ES2552278B1

ES2552278B1 - Implantes biocompatibles de titanio nanoestructurado con propiedades antibacterianas

Info

Publication number: ES2552278B1
Application number: ES201430616A
Authority: ES
Inventors: José Miguel GARCÍA MARTÍN; Alberto PALMERO ACEBEDO; Rafael ÁLVAREZ MOLINA; María VALLET-REGÍ; Daniel Arcos Navarrete; Isabel Izquierdo Barba
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Complutense de Madrid
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Complutense de Madrid
Priority date: 2014-04-25
Filing date: 2014-04-25
Publication date: 2016-09-14
Anticipated expiration: 2034-04-25
Also published as: EP3135242A4; WO2015162329A1; ES2552278A1; US20170224458A1; EP3135242A1

Abstract

Implantes biocompatibles de titanio nanoestructurado con propiedades antibacterianas.#Se describe un nuevo implante basado en titanio, formado por un recubrimiento de titanio fabricado sobre biomateriales con aplicación en implantología ósea. Las características nanotopográficas de estos implantes inhiben la adhesión bacteriana y la formación de biofilm bacteriano en superficie, presentando de forma simultánea propiedades adecuadas para la adhesión, extensión y proliferación de las células formadoras de hueso. Adicionalmente la invención comprende un método de fabricación del implante mediante técnicas de incidencia oblicua y su uso en implantología ósea.

Description

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IMPLANTES BIOCOMPATIBLES DE TITANIO NANOESTRUCTURADO CON PROPIEDADES ANTIBACTERIANAS

DESCRIPCION

SECTOR DE LA TECNICA Y OBJETO DE LA INVENCION

La invention se enmarca en el campo de los materiales de recubrimiento y adhesivos para aplicaciones medicas, de ingenieria medica o ingenieria sanitaria en el sentido mas amplio. La invencion tambien se enmarca en el campo de los nanomateriales con aplicacion medica.

El objeto de la invencion es un implante compuesto de un recubrimiento de titanio depositado sobre un sustrato que comprende un biomaterial de election quirurgica con propiedades osteointegradoras e inhibidoras de la formation de biofilm bacteriano, asi como metodos de fabrication de los implantes mediante tecnicas de incidencia oblicua, preferentemente por pulverization catodica y su uso en implantologia osea.

ESTADO DE LA TECNICA

El titanio y sus aleaciones son ampliamente utilizados en implantologia osea debido a su excepcional biocompatibilidad, excelentes propiedades mecanicas y resistencia a la corrosion. Esta alta resistencia a la corrosion reside fundamentalmente en la rapida formacion de una capa de oxido de titanio sobre su superficie, conocida como corrosion en seco o pasivado del titanio. La formacion de oxido de titanio se produce espontaneamente por oxidation de la superficie del metal al entrar en contacto con el oxigeno atmosferico. La capa de pasivado dota a los implantes basados en titanio de excelentes propiedades anticorrosivas y propiedades osteointegradoras.

La mayoria de las infecciones en implantes ortopedicos metalicos son causadas por bacterias del tipo Staphylococcus. Entre ellos el Staphylococcus aureus (S. aureus) representa la principal especie patogenica en el caso de biomateriales metalicos tales como acero inoxidable, CrCo, Ti y sus aleaciones. Cuando las bacterias se adhieren a la superficie del implante, segregan una matriz extracelular de naturaleza polimerica denominada biofilm, que les dota de una elevada resistencia a los antibioticos (F. Gotz et al, Molecular Microbiology 43, 1367, 2002). La formacion de este biofilm obliga casi siempre a la retirada de las protesis, pues de otro modo la infection del implante puede dar lugar a infecciones cronicas y, en casos extremos, incluso a la muerte del paciente por septicemia.

En la actualidad el problema de la infeccion en implantes se intenta prevenir con varias estrategias, por ejemplo implantando rosarios de polimetilmetacrilato cargados con antibioticos de amplio espectro. Esta estrategia tiene la limitation de que los rosarios requieren de una segunda intervention para ser retirados. Por otra parte, una vez infectado el implante, la estrategia a seguir es la administration via sistemica de elevadas dosis de antibioticos con los consiguientes problemas de toxicidad. En cualquier caso, cuando las bacterias consiguen formar el biofilm bacteriano, se hacen muy resistentes al tratamiento con antibioticos via sistemica y el implante debe ser retirado para evitar infecciones cronicas y la septicemia. Por todo ello, abordar el problema de la infeccion desde su primer estadio

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evitando la adhesion bacteriana, supone un importante avance en la prevention de la infection de implantes oseos.

En lo relativo a implantes ortopedicos y dentales, la formation de nanoestructuras mediante diversas tecnicas (anodization, deposition en fase vapor, etc.) se ha descrito en el campo con la finalidad de favorecer la adhesion de celulas formadoras de hueso (osteoblastos) as^ como de mejorar su comportamiento una vez adheridos (diferenciacion, formacion de matriz extracelular, etc.). Asi por ejemplo, se han sintetizado recubrimientos nanoestructurados sobre implantes mediante diversas tecnicas y con diferentes formas, un ejemplo son nanotubos de TiO2 fabricados mediante tecnicas de anodizacion (M. Ma, et al, J. Biomedical Material Research Part A 100, 278, 2012), pero tambien las hidroxiapatitas

nanoestructuradas mediante la hidrolisis de precursores solidos, las aleaciones metalicas obtenidas por polvometalurgia a baja temperatura, las nanoestructuras de titanio obtenida por nanotopografia qtimica o las nanoestructuras de titanio obtenidas por oxidation superficial.

Por otra parte, tambien se han preparado nanoestructuras sobre Ti que inhiben la adhesion bacteriana (D Campoccia, Biomaterials 34, 8533, 2013; K. Anselme, Acta Biomaterialia 6, 3824, 2010). Por ejemplo, en algunos casos, el TiO2 presente en superficie ha demostrado cierta capacidad bactericida despues de ser irradiado con luz UV.

Hay varios trabajos que describen nanotopografias que conservan su comportamiento respecto a osteoblastos pero inhiben la colonization bacteriana simultaneamente (Colon et al. J Biomedical Materials Research. A 78, 595, 2006 y Ploux L. et al, Langmuir 25, 8161, 2009). En ambos casos, los estudios estan hechos sobre materiales sin aplicacion clmica hasta el momento. En M. Kazemzadeh-Narbat et al, Biomaterials 34 5969 2013 se consiguen ambos efectos (biocompatibilidad con osteoblastos y actividad antimicrobiana) utilizando titanio obtenido mediante procesos de anodizacion, pero se basan en la incorporation de farmacos en las capas crecidas, por lo que su actividad antimicrobiana no se debe a la nanoestructura crecida, sino al medicamento incorporado.

Una tecnica utilizada ampliamente en microelectronica que permite la formacion de nanoestructuras con gran variedad de propiedades como topografias, composiciones, etc., es la denominada pulverization catodica (o sputtering en ingles) (P.J. Kelly et al, Vacuum 56, 159, 2000). Esta tecnica es bien conocida desde hace decadas por crecer laminas delgadas muy compactas y con baja rugosidad. En esta, un bloque solido, tambien llamado blanco, de un material determinado (en este caso de titanio) se coloca en el interior de un reactor o camara de vado con un gas inerte en su interior (normalmente se emplea gas de argon). Al inyectar potencia electromagnetica a traves del blanco mediante una fuente de excitation, se genera un plasma gaseoso, rico en iones energeticos, que pulverizan la superficie del blanco, emitiendose atomos en una direction preferentemente perpendicular al blanco, con energias cineticas del orden de los 10 eV. Estos atomos, al llegar a una superficie en el interior del reactor paralela al blanco, denominada sustrato, se van acumulando y aglomerando sobre una superficie, generando una pelicula delgada. Dependiendo de la presion de operation en la camara, que es debida al gas inerte introducido se puede controlar la energia con la que dichos atomos llegan a la superficie. A altas presiones (por encima de 1 Pa en condiciones estandar), las colisiones son

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numerosas, por lo que los atomos llegan al sustrato con baja energia (decimas o centesimas de eV). A bajas presiones, sin embargo, la energia de llegada es muy similar a la de salida del blanco (regimen baKstico), generando peKculas delgadas altamente compactas.

La pulverizacion catodica es un proceso muy utilizado en la formacion de peliculas delgadas sobre materiales, de hecho la pulverizacion catodica se emplea industrialmente en multiples aplicaciones: fabricacion de discos duros, de espejos, de los recubrimientos internos de las bolsas de comestibles, etc. Frente a tecnicas que involucran algun tipo de reaccion qdmica, como smtesis qdmica, anodizacion, fotolitografia, etc., la pulverizacion catodica es una tecnica de vado, por lo que no se generan residuos agresivos con el medioambiente, y ademas es eficiente desde un punto de vista energetico ya que permite la fabricacion a bajas temperaturas (temperatura ambiente). Frente a otras tecnicas fisicas en vado, como la evaporacion termica o la evaporacion asistida mediante canon de electrones, la pulverizacion catodica se utiliza ampliamente en la industria y permite el crecimiento del material nanoestructurado en grandes superficies con diferentes morfologias.

En los ultimos anos, la pulverizacion catodica tambien se esta empleando en geometrias de angulo oblicuo, esta es la llamada pulverizacion catodica en incidencia oblicua (sputtering at glancing angle o GLAD sputtering en la literatura) (J. C. Sit et al, Journal of Materials Research 14 (4), 1197, 1999). En este caso, tras la generacion del plasma en la camara, el sustrato donde se van acumulando los atomos ya no se coloca paralelo al blanco, sino formando con este un angulo de inclinacion superior a 60°, el llamado angulo GLAD, lo que provoca que los atomos lleguen al sustrato con incidencia oblicua. Esta configuracion induce procesos de sombra en la superficie de la capa delgada en crecimiento que generan estructuras inclinadas.

Hasta ahora no se han preparado recubrimientos sobre implantes oseos con un biomaterial que pueda ser utilizado para recubrir implantes o protesis y que esten formados por nanotopografias de Ti que, simultaneamente, permitan la adhesion y proliferacion de osteoblastos, pero inhiban la colonizacion bacteriana. Estos estudios siempre se han hecho por separado con otras tecnicas y la mayoria de ellos, con bacterias que tampoco suponen una incidencia significativa en las infecciones de las protesis.

EXPLICACION DE LA INVENCION

Un primer aspecto de la invencion es un implante que tiene un recubrimiento de titanio depositado sobre un sustrato caracterizado porque

- el sustrato comprende un biomaterial con una rugosidad cuadratica media inferior a 5 nm en un area de 4 ^m2,

- el recubrimiento tiene una pureza superior al 95% y comprende titanio nanoestructurado formado por titanio metalico y una capa de oxido de titanio,

- el titanio nanoestructurado tiene forma nanocolumnar donde el diametro de las nanocolumnas es de 30 a 100 nm y la altura varia entre 100 y 300 nanometros, el espacio entre nanocolumnas varia entre 50 y 150 nanometros con una inclinacion de la nanocolumna respecto a la vertical del sustrato de entre 0° y 30°.

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El biomaterial del sustrato puede tener al menos uno de los materiales siguientes:

- titanio comercialmente puro con pureza superior al 99% de grado medico para implantes periodontales,

- aleaciones metalicas de grado medico como CrCo, acero inoxidable, Ti6Al4V para aplicaciones ortopedicas, craneales y maxilofaciales

El biomaterial del sustrato puede estar conformado en estructuras que comprenden discos, tornillos, clavos, vastagos, placas de osteosmtesis y demas dispositivos de fijacion de fracturas, generalmente fabricadas en acero inoxidable.

Otro aspecto de la invencion es el procedimiento de obtencion del implante que comprende depositar el recubrimiento sobre el sustrato utilizando tecnicas en incidencia oblicua (GLAD), preferentemente en un sistema de pulverizacion catodica.

La pulverizacion catodica puede ser de tipo magnetron.

El procedimiento puede comprender las siguientes etapas:

a) introduccion del sustrato en la camara del sistema de pulverizacion catodica,

b) cierre de la camara y realizacion de vado,

c) introduccion de gas en la camara,

d) excitacion electromagnetica de las particulas del gas presentes en la camara mediante una fuente,

e) choque de las particulas presentes en la camara contra un blanco de titanio,

f) deposito del material desprendido del blanco sobre el sustrato,

caracterizado por que el producto de la presion de operacion (Pg) por la distancia blanco - sustrato (L), cumple la condicion de regimen balistico para la pulverizacion de Ti, dada por pgL < 12 Pa cm; y el sustrato forma con el blanco un angulo de inclinacion superior a 60°.

En un caso particular el vado alcanzado es inferior a 10-4 Pa, en la camara se cumple que el cociente L/d, siendo d el diametro del blanco y L la distancia blanco-sustrato es superior a 3.5.

El tercer aspecto de la invencion es el uso del implante en implantologia osea.

Otro aspecto de la invencion es un metodo de tratamiento humano o animal que comprende las siguientes etapas:

- insertar el implante mediante cirugia en un cuerpo humano o animal, preferentemente mediante cirugia ortopedica, craneal, dental y/o maxilofacial.

En una realizacion particular el implante puede ser de uso temporal o de uso permanente. DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La invencion se basa en que los inventores han conseguido un nuevo tipo de recubrimientos de titanio sobre biomateriales metalicos de importancia quirurgica que presentan un

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comportamiento selectivo frente a bacterias y osteoblastos. Las caracteristicas nanotopograficas de estos recubrimientos inhiben la adhesion bacteriana y la formation de biofilm bacteriano en superficie, presentando de forma simultanea propiedades adecuadas para la adhesion, extension y proliferation de las celulas formadoras de hueso.

Un objeto de la invention es un implante que comprende un recubrimiento de titanio depositado sobre un sustrato caracterizado porque

- el titanio nanoestructurado tiene forma nanocolumnar donde el diametro de las nanocolumnas es de 30 a 100 nm y la altura varia entre 100 y 300 nanometros, el espacio entre nanocolumnas varia entre 50 y 150 nanometros con una inclination de la nanocolumna respecto a la vertical del sustrato de entre 0° y 30°,

El sustrato es decisivo en la formacion del recubrimiento, ya que su pureza, material, topografia, etc influyen en las propiedades estructurales del recubrimiento que es depositado encima. Si no se utiliza un sustrato adecuado no se forman el recubrimiento con las propiedades necesarias para que funcione como implante.

En una realization particular el biomaterial del sustrato comprende al menos uno de los materiales siguientes:

- titanio comercialmente puro con pureza superior al 99% de grado medico, para implantes periodontales,

Estos biomateriales tienen una enorme importancia en la fabrication de protesis articulares modulares. Las aleaciones de Ti6Al4V son el biomaterial de election para fabricar el componente de la protesis implantado en el canal medular del hueso, pues presenta excelente osteointegracion y un modulo elastico alrededor de 110 GPa lo que permite transmitir carga mecanica desde el material al hueso. Este valor supone la mitad con respecto al del acero inoxidable y al CrCo. La menor rigidez del Ti6Al4V evita situaciones de protection contra la carga, las cuales se asocian con la perdida de hueso en la region que rodea al implante y con el posterior aflojamiento de las protesis. Por el contrario, para aquellos componentes que forman parte del par de friction en protesis articulares, las aleaciones de CrCo o acero inoxidable son las de eleccion por su mejor comportamiento a la friccion.

En una realizacion mas particular el biomaterial del sustrato esta conformado en forma de dispositivos implantables que comprenden discos, tornillos, clavos, vastagos, placas de osteosmtesis asi como otros dispositivos de fijacion de fracturas

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El recubrimiento puede tener capas adicionales de material, por ejemplo una capa entre el recubrimiento y el sustrato que facilite la adhesion del titanio nanoestructurado crecido encima.

La superficie del implante es la superficie del recubrimiento y viene dada por la formation en nanocolumnas del titanio nanoestructurado. Esta superficie inhibe la formacion de biofilm bacteriano. Asi mismo, la adhesion bacteriana sobre el recubrimiento es muy inferior respecto a la observada en los biomateriales sin recubrir. Concretamente, los estudios microbiologicos realizados en esta invention con S. aureus muestran que los recubrimientos son superficies efectivas para inhibir la adhesion de este patogeno. La inhibition de la adhesion bacteriana evita la posterior formacion de colonias y el posterior desarrollo del biofilm bacteriano.

Independientemente del tipo celular, procariota en el caso de las bacterias o eucariota en caso de los osteoblastos, existen una serie de etapas comunes para la colonization de superficies por parte de ambos tipos. La adhesion celular a un substrato es un proceso que se lleva a cabo secuencialmente por parte de la celula en diferentes etapas: i) reconocimiento de la superficie, ii) formacion de contactos iniciales, y su posterior desarrollo en puntos focales, y iii) expansion y desarrollo celular (S. Faghilhi, et al, Journal of Biomedical Materials Research, Part A 91 656 2009). En este caso, la posibilidad de controlar la topologia de la superficie, no solo en el tamano de las nanocolumnas sino tambien en su espaciado y quimica de superficie, permite disenar superficies con un comportamiento selectivo en base a las caracteristicas diferenciales entre ambos tipos de celulas.

Los osteoblastos son celulas con dimensiones laterales entre 10 y 50 ^m. Poseen una membrana celular flexible que les permite adaptarse a diferentes nanotopografias. Los osteoblastos requieren la adsorcion previa de integrinas en la superficie de material para adherirse a ella. Los recubrimientos descritos en esta invencion muestran que la adsorcion de integrinas es suficiente para facilitar la adhesion, extension y proliferation de osteoblastos, con la misma eficacia que lo hacen sobre superficies pulidas de Ti6Al4V de grado medico. Por el contrario, las bacterias no necesitan de la adsorcion previa de protemas en superficie para colonizarlas. Por otra parte, las bacterias tienen en general una forma caracteristica y son menos deformables. En concreto S. aureus muestra unas dimensiones de 1 ^m de diametro y su pared bacteriana es mucho mas rigida que las membranas de las celulas eucariotas. Estas caracteristicas diferenciales respecto a los osteoblastos, traen como resultado que S. aureus presente elevada sensibilidad a la nanotopografia. La rugosidad y la corta distancia entre nanocolumnas, ejercen sobre S. aureus un doble efecto que limita su adhesion. Por una parte, las bacterias tienen acceso a un numero muy limitado de puntos de anclaje, pues su pequeno tamano y rigidez solo les permite entrar en contacto con el area superior de un limitado numero de nanocolumnas para desarrollar puntos focales de adhesion. Por otra parte, el aire atrapado entre las nanocolumnas ejerce un efecto de baja humectabilidad analogo al de la hoja de la flor de loto, que dificulta aun mas la adhesion de S. aureus y el desarrollo de la matriz polimerica extracelular que genere el biofilm bacteriano.

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Sorprendentemente, mientras que en las condiciones de este trabajo, S. aureus desarrolla un biofilm en muestras de sustratos de Ti6Al4V comercial de grado medico tras varios dias de cultivo (3 dias para el caso particular de un sustrato de Ti6Al4V), la superficie del implante, que en este caso particular es la superficie del recubrimiento depositado sobre esos mismos sustratos, o nano-Ti6Al4V, muestra un comportamiento selectivo dependiendo del tipo de celula. Mientras que los osteoblastos se adhieren y proliferan sobre la superficie de nano-Ti6Al4V en la misma extension que sobre Ti6Al4V, la adhesion de S. aureus se ve fuertemente impedida y la formacion de biofilm inhibida cuando se cultiva sobre la superficie nanoestructurada.

Respecto al comportamiento frente a osteoblastos, las caracteristicas nanoestructurales del titanio nanoestructurado, como son la alta densidad de nanocolumnas y el corto espaciado entre ellos (con un valor medio de 100 nm), hacen que no modifiquen su comportamiento con respecto a superficies pulidas de Ti6Al4V. En este sentido, el mayor tamano de los osteoblastos, su flexibilidad y la adhesion de integrinas sobre la capa de pasivado de oxido de titanio que presenta las nanocolumnas, permiten un excelente desarrollo celular sobre estos recubrimientos, de modo analogo al de las aleaciones de Ti6Al4V de grado medico.

En conjunto, esta propiedad de los recubrimientos sobre los sustratos, permite la osteointegracion de los implantes, evitando la posible infeccion que puede surgir en un periodo relativamente corto de tiempo tras el implante, y que generalmente obliga a la retirada y sustitucion de las protesis.

El segundo objeto de la invencion es un procedimiento para obtener el implante, en adelante procedimiento, que comprende depositar el recubrimiento sobre el sustrato utilizando tecnicas en incidencia oblicua (GLAD), preferentemente en un sistema de pulverizacion catodica.

El sistema de pulverizacion catodica puede ser de tipo magnetron, esto es utilizar, al menos, un magnetron, es decir, emplea imanes que concentren la ionizacion del gas en las proximidades del blanco, lo que hace mas rara la ionizacion en el resto de la camara de vado y permite trabajar con menores presiones de gas necesarias para obtener la estructura del recubrimiento.

En una realizacion particular el deposito se realiza en un sistema de pulverizacion catodica y comprende las siguientes etapas:

a) introduccion del sustrato en la camara del sistema de pulverizacion catodica

b) cierre de la camara y realizacion de vado,

c) introduccion de gas en la camara,

e) choque de las particulas presentes en la camara contra un blanco de titanio,

f) deposito del material desprendido del blanco sobre el sustrato,

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caracterizado por que el producto de la presion de operacion (Pg) por la distancia blanco - sustrato (L), cumple la condicion de regimen baKstico para la pulverizacion de Ti, dada por pgL < 12 Pa cm; y el sustrato forma con el blanco un angulo de inclinacion superior a 60°.

En una realizacion particular el procedimiento se caracteriza por que el vado alcanzado es inferior a 10-4 Pa, en la camara se cumple que el cociente L/d es superior a 3.5, siendo d el diametro del blanco y L la distancia blanco-sustrato

La eleccion de las condiciones del deposito GLAD es critica pues no se forman las mismas nanoestructuras. La tecnica de pulverizacion catodica en incidencia oblicua permite la formacion de nanocolumnas cuyas dimensiones y espaciado dependen de la presion de operacion en la camara, de la inclinacion del sustrato con respecto al flujo de atomos proveniente del blanco, de la geometria del sistema de deposito, del sustrato y de la duracion del deposito.

Cuando se trabaja a bajas presiones los atomos de titanio que formaran el material nanoestructurado llegan a la superficie con gran energia, haciendo que las estructuras nanocolumnares crezcan con gran relacion de aspecto y disminuya la superficie horizontal efectiva, de tal manera que las bacterias disponen de menos superficie para anclarse. De forma similar, el valor del cociente L/d asegura que el haz proveniente del blanco que formara el titanio nanoestructurado esta suficientemente colimado para poder formar las nanocolumnas.

Los blancos de titanio utilizados en pulverizacion catodica suelen ser de alta pureza, normalmente superior al 99% ya que no tiene sentido trabajar en un reactor de vado si luego el blanco tiene impurezas en la mayoria de aplicaciones.

La pulverizacion catodica puede generar la excitacion electromagnetica mediante medios que comprenden al menos uno de los siguientes: DC (excitacion en continua), RF (excitacion alterna en el rango de las radiofrecuencias) o DC pulsado (excitacion con pulsos de corriente continua).

El deposito del recubrimiento sobre los sustratos da lugar a una topografia superficial formada por nanocolumnas. El titanio nanoestructurado crece durante el deposito en la superficie del sustrato cubriendo la superficie con nanocolumnas con un alto grado de densidad, i.e. un gran grado de nanomotivos por unidad de area, con espaciado entre nanocolumnas medio de 100 nm.

El implante formado presenta una serie de ventajas respecto al estado de la tecnica: la tecnica propuesta (pulverizacion catodica con bajas presiones e incidencia oblicua) es mas eficiente que otras tecnicas como la anodizacion no solo desde el punto de vista energetico, pues se lleva a cabo a temperatura ambiente y sin generar residuos, sino tambien porque permite un control mas preciso sobre la morfologia del recubrimiento y evita tratamientos qdmicos; ademas permite crecer los recubrimientos sobre grandes superficies de formas variadas, y por un procedimiento escalable industrialmente; al llevarse a cabo a temperatura ambiente, permite sus smtesis sobre superficies que unicamente pueden ser procesadas a bajas temperaturas, tales como materiales polimericos; inhibe la adhesion bacteriana y la

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formation de biofilm bacteriano en superficie y presenta propiedades adecuadas para la adhesion, extension y proliferation osteoblastica.

El tercer objeto de la invention es el uso del implante en implanto^a osea ya que se permite simultanear comportamientos contrarios frente a osteoblastos y bacterias, concretamente frente a S. aureus que es la principal causante de la infection de protesis metalicas.

En una realization particular el implante puede ser de uso temporal o de uso permanente. DESCRIPCION FIGURAS:

Figura 1: Imagenes del implante obtenidas mediante microscopia electronica de barrido (las imagenes de la izquierda son cortes transversales, a la derecha vistas cenitales) que presentan nanocolumnas obtenidas en diferentes condiciones de deposito mediante pulverization catodica en incidencia oblicua. A) Angulo GLAD 70° y presion de operation en la camara o presion de argon 0.15 Pa. B) Angulo GLAD 80° y presion de argon 0.15 Pa. C) Angulo GLAD 85° y presion de argon 0.15 Pa. D) Angulo GLAD 60° y presion de argon 0.5 Pa.

Figura 2: Imagenes de superficies que no presentan nanocolumnas obtenidas mediante microscopia electronica (a la izquierda cortes transversales, a la derecha vistas cenitales) obtenidas en diferentes condiciones mediante pulverizacion catodica en incidencia oblicua: A) Angulo GLAD 60° y presion de argon 0.15 Pa. B) Angulo GLAD 60° y presion de argon 1 Pa.

Figura 3: Diagramas de difraccion de rayos X de muestras de nano-Ti6Al4V (arriba) y Ti6Al4V (abajo) adquiridos por incidencia rasante (Q= 0.5°). Las estrellas (*) indican los maximos de difraccion correspondientes a la aleacion Ti6Al4V. Se indican los indices de Miller para la fase rutilo del TiO2.

Figura 4: Espectro infrarrojo con transformada de Fourier (IR-FT) de nano-Ti6Al4V (abajo) y Ti6Al4V (arriba) obtenidos por reflectancia total atenuada (ATR).

Figura 5: Imagenes SEM de: (A) Ti6Al4V, (B) nano-Ti6Al4V, el area seleccionada con una elipse indica una estimation del tamano del osteoblasto. (C) nano-Ti6Al4V; el area seleccionada con un drculo indica una estimacion del tamano del S. aureus; (D) imagen SEM de una seccion transversal de nano-Ti6Al4V mostrando las nanocolumnas.

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Figura 6: Imagenes de AFM de: A) Ti6Al4V B) nano-Ti6Al4V. La escala de grises de la derecha indica la altura de los motivos, y tiene un maximo de 46nm y 380 nm para Ti6Al4V y nano-Ti6Al4V respectivamente.

Figura 7: Evaluation de la humectabilidad superficial A) Fotografia de una gota de agua sobre una muestra de Ti6Al4V (B) Imagen de una gota de agua sobre una muestra de nano-Ti6Al4V. (C) Evolution del angulo de contacto en funcion del tiempo para ambas muestras.

Figura 8: (A) Adhesion de los osteoblastos tras 90 minutos sobre muestras de nano- Ti6Al4V y Ti6Al4V. (B) Actividad mitocondrial (test MTT) tras tres dias de cultivo sobre Ti6Al4V y nano-Ti6Al4V.

Figura 9: Imagenes SEM obtenidas despues de 24 horas de cultivo con celulas osteoblasticas sobre un sustrato de (A) y (C) Ti6Al4V; y (B) y (D) nano-Ti6Al4V. En C) se indican con elipses algunos de los anclajes formados por las celulas.

Figura 10: Conteo de colonias de S. aureus formadas tras 90 minutos de cultivo sobre superficies de nano-Ti6Al4V y Ti6Al4V. Con * se indica diferencias estadisticamente significativas p < 0,05

Figura 11: Imagenes de microscopio de fluorescencia confocal tras 90 minutos de cultivo con bacterias vivas y muertas de S. aureus (A) y (B) Ti6Al4V; (C) y (D) nano-Ti6Al4V.

Figura 12: Imagenes SEM de muestras de (A) Ti6Al4V y (B) nano-Ti6Al4V tras 24 horas de cultivo con S. aureus. El inset en (a) es la superficie de una muestra Ti6Al4V antes del cultivo.

EJEMPLOS DE REALIZACION DE LA INVENCION

Ejemplo 1: Implante obtenido por el deposito de recubrimiento por pulverizacion catodica en incidencia oblicua sobre un biomaterial.

En este ejemplo se indica como se ha formado el implante.

Utilizando pulverizacion catodica en incidencia oblicua se ha depositado un recubrimiento formado por titanio nanoestructurado sobre un disco de aleacion Ti6Al4V pulido mecanicamente a espejo (rugosidad cuadratica media inferior a 5 nm medida en un area de 4 ^m2), de 1 cm de diametro y 2 mm de espesor. La camara tiene una presion base (previa a la introduction del gas) inferior a 5 * 10"7 Pa (ultra-alto vado) y la distancia blanco - sustrato es de 22 cm. El blanco de 5 cm de diametro y 5 mm de espesor utilizado era de titanio con una pureza de 99.999 %, y tenia encima una chimenea cilmdrica de 5 cm de diametro y 9 cm de longitud (esta chimenea sirve principalmente para evitar contamination cruzada con otros blancos en la camara, pero ademas ayuda a la colimacion del flujo atomico direccionando el flujo de material hacia la superficie del sustrato). El parametro L/d tenia un valor de 4.4. Durante el deposito se utilizo una presion en el reactor o presion de operation de la camara, dada por la presion del gas argon de entre 0.15 y 3 Pa y una

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excitacion DC con potencia constante de 300 W. La temperatura del sustrato se mantuvo por debajo de los 350 K. El angulo de inclination se vario entre 0° y 85°. Se ha operado dentro del regimen balistico cumpliendo que pdL es inferior a 12 en todos los casos.

El implante obtenido se observo utilizando SEM, en la tabla 1 se pueden observar cuando se forman nanocolumnas en funcion de la presion de operation en la camara, que es debida al gas inerte introducido, y el angulo de inclination del sustrato respecto a la vertical del sustrato:

: Angulo de inclinacion

P (Pa): 0° 45° 60° 70° 80° 85°

0.15: X X X C C C

0.5: X X C

1: X X X

1.5: X X X

3: X

Tabla 1: Relation de recubrimientos obtenidos mediante pulverization catodica en incidencia oblicua.

Las celdas que contienen la letra C indican las situaciones donde se han observado nanocolumnas, la letra indica X situaciones donde no se han formado nanocolumnas.

En la Figura 1 se muestran varios casos representativos de nanocolumnas observadas mediante microscopia electronica de barrido (o SEM, por las siglas del ingles Scanning Electron Microscopy), mientras que en la Figura 2 se indican casos donde no se forman las nanocolumnas.

En el caso de obtencion de titanio nanoestructurado con forma nanocolumnar las nanocolumnas obtenidas tienen un diametro de 30 a 100 nm, una separation entre 50 y 150 nanometros, y una inclinacion respecto a la vertical del sustrato de entre 0° y 30°.

Ejemplo 2: Uso del implante en implantologla osea.

En este ejemplo se muestra como el implante obtenido en las condiciones del ejemplo 1 tiene propiedades osteointegradorase inhibidoras de la formation de biofilm bacteriano.

El implante ha sido obtenido segun el procedimiento del ejemplo 1 utilizando una presion de argon de 0.15 Pa y un angulo GLAD de 80°. La temperatura del sustrato se mantuvo por debajo de los 350 K.

En este caso particular, la superficie del implante es la superficie del recubrimiento y esta formada por titanio nanoestructurado que forma nanocolumnas con dimensiones en el rango de 100 a 300 nm de altura y entre 30 a 100 nm en diametro. Las nanocolumnas crecen durante el deposito en la superficie de Ti6Al4V cubriendo la superficie con un alto grado de

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densidad, i.e. un gran grado de nanomotivos en la unidad de area con un espacio medio de 100 nm.

Se han realizado estudios por difraccion de rayos X (representados en diagramas de rayos X o DRX) con un difractometro Philips Model X’Pert en el rango 20 de 20 - 80. Para obtener information preferentemente de la superficie del disco, se utilizo el metodo de incidencia rasante usando un angulo rasante w de 0.5°. En la Figura 3 se muestran los diagramas de difraccion de rayos X obtenidos por incidencia rasante para un sustrato de Ti6Al4V comercial (en adelante Ti6Al4V) sin el recubrimiento y para el recubrimiento objeto de la invention o nano-Ti6Al4V. Los maximos de difraccion para Ti6Al4V se pueden asignar a la fase hexagonal a-Ti (la fase principal de las aleaciones de Ti6Al4V) con grupo espacial P63/mmc. El diagrama de difraccion de rayos X para nano-Ti6Al4V muestra los maximos de difraccion correspondientes a la fase a-Ti junto con una fase secundaria de rutilo TiO2 con grupo espacial P42/mm. Se han realizado espectros por espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (IR-FT) utilizando un espectrofotometro Thermo Nicolet Nexus equipado con un dispositivo de reflectancia total atenuada (ATR) Goldengate. En la Figura 4 se muestra el espectro de Ti6Al4V y de nano-Ti6Al4V observandose en ambas muestras bandas de absorcion correspondientes a enlaces Ti-O-Ti en un amplio rango de frecuencias que van desde de 950 a 500 cm-1, lo cual es indicativo de las capas de TiO2 en la superficie del Ti6Al4V y de nano-Ti6Al4V. Asi mismo, se observan bandas correspondientes al modo de tension del enlace O-H, asignables a la presencia de grupos Ti-OH en superficie.

Finalmente, en el sustrato se observan las bandas del modo fonon (entre 1100 y 1400 cm-1) del Al2O3, cuya presencia es caracteristica en la superficie de la aleacion Ti6Al4V. Esta banda no aparece en el material nano-Ti6Al4V lo que indica que el sustrato ha sido eficazmente recubierto por las nanocolumnas de titanio. La presencia de maximos de difraccion en el diagrama de rayos X correspondientes a una fase tipo rutilo de TiO2 en nano-Ti6Al4V y la presencia de bandas de absorcion en el infrarrojo asignables a enlaces Ti- O-Ti, evidencian la presencia de una capa de TiO2 que recubririan las nanocolumnas de Ti crecidas sobre el substrato de Ti6Al4V.

La estructura del implante se puede ver en la Figura 5. Para ello se realizaron medidas con un SEM. La superficie inicial del sustrato de Ti6Al4V no presenta rugosidad apreciable a la observation por SEM (Figura 5A), lo que se corresponde con una superficie pulida a espejo. Sin embargo, la superficie de nano-Ti6Al4V en la misma escala aparece totalmente cubierta de una nanorugosidad como consecuencia del deposito de Ti sobre el sustrato de Ti6Al4V debido al crecimiento de nanocolumnas. Las medidas de microscopia de fuerza atomica (o AFM del ingles Atomic Force Microscopy) de ambas superficies (Figura 6) muestran la diferencia en rugosidad, en el Ti6Al4V es de 3nm (valor cuadratico medio o RMS del ingles Root Mean Square) en un area de 4 ^m2, mientras que en el nano-Ti6Al4V el valor de la rugosidad medida es de 57 nm en un area de 4 ^m2.

El angulo de contacto se midio por el metodo de la gota-pendiente en un equipo de angulo de contacto CAM 200 KSV a 25 °C tomando fotos cada 1 segundo. Los estudios por angulo de contacto (Figura 7) indican un aumento significativo de la hidrofobicidad tras el proceso de recubrimiento. Los angulos de contacto inicial, tras 1 segundo, fueron 56° and 102° para Ti6Al4V y nano-Ti6Al4V, respectivamente. El angulo de contacto para nano-Ti6Al4V

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permanecio constante en el tiempo, indicando una baja humectabilidad, indicativo de superficies hidrofobicas, mientras que el angulo de contacto de Ti6Al4V disminuyo hasta 44° durante los primeros 8 segundos, indicativo de una alta humectabilidad caracteristica de las aleaciones de Ti6Al4V.

Cultivo de osteoblastos

Previamente al cultivo in vitro de osteoblastos, las muestras fueron esterilizadas y secadas en seco a 150° durante 12h. Se uso una lmea celular de osteosarcoma humano (HOS) obtenida a traves de la Coleccion Europea de Cultivos Celulares (ECACC, no. 87070202). Las celulas se cultivaron en medio completo consistente en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM ) (Sigma Chemical Co., St. Louis, USA) suplementado con 2 mM L- glutamina (Gibco, Invitrogen Corporation, USA), 100 U mL"1 de penicilina (Life technologies limited, Scotland), 100 g mL"1 estreptomicina (Life technologies limited, Scotland), y 10% de suero fetal bobino (FBS) (Gibco, Invitrogen Corporation, USA) a 37°C en atmosfera humeda de 95% aire y 5% CO2. Las celulas HOS fueron rutinariamente tripsinizadas y subcultivadas. Posteriormente las celulas HOS se sembraron en diferentes placas de 24 pocillos con una densidad de siembra de 2.5x 105 celulas por mL en medio completo bajo atmosfera de CO2 (5%) a 37 °C durante diferentes periodos de tiempo para cada uno de los ensayos.

Estad'istica

Los datos obtenidos de los cultivos de osteoblastos y bacterianos se expresan como la media ± la desviacion estandar de experimentos realizados sobre tres muestras diferentes. El analisis estadistico se lleva a cabo con el software Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 11.5. Las comparaciones estadisticas se realizaron mediante el analisis de la varianza (ANOVA). Las diferencias entre grupos se determinaron por evaluation post hoc utilizando el test de Scheffe. Para todas las evaluaciones estadisticas, se considero un valor de diferencia como significativamente estadistico para p < 0,05.

Adhesion celular de osteoblastos

Para los estudios de adhesion de los osteoblastos sobre la superficie del implante, esto es en este caso la superficie del recubrimiento, las muestras se incubaron bajo condiciones estandar de cultivo durante 90 min. Despues se lavaron las muestras tres veces en PBS; tras lo cual las celulas se separaron mediante un tratamiento con tripsina durante 10 min. Tras centrifugation las celulas se resuspendieron en PBS y se contaron en una camara Neubauer. En la Figura 8, se indican los resultados de la biocompatibilidad in vitro realizados con HOS sobre la superficie del recubrimiento. Para ello se consideran los resultados de adhesion inicial (90 minutos) y proliferation de las celulas HOS tras 3 dias de cultivo, mediante la cuantificacion de la actividad mitocondrial. Los datos de las Figuras 8A y 8B se expresan en valores medios ± desviacion standard de medidas llevadas a cabo sobre tres muestras diferentes. La adhesion inicial de los osteoblastos (90 minutos) no muestra diferencias significativas entre TI6Al4V, nanoTi6Al4V, y el control (plastico de la placa de cultivo).

Proliferacion celular de osteoblastos

La proliferacion celular se determino en funcion de la actividad celular mitocondrial. Para ello las celulas HOS se sembraron en la superficie del material en placas de 24 pocillos con

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una densidad de 105 celulas por mL en el medio completo y se incubaron en condiciones standard. La determination de la proliferation celular se realizo utilizando el ensayo MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio) (Sigma-Aldrich, USA) a diferentes periodos de tiempo tras el sembrado. Como control se utilizo el plastico de la placa de cultivo. La determinacion cuantitativa se lleva a cabo en un espectrofotometro UV-VIS llevando a cabo a lectura a 570 nm. La actividad mitocondrial se relaciona directamente con la absorbancia a dicha longitud de onda. La actividad mitocondrial de HOS es casi identica para las dos superficies y no muestra diferencias respecto al control tras 3 dias de cultivo, como se observa en la Figura 8B.

Ensayos de extension celular de osteoblastos

El grado de extension celular y la morfologia de los osteoblastos se observaron mediante microscopia SEM. Las celulas adheridas se lavaron tres veces en PBS y se fijaron con 2.5% glutaraldehido (50% wt. Sigma-Aldrich, USA) en PBS durante 45 min. La deshidratacion de las muestras se realizo reemplazando lentamente el medio, usando series de etanol con concentration creciente (30%, 50%, 70%, 90%) durante 30 min con una deshidratacion final en etanol absoluto durante 60 min, que permitio a las muestras secarse a temperatura ambiente en vado. Las muestras de Ti6Al4V y nano-Ti6Al4V se montaron en portas y se recubrieron con oro para la visualization en el SEM.

En la Figura 9 se muestra la superficie tras un dia de cultivo de celulas HOS sobre la superficie del recubrimiento. La superficie aparece totalmente cubierta por las celulas mostrando una buena adhesion, proliferacion y grado de extension. Las micrografias obtenidas a mayores aumentos muestran los elementos de anclaje formados por las celulas. La Figura 9d muestra un detalle de las nanocolumnas que quedan debajo de la capa de osteoblastos.

Cultivos bacterianos con S. aureus

Los estudios preliminares de adhesion bacteriana in vitro se han realizado utilizando una cepa ATCC 29213 de Staphylococcus aureus (S. aureus) como modelo de bacteria bajo las condiciones estaticas comunmente recogidas en la literatura (Montanaro L, et al, Future Microbiology 2011, 6 (11): 1329-49.) Las muestras se esterilizaron mediante calor seco a 150 °C durante 12 h. Las bacterias de S. aureus crecieron hasta su fase media logaritmica en medio de crecimiento Todd Hewitt (THB) Sigma-Aldrich, USA) a 37 °C bajo agitation magnetica a 100 rpm, hasta que la densidad optica medida a 600 nm alcanzase 1.0. En este punto se recolectaron las bacterias del cultivo por centrifugation a 1500 rpm durante 10 min a temperatura ambiente. Se lavo 3 veces con PBS esteril manteniendo el pH 7.4 y se resuspendio en PBS a una concentracion de 6x108 celulas.ml-1. Posteriormente se incubo a 37 °C bajo agitacion magnetica a 100 rpm para diferentes tiempos de incubacion, en presencia de los biomateriales objeto de estudio.

Ensayos de adhesion de S. aureus

El tiempo de incubacion con las bacterias suspendidas fue de 90 minutos. Posteriormente las muestras se retiraron asepticamente de la suspension bacteriana y se aclararon tres veces en PBS para eliminar las bacterias libres. La cuantificacion de las bacterias unidas a la superficie del material nanoestructurado se ha realizado mediante el siguiente metodo, cada pieza se puso en un tubo Eppendorf que contema 1 ml de PBS esteril. A continuation

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se sonico durante 30 s asumiendo que el 99.9 de% de las bacterias que quedaban eran separadas de la superficie. Despues se tomaron 100 ml de cada producto obtenido tras la sonicacion y se cultivaron en discos de Tryptic Soy Agar (TSA) (Sigma Aldrich, USA), seguido de incubacion durante una noche a 37° C. La determination de las unidades de formadoras de colonia (CFU) resultantes de la suma de los tres procesos de sonicacion permitio determinar el numero de bacterias originales adheridas a las piezas. Los cultivos bacterianos de S. aureus realizados sobre las superficies de Ti6Al4V (Figura 10) no muestran diferencias significativas respecto del control tras 90 minutos de exposition. Sin embargo en el caso de nano-Ti6Al4V, la adhesion de S. aureus es tres veces menor respecto de Ti6Al4V.

Microscop'ta confocal de S. aureus

Tras 90 minutos de incubacion en PBS, las muestras se tineron durante 15 minutos con el kit de viabilidad bacteriano de luz de fondo Invitrogen Live/Dead. Se han realizado estudios de microscopia confocal con un microscopio Biorad MC1025. La fluorescencia SYTO 9 (bacterias vivas, verde) se excita a una longitud de onda de 480/500 nm, emitiendo fluorescencia a 500 nm. La fluorescencia de yoduro de propidio (bacterias muertas/rojas) se excito a 490/635 nm y se midio la fluorescencia emitida a 618 nm. En la Figura 11 se muestran las imagenes obtenidas con microscopia confocal tras 90 minutos de cultivo. Las imagenes muestran una menor adhesion bacteriana sobre nano-Ti6Al4V, en total acuerdo con el conteo mostrado en la Figura 11. No se han observado diferencias significativas en el ratio vivas/muertas cuando se compararon las superficies de Ti6Al4V y nano-Ti6Al4V. Este hecho indica que la actividad antibacteriana de los recubrimientos se ejerce gracias a las propiedades antiadherentes del mismo, sin que se observen efectos bactericidas frente a S. aureus.

Microscop'ta SEM de S. aureus

El estudio por SEM se llevo a cabo preparando las muestras de forma analoga a la descrita para los estudios con osteoblastos. En la Figura 12 se ven las superficies de Ti6Al4V y nano-Ti6Al4V tras 24 horas de cultivo con S. aureus. La Figura 12A corresponde la superficie de la muestra Ti6Al4V y se puede observar a las bacterias rodeadas de una matriz extracelular identificada como biofilm bacteriano y que cubre a la superficie pulida del sustrato. Con el fin de destacar la presencia del biofilm bacteriano, la figura 12 contiene un inset en el que se observa como es la superficie limpia de biofilm antes del cultivo bacteriano mientras, que por el contrario, la superficie de la muestra nano-Ti6Al4V muestra una micrografia en la que las bacterias presentes no han podido formar biofilm, permitiendo ver la nanoestructura de la muestra nano-Ti6Al4V.

Claims

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REIVINDICACIONES

1 Implante que comprende un recubrimiento de titanio depositado sobre un sustrato caracterizado porque

- el sustrato comprende un biomaterial con una rugosidad cuadratica media inferior a 5 nm en un area de 4 ^m2,

- el recubrimiento tiene una pureza superior al 95% y comprende titanio nanoestructurado formado por titanio metalico y una capa de oxido de titanio,

- el titanio nanoestructurado tiene forma nanocolumnar donde el diametro de las nanocolumnas es de 30 a 100 nm y la altura varia entre 100 y 300 nanometros, el espacio entre nanocolumnas varia entre 50 y 150 nanometros con una inclination de la nanocolumna respecto a la vertical del sustrato de entre 0° y 30°.

2 Implante segun la reivindicacion 1 donde el biomaterial del sustrato comprende al menos uno de los materiales siguientes

- titanio comercialmente puro con pureza superior al 99% de grado medico para implantes periodontales,

- aleaciones metalicas de grado medico como CrCo, acero inoxidable, Ti6Al4V para aplicaciones ortopedicas, craneales y maxilofaciales,

3 Implante segun la reivindicacion 2 donde el biomaterial del sustrato comprende Ti6Al4V.

4 Implante segun cualesquiera de las reivindicaciones 2 a 3 donde el biomaterial del sustrato esta conformado en estructuras que comprenden discos, tornillos, clavos, vastagos, placas de osteosmtesis y demas dispositivos de fijacion de fracturas, generalmente fabricadas en acero inoxidable.

5 Procedimiento de obtencion del implante de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende depositar el recubrimiento sobre el sustrato utilizando tecnicas en incidencia oblicua (GLAD).

6 Procedimiento segun la reivindicacion 5 donde el deposito se realiza en un sistema de pulverization catodica.

7 Procedimiento segun la reivindicacion 6 donde el sistema de pulverizacion catodica comprende un magnetron.

8 Procedimiento segun la reivindicacion 7 donde el deposito comprende las siguientes etapas:

a) introduction del sustrato en la camara del sistema de pulverizacion catodica,

b) cierre de la camara y realization de vado,

c) introduccion de gas en la camara,

d) excitation electromagnetica de las particulas del gas presentes en la camara mediante una fuente,

e) choque de las particulas presentes en la camara contra un blanco de titanio,

f) deposito del material desprendido del blanco sobre el sustrato,

caracterizado por que el producto de la presion de operacion (Pg) por la distancia blanco - sustrato (L), cumple la condicion de regimen baKstico para la pulverizacion de Ti, dada por pgL < 12 Pa cm; y el sustrato forma con el blanco un angulo de inclination superior a 60°.

9 Procedimiento segun la reivindicacion 8 caracterizado por que el vado alcanzado es inferior a 10-4 Pa, en la camara se cumple que el cociente L/d es superior a 3.5, siendo d el diametro del blanco y L la distancia blanco-sustrato

10 Uso del implante definido en las reivindicaciones 1 a 4 en implantologia osea.

10 11 Uso segun la reivindicacion 10 en implantes de uso temporal o de uso permanente.