ES2549327T3 - Derivados de pirimidilaminobenzamida para el tratamiento de la neurofibromatosis - Google Patents

Abstract

Un compuesto de fórmula (II), 4-metil-3-[[4-(3-piridinil)-2-pirimidinil]amino]-N-[5-(4-metil-1H-imidazol-1-il)-3- (trifluorometil)fenil]benzamida:**Fórmula** un N-óxido o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para uso en un método para tratar o prevenir tumores cerebrales benignos, no cancerosos, de neurofibromatosis tipo2.

Description

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07-10-2015

cantidad terapéuticamente efectiva de DERIVADOS DE PIRIMIDILAMINOBENZAMIDA, o sales farmacéuticamente aceptables o profármacos de los mismos.

La presente descripción también proporciona un método para tratar mamíferos, especialmente seres humanos, que padecen tumores cerebrales benignos, no cancerosos, especialmente NF, que comprende administrar a un mamífero en necesidad de tal tratamiento, una cantidad inhibidora de 4-metil-3-[[4-(3-piridinil)-2-pirimidinil]amino]-N[5-(4-metil-1H-imidazol-1-il)-3-(trifluorometil)fenil]benzamida (Compuesto (II) o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma.

De preferencia, este método se usa para tratar NF1 o NF2.

En otra realización, la presente descripción se refiere al uso de DERIVADOS DE PIRIMIDILAMINOBENZAMIDA para la preparación de una composición farmacéutica para usarse en el tratamiento de tumores cerebrales benignos, no cancerosos, especialmente NF.

En la presente descripción tanto las realizaciones descritas como inventivas, el término “tratamiento” incluye tanto tratamiento profiláctico como preventivo, así como tratamiento curativo o supresor de la enfermedad, incluyendo tratamiento de pacientes en riesgo de contraer la enfermedad o que se sospecha que han contraído la enfermedad, así como pacientes enfermos. Este término incluye además el tratamiento para el retraso de la progresión de la enfermedad.

El término “curativo”, como se usa en la presente, significa eficacia para tratar episodios en curso que implican tumores cerebrales benignos, no cancerosos, especialmente NF.

El término “profiláctico” significa la prevención del inicio o recurrencia de enfermedades que implican tumores cerebrales benignos no cancerosos, especialmente NF.

El término “retraso de la progresión”, como se usa en la presente, significa administración del compuesto activo a pacientes que están en un pre-estadio o en una fase temprana de la enfermedad a ser tratada, en la cual los pacientes, por ejemplo, una pre-forma de la enfermedad correspondiente es diagnosticada o dichos pacientes están en una condición, por ejemplo, durante un tratamiento médico o una condición que resulta de un accidente, bajo el cual es probable que se desarrolle una enfermedad correspondiente.

Este rango de propiedades que no es previsible significa que el uso de DERIVADOS DE PIRIMIDILAMINOBENZAMIDA es particularmente interesante en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores cerebrales benignos, no cancerosos, especialmente NF.

Para demostrar que los DERIVADOS DE PIRIMIDILAMINOBENZAMIDA son particularmente adecuados para el tratamiento de tumores cerebrales benignos, no cancerosos, especialmente NF con buen margen terapéutico y otras ventajas, pueden realizarse ensayos clínicos de una manera conocida por el experto en la técnica.

La dosificación precisa de DERIVADOS DE PIRIMIDILAMINOBENZAMIDA que va a ser empleada para inhibir tumores cerebrales benignos, no cancerosos, especialmente NF, depende de varios factores incluyendo el huésped, la naturaleza y la severidad de la condición que está siendo tratada, el modo de administración. El compuesto de fórmula (I) puede ser administrado por cualquier ruta incluyendo de manera oral, parenteral, por ejemplo, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intratumoral, o rectal, o enteral. De preferencia, el compuesto de fórmula (I) es administrado oralmente, de preferencia a una dosificación diaria de 1-300 mg/kg de peso corporal o, para la mayoría de primates más grandes, una dosificación diaria de 50-5.000 mg, de preferencia 500-3.000 mg. Una dosificación diaria oral preferida es 1-75 mg/kg de peso corporal o, para la mayoría de primates más grandes, una dosificación diaria de 10-2.000 mg, administrada como una única dosis o dividida en múltiples dosis, tal como dosificación de dos veces al día.

Usualmente, una pequeña dosis se administra inicialmente y la dosificación se incrementa gradualmente hasta que se determina la dosificación óptima para el huésped bajo tratamiento. El límite superior de dosificación es el impuesto por efectos secundarios y puede ser determinado mediante ensayo para el huésped que está siendo tratado.

Los compuestos de fórmula (I) pueden combinarse con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables y, de manera opcional, uno o más adyuvantes farmacéuticos convencionales diferentes y administrarse de manera enteral, por ejemplo, oralmente, en la forma de comprimidos, cápsulas, comprimidos oblongos, etc. o de manera parenteral, por ejemplo, intraperitoneal o intravenosa, en la forma de disoluciones o suspensiones inyectables estériles. Las composiciones enterales y parenterales pueden prepararse por medios convencionales.

Los DERIVADOS DE PIRIMIDILAMINOBENZAMIDA descritos o, en el caso del compuesto de la fórmula (II), según la invención, pueden usarse solos o combinados con al menos otro compuesto farmacéuticamente activo para usarse en estas patologías. Estos compuestos activos pueden combinarse en la misma preparación farmacéutica o en la forma de preparaciones combinadas “kit de partes” en el sentido de que los compañeros de combinación pueden ser dosificados de manera independiente o mediante el uso de combinaciones fijas diferentes con

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El ADN de bácmido fue generado a partir de 10 colonias de cada una de las células DH10Bac transformadas con clones de plásmido pFG-G01-KIT mutante como se describe en materiales y métodos y éstos se transfectaron en células Sf9. Las células transfectadas fueron sedimentadas y se amplificó el baculovirus recombinante resultante presente en el medio de sobrenadante. Se aplicó transferencia Western a los sedimentos de células lisadas para confirmar la expresión de la proteína de fusión GST-c-KIT por los clones virales usando anticuerpos anti-KIT y anti-GST para inmunodetección.

Mutación de Kit

Compuesto II

CI50 (μM) (media)

D816F

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D816H

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D816N

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D816Y

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D816V

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K642E

<10

Y823D

<1

Del 550-558

<2

Del 557-561

<2

N822K

<10

V654A

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N822H

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Del 550-558 + V654A

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Del 557-561 + V654A

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El medio que contiene virus fue recogido del cultivo de células transfectadas y se usó para infección para aumentar su titulación. El medio que contiene virus obtenido después de dos rondas de infección se usó para expresión de proteína a gran escala. Para la expresión de proteína a gran escala, se sembraron placas de cultivo de tejido redondas de 100 cm2 con 5 x 107 células/placa y se infectaron con 1 mL de medio que contiene virus (aproximadamente 5 MOI). Después de 3 días, las células se rasparon de la placa y se centrifugaron a 500 rpm durante 5 minutos. Los sedimentos celulares de 10-20, placas de 100 cm2, se resuspendieron en 50 mL de tampón de lisis enfriado en hielo (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM DTT, 1 mM PMSF). Las células se agitaron en hielo durante 15 minutos y entonces se centrifugaron a 5.000 rpm durante 20 minutos.

El lisado celular centrifugado fue cargado sobre una columna de glutatión-sefarosa de 2 mL (Pharmacia) y se lavó 3x con 10 mL de 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 200 mM NaCl. Las proteínas marcadas con GST se eluyeron entonces mediante 10 aplicaciones (1 mL cada una) de 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM glutatión reducido, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 10% glicerol y se almacenaron a -70ºC.

Las actividades de proteína quinasa de los diversos mutantes de Kit 200-500 ng fueron ensayados en la presencia o ausencia de inhibidores, 20 mM Tris-HCl, pH 7,6, 3 mM MnCl2, 3 mM MgCl2, 1 mM DTT, 10 μM Na3VO4, 3 μg/ml poli(Glu,Tyr) 4:1, 1% DMSO, 1.5 μM ATP (γ-[33P]-ATP 0,1 μCi). El ensayo (30 μL) se realizó en placas de 96 pocillos a temperatura ambiente durante 30 minutos y la reacción se terminó mediante la adición de 20 μL de 125 mM EDTA. Subsecuentemente, 30 μ de la mezcla de reacción se transfirieron sobre la membrana Immobilon-PVDF (Millipore, Bedford, MA, EEUU) previamente remojada durante 5 minutos con metanol, enjuagada con agua, entonces remojada durante 5 minutos con 0,5% H3PO4 y montada sobre colector de vacío con fuente de vacío desconectada. Después de manchar todas las muestras, el vacío fue conectado y cada pocillo se enjuagó con 200 μl de H3PO4 al 0,5%. Las membranas fueron removidas y lavadas 4x en un agitador con 1,0% H3PO4, una vez con etanol. Las membranas se contaron después de secado a temperatura ambiente, montado en un marco de 96 pocillos Packard TopCount y adición de 10 μl/pocillo de Microscint (Packard). Los valores de CI50 fueron calculados mediante análisis de regresión lineal del porcentaje de inhibición por duplicado, a 4 concentraciones (usualmente 0,01, 0,1, 1 y 10 μM). Una unidad de actividad de proteína quinasa es definida como 1 nmol de 33P transferido de [γ33P]ATP a la proteína sustrato/minuto/mg de proteína a RT.

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Claims (1)

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