ES2557933T3 - Procedimiento y aparato para la detección electroquímica - Google Patents

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ES2557933T3 ES08842920.4T ES08842920T ES2557933T3 ES 2557933 T3 ES2557933 T3 ES 2557933T3 ES 08842920 T ES08842920 T ES 08842920T ES 2557933 T3 ES2557933 T3 ES 2557933T3
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Peter Michael Newman
Alastair M. Hodges
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Abstract

Un detector de electrodos opuestos que comprende un electrodo de trabajo, un contraelectrodo, tromboplastina y un sustrato electroquímico de trombina, en el que la tromboplastina está revestida sobre uno de los electrodos y el sustrato electroquímico de trombina está revestido sobre el otro electrodo, en el que el detector detecta la escisión del sustrato electroquímico de trombina.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento y aparato para la deteccion electroqmmica Campo de la invencion
La presente invencion se refiere a un detector con electrodos opuestos y tiras de ensayo que usan este detector. La invencion puede ser usada para medir la coagulacion de sangre o plasma en ensayos tales como el de tiempo de protrombina (TP) y el del potencial de trombina, por ejemplo, en la supervision de anticoagulantes en un centro de atencion.
Antecedentes
Varias patentes describen dispositivos y procedimientos para detectar sustratos electroqmmicos. Por ejemplo, Jozefonvicz et al. (Patente US N° 4.304.853) describe el uso de sustratos electroqmmicos para detectar proteasas, incluyendo las enzimas en un sistema de coagulacion. Desafortunadamente, su procedimiento no es practico para dispositivos usados en centros de atencion. La ensenanza, tal como se usa en la presente memoria, es util para descubrir que el pre-acondicionamiento del electrodo o los electrodos es necesario para mejorar la reproductividad debido a que las corrientes medidas son muy bajas. El sustrato requiere DMSO para ayudar a la solubilidad en soluciones acuosas. Describe tambien un sistema de 3 electrodos con volumenes de muestra y reactivos que son ordenes de magnitud mayores que los requeridos para ensayos viables en centros de atencion.
Ludin et al. (US 6.495.336) describe sustratos electroqmmicas que pueden ser usados para la deteccion de trombina, tfpicamente en un analisis de coagulacion. El sustrato proporcionado en la misma es una mejora con respecto al del de Jozefonvicz et al., ya que aparentemente es soluble en agua. No se indica como usar el sustrato en un dispositivo para centros de atencion.
Frenkel et al. (US 6.352.630) describe el uso de un sustrato electroqmmico de trombina, espedficamente tal como se describe en Ludin et al. (2002), en un dispositivo que parece ser adecuado para ensayos en centros de atencion. La ensenanza, tal como se usa en la presente memoria, indica que el sustrato debe ser inmovilizado sobre el electrodo de trabajo por el extremo que es opuesto al grupo electroactivo que es escindido. Este requerimiento anade complejidad y limita los materiales del electrodo y el procedimiento de fabricacion.
La inmovilizacion del sustrato sobre el electrodo de trabajo es importante y/o esencial cuando se usan los electrodos coplanares descritos por Frenkel et al. Esto es debido a que la distancia relativamente grande entre los electrodos de trabajo y los contraelectrodos prohfbe cualquier difusion significativa de moleculas desde un electrodo al otro.
De manera similar, la ensenanza proporciona un electrodo de referencia de Ag/AgCl, que puede ser tambien un contraelectrodo, y es deseable para las configuraciones de electrodos coplanares debido a que el Ag/AgCl puede actuar como un sumidero o una fuente de electrones. Un problema potencial de este dispositivo es que la cantidad relativamente pequena de producto electroactivo que es liberada, por ejemplo en forma reducida, en una realizacion, puede ser detectada solamente cuando es oxidada. Esto puede resultar en corrientes electroqmmicas relativamente bajas. Ademas, la preparacion de un electrodo de Ag/AgCl se suma al gasto de fabricacion de dichos detectores.
Unkrig et al. (US 2003/0146113A1) describe tambien el uso de un sustrato electroqmmico de trombina que parece adecuado para dispositivos para centros de atencion. Tal como se usa en la presente memoria, la referencia describe un sistema plano de 2 electrodos con un electrodo de trabajo de Pd y un electrodo de referencia y contraelectrodo combinado de Ag/AgCl, con el fin de superar la baja senal inherente en este diseno de electrodo coplanar en ciertas realizaciones la ensenanza regenera el grupo electroactivo acoplando su deteccion a la oxidacion de glucosa. Una ventaja de ciertas realizaciones presentes es que los electrodos opuestos pueden regenerar automaticamente las especies detectadas sin necesidad de acoplamiento a otra reaccion redox.
Opalsky et al. (EP 1.234.053 B1) describe tambien un detector de coagulacion que usa un sustrato electroqmmico. En ciertas realizaciones, la ensenanza describe un cartucho complejo que tiene preferiblemente una bomba para mover la muestra en el interior del cartucho para mezclar la muestra mas el reactivo mas alla de los electrodos coplanares. En contraste, en ciertas realizaciones de la presente memoria, los electrodos opuestos permiten que una tira simple que no se beneficia de una bomba como reactivo pueda difundirse pasivamente en todo el volumen mas pequeno de la muestra.
Hodges et al. (US 6.284.125 B1) describe biodetectores de electrodos opuestos para medir la concentracion de una especie redox. En particular, se genera una especie redox mediante oxidacion de glucosa y a partir de esta se calculo la concentracion de glucosa. Un detector de electrodos opuestos puede consistir en:
(1) Electrodos de trabajo y contraelectrodos (y opcionalmente un electrodo de referencia en cualquier configuracion) separados por una distancia predeterminada y
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(2) Los electrodos enfrentados entre sf mientras se extienden en pianos diferentes pero aproximadamente paralelos
y
(3) La seleccion de la separacion entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo de manera que los productos de reaccion desde el contraelectrodo puedan difundirse al electrodo de trabajo.
Los electrodos opuestos son descritos por Newman y Chatelier (PCT/IB2007/001990) para un detector de coagulacion pero la descripcion se limita al uso de la (in)movilidad de las partfculas magneticas para detectar la coagulacion y no proporciona ensenanzas de sustratos electroqmmicos.
Ohara et al. (US 6.620.310 B1) describen la deteccion de un cambio de viscosidad de una muestra de coagulacion mediante la deteccion de la disminucion en la corriente en estado estacionario a traves de los electrodos opuestos. Una vez mas, la descripcion no se refiere a un sustrato electroqmmico, por el contrario, el cambio en la difusion de un par redox es detectado despues de la coagulacion.
Hodges et al. (US 6.444.115) se refiere a la medicion del progreso de una reaccion qmmica que genera un producto de reaccion electroactivo que es detectado subsiguientemente, amperiometrica o culombimetricamente, en un electrodo.
Ninguno de los documentos de la tecnica anterior describe el uso de electrodos opuestos para detectar un sustrato electroqmmico. Ninguno describe tampoco el descubrimiento inesperado de que cuando se usan electrodos opuestos es preferible no inmovilizar el sustrato electroqmmico sobre el electrodo de trabajo.
Sumario
Las realizaciones de la presente invencion se dirigen a un detector de electrodos opuestos con un electrodo de trabajo, un contraelectrodo, un reactivo seleccionado de entre tromboplastina, y un sustrato electroqmmico de trombina, en el que la tromboplastina es revestida sobre uno de los electrodos y el sustrato electroqmmico de trombina es revestido sobre el otro electrodo, en el que el detector detecta la escision del sustrato electroqmmico de trombina. El sustrato electroqmmico de trombina puede ser revestido sobre el contraelectrodo. Estos detectores pueden ser usados como parte de una tira de ensayo para ensayos de tiempos de coagulacion en sangre.
La invencion se refiere tambien a una tira de ensayo para medir el tiempo de coagulacion de sangre o plasma en una muestra, que comprende un detector segun se define en la presente memoria.
La invencion se refiere tambien a un procedimiento de medicion de la coagulacion de sangre o plasma que comprende:
anadir una muestra de sangre de un paciente a un detector de electrodos opuestos que comprende un electrodo de trabajo, un contraelectrodo, tromboplastina y un sustrato electroqmmico de trombina, caracterizado por que la tromboplastina es revestida sobre uno de los electrodos y el sustrato electroqmmico de trombina es revestido sobre el otro electrodo, y por que el detector detecta la escision del sustrato electroqmmico de trombina; y
analizar la muestra usando el detector para determinar el nivel de escision para determinar al menos una propiedad de coagulacion de sangre o plasma de la muestra.
Otras realizaciones de la invencion se refieren a procedimientos de uso de los detectores y las tiras de la presente invencion. Estos procedimientos pueden ser practicados en el centro de atencion.
Breve descripcion de las Figuras
La Fig. 1 ilustra una vista detallada de una tira electroqmmica ejemplar segun las presentes realizaciones, que incluye un electrodo (1) inferior, un separador (2) aislante, un electrodo (3) superior, una cubierta sobre un canal (4) de llenado, un canal (5) de llenado y una camara (6) de reaccion.
La Fig. 2 ilustra una tira electroqmmica ensamblada ejemplar segun la presente realizacion, que incluye un electrodo
(1) inferior, un separador (2) aislante, un electrodo (3) superior, una cubierta sobre un canal (4) de llenado, un canal (5) de llenado y una camara (6) de reaccion.
La Fig. 3 ilustra una grafica ejemplar segun las presentes realizaciones; la figura demuestra una deteccion de coagulacion mejorada cuando el sustrato de trombina es revestido sobre el contraelectrodo; el tiempo en segundos se proporciona como las abscisas y la corriente en microamperios se proporciona como las ordenadas; la grafica etiquetada "a" representa el sustrato de trombina revestido sobre el contraelectrodo (el catodo en este ejemplo) y la tromboplastina revestida sobre el electrodo de trabajo (el anodo en este ejemplo); la grafica etiquetada "b" representa el sustrato de trombina revestido sobre el electrodo de trabajo (anodo) y la tromboplastina revestida sobre el contraelectrodo (catodo).
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Descripcion detallada
A continuacion se describen en detalle los aspectos ejemplares de la descripcion. Las referencias a "un aspecto", "aspecto ejemplar", "diversos aspectos", etc., pueden indicar que el aspecto o aspectos de la descripcion descrita de esta manera pueden incluir una funcion, una estructura o una caractenstica particular, pero no todos los aspectos incluyen necesariamente la funcion, la estructura o la caractenstica particular. Ademas, el uso repetido de la expresion "en un aspecto," o "en un aspecto ejemplar" no se refiere necesariamente al mismo aspecto, aunque es posible.
La presente invention se refiere a un detector que tiene electrodos opuestos, es decir, un electrodo de trabajo y un contraelectrodo, tromboplastina y un sustrato electroqmmico de trombina. En algunas realizaciones, el sustrato electroqmmico de trombina esta sobre el contraelectrodo. Tal como se describira a continuacion, estos detectores pueden ser usados anadiendo una muestra al detector (opcionalmente sobre una tira de ensayo) en la que una proteasa escinde una especie electroactiva del sustrato. Esta especie electroactiva pueden ser detectada mediante reacciones redox en los electrodos.
El detector descrito puede ser usado en una amplia variedad de tecnologfas, por ejemplo, en procedimientos de medicion de coagulation de sangre o plasma usando ensayos tales como tiempo de protrombina (TP) y potencial de trombina, particularmente en la supervision de anticoagulantes orales en centros de atencion (por ejemplo coumadinas tales como warfarina y fenprocumona).
Tal como se describira mas adelante, una ventaja de la presente descripcion es que los electrodos opuestos de ciertas realizaciones no necesitan de la complejidad de un verdadero electrodo de referencia, tal como un electrodo de Ag/AgCl. Por el contrario, en estos aspectos, la estrecha proximidad de los electrodos permite realizar ciclos de una especie electroactiva. Es decir, una molecula que ha sido reducida en el catodo puede ser reoxidada en el anodo, resultando en una corriente mas alta. Esto puede posibilitar el uso de dos electrodos similares, tales como los formados a partir de un material conductor inerte, tal como carbono, Au, Pd, Pt Ir, oxido de indio, mezcla de indio/oxido de estano, y/u oxido de estano, etc.
Los dispositivos y tiras de ensayo de la presente invencion tienen un sustrato electroqmmico de trombina que puede ser secado sobre el contraelectrodo en algunos aspectos. El sustrato electroqmmico de trombina puede ser escindido por una enzima, por ejemplo, una proteasa. Las proteasas son una clase de enzimas que escinden los enlaces de peptido. Desempenan un papel esencial en muchos procedimientos biologicos. Por ejemplo, estan implicadas en la digestion de alimentos, replication de HIV, la cascada de coagulacion de sangre y la ruta de complemento.
Algunas proteasas son espedficas para una secuencia de peptidos particular, mientras que otras son menos selectivas. En cualquier caso, puede ser altamente deseable detectar y/o cuantificar la actividad de proteasa ya que esto proporciona una perception del procedimiento biologico, Tal como apreciara una persona con conocimientos en la materia, cualquier proteasa natural o disenada sinteticamente u otra enzima de escision puede ser detectada o si no usada en la presente invencion siempre que la enzima sea capaz de reconocer y escindir el enlace o enlaces deseados en el sustrato electroqmmico de trombina usado.
Hay una serie de sustratos de peptido utiles disponibles comercialmente para una gama de proteasas. Tfpicamente, una proteasa escinde un tinte o grupo fluorescente desde estos sustratos, resultando en un cambio de color o fluorescencia. Tambien es posible crear sustratos con grupos electroactivos que pueden ser detectados electroqmmicamente despues de la escision. Las secuencias de aminoacidos de un sustrato de peptidos determina la especificidad para una proteasa. De esta manera, en algunos aspectos, la especificidad de un procedimiento de detection de proteasa puede ser cambiada mediante la selection de un sustrato espedfico para la proteasa de interes.
Un sistema de deteccion de proteasa ejemplar que los aspectos de la presente invencion pueden detectar es la cascada de coagulacion de sangre. La cascada de coagulacion de sangre consiste en una serie de reacciones de proteasa y sirve como sistema modelo, con aplicaciones practicas, para investigar la deteccion de proteasas. El tiempo necesario para que una muestra de sangre o plasma se coagule puede ser indicativo de diversos estados de enfermedad y puede ser util para supervisar una terapia de anticoagulacion. La especificidad de dichos ensayos de coagulacion normalmente es debida, no a la manera en la que se detecta la coagulacion, si no a la naturaleza del reactivo o reactivos usados para iniciar la coagulacion. De esta manera, los presentes aspectos son aplicables a una amplia gama de ensayos de coagulacion.
Por ejemplo, un area de uso para la presente descripcion es en procedimientos de supervision de anticoagulacion mediante antagonistas de vitamina K orales, tales como warfarina y fenprocumon, en un centro de atencion. Estos farmacos son supervisados en general usando un ensayo de tiempo de protrombina y los resultados se indican como una razon normalizada internacional (International Normalized Ratio, INR). Hay una tendencia hacia la realization de estos ensayos usando dispositivos para centros de atencion que proporcionan un resultado en un par de minutos usando sangre derivada de una simple puncion de dedo. Este enfoque es normalmente mas conveniente que la venopuncion y la preparation de plasma tradicional pero dichos dispositivos requieren un procedimiento para la deteccion de coagulacion
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en sangre entera. Los presentes aspectos mejoran las tecnicas que tratan este problema.
La coagulacion de plasma puede ser detectada en una diversidad de maneras. Por ejemplo, la gelificacion de la muestra puede ser detectada por una mayor resistencia al movimiento de partfculas (comunmente magneticas) a traves de la muestra o por un cambio de fluidez de la muestra. El punto de formacion de gel puede corresponder tambien a una mayor turbidez del plasma, que puede detectarse opticamente. Pueden usarse procedimientos electroqmmicos para detectar cambios en la viscosidad de una muestra midiendo cambios en la impedancia, por ejemplo, tal como en las patentes US N° 6.673.622, 6.066.504 y 6.046.051.
La coagulacion puede ser detectada indirectamente usando sustratos de peptidos artificiales para trombina segun los aspectos. Por ejemplo, los sustratos cromogenicos pueden ser escindidos por trombina (u otras enzimas de coagulacion) y puede liberarse un grupo de tinte. Esto produce un cambio de color detectable en la solucion. Pueden proporcionarse otros sustratos en los que el grupo escindido es electroqmmicamente activo (puede ser oxidado y/o reducido en un electrodo) y puede ser detectado en un detector electroqmmico. Este tipo de sustrato se denomina sustrato electroqmmico y es la materia de ciertos aspectos de la presente memoria.
Para los propositos de los presentes aspectos, se define un sustrato electroqmmico como un compuesto qmmico que es escindido por una enzima para liberar un grupo saliente electroactivo. El sustrato intacto tiene poca o diferente actividad electroqmmica bajo las condiciones de deteccion, en comparacion con el grupo saliente libre que es liberado mediante escision.
Una especie electroactiva puede ser detectada amperometricamente en realizaciones de la presente invencion, por ejemplo, usando un sistema de dos o tres electrodos. Un sistema de tres electrodos puede tener un electrodo de trabajo, un contraelectrodo y un electrodo de referencia. El electrodo de referencia mide el voltaje de la solucion cerca de la superficie del electrodo de trabajo. El potencial entre el electrodo de trabajo y el contraelectrodo puede ser ajustado de manera que el voltaje entre el electrodo de trabajo y el electrodo de referencia sea ajustado al valor deseado. La magnitud de la corriente a traves del circuito que conecta el electrodo de trabajo y el contraelectrodo es determinada por la velocidad de reduccion u oxidacion en la interfaz de solucion del electrodo de trabajo. De esta manera, es en el electrodo de trabajo donde tiene lugar la reaccion de interes. El sistema esta disenado de manera que la reaccion en el electrodo de trabajo, y no en el contraelectrodo, limite la corriente.
En un aspecto, un sistema de dos electrodos no tiene un electrodo de referencia separado. Por el contrario, puede ajustarse el voltaje entre los conductores de los dos electrodos restantes. El electrodo de trabajo puede definirse una vez mas como el electrodo en el que se produce la reaccion de interes. Este sera el electrodo en el que se produce la reaccion que limita la corriente.
Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que los detectores electroqmmicos que tienen electrodos opuestos pueden tener una serie de ventajas en comparacion con los que usan electrodos coplanares, incluyendo pero sin limitarse a las siguientes:
(1) Las especies electroactivas pequenas pueden difundirse facilmente desde un electrodo opuesto al otro. Esto puede resultar en el reciclado de las formas reducidas y oxidadas, amplificando efectivamente la senal. Esto no es posible en los electrodos coplanares ya que las distancias son demasiado grandes para que las especies se difundan la distancia requerida al electrodo de trabajo en el tiempo disponible.
(2) Tal como apreciara una persona con conocimientos en la materia, cualquier reaccion redox debe tener un componente de oxidacion y un componente de reduccion. En los detectores de electrodos opuestos, la especie electroactiva de interes puede ser oxidada en un electrodo y reducida en el otro en el reciclado indicado anteriormente. En los detectores de electrodos coplanares se requiere un esfuerzo adicional para asegurar que pueda producirse la reaccion en el contraelectrodo. Por ejemplo, el contraelectrodo puede ser de Ag/AgCl o puede aplicarse un voltaje alto o puede requerirse una especie electroactiva complementaria.
(3) La estrecha proximidad de los electrodos opuestos entre sf significa que la mayor parte de la diferencia de potencial entre los electrodos es debida al voltaje a traves de las interfaces de electrodo y no a traves del volumen de la solucion. En contraste, los electrodos coplanares pueden tener una cafda de voltaje IxR considerable a traves de la muestra, particularmente si la solucion entre los electrodos tiene una baja fuerza ionica en una realizacion.
(4) La fabricacion de electrodos opuestos puede ser mas sencilla que los coplanares ya que para formar electrodos coplanares puede ser necesario depositar o someter a ablacion un metal (u otro material conductor) para crear electrodos distintos que estan aislados electricamente entre sf Por el contrario, puede ser ventajoso tener una superficie conductora que cubre todo el material que forma cada electrodo opuesto. Esto significa, por ejemplo, que puede usarse un procedimiento simple, tal como revestimiento por bombardeo ionico, para revestir los electrodos y no se requieren patrones espedficos en el conductor. El area del electrodo opuesto que contacta con la muestra puede ser definida por el separador aislante que separa los electrodos.
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(5) El uso de electrodos opuestos puede evitar el requisito en ciertas realizaciones de Frenkel et al. (US 6.352.630, 2002) que requiere la inmovilizacion de un sustrato electroqmmico en una orientacion especifica. En detectores de electrodos opuestos, el sustrato electroqmmico puede estar libre para disolverse en la muestra y su orientacion es irrelevante. Esto simplifica el procedimiento de fabricacion.
Uno o mas aspectos se refieren a un dispositivo, en la configuracion de una tira, que mide las actividades de proteasa. Por ejemplo, para supervisar la coagulacion de sangre. La tira se conecta electricamente a un medidor que aplica un voltaje o una corriente predeterminados a la tira y mide la corriente o el voltaje resultantes. Tal como apreciara una persona con conocimientos en la materia, estos procedimientos son conocidos, por ejemplo, como tecnicas de amperometrfa o electroqmmicas galvanostaticas, respectivamente. El medidor tambien puede regular termicamente la tira, calcular, registrar, mostrar y/o transmitir el resultado de la reaccion.
Una tira ejemplar, mostrada en las Figs. 1 y 2, puede comprender dos electrodos 1 y 3 en una configuracion opuesta. Los electrodos pueden estar aislados electricamente entre sf por un separador 2 de plastico o su equivalente. En algunos aspectos, los electrodos pueden estar separados menos de 0,5 mm y en ciertas realizaciones pueden estar separados entre 0,05 y 0,15 mm.
El separador 2 puede tener un espacio en el mismo que forma una cavidad entre los electrodos y define una camara 6 de reaccion. Las superficies de electrodo son electricamente conductoras y estan en contacto electrico con el medidor.
En ciertos aspectos, las superficies son revestidas por bombardeo ionico sobre un soporte de plastico. Los revestimientos adecuados pueden ser conocidos por las personas con conocimientos en la materia y pueden incluir platino, indio, carbono, mezcla de oxido de estano/indio, y oxido de estano, pero preferiblemente paladio u oro.
Las superficies sobre cada uno de los electrodos pueden ser las mismas o diferentes. Las superficies conductoras estan enfrentadas entre sf. Un canal 5 de llenado puede permitir que una muestra sea introducida a la camara de reaccion mientras la camara de reaccion puede ser mantenida a una temperatura establecida dentro del medidor.
En ciertos aspectos, el sustrato electroqmmico de trombina no es revestido sobre el electrodo de trabajo. Despues de la adicion de la muestra (por ejemplo, sangre), la escision del sustrato de trombina libera una especie electroactiva y se produce un cambio detectable en la actividad electroqmmica.
En ciertos aspectos, la tira descrita consiste en dos electrodos en una configuracion opuesta. Los electrodos pueden comprender paladio aplicado mediante bombardeo ionico sobre un soporte de plastico. Una capa separadora aislante de 0,1 mm de espesor puede definir la separacion de los electrodos. Uno o mas huecos en el separador pueden definir la camara o camaras de reaccion. Un canal de llenado puede permitir que la muestra sea conducida al interior de la camara o camaras de reaccion por la accion capilar.
El reactivo contiene tromboplastina, necesaria para un ensayo de tiempo de protrombina.
El reactivo contiene tromboplastina diluida, necesaria para un ensayo de generacion de trombina a partir del cual pueden derivarse parametros tales como el tiempo de retardo, el pico de trombina y el potencial de trombina endogena.
En algunos aspectos, es ventajoso revestir uno o mas electrodos con un compuesto electroactivo que asegura que el contraelectrodo no limite la corriente. Por ejemplo, si el catodo es el contra-electrodo, entonces su revestimiento con hierro (III) EDTA proporciona un compuesto reducible para soportar la deteccion (en esta realizacion, por oxidacion) de las especies de interes. Esto puede ser particularmente ventajoso si la especie de interes no es completamente reversible electroqmmicamente.
Se ha encontrado que es ventajoso secar a tromboplastina y el sustrato electroqmmico de trombina sobre los electrodos opuestos para prevenir reacciones adversas entre los dos reactivos. En una realizacion ejemplar, el sustrato electroqmmico de trombina (toluolsulfonil-glicil-prolinil-arginin-4-amido-2-clorofenol) puede ser revestido sobre el contraelectrodo y la tromboplastina puede ser revestida sobre el electrodo de trabajo. En este ejemplo, el grupo saliente del sustrato de trombina es escindido en la forma reducida. Aqm, es la especie que esta siendo detectada y limita la corriente. Debido a que el grupo saliente esta en la forma reducida, puede ser oxidado sobre el anodo para hacer pasar corriente y, de esta manera el anodo es el electrodo de trabajo.
En general, se esperana que el revestimiento de sustrato de trombina sobre el electrodo de trabajo produjera una deteccion de coagulacion mas rapida debido a que el grupo saliente es liberado en el electrodo en el que es detectado. Sin embargo, en algunas realizaciones, se cumple lo opuesto. Por ejemplo, la Fig. 3 muestra que la cinetica de reaccion fue mas rapida cuando el sustrato de trombina fue secado sobre el contraelectrodo (catodo) en lugar de sobre el electrodo de trabajo (anodo). La velocidad de reaccion mas rapida de estas realizaciones puede hacer que la determinacion del tiempo de coagulacion sea mas consistente.
Muchos analisis biologicos (por ejemplo, analisis de generacion de trombina) implican el calculo de las velocidades de
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reaccion. En ciertas realizaciones, se observa que puede ser mas facil medir la cinetica de reaccion de una especie electroactiva generada qmmicamente cuando la especie se esta difundiendo al electrodo de trabajo en lugar de ser generada en el electrodo de trabajo. Veanse por ejemplo, las patentes US N° 5.942.102 y 6.444.115. Esta es otra razon por la que en ciertas realizaciones puede ser preferible revestir los sustratos electroqmmicos de trombina lejos del electrodo de trabajo.
En otro aspecto, el sustrato electroqmmico de trombina y la tromboplastina son formulados de manera que no interaction adversamente, lo que puede permitir que todos los componentes o los componentes reactivos sean revestidos conjuntamente sobre el contraelectrodo. Esto tiene la ventaja de dejar el electrodo de trabajo libre de cualquier reactivo que podna ensuciarlo. El ensuciamiento sobre el contraelectrodo es una preocupacion menor ya que el electrodo no limita la corriente. El ensuciamiento del electrodo de trabajo puede no ser evidente inmediatamente y frecuentemente solo se hace evidente despues del almacenamiento, donde puede ser una causa de una vida util reducida para un producto que materializa la presente invencion. De esta manera, el revestimiento sobre el contraelectrodo puede evitar el riesgo de ensuciamiento del electrodo de trabajo.
Las tiras de ensayo de la presente descripcion pueden incluir tambien medios para verificar la integridad de la tira y/o la muestra. En un aspecto, la tira tiene una camara de reaccion que contiene reactivos cuya funcion es verificar la integridad de la tira y/o la muestra. Los reactivos pueden incluir factores de coagulacion que si no serfan escasos en la muestra. Esta camara de reaccion puede producir un tiempo de coagulacion que es aproximadamente normal, independientemente del grado de escasez en la muestra, y puede ser usada para demostrar la integridad de la tira cuando el tiempo coagulacion esta comprendido entre lfmites predeterminados.
En otros aspectos, la integridad de la tira puede verificada incluyendo un compuesto electroactivo en el reactivo. Dicho compuesto puede ser diferente del sustrato electroqmmico de trombina, que es posible que libere solamente un grupo electroactivo en la escision enzimatica. El compuesto que supervisa la integridad de la tira puede cambiar (aumentar o disminuir) la actividad electroqmmica bajo condiciones de almacenamiento (por ejemplo, temperatura o humedad elevadas) que pueden danar otros componentes de la tira. Los ejemplos de dichos compuestos pueden incluir 4-amino-2-clorofenol, ferricianuro, ferrocianuro y los compuestos nitrosos o N-oxido organicos descritos en la solicitud de patente N° US 2005/0123441. La actividad electroqmmica de dichos compuestos puede ser comparada con lfmites predeterminados para el bano de tiras. Si el valor no esta comprendido entre los lfmites, entonces el medidor puede proporcionar un mensaje de error en lugar de un resultado.
Los reactivos para supervisar la integridad de la tira pueden estar en la misma camara de reaccion que detecta la escision del sustrato o pueden estar en camaras diferentes. En los aspectos en los que las camaras estan separadas, entonces las camaras pueden estar aisladas electricamente por una discontinuidad de los electrodos o, en un aspecto alternativo, las camaras pueden usar electrodos conectados electricamente. Cuando las camaras comparten un electrodo continuo, la senal detectada por el medidor puede ser una combinacion de las camaras. La interferencia entre la integridad y las senales de reaccion de escision puede ser minimizada detectando la reaccion de integridad antes o despues de la reaccion de escision y/o reduciendo el area de reaccion cruzada del electrodo.
Algunos aspectos de la presente memoria se refieren a un control incorporado adecuado para supervisar la viabilidad de las tiras biodetectoras electroqmmicas, tales como, pero sin limitarse a, los descritos en la presente memoria. Los materiales de electrodo y el revestimiento sobre los mismos, son seleccionados de manera que se establezca una diferencia de potencial entre los electrodos. Este voltaje puede ser medido directamente o se mide la corriente que induce el mismo. En algunos aspectos, el detector se comporta brevemente como una batena, generando carga. La diferencia de potencial se interrumpe despues de un tiempo relativamente corto y no interfere con la reaccion de ensayo subsiguiente.
Dichos controles son utiles, por ejemplo, en ensayos en centros de atencion, basados en un medidor que mide una reaccion electroqmmica en una tira desechable, que se estan haciendo cada vez mas comunes. Existe una necesidad de garantizar que los resultados de ensayo sean exactos, por lo tanto son deseables controles para asegurarla la integridad de la tira. Para los usuarios finales, por ejemplo un paciente, el control mas conveniente es uno que esta “incorporado” en la tira y que verifica la integridad de la propia tira que esta siendo ensayada. Los ejemplos de controles incorporados pueden encontrarse en el area de los dispositivos de coagulacion para centros de atencion ya en el mercado (por ejemplo, Coaguchek XS, INRatio). Ademas, el documento US2005123441A1 proporciona una introduccion concisa a las ventajas de un control incorporado.
Tfpicamente, los biodetectores electroqmmicos son mas complicados cuanto mas aislada esta la reaccion de control con relacion a la reaccion de ensayo. Por ejemplo, con el fin de aumentar la complejidad:
a. Una tira con una unica camara de reaccion que incluye tanto la reaccion de control como la reaccion de ensayo es
comparativamente facil de fabricar.
b. Una tira con camaras de control y de ensayo que estan separadas pero conectadas electricamente es mas
complicada ya que requiere la deposicion de multiples reactivos en diferentes areas.
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c. La fabricacion economica a escala de una tira con camaras de control y de ensayo que no solamente estan separadas si no tambien aisladas electricamente puede suponer un importante reto. Normalmente, requiere la deposicion o ablacion del material de electrodo en un patron.
Sin embargo, la dificultad de encontrar una qmmica de reaccion de control adecuada esta en orden inverso al anterior.
a. Una tira con camaras de control y de ensayo separadas y aisladas electricamente, no tendra ningun problema con que una reaccion (por ejemplo, de control) interfiera con la otra (por ejemplo, de ensayo).
b. Una tira con camaras de control y ensayo separadas pero conectadas electricamente puede sufrir interferencia electrica entre las camaras ya que los electrones de una reaccion son indistinguibles de los electrones de la otra, pero el control y el ensayo no se interferiran entre sf qmmicamente.
c. Una tira con una unica camara de reaccion requiere componentes que no se interferiran qmmicamente entre sf o que no causaran senales electricas interferentes.
Se describe ademas una nueva manera de determinar una reaccion de control en un detector electroqmmico, asf como una manera para prevenir que las senales electricas de la reaccion de control y la reaccion de ensayo interfieran entre sf
El documento US2005123441 A1 describe una reaccion de control incorporada que utiliza compuestos nitrosos o N-oxido que son reducidos despues de la exposicion a condiciones que pueden danar el rendimiento de la tira. El cambio en el control incorporado puede ser detectado optica o electroqmmicamente. El procedimiento de deteccion electroqmmico descrito en el documento US2005123441 A1 implica la aplicacion de - 700 mV, con relacion a Ag/AgCl, a traves del electrodo detrabajo y, a continuacion, aplicar -100 mV.
La presente descripcion puede ser ventajosa debido a que los controles de la invencion solamente requieren 1-2 segundos en lugar de 4,5 segundos para algunos dispositivos anteriores. El control de la presente invencion no corre el riesgo de que el voltaje aplicado interfiera con el ensayo.
Se describe un control incorporado para supervisar la viabilidad de los detectores electroqmmicos que detectan la coagulacion de sangre. El reactivo de reaccion de control, que mide la viabilidad de la tira, esta contenido dentro de la misma camara que los reactivos de reaccion de ensayo que miden el tiempo de coagulacion. La senal desde la reaccion de control se diferencia de la del ensayo en el tiempo en el que ocurren. Espedficamente, la reaccion de control es determinada en los primeros pocos segundos despues de anadir la muestra y a continuacion se determina la reaccion de ensayo.
La reaccion de control puede ser creada mediante revestimiento, sobre un electrodo, de un reactivo que contiene una baja concentracion (por ejemplo, 0,5 mM) de ferricianuro y, sobre el otro electrodo, un reactivo sin ferricianuro. La diferencia en la qmmica de electrodo crea un voltaje a traves de los electrodos cuando se anade la muestra. Este voltaje puede ser medido directamente con un volrfmetro o la corriente a traves de un circuito externo puede ser registrada por un amperfmetro.
El voltaje electroqmmico se puede disipar mediante al menos dos procedimientos: la corriente que fluye a traves de un circuito externo aplana efectivamente la baterfa electroqmmica y la difusion de ferricianuro desde un electrodo al otro disminuye el gradiente de concentracion de ferricianuro y, de esta manera, el voltaje. Una vez que la senal desde la reaccion de control se ha disipado, entonces puede comenzar el analisis de la reaccion de ensayo. Esto puede consistir por ejemplo en la aplicacion de 0,3-0,4V a traves de los electrodos y medir la corriente amperometrica resultante.
La concentracion de ferricianuro es suficientemente baja de manera que no interfiera sustancialmente con la deteccion de la reaccion de ensayo. Sin embargo, tal como apreciara un experto en la materia, se puede producir el uso de alternativas al ferricianuro. Por ejemplo, yoduro, ascorbato, ferrocianuro, 4-amino-2-clorofenol pueden producir un efecto de baterfa.
El efecto de baterfa se mide midiendo la corriente sin ningun voltaje externo aplicado a traves de los electrodos del detector. Sin embargo, es posible medir la corriente con un pequeno voltaje aplicado, siempre que el voltaje no cause interferencia sustancial con la reaccion de ensayo.
Los detectores pueden contener dos camaras. Una camara puede contener los reactivos de la reaccion de ensayo y la otra los reactivos de la reaccion de control. Este enfoque es ventajoso si los componentes de una reaccion (por ejemplo, la reaccion de control) pueden inhibir qmmicamente la otra (por ejemplo, la reaccion de ensayo). No es necesario que las camaras esten aisladas electricamente, siempre que la reaccion de ensayo y la reaccion de control no interfieran entre sf electricamente. Este aspecto es particularmente ventajoso si se incluye un agente neutralizante en la camara de reaccion de control (por ejemplo, en un electrodo opuesto).
De manera alternativa, pueden usarse concentraciones de reactivos de reaccion de control que normalmente interferirfan con la reaccion de ensayo. En este aspecto, la camara de control contiene areas separadas de reactivo de control y un
agente neutralizante. Cuando la muestra es anadida, el reactivo de control produce un efecto de batena o alguna otra senal electroqmmica pero, a continuacion, es neutralizada rapidamente por el agente neutralizante. El efecto neutralizante puede ser mediante una reaccion electroqmmica (por ejemplo, yodo y ascorbato se neutralizan entre sf) o mas de un efecto ffsico, tal como precipitacion (por ejemplo, los iones de Co2+ o Mn2+ precipitan ferricianuro). La precipitacion de un 5 compuesto electroactivo puede hacer que sea incapaz de interactuar con un electrodo.
En un aspecto que mide la coagulacion de sangre o plasma, un medidor puede mantener el detector a 37°C. la senal electrica detectada por el medidor puede ser interpretada para calcular el tiempo de coagulacion. Por ejemplo, el tiempo de coagulacion puede definirse como el punto en el que la senal, o la proporcion de cambio de la misma, alcanza un umbral. El tiempo de coagulacion puede ser indicado, mostrado o sin no emitido con las unidades de tiempo o puede ser
10 convertido a unidades diferentes, tales como INR, usando datos de calibracion asignados al detector y/o al medidor.
Pueden calcularse e indicarse tambien otros resultados. Por ejemplo, con los reactivos correctos, el area bajo la curva puede indicar el potencial de trombina endogeno, que puede ser indicado de manera similar. El resultado del analisis puede ser indicado mostrandolo sobre la pantalla del medidor pero tambien puede ser almacenado en memoria y/o transmitido a otro dispositivo.
15 Tambien se describen en la presente memoria kits que tienen un detector o una tira de ensayo. Dichos kits pueden ser envasados de manera esteril. Las tiras de ensayo o detectores pueden incluirse en envases individuales asf como en envases de tipo multi-envase. Opcionalmente, los kits incluyen un medidor para interactuar con las tiras de ensayo o detector y/o instrucciones para usar el kit, la tira de ensayo o el detector.
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    REIVINDICACIONES
    1. Un detector de electrodos opuestos que comprende un electrodo de trabajo, un contraelectrodo, tromboplastina y un sustrato electroqmmico de trombina, en el que la tromboplastina esta revestida sobre uno de los electrodos y el sustrato electroqmmico de trombina esta revestido sobre el otro electrodo, en el que el detector detecta la escision del sustrato electroqmmico de trombina.
  2. 2. Detector segun la reivindicacion 1, en el que el sustrato electroqmmico de trombina no esta inmovilizado sobre el electrodo de trabajo.
  3. 3. Detector segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, caracterizado por que el sustrato electroqmmico de trombina comprende un peptido unido a un grupo saliente, en el que el grupo saliente se convierte en electroactivo una vez escindido por la trombina.
  4. 4. Detector segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende ademas un medidor conectado al detector, en el que el medidor determina un tiempo de coagulacion para una muestra.
  5. 5. Detector segun la reivindicacion 4, en el que el medidor muestra o emite un resultado que comprende el tiempo de coagulacion o un resultado o valor que depende del tiempo de coagulacion.
  6. 6. Detector segun una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende ademas un medidor conectado al detector, en el que el medidor muestra o emite un resultado que comprende un parametro de generacion de trombina en la muestra.
  7. 7. Una tira de ensayo para medir el tiempo de coagulacion de sangre o plasma en una muestra, que comprende un detector segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-6.
  8. 8. Tira de ensayo segun la reivindicacion 7, que comprende ademas unos medios para verificar la integridad de la tira.
  9. 9. Un procedimiento de medicion de la coagulacion de sangre o plasma que comprende:
    anadir una muestra de sangre de un paciente a un detector de electrodos opuestos que comprende un electrodo de trabajo, un contraelectrodo, tromboplastina y un sustrato electroqmmico de trombina, caracterizado por que la tromboplastina esta revestida sobre uno de los electrodos y el sustrato electroqmmico de trombina esta revestido sobre el otro electrodo, y que el detector detecta la escision del sustrato electroqmmico de trombina; y
    analizar la muestra usando el detector para determinar el nivel de escision para determinar al menos una propiedad de coagulacion de sangre o plasma de la muestra.
  10. 10. Procedimiento segun la reivindicacion 9, en el que el procedimiento se realiza en un centro de atencion.
  11. 11. Procedimiento segun la reivindicacion 9 o la reivindicacion 10, en el que el procedimiento comprende ademas un medidor conectado al detector, en el que el medidor muestra o emite a un resultado que comprende un parametro de generacion de trombina en la muestra.
  12. 12. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 9-11, en el que el paciente esta tomando una medicacion anticoagulante.
  13. 13. Procedimiento segun la reivindicacion 12, en el que la medicacion anticoagulante es un antagonista de vitamina K.
  14. 14. Procedimiento segun una cualquiera de las reivindicaciones 9-13, en el que la muestra es tomada del paciente mediante un pinchazo en el dedo del paciente.
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