y BNP y el impacto de combinar estas dos protemas marcadoras en la precision del diagnostico. Los niveles de BNP medidos por ELISA convencional se muestran en el eje X y los niveles de MCAM medidos por MASSterclass se representan en el eje Y. Tambien se muestran el punto de corte mejor calculado para la MCAM (lmea horizontal) y los puntos de corte usados habitualmente para la BNP (dos lmeas verticales que abarcan la “zona gris”). La precision calculada para los marcadores independientes y la combinacion de ambos marcadores se dan en la tabla 2 mas adelante.
La figura 5 ilustra los niveles de MCAM (A) y BNP (B) medidos en pacientes con ICA en el ingreso y en los mismos pacientes en el alta del hospital. La grafica superior muestra valores sin procesar medidos por MASSterclass o ELISA, mientras que la grafica inferior muestra valores normalizados que son el numero de veces de cambio entre el ingreso y el alta.
Figura 6: Vista plana (A) y lateral (B) de una tira de ensayo de acuerdo con la descripcion.
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Figura 7: Vista plana de un cartucho de ensayo de acuerdo con la descripcion.
Las figuras 8 A-B muestran una vista lateral y una vista superior, respectivamente, de una tira reactiva de acuerdo con la descripcion, que comprende varias almohadillas de ensayo.
Figura 9: ilustra en graficas de caja y bigotes la correlacion entre la ganancia de peso y los niveles de MCAM en pacientes con ICA en el ingreso.
Figura 10: ilustra en graficas de caja y bigotes la correlacion entre la FEVI y niveles de MCAM en pacientes con ICA en el ingreso.
Descripcion detallada de la invencion
Como se usa en la presente memoria, las formas singulares “un”, “una” y “el”, “la” incluyen tanto las referencias singulares como plurales, salvo que el contexto indique claramente otra cosa.
Los terminos “que comprende”, “comprende” y “compuesto de” como se usan en la presente memoria, son sinonimos con “que incluye”, “incluye” o “que contiene”, “contiene”, y son inclusivos o no limitados y no excluyen miembros, elementos o etapas del metodo adicionales no citados.
La cita de intervalos numericos y puntos finales incluye todos los numeros y fracciones abarcados dentro de los respectivos intervalos, asf como los puntos finales citados.
El termino “aproximadamente” como se usa en la presente memoria cuando se refiere a un valor medible tal como un parametro, una cantidad, una duracion de tiempo, y similares, se entiende que abarca variaciones de y desde el valor especificado, en particular variaciones de +/-10% o menos, preferiblemente +/-5% o menos, mas preferiblemente +/-1% o menos, y todavfa mas preferiblemente +/-0,1% o menos de y desde el valor especificado, siempre que dichas variaciones sean adecuadas para la realizacion en la descripcion. Debe entenderse que el valor al cual se refiere el modificador “aproximadamente” se describe el mismo tambien espedfica y preferiblemente.
Salvo que se especifique otra cosa, todos los terminos usados en esta descripcion, incluyendo terminos tecnicos y cientfficos, tienen el significado entendido habitualmente por un experto en la tecnica a la que pertenece esta descripcion. Como grna adicional, las definiciones de terminos pueden estar incluidas para apreciar mejor la ensenanza de la presente descripcion.
La presente invencion deriva del entendimiento muy innovador de los autores de la invencion de que la MCAM es un biomarcador valioso para la insuficiencia cardiaca (aguda), en particular como un biomarcador para la disfuncion sistolica como una causa subyacente de la insuficiencia cardiaca (aguda), incluyendo los parametros asociados a la disfuncion sistolica tales como la fraccion de eyeccion (FE) y el volumen y presion de llenado cardiaco.
El termino “biomarcador” esta extendido en la tecnica y puede indicar de forma amplia una molecula biologica y/o una parte detectable de la misma cuya evaluacion cualitativa y/o cuantitativa en un sujeto es predictiva o informativa (p. ej., prediccion, diagnostico y/o pronostico) con respecto a uno o mas aspectos del fenotipo y/o genotipo del sujeto, tales como, por ejemplo, con respecto al estado del sujeto respecto a una enfermedad o afeccion dada.
Las expresiones “insuficiencia cardiaca”, “insuficiencia cardiaca aguda” e “insuficiencia cardiaca cronica” como se usan en la presente memoria, llevan sus respectivos significados establecidos en la tecnica. Como grna adicional, la expresion “insuficiencia cardiaca” como se usa de forma amplia en la presente memoria se refiere a afecciones patologicas caracterizadas por la velocidad del flujo sangumeo diastolico o sistolico alterada y por lo tanto insuficiente flujo de sangre desde el ventnculo a los organos perifericos. En realizaciones preferidas de la invencion, la ICA esta asociada a la disfuncion sistolica, preferiblemente caracterizada por una disminucion de la fraccion de eyeccion ventricular izquierda (FEVI), preferiblemente en donde dicha FEVI es menor que 55% o menor que 50% o menor que 45% y/o por presion de llenado cardiaco aumentada.
La “insuficiencia cardiaca aguda” o denominada tambien “insuficiencia cardiaca aguda descompensada”, se pueden definir como el inicio rapido de smtomas y signos secundarios a la funcion cardiaca anomala, que da como resultado la necesidad de tratamiento urgente. La ICA puede presentarse aguda desde el principio (aparicion nueva de insuficiencia cardiaca aguda en un paciente sin disfuncion cardiaca previamente conocida) o como descompensacion aguda de la ICC.
La disfuncion cardiaca puede estar relacionada con la disfuncion sistolica o diastolica, las anomalfas en la frecuencia cardiaca, o con la carga previa y carga posterior desajustadas. A menudo es potencialmente mortal y requiere tratamiento urgente. De acuerdo con la clasificacion establecida, la ICA incluye varias afecciones clmicas distintas de pacientes que presentan: (I) insuficiencia cardiaca congestiva aguda descompensada, (II) ICA con hipertension/crisis hipertensiva, (III) ICA con edema pulmonar, (IVa) choque cardiogenico/smdrome de capacidad baja, (IVb) choque cardiogenico grave, (V) insuficiencia de alto gasto, y (VI) insuficiencia cardiaca aguda del lado derecho. Para la descripcion clmica detallada, clasificacion y diagnostico de ICA, y para el resumen de sistemas de clasificacion de ICA adicionales incluyendo la clasificacion de Killip, la clasificacion de Forrester y la clasificacion de
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“gravedad clmica”, se hace referencia entre otros a Nieminen et al. 2005 ("Executive summary of the guidelines on the diagnosis and treatment of acute heart failure: the Task Force on Acute Heart Failure of the European Society of Cardiology". Eur Heart J 26: 384-416) y referencias en el mismo. Preferiblemente, dicha disfuncion cardiaca es disfuncion sistolica, mas preferiblemente caracterizada por una disminucion de la fraccion de eyeccion ventricular izquierda (FEVI), preferiblemente en donde dicha FEVI es menor que 55% o menor que 50% o menor que 45%, y/o por aumento de la presion de llenado cardiaco.
La expresion “disfuncion sistolica” como se usa en la presente memoria lleva su significado establecido en la tecnica. Como grna adicional, la expresion “disfuncion sistolica” se puede usar de forma intercambiable con expresiones sinonimas conocidas por el experto en la tecnica, tales como “insuficiencia o disfuncion ventricular sistolica” o “insuficiencia o disfuncion cardiaca sistolica”. Esencialmente, la “disfuncion sistolica” se refiere a una insuficiencia de la funcion de bombeo del corazon, debido a una menor contractilidad del ventnculo.
La expresion “disfuncion diastolica” como se usa en la presente memoria lleva su significado establecido en la tecnica. Como grna adicional, la expresion “disfuncion diastolica” se puede usar de forma intercambiable con expresiones sinonimas conocidas por el experto en la tecnica, tales como “insuficiencia o disfuncion ventricular diastolica” o “insuficiencia o disfuncion cardiaca diastolica”. Esencialmente, la “disfuncion diastolica” se refiere a una insuficiencia de la funcion de bombeo del corazon, debido al llenado ventricular alterado.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “fraccion de eyeccion ventricular (izquierda)” significa el gasto del ventnculo (izquierdo) durante la sfstole, y representa la fraccion de sangre bombeada fuera de un ventnculo (izquierdo) con cada latido del corazon. Por definicion, el volumen de sangre dentro de un ventnculo inmediatamente antes de una contraccion se conoce como volumen diastolico final. Igualmente, el volumen de sangre que queda en un ventnculo al final de una contraccion es el volumen sistolico final. La diferencia entre los volumenes diastolico final y sistolico final es el volumen sistolico, el volumen de sangre eyectado con cada latido. La fraccion de eyeccion (FE) es la fraccion del volumen diastolico final que es eyectado con cada latido; es decir, es el volumen sistolico (VS) dividido entre el volumen diastolico final (VDF): FE = VS/VDF = (VDF-VSF)/VDF.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “presion de llenado cardiaco” se refiere a la presion con la que el ventnculo se llena con sangre. Las presiones de llenado cardiaco se controlan para calcular los volumenes de llenado cardiaco que, a su vez, determina los volumenes sistolicos de los ventnculos izquierdo y derecho. Como se usa en la presente memoria, la presion de llenado cardiaco es una representacion de la presion diastolica final ventricular izquierda. Se conocen en la tecnica metodos para determinar o calcular la presion de llenado cardiaco e incluyen mediciones por ultrasonidos (ecocardiograffa) y Doppler, asf como la medicion directa por cateterismo del ventnculo. La presion de llenado cardiaco se puede calcular indirectamente por la medicion de la presion auricular izquierda, presion venosa central o presion de la arteria pulmonar o presion capilar.
La expresion “acumulacion de lfquidos” como se usa en la presente memoria significa un aumento de lfquido corporal en un sujeto. Como tal, la acumulacion de lfquidos esta asociada con la retencion de lfquidos. La acumulacion de lfquidos puede estar causada, entre otros, por ejemplo por insuficiencia cardiaca (aguda), en particular debido a la disfuncion sistolica o disfuncion o insuficiencia renal, en particular una disfuncion que previene o interfiere de otra forma con la secrecion normal de lfquidos en un sujeto, tal como el smdrome nefrotico. Las caractensticas de acumulacion de lfquidos incluyen un aumento de volumen de llenado vascular (o expansion de volumen vascular) y un aumento de la presion de llenado vascular. Como se usa en la presente memoria, el “estado de llenado” o “carga de lfquido” se refiere al contenido de lfquido en un sujeto, en particular al contenido de lfquido vascular, tisular e intersticial. Como se usa en la presente memoria, el “volumen de llenado vascular” se refiere a la cantidad o volumen de lfquidos en la vasculatura. Como se usa en la presente memoria, la “presion de llenado vascular” se refiere a la presion que es generada por la cantidad o volumen de lfquidos en la vasculatura. Como se usa en la presente memoria, las expresiones “volumen de llenado vascular” y “presion de llenado vascular” se pueden usar de forma intercambiable. Los smtomas de la acumulacion de lfquidos en general y un aumento de volumen y/o presion de llenado vascular incluyen edema. Como se usa en la presente memoria, “edema” se refiere a la acumulacion o retencion de lfquidos extravasculares, causada por un aumento de volumen o presion de llenado vascular. De acuerdo con la invencion, la acumulacion de Kquidos, un aumento de volumen y/o presion de llenado vascular y el edema, pueden ser causados por la insuficiencia cardiaca (aguda), disfuncion sistolica, disfuncion renal o cualquier mecanismo fisiopatologico conocido en la tecnica que produzca dicho desequilibrio de lfquidos u homeostasis de lfquidos anomala.
La expresion “insuficiencia cardiaca cronica” (ICC) se refiere en general a un caso de insuficiencia cardiaca que progresa tan lentamente que trabajan varios mecanismos compensatorios para llevar la enfermedad al equilibrio. Los smtomas clmicos comunes de la ICC incluyen, entre otros, uno cualquiera o mas de dificultad respiratoria, capacidad de ejercicio disminuida, fatiga, letargo y edema periferico. Otros smtomas menos comunes incluyen uno o mas de palpitaciones, alteraciones de la memoria o sueno y confusion, y normalmente ocurren simultaneamente con uno o mas de los smtomas comunes citados antes.
En estudios tales como el presente, la poblacion de ICC puede diferir de la poblacion de ICA en cuanto que los pacientes de ICC no tienen una descompensacion aguda y por lo tanto no se presentan en el SU en el momento en el que se toma la muestra en dicho estudio o investigacion. Sin embargo, los pacientes con insuficiencia cardiaca
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cronica pueden tener descompensacion facilmente conduciendo a la “insuficiencia cardiaca aguda”.
En estudios tales como el presente, una poblacion de pacientes disneicos sin insuficiencia cardiaca puede comprender por ejemplo, pacientes que en el SU presentan smtomas similares a la poblacion con ICA pero donde la causa de la disnea no esta relacionada con la insuficiencia cardiaca aguda descompensada. Los ejemplos tfpicos son pacientes con EPOC o neumoma. Dichos pacientes pueden o no tener antecedentes de insuficiencia cardiaca subyacente, que pueden complicar en particular el diagnostico final usando medios de diagnostico convencionales tales como las mediciones de BNP o NT-pro-BNP.
Los terminos “predecir” o “prediccion”, “diagnosticar” o “diagnostico” y “pronosticar” o “pronostico” son comunes y estan bien entendidos en la practica medica y clmica. Como explicacion adicional y sin limitacion, “predecir” o “prediccion” en general se refiere a una declaracion de avance, indicacion o anticipacion de una enfermedad o afeccion en un sujeto al que (todavfa) no se le ha dicho dicha enfermedad o afeccion. Por ejemplo, una prediccion de una enfermedad o afeccion en un sujeto puede indicar una probabilidad, posibilidad o riesgo de que el sujeto desarrolle dicha enfermedad o afeccion, por ejemplo, en un determinado periodo de tiempo o a una determinada edad. Dicha probabilidad, posibilidad o riesgo puede estar indicada, entre otros, como un valor absoluto, intervalo o estadfstica, o puede estar indicado con respecto a una poblacion de sujetos o sujeto de control adecuado (tal como, p. ej., con respecto a una poblacion de sujetos o sujeto en general, normal o sano). Por lo tanto, la probabilidad, posibilidad o riesgo de que un sujeto desarrolle una enfermedad o afeccion puede estar ventajosamente indicada como un aumento o disminucion, o como un numero de veces de aumento o numero de veces de disminucion con respecto a una poblacion de sujetos o sujeto de control adecuado.
Como se usa en la presente memoria, la expresion “prediccion de la ICA” en un sujeto puede significar en particular que el sujeto tiene una prediccion “positiva” de la iCa, es decir, que el sujeto tiene riesgo de tener ICA (p. ej., el riesgo es significativamente mayor frente a una poblacion de sujetos o sujeto de control adecuado). La expresion “prediccion de ausencia de ICA” en un sujeto puede significar en particular que el sujeto tiene una prediccion “negativa” de la ICA, es decir, que el riesgo del sujeto de tener ICA no es significativamente mayor frente a una poblacion de sujetos o sujeto de control adecuado.
Los terminos “diagnosticar” o “diagnostico” se refieren en general al proceso o acto de reconocer, decidir sobre o concluir sobre una enfermedad o afeccion en un sujeto, basandose en los smtomas y/o signos y/o resultados de diferentes procedimientos de diagnostico (tales como, por ejemplo, de conocer la presencia, ausencia y/o cantidad de uno o mas biomarcadores caractensticos de la enfermedad o afeccion diagnosticados).
Como se usa en la presente memoria, el “diagnostico de ICA” en un sujeto puede significar en particular que el sujeto tiene ICA, por lo tanto, se le diagnostica que tiene ICA. El “diagnostico de ausencia de ICA” en un sujeto puede significar en particular que el sujeto no tiene ICA, por lo tanto, se le diagnostica que no tiene ICA. Se puede diagnosticar a un sujeto, como se ensena en la presente memoria, que no tiene ICA, a pesar de presentar uno o mas smtomas o signos convencionales reminiscentes de la ICA.
Los terminos “pronosticar” y “pronostico” en general se refieren a una anticipacion del progreso de una enfermedad o afeccion y la perspectiva (p. ej., la probabilidad, duracion y/o extension) de recuperacion.
Un buen pronostico de ICA en general puede abarcar la anticipacion de una recuperacion parcial o completa satisfactoria de la ICA, preferiblemente dentro de un periodo de tiempo aceptable. Un buen pronostico de ICA puede abarcar mas habitualmente la anticipacion de no empeoramiento o agravamiento adicional de la afeccion de insuficiencia cardiaca, preferiblemente dentro de un periodo de tiempo dado.
Un pronostico malo de ICA en general puede abarcar la anticipacion de una recuperacion deficiente y/o recuperacion insatisfactoriamente lenta, o sustancialmente no recuperacion o incluso mas empeoramiento de la ICA.
Los diferentes aspectos y realizaciones ensenados en la presente memoria se pueden basar en la medicion de la cantidad de MCAM, y opcionalmente la medicion de la presencia o ausencia y/o cantidad de uno o mas de otros biomarcadores relevantes, tales como preferiblemente BNP, proBNP, NTproBNP y/o fragmentos de uno cualquiera de los mismos, en una muestra de un sujeto.
El termino “sujeto” o “paciente” como se usa en la presente memoria, tfpicamente indica seres humanos, pero puede abarcar tambien la referencia a animales no humanos, preferiblemente animales de sangre caliente, mas preferiblemente mairnferos, tales como, p. ej., primates no humanos, roedores, caninos, felinos, equinos, ovinos, porcinos y similares.
Los terminos “muestra” o “muestra biologica” como se usan en la presente memoria, incluyen cualquier muestra biologica obtenida de un sujeto. Las muestras pueden incluir, sin limitacion, sangre entera, plasma, suero, globulos rojos, globulos blancos (p. ej., celulas mononucleares de sangre periferica), saliva, orina, excrementos (es decir, las heces), lagrimas, sudor, sebo, aspirado de pezon, lavado ductal, exudados tumorales, lfquido sinovial, lfquido cefalorraqrndeo, linfa, aspirado con aguja fina, lfquido amniotico, cualquier otro lfquido corporal, lisados celulares, productos de secrecion celulares, lfquidos de inflamacion, semen y secreciones vaginales. Las muestras preferidas pueden incluir las que comprenden MCAM en cantidades detectables. En realizaciones preferidas, la muestra puede
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ser sangre entera o un componente fraccional de la misma tal como, p. ej., plasma, suero o un sedimento celular. Preferiblemente, la muestra se puede obtener facilmente por metodos invasivos mmimos. Las muestras tambien pueden incluir muestras de tejido y biopsias, homogeneizados de tejidos y similares. Preferiblemente, la muestra usada para detectar los niveles de MCAM es plasma sangumeo. El termino “plasma” define el lfquido acuoso incoloro de la sangre que no contiene celulas, pero en el que se suspenden las celulas (eritrocitos, leucocitos, trombocitos, etc.), que contienen nutrientes, azucares, protemas, minerales, enzimas, etc.
Una molecula o analito tal como una protema, polipeptido o peptido o un grupo de dos o mas moleculas o analitos tales como dos o mas protemas, polipeptidos o peptidos, se “miden” en una muestra cuando la presencia o ausencia y/o cantidad de dicha molecula o analito o dicho grupo de moleculas o analitos, se detecta o determina en la muestra, preferiblemente sustancialmente con la exclusion de otras moleculas y analitos.
Los terminos “cantidad” y “nivel” son sinonimos y en general estan bien entendidos en la tecnica. Los terminos usados en la presente memoria pueden referirse en particular a una cuantificacion absoluta de una molecula o un analito en una muestra, o a una cuantificacion relativa de una molecula o analito en una muestra, es decir, con respecto a otro valor tal como con respecto a un valor de referencia, como se ensena en la presente memoria, o a un intervalo de valores que indican una expresion base del biomarcador. Estos valores o intervalos se pueden obtener de un solo paciente o de un grupo de pacientes.
Una cantidad absoluta de una molecula o analito en una muestra se puede expresar ventajosamente como una cantidad en peso o molar, o mas habitualmente como una concentracion, p. ej. peso por volumen o mol por volumen.
Una cantidad relativa de una molecula o analito en una muestra se puede expresar ventajosamente como un aumento o disminucion o como un numero de veces de aumento o disminucion con respecto a dicho otro valor, tal como con respecto a un valor de referencia, como se ensena en la presente memoria. Llevar a cabo una comparacion relativa entre el primer y el segundo parametro (p. ej., primera y segunda cantidades) puede, pero no es necesario, requerir determinar primero los valores absolutos de dichos primer y segundo parametro. Por ejemplo, un metodo de medicion puede producir lecturas cuantificables (tales como, p. ej., intensidades de senales) para dichos primer y segundo parametros, en donde dichas lecturas son una funcion del valor de dichos parametros, y en donde dichas lecturas se pueden comparar directamente para producir un valor relativo para el primer parametro frente al segundo parametro, sin la necesidad real de convertir primero las lecturas en valores absolutos de los respectivos parametros.
Como se usa en la presente memoria, el termino “MCAM” corresponde a la protema normalmente conocida como molecula de adhesion de celulas de melanoma (MCAM), MUC18 o CD146, es decir, las protemas y polipeptidos normalmente conocidas bajo estas designaciones en la tecnica. Los terminos abarcan dichas protemas y polipeptidos de cualquier organismo donde se encuentren, y en particular de animales, preferiblemente vertebrados, mas preferiblemente mairnferos, incluyendo seres humanos y marnfferos no humanos, incluso mas preferiblemente de seres humanos. Los terminos abarcan en particular dichas protemas y polipeptidos con una secuencia natural, es decir, aquellos cuya secuencia primaria es la misma que la de la MCAM encontrada en u obtenida de la naturaleza. Un experto en la tecnica entiende que las secuencias naturales de MCAM pueden diferir entre diferentes especies debido a divergencia genetica entre dichas especies. Ademas, las secuencias naturales de MCAM pueden diferir entre o en diferentes individuos de la misma especie, debido a la diversidad (variacion) genetica normal dentro de una especie dada. Tambien, las secuencias naturales de MCAM pueden diferir entre o incluso en individuos diferentes de la misma especie debido a modificaciones postranscripcionales y postraduccionales. Por consiguiente, todas las secuencias de MCAM encontradas en u obtenidas en la naturaleza se consideran “naturales”. Los terminos abarcan protemas y polipeptidos de MCAM cuando forman una parte de un organismo vivo, organo, tejido o celula, cuando forman una parte de una muestra biologica, asf como cuando al menos se afslan parcialmente de dichas fuentes. Los terminos tambien abarcan protemas y polipeptidos cuando son producidos por medios recombinantes o sinteticos.
Las MCAM de ejemplo incluyen, sin limitacion, MCAM humana que tiene la secuencia de aminoacidos primaria como esta anotada en el numero de acceso en Uniprot/Swissprot (
http://www.expasy.org/) NP 006491 como se muestra en la Fig. 1 (SEQ ID NO: 1). Un experto en la tecnica tambien puede apreciar que dichas secuencias son del precursor de MCAM y pueden incluir partes que son separadas por procesado de la MCAM madura. Por ejemplo, la protema MCAM puede estar en una forma soluble o puede estar unida a la membrana celular. En la figura 1, el peptido senal y los dominios transmembrana y citoplasmatico estan indicados en letras minusculas en la secuencia de aminoacidos. Tambien esta indicado el peptido cuantificado MASSterclass seleccionado (pept25 - negrilla, subrayado: SEQ ID NO: 2). Este peptido MASSterclass puede cuantificar tanto la forma de longitud completa como la soluble escindida de MCAm, aunque debido a la configuracion experimental solo se mide la fraccion que circula en el plasma (es decir, la fraccion no unida a celulas).
La protema MCAM es espedfica para celulas endoteliales y celulas musculares lisas vasculares y se ha usado como una herramienta para la separacion de celulas endoteliales de una poblacion de celulas sangumeas, basado en la forma unida a membrana de CD146. La MCAM pertenece a la superfamilia de genes de inmunoglobulina con 5 dominios de tipo inmunoglobulina (V-V-C2-C2-C2), una region transmembrana y una cola citoplasmatica de 63
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restos. Es una glicoprotema de membrana que funciona como una molecula de adhesion celular independiente del Ca2+ implicada en interacciones heterofilas de celula a celula. La protema tiene un tamano molecular de 130 kDa en su forma reducida (118 kDa no reducida) y cantidades de glicosilacion unidas a N para el 50 por ciento del peso molecular aparente. La CD146 soluble es liberada por derramamiento de ectodominio (por la accion de MMP). Se observo un aumento de los niveles plasmaticos de CD146 soluble en pacientes con insuficiencia renal cronica (niveles saludables en el suero: ~270 ng/ml; pacientes con insuficiencia renal: ~500ng/ml) como se describe en Saito et al., 2008 (Clin Exp Nephrol., febrero de 2008;12(1):58-64. Epub 5 de enero de 2008). Por otra parte, se observaron niveles en el suero menores de sCD146 (CD146 soluble) en pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (EII) tal como enfermedad de Crohn, mientras que la expresion de CD146 unido a membrana es mayor en la EII activa (Bardin et al., Inflamm. Bowel Dis., enero de 2006;12(1):16-21 y Reumaux et al., Inflamm. Bowel Dis., octubre de 2007;13(10):1315-7). Las ultimas dos publicaciones indican que hay una clara diferencia en la correlacion entre la afeccion del paciente y los niveles de 1) la MCAM soluble, y 2) la o las formas unidas a celula o membrana de la MCAM. En una realizacion preferida de los metodos, kits y dispositivos de la presente invencion como se describen en la presente memoria, se detecta la protema MCAM circulante, p. ej., la forma que circula en el plasma sangumeo, en oposicion a la protema MCAM unida a membrana o celula (p. ej., la MCAM presente en la superficie de celulas endoteliales).
La MCAM se ha conocido como un marcador de dano celular endotelial, pero no se ha mostrado que sean util para distinguir pacientes con ICA y con disnea sin ICA. Ademas, el marcador MCAM a menudo se usa como una herramienta para la separacion de celulas endoteliales, que implica que se usa la protema (de longitud completa) unida a membrana (vease, p. ej., el documento WO2006/020936).
La referencia en la presente memoria a la MCAM tambien abarca fragmentos de MCAM. Por lo tanto, la referencia en la presente memoria a la medicion de la MCAM, o la medicion de la cantidad de MCAM, puede abarcar medir la protema o polipeptido MCAM, tal como, p. ej., medir la madurez y/o la forma soluble procesada por MMP (llamada de forma abreviada “forma soluble” en lo sucesivo) de MCAM y/o medir uno o mas fragmentos de la misma. Por ejemplo, la MCAM y/o uno o mas fragmentos de la misma se pueden medir de forma colectiva, de modo que la cantidad medida corresponda a la suma de las cantidades de las especies medidas de forma colectiva. En otro ejemplo, la MCAM y/o uno o mas fragmentos de la misma se pueden medir cada uno individualmente. Preferiblemente, dicho fragmento de MCAM es una forma de MCAM circulante en el plasma.
La expresion “forma circulante en el plasma de MCAM” o de forma abreviada “forma circulante” abarca todas las protemas de MCAM o fragmentos de la misma que circulan en el plasma, es decir, no estan unidas a celula o membrana. Sin querer estar ligados por ninguna teona, dichas formas circulantes se pueden obtener de la protema MCAM de longitud completa por procesamiento natural (p. ej., escision por MMP en su “forma soluble” como se ha indicado antes), o pueden ser resultado de procesos de degradacion conocidos que ocurren en dicha muestra. En algunas situaciones, la forma circulante tambien puede ser la protema MCAM de longitud completa, que se encuentra que esta circulando en el plasma. Dicha “forma circulante” puede ser, por lo tanto, cualquier protema de MCAM o cualquier forma soluble procesada de MCAM o fragmentos de cualquiera de ellos, que estan circulando en la muestra, es decir, no esta unida a fraccion de celula o membrana de dicha muestra.
Como se usan en la presente memoria, las expresiones “propeptido natriuretico tipo B” (tambien abreviado como “proBNP”) y “fragmento amino terminal del propeptido natriuretico tipo B” (tambien abreviado como “NTproBNP”) y “peptido natriuretico tipo B” (tambien abreviado como “BNP”), se refieren a peptidos habitualmente conocidos con estas designaciones en la tecnica. Como explicacion adicional y sin limitacion, proBNP, NTproBNP y BNP in vivo, derivan de la preprotema precursora del peptido natriuretico B (preproBNP). En particular, el peptido proBNP corresponde a la parte de preproBNP despues de eliminacion de la secuencia (lfder) de la senal de secrecion N- terminal de preproBNP. NTproBNP corresponde a la parte N-terminal y BNP corresponde a la parte C-terminal del peptido proBNP despues de escision del ultimo adyacente C-terminal al aminoacido 76 de proBNP. Los terminos abarcan dichos peptidos de cualquier organismo en los que se encuentren, y en particular de animales, preferiblemente vertebrados, mas preferiblemente mairnferos, incluyendo seres humanos y mairnferos no humanos, incluso mas preferiblemente de seres humanos.
Las designaciones proBNP, NTproBNP y BNP, como se usan en la presente memoria, se refieren en particular a dichos peptidos con una secuencia natural, es decir, peptidos en los que la secuencia primaria es la misma que la de los respectivos proBNP, NTproBNP o BNP encontrados en u obtenidos de la naturaleza. Un experto en la tecnica entiende que las secuencias naturales de proBNP, NTproBNP o BNP pueden diferir entre diferentes especies debido a la divergencia genetica entre dichas especies. Ademas, las secuencias nativas de proBNP, NTproBNP o BNP pueden diferir entre o incluso en individuos diferentes de la misma especie debido a la diversidad (variacion) genetica normal en una especie dada. Ademas, las secuencias naturales de proBNP, NTproBNP o BNP pueden diferir entre o incluso en diferentes individuos de la misma especie debido a modificaciones postranscripcionales o postraduccionales. Por consiguiente, todas las secuencias proBNP, NTproBNP o BNP encontradas en u obtenidas de la naturaleza se consideran “naturales”.
Las designaciones proBNP, NTproBNP o BNP, como se usan en la presente memoria, abarcan los respectivos peptidos cuando forman parte de un organismo vivo, organo, tejido o celula, cuando forman una parte de una muestra biologica, asf como cuando se afslan al menos parcialmente de dichas fuentes. Los terminos tambien
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abarcan los respectivos peptidos cuando son producidos por medios recombinantes o sinteticos.
El peptido proBNP humano de ejemplo incluye, sin limitacion, el peptido desde la posicion de aminoacido 27 a la posicion 134 de la secuencia de la preprotema del precursor de peptido natriuretico B, como esta anotado con el numero de acceso en NIH Entrez Protein (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?db=protein) NP_002512 (version NP_002512.1 revisado el 25 de enero, 2009).
La secuencia NP_002512 se muestra en la figura 3A(SEQ ID NO: 3) y la secuencia de ejemplo de proBNP de NP_002512 se muestra en la figura 3B (SEQ ID NO: 4). El peptido NTproBNP humano de ejemplo, incluye sin limitacion el peptido desde la posicion de aminoacido 27 a la posicion 102 de la secuencia de la preprotema del precursor de peptido natriuretico B, como esta anotado en dicho numero de acceso en NIH Entrez Protein NP_002512. La secuencia de ejemplo de NTproBNP de NP_002512 se muestra en la figura 3C (SEQ ID NO: 5). El peptido BNP humano de ejemplo incluye, sin limitacion, el peptido desde la posicion de aminoacido 103 a la posicion 134 de la secuencia de la preprotema del precursor de peptido natriuretico B como esta anotado con dicho numero de acceso en NIH Entrez Protein NP_002512. La secuencia de ejemplo de BNP de NP_002512 se muestra en la figura 3D (SEQ ID NO: 6). Vease tambien Sudoh et al. 1989 (Biochem Biophys Res Commun 159: 1427-1434) para mas ilustracion de los peptidos derivados de preproBNP humanos, incluyendo proBNP, NTproBNP y BNP. Vease tambien Maisel et al. 2008 (Eur J Heart Fail 10(9): 824-39) y Miller et al. 2007 (Biomarkers Med 1(4): 503-512) en el uso de niveles de peptido natriuretico en la practica clinica.
La referencia en la presente memoria a proBNP, NTproBNP y/o BNP tambien puede abarcar fragmentos de uno cualquiera de proBNP, NTproBNP y/o BNP. Por lo tanto, la referencia en la presente memoria a la medicion de la presencia o ausencia y/o cantidad de proBNP, NTproBNP y/o BNP, puede abarcar la medicion de los peptidos proBNP, NTproBNP y/o BNP, y/o la medicion de uno o mas fragmentos de uno cualquiera de los peptidos proBNP, NTproBNP y/o BNP. Por ejemplo, los peptidos proBNP, NTproBNP y/o BNP y/o uno o mas fragmentos de uno cualquiera de los mismos, se pueden medir de forma colectiva, de modo que la cantidad medida corresponde a la suma de las cantidades de las especies medidas de forma colectiva. En otro ejemplo, los peptidos proBNP, NTproBNP y/o BNP y/o uno o mas fragmentos de uno cualquiera de los mismos, se pueden medir cada uno individualmente.
Ademas, salvo que sea evidente por el contexto, la referencia en la presente memoria a cualquier protema, polipeptido o peptido (tal como, p. ej., MCAM, proBNP, NTproBNP o BNP) y fragmentos de los mismos, en general puede abarcar formas modificadas de dicha protema, polipeptido o peptido y fragmentos, tales como las que llevan modificaciones posteriores a la expresion que incluyen, por ejemplo, fosforilacion, glicosilacion, lipidacion, metilacion, cisteinilacion, sulfonacion, glutationilacion, acetilacion, oxdiacion de metionina a sulfoxido de metionina o metionina- sulfona, y similares.
En una realizacion, la MCAM y fragmentos de la misma, o proBNP, NTproBNP, BNP y fragmentos de los mismos, pueden ser humanos, es decir, su secuencia primaria puede ser la misma que una que corresponda a la secuencia primaria de o presente en una MCAM humana natural y fragmentos de la misma, o proBNP, NTproBNP, BNP y fragmentos de los mismos. Por lo tanto, el calificativo “humano” en relacion con esto, se refiere a la secuencia primaria de las protemas, polipeptidos, peptidos o fragmentos respectivos, mas que a su origen o fuente. Por ejemplo, dichas protemas, polipeptidos, peptidos o fragmentos pueden estar presentes en o aislarse de muestras de sujetos humanos o pueden obtenerse por otros medios (p. ej., por expresion recombinante, traduccion sin celulas o smtesis de peptidos no biologica).
El termino “fragmento” de una protema, polipeptido o peptido se refiere en general a las formas de eliminacion o truncado N-terminal y/o C-terminal de dicha protema, polipeptido o peptido. El termino abarca fragmentos que surgen de cualquier mecanismo, tal como sin limitacion, por traduccion alternativa, exo y/o endoproteolisis y/o degradacion de dicha protema o polipeptido, tal como, por ejemplo, in vivo o in vitro, tal como, por ejemplo, por proteolisis ffsica, qmmica y/o enzimatica. Sin limitacion, un fragmento de una protema, polipeptido o peptido puede representar al menos aproximadamente 5%, o al menos aproximadamente 10%, p. ej., > 20%, > 30% o > 40%, tal como > 50%, p. ej., > 60%, > 70% o > 80%, o incluso > 90% o > 95% de la secuencia de aminoacidos de dicha protema, polipeptido o peptido.
Por ejemplo, un fragmento de MCAM puede incluir una secuencia de > 5 aminoacidos consecutivos, o >10 aminoacidos consecutivos, o > 20 aminoacidos consecutivos, o > 30 aminoacidos consecutivos, p. ej., >40 aminoacidos consecutivos, tal como, por ejemplo > 50 aminoacidos consecutivos, p. ej., > 60, > 70, > 80, > 90, > 100, > 200, > 300, > 400, > 500 o > 600 aminoacidos consecutivos de la MCAM.
En una realizacion, un fragmento de MCAM puede ser la forma truncada N-terminal y/o C-terminal por entre 1 y aproximadamente 20 aminoacidos, tal como, p. ej., por entre 1 y aproximadamente 15 aminoacidos, o por entre 1 y aproximadamente 10 aminoacidos, o por entre 1 y aproximadamente 5 aminoacidos, comparado con la MCAM madura de longitud completa (SEQ ID NO: 1) o su forma soluble (vease la figura 1).
En una realizacion, un fragmento de proBNP, NTproBNP o BNP puede ser la forma truncada N-terminal y/o C- terminal por entre 1 y aproximadamente 20 aminoacidos, tal como, p. ej., por entre 1 y aproximadamente 15
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aminoacidos, o por entre 1 y aproximadamente 10 aminoacidos, o por entre 1 y aproximadamente 5 aminoacidos, comparado con proBNP, NTproBNP o BNP. A modo de ejemplo, los fragmented proBNP, NTproBNP y BNP utiles como biomarcadores se describen en el documento WO 2004/094460.
En una realizacion, los fragmentos de una protema, polipeptido o peptido dados se pueden conseguir por proteolisis in vitro de dicha protema, polipeptido o peptido para obtener ventajosamente peptido o peptidos detectables de una muestra.
Por ejemplo, dicha proteolisis se puede llevar a cabo mediante agentes ffsicos, qmmicos y/o enzimaticos, p. ej., proteinasas, preferiblemente endoprotemasas, es decir, escision por proteasa internamente dentro de una cadena de protema, polipeptido o peptido. Una lista no limitante de endorpoteinasas incluye serina proteinasas (EC 3.4.21), treonina proteinasas (EC 3.4.25), cistema proteinasas (EC 3.4.22), acido aspartico proteinasas (EC 3.4.23), metaloproteinasas (EC 3.4.24) y acido glutamico proteinasas.
Las endoproteinasas de ejemplo no limitantes incluyen tripsina, quimiotripsina, elastasa, endoproteinasa Lys-C de Lysobacter enzymogenes, endoproteinasa Glu-C de Staphylococcus aureus (endopeptidasa V8) o endoproteinasa Arg-C de Clostridium histolyticum (clostripama). Se pueden usar enzimas conocidas o todavfa no identificadas adicionales; un experto en la tecnica puede elegir la o las proteasas adecuadas basandose en su especificidad y frecuencia de escision para lograr las formas de peptidos deseadas.
Preferiblemente, la proteolisis se puede realizar mediante endopeptidasas del tipo tripsina (EC 3.4.21.4), preferiblemente tripisina, tal como, sin limitacion, preparaciones de tripsina de pancreas bovino, pancreas humano, pancreas porcino, tripsina recombinante, tripsina Lys-acetilada, tripsina en solucion, tripsina inmovilizada sobre un soporte solido, etc. La tripsina es particularmente util, entre otros, debido a la alta especificidad y eficacia de escision. La descripcion tambien contempla el uso de cualquier proteasa de tipo tripsina, es decir, con una especificidad similar a la de la tripsina.
Por otra parte, se pueden usar reactivos qmmicos para la proteolisis. Por ejemplo, CNBr puede escindir en Met, BNPS-escatol puede escindir en Trp.
Las condiciones para el tratamiento, p. ej., concentracion de protemas, concentracion de enzimas o reactivos qmmicos, pH, tampon, temperatura, tiempo, los puede determinar el experto en la tecnica dependiendo de la enzima o reactivo qmmico usado.
Por lo tanto, en un aspecto, la descripcion tambien proporciona un fragmento aislado de MCAM como se ha definido antes aqm. Dichos fragmentos pueden dar informacion util sobre la presencia y cantidad de MCAM en muestras biologicas, de modo que la deteccion de dichos fragmentos sea de interes. Por lo tanto, los fragmentos descritos en la presente memoria de MCAM son biomarcadores utiles.
El termino “aislado” con referencia a un componente particular (tal como, por ejemplo, una protema, polipeptido, peptido o fragmento de los mismos) en general indica que dicho componente existe separado, por ejemplo, se ha separado o preparado separado, de uno o mas de otros componentes de su entorno natural. Por ejemplo, una protema, polipeptido, peptido o fragmento aislado, humano o animal, existe separado de un cuerpo humano o animal donde se encuentra de forma natural.
El termino “aislado” como se usa en la presente memoria, puede abarcar tambien preferiblemente el calificativo “purificado”. Como se usa en la presente memoria, el termino “purificado” con referencia a protema(s), polipeptido(s), peptido(s) y/o fragmento(s) de los mismos, no requiere la pureza absoluta. En cambio, indica que dicha o dichas protemas, polipeptidos, peptidos y/o fragmentos de los mismos estan en un entorno discreto en el que su abundancia (expresada de forma conveniente en terminos de masa o peso o concentracion) con respecto a otras protemas, es mayor que en una muestra biologica. Un entorno discreto indica un medio solo, tal como por ejemplo una solucion sola, gel, precipitado, liofilizado, etc. Los peptidos, polipeptidos o fragmentos purificados se pueden obtener por metodos conocidos que incluyen, por ejemplo, smtesis de laboratorio o recombinante, cromatograffa, electroforesis preparativa, centrifugacion, precipitacion, purificacion por afinidad, etc.
La o las protemas, polipeptidos, peptidos y/o fragmentos purificados preferiblemente constituyen, en peso, > 10%, mas preferiblemente > 50%, tal como > 60%, todavfa mas preferiblemente > 70%, tal como > 80%, y todavfa mas preferiblemente > 90%, tal como > 95%, > 96%, > 97%, > 98%, > 99% o incluso 100%, del contenido de protema del entorno discreto. El contenido de protema se puede determinar, p. ej., por el metodo de Lowry (Lowry et al. 1951. J Biol Chem 193: 265), opcionalmente como describe Hartree 1972 (Anal Biochem 48: 422-427). Ademas, la pureza de los peptidos o polipeptidos se puede determinar por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras usando azul Coomassie, o preferiblemente tincion con plata.
Una realizacion adicional proporciona MCAM aislada o fragmentos de MCAM, como se ensena en la presente memoria, que comprenden un marcador detectable. Esto facilita la deteccion facil de dichos fragmentos. El termino “marcador” como se usa a lo largo de esta memoria descriptiva se refiere a cualquier atomo, molecula, resto o biomolecula que se puede usar para proporcionar una lectura o propiedad detectable y preferiblemente cuantificable, y que puede estar unida a o formar parte de una entidad de interes, tal como un peptido o polipeptido o un agente de
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union espedfico. Los marcadores se pueden detectar de forma adecuada por medios de espectrometna de masas, espectroscopicos, opticos, colorimetricos, magneticos, fotoqmmicos, bioqmmicos, inmunoqmmicos o medios qmmicos. Los marcadores incluye, sin limitacion, colorantes; radiomarcadores tales como 32P, 33P, 35S, 125I, 131I; reactivos de densidad electronica; enzimas (p. ej., peroxidasa de rabano picante o fosfatasa alcalina, como se usa habitualmente en inmunoensayos); restos de union tales como biotina-estreptavidina; haptenos tales como diogoxigenina; restos luminogenos, fosforescentes o fluorogenos; marcadores de masas; y colorantes fluorescentes solos o en combinacion con restos que pueden suprimir o cambiar los espectros de emision por transferencia de energfa por resonancia de fluorescencia (FRET).
En una realizacion, la MCAM aislada o fragmentos de MCAM, como se ensena en la presente memoria, pueden marcarse mediante un marcador que altera la masa. Preferiblemente, un marcador que altera la masa puede implicar la presencia de un isotopo estable distinto en uno o mas aminoacidos del peptido frente a su correspondiente peptido no marcado. Los peptidos con marcaje de masas son particularmente utiles como controles positivos, patrones o calibradores en aplicaciones de espectrometna de masas. En particular, los peptidos que incluyen uno o mas isotopos distintos son qmmicamente similares, se separan cromatografica y electroforeticamente de la misma forma y tambien se ionizan y fragmentan de la misma forma. Sin embargo, en un analizador de masas adecuado, dichos peptidos y opcionalmente los iones de fragmentacion seleccionados de los mismos, presentaran relaciones m/z que los distinguen y por lo tanto se pueden diferenciar. Los ejemplos de parejas de isotopos estables que se pueden distinguir incluyen H y D, 12C y 13C, 14N y 15N o 16O y 18O. Normalmente, los peptidos y protemas de muestras biologicas analizadas en la presente descripcion pueden contener sustancialmente solo isotopos comunes que tienen una alta prevalencia en la naturaleza, tales como, por ejemplo H, 12C, 14N y 16O. En dicho caso, el peptido con marcaje de masa se puede marcar con uno o mas isotopos no comunes que tienen una prevalencia baja en la naturaleza, tales como, por ejemplo D, 13C, 15N y/o 18O. Es posible tambien, que en casos donde los peptidos o protemas de una muestra biologica incluyeran uno o mas isotopos no comunes, el peptido con marcaje de masa pueda comprender el o los respectivos isotopos comunes.
Los peptidos sinteticos con marcaje isotopico, se pueden obtener, entre otros, por smtesis o produccion recombinante de dichos peptidos, usando uno o mas sustratos de aminoacidos con marcaje isotopico, o por modificacion qmmica o enzimatica de peptidos no marcados para introducir en estos uno o mas isotopos distintos. A modo de ejemplo y no de limitacion, los peptidos marcados con D se pueden sintetizar o producir de forma recombinante en presencia de L-metionina deuterada disponible en el comercio CH3-S-CD2CD2-CH(NH2)-COOH o arginina deuterada H2NC(=NH)-NH-(CD2)3-CD(NH2)-COOH. Debe observarse que cualquier aminoacido cuya forma deuterada o que contiene 15N o 13C exista, se puede considerar para la smtesis o produccion recombinante de peptidos marcados. En otro ejemplo no limitante, un peptido se puede tratar con tripsina en H216O o H218O, conduciendo a la incorporacion de dos oxfgenos (16O o 18O, respectivamente) en el extremo COOH de dicho peptido (p. ej., documento US 2006/105415).
Por consiguiente, tambien esta contemplado el uso de MCAM y fragmentos aislados de MCAM como se ensena en la presente memoria, que comprende opcionalmente un marcador detectable, como controles (positivo), patrones o calibradores en ensayos de deteccion cualitativos o cuantitativos (metodos de medicion) de MCAM, y en particular en dichos metodos para la prediccion, diagnostico y/o pronostico de la ICA en sujetos, como se ensena en la presente memoria. Las protemas, polipeptidos o peptidos se pueden suministrar en cualquier forma, entre otros como precipitado, secado al vado, liofilizado, en solucion como lfquido o congelado, o inmovilizado de forma covalente o no covalente sobre fase solida, tal como por ejemplo, sobre matriz cromatografica solida o sobre vidrio o plastico y otras superficies adecuadas (p. ej., como parte de matrices y micromatrices de peptidos). Los peptidos se pueden preparar facilmente, por ejemplo, aislados de fuentes naturales, o preparados de forma recombinante o sintetica.
Tambien se proporcionan agentes de union capaces de unirse espedficamente a uno cualquiera o mas de los fragmentos aislados de la MCAM, como se ensena en la presente memoria. Se proporcionan ademas agentes de union capaces de unirse espedficamente a solo uno de los fragmentos aislados de MCAM, como se ensena en la presente memoria. Dichos agentes de union pueden incluir, entre otros, un anticuerpo, aptamero, fotoaptamero, protema, peptido, peptidomimetico o una molecula pequena.
En una realizacion preferida, dicho agente de union es capaz de unirse tanto a las formas unidas a membrana como circulantes en el plasma de la MCAM. Preferiblemente, dicho agente de union es capaz de unirse espedficamente o detectar la forma circulante en el plasma de la MCAM.
La expresion “se une espedficamente” como se usa a lo largo de esta memoria descriptiva, significa que un agente (indicado en la presente memoria tambien como “agente de union espedfica”) se une a una o mas moleculas o analitos deseados, tales como a una o mas protemas, polipeptidos o peptidos de interes o fragmentos de los mismos, sustancialmente con exclusion de otras moleculas que son aleatorias o no relacionadas, y opcionalmente sustancialmente con la exclusion de otras moleculas que estan estructuralmente relacionadas.
La expresion “se une espedficamente” no requiere necesariamente que un agente se una exclusivamente a su diana o dianas previstas. Por ejemplo, se puede decir que un agente se une espedficamente a protema(s), polipeptido(s), peptido(s) y/o fragmento(s) de los mismos de interes, si su afinidad por dicha diana o dianas previstas
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en condiciones de union es al menos aproximadamente 2 veces mayor, preferiblemente al menos aproximadamente 5 veces mayor, mas preferiblemente al menos aproximadamente 10 veces mayor, todavfa mas preferiblemente al menos aproximadamente 25 veces mayor, todavfa mas preferiblemente al menos aproximadamente 50 veces mayor, e incluso mas preferiblemente al menos aproximadamente 100 veces o mas mayor, que su afinidad por una molecula que no es diana.
Preferiblemente, el agente se puede unir a su o sus dianas previstas con constante de afinidad (Ka) de dicha union Ka > 1*106M-1, mas preferiblemente Ka > 1x107M"1, todavfa mas preferiblemente Ka > 1x108M"1, incluso mas preferiblemente Ka > 1x10aM , y todavfa mas preferiblemente Ka > 1x10 M o Ka > 1x10 M, en donde Ka = [SBA_T]/[SBA][T], SBA indica el agente de union espedfica, T indica la diana prevista. La determinacion de Ka se puede llevar a cabo por metodos conocidos en la tecnica, tales como por ejemplo, usando dialisis de equilibrio y analisis de grafico de Scatchard.
Los agentes de union espedficos, como se usa a lo largo de esta memoria descriptiva pueden incluir, entre otros un anticuerpo, aptamero, fotoaptamero, protema, peptido, peptidomimetico o una molecula pequena.
Como se usa en la presente memoria, el termino “anticuerpo” se usa en su sentido mas amplio y en general se refiere a cualquier agente de union inmunologico. El termino abarca espedficamente anticuerpos monoclonales intactos, anticuerpos policlonales, anticuerpos multivalentes (p. ej., multivalente 2, 3 o superior) y/o multiespedficos (p. ej., anticuerpos espedficos bi- o superior) formados a partir de al menos dos anticuerpo intactos, y fragmentos de anticuerpo en la medida que presenten la actividad biologica deseada (en particular, la capacidad para unirse espedficamente a un antfgeno de interes), asf como compuestos multivalentes y/o multiespedficos de dichos fragmentos. El termino “anticuerpo” no es inclusivo de anticuerpos generados por metodos que comprenden inmunizacion, si no que incluye tambien cualquier polipeptido, p. ej., un polipeptido expresado de forma recombinante, que se hace para abarcar al menos una region determinante de la complementariedad (CDR) capaz de union espedfica a un epftopo en un antfgeno de interes. Por lo tanto, el termino se aplica a dichas moleculas independientemente de si se producen in vitro o in vivo.
En una realizacion, un anticuerpo puede ser cualquiera de las clases IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y preferiblemente anticuerpo de clase IgG.
En una realizacion, el anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal, p. ej., un antisuero o inmunoglobulinas purificadas a partir de este (p. ej., purificado por afinidad).
En otra realizacion preferida, el anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal o una mezcla de anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden dirigirse a un antfgeno particular o un epftopo particular dentro de un antfgeno, con mayor selectividad y reproducibilidad.
A modo de ejemplo y no de limitacion, los anticuerpos monoclonales se pueden hacer por el metodo de hibridoma descrito por primera vez por Kohler et al. 1975 (Nature 256: 495), o se puede hacer por metodos de ADN recombinantes (p. ej., como en el documento US 4.816.567). Los anticuerpos monoclonales tambien se pueden aislar de bibliotecas de anticuerpos en fagos usando tecnicas descritas porClackson et al. 1991 (Nature 352: 624628) y Marks et al. 1991 (J Mol Biol 222: 581-597), por ejemplo.
En realizaciones adicionales, los agentes de union a anticuerpo pueden ser fragmentos de anticuerpos. Los “fragmentos de anticuerpos” comprenden una parte de un anticuerpo intacto, que comprende la region de union al antfgeno o variable del mismo. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fv y scFv; fragmentos bivalentes; anticuerpos lineales; moleculas de anticuerpo monocatenarias; y anticuerpos multivalentes y/o multiespedficos formados a partir de fragmento(s) de anticuerpos, p. ej., fragmentos bivalentes, fragmentos trivalentes y fragmentos multivalentes. Las designaciones anteriores Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv etc. se pretende que tengan su significado establecido en la tecnica.
El termino anticuerpo incluye anticuerpos procedentes de o que comprenden una o mas porciones derivadas de cualquier especie animal, preferiblemente especie de vertebrado, incluyendo, p. ej., aves y mairftferos. Sin limitacion, los anticuerpos pueden ser de pollo, pavo, ganso, pato, pintada, codorniz o faisan. Tambien sin limitacion, los anticuerpos pueden ser humanos, murinos (p. ej., raton, rata, etc.), burro, conejo, cabra, oveja, cobaya, camello (p. ej., (p. ej., Camelus bactrianus y Camelus dromaderius), llama (p. ej., Lama paccos, Lama glama o Lama vicugna) o caballo.
Un experto entendera que un anticuerpo puede incluir una o mas eliminaciones, adiciones y/o sustituciones de aminoacidos (p. ej., sustituciones conservativas), siempre que dichas alteraciones conserven su union del respectivo antfgeno. Un anticuerpo tambien puede incluir una o mas modificaciones naturales o artificiales de sus restos de aminoacidos constituyentes (p. ej., glicosilacion, etc.).
Los metodos para producir anticuerpos policlonales y monoclonales, asf como fragmentos de los mismos son bien conocidos en la tecnica, como lo son metodos para producir anticuerpos recombinantes o fragmentos de los mismos (vease, por ejemplo, Harlow y Lane, "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1988; Harlow y Lane, "Using Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1999,
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ISBN 0879695447; "Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques", de Zola, ed., CRC Press 1987, ISBN 0849364760; "Monoclonal Antibodies: A Practical Approach", de Dean y Shepherd, eds., Oxford University Press 2000, ISBN 0199637229; Methods in Molecular Biology, vol. 248: "Antibody Engineering: Methods and Protocols", Lo, ed., Humana Press 2004, ISBN 1588290921).
El termino “aptamero” se refiere a una oligo-ADN, oligo-ARN u oligo-ADN/ARN monocatenario o bicatenario o cualquier analogo de los mismos, que se puede unir espedficamente a una molecula diana tal como un peptido. Ventajosamente, los aptameros pueden presentar especificidad y afinidad bastante altas (p. ej., Ka del orden de 1*109M'1) para sus dianas. La produccion de aptameros se describe, entre otros, en el documento US 5.270.163; Ellington y Szostak 1990 (Nature 346: 818-822); Tuerk y Gold 1990 (Science 249: 505-510); o "The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications", de Klussmann, ed., Wiley-VCH 2006, ISBN 3527310592. El termino “fotoaptamero” se refiere a un aptamero que contiene uno o mas grupos funcionales fotorreactivos que se pueden unir de forma covalente o entrecruzar con una molecula diana. El termino “peptidomimetico” se refiere a un agente no peptfdico que es topologicamente analogo a un peptido correspondiente. Los metodos de peptidomimeticos disenados racionalmente son conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el diseno racional de tres peptidomimeticos basados en el peptido octamero sulfatado CCK26-33, y los dos peptidomimeticos basados en el peptido undecamero sustancia P, y principios de diseno de peptidomimeticos relacionados, se describen en Horwell 1995 (Trends Biotechnol 13:132-134).
La expresion “molecula pequena” se refiere a compuestos, preferiblemente compuestos organicos, con un tamano comparable al de las moleculas organicas usadas en general en productos farmaceuticos. La expresion excluye macromoleculas biologicas (p. ej., protemas, acidos nucleicos, etc.). Las moleculas organicas pequenas preferidas estan en el intervalo de tamano de hasta aproximadamente 5000 Da, p. ej., hasta aproximadamente 4000, preferiblemente hasta 3000 Da, mas preferiblemente hasta 2000 Da, incluso mas preferiblemente hasta aproximadamente 1000 Da, p. ej., hasta aproximadamente 900, 800, 700, 600 o hasta aproximadamente 500 Da.
Tambien se proporcionan metodos para inmunizar animales, p. ej., animales no humanos tales como animales de laboratorio o granja usando (es decir, usando como el antfgeno de inmunizacion) los fragmentos ensenados en la presente memoria de MCAM, opcionalmente unidos a un veldculo presentador. La inmunizacion y preparacion de reactivos anticuerpos a partir de suero inmune es bien conocido y se describe en documentos a los que se hace referencia en otra parte en esta memoria descriptiva. Los animales que se van a inmunizar pueden incluir cualquier especie animal, preferiblemente especies de sangre caliente, mas preferiblemente especies de vertebrados, incluyendo, p.ej., aves y mairnferos. Sin limitacion, los anticuerpos pueden ser de pollo, pavo, ganso, pato, pintada, codorniz o faisan. Tambien sin limitacion, los anticuerpos pueden ser humanos, murinos (p. ej., raton, rata, etc.), burro, conejo, cabra, oveja, cobaya, camello, Ilama o caballo.
El termino “vetnculo presentador” o “vetnculo” en general indica una molecula inmunogena que, cuando se une a una segunda molecula, aumenta las respuestas inmunitarias contra esta ultima, normalmente proporcionando epttopos de celulas T adicionales. El vetnculo presentador puede ser una estructura (poli)peptidica o una estructura no peptfdica, tal como, entre otros, glicanos, polietilenglicoles, mimeticos de peptidos, polfmeros sinteticos, etc. Los ejemplos no limitantes de vetnculos incluyen la protema nuclear del virus de la hepatitis B, dominios C3d multiples, fragmento C de la toxina tetanica o partfculas Ty de levaduras.
Los sueros inmunes obtenidos o que se pueden obtener por inmunizacion, como se ensena en la presente memoria, pueden ser particularmente utiles para generar reactivos anticuerpos que se unen espedficamente con uno o mas de los fragmentos de MCAM descritos en la presente memoria.
La memoria descriptiva tambien ensena un metodo para seleccionar agentes de union espedficos que se unen a (a) uno o mas de los fragmentos de MCAM ensenados en la presente memoria, sustancialmente con la exclusion de (b) MCAM y/u otros fragmentos de la misma. De forma conveniente, dichos metodos se pueden basar en sustraer o eliminar agentes de union que tienen reacciones cruzadas o uniones cruzadas con las moleculas de MCAM no deseadas de (b). Dicha sustraccion se puede llevar a cabo como se conoce en la tecnica, mediante una variedad de metodos de separacion por afinidad, tales como cromatograffa de afinidad, extraccion en fase solida por afinidad, extraccion magnetica por afinidad, etc.
Se puede usar cualquier metodo de separacion, deteccion y cuantificacion existente, disponible o convencional, en la presente memoria, para medir la presencia o ausencia (p. ej., siendo la lectura presente frente a ausente; o cantidad detectable frente a cantidad no detectable) y/o cantidad (p. ej., siendo la lectura una cantidad absoluta o relativa, tal como, por ejemplo, concentracion absoluta o relativa) de MCAM y/o fragmentos de la misma, y opcionalmente de uno o mas biomarcadores utiles para la ICA en muestras (cualesquiera moleculas o analitos de interes para medir en muestras, incluyendo MCAM y fragmentos de los mismos, se pueden referir a continuacion en la presente memoria de forma colectiva como biomarcadores).
Por ejemplo, dichos metodos pueden incluir metodos de inmunoensayo, metodos de analisis de espectrometna de masas, o metodos cromatograficos o combinaciones de los mismos.
El termino “inmunoensayo” se refiere en general a metodos conocidos como tales para la deteccion de una o mas
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moleculas o analitos de interes en una muestra, en donde la especificidad de un inmunoensayo por la o las moleculas o analitos de interes se confiere mediante la union espedfica entre un agente de union espedfico, normalmente un anticuerpo, y la o las moleculas o analitos de interes.
Las tecnologfas de inmunoensayo incluyen, sin limitacion, tecnologfas ELISA (ensayo de inmunoadsorcion ligado a enzima), ELISA indirecto, ELISA tipo sandwich, ELISA competitivo, ELISA multiplexado, radioinmunoensayo (RIA), ELISPOT, y otras tecnicas similares conocidas en la tecnica. Los principios de estos metodos de inmunoensayo se conocen en la tecnica, por ejemplo, John R. Crowther, "The ELISA Guidebook", 1a ed., Humana Press 2000, ISBN 0896037282.
Como explicacion adicional y no limitacion, el ELISA directo usa un anticuerpo primario marcado para unirse a y de esta forma cuantificar el antigeno diana en una muestra inmovilizada en un soporte solido tal como una placa de microvaloracion. El ELISA indirecto usa un anticuerpo primario no marcado que se une al antigeno diana y un anticuerpo secundario marcado que reconoce y permite cuantificar el anticuerpo primario unido a antigeno. En el ELISA de tipo sandwich el antfgeno diana es capturado de una muestra usando un anticuerpo de “captura” inmovilizado que se une a un sitio antigenico en el antigeno, y posteriormente para separar los analitos no unidos, el antigeno asf capturado se detecta usando un anticuerpo de “deteccion” que se une a otro sitio antigenico en dicho antigeno, donde el anticuerpo de deteccion puede estar marcado directamente o ser detectable indirectamente como antes. El ELISA competitivo usa un “competidor” marcado que puede ser el anticuerpo primario o el antigeno diana. En un ejemplo, el anticuerpo primario inmovilizado no marcado se incuba con una muestra, esta reaccion se deja que alcance del equilibrio, y despues se anade el antigeno diana marcado. Este ultimo se unira al anticuerpo primario donde quiera que sus sitios de union no esten todavfa ocupados por antigeno diana no marcado de la muestra. Por lo tanto, la cantidad detectada de antigeno marcado unido se correlaciona inversamente con la cantidad de antigeno no marcado en la muestra. El ELISA multiplexado permite la deteccion simultanea de dos o mas analitos en un solo compartimento (p. ej., pocillo de microplaca) normalmente en una pluralidad de localizaciones de la matriz (vease, por ejemplo, Nielsen y Geierstanger 2004. J Immunol Methods 290: 107-20 y Ling et al. 2007. Expert Rev Mol Diagn 7: 87-98 para grna adicional). Como se apreciara, el marcaje en las tecnologfas de ELISA normalmente es por conjugacion enzimatica (tal como, p. ej., peroxidasa de rabano picante) y el punto final tfpicamente es colorimetrico, quimiluminiscente o fluorescente.
El radioinmunoensayo (RIA) es una tecnica basada en competicion e implica mezclar cantidades conocidas de antfgeno diana con marcaje radiactivo (p. ej., marcado con 125I o 131I), con anticuerpo contra dicho antfgeno, despues anadir antfgeno no marcado o “fno” de una muestra y medir la cantidad de antfgeno marcado desplazado (vease, p. ej., "An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques", de Chard T, ed., Elsevier Science 1995, ISBN 0444821198 para grna).
Ademas, los metodos de espectrometna de masas son adecuados para medir biomarcadores.
En general, son utiles en la presente memoria cualesquiera tecnicas de espectrometna de masas (MS) que puedan obtener informacion precisa sobre la masa de peptidos y preferiblemente tambien sobre la fragmentacion y/o secuencia de aminoacidos (parcial) de peptidos seleccionados (p. ej., en espectrometna de masas en tandem, MS/MS; desintegracion post-fuente, TOF MS). Las tecnicas y sistemas de MS y MS/MS de peptidos adecuadas son bien conocidas (vease, p. ej., Methods in Molecular Biology, vol. 146: "Mass Spectrometry of Proteins and Peptides", de Chapman, ed., Humana Press 2000, ISBN 089603609x; Biemann 1990. Methods Enzymol 193: 455-79; o Methods in Enzymology, vol. 402: "Biological Mass Spectrometry", de Burlingame, ed., Academic Press 2005, ISBN 9780121828073), y se pueden usar en la presente memoria.
Las disposiciones, instrumentes y sistemas de MS adecuados para el analisis de peptidos biomarcadores pueden incluir, sin limitacion, MS con ionizacion por desorcion por laser asistida por matriz en tiempo de vuelo (MALDI-TOF); MALDI-TOF de desintegracion post-fuente (PSD); MALDI-TOF/TOF; MS espectrometna de masas con ionizacion por desorcion por laser inducida en superficie en tiempo de vuelo (SELDI-TOF); espectrometna de masas por ionizacion por electropulverizacion (ESI-MS); ESI-MS/MS; ESI-MS/(MS)n (n es un numero entero mayor que cero); MS de trampa ionica por ESI 3D o lineal (2D); MS de triple cuadrupolo por ESI; MS por ESI de TOF de cuadrupolo ortogonal (Q-TOF); sistemas de MS por ESI de transformada de Fourier; desorcion/ionizacion en silicio (DIOS); espectrometna de masas de iones secundarios (SIMS); espectrometna de masas por ionizacion qmmica a presion atmosferica (APCI-MS); APCI-MS/MS; APCI-(MS)n; espectrometna de masas por fotoionizacion a presion atmosferica (ApPI-MS); APPI-MS/MS; y APPI-(MS)n. Las disposiciones de MS de fragmentacion ionica en tandem (MS/MS) se pueden lograr usando formas establecidas en la tecnica, tales como, p. ej., disociacion inducida por colision (CID).
En una realizacion, la deteccion y cuantificacion de biomarcadores por espectrometna de masas puede implicar el seguimiento de reacciones multiples (MRM), tal como describen, entre otros, Kuhn et al. 2004 (Proteomics 4:117586).
En una realizacion, los metodos de analisis de peptidos por MS se pueden combinar de forma ventajosa con metodos de separacion o fraccionamiento de peptidos o protemas corriente arriba, tal como, por ejemplo, con los metodos cromatograficos y otros metodos descritos en la presente memoria mas adelante.
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La cromatograffa tambien se puede usar para medir biomarcadores. Como se usa en la presente memoria, el termino “cromatograffa” abarca metodos para separar sustancias qmmicas, mencionadas como tales y ampliamente disponibles en la tecnica. En un procedimiento preferido, la cromatograffa se refiere a un procedimiento en el que una mezcla de sustancias qmmicas (analitos) llevada por una corriente de ffquido o gas que se mueve (“fase movil”) se separa en componentes, como resultado de la distribucion diferencial de los analitos, cuando fluyen alrededor y sobre una fase estacionaria Kquida o solida (“fase estacionaria”), entre dicha fase movil y dicha fase estacionaria. La fase estacionara normalmente puede ser un solido finamente dividido, una lamina de material de filtro, o una peffcula fina de un lfquido sobre la superficie de un solido, o similares. La cromatograffa tambien se puede aplicar ampliamente para la separacion de compuestos qmmicos de origen biologico, tales como, p. ej., aminoacidos, protemas, fragmentos de protemas o peptidos, etc.
La cromatograffa como se usa en la presente memoria puede ser preferiblemente en columna (es decir, en donde la fase estacionaria se deposita o empaqueta en una columna), preferiblemente cromatograffa de lfquidos, y todavfa mas preferiblemente HPLC. Aunque los detalles de la cromatograffa son bien conocidos en la tecnica, para una gma adicional vease, p. ej., Meyer M., 1998, ISBN: 047198373X, y "Practical HPLC Methodology and Applications", Bidlingmeyer, B. A., John Wiley & Sons Inc., 1993.
Los tipos de cromatograffa de ejemplo incluyen, sin limitacion, cromatograffa lfquida de alto rendimiento (HPLC), HPLC de fase normal (NP-HPLC), HPLC de fase inversa (RP-HPLC), cromatograffa de intercambio ionico (IEC), tal como cromatograffa de intercambio cationico o anionico, cromatograffa de interaccion hidrofila (HILIC), cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC), cromatograffa de exclusion por tamanos (SEC) incluyendo cromatograffa de filtracion en gel o cromatograffa de gel permeable, cromatoenfoque, cromatograffa de afinidad tal como cromatograffa de inmunoafinidad, de afinidad de metal inmovilizado, y similares.
En una realizacion, la cromatograffa que incluye cromatograffa monodimensional, bidimensional o mas dimensiones, se puede usar como un metodo de fraccionamiento de peptidos junto con un metodo de analisis de peptidos adicional, tal como, por ejemplo, con un analisis de espectrometffa de masas corriente abajo como se describe en otra parte en esta memoria descriptiva.
Se pueden usar metodos adicionales de separacion, identificacion o cuantificacion de peptidos o polipeptidos, opcionalmente junto con cualquiera de los metodos de analisis descritos antes, para medir biomarcadores en la presente descripcion. Dichos metodos incluyen, sin limitacion, reparto por extraccion qmmica, isoelectroenfoque (IEF) que incluye el isoelectroenfoque capilar (CIEF), isotacoforesis capilar (CITP), electrocromatograffa capilar (CEC), y similares, electroforesis en gel de poliacrilamida monodimensional (PAGE), electroforesis en gel de poliacrilamida bidimensional (2D-PAGE), electroforesis en gel capilar (CGE), electroforesis capilar de zona (CZE), cromatograffa electrocinetica capilar (MEKC), electroforesis de flujo libre (FFE), etc.
Los diferentes aspectos y realizaciones ensenados en la presente memoria, se pueden basar ademas en la comparacion de la cantidad de MCAM medida en muestras con valores de referencia de la cantidad de MCAM, en donde dichos valores de referencia representan predicciones, diagnosticos y/o pronosticos conocidos de ICA.
Por ejemplo, distintos valores de referencia pueden representar la prediccion de un riesgo (p. ej., un riesgo anormalmente elevado) de tener ICA frente a la prediccion de no tener o tener riesgo normal de ICA. En otro ejemplo, distintos valores de referencia pueden representar predicciones de diferentes grados de riesgo de tener ICA.
En un ejemplo adicional, los distintos valores de referencia pueden representar el diagnostico de ICA frente al diagnostico de ausencia de ICA (tal como, p. ej., el diagnostico de sano o recuperado de la ICA, etc.). En otro ejemplo, distintos valores de referencia pueden representar el diagnostico de ICA de diferente gravedad.
En otro ejemplo mas, diferentes valores de referencia pueden representar un buen pronostico para la ICA frente a un mal pronostico para la ICA. En un ejemplo adicional, los distintos valores de referencia pueden representar pronosticos favorables o desfavorables de forma variable para la ICA.
Dicha comparacion en general puede incluir medios para determinar la presencia o ausencia de al menos una diferencia y opcionalmente del tamano de dichos valores o perfiles intermedios diferentes que se comparan. Una comparacion puede incluir una inspeccion visual, una comparacion aritmetica o estadfstica de mediciones. Dichas comparaciones estadfsticas incluyen, pero no se limitan a aplicar una regla. Si los valores o perfiles de biomarcadores comprenden al menos un patron, la comparacion para determinar una diferencia en dichos valores o perfiles de biomarcadores tambien puede incluir mediciones de esos patrones, de modo que dichas mediciones del biomarcador se correlacionan con las mediciones de los patrones internos.
Los valores de referencia para la cantidad de MCAM se pueden establecer de acuerdo con procedimientos conocidos previamente usados para otros biomarcadores.
Por ejemplo, un valor de referencia de la cantidad de MCAM para una prediccion, diagnostico y/o pronostico particular de ICA se puede establecer determinando la cantidad de MCAM en la o las muestras de un individuo o de una poblacion de individuos caracterizada por dicha prediccion, diagnostico y/o pronostico particular de ICA (es
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dedr, para quien dicha prediccion, diagnostico y/o pronostico de ICA es valida). Dicha poblacion puede comprender sin limitacion > 2, > 10, > 100, o incluso varios cientos o mas individuos.
Por lo tanto, a modo de ejemplo ilustrativo, los valores de referencia de la cantidad de MCAM para el diagnostico de ICA frente a ausencia de ICA, se pueden establecer determinando la cantidad de MCAM en la o las muestras de un individuo o de una poblacion de individuos a los que se ha diagnosticado (p. ej., basado en otro medio adecuadamente concluyente, tal como por ejemplo, signos y smtomas clmicos, imagenes, ECG, etc.) respectivamente que tienen o no tienen ICA.
En una realizacion, el o los valores de referencia como se pretende en la presente memoria pueden trasmitir cuantidades absolutas de MCAM. En otra realizacion, la cantidad de MCAM en una muestra de un sujeto ensayado se puede determinar directamente con respecto al valor de referencia (p. ej., en terminos de aumento o disminucion, o numero de veces de aumento o numero de veces de disminucion). Ventajosamente, esto puede permitir comparar la cantidad de MCAM en la muestra del sujeto con el valor de referencia (en otras palabras, para medir la cantidad relativa de MCAM en la muestra del sujeto frente al valor de referencia) sin necesidad de determinar primero las respectivas cantidades absolutas de MCAm.
El nivel de expresion o presencia de un biomarcador en una muestra de un paciente a veces puede fluctuar, es decir, aumentar o disminuir significativamente sin smtomas de cambio (aspecto de empeorar o mejorar). En dicho caso, el cambio del marcador precede al cambio en los smtomas y se hace una medicion mas sensible que el cambio de smtomas. La intervencion terapeutica se puede iniciar antes y ser mas eficaz que esperar los smtomas deteriorantes. Los smtomas pueden ser (no limitados a): dificultad para respirar, edema en las extremidades inferiores, palpitaciones cardiacas, fatiga, etc. La intervencion temprana en un estado mas inicial se puede llevar a cabo de forma segura en casa, lo cual es una mejora importante para tratar pacientes gravemente deteriorados en el servicio de urgencias.
La medicion del nivel de MCAM del mismo paciente en diferentes tiempos de medicion, en dicho caso puede asf permitir el seguimiento continuo del estado del paciente y puede llevar a la prediccion de empeoramiento o mejora de la afeccion del paciente con relacion a la ICA. Se puede usar un kit o dispositivo de ensayo domestico o clinico como se indica en la presente memoria, para este seguimiento continuo. Uno o mas valores de referencia o intervalos de niveles de MCAM asociados con una determinada enfermedad (p. ej., ICA o ausencia de ICA) para dicho ensayo, se pueden determinar, p. ej., de antemano o durante el proceso de seguimiento a lo largo de un determinado periodo de tiempo en dicho sujeto. Alternativamente, estos valores de referencia o intervalos se pueden establecer mediante conjuntos de datos de varios pacientes con fenotipos de enfermedad muy parecidos, p. ej., de sujetos sanos o sujetos que no tienen ICA. Una desviacion repentina de los niveles de MCAM de dichos valor de referencia o intervalo, puede predecir el empeoramiento de la afeccion del paciente (p. ej., en casa o centro medico) antes de que realmente se puedan sentir u observar los smtomas (a menudo graves).
Por lo tanto, esta memoria descriptiva proporciona tambien un metodo o algoritmo para determinar un cambio significativo en el nivel del marcador MCAM en un determinado paciente, que es indicativo de cambio (empeoramiento o mejora) del estado clmico. Ademas, la invencion permite establecer el diagnostico de que el sujeto se esta recuperando o se ha recuperado de la afeccion de ICA.
En una realizacion, los presentes metodos pueden incluir una etapa de establecer dicho o dichos valores de referencia. En una realizacion, los kits y dispositivos presentes pueden incluir medios para establecer un valor de referencia de la cantidad de MCAM para una prediccion, diagnostico y/o pronostico particular de ICA. Dichos medios pueden comprender, por ejemplo, una o mas muestras (p. ej., muestras separadas o juntadas) de uno o mas individuos caracterizados por dicha prediccion, diagnostico y/o pronostico de ICA.
Los diferentes aspectos y realizaciones ensenados en la presente memoria, pueden implicar ademas encontrar una desviacion o ausencia de desviacion entre la cantidad de MCAM medida en una muestra de un sujeto y un valor de referencia dado.
Una “desviacion” de un primer valor respecto a un segundo valor puede abarcar en general cualquier direccion (p. ej., aumento: primer valor > segundo valor; o disminucion: primer valor < segundo valor) y cualquier extension de la alteracion.
Por ejemplo, una desviacion puede abarcar una disminucion en un primer valor de, sin limitacion, al menos aproximadamente 10% (aproximadamente 0,9 veces o menos), o de al menos aproximadamente 20% (aproximadamente 0,8 veces o menos), o de al menos aproximadamente 30% (aproximadamente 0,7 veces o menos), o de al menos aproximadamente 40% (aproximadamente 0,6 veces o menos), o de al menos aproximadamente 50% (aproximadamente 0,5 veces o menos), o de al menos aproximadamente 60% (aproximadamente 0,4 veces o menos), o de al menos aproximadamente 70% (aproximadamente 0,3 veces o menos), o de al menos aproximadamente 80% (aproximadamente 0,2 veces o menos), o de al menos aproximadamente 90% (aproximadamente 0,1 veces o menos), con respecto a un segundo valor con el que se esta haciendo la comparacion.
Por ejemplo, una desviacion puede abarcar un aumento en un primer valor de, sin limitacion, al menos
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aproximadamente 10% (aproximadamente 1,1 veces o mas), o de al menos aproximadamente 20% (aproximadamente 1,2 veces o mas), o de al menos aproximadamente 30% (aproximadamente 1,3 veces o mas), o de al menos aproximadamente 40% (aproximadamente 1,4 veces o mas), o de al menos aproximadamente 50% (aproximadamente 1,5 veces o mas), o de al menos aproximadamente 60% (aproximadamente 1,6 veces o mas), o de al menos aproximadamente 70% (aproximadamente 1,7 veces o mas), o de al menos aproximadamente 80% (aproximadamente 1,8 veces o mas), o de al menos aproximadamente 90% (aproximadamente 1,9 veces o mas), o de al menos aproximadamente 100% (aproximadamente 2 veces o mas), o de al menos aproximadamente 150% (aproximadamente 2,5 veces o mas), o de al menos aproximadamente 200% (aproximadamente 3 veces o mas), o de al menos aproximadamente 500% (aproximadamente 6 veces o mas), o de al menos aproximadamente 700% (aproximadamente 8 veces o mas), o similar, con respecto a un segundo valor con el que se esta haciendo la comparacion.
Preferiblemente, una desviacion se puede referir a una alteracion observada estadfsticamente significativa. Por ejemplo, una desviacion se puede referir a una alteracion observada que esta fuera de los margenes de error de los valores de referencia en una poblacion dada (expresado, por ejemplo, por la desviacion estandar o error estandar o por un multiplo predeterminado del mismo, p. ej., ±1xDE o ±2xDe, o ±1xDE o ±2xEE). La desviacion tambien puede referirse a un valor que esta fuera de un intervalo de referencia definido por valores en una poblacion dada (por ejemplo, fuera de un intervalo que comprende >40%, > 50%, >60%, >70%, >75% o >80% o >85% o >90% o >95% o incluso >100% de los valores en dicha poblacion).
En una realizacion adicional, se puede inferir una desviacion si una alteracion observada esta mas alla de un umbral o punto de corte dado. Dicho umbral o punto de corte se puede seleccionar como se conoce en general en la tecnica, para proporcionar una sensibilidad y/o especificidad elegidas de los metodos de prediccion, diagnostico y/o pronostico, p. ej., sensibilidad y/o especificidad de al menos 50%, o al menos 60%, o al menos 70%, o al menos 80%, o al menos 85%, o al menos 90%, o al menos 95%.
Por ejemplo, en una realizacion, una cantidad elevada de MCAM en la muestra del sujeto - preferiblemente al menos aproximadamente 1,1 veces elevada, o al menos aproximadamente 1,2 veces elevada, mas preferiblemente al menos aproximadamente 1,3 veces elevada, incluso mas preferiblemente al menos aproximadamente 1,4 veces elevada, todavfa mas preferiblemente al menos aproximadamente 1,5 veces elevada, tal como entre aproximadamente 1,1 veces y 3 veces elevada o entre aproximadamente 1,5 veces y 2 veces elevada - comparada con un valor de referencia que representa la prediccion o diagnostico de ausencia de ICA o que representa un buen pronostico para la ICA, indica que el sujeto tiene o tiene riesgo de tener ICA o indica un mal pronostico para la ICA en el sujeto.

Cuando se encuentra una desviacion entre la cantidad de MCAM en una muestra de un sujeto y un valor de

referencia que representa una determinada prediccion, diagnostico y/o pronostico de ICA, dicha desviacion es
indicativa o se puede atribuir a la conclusion de que la prediccion, diagnostico y/o pronostico de ICA en dicho sujeto es diferente de la representada por el valor de referencia.

Cuando no se encuentra desviacion entre la cantidad de MCAM en una muestra de un sujeto y un valor de
referencia que representa una determinada prediccion, diagnostico y/o pronostico de ICA, la ausencia de dicha
desviacion es indicativa o se puede atribuir a la conclusion de que la prediccion, diagnostico y/o pronostico de ICA en dicho sujeto es sustancialmente la misma que la representada por el valor de referencia.
Las consideraciones anteriores se aplicar de forma analoga a perfiles de biomarcadores.
Cuando se determinan dos o mas biomarcadores diferentes en un sujeto, sus respectivas presencia, ausencia y/o cantidad se pueden representar juntas como un perfil de biomarcadores, formando los valores de cada uno de los biomarcadores medidos una parte de dicho perfil. Como se usa en la presente memoria, el termino “perfil” incluye cualquier conjunto de datos que representa los distintos aspectos o caractensticas asociadas con una afeccion de interes, tal como con una prediccion, diagnostico y/o pronostico particular de ICA. El termino abarca en general, entre otros perfiles de acidos nucleicos, tales como por ejemplo perfiles de genotipos (conjuntos de datos genotfpicos que representan el genotipo de uno o mas genes asociados con una afeccion de interes), perfiles de numero de copias de genes (conjuntos de datos de numero de copias de genes que representan la amplificacion o eliminacion de uno o mas genes asociados con una afeccion de interes), perfiles de expresion de genes (conjuntos de datos de expresion de genes que representan los niveles de ARNm de uno o mas genes asociados con una afeccion de interes), perfiles de metilacion de ADN (conjuntos de datos de metilacion que representan niveles de metilacion de ADN de uno o mas genes asociados con una afeccion de interes), asf como perfiles de protemas, polipeptidos o peptidos, tal como por ejemplo perfiles de expresion de protemas (conjuntos de datos de expresion de protemas que representan los niveles de una o mas protemas asociadas con una afeccion de interes), perfiles de activacion de protemas (conjuntos de datos que representan la activacion o inactivacion de una o mas protemas asociadas con una afeccion de interes), perfiles de modificacion de protemas (conjuntos de datos que representan la modificacion de una o mas protemas asociadas con una afeccion de interes), perfiles de escision de protemas (conjuntos de datos que representan la escision proteolttica de una o mas protemas asociadas con una afeccion de interes), asf como cualquier combinacion de los mismos.
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Los perfiles de biomarcadores se pueden crear en una serie de formas y pueden ser la combinacion de biomarcadores o aspectos de biomarcadores medibles usando metodos tales como proporciones, u otros metodos o algoritmos de asociacion mas complejos (p. ej., metodos basados en una regla). Un perfil de biomarcador comprende al menos dos mediciones, donde las mediciones pueden corresponder al mismo o diferentes biomarcadores. Un perfil de biomarcador tambien puede comprender al menos 3, 4, 5, 10, 20, 30 o mas mediciones. En una realizacion, un perfil de biomarcador comprende cientos, o incluso miles de mediciones.
Por lo tanto, por ejemplo, distintos perfiles de referencia pueden representar la prediccion de un riesgo (p. ej., un riesgo anormalmente elevado) de tener ICA frente a la prediccion de no tener riesgo o tener riesgo normal de ICA. En otro ejemplo, distintos perfiles de referencia pueden representar predicciones de diferentes grados de riesgo de tener ICA.
En un ejemplo adicional, distintos perfiles de referencia pueden representar el diagnostico de ICA frente al diagnostico de ausencia de ICA (tal como, p. ej., el diagnostico de salud, recuperacion de ICA, etc.). En otro ejemplo, distintos perfiles de referencia pueden representar el diagnostico de ICA de gravedad variable.
En otro ejemplo mas, distintos perfiles de referencia pueden representar un buen pronostico para la ICA frente a un mal pronostico para la ICA. En un ejemplo adicional, diferentes perfiles de referencia pueden representar pronosticos favorables o desfavorables de forma variable para la ICA.
Los perfiles de referencia, como se usa en la presente invencion, se pueden establecer de acuerdo con procedimientos conocidos previamente usados para otros biomarcadores.
Por ejemplo, un perfil de referencia de la cantidad de MCAM y la presencia, ausencia y/o cantidad de uno o mas de otros biomarcadores relacionados con la ICA para una prediccion, diagnostico y/o pronostico particular de ICA, se puede establecer determinando el perfil en la o las muestras de un individuo o de una poblacion de individuos caracterizados por dicha prediccion, diagnostico y/o pronostico particular de ICA (es decir, para los que dicha prediccion, diagnostico y/o pronostico de ICA es valida).
Dicha poblacion puede comprender sin limitacion > 2, > 10, > 100, o incluso varios cientos o mas individuos.
Por lo tanto, mediante un ejemplo ilustrativo, se pueden establecer perfiles de referencia para el diagnostico de ICA frente a la ausencia de ICA, determinando los perfiles en la o las muestras de un individuo o de una poblacion de individuos a los que se ha diagnosticado, respectivamente, que tienen o no tienen ICA.
En una realizacion, los presentes metodos pueden incluir una etapa de establecer dicho o dichos perfiles de referencia. En una realizacion, los presentes kits y dispositivos pueden incluir medios para establecer un perfil de referencia para una prediccion, diagnostico y/o pronostico particular de ICA. Dichos medios pueden comprender, por ejemplo, una o mas muestras (p. ej., muestras separadas o juntadas) de uno o mas individuos caracterizados por dicha prediccion, diagnostico y/o pronostico particular de ICA.
Ademas, se pueden usar analisis multiparametricos conocidos en la tecnica, cambiando lo que se deba cambiar, para determinar desviaciones entre grupos de valores y perfiles generados a partir de estos (p. ej., entre perfiles de biomarcadores de la muestra y de referencia).
Cuando se encuentra una desviacion entre el perfil de la muestra y un perfil de referencia que representa una determinada prediccion, diagnostico y/o pronostico de ICA, dicha desviacion es indicativa o se puede atribuir a la conclusion de que la prediccion, diagnostico y/o pronostico de ICA en dicho sujeto es diferente de la representada por el perfil de referencia.
Cuando no se encuentra desviacion entre el perfil de la muestra y un perfil de referencia que representa una determinada prediccion, diagnostico y/o pronostico de ICA, la ausencia de dicha desviacion es indicativa o se puede atribuir a la conclusion de que la prediccion, diagnostico y/o pronostico de ICA en dicho sujeto es sustancialmente la misma que la representada por el perfil de referencia.
La presente descripcion proporciona kits o dispositivos para el diagnostico de insuficiencia cardiaca, mas en particular de insuficiencia cardiaca aguda, que comprenden medios para detectar el nivel del marcador MCAM en una muestra del paciente. En una realizacion mas preferida, dicho kit o kits de la descripcion se pueden usar en marcos clmicos o en casa. El kit de acuerdo con la descripcion se puede usar para diagnosticar la insuficiencia cardiaca aguda, para el seguimiento de la eficacia del tratamiento de un sujeto que padece ICA con un agente, o para el cribado de sujetos para la prevencion de la aparicion de ICA en dicho sujeto.
En un marco clmico, el kit o dispositivo puede estar en forma de un dispositivo clfnico o en un marco de equipo de urgencias, p. ej., como parte del equipamiento de una ambulancia u otro vehfculo de urgencias movil o equipamiento de equipo o como parte de un kit de primeros auxilios. El kit o dispositivo de diagnostico puede ayudar a un medico, auxiliar de primeros auxilios o enfermera a decidir si el paciente que esta en observacion esta desarrollando una insuficiencia cardiaca aguda, despues de lo cual se puede llevar a cabo la accion o tratamiento adecuados.
Un kit de ensayo domestico da al paciente una lectura que puede comunicar a un medico, un auxiliar de primeros auxilios o al servicio de urgencias de un hospital, despues de lo cual se puede realizar la accion adecuada. Dicho dispositivo de ensayo domestico tiene un interes particular para gente que tiene antecedentes de, o tienen riesgo de padecer insuficiencia cardiaca (p. ej., pacientes con insuficiencia cardiaca cronica) o que tienen antecedentes o 5 tienen riesgo de padecer disnea (dificultad para respirar), que puede estar causada, p. ej., por insuficiencia cardiaca aguda, infecciones, problemas pulmonares, septicemia, etc. Dichos sujetos con un riesgo alto de insuficiencia cardiaca o que tienen antecedentes de disnea podnan realmente beneficiarse de tener en casa un dispositivo o kit de ensayo domestico de acuerdo con la invencion, porque entonces pueden distinguir facilmente entre un suceso de insuficiencia cardiaca aguda y otro suceso que cause disnea, dando lugar a una forma mas facil de determinar las 10 acciones que deben tomarse para resolver el problema.
Los kits o dispositivos tfpicos de acuerdo con la descripcion comprenden los siguientes elementos:
a) un medio para obtener una muestra del sujeto
b) un medio o dispositivo para medir la cantidad del marcador MCAM en dicha muestra y visualizar si la cantidad del marcador MCAM en dicha muestra esta por debajo o por encima de un determinado nivel o valor umbral, que indica
15 si el sujeto padece o no insuficiencia cardiaca aguda.
En cualquiera de las realizaciones de la invencion, los kits o dispositivos pueden comprender ademas, c) medios para comunicar directamente con un medico, un servicio de urgencias del hospital o un puesto de primeros auxilios, que indique que una persona esta sufriendo o no una insuficiencia cardiaca aguda.
La expresion “nivel o valor umbral” o “valor de referenda” se usa de forma intercambiable como un sinonimo y es 20 como se define en la presente memoria. Tambien puede ser un intervalo de valores base (p. ej., “peso en seco”) determinado en un paciente individual o en un grupo de pacientes con afecciones muy similares.
En cualquiera de las realizaciones de la descripcion, el dispositivo o kit o kits de la descripcion pueden comprender ademas medios para detectar el nivel de un marcador adicional para la insuficiencia cardiaca o la insuficiencia cardiaca aguda en la muestra de dicho paciente. Marcadores adicionales podnan ser, por ejemplo, el BNP o NT- 25 pro-BNP o fragmentos de BNP o NT-pro-BNP.
Se puede usar cualquiera de los kits definidos en la presente memoria como un dispositivo clmico para que use el propio sujeto o un medico.
En dicho kit de la descripcion, el medio para obtener una muestra del sujeto (a) puede ser cualquier medio para obtener una muestra de dicho sujeto, conocido en la tecnica. Los ejemplos para obtener, p. ej., una muestra de 30 sangre, son conocidos en la tecnica y podna ser cualquier tipo de dispositivo basado en lanceta o pinchazo en el dedo o piel, que basicamente perfora la piel y produce una gota de sangre que es liberada de la piel. Cuando se usa una muestra de orina, el medio para obtener una muestra del sujeto puede ser en forma de una tira absorbente tal como las usadas en las pruebas de embarazo domesticas conocidas en la tecnica. De forma analoga, una muestra de saliva se podna obtener usando una torunda en soporte conocida en la tecnica. Los ejemplos de dispositivos de 35 toma de muestra de sangre u otros dispositivos de toma de muestra se dan, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. n° 4.802.493, 4.966.159, 5.099.857, 6.095.988, 5.944.671, 4.553.541, 3.760.809, 5.395.388, 5.212.879, 5.630.828, 5.133.730, 4.653.513, 5.368.047, 5.569.287, 4.360.016, 5.413.006 y solicitudes de patente de EE.UU. n° 2002/111565, 2004/0096959, 2005/143713, 2005/137525, 2003/0153900, 2003/0088191, WO9955232,
WO2005/049107, WO2004/060163, WO02/056751, WO02/100254, WO2003/022330, WO2004/066822,
40 WO97/46157, WO2004/039429, o EP0364621, EP0078724, EP1212138, EP0081975, o EP0292928.
En dicho kit de la descripcion, el medio o dispositivo para medir la cantidad del marcador MCAM en dicha muestra (b) puede ser cualquier medio o dispositivo que pueda detectar espedficamente la cantidad de la protema MCAM en la muestra. Los ejemplos son sistemas que comprenden moleculas de union espedficas a MCAM unidas a una fase solida, p. ej., dispositivos de tiras o varillas de flujo lateral y similares, bien conocidos en la tecnica. Un ejemplo no 45 limitante para realizar un ensayo bioqmmico es usar una tira de ensayo y anticuerpos marcados, cuya combinacion no requiera ningun lavado de la membrana. La tira de ensayo es bien conocida, por ejemplo, en el campo de los kits de prueba de embarazo donde un anticuerpo anti-hCG esta presente sobre el soporte, y es transportado en complejo con la hCG por el flujo de orina a un segundo anticuerpo inmovilizado que permite la visualizacion. Otros ejemplos no limitantes de dichos dispositivos, sistemas o kits de ensayo domesticos se puede encontrar, por 50 ejemplo, en las siguientes patentes de EE.UU.: 6.107.045, US6.974.706, 5.108.889, 6.027.944, 6.482.156, 6.511.814, 5.824.268, 5.726.010, 6.001.658 o solicitudes de patente de EE.UU.: 2008/0090305 o 2003/0109067.
En una realizacion preferida, la descripcion proporciona un dispositivo o varilla de flujo lateral. Dicha varilla comprende una tira de ensayo que permite la migracion de una muestra por flujo capilar desde un extremo de la tira donde se aplica la muestra al otro extremo de dicha tira, donde se mide la presencia de un analito en dicha muestra.
55 En otra realizacion, la descripcion proporciona un dispositivo que comprende una tira de reactivos. Dicha tira de reactivos comprende una o mas almohadillas de ensayo que cuando se humedecen con la muestra, proporcionan un cambio de color en la presencia de un analito y/o indican la concentracion de la protema en dicha muestra.
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En una realizacion preferida del kit de la descripcion, el medio o dispositivo (1) para medir la cantidad de protema en una muestra (b), es un soporte solido (7) que tiene un extremo proximal (2) y distal (3) que comprende:
- una zona de aplicacion de la muestra (4) en la cercama del extremo proximal,
- una zona de reaccion (5) distal a la zona de aplicacion de la muestra (4), y
- una zona de deteccion (6) distal a la zona de reaccion (5),
por el cual dicho soporte tiene una propiedad capilar que dirige un flujo de la muestra fluida aplicada en la zona de aplicacion, en una direccion desde el extremo proximal al extremo distal,
- opcionalmente, el medio o dispositivo tambien comprende una fuente de fluido, p. ej., en un envase, pipeta cuentagotas o vial, que permite que muestras viscosas fluyan mas facilmente a traves de la tira.
La zona de reaccion (5) comprende una o mas bandas (10) de molecula de union a MCAM conjugada con un agente de deteccion (p. ej., oro coloidal), cuyo conjugado de molecula de union a MCAM esta dispuesto sobre el soporte solido de modo que puede migrar con el flujo capilar de fluido, es decir, no esta inmovilizado. La zona de deteccion (6) comprende una o mas bandas de captura (11) que comprenden una poblacion de moleculas de union a MCAM inmovilizadas sobre el soporte solido.
Cuando se aplica una muestra en la zona de aplicacion de la muestra (4), migra hacia la zona de reaccion (5) por flujo capilar. Cualquier MCAM presente en la muestra reacciona con el conjugado de molecula de union a MCAM marcada, y el complejo asf formado es transportado por flujo capilar a la zona de deteccion (6). La zona de deteccion (6), que tiene las moleculas de union a MCAM permanentemente inmovilizadas en la misma, captura e inmoviliza cualquier complejo, produciendo una concentracion localizada de conjugado que se puede visualizar.
Las dos zonas (5 y 6) como se describen en la presente memoria (una zona con los conjugados no fijados y una zona con los anticuerpos de captura fijados) en general no se superponen. Pueden estar dispuestas de forma adyacente con ausencia o presencia de un hueco intermedio del soporte solido que carece de banda. Una banda puede estar dispuesta sobre un soporte solido por cualquier medio, por ejemplo, absorbida, adsorbida, en recubrimiento, unida covalentemente o secada, dependiendo de si es necesario que el reactivo se movilice o no.
Con el fin de obtener una tira de ensayo semicuantitativa en la que solo se forme una senal una vez que el nivel de protema MCAM en la muestra es mayor que un determinado nivel o valor umbral predeterminado, la zona de reaccion (5) que comprende las moleculas de union a MCAM conjugadas no fijadas, podna comprender tambien una cantidad predeterminada de anticuerpos de captura de MCAM fijados. Esto permite capturar una determinada cantidad de protema MCAM presente en la muestra, que corresponde al nivel o valor umbral predeterminado. La cantidad restante de protema MCAM (si hay) unida por el conjugado o moleculas de union marcadas despues se puede dejar que migren a la zona de deteccion (6). En este caso, la zona de reaccion (6) solo recibira complejos de molecula de union marcada-MCAM y posteriormente solo produce una senal si el nivel de la protema MCAM en la muestra es mayor que el nivel o valor umbral predeterminado.
Otra posibilidad para determinar si la cantidad de la protema MCAM en la muestra esta por debajo o por encima de un determinado nivel o valor umbral, es usar un anticuerpo de captura primario que captura toda la protema MCAM presente en la muestra, en combinacion con un anticuerpo secundario marcado, que desarrolla una determinada senal o color cuando esta unido a la fase solida. La intensidad del color o senal despues se puede comparar con un cuadro de colores o senales de referencia que indica que cuando la intensidad de la senal esta por encima de una determinada senal umbral, la prueba es positiva (es decir, la ICA es inminente). Alternativamente, la cantidad o intensidad del color o senal se pueden medir con un dispositivo electronico que comprende, p. ej., un detector de absorbancia de luz o medidor de emision de luz, que produce un valor numerico de intensidad de senal o absorbancia de color formada, que despues se puede presentar al sujeto en forma de un resultado negativo si dicho valor numerico esta por debajo del valor umbral o un resultado positivo si dicho valor numerico esta por encima del valor umbral.
Esta realizacion es de particular relevancia en el seguimiento del nivel de MCAM en un paciente a lo largo de un periodo de tiempo.
El valor de referencia o intervalo se puede, p. ej., determinar usando el dispositivo domestico en un periodo en el que el sujeto no tiene ICA, dando al paciente una indicacion de su nivel base de MCAM. Por lo tanto, el uso regular del dispositivo domestico permitira que el sujeto note un cambio repentino en los niveles de MCAM comparado con el nivel base, lo cual le puede permitir contactar con un medico.
Alternativamente, se puede determinar el valor de referencia en el sujeto que padece ICA, el cual indica entonces su “nivel de riesgo” de MCAM personal, es decir, el nivel de MCAM que indica que esta expuesto o que pronto estara expuesto a un suceso de ICA. El nivel de riesgo es interesante para el seguimiento del progreso de la enfermedad o para evaluar el efecto del tratamiento. La reduccion del nivel de MCAM comparado con el nivel de riesgo indica que la afeccion del paciente esta mejorando.
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Ademas, el valor o nivel de referencia se puede establecer por resultados de mediciones combinadas en sujetos con estados patologicos o fenotipos muy similares (p. ej., todos en estado de ausencia de ICA o todos en estado de ICA).
Los ejemplos no limitantes de dichos pruebas semicuantitativas conocidas en la tecnica, cuyo principio se podna usar para el dispositivo de ensayo domestico de acuerdo con la presente descripcion, son la prueba de VIH/SlDA o pruebas de cancer de prostata vendidos por Sanitoets. La prueba de prostata domestica es una prueba rapida dirigida a un ensayo inicial semicuantitativo para detectar niveles de PSA en la sangre mayores que 4 ng/ml en la sangre entera. El kit de autodiagnostico domestico tfpico comprende los siguientes componentes: un dispositivo de enayo al que se va a administrar la muestra de sangre y que produce una senal cuando el nivel de protema esta por encima de un determinado nivel umbral, una cantidad de diluyente, p. ej., en una pipeta cuentagotas para ayudar a la transferencia de los analitos (es decir, la protema de interes) desde la zona de aplicacion a la zona de deteccion de la senal, opcionalmente una pipeta vacfa para recoger la muestra de sangre, un dispositivo de puncion del dedo, opcionalmente torunda esteril para limpiar la zona de la puncion, e instrucciones para usar el kit.
Tambien se conocen ensayos similares, p. ej., para la deteccion del cancer de mama y deteccion del nivel de protema CRP en el aspecto los ensayos domesticos de riesgo cardiaco. La ultima prueba abarca enviar el resultado de la prueba a un laboratorio, donde el resultado es interpretado por un tecnico o medico experto. Dicho diagnostico basado en telefono o internet de la afeccion del paciente, por supuesto es posible y aconsejable con la mayona de los kits, puesto que la interpretacion del resultado del ensayo a menudo es mas importante que realizar el ensayo. Cuando se usa un dispositivo electronico como se ha mencionado antes que da un valor numerico del nivel de protema presente en la muestra, este valor, por supuesto, se puede comunicar facilmente por telefono, telefono movil, telefono satelital, correo electronico, internet u otros medios de comunicacion, que avisan a un hospital, un medico o un equipo de primeros auxilios que una persona esta sufriendo una insuficiencia cardiaca aguda. Un ejemplo no limitante de dicho sistema se describe en la patente de EE.UU. 6.482.156.
En la siguiente descripcion se hace referencia a los dibujos en los que se ilustran realizaciones particulares de la descripcion; no se pretende que sean en absoluto limitantes. El experto puede adaptar el dispositivo y sustituir componentes y caractensticas de acuerdo con las practicas comunes del experto en la tecnica.
Las figuras 6A y B muestran una realizacion preferida de una tira de ensayo de la descripcion. La tira (1) incluye un extremo proximal (2) y un extremo distal (3). Se proporciona una zona de aplicacion de la muestra (4) en el extremo proximal (2), una zona de reaccion (5) esta adyacente a la misma y una zona de deteccion (6) esta en la cercama del extremo distal (3). Se puede depositar una muestra sobre el soporte solido (7) en la zona de aplicacion (4) para la transferencia por accion capilar a la zona de deteccion (6). Se puede proporcionar una capa protectora (8) que cubre cualquiera o ambas superficies del soporte solido (7), excepto una region de la zona de aplicacion de la muestra (4). Dicha capa protectora protege la muestra y constituyentes qmmicos de la tira de la contaminacion y evaporacion. Una o mas almohadillas absorbentes (9) en contacto capilar con la zona de aplicacion de la muestra (4) del soporte solido (7) pueden absorber y liberar muestra segun sea necesario; dicha almohadilla (9) tfpicamente esta colocada en la superficie del soporte solido (7) que es la misma o la opuesta a la zona de aplicacion de la muestra (4). En la figura 5B, la almohadilla absorbente (9) es parte de la zona de aplicacion de la muestra (4). Una o mas de las almohadillas absorbentes (9') se pueden poner en contacto capilar con la zona de deteccion (6) del soporte solido (7), distal a cualquiera de las bandas de captura (11), (14). Estas almohadillas (9') pueden absorber fluido que ha pasado por el soporte solido; dicha almohadilla (9') tfpicamente esta colocada en la superficie del soporte solido (7) que es la misma u opuesta a la zona de aplicacion de la muestra (4). El soporte solido (7) puede estar hecho de cualquier material adecuado que tenga una propiedad de accion capilar, y puede tener las mismas propiedades descritas antes. Debena ser capaz tambien de soportar una sustancia (p. ej., una molecula de union a MCAM no inmovilizada), que cuando se hidrata, puede migrar a traves del soporte solido por un flujo de fluido de accion capilar.
El soporte solido (7) tambien puede comprender una banda de conjugado de molecula de union a MCAM (10), situada en la zona de reaccion (5), en una posicion distal a la zona de aplicacion de la muestra (4). Cualquier MCAM en la muestra es transportada por accion capilar hacia esta banda (10), donde reacciona con el conjugado de molecula de union a MCAM inmovilizado de forma permanente.
El conjugado de molecula de union a MCAM puede estar asociado con o unido a un agente de deteccion para facilitar la deteccion. Los ejemplos de agentes de deteccion de laboratorio incluyen, pero no se limitan a marcadores luminiscentes; marcadores colorimetricos, tales como colorantes; marcadores fluorescentes; o marcadores qmmicos, tales como agente electroactivos (p. ej., ferrocianuro); enzimas, marcadores radiactivos; o marcadores de radiofrecuencia. Mas habitualmente, el agente de deteccion es una partmula. Los ejemplos de partmulas utiles en la practica de la descripcion incluyen, pero no se limitan a partmulas coloidales de oro; partmulas coloidales de azufre; partmulas coloidales de selenio; partmulas coloidales de sulfato de bario; partmulas coloidales de sulfato de hierro; partmulas de yodato metalico; partmulas de haluro de plata; partmulas de silice; partmulas coloidales de oxido metalico (hidrato); partmulas coloidales de sulfuro metalico; partmulas coloidales de selenuro de plomo; partmulas coloidales de selenuro de cadmio; partmulas coloidales de fosfato metalico; partmulas coloidales de ferrito metalico; cualquiera de las partmulas coloidales mencionadas antes recubiertas con capas organicas o inorganicas; moleculas de protemas o peptidos; liposomas; o partmulas de latex de polfmero organico, tales como perlas de latex de
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El soporte solido (7) ademas comprende una o mas bandas de captura (11) en la zona de deteccion (6). Una banda de captura comprende una poblacion de moleculas de union a MCAM inmovilizadas de forma permanente sobre el mismo. El complejo de MCAM:conjugado de molecula de union a MCAM formado en la zona de reaccion (5) migra hacia la zona de deteccion (6) donde dicha banda (11) captura el complejo que migra y lo concentra, permitiendo que sea visualizado a simple vista o usando una maquina lectora. La molecula de union a MCAM presente en la zona de reaccion (5) y en la zona de deteccion (6) puede reaccionar con la misma parte de MCAM o puede reaccionar con diferentes partes de MCAM.
Pueden estar presentes una o mas bandas de control (12) sobre el soporte solido (7). Por ejemplo, puede estar presente un peptido no inmovilizado (12) en la zona de aplicacion de la muestra (4), cuyo peptido no tiene reaccion cruzada con ninguna de las bandas de la molecula de union a MCAM (13) o (14). Cuando se aplica la muestra, migra hacia la zona de reaccion (5), donde esta dispuesto un conjugado de anticuerpo antipeptido y donde se forma un complejo peptido-anticuerpo. Dicho complejo migra hacia la zona de deteccion (6), donde una banda de captura (14) del anticuerpo antipeptido esta inmovilizada sobre el soporte solido, y que concentra dicho complejo permitiendo la visualizacion. La banda de captura de control (14) esta situada por separado de la banda de captura de MCAM (11), por lo tanto, se puede ver una reaccion positiva distinta de la reaccion de deteccion si el ensayo esta funcionando correctamente.
Una ventaja particular de un control de acuerdo con la descripcion, es que son controles internos, es decir, el control frente al que se pueden comparar los resultados de la medicion de MCAM esta presente en el soporte solido individual. Por lo tanto, los controles de acuerdo con la descripcion se pueden usar para corregir la variabilidad en el soporte solido, por ejemplo. Dicha correccion sena impracticable con controles externos que se basan, por ejemplo, en un muestreo estadfstico de soportes. Ademas, se pueden minimizar las variaciones de un lote a otro y de un experimento a otro, usando los agentes de union de control y agentes de control de acuerdo con la descripcion. Ademas, se pueden reducir los efectos de la union no espedfica. Todas estas correcciones senan diffciles de realizar usando controles externos, fuera del soporte.
Durante el ensayo, la MCAM de la muestra y el conjugado de molecula de union a MCAM se combinan y concentran sobre el soporte solido (7). Esta combinacion produce una concentracion de los compuestos que se pueden visualizar por encima del color de fondo del soporte solido (7). Los compuestos se pueden formar a partir de una combinacion de los compuestos mencionados antes, que incluyen anticuerpos, agentes de deteccion y otras partfculas asociadas con las zonas de reaccion y de deteccion. Basandose en el ensayo particular que se lleva a cabo, las zonas de reaccion y deteccion se pueden implementar selectivamente para lograr un intervalo dinamico adecuado que puede ser lineal o no lineal.
Un soporte solido (7) para realizar el ensayo puede estar albergado dentro de un cartucho (20) como se muestra, por ejemplo, en la figura 6. El cartucho preferiblemente es estanco frente a la orina, salvo por una o mas aberturas. El soporte solido (7) puede estar expuesto por una abertura (21) en el cartucho para proporcionar una zona de aplicacion (4) en el extremo proximal (2), y otra abertura (22) para permitir la lectura de la zona de deteccion (6) cerca del extremo distal (3). El cartucho (20) puede incluir un codigo detector (23) para comunicar con un dispositivo de lectura.
La presencia y/o concentracion de MCAM en una muestra se puede medir por resonancia de plasmon de superficie (SPR) usando un chip que tiene molecula de union a MCAM inmovilizada sobre el mismo, transferencia de energfa por resonancia de fluorescencia (FRET), transferencia de energfa por resonancia de bioluminiscencia (BRET), atenuacion de fluorescencia, medicion de polarizacion de fluorescencia u otros medios conocidos en la tecnica. Cualquiera de los ensayos de union descritos se puede usar para determinar la presencia y/o concentracion de MCAM en una muestra. Para hacer esto, la molecula de union a MCAM se hace reaccionar con una muestra, y la concentracion de MCAM se mide segun sea adecuado, para el ensayo de union que se esta usando. Para validar y calibrar un ensayo, se pueden llevar a cabo reacciones de control que usan diferentes concentraciones de MCAM y/o molecula de union a MCAM patron. Cuando se usan ensayos en fase solida, despues de incubacion, se lleva a cabo una etapa de lavado para eliminar la MCAM no unida. La MCAM unida se mide segun sea adecuado para el marcador dado (p. ej., recuento de centelleo, fluorescencia, anticuerpo-colorante etc.). Si se desea un resultado cuantitativo, pueden no ser necesarios los controles y diferentes concentraciones. Por supuesto se pueden cambiar las funciones de la MCAM y molecula de union a MCAM; el experto en la tecnica puede adaptar el metodo de modo que se aplique la molecula de union a MCAM a la muestra, en diferentes concentraciones de muestra.
Una molecula de union a MCAM de acuerdo con la descripcion es cualquier sustancia que se une espedficamente a la MCAM. Los ejemplos de una molecula de union a MCAM util de acuerdo con la presente descripcion, incluyen, pero no se limitan a un anticuerpo, un polipeptido, un peptido, un lfpido, un hidrato de carbono, un acido nucleico, un peptido-acido nucleico, molecula pequena, molecula organica pequena, u otro candidato a farmaco. Una molecula de union a MCAM puede ser un compuesto natural o sintetico, que incluye, por ejemplo, molecula pequena sintetica,
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compuesto contenido en extractos de celulas animales, vegetales, bacterianas o fungicas, as^ como medio condicionado de dichas celulas. Alternativamente, la molecula de union a MCAM puede ser una protema geneticamente modificada que tiene sitios de union para la MCAM. De acuerdo con un aspecto de la descripcion, una molecula de union a MCAM se une espedficamente a la MCAM con una afinidad mejor que 10-6 M. Una molecula de union a MCAM adecuada se puede determinar a partir de su union con una muestra patron de MCAM. Los metodos para determinar la union entre la molecula de union a MCAM y la MCAM son conocidos en la tecnica. Como se usa en la presente memoria, el termino anticuerpo incluye, pero no se limita a anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales, anticuerpos humanizados o quimericos, anticuerpos geneticamente modificados, y fragmentos de anticuerpo biologicamente funcionales (p. ej., scFv, Nanobodies, Fv, etc.) suficientes para la union del fragmento de anticuerpo a la protema. Dicho anticuerpo puede estar disponible en el comercio contra la MCAM, tal como, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal de raton, rata, humano o humanizado.
En una realizacion preferida, la molecula o agente de union es capaz de unirse tanto a la protema MCAM madura unidad a membrana o a celula o como al fragmento. En una realizacion mas preferida, el agente o molecula de union se une espedficamente o se detecta la forma soluble, preferiblemente la forma de MCAM circulante plasmatica, como se define en la presente memoria.
De acuerdo con un aspecto de la descripcion, la molecula de union a MCAM esta marcada con un marcador que permite la deteccion con otro agente (p. ej., con una pareja de union a sonda). Dichos marcadores pueden ser, por ejemplo, biotina, estreptavidina, marcador his, marcador myc, maltosa, protema de union a maltosa o cualquier otro tipo de marcador conocido en la tecnica que tenga una pareja de union. El ejemplo de asociaciones que se pueden usar en la disposicion de detector:pareja de union puede ser cualquiera, e incluye por ejemplo, biotina:estreptavidina, marcador de his:ion metalico (p. ej., Ni2+), maltosa:protema de union a maltosa.
En otra realizacion, la descripcion proporciona una tira reactiva colorimetrica simple y precisa y el metodo para medir la presencia de MCAM en una muestra. Mas en particular, la presente descripcion tambien se refiere a un dispositivo que comprende una tira reactiva. La presente tira reactiva comprende un soporte solido que se proporciona con al menos una almohadilla de ensayo para medir la presencia de MCAM en una muestra. Dicha almohadilla de ensayo preferiblemente comprende una matriz vehmulo que incorpora una composicion de reactivos capaz de interaccionar con la MCAM para producir una respuesta medible, preferiblemente una respuesta medible visualmente o mediante un instrumento. La tira reactiva puede estar fabricada en cualquier tamano y forma, pero en general la tira reactiva es mas larga que ancha. El soporte solido puede estar compuesto de cualquier material adecuado y preferiblemente esta hecho de material firme o ngido tal como acetato de celulosa, poli(tereftalato de etileno), polipropileno, policarbonato o poliestireno. En general, la matriz vehmulo es un material absorbente que permite que la muestra de orina se mueva, en respuesta a fuerzas capilares, a traves de la matriz vehmulo para ponerse en contacto con la composicion de reactivos y producir una transicion de color detectable o medible. La matriz vehmulo puede ser cualquier sustancia capaz de incorporar los reactivos qmmicos necesarios para llevar a cabo el ensayo de interes, con la condicion de que la matriz vehmulo sea sustancialmente inerte con respecto a los reactivos qmmicos, y sea porosa o absorbente con respecto a los componentes solubles de la muestra de ensayo lfquida. La expresion “matriz vehmulo” se refiere a matrices absorbentes o no absorbentes que son insolubles en agua y otros lfquidos fisiologicos y mantienen su integridad estructural cuando se exponen a agua y otros lfquidos fisiologicos. Las matrices absorbentes adecuadas incluyen papel de filtro, materiales de esponja, celulosa, madera, telas tejidas y no tejidas y similares. Las matrices no absorbentes incluyen fibra de vidrio, pelmulas polfmeras y membranas preformadas o microporosas. Otras matrices vehmulo adecuadas incluyen polvos inorganicos hidrofilos tales como gel de silice, alumina, tierra de diatomeas y similares; sustancias arcillosas; tela; materiales polfmeros naturales hidrofilos, en particular material de celulosa, como perlas celulosicas, y en especial papeles que contienen fibra tales como papel de filtro o papel cromatografico; polfmeros que se encuentran de forma natural sinteticos o modificados, tales como gelatina reticulada, acetato de celulosa, poli(cloruro de vinilo), poliacrilamida, celulosa, poli(alcohol vimlico), polisulfonas, poliesteres, poliacrilatos, poliuretanos, dextrano reticulado, agarosa, y otros de dichos polfmeros hidrofilos insolubles en agua reticulados y no reticulados. Las sustancias hidrofobas y no absorbentes no son adecuadas para usar como la matriz vehmulo de la presente descripcion. Las matrices vehmulo pueden ser de diferentes composiciones qmmicas o una mezcla de composiciones qmmicas. Las matrices tambien pueden variar en cuanto a la lisura o rugosidad combinado con la dureza y blandura. Sin embargo, en cada caso la matriz vehmulo comprende un material hidrofilo o absorbente. La matriz vehfculo esta construida lo mas ventajosamente de papel de filtro absorbente o pelmulas polfmeras no absorbentes. Una matriz vehmulo preferida es una matriz absorbente, hidrofila, que incluye materiales celulosicos, tales como papel, y preferiblemente papel de filtro o una matriz no absorbente, que incluye pelmulas polfmeras, tales como un poliuretano o una gelatina reticulada. Una composicion de reactivos que produce un cambio colorimetrico cuando se hace reaccionar con MCAM en una muestra, se puede incorporar homogeneamente en la matriz vehmulo, y la matriz vehmulo contiene entonces la composicion de reactivos homogeneamente por toda la matriz vehmulo, mientras que mantiene la penetrabilidad de la matriz vehmulo por el componente predeterminado de la muestra de ensayo. Los ejemplos de composiciones de reactivos adecuadas pueden incluir, por ejemplo, una molecula de union a MCAM en el caso de una tecnica basada en anticuerpo, o tampon de pH en el caso de deteccion enzimatica. La composicion de reactivos preferiblemente se seca y estabiliza sobre una almohadilla de ensayo adherida a al menos un extremo de un soporte solido. La almohadilla de ensayo sobre la que se absorbe y seca la composicion de reactivos, esta hecha preferiblemente de un material de membrana que muestra un color de fondo mmimo. Preferiblemente, la almohadilla de ensayo puede
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estar construida de materiales lavados con acido o base, con el fin de minimizar el color de fondo. En otra realizacion, la composicion de reactivos que se seca sobre la tira reactiva comprende ademas agentes humectantes para reducir la fragilidad de la almohadilla de ensayo. Los ejemplos no limitantes de agentes humectantes preferidos incluyen Triton X-100, Bioterg, glicerol, 0 Tween, y similares. La composicion de reactivos se puede aplicar a la tira reactiva por cualquier metodo conocido en la tecnica. Por ejemplo, la matriz vehmulo a partir de la cual estan hechas las almohadillas de ensayo, se puede sumergir en una solucion de la composicion de reactivos y secar de acuerdo con tecnicas conocidas en la materia. Una tira reactiva de acuerdo con la descripcion se puede proporcionar con multiples almohadillas de ensayo para ensayar mas de un analito en una muestra de orina. Se puede proporcionar una tira reactiva que comprende un soporte solido provista de una o mas almohadillas de ensayo que incluyen almohadillas de ensayo para medir la presencia de uno o mas analitos seleccionados del grupo que comprende protemas tales como marcadores de ICA, BNP, NT-pro-BNP o fragmentos de los mismos, sangre, leucocitos, nitrito, glucosa, cetonas, creatinina, albumina, bilirrubina, urobilinogeno y/o una almohadilla de ensayo de pH, y/o una almohadilla de ensayo para medir la gravedad espedfica.
Una posible realizacion de una tira reactiva 101 de acuerdo con la descripcion se representa esquematicamente en la figura 8 A-B. La tira 101 incluye un extremo proximal 102 y un extremo distal 103. Se proporcionan diferentes almohadillas de ensayo 109, 109', 109” sobre las que se proporcionan las composiciones de reactivos en el extremo proximal 102 sobre el soporte solido 107 de la tira reactiva. La tira debe estar disenada de modo que se pueda humectar con una cantidad de muestra suficientemente grande, opcionalmente diluida por un lfquido fisiologico que mejore el flujo capilar de una muestra viscosa tal como sangre o saliva y similares.
Una tira reactiva como se define en la presente memoria, se usa como sigue. Brevemente, una o mas zonas de la almohadilla de ensayo de la tira reactiva de la descripcion se sumergen en una muestra o se aplica una pequena cantidad de muestra a la tira reactiva sobre la o las zonas de la almohadilla de ensayo. Se produce un desarrollo de color que se puede analizar visualmente o por reflectometna en la tira reactiva en un espacio de tiempo corto, normalmente en el espacio de 0,5 a 10 minutos. El cambio de color de la zona de reactivo sobre la almohadilla de ensayo tras la reaccion con MCAM preferiblemente es directamente proporcional a la concentracion de MCAM en la muestra del paciente. La intensidad de color que se desarrolla en la almohadilla de ensayo se puede determinar visualmente o por un lector basado en la reflectancia, por ejemplo. El desarrollo de color y la o las zonas de la almohadilla de ensayo se comparan con un color o colores de referencia para determinar una estimacion de la cantidad de MCAM presente en la muestra. La intensidad de color que se desarrolla en la almohadilla de ensayo se compara con al menos uno, y preferiblemente al menos dos tonos de color estandar que corresponden a un intervalo de concentracion de MCAM determinada por aplicacion de un factor de correccion.
La tira reactiva puede comprender ademas un colorante fluorescente o infrarrojo, aplicado a la tira soporte o incorporada en una almohadilla de ensayo, que asegura el alineamiento adecuado de la tira reactiva en un aparato que tiene un sistema de deteccion para la respuesta detectable o medible.
En otra realizacion, la descripcion se refiere tambien a una almohadilla de ensayo para medir la presencia de MCAM en una muestra. Preferiblemente, dicha almohadilla de ensayo comprende una matriz vehmulo que incorpora una composicion de reactivos capaz de interaccionar con la MCAM para producir una respuesta medible, preferiblemente una respuesta medible visualmente o mediante un instrumento. En otra realizacion preferida, la descripcion proporciona una almohadilla de ensayo segun se define en la presente memoria para usar en una tira reactiva, preferiblemente en una tira reactiva como se define en la presente memoria.
Los agentes de union espedficos, peptidos, polipeptidos, protemas, biomarcadores etc. en los presentes kits, pueden estar en diferentes formas, p. ej., liofilizados, libres en solucion o inmovilizados en una fase solida. Se pueden proporcionar, p.ej., en una placa de multipocillos o como una matriz o micromatriz, o se pueden envasar por separado y/o individualmente. Se pueden marcar de forma adecuada como se ensena en la presente memoria. Dichos kits pueden ser particularmente adecuados para llevar a cabo los metodos de ensayo de la descripcion, tales como, p. ej., inmunoensayos, ensayos ELISA, ensayos de espectrometna de masas, y similares.
Los aspectos y realizaciones anteriores se apoyan mejor mediante los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplos
Ejemplo 1: Cuantificacion de protemas dirigida por MASSterclass para la validacion temprana de marcadores candidatos derivados del descubrimiento
Configuracion experimental de MASSterclass
Los ensayos de MASSterclass usan espectrometna de masas en tandem dirigida con dilucion de isotopos estable como un sistema de cuantificacion de peptidos de etapa final (llamado tambien Monitorizacion de Reaccion Multiple (MRM) y Monitorizacion de Reaccion Seleccionada (SRM)). El peptido diana es espedfico (es decir, proteotfpico) para la protema espedfica de interes, es decir, la cantidad de peptido medida esta directamente relacionada con la cantidad de protema en la muestra original. Para alcanzar la especificidad y sensibilidad necesarias para la cuantificacion de biomarcadores en muestras complejas, preceden fraccionamientos de peptidos a la etapa de cuantificacion final.
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Un ensayo MASSterclass adecuado puede incluir las siguientes etapas:
- Muestra de plasma/suero
- Reduccion de albumina humana e IgG (reduccion de complejidad en el nivel de protemas) usando captura de afinidad con anticuerpos anti-albumina y anti-IgG usando columnas centnfugas ProteoPre (Sigma Aldrich)
- Adicion de cantidades conocidas de peptidos con marcaje isotopico. Este peptido tiene la misma secuencia de aminoacidos que el peptido proteotfpico de interes, tipicamente con un aminoacido con marcaje isotopico incorporado en el mismo para generar una diferencia de masa. Durante el procedimiento entero, el peptido marcado tiene identico comportamiento qmmico y cromatografico que el peptido endogeno, excepto durante la etapa de cuantificacion de etapa final que se basa en la masa molecular.
- Digestion tnptica. Las protemas en la muestra de suero/plasma reducida se digieren en peptidos usando tripsina. Esta enzima escinde protemas de forma C-terminal desde lisina y arginina, excepto cuando esta presente una prolina C-terminal de la lisina o arginina. Antes de la digestion, las protemas se desnaturalizan por ebullicion, que vuelve a la molecula de protema mas accesible para la actividad de la tripsina durante las 16 h de incubacion a 37°C.
- Primer fraccionamiento basado en peptidos: La electroforesis de flujo libre (FFE; BD Diagnostic) es una tecnica de separacion de fluidos sin gel, en la que moleculas cargadas que se mueven en un flujo laminar continuo se separan por un campo electrico perpendicular al flujo. El campo electrico hace que las moleculas cargadas se separen en un gradiente de pH de acuerdo con su punto isoelectrico (pi). Solo las fracciones que contienen los peptidos seguidos se seleccionan para el fraccionamiento adicional y analisis de LC-MS/MS. Cada peptido de interes eluye de la camara de FFE en un numero de fraccion espedfico, que se determina durante el desarrollo del ensayo de protemas usando el homologo del peptido sintetico. Las fracciones espedficas o mezclas de fracciones (multiplexado) continuan al siguiente nivel de fraccionamiento.
- Segundo fraccionamiento basado en peptidos: La HPLC con fenilo (XBridge Phenyl; Waters) separa peptidos de acuerdo con la hidrofobicidad y naturaleza aromatica de los aminoacidos presentes en la secuencia peptfdica. La ortogonalidad con la separacion en C18 de la etapa final se logra trabajando con la columna a un valor de pH mayor (pH 10). Como demostraron Gilar et al. 2005, J Sep Sci 28(14): 1694-1703), el pH es de lejos el parametro mas drastico para alterar la selectividad de peptidos en la RP-HPLC. Cada peptido de interes eluye de la columna de Fenilo con un tiempo de retencion espedfico, que se determina durante el desarrollo del ensayo de protemas usando el homologo de peptido sintetico. El uso de un sistema de control externo, en el que una mezcla de 9 peptidos patron se separa por adelantado de un lote de separaciones de muestra, permite ajustar la recoleccion de fracciones con el fin de corregir los cambios de tiempo de retencion. La extension del fraccionamiento depende de la concentracion de la protema en la muestra y la complejidad de esa muestra.
- La cuantificacion basada en LC-MS/MS, que incluye la separacion adicional en fase inversa (C18) nanoLC (PepMap C18; Dionex) y MS/MS: espectrometna de masas en tandem usando el modo de MRM (4000 QTRAP; ABI)/SRM (Vantage TSQ; Thermo Scientific). La columna LC se conecta a una aguja de electropulverizacion conectada a la cabeza de la fuente del espectrometro de masas. Cuando el material eluye de la columna, las moleculas son ionizadas y entran en el espectrometro de masas en la fase gaseosa. El peptido que se sigue se selecciona espedficamente para pasar el primer cuadrupolo (Q1), basado en su relacion de masa a carga (m/z). Despues, el peptido seleccionado se fragmenta en un segundo cuadrupolo (Q2) que se usa como una celda de colision. Los fragmentos resultantes despues entran en el tercer cuadrupolo (Q3). Dependiendo de los ajustes del instrumento (determinados durante la fase de desarrollo del ensayo) solo se seleccionan para la deteccion un fragmento de peptido espedfico o fragmentos de peptidos espedficos (o las llamadas transiciones).
- La combinacion de m/z del peptido seguido y de m/z del fragmento seguido de este peptido se llama una transicion. Este procedimiento se puede llevar a cabo para multiples transiciones durante un experimento. Tanto el peptido endogeno (analito) como su correspondiente peptido sintetico con marcaje isotopico (patron interno) eluyen en el mismo tiempo de retencion, y se miden en el mismo experimento de LC-MS/MS.
- La lectura de MASSterclass se define por la relacion entre el area bajo el pico espedfico para el analito y el area bajo el pico espedfico para el analogo sintetico con marcaje isotopico (patron interno). Las lecturas de MASSterclass estan directamente relacionadas con la concentracion original de la protema en la muestra. Por lo tanto, se pueden comparar las lecturas de MASSterclass entre diferentes muestras y grupos de muestras.
A continuacion se da un protocolo de MASSterclass tfpico que se sigue en el presente estudio:
- 25 |jl de plasma se someten a reduccion de la albumina e IgG humanas (columnas centnfugas ProteoPre; Sigma Aldrich) de acuerdo con el protocolo del fabricante, excepto que se uso NH4HCO3 20 mM como el tampon de union/equilibrado.
- La muestra reducida (225 jl) se desnaturaliza durante 15 min a 95°C y se enfna inmediatamente sobre hielo
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- Se anaden a la muestra 500 fmol del peptido con marcaje isotopico (peptido “Heavy AQUA” hecho por encargo; Thermo Scientific)
- Se anaden 20 |jg de tripsina a la muestra y se deja que se produzca la digestion durante 16 h a 37°C
- La muestra digerida se diluyo primero 1/8 en disolvente A (acido formico al 0,1%) y despues 1/20 en el mismo disolvente que contema 250 amol/jl de todos los peptidos con marcaje isotopico (peptido “Heavy AQUA” hecho por encargo; Thermo Scientific) de interes.
- Se separaron 20 jl de la dilucion final usando nano-LC de fase inversa con MS/MS en lmea en el modo MRM/SRM:
- Columna: PepMap C18, D.I. 75 jm x L 25 cm, diametro de poros 100 A, tamano de partmulas 5 jm
- Disolvente A: acido formico al 0,1%
- Disolvente B: acetonitrilo 80%, acido formico al 0,1%
- Gradiente: 30 min; 2%-55% de disolvente B
- MS/MS en modo MRM: el metodo contiene las transiciones para el analito asf como para el peptido marcado sintetico.
- Las transiciones usadas se determinaron experimentalmente y se seleccionaron durante el desarrollo del ensayo de protemas
- Cada una de las transiciones de interes se midio durante un periodo que empezaba 3 min antes y terminaba 3 min despues del tiempo de retencion determinado del peptido de interes, asegurandose de que cada pico tema al menos un conjunto de 15 datos.
- Los datos no procesados se analizaron y cuantificaron usando el programa de ordenador LCQuan (Thermo Scientific): el area bajo el pico del analito (= el peptido MCAM) y el bajo el pico del patron interno (el peptido MCAM sintetico, marcado) en el mismo tiempo de retencion en C18 se determinaron por deteccion automatica del pico. Estos se comprobaron manualmente.
- La lectura de MASSterclass se definio por la relacion el area del pico del analito y el area del pico del patron interno Analisis estadfstico de MASSterclass
Las proporciones medidas son cuantificaciones diferenciales de peptidos. En otras palabras, una proporcion es la concentracion normalizada de un peptido. La concentracion de un peptido es proporcional a la proporcion medida con la espectrometna de masas.
Se lleva a cabo un analisis estadfstico con el fin de determinar la precision diagnostica de una protema espedfica. Para hacer esto, se comparan las clases de muestras por parejas. El analisis define la capacidad de una protema para discriminar dos poblaciones de muestras.
El rendimiento diagnostico de una protema espedfica se determino midiendo el area bajo las curvas (AUC) de Caractensticas Operativas del Receptor (ROC) (curva de eficacia diagnostica) (vease, Sullivan Pepe M, The statistical evaluation of medical tests for classification and prediction. 1993 Oxford University Press New York). Los intervalos de confianza (IC) y estimados de las AUC tambien se computaron usando un procedimiento no parametrico, en concreto el metodo Bootstrap (vease, Efron B, Tibshirani RJ. Nonparametric confidence intervals. An introduction to the bootstrap. Monographs on statistics and applied probability. 1993; 57:75-90 Chapman & Hall New York).
Ejemplo 2: Verificacion del valor diagnostico del marcador candidato MCAM usando MASSterclass
Se recogieron muestras clmicas de forma prospectiva a lo largo de 3 centros medicos diferentes de pacientes que se presentaron en el servicio de urgencias (SU) con disnea aguda (n=100) relacionada con insuficiencia cardiaca agua o relacionada con otras causas (= disnea sin ICA).
Para todos los pacientes incluidos se completo un cuaderno de recogida de datos (CRD) con detalles sobre antecedentes medicos, diagnostico de ingreso y medicacion.
El analisis de Caractensticas Operativas del Receptor (ROC) demostro que la MCAM era muy sensible y espedfica para el diagnostico de ICA en pacientes disneicos que se presentaban en el SU, indicado por una mediana del AUC general de 0,91 con IC al 95% de 0,85-0,96 (vease la figura 4). Este rendimiento diagnostico es equivalente al BNP y NT-proBNP, el patron referencial actual de los biomarcadores para el diagnostico de ICA en la poblacion con disnea aguda. La tabla 1 cita los resultados.
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Tabla 1:
BNP NT-proBNP MCAM
Mediana de AUC
0,88 0,85 0,91
IC al 95%
0,82-0,95 0,77-0,92 0,85-0,96
La combinacion de la MCAM con el BNP tiene un impacto significativo en la precision diagnostica general, alcanzando un maximo de 86% en el conjunto de datos actual (vease la figura 4). La precision diagnostica de la MCAM y el BNP en un solo punto de corte y la combinacion de los dos marcadores se resume en la siguiente tabla 2. Teniendo en cuenta que 100 pg/ml es el punto de corte de “descarte” usado clmicamente para el BNP, el uso del nivel de MCAM en un solo punto de corte puede mejorar mucho la precision diagnostica del BNP. Los valores de MCAM pueden compensar la falta de especificidad del BNP cuando los valores son superiores a 100 pg/ml.
Tabla 2:
Precision de BNP en 100 pg/ml =
71%
Precision de MCAM =
84%
Precision de BNP (descarte) + MCAM =
86%
Ejemplo 3: Verificacion de la MCAM como un marcador del progreso de la enfermedad: comparacion de los niveles en el ingreso frente al alta.
Se recogieron muestras de los pacientes a los que se diagnostico insuficiencia cardiaca agua tanto en el ingreso en el SU como en el alta del hospital, es decir, cuando se considero que los pacientes se habfan recuperado y estaban estables. Como media la muestra del alta se recogio 9-11 dfas despues de la muestra de ingreso. Los niveles de MCAM se midieron usando MASSterclass tanto en ambas muestras y se compararon los niveles dentro del mismo paciente. Para la mayona de los pacientes hubo una disminucion significativa de MCAM cuando se compararon los niveles en el ingreso y en el alta (figura 5). Se obtiene un cuadro muy parecido cuando se comparan los niveles de BNP en el ingreso frente al alta. Estos datos apoyan la idea de que los niveles de MCAM son un reflejo del estado de la enfermedad y por lo tanto se podnan usar para el seguimiento y/o prediccion de un suceso agudo.
Ademas el tratamiento principal dado a estos pacientes de ICA eran diureticos y como consecuencia los pacientes perdieron lfquidos. Por lo tanto, una disminucion de los niveles de MCAM es reflejo de un cambio en el estado de llenado de los pacientes.
Ejemplo 4: niveles de MCAM asociados con la ganancia de peso y perdida de peso en pacientes con disnea aguda.
Se cribo la MCAM de muestras clmicas de pacientes con disnea aguda (cohorte de BASEL V como se describe en Potocki et al., Journal of Internal Medicine enero 2010;267(1):119-29), a los que se habfa diagnosticado insuficiencia cardiaca aguda descompensada o disnea debido a otras causas, usando MASSterclass. Todos los datos clmicos relativos a las muestras se obtuvieron por el colaborador clmico y se anadieron a la ruta de analisis de datos de MASSterclass.
Las asociaciones de los niveles de MCAM con todos los parametros clmicos disponibles se computaron usando pruebas estadfsticas unifactoriales. Se uso la prueba de correlacion por rangos de Spearman para computar los coeficientes de correlacion y la prueba de suma de rangos de Wilcoxon para evaluar si dos muestras de observacion independientes proceden de la misma poblacion.
Estos analisis mostraron una clara asociacion de la MCAM con la ganancia de peso antes del ingreso en el hospital y perdida de peso despues del uso de diureticos terapeuticos, indicado por los p valores de Wilcoxon bajos (resumido en la tabla 3).
Tabla 3:
poblacion MCAM p-valores
perdida de peso del ingreso al alta
ICA 0,00383
ganancia de peso antes del ingreso
ICA 0,00058
La figura 9 ilustra el efecto de la ganancia de peso en los niveles de MCAM. Los pacientes con ICA que subieron de peso antes del ingreso en el hospital (acumulacion de Uquidos) tienen niveles de MCAM claramente aumentados.
Ejemplo 5: los niveles de MCAM aumentan en pacientes con ICA con disfuncion sistolica
El efecto de la disfuncion sistolica frente a la diastolica en pacientes con insuficiencia cardiaca, en los niveles de MCAM, se investigo basandose en los resultados del cribado de MASSterclass de la cohorte de BASEL V. Esta cohorte contiene un numero suficiente de pacientes con ICA con fraccion de eyeccion ventricular izquierda reducida
(FEVI<55) o FEVI conservada (FEVI>55). Los niveles de MCAM eran significativamente mayores en pacientes con ICA con fracciones de eyeccion reducidas (p<0,001). La figura 10 muestra graficas de cajas y bigotes para la MCAM en estas dos subpoblaciones de ICA.
Los pacientes con una disfuncion sistolica (FE reducida) son mas resistentes a la acumulacion de Ifquidos y 5 acumularan mas volumen comparado con pacientes con disfuncion diastolica antes de que se produzcan los smtomas de disnea.

Claims (18)

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    REIVINDICACIONES
    1. Uso de MCAM como un biomarcador para diagnosticar, predecir y/o pronosticar la insuficiencia cardiaca agua (ICA) en un sujeto.
  2. 2. Un metodo para diagnosticar, predecir y/o pronosticar la insuficiencia cardiaca agua (ICA) en un sujeto, caracterizado porque la fase de examen del metodo comprende medir la cantidad de MCAM en una muestra del sujeto.
  3. 3. El metodo segun la reivindicacion 2, que comprende las etapas de:
    (i) medir la cantidad de MCAM en la muestra del sujeto;
    (ii) comparar la cantidad de MCAM medida en (i) con un valor de referencia de la cantidad de MCAM, representando dicho valor de referencia un diagnostico, prediccion y/o pronostico conocido de ICA;
    (iii) encontrar una desviacion o ausencia de desviacion de la cantidad de MCAM medida en (i) respecto al valor de referencia;
    (iv) atribuir dicha desviacion o ausencia de desviacion encontrada a un diagnostico, prediccion y/o pronostico particular de ICA en el sujeto.
  4. 4. El metodo segun las reivindicaciones 2 o 3, en donde una cantidad elevada de MCAM en la muestra del sujeto comparada con un valor de referencia que representa el diagnostico o prediccion de ausencia de ICA o que representa un buen pronostico para la ICA, indica que el sujeto tiene o tiene riesgo de tener ICA o indica un mal pronostico para la ICA en el sujeto.
  5. 5. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde el sujeto presenta uno o mas smtomas y/o signos potencialmente indicativos de ICA, en donde el sujeto presenta disnea, p. ej., causada por EPOC, neumoma o ICA, o en donde el sujeto tiene antecedentes medicos de insuficiencia cardiaca.
  6. 6. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, para diagnosticar insuficiencia cardiaca agua (ICA) o recuperacion de la misma, en un sujeto ingresado en el hospital, que comprende las etapas de:
    (i) medir la cantidad de MCAM en la muestra del sujeto tras el ingreso en el hospital y en un tiempo de medicion donde se haga un diagnostico de recuperacion de la ICA;
    (ii) comparar la cantidad de MCAM medida en (i) con un valor de referencia de la cantidad de MCAM, representando dicho valor de referencia un diagnostico, prediccion y/o pronostico conocido de ICA;
    (iii) encontrar una desviacion o ausencia de desviacion de la cantidad de MCAM medida en (i) respecto al valor de referencia;
    (iv) atribuir dicha desviacion o ausencia de desviacion encontrada a un diagnostico particular de ICA o recuperacion de ICA en el sujeto.
  7. 7. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 para el seguimiento de un cambio en el diagnostico, prediccion y/o pronostico de ICA en un sujeto, que comprende:
    (i) aplicar el metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 al sujeto en uno o mas tiempos de medicion sucesivos, de modo que se determine el diagnostico, prediccion y/o pronostico de ICA en el sujeto en dichos tiempos de medicion sucesivos;
    (ii) comparar el diagnostico, prediccion y/o pronostico de ICA en el sujeto en dichos tiempos de medicion sucesivos determinados en (i); y
    (iii) encontrar la presencia o ausencia de un cambio entre el diagnostico, prediccion y/o pronostico de ICA en el sujeto en dichos tiempos de medicion sucesivos determinados en (i).
  8. 8. El metodo segun la reivindicacion 7, en donde dicho cambio en el diagnostico, prediccion y/o pronostico de ICA en sujetos se sigue en el transcurso de un tratamiento medico de dicho sujeto.
  9. 9. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 8, en donde la fase de examen del metodo comprende ademas medir la presencia o ausencia y/o cantidad de uno o mas de otros biomarcadores utiles para el diagnostico, prediccion y/o pronostico de ICA en la muestra del sujeto, en donde dicho otro biomarcador util para el diagnostico, prediccion y/o pronostico de ICA se elige del grupo que consiste en el peptido natriuretico tipo B (BNP), propeptido natriuretico tipo B (proBNP), y fragmento amino terminal del propeptido natriuretico tipo B (NTproBNP).
  10. 10. El metodo segun la reivindicacion 9, que comprende las etapas de:
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    (i) medir la cantidad de MCAM y la presencia o ausencia y/o la cantidad de dichos uno o mas de otros biomarcadores en la muestra del sujeto;
    (ii) usar las mediciones de (i) para establecer un perfil del sujeto de la cantidad MCAM y la presencia o ausencia y/o la cantidad de dichos uno o mas de otros biomarcadores;
    (iii) comparar dicho perfil del sujeto de (ii) con un perfil de referencia de la cantidad de MCAM y la presencia o ausencia y/o la cantidad de dichos uno o mas de otros biomarcadores, representando dicho perfil de referencia un diagnostico, prediccion y/o pronostico conocido de ICA;
    (iv) encontrar una desviacion o ausencia de desviacion del perfil del sujeto de (ii) respecto al perfil de referencia;
    (v) atribuir dicha desviacion o ausencia de desviacion descubierta a un diagnostico, prediccion y/o pronostico particular de ICA en el sujeto.
  11. 11. Un metodo para establecer un perfil de referencia para la cantidad de MCAM y opcionalmente la presencia o ausencia y/o cantidad de uno o mas de otros biomarcadores utiles para el diagnostico, prediccion y/o pronostico de ICA, representando dicho perfil de referencia:
    (a) un diagnostico o prediccion de ausencia de ICA o un buen pronostico para la ICA, o
    (b) un diagnostico o prediccion de ICA o un mal pronostico para la ICA, que comprende:
    (i) medir la cantidad de MCAM y opcionalmente la presencia o ausencia y/o la cantidad de dichos uno o mas de otros biomarcadores en:
    (i a) una o mas muestras de uno o mas sujetos que no tienen ICA o no estan en riesgo de tener ICA o que tienen un buen pronostico para la ICA; o
    (i b) una o mas muestras de uno o mas sujetos que tienen ICA o estan en riesgo de tener ICA o tienen mal pronostico para la ICA;
    (ii)
    (ii a) usar las mediciones de (i a) para crear un perfil de la cantidad de MCAM y opcionalmente de la presencia o ausencia y/o la cantidad de dichos uno o mas de otros biomarcadores; o
    (ii b) usar las mediciones de (i b) para crear un perfil de la cantidad de MCAM y opcionalmente de la presencia o ausencia y/o la cantidad de dichos uno o mas de otros biomarcadores;
    (iii)
    (iii a) almacenar el perfil de (ii a) como el perfil de referencia que representa el diagnostico o prediccion de ausencia de ICA o que representa el pronostico bueno para la ICA; o
    (iii b) almacenar el perfil de (ii b) como el perfil de referencia que representa el diagnostico o prediccion de ICA o que representa el pronostico malo para la ICA, en donde dicho otro biomarcador util para diagnosticar, predecir y/o pronosticar ICA se elige del grupo que consiste en el peptido natriuretico tipo B (BNP), propeptido natriuretico tipo B (proBNP), y fragmento amino terminal del propeptido natriuretico tipo B (NTproBNP).
  12. 12. Un metodo para establecer un valor base o de referencia de MCAM en un sujeto, que comprende:
    (i) medir la cantidad de MCAM en la muestra del sujeto en diferentes tiempos de medicion, en donde el sujeto no padece ICA, y
    (ii) calcular el intervalo o valor medio del sujeto, que es el valor base o de referencia de MCAM para dicho sujeto.
  13. 13. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, en donde el sujeto padece ICA que implica disfuncion sistolica, preferiblemente en donde dicha disfuncion sistolica se caracteriza por una disminucion de la fraccion de eyeccion ventricular izquierda (FEVI), preferiblemente en donde dicha FEVI es menor que 55% o menor que 50% o menor que 45%, y/o en donde dicha disfuncion sistolica se caracteriza por aumento de la presion de llenado cardiaco.
  14. 14. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 13, en donde la cantidad de MCAM y/o la presencia o ausencia y/o la cantidad de uno o mas de otros biomarcadores se mide usando, respectivamente, un agente de union capaz de unirse espedficamente a la MCAM y/o fragmentos de la misma, y un agente de union capaz de unirse espedficamente a dichos uno o mas de otros biomarcadores, preferiblemente, en donde la cantidad
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    10
    15
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    25
    de MCAM y/o la presencia o ausencia y/o la cantidad de uno o mas de otros biomarcadores se mide usando una tecnolog^a de inmunoensayo, tal como tecnolog^as de ELISA directo, ELISA indirecto, ELISA tipo sandwich, ELISA competitivo, ELISA multiplexado, radioinmunoensayo (RIA), ELISPOT, o usando un metodo de analisis de espectrometna de masas o usando un metodo de cromatograffa, o usando una combinacion de dichos metodos.
  15. 15. El metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 2-14, en donde la muestra usada es plasma y en donde se detecta la forma circulante en el plasma de la MCAM.
  16. 16. Uso de un kit que comprende medios para medir la cantidad de MCAM en una muestra del sujeto, para diagnosticar, predecir y/o pronosticar la ICA en dicho sujeto, opcionalmente comprendiendo ademas un valor de referencia de la cantidad de MCAM o medios para establecer un valor de referencia, en donde dicho valor de referencia representa un diagnostico, prediccion y/o pronostico conocido de ICA, opcionalmente en donde dicho medio para detectar la MCAM es capaz de detectar la forma circulante en el plasma de la MCAM, preferiblemente capaz de detectar espedficamente la forma circulante en el plasma de la MCAM.
  17. 17. Una matriz o micromatriz de agentes de union que comprende:
    (a) uno o mas agentes de union capaces de unirse espedficamente a la MCAM y/o a fragmentos de la misma, preferiblemente, una cantidad o concentracion conocida de dichos agentes de union; y
    (b) uno o mas agentes de union capaces de unirse espedficamente a uno o mas de otros biomarcadores utiles para diagnosticar, predecir y/o pronosticar la ICA, preferiblemente una cantidad o concentracion conocida de dichos agentes de union, en donde dichos otros biomarcadores se eligen del grupo que consiste en BNP, proBNP y NTproBNP.
  18. 18. Un dispositivo de prueba portatil capaz de medir la cantidad de MCAM en una muestra de un sujeto, que comprende:
    (i) medios para obtener una muestra del sujeto, y
    (ii) medios para medir la cantidad de MCAM en dicha muestra, y
    (iii) medios para visualizar la cantidad de MCAM medida en la muestra, en donde el medio de visualizacion es capaz de indicar si la cantidad de MCAM en la muestra es mayor o menor que un determinado nivel umbral y/o si la cantidad de MCAM en la muestra se desvfa o no de un valor de referencia de la cantidad de MCAM, representando dicho valor de referencia un diagnostico, prediccion y/o pronostico conocido de ICA.
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