ES2546669T3 - Utilización mejorada de xilosa en bacterias Zymomonas recombinantes que presentan una actividad ribosa-5-fosfato aumentada - Google Patents

Abstract

Una célula huésped bacteriana recombinante que comprende: a) una ruta metabólica de la xilosa que comprende al menos un gen que codifica un polipéptido que presenta actividad xilosa isomerasa; b) al menos un gen que codifica un polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa; y c) al menos una modificación genética que aumenta la expresión de la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa en la célula huésped en comparación con la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa en la célula huésped que carece de dicha modificación genética; en donde la célula huésped bacteriana utiliza xilosa para producir etanol, y en donde la célula huésped bacteriana es seleccionada del grupo que consiste en Zymomonas y Zymobacter, y en donde la al menos una modificación genética de la operación (c) comprende aumentar el número de copias génicas de un gen que codifica un polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa y/o hacer que se exprese dicho gen que codifica ribosa-5-fosfato isomerasa a partir de un promotor de alta expresión.

Description

Utilización mejorada de xilosa en bacterias Zymomonas recombinantes que presentan una actividad ribosa-5-fosfato aumentada

Campo de la invención

La invención se refiere a los campos de la microbiología y la ingeniería genética. Más específicamente, el aumento de la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa en bacterias Z. mobilis que utilizan xilosa mejoró la utilización de xilosa por el microorganismo.

Antecedentes de la invención

La producción de etanol por microorganismos proporciona una fuente de energía alternativa a los combustibles fósiles y, por lo tanto, es un área importante de la investigación actual. Es deseable que los microorganismos que producen etanol, así como otros productos útiles, sean capaces de utilizar xilosa como una fuente de carbono ya que la xilosa es la pentosa principal en la biomasa lignocelulósica hidrolizada. La biomasa puede proporcionar un sustrato carbonado de bajo coste y abundantemente disponible. La bacteria Zymomonas mobilis y otras bacterias etanologénicas que no utilizan xilosa de forma natural han sido genéticamente modificadas en cuanto a la utilización de xilosa mediante la introducción de genes que codifican 1) xilosa isomerasa, que cataliza la conversión de xilosa en xilulosa; 2) xilulocinasa, que fosforila la xilulosa para formar xilulosa-5-fosfato; 3) transcetolasa; y 4) transaldolasa.

Ha habido éxito en la modificación de cepas de Z. mobilis en cuanto al metabolismo de la xilosa [(Documentos US 5514583, US 5712133, US 6566107 y WO 95/28476; Feldmann et al. (1992), Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 354361; Zhang et al. (1995), Science 267: 240-243], así como una cepa de Zymobacter palmae [Yanase et al. (2007), Appl. Environ. Microbiol. 73: 2592-2599]. Sin embargo, típicamente, las cepas modificadas no crecen ni producen etanol tan bien sobre xilosa como sobre glucosa. Las cepas modificadas para la utilización de xilosa han sido adaptadas mediante subcultivos sucesivos sobre medio de xilosa para dar lugar a cepas con una utilización mejorada de xilosa, como se describe en la Patente de EE.UU. nº 7.223.575 y en la Patente de EE.UU. nº 7.741.119 en propiedad común y tramitación con la presente. En la Solicitud de Patente de EE.UU. nº US 2009-0246846 A1, en propiedad común y tramitación con la presente, se describe el hallazgo de que una cepa adaptada con mayor utilización de xilosa presenta una actividad xilosa isomerasa aumentada, y la modificación para una utilización mejorada de xilosa mediante la expresión de xilosa isomerasa a partir de un promotor mutado y muy activo (Pgap) del gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa de Zymomonas mobilis. Sin embargo, la utilización de xilosa no es todavía comparable a la utilización de glucosa.

Sigue habiendo la necesidad de cepas de Zymomonas, y de otras bacterias etanologénicas, que presenten una mejora adicional en la utilización de xilosa.

Sumario de la invención

La invención proporciona células de Zymomonas o Zymobacter que producen etanol y utilizan xilosa recombinantes, que son modificadas para que presenten una actividad ribosa-5-fosfato isomerasa (RPI) aumentada. Se ha descubierto que, en cepas cuya actividad xilosa isomerasa es elevada, el flujo de carbono a la RPI es también elevado y da lugar a la generación de los subproductos indeseables ribulosa-5 fosfato y/o ribulosa (catalizada por fosfatasas celulares), que se acumulan en el medio. La generación de estos subproductos desvía el carbono que se podría utilizar en la producción de etanol. La solución de los solicitantes a este problema recién descubierto es aumentar la actividad de la RPI para dirigir más carbono a los productos deseados de la ruta metabólica de la xilosa (fructosa-6-fosfato y gliceraldehído-6-fosfato) que se utilizan en la generación de etanol. De este modo, en cepas de Zymomonas o Zymobacter que utilizan xilosa, que acumulan ribulosa-5-fosfato y/o ribulosa cuando se cultivan en un medio que contiene xilosa, un aumento de la actividad RPI mejora el crecimiento celular, la utilización de xilosa y la producción de etanol.

En consecuencia, la invención proporciona una célula huésped bacteriana recombinante que comprende:

a) una ruta metabólica de la xilosa que comprende al menos un gen que codifica un polipéptido que presenta actividad xilosa isomerasa;

b) al menos un gen que codifica un polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa; y

c) al menos una modificación genética que aumenta la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa en la célula huésped en comparación con la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa en la célula huésped que carece de dicha modificación genética;

en donde la célula huésped bacteriana utiliza xilosa para producir etanol, y en donde la célula huésped bacteriana es seleccionada del grupo que consiste en Zymomonas y Zymobacter, y en donde la al menos una modificación genética de la operación (c) comprende aumentar el número de copias génicas de un gen que codifica un

polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa y/o hacer que se exprese dicho gen que codifica ribosa-5-fosfato isomerasa a partir de un promotor de alta expresión.

La ribosa-5-fosfato isomerasa de la invención puede ser del tipo "A" o del tipo "B", como se describen en esta memoria. Las ribosa-5-fosfato isomerasas del tipo "A" preferidas son aquellas que:

i) proporcionan una puntuación del valor E de 0,1 o menos cuando se hace la búsqueda empleando un perfil de modelo oculto de Markov preparado usando las ID. SEC. números 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 y 97; llevándose a cabo la búsqueda utilizando el algoritmo hmmsearch en el que se ajusta el parámetro Z a 1000 millones, y

ii) tienen ácido aspártico y ácido glutámico en las posiciones que corresponden a 107 y 129, respectivamente, en la proteína RPI-A de Saccharomyces cerevisiae de ID. SEC. nº 97.

Similarmente, las ribosa-5-fosfato isomerasas del tipo "B" preferidas son aquellas que:

i) proporcionan una puntuación del valor E de 0,1 o menos cuando se hace la búsqueda empleando un perfil de modelo oculto de Markov preparado usando las ID. SEC. números 1213, 1214, 1215, 1216 y 1217; llevándose a cabo la búsqueda utilizando el algoritmo hmmsearch en el que se ajusta el parámetro Z a 1000 millones,

ii) o bien tienen cisteína y treonina en las posiciones que corresponden a 66 y 68, respectivamente, en la proteína RPI-B de E. coli de ID. SEC. nº 1216, o bien tienen serina y ácido glutámico en las posiciones que corresponden a 68 y 72, respectivamente, en la proteína RPI-B de M. tuberculosis de ID. SEC. nº 1213, y

iii) tienen asparagina, glicocola, ácido aspártico, serina o ácido glutámico, pero no leucina, en la posición que corresponde a 100 en la proteína RPI-B de E. coli de ID. SEC. nº 1216.

Las xilosa isomerasas preferidas para uso en la invención son aquéllas que tienen una puntuación del valor E inferior o igual a 3x10-10 cuando se hace la búsqueda empleando un perfil HMM preparado usando las ID. SEC. números 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 y 81 y que tienen cuatro restos de sitio catalítico: histidina 54, ácido aspártico 57, ácido glutámico 181 y lisina 183, con los números de posición en relación con la secuencia de xilosa isomerasa de Streptomyces albus de ID. SEC. nº 61.

Un método para preparar una célula huésped bacteriana recombinante para la producción de etanol puede comprender:

a) proporcionar una célula huésped de bacteria Zymomonas o Zymobacter que comprende una ruta metabólica de la xilosa, en donde la célula huésped bacteriana produce etanol en presencia de xilosa y acumula ribulosa-5-fosfato, ribulosa o ambas, ribulosa-5-fosfato y ribulosa, en el medio cuando se cultiva en un medio que comprende xilosa; y

b) modificar genéticamente la célula huésped bacteriana de (a), en donde la modificación genética aumenta la expresión de la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa en la célula huésped en comparación con la actividad ribosa-5fosfato isomerasa en la célula huésped que carece de dicha modificación genética, en donde dicha modificación comprende aumentar el número de copias génicas de un gen que codifica un polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa y/o hacer que se exprese dicho gen de ribosa-5-fosfato isomerasa a partir de un promotor de alta expresión, y en donde ya no se acumulan ribulosa-5-fosfato, ribulosa ni ambas, ribulosa-5-fosfato y ribulosa, en el medio.

En otra realización, la invención proporciona un proceso para producir etanol, que comprende:

a) proporcionar una célula huésped bacteriana recombinante de la invención que produce etanol; y

b) cultivar la célula huésped bacteriana de (a) en un medio que comprende xilosa, mediante lo cual se convierte la xilosa en etanol.

Breve descripción de los depósitos biológicos, las figuras y las descripciones de secuencias

Los solicitantes han realizado los siguientes depósitos biológicos bajo los términos del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con las Finalidades de Procedimiento de Patente:

Información sobre cepas depositadas

Referencia de identificación del depositante

Denominación internacional de la depositaría Fecha de depósito

Zymomonas ZW658

ATCC nº PTA-7858 12 de septiembre de 2006

En la Figura 1 se muestra un diagrama de las rutas del metabolismo de xilosa y de la fermentación etanólica en bacterias Zymomonas modificadas en cuanto a la utilización de xilosa.

En la Figura 2 se muestra el análisis por HPLC de medios de cultivo después del crecimiento de la cepa ZW801-4 en medios que contienen glucosa (línea continua) o xilosa (línea discontinua).

En la Figura 3 se muestran gráficos de crecimiento (A), utilización de xilosa (B), producción de etanol (C), y acumulación de ribulosa en medios (D) de cultivos de cepas testigo ZW801-4 (ZW801-4#1 y ZW801-4#2) y cepas ZW801-4 que contienen un plásmido que contiene un gen quimérico con un promotor GI de A. missouriensis y una región de codificación de RPI-A de Z. mobilis (RPI-1 y RPI-2).

En la Figura 4 se muestra un gráfico del crecimiento de cepas testigo ZW801-4 (ZW801-1 y ZW801-2) y cepas ZW801-4 que contienen un plásmido que contiene un gen quimérico con un promotor GAP de Z. mobilis nativo y una región de codificación de RPI-A de E. coli (ZW801-rpiEc-1 y ZW801-rpiEc -2).

En la Figura 5 se muestra un gráfico del crecimiento de cepas testigo ZW801-4 (801/pZB188-1 y 801/pZB188-3) y cepas ZW801-4 que contienen un plásmido que contiene un gen quimérico con un promotor GAP de Z. mobilis y una región de codificación de xylA de E. coli (801/pXylA-2 y 801/pXylA-4).

En la Figura 6 se muestran gráficos de crecimiento (A), utilización de xilosa (B), producción de etanol (C), y acumulación de ribulosa en medios (D) de cultivos de cepas testigo ZW801-4 (ZW801-1 y ZW801-2) y cepas ZW801-4 que contienen un plásmido que contiene un gen quimérico con un promotor GI de A. missouriensis y una región de codificación de RPI-A de Z. mobilis , y un plásmido que contiene un gen quimérico con un promotor GAP de Z. mobilis y una región de codificación de xylA de E. coli (xylA/GI-rpiZ1.1 y xylA/GI-rpiZ1.2).

En la Figura 7 se muestra un gel teñido de marcadores (carril 1) y extractos proteicos totales de células que expresan RPI-A con un codón de inicio ATG en ZW801 GAP-rpi-1, ZW801 GAP-rpi-3 y ZW801 GAP-rpi-4 (carriles 2, 3 y 4, respectivamente), y testigos que expresan RPI-A con el codón de inicio GTG nativo (carriles 5 y 6), con la posición de la proteína RPI-A de Z. mobilis marcada mediante una flecha.

La Tabla 3 es una tabla del perfil HMM para xilosa isomerasas. La Tabla 3 se adjunta electrónicamente y se incorpora a la memoria por referencia.

La Tabla 4 es una tabla del perfil HMM para proteínas RPI-A. La Tabla 4 se adjunta electrónicamente y se incorpora a la memoria por referencia.

La Tabla 5 es una tabla del perfil HMM para proteínas RPI-B. La Tabla 5 se adjunta electrónicamente y se incorpora a la memoria por referencia.

Las secuencias siguientes se ajustan a 37 C.F.R. 1.821-1.825 ("Requisitos para Solicitudes de Patente que Contienen Descripciones de Secuencias de Nucleótidos y/o Secuencias de Aminoácidos – Las Reglas de Secuencias") y son coherentes con la Norma ST.25 (1998) de la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual (WIPO; del inglés, World Intellectual Property Organization) y los requisitos de listas de secuencias de la EPO y el PCT [Reglas 5.2 y 49.5 (a-bis), y la Sección 208 y el Anexo C de las Instrucciones Administrativas]. Los símbolos y el formato empleados para los datos de secuencias de nucleótidos y de aminoácidos se ajustan a las reglas expuestas en 37 C.F.R. §1.822.

Las ID. SEC. números 1-13 son cebadores oligonucleotídicos.

La ID. SEC. nº 14 es la secuencia de nucleótidos del promotor del gen de glucosa isomerasa de Actinoplanes missouriensis.

La ID. SEC. nº 15 es la secuencia de nucleótidos del plásmido pZB188/aadA.

La ID. SEC. nº 16 es la secuencia de nucleótidos del plásmido pZB-GI-RPI.

La ID. SEC. nº 17 es la secuencia de nucleótidos del promotor de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) de la cepa ZW1 (ZW4) de Z. mobilis.

La ID. SEC. nº 18 es la secuencia de nucleótidos del casete PgapXylA de expresión de xilosa isomerasa.

Tabla 1. Números de ID. SEC. de proteínas xilosa isomerasa y sus regiones de codificación

Organismo

Proteína de ID. SEC. nº: Región de codificación de ID. SEC. nº:

Escherichia coli K12

19 20

Lactobacillus brevis ATCC 367

21 22

Organismo

Proteína de ID. SEC. nº: Región de codificación de ID. SEC. nº:

Thermoanaerobacterium

23 24

Clostridium thermosulfurogenes

25 26

Actinoplanes missouriensis

27 28

Cepa B3728 de Arthrobacter

29 30

Bacillus licheniformis ATCC 14580

31 32

Geobacillus stearothermophilus

33 34

Bacillus coagulans 36D1

35 36

Cepa 168 de Bacillus subtilis subsp. subtilis

37 38

Bacteroides vulgatus ATCC 8482

39 40

Bifidobacterium adolescentis ATCC 15703

41 42

Erwinia carotovora subsp. atroseptica SCRI1043

43 44

Hordeum vulgare subsp. vulgare

45 46

Klebsiella pneumoniae subsp. pneumoniae MGH 78578

47 48

Lactococcus lactis subsp. lactis

49 50

Lactobacillus reuteri 100-23

51 52

Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides ATCC 8293

53 54

Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes

55 56

Thermotoga neapolitana

57 58

Streptomyces rubiginosus

59 60

Streptomyces albus

61 621

Thermus thermophilus

63 64

Streptomyces diastaticus

65 66

Streptomyces coelicolor A3(2)

67 68

Thermus caldophilus

69 702

Cepa 85-10 de Xanthomonas campestris pv. vesicatoria

71 72

Thermus aquaticus

73 743

Tetragenococcus halophilus

75 76

Staphylococcus xylosus

77 78

Cepa MC2 155 de Mycobacteriurn smegmatis

79 80

Piromyces sp. E2

81 82

1Se diseña esta secuencia de codificación, basándose en la secuencia de codificación de Streptomyces rubiginosus, para que codifique la proteína de Streptomyces albus (que tiene tres diferencias de aminoácido con la proteína de Streptomyces rubiginosus). 2Se diseña esta secuencia de codificación, basándose en una secuencia de codificación de Thermus thermophilus, para que codifique la proteína de Thermus caldophilus (que tiene 21 diferencias de aminoácido con la proteína de Streptomyces rubiginosus). 3Esta secuencia de codificación es de Thermus thermophilus y se traduce en la proteína de Thermus aquaticus, aunque la secuencia de codificación de Thermus aquaticus puede tener diferencias debidas a la degeneración de codones.

Tabla 2. Números de ID. SEC. de proteínas ribosa-5-fosfato isomerasa usadas como secuencias semilla para el análisis de la estructura de RPI-A, y sus regiones de codificación

Organismo

Proteína de ID. SEC. nº: Región de codificación de ID. SEC. nº:

Cepa K-12, subcepa DH10B, de Escherichia coli

83 2108

Enterobacter cloacae

84 2109

Vibrio vulnificus

85 2110

Thermus thermophilus HB8

86 2111

Chlamydomonas reinhardtii

87 2112

Spinacia oleracea

88 2113

Arabidopsis thaliana

89 2114

Arabidopsis thaliana

90 2115

Plasmodium falciparum 3D7

91 2116

Pyrococcus horikoshii OT3

92 2117

Methanocaldococcus jannaschii DSM 2661

93 2118

Fibrobacter succinogenes subsp. succinogenes S85

94 2119

Homo sapiens

95 2120

Caenorhabditis elegans

96 2121

Saccharomyces cerevisiae

97 2122

Las ID. SEC. números 98-1212 son proteínas ribosa-5-fosfato isomerasa RPI-A. Las ID. SEC. números 2123-3237 son secuencias que codifican proteínas ribosa-5-fosfato isomerasa RPI-A. Tabla 3. Números de ID. SEC. de proteínas ribosa-5-fosfato isomerasa usadas como secuencias semilla para el análisis de la estructura de RPI-B, y sus regiones de codificación

Organismo

Proteína de ID. SEC. nº: Región de codificación de ID. SEC. nº:

Mycobacterium tuberculosis CDC1551

1213 3238

Thermotoga maritima MSB8

1214 3239

Clostridium thermocellum ATCC 27405

1215 3240

Cepa K12, subcepa MG1655, de Escherichia coli

1216 3241

Cepa CL Brener de Trypanosoma cruzi

1217 3242

Las ID. SEC. números 1218-2107 son proteínas ribosa-5-fosfato isomerasa RPI-B.

Las ID. SEC. números 3243-4132 son secuencias que codifican proteínas ribosa-5-fosfato isomerasa RPI-B.

Descripción detallada

10 Se describen en esta memoria cepas de Zymomonas o Zymobacter que utilizan xilosa, que están genéticamente modificadas para que presenten una expresión aumentada de actividad ribosa-5-fosfato isomerasa (RPI) en comparación con cepas sin la modificación genética. Cuando se produce ribulosa como un producto secundario en la utilización de xilosa, la actividad RPI aumentada proporciona una utilización mejorada de xilosa, que se desea para el crecimiento en medios que contienen xilosa, incluyendo biomasa sacarificada, lo que conduce a una

15 producción aumentada de etanol. El etanol es un compuesto importante para uso en la sustitución de los combustibles fósiles, y la biomasa sacarificada proporciona una fuente de carbono renovable para la producción de etanol por fermentación.

Las definiciones siguientes pueden ser empleadas para la interpretación de las reivindicaciones y la memoria descriptiva.

Como se emplean en esta memoria, con los términos y expresiones "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "tiene", "que tiene", "contiene" y "que contiene", y cualquier otra variación de los mismos, se pretende cubrir una inclusión no exclusiva. Por ejemplo, una composición, mezcla, proceso, método, artículo o aparato que comprende una lista de elementos no se limita necesariamente a sólo esos elementos sino que puede incluir otros elementos no expresamente enumerados o inherentes a dicha composición, mezcla, proceso, método, artículo o aparato. Además, a menos que se afirme expresamente lo contrario, "o" se refiere a un "o" inclusivo y no a un "o" exclusivo. Por ejemplo, una condición A o B se satisface mediante cualquiera de los puntos siguientes: A es cierto (o está presente) y B es falso (o no está presente), A es falso (o no está presente) y B es cierto (o está presente), o tanto A como B son ciertos (o están presentes).

Además, se considera que los artículos indefinidos "un" y "una" que preceden a un elemento o componente de la invención son no restrictivos en cuanto al número de casos (es decir, sucesos) del elemento o componente. Por lo tanto, se debería leer que "un" o "una" incluye uno o al menos uno, y la forma de palabra singular del elemento o componente también incluye el plural a menos que el número signifique obviamente que es singular.

La expresión "invención" o "presente invención", como se emplea en esta memoria, es una expresión no restrictiva y con ella no se pretende referir a una sola realización de la invención particular sino que abarca todas las posibles realizaciones como las descritas en la memoria descriptiva y las reivindicaciones.

Como se emplea en esta memoria, el término "aproximadamente" que modifica la cantidad de un ingrediente o reactivo de la invención empleado se refiere a una variación en la cantidad numérica que se puede presentar, por ejemplo, a lo largo de procedimientos típicos de manipulación de líquidos y medición empleados para preparar concentrados o usar disoluciones en el mundo real; a causa de un error involuntario en estos procedimientos; a causa de diferencias en la fabricación, la fuente o la pureza de los ingredientes empleados para preparar las composiciones o llevar los métodos a cabo; y similares. El término "aproximadamente" también abarca cantidades que difieren a causa de unas diferentes condiciones de equilibrio para una composición que resulta de una mezcla inicial particular. Estén o no modificadas por el término "aproximadamente", las reivindicaciones incluyen equivalentes a las cantidades. En una realización, el término "aproximadamente" significa dentro del 10% del valor numérico indicado, preferiblemente dentro del 5% del valor numérico indicado.

La expresión "sustrato carbonado" o "sustrato carbonado fermentable" se refiere a una fuente de carbono que puede ser metabolizada por organismos huésped de la presente invención y, particularmente, a fuentes de carbono seleccionadas del grupo que consiste en monosacáridos, oligosacáridos y polisacáridos.

"Gen" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que expresa una proteína específica o una molécula de RNA funcional, que puede incluir opcionalmente secuencias reguladoras que preceden (secuencias no codificadoras 5') y siguen (secuencias no codificadoras 3') a la secuencia codificadora. "Gen nativo" o "gen de tipo silvestre" se refieren a un gen como el hallado en la naturaleza, con sus propias secuencias reguladoras. "Gen quimérico" se refiere a cualquier gen que no es un gen nativo, que comprende secuencias reguladoras y codificadoras que no se hallan juntas en la naturaleza. En consecuencia, un gen quimérico puede comprender secuencias reguladoras y secuencias codificadoras que proceden de diferentes fuentes, o secuencias reguladoras y secuencias codificadoras procedentes de la misma fuente pero dispuestas de un modo diferente al hallado en la naturaleza.

"Gen endógeno" se refiere a un gen nativo en su posición natural en el genoma de un organismo. Un gen "extraño" se refiere a un gen no hallado normalmente en el organismo huésped pero que se introduce en el organismo huésped por transferencia génica. Los genes extraños pueden comprender genes nativos insertados en un organismo no nativo, o genes quiméricos.

La expresión "construcción genética" se refiere a un fragmento de ácido nucleico que codifica la expresión de una o más proteínas específicas o moléculas de RNA funcionales. En una construcción génica el gen puede ser de naturaleza nativa, quimérica o extraña. Típicamente, una construcción genética comprenderá una "secuencia de codificación". Una "secuencia de codificación" se refiere a una secuencia de DNA que codifica una secuencia de aminoácidos específica.

"Promotor" o "regiones de control de la iniciación" se refieren a una secuencia de DNA capaz de controlar la expresión de una secuencia de codificación o un RNA funcional. En general, una secuencia de codificación está situada en 3' con respecto a una secuencia promotora. Los promotores pueden proceder en su totalidad de un gen nativo o pueden estar compuestos de diferentes elementos procedentes de diferentes promotores hallados en la naturaleza, o incluso comprender segmentos de DNA sintéticos. Los expertos en la técnica entienden que diferentes promotores pueden dirigir la expresión de un gen en diferentes tejidos o tipos celulares, o en diferentes fases de desarrollo, o en respuesta a diferentes condiciones ambientales. A los promotores que causan que un gen se exprese la mayoría de las veces en la mayoría de los tipos celulares se hace comúnmente referencia como "promotores constitutivos".

La expresión "modificación genética" se refiere, no inclusivamente, a cualquier modificación, mutación, supresión de bases, adición de bases, modificación de codones, sobreexpresión de genes, supresión de genes, modificación o sustitución de promotores, adición de genes (sean de copia única o múltiple), expresión o supresión antisentido, o

cualquier otro cambio en los elementos genéticos de una cepa bacteriana o célula huésped, ya produzcan un cambio en el fenotipo o no.

La expresión "célula huésped bacteriana recombinante" se refiere a una célula bacteriana que comprende al menos un gen o construcción genética o fragmento de ácido nucleico heterólogos.

El término "expresión", como se emplea en esta memoria, se refiere a la transcripción y la acumulación estable de RNA de codificación (mRNA) o funcional procedente de un gen. La expresión puede hacer también referencia a la traducción de mRNA en una proteína. "Inhibición antisentido" se refiere a la producción de transcritos de RNA antisentido capaces de suprimir la expresión de la proteína diana. "Sobreexpresión" se refiere a la producción de un producto génico en organismos transgénicos que sobrepasa los niveles de producción en organismos normales o no transformados. "Cosupresión" se refiere a la producción de transcritos o fragmentos de RNA sentido capaces de suprimir la expresión de genes extraños o endógenos idénticos o sustancialmente similares (Documento U.S. 5.231.020). El término "transformación", como se emplea en esta memoria, se refiere a la transferencia de un fragmento de ácido nucleico a un organismo huésped para dar lugar a una herencia genéticamente estable. El ácido nucleico transferido puede estar en forma de un plásmido mantenido en la célula huésped, o algún ácido nucleico transferido se puede integrar en el genoma de la célula huésped. A los organismos huésped que contienen los fragmentos de ácido nucleico transformados se hace referencia como organismos "transgénicos" o "recombinantes"

o "transformados".

Los términos "plásmido" y "vector", como se emplean en esta memoria, se refieren a un elemento extracromosómico que a menudo lleva genes que no son parte del metabolismo central de la célula, y normalmente en forma de moléculas de DNA circular de doble cadena. Dichos elementos pueden ser secuencias que se replican autónomamente, secuencias que se integran en el genoma, secuencias de fago o de nucleótidos, lineales o circulares, de un DNA o RNA de cadena sencilla o doble, procedentes de cualquier fuente, en que un número de secuencias de nucleótidos se han juntado o recombinado en una construcción única que es capaz de introducir en una célula un fragmento de promotor y una secuencia de DNA para un producto génico seleccionado junto con la apropiada secuencia 3' no traducida.

La expresión "operativamente ligado" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico sobre un único fragmento de ácido nucleico de modo que la función de una resulta afectada por la otra. Por ejemplo, un promotor está operativamente ligado a una secuencia de codificación cuando es capaz de afectar a la expresión de esa secuencia de codificación (es decir, que la secuencia de codificación está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias de codificación pueden estar operativamente ligadas a secuencias reguladoras en orientación sentido o antisentido.

La expresión "marcador seleccionable" significa un factor identificativo, normalmente un gen de resistencia a antibióticos o productos químicos, que se puede seleccionar basándose en el efecto del gen del marcador, es decir, la resistencia a un antibiótico, en donde el efecto se utiliza para rastrear la herencia de un ácido nucleico de interés y/o para identificar una célula u organismo que ha heredado el ácido nucleico de interés.

Como se emplea en esta memoria, la expresión "degeneración de codones" se refiere a la naturaleza del código genético que permite una variación de la secuencia de nucleótidos sin que resulte afectada la secuencia de aminoácidos de una proteína codificada. El técnico experto está al corriente de la "tendencia de codones" presentada por una célula huésped específica en el empleo de codones nucleotídicos para especificar un aminoácido dado. Por lo tanto, cuando se sintetiza un gen para una expresión mejorada en una célula huésped, es deseable diseñar el gen de modo que su frecuencia de empleo de codones se aproxime a la frecuencia del empleo de codones preferido de la célula huésped.

La expresión "optimizado en cuanto a codones", cuando se refiere a genes o regiones de codificación de moléculas de ácido nucleico para la transformación de diversos huéspedes, se refiere a la alteración de codones en el gen o las regiones de codificación de las moléculas de ácido nucleico para reflejar el empleo típico de codones del organismo huésped sin que se altere la proteína codificada por el DNA.

El término "lignocelulósico" se refiere a una composición que comprende tanto lignina como celulosa. El material lignocelulósico puede también comprender hemicelulosa.

El término "celulósico" se refiere a una composición que comprende celulosa y componentes adicionales, incluyendo hemicelulosa.

El término "sacarificación" se refiere a la producción de azúcares fermentables a partir de polisacáridos.

La expresión "biomasa pretratada" significa biomasa que ha sido sometida a un pretratamiento físico, químico y/o térmico para aumentar la accesibilidad de los polisacáridos en la biomasa antes de la sacarificación.

"Biomasa" se refiere a cualquier material celulósico o lignocelulósico e incluye materiales que comprenden celulosa y que además comprenden opcionalmente hemicelulosa, lignina, almidón, oligosacáridos y/o monosacáridos. La biomasa puede comprender también componentes adicionales, tales como proteína y/o lípido. La biomasa puede

proceder de una sola fuente o la biomasa puede comprender una mezcla procedente de más de una fuente; por ejemplo, la biomasa podría comprender una mezcla de mazorcas de maíz y caña de maíz o una mezcla de hierba y hojas. La biomasa incluye, pero no se limita a, cultivos para bioenergía, residuos agrícolas, desechos sólidos municipales, desechos sólidos industriales, suspensiones procedentes de la fabricación de papel, desechos de jardines, madera y desechos forestales. Los ejemplos de biomasa incluyen, pero no se limitan a, mazorcas de maíz, residuos de cultivos tales como hojas de maíz, caña de maíz, hierbas, paja de trigo, paja de cebada, heno, paja de arroz, pasto varilla, papel de desecho, bagazo de caña de azúcar, sorgo, soja, componentes obtenidos de la molienda de granos, árboles, ramas, raíces, hojas, astillas de madera, serrín, arbustos y matas, vegetales, frutos, flores y estiércol.

"Producto de hidrólisis de biomasa" se refiere al producto que resulta de la sacarificación de biomasa. La biomasa puede ser también pretratada o preprocesada antes de la sacarificación.

La expresión "ruta metabólica de la xilosa" o "ruta de utilización de la xilosa" se refiere a una serie de enzimas (codificadas por genes) que metabolizan la xilosa a través de fructosa-6-fosfato y/o gliceraldehído-6-fosfato e incluye 1) xilosa isomerasa, que cataliza la conversión de xilosa en xilulosa, 2) xilulocinasa, que fosforila la xilulosa para formar xilulosa-5-fosfato, 3) transcetolasa y 4) transaldolasa.

La expresión "xilosa isomerasa" se refiere a una enzima que cataliza la interconversión de D-xilosa y D-xilulosa. Las xilosa isomerasas (XI) pertenecen al grupo de enzimas clasificado como EC 5.3.1.5.

La expresión "ribosa-5-fosfato isomerasa" o "RPI" se refiere a una enzima que cataliza la interconversión de ribulosa-5-fosfato y ribosa-5-fosfato. Las ribosa-5-fosfato isomerasas pertenecen al grupo de enzimas clasificado como EC 5.3.1.6.

La expresión "valor E", como se conoce en el campo de la bioinformática, es el "valor esperado" que proporciona la probabilidad de que se produzca una coincidencia por casualidad. Proporciona la significación estadística de la coincidencia a una secuencia. Cuanto menor es el valor E, más significativo es el resultado.

La expresión "RPI-A de Z. mobilis" se refiere a la RPI de Z. mobilis que ha sido etiquetada en la técnica como RPI-A. Sin embargo, la proteína RPI de Z. mobilis presenta una identidad secuencial más próxima a la proteína RPI-B de E. coli (36%) que a la proteína RPI-A de E. coli (20%), y otro análisis de las RPIs descritas en esta memoria sitúa a la RPI de Z. mobilis en el grupo RPI-B. Sin embargo, en esta memoria la RPI de Z. mobilis es llamada RPI-A para que sea consistente con su nombre públicamente conocido.

El término "heterólogo" significa no hallado de forma natural en el lugar de interés. Por ejemplo, un gen heterólogo se refiere a un gen que no se encuentra de forma natural en el organismo huésped sino que se introduce en el organismo huésped por transferencia génica. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico heteróloga que está presente en un gen quimérico es una molécula de ácido nucleico que no se halla asociada de forma natural con los otros segmentos del gen quimérico, tal como las moléculas de ácido nucleico que tienen los segmentos de región codificadora y promotor no asociados de forma natural entre sí.

Como se emplea en esta memoria, una "molécula de ácido nucleico aislada" es un polímero de RNA o DNA que tiene cadena sencilla o doble, que contiene opcionalmente bases nucleotídicas sintéticas, artificiales o alteradas. Una molécula de ácido nucleico aislada en forma de un polímero de DNA puede estar compuesta de uno o más segmentos de cDNA, DNA genómico o DNA sintético.

Un fragmento de ácido nucleico es "hibridable" con otro fragmento de ácido nucleico, tal como un cDNA, DNA genómico o molécula de RNA, cuando una forma de cadena sencilla del fragmento de ácido nucleico se puede hibridar por extremos complementarios con el otro fragmento de ácido nucleico bajo las apropiadas condiciones de temperatura y fuerza iónica de la disolución. Las condiciones de hibridación y lavado son bien conocidas y son ejemplificadas en J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1989), particularmente en su Capítulo 11 y su Tabla

11.1. Las condiciones de temperatura y fuerza iónica determinan el "rigor" de la hibridación. Las condiciones de rigor pueden ser ajustadas para explorar desde fragmentos moderadamente similares (tales como secuencias homólogas de organismos poco relacionados), hasta fragmentos muy similares (tales como genes que duplican enzimas funcionales de organismos íntimamente relacionados). Los lavados después de la hibridación determinan las condiciones de rigor. En un conjunto de condiciones preferidas se emplea una serie de lavados que comienza con SSC 6X, SDS al 0,5%, a temperatura ambiental durante 15 minutos, se repite luego con SSC 2X, SDS al 0,5%, a 45 °C durante 30 minutos, y luego se repite dos veces con SSC 0,2X, SDS al 0,5%, a 50° durante 30 minutos. En un conjunto más preferido de condiciones rigurosas se emplean temperaturas más elevadas, siendo los lavados idénticos a los anteriores salvo por que se aumenta a 60 °C la temperatura de los dos lavados finales de 30 minutos en SSC 0,2X, SDS al 0,5%. En otro conjunto preferido de condiciones muy rigurosas se emplean dos lavados finales en SSC 0,1X, SDS al 0,1%, a 65 °C. Un conjunto adicional de condiciones rigurosas incluye, por ejemplo, la hibridación en SSC 0,1X, SDS al 0,1%, 65 °C, y lavados con SSC 2X, SDS al 0,1%, seguidos de SSC 0,1X, SDS al 0,1%.

La hibridación requiere que los dos ácidos nucleicos contengan secuencias complementarias aunque, dependiendo del rigor de la hibridación, son posibles discordancias entre bases. El rigor apropiado para hibridar ácidos nucleicos depende de la longitud de los ácidos nucleicos y del grado de complementación, variables bien conocidas en la técnica. Cuanto mayor es el grado de similitud u homología entre dos secuencias de nucleótidos, mayor es el valor de Tm para los híbridos de ácidos nucleicos que tienen esas secuencias. La estabilidad relativa (que corresponde a una Tm mayor) de las hibridaciones de ácidos nucleicos disminuye en el orden siguiente: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos de más de 100 nucleótidos de longitud se han obtenido ecuaciones para calcular la Tm (véase Sambrook et al., supra, 9.50-9.51). Para hibridaciones con ácidos nucleicos más cortos, es decir, oligonucleótidos, la posición de las discordancias se vuelve más importante y la longitud del oligonucleótido determina su especificidad (véase Sambrook et al., supra, 11.7-11.8). En una realización, la longitud para un ácido nucleico hibridable es al menos aproximadamente 10 nucleótidos. Preferiblemente, una longitud mínima para un ácido nucleico hibridable es al menos aproximadamente 15 nucleótidos, más preferiblemente al menos aproximadamente 20 nucleótidos y, lo más preferiblemente, la longitud es al menos aproximadamente 30 nucleótidos. Además, el técnico experto reconocerá que la temperatura y la concentración de sales de la disolución de lavado se pueden ajustar según sea necesario de acuerdo con factores tales como la longitud de la sonda. El término "complementario" se utiliza para describir la relación entre bases nucleotídicas que son capaces de hibridarse entre sí. Por ejemplo, con respecto al DNA, la adenosina es complementaria de la timina, y la citosina es complementaria de la guanina.

El término "homólogo" se refiere a fragmentos de ácido nucleico en los que cambios en una o más bases nucleotídicas no afectan a la capacidad del fragmento de ácido nucleico para mediar en la expresión génica o producir un cierto fenotipo. El término también se refiere a modificaciones de los fragmentos de ácido nucleico de la presente invención, tales como supresión o inserción de uno o más nucleótidos, que no alteran sustancialmente las propiedades funcionales del fragmento de ácido nucleico resultante con respecto al fragmento inicial, no modificado. Por lo tanto, se entiende que, como apreciarán los expertos en la técnica, la invención abarca más que las secuencias ejemplares específicas.

Además, el técnico experto reconoce que secuencias de ácido nucleico homólogas abarcadas por esta invención también son definidas por su capacidad para hibridarse, bajo condiciones moderadamente rigurosas (por ejemplo, SSC 0,5X, SDS al 0,1%, 60 °C), con las secuencias ejemplificadas en esta memoria o con cualquier porción de las secuencias de nucleótidos descritas en esta memoria y que son funcionalmente equivalentes a cualesquiera de las secuencias de ácido nucleico descritas en esta memoria.

La expresión "porcentaje de identidad", como se conoce en la técnica, es una relación entre dos o más secuencias polipeptídicas o dos o más secuencias polinucleotídicas según se determina al comparar las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de parentesco secuencial entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, según sea el caso, como se determina por la coincidencia entre cadenas de tales secuencias. La "identidad" y la "similitud" pueden ser fácilmente calculadas mediante métodos conocidos que incluyen, pero no se limitan a, los descritos en 1.) Computational Molecular Biology (redactado por A. M. Lesk), Oxford University: New York (1988); 2.) Biocomputing: Informatics and Genome Projects (redactado por D. W. Smith), Academic: New York (1993); 3.) Computer Analysis of Sequence Data, Parte I (redactado por A. M. Griffin y H. G. Griffin), Humania: New Jersey (1994); 4.) Sequence Analysis in Molecular Biology (redactado por G. von Heinje), Academic (1987); y 5.) Sequence Analysis Primer (redactado por M. Gribskov y J. Devereux), Stockton: New York (1991).

Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para obtener la mejor coincidencia entre las secuencias examinadas. Los métodos para determinar la identidad y la similitud están codificados en programas informáticos públicamente disponibles. Los alineamientos de secuencias y los cálculos del porcentaje de identidad pueden ser llevados a cabo usando el programa MegAlign™ de la serie LASERGENE de programas bioinformáticos (DNASTAR Inc., Madison, Wisconsin). Se lleva a cabo el alineamiento múltiple de las secuencias usando el "método Clustal de alineamiento" que abarca diversas variedades del algoritmo, incluyendo el "método Clustal V de alineamiento" que corresponde al método de alineamiento etiquetado Clustal V [descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989); D. G. Higgins et al., Comput. Appl. Biosci. 8: 189-191 (1992)] y hallado en el programa MegAlign™ de la serie LASERGENE de programas bioinformáticos (DNASTAR Inc.). Para alineamientos múltiples, los valores por omisión corresponden a una PENALIZACIÓN POR HUECO = 10 y una PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO = 10. Los parámetros por omisión para alineamientos por pares y cálculo del porcentaje de identidad de las secuencias proteicas usando el método Clustal son KTUPLE = 1, PENALIZACIÓN POR HUECO = 3, VENTANA = 5 y DIAGONALES GUARDADAS = 5. Para ácidos nucleicos, estos parámetros son KTUPLE = 2,PENALIZACIÓN POR HUECO = 5, VENTANA = 4 y DIAGONALES GUARDADAS = 4. Después del alineamiento de las secuencias usando el programa Clustal V, es posible obtener un "porcentaje de identidad" observando la tabla de "distancias de secuencias" en el mismo programa. Además, el "método Clustal W de alineamiento" está disponible y corresponde al método de alineamiento etiquetado Clustal W [descrito por Higgins y Sharp, CABIOS 5: 151-153 (1989); D. G. Higgins et al., Comput. Appl. Biosci. 8: 189-191 (1992)] y hallado en el programa MegAlign™ v6.1 de la serie LASERGENE de programas bioinformáticos (DNASTAR Inc.). Los parámetros por omisión para el alineamiento múltiple son PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO = 0,2, Retraso de secuencias divergentes (%) = 30, Peso de las transiciones para DNA = 0,5, Matriz ponderada para proteínas = serie Gonnet, matriz ponderada para DNA = IUB. Después del alineamiento de las secuencias usando el programa

Clustal W, es posible obtener "un porcentaje de identidad" observando la tabla de "distancias de secuencias" en el mismo programa.

Un experto en la técnica entenderá bien que muchos niveles de identidad secuencial son útiles para identificar polipéptidos de otras especies, en donde dichos polipéptidos tienen una función o actividad igual o similar. Los ejemplos útiles de porcentajes de identidad incluyen, pero no se limitan a, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% o 95%; o cualquier número entero porcentual de 25% a 100% puede ser útil para describir la presente invención, tal como 25%, 26%, 27%, 28%, 29%, 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99%. Los fragmentos de ácido nucleico adecuados no sólo tienen las anteriores homologías sino que codifican típicamente un polipéptido que tiene al menos 50 aminoácidos, preferiblemente al menos 100 aminoácidos, y más preferiblemente al menos 150 aminoácidos.

La expresión "software para análisis de secuencias" se refiere a cualquier algoritmo o programa informático que es útil para el análisis de secuencias de nucleótidos o aminoácidos. El "software para análisis de secuencias" puede estar comercialmente disponible o ser independientemente desarrollado. El software para análisis de secuencias típico incluirá, pero no se limitará a: 1.) la serie GCG de programas [Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin]; 2.) BLASTP, BLASTN, BLASTX [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403410 (1990)]; 3.) DNASTAR (DNASTAR, Inc., Madison, Wisconsin); 4.) Sequencher (Gene Codes Corporation, Ann Arbor, Michigan); y 5.) el programa FASTA que lleva incorporado el algoritmo de Smith-Waterman {W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20, redactado por Sandor Suhai, Plenum: New York, EE.UU.}. Dentro del contexto de esta solicitud se entenderá que, donde se utilice el software para análisis de secuencias para el análisis, los resultados del análisis se basarán en los "valores por omisión" del programa al que se hace referencia, a menos que se especifique otra cosa. Como se emplean en esta memoria, los "valores por omisión" significarán cualquier conjunto de valores o parámetros que se cargan originalmente con el software cuando se inicializa éste por vez primera.

Las técnicas de DNA recombinante y clonación molecular estándares empleadas en esta memoria son bien conocidas en este campo técnico y descritas por J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, New York, 1989 (en lo sucesivo "Maniatis"); y por T. J. Silhavy, M. L. Bennan y L. W. Enquist, "Experiments with Gene Fusions"; Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, New York, 1984; y por F. M Ausubel et al. en "Current Protocols in Molecular Biology", publicado por Greene Publishing and Wiley-Interscience, 1987.

La presente invención se refiere a cepas modificadas de Zymomonas o Zymobacter que utilizan xilosa, que presentan una utilización mejorada de xilosa cuando fermentan en medios que contienen xilosa. Un reto para mejorar la producción de etanol por fermentación de un biocatalizador en un medio que incluye un producto de hidrólisis de biomasa, típicamente producido por pretratamiento y sacarificación de biomasa, es obtener una utilización óptima de la xilosa. La xilosa es uno de los azúcares pentosa predominantes en los materiales lignocelulósicos hidrolizados, siendo arabinosa el otro. Los solicitantes han descubierto que una expresión aumentada de la ribosa-5-fosfato isomerasa en cepas que utilizan xilosa conduce a una eficacia aumentada en la utilización de xilosa y, por lo tanto, a mayores producciones de etanol cuando la fermentación es en medios que contienen xilosa.

Descubrimiento de ineficacia en la utilización de xilosa

La modificación de bacterias etanologénicas en cuanto a la utilización de xilosa incluye típicamente la expresión de cuatro proteínas: xilosa isomerasa, xilulocinasa, transcetolasa y transaldolasa. Estas enzimas proporcionan una ruta de utilización de xilosa que conduce a la producción de etanol, como se muestra en la Figura 1. Sin embargo, la utilización de xilosa por cepas de Zymomonas modificadas para que metabolicen xilosa no es típicamente eficaz.

Los solicitantes han descubierto una posible causa de la ineficacia en la utilización de xilosa: un metabolito de la ruta de utilización de la xilosa que podría ser utilizado para producir etanol es desviado a un subproducto. Específicamente, los solicitantes han descubierto que con cepas de Zymomonas que utilizan xilosa y son capaces de crecer en xilosa como única fuente de carbono se acumula ribulosa (D-ribulosa) en el medio cuando son cultivadas en un medio que sólo contiene xilosa como fuente de carbono. La ribulosa acumulada en el medio puede representar aproximadamente el 8% de la xilosa total consumida. Esta acumulación de ribulosa no se produce cuando la misma bacteria Zymomonas que utiliza xilosa es cultivada en un medio que contiene glucosa y no xilosa.

Se puede producir ribulosa por conversión de ribulosa-5-fosfato en ribulosa por una fosfatasa. Si se acumula ribulosa-5-fosfato en una célula, puede proporcionar un sustrato para fosfatasas celulares. La conversión de ribulosa-5-fosfato en ribulosa y la acumulación de ribulosa en el medio indican una deficiencia enzimática en la ruta responsable de metabolizar xilosa hasta etanol. Las condiciones bajo las cuales resulta aumentada la etapa inicial del metabolismo de la xilosa, catalizada por xilosa isomerasa, pueden actuar para intensificar esta deficiencia, lo que conduce a niveles aún mayores de acumulación de ribulosa-5-fosfato y ribulosa. Además, la acumulación de

ribulosa-5-fosfato puede ser tan grande que ésta llegue a ser bacteriostática o incluso letal, ya que se sabe que la acumulación de azúcar-fosfato en células bacterianas es perjudicial para su metabolismo y su viabilidad. Por lo tanto, mediante el descubrimiento de ribulosa en el medio y el reconocimiento de las posibles implicaciones de este hallazgo por los solicitantes, los solicitantes han identificado un problema a resolver que puede afectar a la utilización de xilosa. La reducción de la producción de ribulosa y la mejora de la utilización de ribulosa-5-fosfato en las rutas del metabolismo de la xilosa y de la producción de etanol, como se muestra en la Figura 1, pueden mejorar la producción de etanol a partir de xilosa.

Aumento de la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa

Los solicitantes han descubierto que un aumento de la expresión de ribosa-5-fosfato isomerasa (RPI) en bacterias Z. mobilis que utilizan xilosa y acumulan ribulosa cuando se cultivan en un medio que contiene xilosa conduce a una acumulación reducida de ribulosa. La acumulación reducida de ribulosa puede estar relacionada con una acumulación reducida de ribulosa-5-fosfato, como se describió anteriormente. Las cepas con expresión aumentada de RPI mostraban un crecimiento mejorado, una utilización aumentada de xilosa y una producción aumentada de etanol cuando se cultivaban en un medio que contenía xilosa en comparación con las mismas cepas que carecían de la expresión aumentada de RPI. La RPI cataliza la interconversión de ribulosa-5-fosfato y ribosa-5-fosfato (véase la Figura 1).

Un aumento de la expresión de la enzima RPI-A de Z. mobilis (que en realidad es una enzima RPI-B según se determina en esta memoria y se describe más adelante) en una cepa de Z. mobilis que utiliza xilosa y produce ribulosa cuando se cultiva en un medio que contiene xilosa condujo a una reducción de casi el 50% en la acumulación de ribulosa en el medio en comparación con la misma cepa sin la expresión aumentada de RPI. Además, las cepas con expresión aumentada de RPI mostraban una producción aumentada de masa celular, un consumo aumentado de xilosa y un título aumentado de etanol, lo que indica una conversión aumentada de xilosa en etanol. La expresión aumentada de la enzima RPI-A de E. coli en la misma cepa de Z. mobilis que produce ribulosa también condujo a la producción de una masa celular aumentada. Los aumentos de masa celular, consumo de xilosa y producción de etanol variarán dependiendo de factores tales como la cepa de partida que utiliza xilosa, la composición de los medios y el nivel de expresión de RPI. La masa celular aumentada puede ser aproximadamente 15% o más después de 60 horas de crecimiento en un medio que contiene 100 g/l de xilosa como único azúcar, y el aumento de producción de etanol puede ser al menos aproximadamente 5% al utilizar las cepas presentes en las condiciones descritas en los Ejemplos de esta memoria.

La expresión aumentada de RPI se puede llevar a cabo usando cualquier proteína o polipéptido con actividad ribosa5-fosfato isomerasa en Zymomonas. Hay dos grupos de enzimas ribosa-5-fosfato isomerasas, que son denominados RPI-A y RPI-B. Las enzimas RPI-B pertenecen a la familia RpiB/LacA/LacB de azúcar-fosfato isomerasas. La bacteria E. coli tiene dos proteínas RPI; una es una RPI-A y la otra es una RPI-B. La bacteria Z. mobilis tiene una sola proteína RPI que es indicada como RPI-A. Sin embargo, la proteína RPI de Z. mobilis presenta una identidad secuencial más próxima a la proteína RPI-B de E. coli (36%) que a la proteína RPI-A de E. coli (20%). Otro análisis de RPIs descrito más adelante coloca a la RPI de Z. mobilis en el grupo RPI-B. Sin embargo, la RPI de Z. mobilis es llamada RPI-A para que sea consistente con su nombre públicamente conocido.

Las secuencias de proteínas RPI que se pueden emplear en los microorganismos presentes son muy diversas, como se ejemplifica por las proteínas RPI de Z. mobilis y E. coli. Las proteínas RPI que se pueden emplear en los microorganismos presentes pueden ser identificadas usando un análisis bioinformático. Un planteamiento bioinformático de estructura/función utilizado en esta memoria en el Ejemplo 8 es el análisis basado en un perfil de modelado oculto de Markov, una identificación de restos de sitio activo y una exploración adicional de aminoácidos identificativos.

Se construyeron perfiles de modelos ocultos de Markov (HMM; del inglés, Hidden Markov Models) usando el algoritmo hmmsearch del paquete informático HMMER (Janelia Farm Research Campus, Ashburn, Virginia, EE.UU.). La teoría tras los perfiles HMM se describe en Durbin et al. ["Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids" (1998), Cambridge University Press] y Krogh et al. [J. Mol. Biol. 235 (1994): 1501-1531], que permite caracterizar un conjunto de proteínas basándose en la probabilidad de que cada aminoácido se encuentre en cada posición en el alineamiento de las proteínas del conjunto.

Como secuencias semilla para preparar perfiles HMM para RPI-A y RPI-B se usaron proteínas con identificación funcional como la citada en las bases de datos BRENDA (Cologne University BioInformatics Center) y PubMed (US National Library of Medicine, National Institutes of Health), 15 para RPI-A (Tabla 2; ID. SEC. números 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 y 97) y 5 para RPI-B (Tabla 3; ID. SEC. números 1213, 1214, 1215, 1216 y 1217). BRENDA es una base de datos de anotación humana que contiene información detallada acerca de propiedades cinéticas, físicas y bioquímicas de enzimas, extraídas de la bibliografía experimental y con vínculos a las bases de datos relevantes. Usando cada conjunto de secuencias semillas se construyó un alineamiento múltiple de secuencias (MSA; del inglés, multiple sequence alignment) usando Clustal W con los parámetros por omisión. Los resultados del MSA se usaron como datos de entrada para preparar los perfiles HMM que se proporcionan en las Tablas 4 y 5 para proteínas ribosa-5-fosfato isomerasa A y proteínas ribosa-5-fosfato isomerasa B, respectivamente. En las tablas, los aminoácidos se representan mediante el código de una letra. La primera línea

para cada posición presenta las puntuaciones de emisión de coincidencia: la probabilidad de que cada aminoácido esté en ese estado (se resalta la puntuación más elevada). La segunda línea presenta las puntuaciones de emisión de inserción, y la tercera línea presenta las puntuaciones de transición de estado: M→M, M→1, M→D; I→M, I→I; D→M, D→D; B→M; M→E.

Además de los perfiles HMM, se utilizaron los restos de sitio activo conocidos para enzimas RPI-A y RPI-B [Roos et al. (2004), J. Mol. Biol. 335: 799-809; Graile et al. (2005), Biochimie 87: 763-769], y un aminoácido que distingue a LacB, para identificar proteínas RPI-A y RPI-B que se pueden utilizar en los microorganismos presentes. Las proteínas RPI-A que se pueden utilizar son proteínas que i) proporcionan una puntuación del valor E de 0,1 o menos cuando se hace la búsqueda empleando un perfil de modelo oculto de Markov preparado usando las ID. SEC. números 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 y 97; llevándose a cabo la búsqueda utilizando el algoritmo hmmsearch en el que se ajusta el parámetro Z a 1000 millones, y ii) tienen ácido aspártico y ácido glutámico en las posiciones que corresponden a 107 y 129, respectivamente, en la proteína RPI-A de Saccharomyces cerevisiae (ID. SEC. nº 97). Las proteínas RPI-B que se pueden utilizar son proteínas que i) proporcionan una puntuación del valor E de 0,1 o menos cuando se hace la búsqueda empleando un perfil de modelo oculto de Markov preparado usando las ID. SEC. números 1213, 1214, 1215, 1216 y 1217; llevándose a cabo la búsqueda utilizando el algoritmo hmmsearch en el que se ajusta el parámetro Z a 1000 millones, ii) o bien tienen cisteína y treonina en las posiciones que corresponden a 66 y 68, respectivamente, en la proteína RPI-B de E. coli (ID. SEC. nº 1216), o bien tienen serina y ácido glutámico en las posiciones que corresponden a 68 y 72, respectivamente, en la proteína RPI-B de M. tuberculosis (ID. SEC. nº 1213), y iii) tienen asparagina, glicocola, ácido aspártico, serina o ácido glutámico, pero no leucina, en la posición que corresponde a 100 en la proteína RPI-B de

E. coli (ID. SEC. nº 1216).

Los ejemplos de proteínas RPI-A y RPI-B que encajan en los criterios anteriores y que se pueden utilizar en los microorganismos presentes son, para RPI-A: ID. SEC. números 83 a 1212 y para RPI-B: ID. SEC. números 1213 a 2107. Estas proteínas, así como cualquier proteína con una identidad secuencial de al menos aproximadamente 8085%, 85%-90%, 90%-95% o al menos aproximadamente 96%, 97%, 98% o 99% con respecto a cualquiera de estas secuencias y que tenga actividad ribosa-5-fosfato isomerasa, se pueden utilizar en las células presentes. Los ejemplos de secuencias que codifican proteínas RPI-A incluyen las ID. SEC. números 2108 a 3237. Los ejemplos de secuencias que codifican proteínas RPI-B incluyen las ID. SEC. números 3238 a 4132. Se pueden identificar fácilmente RPIs adicionales en la bibliografía y en bases de datos bioinformáticas, como es bien sabido por la persona experta y como se describió anteriormente. La identificación de secuencias proteicas y/o codificadoras utilizando la bioinformática es típicamente a través de una búsqueda BLAST (anteriormente descrita) en bases de datos públicamente disponibles con secuencias de aminoácidos o secuencias de codificación de RPI, tales como las proporcionadas en esta memoria. Las identidades se basan en el método Clustal W de alineamiento usando los parámetros por omisión de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO = 0,1, y serie Gonnet 250 de matriz ponderada para proteínas.

Además, las secuencias descritas en esta memoria o las citadas en la técnica pueden ser utilizadas para identificar otros compuestos homólogos en la naturaleza. Por ejemplo, cada uno de los fragmentos de ácido nucleico que codifican RPI descritos en esta memoria puede ser utilizado para aislar secuencias de DNA que codifican proteínas homólogas. El aislamiento de secuencias homólogas usando protocolos dependientes de secuencias es bien conocido en la técnica. Los ejemplos de protocolos dependientes de secuencias incluyen, pero no se limitan a: 1) métodos de hibridación de ácido nucleico; 2) métodos de multiplicación de DNA y RNA, como se ejemplifica mediante los usos diversos de tecnologías de multiplicación de ácido nucleico [por ejemplo, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR; del inglés, polymerase chain reaction), Mullis et al., Patente de EE.UU. nº 4.683.202; la reacción en cadena de la ligasa (LCR; del inglés, ligase chain reaction), S. Tabor et al., Proc. Acad. Sci. USA 82: 1074 (1985); o la multiplicación con desplazamiento de cadena (SDA; del inglés, strand displacement amplification), Walker et al., Proc. Natl. Acad: Sci. U.S.A., 89: 392 (1992)]; y 3) métodos de construcción y exploración de bancos por complementación.

Cepa huésped que utiliza xilosa

Se puede aumentar la expresión de RPI en cualquier cepa de Zymomonas u otra bacteria etanologénica, tal como Zymobacter, que sea capaz de utilizar xilosa como una fuente de carbono. Zymobacter palmae es una bacteria productora de etanol que ha sido modificada en cuanto a la utilización de xilosa mediante la expresión de genes para la utilización de xilosa, como se describe más adelante para Zymomonas, usando promotores de gliceraldehído-3fosfato deshidrogenasa y enolasa de Z. mobilis [Yanase et al., Applied and Environmental Microbiology (2007) 73: 2592-2599]. Además, la bacteria etanologénica acumula ribulosa-5-fosfato o ribulosa cuando se cultiva en un medio que contiene xilosa y no se aumenta la expresión de RPI.

Se han modificado cepas de Zymomonas, tal como Z. mobilis, para la fermentación de xilosa hasta etanol. Típicamente, se han introducido cuatro genes en Z. mobilis para la expresión de cuatro enzimas implicadas en el metabolismo de la xilosa (Figura 1), como se describe en la Patente de EE.UU. nº 5514583, la Patente de EE.UU. nº 5712133, la Patente de EE.UU. nº 6566107, el Documento WO 95/28476, Feldmann et al. [Appl. Microbiol. Biotechnol. (1992) 38: 354-361], y Zhang et al. [Science 267 (1995): 240-243]. Dichos genes incluyen genes que

codifican xilosa isomerasa, que cataliza la conversión de xilosa en xilulosa, y xilulocinasa, que fosforila la xilulosa para formar xilulosa-5-fosfato. Se expresan además transcetolasa y transaldolasa, dos enzimas de la ruta de las pentosas-fosfato que convierten la xilulosa-5-fosfato en productos intermedios que conectan el metabolismo de las pentosas con la ruta glicolítica de Entner-Doudoroff permitiendo el metabolismo de la xilosa hasta etanol (véase la Figura 1). Las secuencias de DNA que codifican estas enzimas se pueden obtener de cualquiera de los numerosos microorganismos que son capaces de metabolizar la xilosa, tales como bacterias entéricas y algunas levaduras y hongos. Las fuentes para las regiones de codificación pueden incluir Xanthomonas, Klebsiella, Escherichia, Rhodobacter, Flavobacterium, Acetobacter, Gluconobacter, Rhizobium, Agrobacterium, Salmonella, Pseudomonas y Zymomonas. Se emplean típicamente las regiones de codificación de E. coli.

Genes endógenos pueden proporcionar parte de una ruta de fermentación de la xilosa o pueden ser alterados mediante cualquier técnica de manipulación genética conocida para proporcionar una proteína con actividad enzimática útil para el metabolismo de la xilosa. Por ejemplo, en la creación de una ruta de utilización de la xilosa la transcetolasa endógena puede complementar otras actividades enzimáticas introducidas.

En el presente proceso también se pueden emplear cepas de Zymomonas o Zymobacter que son adicionalmente modificadas para que utilicen otros azúcares que, como la xilosa, no son sustratos naturales. Un ejemplo es una cepa de Z. mobilis modificada en cuanto a la utilización de arabinosa, como se describe en el Documento US 5843760. Se pueden modificar cepas de otros modos adicionales para mejorar la utilización de xilosa y la producción de etanol.

Expresión aumentada de RPI

En el presente microorganismo se realiza una modificación genética que aumenta la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa en comparación con la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa en el microorganismo que carece de la modificación genética. Se puede obtener una expresión aumentada de actividad RPI haciendo que se exprese una molécula de DNA que codifica una proteína que tiene actividad ribosa-5-fosfato isomerasa y que es activa en el microorganismo huésped. Se describieron anteriormente proteínas útiles con actividad ribosa-5-fosfato isomerasa, incluyendo proteínas ribosa-5-fosfato isomerasa A y ribosa-5-fosfato isomerasa B.

Para aumentar la actividad RPI se puede utilizar cualquier método para aumentar la actividad de una enzima en un microorganismo. Dichos métodos son bien conocidos por un experto en la técnica e incluyen aumentar el número de copias del gen de codificación y/o la expresión de un gen que contiene un promotor de alta expresión. Las cepas presentes pueden ser modificadas para una expresión aumentada de una región de codificación endógena de RPI, y/o la expresión de una región de codificación heteróloga introducida de RPI para obtener una actividad enzimática aumentada. Además, la actividad RPI puede ser aumentada por mutación y exploración de genes mutados expresados, para identificar microorganismos con actividad aumentada.

Típicamente, se alcanza una expresión aumentada de RPI al transformar con una molécula de DNA que codifica RPI, que está operativamente ligada a un promotor en un gen u operón quimérico. Las secuencias de codificación de RPIs que se pueden utilizar incluyen cualesquier secuencias que codifiquen las proteínas RPI-A y RPI-B anteriormente descritas. Los ejemplos de estas secuencias de codificación incluyen, para RPI-A: las ID. SEC. números 2108 a 3237, y para RPI-B: las ID. SEC. números 3238 a 4132.

Cuando se utiliza una región de codificación heteróloga, la secuencia puede estar optimizada en cuanto a codones para una expresión máxima en la célula huésped diana, como es bien sabido por un experto en la técnica. Si el codón de inicio nativo es GTG, puede ser cambiado por ATG para una expresión proteica aumentada. Los métodos para expresión génica en bacterias son bien conocidos en la técnica. La expresión de genes en bacterias requiere típicamente un promotor, operativamente ligado a una región de codificación de interés, y un terminador de la transcripción. Los promotores que se pueden emplear son promotores que se expresan en células de Zymomonas o Zymobacter, tales como los promotores del gen de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (promotor GAP; Pgap) de

Z. mobilis, del gen de enolasa (promotor ENO; Peno) de Z. mobilis y del gen que codifica xilosa isomerasa (promotor GI; Pgi) de Actinoplanes missouriensis. Particularmente, los promotores de alta expresión que se pueden utilizar son los promotores Pgap con mutaciones que causan una elevada expresión, como se describe en la Publicación de Patente de EE.UU. nº 2009-0246876 A1. Los promotores Pgap de dicha publicación tienen una sustitución de base en una posición seleccionada del grupo que consiste en la posición -190, la posición -89 o ambas posiciones, -190 y 89; en donde los números de posición son con respecto al codón de iniciación de la traducción ATG natural para la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa en las cepas CP4 y ZM4 de Z. mobilis. Específicamente, la sustitución de base es una T que sustituye a una G en la posición -190 y una T que sustituye a una C en la posición -89. Estas posiciones son las 116 y 217, respectivamente, en la ID. SEC. nº 17.

Un gen u operón quimérico para la expresión de RPI es típicamente construido en, o transferido a, un vector para otras manipulaciones. Los vectores son bien conocidos en la técnica. Ciertos vectores son capaces de replicarse en una gran variedad de bacterias huésped y pueden ser transferidos por conjugación. Se dispone de la secuencia completa y anotada de pRK404 y tres vectores relacionados: pRK437, pRK442 y pRK442(H). Se ha demostrado que estos derivados son herramientas valiosas para la manipulación genética en bacterias Gram negativas [Scott et al., Plasmid 50 (1): 74-79 (2003)].

Los vectores que se pueden replicar tanto en E. coli como en Zymomonas, tal como pZB188 que se describe en la Patente de EE.UU. nº 5.514.583, son particularmente útiles para la expresión en Zymomonas. Los vectores pueden incluir plásmidos para replicación autónoma en una célula, y plásmidos para portar construcciones que se van a integrar en genomas bacterianos. Los plásmidos para integración de DNA pueden incluir transposones, regiones de secuencia de ácido nucleico homólogas al genoma bacteriano diana, u otras secuencias que soportan la integración. Un tipo adicional de vector puede ser un transposoma producido al utilizar, por ejemplo, un sistema que es comercialmente asequible de EPICENTRE®. Es bien sabido cómo escoger un vector apropiado para el huésped diana deseado y la función deseada.

Se pueden modificar células bacterianas introduciendo un vector que tiene un gen quimérico que comprende una región de codificación de RPI por métodos bien conocidos, tal como utilizando transformación por congelacióndescongelación, transformación mediada por calcio, electroporación o conjugación. Cualquier célula bacteriana que se va a modificar para una utilización mejorada de xilosa aumentando la expresión de una enzima RPI es una célula huésped diana para su transformación con objeto de obtener una cepa como la descrita en esta memoria. Son células huésped particularmente adecuadas las de Zymomonas y Zymobacter. El gen quimérico introducido se puede mantener en la célula sobre un plásmido que se replica establemente o se puede integrar en el genoma después de la introducción.

Para modificar una cepa con un gen u operón quimérico de RPI integrado en el genoma de la célula bacteriana se pueden utilizar métodos que son bien conocidos en la técnica, tales como recombinación homóloga, inserción de transposones e inserción de transposomas. En la recombinación homóloga, secuencias de DNA que flanquean un sitio de integración diana están situadas junto a un gen de resistencia a espectinomicina, u otro marcador seleccionable, y un gen quimérico Rpi, lo que conduce a la inserción del marcador seleccionable y el gen quimérico Rpi en el sitio genómico diana. Además, el marcador seleccionable puede lindar con sitios de recombinación específicos del sitio, de manera que, después de la expresión de la correspondiente recombinasa específica del sitio, se escinda el gen de resistencia del genoma.

Además, el promotor del gen endógeno que expresa RPI puede ser sustituido por un promotor mucho más expresado para que aumente la actividad RPI en la célula. Esto se puede llevar a cabo por recombinación homóloga usando vectores y métodos como los anteriormente descritos.

Combinación de xilosa isomerasa y expresión de RPI aumentadas

Los presentes microorganismos pueden ser modificados para que presenten una expresión aumentada de xilosa isomerasa. La presencia de una actividad RPI aumentada en las células, junto con una expresión más aumentada de xilosa isomerasa, conducen a una producción más aumentada de etanol. Por ejemplo, la producción de etanol puede ser aumentada en al menos aproximadamente 10%, 15%, 20% o 25% dependiendo de factores tales como la cepa específica, la composición de los medios y las condiciones de crecimiento.

En las células presentes, se puede obtener una expresión aumentada de actividad xilosa isomerasa haciendo que se exprese un gen que codifica una enzima xilosa isomerasa que es activa en la célula huésped, usando cualquier método conocido en la técnica como el anteriormente descrito para la expresión de RPI. En la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. US 2009-0246846 A1, en propiedad común y tramitación con la presente, se describen enzimas útiles con actividad xilosa isomerasa. Como se describe en dicha publicación, se pueden identificar xilosa isomerasas usando un perfil HMM (anteriormente descrito para RPI) preparado en dicha publicación usando 32 secuencias de proteína xilosa isomerasa con una función experimentalmente verificada según se cita en la base de datos BRENDA. Estas proteínas se enumeran en la Tabla 1 y tienen las ID. SEC. números 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 y 81. En la Tabla 3 se proporciona el perfil HMM para la familia xilosa isomerasa de proteínas. Además del perfil HMM, se halló que cuatro aminoácidos de sitio catalítico eran característicos de las xilosa isomerasas: la histidina 54, el ácido aspártico 57, el ácido glutámico 181 y la lisina 183, con los números de posición relativos a la secuencia de xilosa isomerasa de Streptomyces albus (ID. SEC. nº 61). Cualquier proteína que encaje en el perfil HMM de xilosa isomerasa con una puntuación del valor E < o = 3x10-10 y que tenga estos cuatro restos de sitio catalítico es una xilosa isomerasa cuya región de codificación puede ser utilizada para aumentar la actividad xilosa isomerasa en las células presentes, además de las proteínas con los números de ID. SEC. expuestos en la Tabla 1. Las ID. SEC. números 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78 y 80, como se exponen en la Tabla 1, son ejemplos de regiones de codificación que se pueden utilizar para expresar proteínas xilosa isomerasas.

Como es sabido en la técnica, puede haber variaciones en las secuencias de DNA que codifican una secuencia de aminoácidos a causa de la degeneración del código genético. Se pueden optimizar los codones para la expresión de una secuencia de aminoácidos en una célula huésped diana con objeto de obtener una expresión codificada óptima.

Fermentación de una cepa con utilización mejorada de xilosa

Los presentes microorganismos modificados con actividad RPI aumentada pueden ser utilizados en una fermentación para producir etanol. Como un ejemplo, se describe la producción de etanol por una cepa de Z. mobilis

de la invención.

Para la producción de etanol, se pone una bacteria Z. mobilis recombinante que utiliza xilosa y tiene una actividad RPI aumentada en contacto con un medio que contiene xilosa. La xilosa puede ser el único azúcar pero, típicamente, el medio contiene una mezcla de azúcares que incluye xilosa y glucosa. El medio puede contener un producto de hidrólisis de biomasa que incluye estos azúcares que proceden de una biomasa celulósica o lignocelulósica tratada.

Cuando la concentración de azúcares mixtos es tan alta que se inhibe el crecimiento, el medio incluye sorbitol, manitol o una mezcla de los mismos, como se describe en el Documento US 7629156 B2 en propiedad común. El galactitol o el ribitol pueden sustituir a, o combinarse con, el sorbitol o el manitol. La bacteria Z. mobilis crece en el medio donde tiene lugar la fermentación y se produce etanol. La fermentación se desarrolla sin aire, oxígeno u otros gases complementados (que pueden incluir condiciones tales como una fermentación anaeróbica, microaeróbica o microaerófila) durante al menos 24 horas, y se puede desarrollar durante 30 horas o más. El periodo de tiempo para alcanzar la máxima producción de etanol es variable, dependiendo de las condiciones de fermentación. Típicamente, si están presentes inhibidores en el medio, se requiere un periodo de fermentación más prolongado. Las fermentaciones se pueden desarrollar a temperaturas que están entre aproximadamente 30 °C y aproximadamente 37 °C, en un pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 7,5.

La presente bacteria Z. mobilis puede ser cultivada en un medio que contiene azúcares mixtos, incluyendo xilosa, en fermentadores a escala de laboratorio y en una fermentación ampliada donde se producen cantidades comerciales de etanol. Cuando se desea una producción comercial de etanol, se pueden aplicar una diversidad de metodologías de cultivo. Por ejemplo, la producción a gran escala a partir de las presentes cepas de Z. mobilis se puede producir mediante metodologías de cultivo tanto discontinuas como continuas. Un método clásico de cultivo discontinuo es un sistema cerrado donde la composición del medio se ajusta al comienzo del cultivo y no se somete a alteraciones artificiales durante el proceso de cultivo. De esta manera, al comienzo del proceso de cultivo, se inocula el deseado organismo en el medio y se permite que tenga lugar la actividad metabólica o de crecimiento sin añadir nada al sistema. Sin embargo, típicamente, un cultivo "discontinuo" es discontinuo con respecto a la adición de fuente de carbono y a menudo se hacen intentos para controlar factores tales como el pH y la concentración de oxígeno. En sistemas discontinuos, las composiciones de metabolitos y biomasa del sistema cambian constantemente hasta el momento en que se termina el cultivo. En los cultivos discontinuos, las células se moderan a través de una fase estática de latencia hasta una fase logarítmica de alto crecimiento y finalmente hasta una fase estacionaria en la que disminuye o se detiene la velocidad de crecimiento. Si no son tratadas, las células de la fase estacionaria finalmente morirán. Las células de la fase logarítmica son a menudo responsables de la mayor parte de la producción del producto final o producto intermedio en algunos sistemas. En otros sistemas se puede obtener una producción en fase estacionaria o postexponencial.

Una variación del sistema discontinuo estándar es el sistema de alimentación discontinua. Los procesos de cultivo con alimentación discontinua son también adecuados para el crecimiento de las presentes cepas de Z. mobilis y comprenden un sistema discontinuo típico con la excepción de que se añade el sustrato en incrementos conforme progresa el cultivo. Los sistemas de alimentación discontinua son útiles cuando la represión de catabolitos tiende a inhibir el metabolismo de las células y cuando es deseable tener cantidades limitadas de sustrato en el medio. La medición de la concentración real de sustrato en los sistemas de alimentación discontinua es difícil y, por lo tanto, se estima basándose en los cambios de factores mensurables tales como el pH y la presión parcial de gases residuales tales como el CO2. Los métodos de cultivo discontinuos y de alimentación discontinua son comunes y bien conocidos en la técnica, y se pueden hallar ejemplos de ellos en "Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology", Crueger, Crueger y Brock, segunda edición (1989), Sinauer Associates, Inc., Sunderland, Massachusetts, o en Mukund V. Deshpande, Appl. Biochem. Biotechnol. 36, 227 (1992).

La producción comercial de etanol también se puede llevar a cabo con un cultivo continuo. Los cultivos continuos son sistemas abiertos en los que se añade continuamente un medio de cultivo definido a un biorreactor y se extrae simultáneamente una cantidad igual de medio acondicionado para su procesamiento. Los cultivos continuos mantienen generalmente las células con una densidad de fase líquida elevada y constante, estando fundamentalmente las células en crecimiento en fase logarítmica. Alternativamente, se puede llevar a la práctica el cultivo continuo con células inmovilizadas, añadiéndose continuamente carbono y nutrientes y retirándose continuamente productos valiosos, subproductos o productos de desecho de la masa celular. La inmovilización de células puede ser llevada a cabo usando una gran variedad de soportes sólidos compuestos de materiales naturales y/o sintéticos, como es sabido por un experto en la técnica.

El cultivo continuo o semicontinuo permite la modulación de un factor o de cualquier número de factores que afectan al crecimiento celular o a la concentración del producto final. Por ejemplo, un método mantendrá un nutriente limitante, tal como la fuente de carbono o el nivel de nitrógeno, en una proporción fija y permitirá que se moderen todos los demás parámetros. En otros sistemas, un número de factores que afectan al crecimiento puede ser continuamente alterado mientras se mantiene constante la concentración de células, medida mediante la turbiedad del medio. Los sistemas continuos tienden a mantener las condiciones de crecimiento en estado estacionario y, de este modo, la pérdida de células debida al medio que se extrae debe ser equilibrada con respecto a la velocidad de

crecimiento de las células en el cultivo. Los métodos para modular los nutrientes y los factores de crecimiento para procesos de cultivo continuos así como las técnicas para maximizar la velocidad de formación del producto son bien conocidos en el campo de la microbiología industrial, y una diversidad de métodos es detallada por Brock, supra.

Particularmente adecuado para la producción de etanol es un régimen de fermentación como el siguiente. La cepa deseada de Z. mobilis de la presente invención es cultivada en matraces agitados en un medio semicomplejo a una temperatura de aproximadamente 30 °C a aproximadamente 37 °C, con agitación a aproximadamente 150 rpm en agitadores orbitales, y es luego transferida a un fermentador de siembra de 10 l de capacidad que contiene un medio similar. El cultivo de siembra es desarrollado anaeróbicamente en el fermentador de siembra hasta que la densidad óptica a 600 nm (OD600) es entre 3 y 6, cuando es transferido al fermentador de producción donde se optimizan los parámetros de fermentación para la producción de etanol. Los volúmenes de inóculo típicos transferidos desde el depósito de siembra hasta el depósito de producción varían de aproximadamente 2% a aproximadamente 20% en volumen/volumen. El medio de fermentación típico contiene componentes de medio mínimo tales como fosfato potásico (1,0 – 10,0 g/l), sulfato amónico (0 – 2,0 g/l), sulfato magnésico (0 – 5,0 g/l), y una fuente de nitrógeno complejo tal como extracto de levadura o productos basados en soja (0 – 10 g/l). Está presente en el medio una concentración final de sorbitol o manitol aproximadamente 5 mM. Se añaden continuamente azúcares mixtos que incluyen xilosa y al menos un azúcar adicional tal como glucosa (o sacarosa), que proporcionan una fuente de carbono, al recipiente de fermentación tras el agotamiento de la fuente de carbono discontinua inicial (50 – 200 g/l) para maximizar la velocidad y el título de etanol. Las velocidades de alimentación de la fuente de carbono se ajustan dinámicamente para asegurar que no se está acumulando glucosa en exceso en el cultivo, lo que podría conducir a la acumulación de subproductos tóxicos tales como el ácido acético. Con objeto de maximizar el rendimiento de etanol producido a partir del sustrato utilizado, se restringe el crecimiento de biomasa mediante la cantidad de fosfato que es alimentada discontinuamente al inicio o que es alimentada durante el curso de la fermentación. El pH de la fermentación es controlado en un valor de 5,0 – 6,0 usando una disolución cáustica (tal como hidróxido amónico, hidróxido potásico o hidróxido sódico) y ácido sulfúrico o fosfórico. La temperatura del fermentador es controlada en un valor de 30 °C – 35 °C. Con objeto de minimizar la formación de espuma, se añaden agentes antiespumantes (agentes basados en silicona de cualquier clase, basados en compuestos orgánicos, etc.) al recipiente según sea necesario. Para minimizar la contaminación se puede utilizar opcionalmente un antibiótico, para el cual hay un marcador resistente al antibiótico en la cepa, tal como kanamicina.

Cualquier conjunto de condiciones anteriormente descrito, y variaciones adicionales en estas condiciones que son bien conocidas en la técnica, son condiciones adecuadas para la producción de etanol por una cepa de Zymomonas recombinante que utiliza xilosa.

Ejemplos

La presente invención es adicionalmente definida en los ejemplos siguientes. Se debe entender que estos ejemplos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, sólo se proporcionan a modo de ilustración. A partir de la discusión anterior y estos ejemplos, un experto en la técnica puede determinar las características esenciales de esta invención y puede realizar diversos cambios y modificaciones de la invención para adaptarla a los diversos usos y condiciones.

Métodos generales

Las técnicas estándares de DNA recombinante y clonación molecular empleadas en esta memoria son bien conocidas en este campo técnico y son descritas por J. Sambrook, E. F. Fritsch y T. Maniatis, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, New York (1989) (en lo sucesivo "Maniatis"); y por T. J. Silhavy, M. L. Bennan y L. W. Enquist, "Experiments with Gene Fusions", Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, New York (1984); y por F. M. Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", publicado por Greene Publishing Assoc. y Wiley-Interscience, Hoboken, New Jersey (1987).

El significado de las abreviaturas es el siguiente: "kb" significa kilobases, "bp" significa pares de bases (del inglés, base pairs), "nt" significa nucleótidos, "h" significa horas, "min" significa minutos, "s" significa segundos, "d" significa días, "l" significa litros, "ml" significa mililitros, "µl" significa microlitros, "µg" significa microgramos, "ng" significa nanogramos, "mM" significa milimolar, "µM" significa micromolar, "nm" significa nanómetros, "µmol" significa micromoles, "pmol" significa picomoles, "Cm" significa cloranfenicol, "Cmr" significa resistente a cloranfenicol, "Cms" significa sensible a cloranfenicol, "Spr" significa resistencia a espectinomicina, "Sps" significa sensible a espectinomicina, "XI" es xilosa isomerasa, "XK" es xilulocinasa (del inglés, xylulokinase), "TAL" es transaldolasa, "TKT" es transcetolasa (del inglés, transketolase), "OD600" significa densidad óptica (del inglés, optical density) medida a una longitud de onda de 600 nm, "PCR" significa reacción en cadena de la polimerasa (del inglés, polymerase chain reaction), "kDa" significa kilodáltones, "g" significa la constante de gravitación, "bp" significa pares de bases, "kbp" significa kilopares de bases, "HPLC" significa cromatografía de alta eficacia en fase líquida (del inglés, high performance liquid chromatography) y "GC" significa cromatografía en fase gaseosa (del inglés, gas chromatography), "RM" significa medio rico (del inglés, rich medium) que contiene 10 g/l de extracto de levadura más 2 g/l de KH2PO4, "MM" significa medio de cruce (del inglés, mating medium) que contiene 10 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de triptona, 2,5 g/l de (NH4)2SO4 y 0,2 g/L de KH2PO4.

Ejemplo 1

Acumulación de ribulosa en la cepa ZW1801-4 de Zymomonas mobilis

En la Patente de EE.UU. nº 7.741.119 se describió la cepa recombinante ZW801-4 de Z. mobilis. La cepa ZW1801-4 procedía de la cepa ZW800, que procedía de la cepa ZW658, todas como se describen en el Documento US

7.741.119. Se construyó ZW658 integrando dos operones, PgapxylAB y Pgaptaltkt, que contienen cuatro genes de utilización de xilosa que codifican xilosa isomerasa (xylA), xilulocinasa (xylB), transaldolasa (tal) y transcetolasa (tkt), en el genoma de ZW1 (nuevo nombre de la cepa ZM4: ATCC nº 31821) a través de procesos de transposición secuenciales para producir la cepa X13L3, que fue renombrada ZW641, lo que fue seguido de adaptación en medios selectivos que contienen xilosa. Se depositó ZW658 bajo el Tratado de Budapest como ATCC nº PTA-7858. En ZW658, el gen que codifica glucosa-fructosa oxidorreductasa fue inactivado por inserción usando doble entrecruzamiento, recombinación homóloga y resistencia a espectinomicina como un marcador seleccionable, todo mediado por el huésped, para crear la cepa ZW800. El marcador de resistencia a espectinomicina, que lindaba con sitios loxP, fue eliminado por recombinación específica del sitio usando recombinasa Cre para crear la cepa ZW801

4. Como se describe en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. nº US 20090246846 A1, en propiedad común y tramitación con la presente, ZW648 presenta mucha más actividad xilosa isomerasa (aproximadamente 7 veces más) que ZW641 (representada por la cepa X13bC) a causa de una mutación en el promotor (Pgap) que expresa la región de codificación de xylA.

Se cultivó ZW801-4 en un medio que contenía xilosa como única fuente de carbono (medios MRM3X10: extracto de levadura al 1%, KH2PO4 15 mM, MgSO4 4 mM y 100 g/l de xilosa) y en un medio con 100 g/l de glucosa en sustitución de la xilosa (MRM3G10). Las células se cultivaron a 33 °C con agitación mínima (125 rpm en un agitador orbital LAB-Line; Terra Universal, Inc., Fullerton, California). Se analizaron la ribulosa y otros productos de fermentación por cromatografía de alta eficacia (HPLC). El análisis por HPLC se llevó a cabo en un aparato Agilent serie 1200 (Agilent Technologies, Santa Clara, California) con detectores tanto de índice de refracción como de red de diodos. La fase móvil consistía en ácido sulfúrico 0,01 N a un caudal de 0,5 ml/min. Se utilizó una columna Shodex SH1011 (Showa Denko, Tokio, Japón) para azúcares, para la separación de sustratos y productos de fermentación. Los patrones externos incluían D-glucosa, D-xilosa, glicerol, acetato, etanol y D-ribulosa (Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri) en diversas concentraciones para la calibración y la comparación de productos que se acumulaban en los medios de cultivo. La señal por índice de refracción para el patrón de D-ribulosa estaba en un tiempo de retención de 17,3 minutos y, como se esperaba, no se presentó señal con la detección por red de diodos. El análisis de los medios de cultivo mostró que la producción de ribulosa comenzó muy pronto en el cultivo que contenía xilosa y continuó hasta que se hubo agotado la fuente de xilosa. Además, sólo se acumulaba ribulosa cuando se cultivaban las células en medios que contenían xilosa (Figura 2, línea discontinua). La comparación de los medios de cultivo por HPLC para la cepa ZW801-4 desarrollada en medios de cultivo con glucosa como fuente de carbono (Figura 2, línea continua) no mostró producción transitoria ni acumulada de ribulosa a pesar del uso completo de este sustrato (Figura 2). No se utilizó la xilosa hasta compleción en el cultivo que contenía medio de xilosa.

Ejemplo 2

Modificación de bacterias Z. mobilis con gen quimérico de ribulosa-5-fosfato isomerasa de Z. mobilis

Se llevó a cabo la expresión de una copia extracromosómica de un gen quimérico que contiene la región de codificación nativa de ribulosa-5-fosfato isomerasa (RPI-A) de Z. mobilis clonando la región de codificación en un vector lanzadera adyacente a un promotor de glucosa isomerasa (GI) procedente de Actinoplanes missouriensis.

La región de codificación de RPI-A de Z. mobilis (ID. SEC. nº 1870) fue aislada de DNA genómico de la cepa ZW1 (nuevo nombre de la cepa ZM4: ATCC 31821) usando la PCR. Se preparó DNA genómico de ZW1 usando un kit Puregene para la purificación de DNA genómico, siguiendo las instrucciones del fabricante (Gentra Systems, Minneapolis, Minnesota). Se diseñaron cebadores de PCR para multiplicar la región de codificación de RPI-A e incorporar sitios de enzimas de restricción apropiados con fines de clonación. También se diseñaron cebadores de PCR para conservar la distancia nativa entre la secuencia Shine-Dalgarno del promotor y el codón de iniciación de la región de codificación.

Los cebadores de PCR empleados para aislar la región de codificación de RPI-A fueron el Cebador-1 y el Cebador-2 (ID. SEC. números 1 y 2). La secuencia del Cebador-1 corresponde al extremo 5' de la región de codificación de RPI-A, incluyendo el codón de iniciación nativo y 15 bp de la secuencia del extremo terminal 3' del promotor GI de A. missouriensis. El Cebador-2 incluye el extremo 3' de la región de codificación de RPI-A, que lleva incorporados el codón de parada nativo y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción XhoI. Una PCR usando DNA genómico de ZW1 de Z. mobilis con el Cebador-1 y el Cebador-2 dio lugar a un fragmento de DNA que contenía la secuencia de codificación de RPI-A de 474 bp, con 15 bp de la secuencia del promotor GI en el extremo 5' y un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción XhoI en el extremo3'.

Se aisló el promotor GI de A. missouriensis (ATCC 14538) de 186 bp (ID. SEC. nº 14) por PCR usando los cebadores Cebador-3 y Cebador-4 (ID. SEC. números 3 y 4). El Cebador-3 de PCR contiene la secuencia para los

sitios de reconocimiento de las enzimas de restricción NcoI y SacI situados en el extremo 5' del fragmento del promotor GI. La secuencia para el Cebador-4 contiene el extremo 3' del promotor GI y los primeros 15 bp para la secuencia de codificación de RPI-A.

Los productos de PCR, el promotor GI y la secuencia de codificación de RPI-A, se combinaron en una segunda PCR usando sólo los cebadores Cebador-2 y Cebador-3, lo que dio lugar a un fragmento de DNA que contenía el promotor GI ligado a la secuencia de codificación de RPI-A, conservándose la distancia entre la secuencia Shine-Dalgarno y el codón de iniciación. El fragmento de DNA fue luego digerido con las enzimas de restricción NcoI y XhoI y fue ligado en el vector lanzadera pZB188/aadA de Zymomonas-E. coli previamente tratado con las dos mismas enzimas. pZB188/aadA (ID. SEC. nº 15) es un vector construido a partir de pZB188, descrito en el Documento US 5514583, que es capaz de replicarse en E. coli y Z. mobilis y tiene un marcador de resistencia a tetraciclina. La construcción de pZB188/aadA se describió en la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. nº US 2009-0246876 A1, en propiedad común y tramitación con la presente (Ejemplo 5), y tiene una deleción del marcador de resistencia a tetraciclina y su sustitución por un marcador de resistencia a espectinomicina. Después de la ligación, el plásmido resultante, denominado pZB-GI-RPI (ID. SEC. nº 16), fue empleado para transformar células SCS110 de E. coli químicamente competentes (Stratagene, San Diego, California) usando el protocolo del fabricante.

El plásmido pZB-GI-RPI aislado de células SCS110 fue utilizado para transformar la cepa competente ZW801-4 de

Z. mobilis. Se prepararon células ZW801-4 competentes desarrollando cultivos durante la noche en MRM3G5 (extracto de levadura al 1%, KH2PO4 15 mM, MgSO4 4 mM y 50 g/l de glucosa) a 30 °C. Se recogieron las células el día siguiente y se transfirieron a medio fresco hasta un valor inicial de OD600 de 0,025. Los cultivos fueron desarrollados hasta una OD600 de 0,5 y fueron luego recolectados y lavados una vez con agua esterilizada por filtración, a 4 °C, y después dos veces con glicerol al 10% a 4 °C. Las células competentes, concentradas por un factor de 200X (OD600 = 100) se guardaron a -80 °C hasta su uso.

Se aislaron cepas transformadas de Z. mobilis que contenían el plásmido pZB-GI-RPI a partir de colonias individuales después de una incubación en placas MRM3G5-Spec250 (medios MRM3G5 con 250 mg/l de espectinomicina y 15 g/l de agar) durante 2 días a 30 °C en un vaso anaeróbico usando AnaeroPacks (Mitsubishi Gas Chemical, New York, EE.UU.).

Ejemplo 3

Efectos de una expresión aumentada de ribulosa-5-fosfato isomerasa de Z. mobilis en cepas de Z. mobilis recombinantes

Para determinar si las cepas de Z. mobilis recombinantes que llevaban copias extracromosómicas del gen RPI-A presentaban niveles alterados de ribulosa y una fermentación mejorada de xilosa, se seleccionaron cepas transformadas individuales que contenían pZB-GI-RPI de placas MRM3G5-Spec250. Las cepas transformadas (RPI1 y RPI-2) fueron transferidas a medios líquidos MRM3G5-Spec250 con una OD600 inicial de 0,1 y fueron incubadas a 30 °C. Después de una incubación de 14-16 horas, las cepas fueron transferidas a medio MRM3X10 (extracto de levadura al 1%, KH2PO4 15 mM, MgSO4 4 mM y 100 g/l de xilosa) y fueron incubadas durante 24 horas. El examen del efecto de un número de copias aumentado del gen RPI-A sobre la eficacia de la fermentación comenzó después de una segunda transferencia de los cultivos a medio MRM3X10 fresco como una medida para evitar el arrastre de glucosa del cultivo original. Se inocularon las cepas transformadas que llevaban pZB-GI-RPI y los testigos (W801-4 por duplicado: ZW801-1 y ZW801-2) hasta una OD600 inicial de 0,1 y se llevó a cabo una incubación a 30 °C. El crecimiento se determinó mediante mediciones de densidad óptica. Se determinaron el consumo de xilosa y la acumulación de producto (es decir, ribulosa y etanol) mediante un análisis por HPLC, como se describió en el Ejemplo 1.

En la Figura 3 (A-C) se muestran los resultados de la fermentación en medio MRM3X10. La Figura 3A es un registro del cambio de densidad óptica para dos cepas transformadas (RPI-1 y RPI-2) en comparación con los testigos (ZW801-4#1 y ZW801-4#2). A partir de estos datos se puede ver que los crecimientos precoces de las cepas transformadas y testigo eran similares. Sin embargo, en el punto temporal 48 horas la cepa testigo dejó de crecer mientras que las dos cepas transformadas independientes continuaron aumentando de masa celular. El aumento de masa celular acumulada por las cepas que llevan copias extra de la región de codificación de RPI-A de Z. mobilis se refleja también en el uso aumentado de xilosa y en el aumento de producción de etanol a lo largo de los puntos temporales posteriores de este experimento (Figuras 3B y 3C). En la Figura 3D también se muestra el curso temporal de la acumulación de ribulosa para cada cepa. A partir de estos datos es evidente que el nivel de ribulosa se redujo para las cepas recombinantes que contenían copias adicionales de la región de codificación de RPI-A de

Z. mobilis en comparación con los testigos.

Ejemplo 4

Expresión del gen RPI-A de E. coli en Zymomonas mobilis recombinante

Se clonó la región de codificación de RPI-A de E. coli (región de codificación ID. SEC. nº 2108, proteína ID. SEC. nº

83) y se colocó en el vector lanzadera pZB188/aadA, en un gen quimérico expresado desde el promotor nativo de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) de Z. mobilis (de ZW1, también llamado ZM4; ID. SEC. nº 17).

A lo largo del diseño de cebadores se conservó la distancia nativa entre la secuencia Shine-Dalgarno para el promotor GAP y el codón de iniciación de la región de codificación de RPI-A de E. coli. Se añadieron apropiados sitios de reconocimiento para enzimas de restricción con fines de clonación. El Cebador-5 de PCR (ID. SEC. nº 5) incluye sitios de reconocimiento para NcoI y SacI añadidos al extremo 5' de la secuencia promotora de GAP. Usando el Cebador-6 (ID. SEC. nº 6) en una reacción, emparejado con el Cebador-5, y DNA genómico de ZW1 (ATCC nº 31821) como molde, se produjo un fragmento de DNA de 304 pares de bases que contenía el promotor GAP nativo completo de Z. mobilis. Este fragmento también contenía 15 pares de bases de la secuencia de codificación del extremo 5' para la región de codificación de RPI-A de E. coli por incorporación a la secuencia del Cebador-6. Usando el Cebador-7 y el Cebador-8 (ID. SEC. números 7 y 8), y DNA genómico aislado de E. coli K12, se multiplicó por PCR un fragmento de 660 pares de bases. El extremo 5' del fragmento contenía 15 pares de bases de la secuencia correspondiente al extremo 3' del promotor GAP. Se añadió la secuencia para el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción XhoI al extremo 3' de la región de codificación de RPI-A. Se aislaron el promotor GAP y fragmentos de la región de codificación de RPI-A y se utilizaron en una segunda PCR con el Cebador-5 y el Cebador-8. Esta reacción dio lugar a un único fragmento de DNA que ligaba el promotor GAP a la región de codificación de RPI-A de E. coli, conservándose la distancia nativa entre Shine-Dalgarno y el codón de iniciación, incorporando también sitios de enzimas de restricción para clonación en el vector lanzadera pZB188/aadA (descrito en el Ejemplo 2). La inserción en el vector lanzadera fue seguida de digestión con las enzimas NcoI y XhoI. La transformación de células SCS110 competentes de E. coli con el producto de ligación permitió el aislamiento de un plásmido intacto (denominado pZB-GI-RPI-ECA) que fue luego utilizado para transformar células ZW801-4 competentes de Z. mobilis mediante los métodos descritos en el Ejemplo 2.

Se cultivaron colonias individuales de las placas MRM3G5-Spec250, cepas denominadas ZW801-rpiEc-1 y ZW801rpiEc-2), en medio líquido MRM3G10 con espectinomicina (250 µg/ml) y se transfirieron luego a medio MRM3X10 fresco junto con la cepa ZW801-4 parental (ZW801-1 y ZW801-2) como un testigo. Se determinó la densidad óptica de los cultivos después de 16 horas de incubación a 30 °C. Se transfirieron las células a medio MRM3X10 fresco, minimizándose la transferencia de glucosa al medio de xilosa, y se comparó el crecimiento de las cepas que contenían el gen quimérico que expresa la región de codificación de RPI-A de E. coli con el crecimiento del testigo (por duplicado) para determinar si eran posibles un aumento de masa celular y una reducción de acumulación de ribulosa a través de la expresión de este gen heterólogo. Los resultados de la Figura 4 demuestran un aumento de acumulación de masa celular para las dos cepas independientemente aisladas que contienen el gen quimérico que expresa la región de codificación heteróloga de RPI-A en comparación con los testigos. Los resultados fueron similares a los demostrados para la región de codificación de RPI-A de Z. mobilis, mostrados en la Figura 3A, con las líneas transformadas que acumulan mayor masa celular. El análisis por HPLC también demostró una menor acumulación de ribulosa en el medio. El análisis del punto final a las 91 horas dio lugar a una acumulación de 3,03 g/l de ribulosa para una media de las dos cepas testigo y sólo 2,12 g/l y 1,93 g/l de ribulosa para las cepas ZW801rpiEc-1 y ZW801-rpiEc-2, respectivamente. Los resultados de esta comparación son consistentes con los demostrados en el Ejemplo 3, que muestran que una expresión aumentada de RPI en una cepa que crece en un medio que contiene xilosa da lugar a un aumento de acumulación de masa celular y a una acumulación reducida de ribulosa.

Ejemplo 5

Ejemplo comparativo: Eficacia de la fermentación para una cepa ZW801-4 recombinante de Z. mobilis con una expresión más aumentada de xilosa isomerasa

Se hizo que se expresara la región de codificación de xylA de E. coli desde un promotor GAP sobre un vector lanzadera multicopia para aumentar la actividad de esta enzima. La expresión fue en la cepa ZW801-4, que es una cepa que utiliza xilosa con elevada actividad xilosa isomerasa a causa de una mutación en el promotor (Pgap) que expresa la región de codificación de xylA, como se describió en el Ejemplo 1.

La construcción de un vector pZB188/aadA (descrito en el Ejemplo 2 anterior) que contiene la región de codificación de xilosa isomerasa de E. coli (región de codificación ID. SEC. nº 20; proteína ID. SEC. nº 19) con su transcripción dirigida por un promotor nativo de gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP) de Z. mobilis (pZB188/aadA-GapXylA, también llamado pZB188/aadA-641GapXylA) fue previamente descrita en el Ejemplo 5 de la Publicación de Solicitud de Patente de EE.UU. nº US 2009-0246876 A1, en propiedad común y tramitación con la presente. La casete de expresión PgapXylA (ID. SEC. nº 18) tiene el promotor GAP (Pgap) de la cepa ZW641.

Se transformó la cepa ZW801-4 con los plásmidos pZB188/aadA y pZB188/aadA-641GapXylA, como se describió en el Ejemplo 1 anterior. Se aislaron las cepas de colonias individuales desarrolladas en una placa MMG-KAN500 (extracto de levadura al 1%, KH2PO4 15 mM, MgSO4 4 mM, 50 g/l de glucosa y 500 µg/ml de kanamicina) y se transfirieron a medio MRM3X10. Se ajustó la OD600 inicial de las células a 0,08 para cada cepa y luego se incubaron las células a 30 °C con agitación a 150 rpm.

En la Figura 5 se muestran las velocidades de crecimiento de las cepas en medio MRM3X10. Los resultados

muestran que las velocidades de crecimiento para los testigos (801/pZB188-1 y 801/pZB188-3) eran mayores que para las cepas transformadas con pZB188/aadA-641GapXylA (801/pXylA-2 y 801/pXylA-4). La masa celular final también resultó aumentada para las cepas testigo que se desarrollaban en medios que contenían xilosa. El análisis por HPLC de la Tabla 6 también demostró claramente el uso reducido de xilosa y la menor producción de etanol para las cepas que contenían pZB188/aadA-641GapXylA. También se halló que la acumulación de ribulosa por gramo de xilosa empleada estaba aumentada en estas cepas en comparación con la línea testigo.

De este modo, una expresión más aumentada de xilosa isomerasa en ZW801-4, que ya presenta una elevada expresión de xilosa isomerasa como se describió anteriormente, es perjudicial para la eficacia de la fermentación.

Tabla 6. Análisis por HPLC de medios de cultivo después de una incubación de 91 horas. Los datos están en g/l.

Cepa

Xilosa Ribulosa Etanol

801/pXylA-2

34,72 4,27 32,26

801/pXylA-4

39,05 3,93 29,67

801/pZB188-1

8,20 8,20 43,67

801/pZB188-3

5,57 6,95 45,17

Ejemplo 6

Eficacia de fermentación para la cepa ZW801-4 con expresión aumentada de xilosa isomerasa y ribulosa-5-fosfato isomerasa

Se evaluaron los efectos de aumentar la expresión tanto de xilosa isomerasa (XI) como de ribulosa-5-fosfato isomerasa (RPI) en la cepa ZW801-4 que expresa elevada actividad xilosa isomerasa.

La cepa ZW801-4 de Z. mobilis anteriormente descrita fue transformada secuencialmente con los vectores lanzadera pZB-GI-RPI, descrito en el Ejemplo 1, y pZB188/aadA-641GapXylA, descrito en el Ejemplo 5. Se aisló primero la cepa que contenía el vector de RPI-A, que contenía un marcador de espectinomicina, por transformación y selección en placas MRM3G5-spec. Las células transformadas fueron aisladas como colonias individuales y fueron luego vueltas a transformar con el vector de xylA que contenía un marcador de resistencia a kanamicina. Se mostró que las cepas aisladas de placas MRM3G5-KAN eran tolerantes tanto a espectinomicina como a kanamicina, y a ellas se hace referencia como cepas xylA/GI-rpiZ.

Se cultivaron durante la noche colonias individuales que contenían los dos plásmidos (xylA/GI-rpiZ1.1 y xylA/GIrpiZ1.2) en medio MRM3G10 tanto con espectinomicina (250 µg/ml) como con kanamicina (400 µg/ml). Se cultivaron las cepas testigo (ZW801-1 y ZW801-2) en medio MRM3G10 sin ninguna selección por antibiótico. Se transfirieron luego las células a medio MRM3X10 y se incubaron durante 20 horas adicionales a 30 °C. Se realizó una transferencia final a medio MRM3X10 fresco, con una OD600 inicial de 0,1, para minimizar la transferencia de glucosa desde el cultivo original al medio de ensayo. Se incubaron la cepa testigo ZW801, por duplicado, y las cepas xylA/GI-rpiZ a 30 °C y se determinaron el crecimiento celular y el consumo de azúcar mediante un análisis por HPLC.

Los resultados se muestran en la Figura 6 (A-D). En la Figura 6A se muestra el crecimiento de las células a lo largo del experimento. Las cepas con expresión aumentada de XI y RPI crecieron a una velocidad aumentada y hasta una mayor masa celular final con respecto a los testigos. Los resultados están en contraste con los del Ejemplo 4, donde una cepa que sólo tenía una expresión aumentada de XI crecía a velocidad reducida en un medio que contenía xilosa. En las Figuras 6B y 6C también se muestra una eficacia de fermentación mejorada con un aumento de la velocidad de utilización de xilosa y de la cantidad de xilosa final consumida por las cepas que llevan vectores lanzadera tanto de xylA como de RPI-A, con un uso aumentado de xilosa que se refleja en un aumento del título final de etanol. En la Figura 6D se muestra que también se halló que los niveles de ribulosa eran menores en comparación con los testigos.

De esta manera, la combinación de XI y RPI aumentadas corregía el efecto perjudicial de sólo una XI aumentada (Ejemplo 5) y aumentaba más la utilización de xilosa y la producción de etanol en la cepa ZW801-4 con alta expresión de XI.

Ejemplo 7

Niveles aumentados de proteína ribulosa-5-fosfato isomerasa en cepas recombinantes de Z. mobilis

Los datos de los ejemplos anteriores demostraron que una expresión aumentada de proteína RPI-A en bacterias Z. mobilis recombinantes daba lugar a una eficacia de fermentación aumentada. Este ejemplo demuestra un método alternativo para aumentar RPI en células transformadas.

El codón de iniciación de la traducción para la región de codificación de RPI-A de Z. mobilis (ID. SEC. nº 3895) fue cambiado del codón GTG de origen natural al codón ATG más común. Además, el promotor GAP nativo de Z. mobilis fue ligado a la secuencia de codificación para RPI-A mientras se conservaba la distancia entre la secuencia Shine-Dalgarno y el codón de iniciación para este promotor. Se aisló el promotor GAP (ID. SEC. nº 17) de DNA genómico de Z. mobilis ZW1 por PCR usando el Cebador-5 (ID. SEC. nº 5), que tiene sitios para enzimas de restricción NcoI y SacI incorporados al extremo 3', y el Cebador-9 (ID. SEC. nº 9), que contiene un solapamiento de 15 pares de bases con el inicio de la región de codificación de RPI-A. El solapamiento de 15 pares de bases en el Cebador-9 también altera el codón de inicio GTG nativo por un ATG.

Se aisló la región de codificación de RPI-A en una PCR separada utilizando DNA genómico de Z. mobilis ZW1 como molde con el Cebador-10 (ID. SEC. nº 10), también con el cambio del codón de inicio por ATG y un solapamiento de 15 pares de bases con el promotor GAP. Se emparejó el Cebador-11 (ID. SEC. nº 11) con el Cebador-10 en una reacción que condujo al aislamiento de la secuencia de codificación completa para RPI-A. El Cebador-11 también contiene un sitio de reconocimiento para la enzima de restricción XhoI, para clonación en el vector lanzadera pZB188.

Después de las dos reacciones separadas, se desarrolló una tercera PCR con los dos productos de fragmentos de DNA aislados utilizando el Cebador-5 y el Cebador-11. De esta reacción se aisló un fragmento de DNA que contenía un promotor GAP ligado a la región de codificación de RPI-A con un codón de inicio ATG, y luego se digirió el fragmento con las enzimas NcoI y XhoI. El fragmento se ligó al vector lanzadera pZB188/aadA, que se empleó para determinar el efecto de un codón de inicio alterado sobre los niveles proteicos en estado estacionario de las células transformadas.

Como un testigo se aisló la misma región de codificación de RPI-A con su codón de inicio GTG nativo mediante el mismo método salvo por que el Cebador-12 (ID. SEC. nº 12) y el Cebador-13 (ID. SEC. nº 13) sustituyeron a los Cebadores 9 y 10. Después del primer ciclo de PCR, se aislaron los dos fragmentos de DNA, uno que contenía el promotor GAP con un solapamiento de 15 pares de bases con la región de codificación de RPI-A nativa y el otro que contenía la región de codificación de RPI-A con el codón de inicio nativo, y se utilizaron en una tercera PCR. Esta reacción incluía el Cebador-5 y el Cebador-11 y produjo un fragmento de DNA que contenía el promotor GAP ligado a la región de codificación de RPI-A con un codón de inicio GTG nativo. Este fragmento fue digerido con las enzimas de restricción NcoI y XhoI y fue ligado al vector lanzadera pZB188/aadA. El vector de expresión de RPI-A nativopromotor GAP fue utilizado como un testigo para comparar con los niveles proteicos producidos por las células que contenían el mismo promotor ligado a la versión alterada ATG de la región de codificación de RPI-A.

Se transformaron células competentes SCS110 de E. coli con los vectores lanzadera que contenían los genes nativo y alterado en ATG. Se emplearon los plásmidos aislados de E. coli para transformar células ZW801-4 competentes y se seleccionaron colonias individuales mediante siembra en placas MRM3G5-spec. Las colonias individuales aisladas, denominadas ZW801 GAP-rpi-1, ZW801 GAP-rpi-3 y ZW801 GAP-rpi-4, fueron cultivadas durante la noche en medios MRM3G5 con espectinomicina (250 µg/ml) y fueron recolectadas para la preparación de extractos proteicos. Se prepararon extractos transfiriendo células a medio MRM3G10 fresco y cultivando hasta una OD600 de 0,6 a 0,8. La concentración de proteína total en los extractos se controló por dilución de las células en una relación de OD600 1 a 44,38 µl de tampón de muestras. El tampón de muestras consistía en 650 µl de agua, 250 µl de tampón de carga Nupage 4X y 100 µl de tampón reductor Nupage 10X. Las células suspendidas en tampón de muestras fueron calentadas a 80 °C durante 10 minutos. Se recogieron los sobrenadantes después de una centrifugación a 13.000 rpm durante 10 minutos. Se cargaron quince microlitros de extracto proteico de los sobrenadantes y patrones no teñidos Mark12 (Invitrogen, Carlsbad, California) en un gel de acrilamida Nupage Bis-Tris al 4-12% (Invitrogen, Carlsbad, California) que fue desarrollado utilizando el tampón de desarrollo Nupage MES SDS 1X.

En la Figura 7 se muestra el gel de SDS teñido con SimplyBlue SafeStain (Invitrogen, Carlsbad, California). En esta figura se puede ver que el nivel de proteína RPI-A de un extracto de proteína total era mayor en las cepas que contenían la región de codificación de RPI-A con el codón de inicio alterado (ZW801 GAP-rpi-1, ZW801 GAP-rpi-3 y ZW801 GAP-rpi-4 en los carriles 2, 3 y 4, respectivamente) que en los carriles testigo que contenían la región de codificación de RPI-A nativa (carriles 5 y 6). Los resultados son una clara demostración de que el nivel de proteína RPI-A de Z. mobilis aumentó en las líneas transformadas al cambiar el codón de inicio del GTG nativo a ATG.

Ejemplo 8

Análisis estructural de enzimas ribosa-5-fosfato isomerasa

Para el análisis de la estructura de la secuencia de RPI, se extrajeron proteínas RPI funcionalmente caracterizadas como ribosa-5-fosfato isomerasas de las bases de datos Brenda ("BRENDA, AMENDA and FRENDA the enzyme information system: new content and tools in 2009", A. Chang, M. Scheer, A. Grote, I. Schomburg, D. Schomburg, Nucleic Acids Res. 2009, Vol. 37, Database issue, D588-D592) y PubMed (US National Library of Medicine, National Institutes of Health). Estas secuencias semilla incluían 15 secuencias para RPI-A y 5 secuencias para RPI-B. Las secuencias semilla para RPI-A son las de E. coli (ID. SEC. nº 83), Enterobacter cloacae (ID. SEC. nº 84), Vibrio vulnificus (ID. SEC. nº 85), Thermus thermophilus (ID. SEC. nº 86), Chlamydomonas reinhardtii (ID. SEC. nº 87),

Spinacia oleracea (ID. SEC. nº 88), Arabidopsis thaliana (ID. SEC. nº 89), Arabidopsis thaliana (ID. SEC. nº 90), Plasmodium falciparum (ID. SEC. nº 91), Pyrococcus horikoshii (ID. SEC. nº 92), Methanocaldococcus jannaschii (ID. SEC. nº 93), Fibrobacter succinogenes (ID. SEC. nº 94), Homo sapiens (ID. SEC. nº 95), Caenorhabditis elegans (ID. SEC. nº 96) y Saccharomyces cerevisiae (ID. SEC. nº 97). Las secuencias semilla para RPI-B son las de Mycobacterium tuberculosis (ID. SEC. nº 1213), Thermotoga maritima (ID. SEC. nº 1214), Clostridium thermocellum (ID. SEC. nº 1215), Escherichia coli (ID. SEC. nº 1216) y Trypanosoma cruzi (ID. SEC. nº 1217).

Cada secuencia (miembro) de las secuencias semillas se utilizó para buscar en la base de datos Genbank no redundantes (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, Maryland) usando BLAST con el valor E ajustado a 0,001. Se combinaron separadamente los resultados de la búsqueda Blast para RPI-A y RPI-B y se llevó a cabo la redundancia para 100% de ID y 100% de solapamiento de longitudes. Este análisis dio lugar a 1232 secuencias de RPI-A y 1206 secuencias de RPI-B. Estos números fueron reducidos a 1155 secuencias de RPI-A y 1112 secuencias de RPI-B al conservar las secuencias con una longitud en el intervalo de 200-300 aminoácidos para RPI-A y 125-185 aminoácidos para RPI-B.

Se realizó un alineamiento múltiple de secuencias para cada conjunto de secuencias semilla de RPI-A y RPI-B, que fue luego utilizado para crear un perfil de modelo oculto de Markov (HMM) usando el algoritmo hmmsearch del paquete informático HMMER siguiendo la guía de usuario que está disponible en HMMER (Janelia Farm Research Campus, Ashburn, Virginia, EE.UU.). La teoría detrás de los perfiles HMM es descrita por R. Durbin, S. Eddy, A. Krogh y G. Mitchison, "Biological sequence analysis: probabilistic models of proteins and nucleic acids", Cambridge University Press, 1998; Krogh et al., 1994, J. Mol. Biol. 235: 1501-1531). Como se afirma en la guía de usuario, los perfiles HMM son modelos estadísticos de alineamientos múltiples de secuencias. Captan información, específica de la posición, acerca de cuán conservada está cada columna del alineamiento y qué restos de aminoácido tienen más probabilidades de encontrarse en cada posición. De esta manera, los HMM tienen una base probabilística formal. Los perfiles HMM para un gran número de familias de proteínas están públicamente disponibles en la base de datos PFAM (Janelia Farm Research Campus, Ashburn, Virginia, EE.UU.) y el software está públicamente disponible para crear perfiles HMM.

Los perfiles HMM se construyeron del modo siguiente:

Operación 1. Construcción de un alineamiento de secuencias

Se alinearon las secuencias semilla (secuencias con caracterización funcional de alta confianza) usando Clustal W con los parámetros por omisión.

Operación 2. Construcción de un perfil HMM

Se puso en marcha el programa hmmbuild sobre cada conjunto de secuencias alineadas usando los parámetros por omisión. Hmmbuild lee el archivo de alineaciones múltiples de secuencias, construye un nuevo perfil HMM y guarda el perfil HMM en un archivo. Utilizando este programa se generó un perfil a partir del alineamiento múltiple para cada conjunto de secuencias semilla anteriormente descrito. El perfil HMM para RPI-A se proporciona en la Tabla 4, y el perfil HMM para RPI-B se proporciona en la Tabla 5.

La siguiente información basada en la guía de usuario del software HMMER proporciona alguna descripción sobre el modo en que el programa hmmbuild prepara un perfil HMM. Un perfil HMM permite modelar alineamientos con huecos, por ejemplo, incluyendo inserciones y supresiones, lo que permite al software describir un dominio conservado completo (en lugar de sólo un pequeño motivo sin huecos). Las inserciones y las supresiones se modelan usando estados de inserción (I) y estados de supresión (D; del inglés, deletion). Todas las columnas que contienen más de una cierta fracción x de caracteres de hueco serán asignadas como una columna de inserción. Por omisión, x está ajustado a 0,5. Cada estado de coincidencia (M; del inglés, match) tiene un estado I y un estado D asociados con él. HMMER llama un "nodo" a un grupo de tres estados (M/D/I) en la misma posición de consenso en el alineamiento. Estos estados están interconectados con flechas llamadas "probabilidades de transición de estado". Los estados M e I son emisores, mientras que los estados D son silenciosos. Las transiciones se disponen de modo que en cada nodo se utilice el estado M (y un resto es alineado y puntuado) o se utilice el estado D (y no se alinea ningún resto, lo que da lugar a un carácter de supresión-hueco, '-'. Las inserciones se producen entre nodos y los estados I tienen una autotransición, lo que permite que aparezcan uno o más restos insertados entre columnas de consenso.

Las puntuaciones de restos en un estado de coincidencia (es decir, puntuaciones de emisión de estado de coincidencia) o en un estado de inserción (es decir, puntuaciones de emisión de estado de inserción) son proporcionales a log_2 (p_x) / (null_x), donde p_x es la probabilidad de un resto de aminoácido en una posición particular del alineamiento de acuerdo con el perfil HMM y null_x es la probabilidad de acuerdo con el modelo Nulo (del inglés, Null). El modelo Nulo es un sencillo modelo probabilístico de un estado que calcula previamente un conjunto de probabilidades de emisión para cada uno de los 20 aminoácidos procedentes de la distribución de aminoácidos en SWISSPROT, edición 24.

Las puntuaciones de transición de estado también se calculan como log de parámetros de probabilidades y son

proporcionales a log_2 (t_x), donde t_x es la probabilidad de transitar a un estado emisor o no emisor.

Operación 3. Comprobación del perfil HMM

Los perfiles HMM fueron sometidos a búsqueda frente al correspondiente conjunto de compuestos homólogos a RPI-A o RPI-B recuperados por una búsqueda BLAST, como se indicó anteriormente. Se empleó un valor E de 0,1 como valor de corte, con el parámetro Z ajustado a 1000 millones. Mediante las búsquedas de perfiles HMM se identificaron todos los compuestos homólogos a secuencias de RPI-A y RPI-B salvo uno. La secuencia que no presentaba coincidencia fue eliminada. En la Tabla 4 se proporciona el perfil HMM de RPI-A; en la Tabla 5 está el perfil HMM de RPI-B.

Refinación de los conjuntos de secuencias de RPI-A y RPI-B

La ulterior refinación de los conjuntos de secuencias de RPI-A y RPI-B fue la siguiente. Se llevaron a cabo múltiples alineamientos de secuencias para eliminar las secuencias con truncamientos internos, N-terminales o C-terminales. Esto dio lugar a 1145 secuencias para RPI-A y ningún cambio para RPI-B (1112 secuencias).

Se evaluaron las secuencias con respecto a restos de sitio activo que habían sido identificados para RPI-A y RPI-B [Roos et al. (2004), J. Mol. Biol. 335: 799-809; Graile et al. (2005), Biochimie 87: 763-769]. Estos restos de sitio activo son:

Para RPI-A: ácido aspártico y ácido glutámico en las posiciones 107 y 128, respectivamente, de la secuencia de S. cerevisiae (D107 y E128; ID. SEC. nº 97). Las posiciones 107 y 128 de la proteína de S. cerevisiae corresponden a las posiciones 91 y 114, respectivamente, en el perfil HMM.

Para RPI-B: cisteína y treonina en las posiciones 66 y 68, respectivamente, de la secuencia de E. coli (C66 y T68; ID. SEC. nº 1216). Las posiciones 66 y 68 de la proteína de E. coli corresponden a las posiciones 69 y 71, respectivamente, en el perfil HMM.

OR: serina y ácido glutámico en las posiciones 68 y 72, respectivamente, de la secuencia de M. tuberculosis (S68 y E72; ID. SEC. nº 1213). Las posiciones 68 y 72 de la proteína de M. tuberculosis corresponden a las posiciones 71 y 75, respectivamente, en el perfil HMM.

Las proteínas que carecían de los apropiados restos de sitio catalítico fueron eliminadas de los conjuntos de compuestos homólogos a RPI-A o RPI-B. El conjunto final de proteínas RPI-A era de 1130 proteínas.

Se halló que, aunque el perfil HMM de RpiB se generó a partir de un alineamiento de secuencias de RPI-B procedentes de enzimas experimentalmente verificadas, el perfil HMM permite identificar una clase general de azúcar isomerasas conocida como la familia RpiB/LacA/LacB que contiene, además de ribosa-6-fosfato isomerasa, las dos subunidades LacA y LacB de la galactosa-6-fosfato isomerasa. Las dos subunidades son fácilmente identificables: están contiguamente situadas en el genoma, una subunidad carece de los dos restos catalíticos, y la otra lleva restos de sitio activo complementarios así como los dos restos catalíticos.

La subunidad LacA fue eliminada del conjunto RPI-B de proteínas por su carencia de los restos catalíticos. Las proteínas LacB se distinguen de las proteínas RPI-B basándose en que tienen leucina en lugar de asparagina en la posición 100 de las proteínas de E. coli y M. tuberculosis (ID. SEC. números 1216 y 1213). Las proteínas RPI-B pueden tener también glicocola, ácido aspártico, serina o ácido glutámico en la posición que corresponde a 100, que corresponde a la posición 104 en el perfil HMM. Las proteínas que tienen leucina en esta posición fueron eliminadas del conjunto de proteínas RPI-B, quedando 895 secuencias.

A lo largo de este análisis estructural, las proteínas que coinciden con la función de RPI-A han sido identificadas como ID. SEC. números 83 a 1212. Las secuencias de codificación para las proteínas RPI-A son las ID. SEC. números 2108 a 3237.

A lo largo de este análisis estructural, las proteínas que coinciden con la función de RPI-B han sido identificadas como ID. SEC. números 1213 a 2107. Las secuencias de codificación para las proteínas RPI-B son las ID. SEC. números 3238 a 4132.

Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una célula huésped bacteriana recombinante que comprende:

   a) una ruta metabólica de la xilosa que comprende al menos un gen que codifica un polipéptido que presenta actividad xilosa isomerasa;

   b) al menos un gen que codifica un polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa; y

   c) al menos una modificación genética que aumenta la expresión de la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa en la célula huésped en comparación con la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa en la célula huésped que carece de dicha modificación genética;

   en donde la célula huésped bacteriana utiliza xilosa para producir etanol, y en donde la célula huésped bacteriana es seleccionada del grupo que consiste en Zymomonas y Zymobacter, y en donde la al menos una modificación genética de la operación (c) comprende aumentar el número de copias génicas de un gen que codifica un polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa y/o hacer que se exprese dicho gen que codifica ribosa-5-fosfato isomerasa a partir de un promotor de alta expresión.
2. 2. La célula huésped recombinante de la Reivindicación 1, en donde la al menos una modificación genética de la operación (c) es

   (i)

   sobreexpresión de un gen endógeno que codifica un polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa, y/o

   (ii)

   expresión de al menos un gen no endógeno que codifica un polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa.

3. 3.

   El microorganismo recombinante de la Reivindicación 1 o 2, en donde el polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa tiene la clasificación de la EC: EC 5.3.1.6.

4. 4.

   La célula huésped recombinante de la Reivindicación 3, en donde el polipéptido que presenta actividad ribosa-5-fosfato isomerasa es seleccionado del grupo que consiste en ribosa-5-fosfato isomerasa A y ribosa-5fosfato isomerasa B.

5. 5.

   La célula huésped recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en donde el polipéptido ribosa-5-fosfato isomerasa A:

   i) proporciona una puntuación del valor E de 0,1 o menos cuando se hace la búsqueda empleando un perfil de modelo oculto de Markov preparado usando las ID. SEC. números 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 y 97; llevándose a cabo la búsqueda utilizando el algoritmo hmmsearch en el que se ajusta el parámetro Z a 1000 millones, y

   ii) tiene ácido aspártico y ácido glutámico en las posiciones que corresponden a 107 y 129, respectivamente, en la proteína RPI-A de Saccharomyces cerevisiae de ID. SEC. nº 97.

6. 6.

   La célula huésped recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en donde la ribosa-5-fosfato isomerasa A tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las ID. SEC. números 83 a 1212 basándose en el método Clustal W de alineamiento al usar los parámetros por omisión de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10,PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO = 0,1, y serie Gonnet 250 de matriz ponderada para proteínas, en donde la ribosa-5-fosfato isomerasa A tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las ID. SEC. números 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96 y 97 basándose en el método Clustal W de alineamiento al usar los parámetros por omisión de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO = 0,1, y serie Gonnet 250 de matriz ponderada para proteínas.

7. 7.

   La célula huésped recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en donde el polipéptido ribosa-5-fosfato isomerasa B:

   i) proporciona una puntuación del valor E de 0,1 o menos cuando se hace la búsqueda empleando un perfil de modelo oculto de Markov preparado usando las ID. SEC. números 1213, 1214, 1215, 1216 y 1217; llevándose a cabo la búsqueda utilizando el algoritmo hmmsearch en el que se ajusta el parámetro Z a 1000 millones;

   ii) o bien tiene cisteína y treonina en las posiciones que corresponden a 66 y 68, respectivamente, en la proteína RPI-B de E. coli de ID. SEC. nº 1216, o bien tiene serina y ácido glutámico en las posiciones que corresponden a 68 y 72, respectivamente, en la proteína RPI-B de M. tuberculosis de ID. SEC. nº 1213; y

   iii) tiene asparagina, glicocola, ácido aspártico, serina o ácido glutámico, pero no leucina, en la posición que corresponde a 100 en la proteína RPI-B de E. coli de ID. SEC. nº 1216.

8. 8.

   La célula huésped recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, en donde la ribosa-5-fosfato isomerasa B tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las ID. SEC. números 1213 a 2107 basándose en el método Clustal W de alineamiento al usar los parámetros por omisión de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO = 0,1, y serie Gonnet 250 de matriz ponderada para proteínas, en donde la ribosa-5-fosfato isomerasa B tiene preferiblemente una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las ID. SEC. números 1213, 1214, 1215, 1216 y 1217 basándose en el método Clustal W de alineamiento al usar los parámetros por omisión de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10, PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO = 0,1, y serie Gonnet 250 de matriz ponderada para proteínas.

9. 9.

   La célula huésped recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho microorganismo comprende además al menos una modificación genética que aumenta la actividad xilosa isomerasa en comparación con la actividad xilosa isomerasa en el microorganismo que carece de dicha modificación genética.

10. 10.

    La célula huésped recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en donde el gen que codifica un polipéptido que presenta actividad xilosa isomerasa está sobreexpresado.

11. 11.

    El microorganismo recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 8, en donde el gen que codifica un polipéptido que presenta actividad xilosa isomerasa se expresa en múltiples copias.

12. 12.

    La célula huésped recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 11, en donde el polipéptido que presenta actividad xilosa isomerasa es seleccionado de entre:

    (i)

    una proteína que tiene una puntuación del valor E inferior o igual a 3x10-10 cuando se hace la búsqueda empleando un perfil HMM preparado usando las ID. SEC. números 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 y 81 y que tiene cuatro restos de sitio catalítico: histidina 54, ácido aspártico 57, ácido glutámico 181 y lisina 183, con los números de posición en relación con la secuencia de xilosa isomerasa de Streptomyces albus de ID. SEC. nº 61; y

    (ii)

    un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad de al menos 90% con respecto a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las ID. SEC. números 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45, 47, 49, 51, 53, 55, 57, 59, 61, 63, 65, 67, 69, 71, 73, 75, 77, 79 y 81 basándose en el método Clustal W de alineamiento al usar los parámetros por omisión de PENALIZACIÓN POR HUECO = 10,PENALIZACIÓN POR LONGITUD DE HUECO = 0,1, y serie Gonnet 250 de matriz ponderada para proteínas.

13. 13. Un proceso para producir etanol, que comprende:

    a) proporcionar una célula huésped bacteriana recombinante de cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 12; y

    b) cultivar la célula huésped bacteriana de (a) en un medio que comprende xilosa, mediante lo cual se convierte la xilosa en etanol.

14. 14.

    El proceso de la Reivindicación 13, en donde la actividad ribosa-5-fosfato isomerasa es la actividad de un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en ribosa-5-fosfato isomerasa A y ribosa-5-fosfato isomerasa B.

15. 15.

    El proceso de la Reivindicación 14, en donde el medio comprende o bien una mezcla de azúcares que incluye xilosa o bien xilosa como único azúcar.