ES2537806T3 - Método para la secreción y producción de alto nivel de proteína - Google Patents
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Abstract
Célula huésped transformada (i) en la que se han introducido uno o una combinación de dos o más de los genes de chaperonas (a) a (c) a continuación: (a) un gen que comprende ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1; (b) un gen que se hibrida en condiciones rigurosas con un ADN que consiste en una secuencia de nucleótidos complementaria al ADN que consiste en la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 y que codifica para una proteína que tiene una actividad de aumento de la secreción de proteínas foráneas, en la que las condiciones rigurosas comprenden una concentración de sodio de 15 a 750 mM, una temperatura de 25ºC a 70ºC, una concentración de formamida del 0% al 50%, lavándose el filtro a una concentración de sal de sodio de 15 a 600 mM y a una temperatura de 50ºC a 70ºC tras la hibridación; y (c) un gen que consiste en una secuencia de nucleótidos que tiene una homología de al menos el 90% con la secuencia de nucleótidos mostrada en SEQ ID NO: 1 y que codifica para una proteína que tiene una actividad de aumento de la secreción de proteínas foráneas, en la que la homología se determina usando un programa FASTA o BLAST, o (ii) en la que se han introducido uno o una combinación de dos o más de los genes que codifican para las proteínas chaperonas (d) a (f) a continuación: (d) una proteína que consiste en la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2; (e) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos que tiene una homología de al menos el 90% con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 y que tiene una actividad de aumento de la secreción de proteínas foráneas, en la que la homología se determina usando un programa FASTA o BLAST; y (f) una proteína que consiste en una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID NO: 2 mediante deleción, sustitución y/o adición de uno a 10 aminoácidos y que tiene una actividad de aumento de la secreción de proteínas foráneas.
Description
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15
25
35
45
55
65
E08845087
26-05-2015
la adición de una cadena de O-azúcar peculiar para una levadura o un moho.
(2) Se usan células en las que se inhibe la actividad PMT que experimenta la adición de una cadena de O-azúcar peculiar para una levadura o un moho.
La actividad proteína O-manosiltransferasa (PMT) de (1) anteriormente puede inhibirse con la adición de un inhibidor de la actividad PMT (es decir, un inhibidor de PMT) al medio, por ejemplo. Un ejemplo de un inhibidor de la actividad PMT que puede usarse es el derivado de ácido rodanin-3-acético (Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 14, págs. 3975-3978, 2004). Los ejemplos específicos del derivado de ácido rodanin-3-acético incluyen ácido 5-[[3,4-(1fenilmetoxi)fenil]metilen]-4-oxo-2-tioxo-3-tiazolidinacético (compuesto (1c) descrito en Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 14, pág. 3975, 2004) y ácido {(5Z)-4-oxo-5-[3-(1-feniletoxi)-4-(2-feniletoxi)benciliden]-2-tioxo1,3-tiazolidin-3-il}acético (compuesto (5a) descrito en Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, Vol. 14, pág. 3975, 2004). PMT es importante para la generación de manoproteínas que constituyen la pared celular de levadura. Una actividad PMT excesivamente reducida afectará de manera adversa al crecimiento de levadura. Por consiguiente, cuando se usan sistemas de expresión inducible, la adición de un inhibidor de la actividad PMT en el momento de la expresión de genes de proteínas foráneas, tras el crecimiento celular, sería más eficaz. Por tanto, pueden producirse al máximo nivel proteínas diana de alta calidad en las que se inhibe la modificación de cadena de O-azúcar.
La actividad proteína O-manosiltransferasa (PMT) descrita en (2) anteriormente puede inhibirse perturbando el gen PMT o inhibiendo la expresión de tal gen. En S. cerevisiae, PMT está codificada por al menos 6 genes; es decir, el gen PMT1 (GenBank: L19169), el gen PMT2 (GenBank: L05146), el gen PMT3 (GenBank: X83797), el gen PMT4 (GenBank: X83798), el gen PMT5 ((GenBank: X95644) y el gen PMT46 ((GenBank: Z72984), y estos genes forman independientemente un homodímero (PMT4p) o un heterodímero (PMT1p/PMT2p) y presentan actividad. La deficiencia del gen PMT puede ser deficiencia simple o doble. Tal como se describió anteriormente, PMT es un gen importante para el crecimiento de levadura. Cuando la actividad, tal como deficiencia de gen PMT, se elimina o se reduce extremadamente, la pared celular se vuelve frágil. Por tanto, el uso de una cepa deficiente en el gen PMT requiere atención. Una cepa en la que el gen PMT se ha destruido es preferiblemente una cepa en la que se ha destruido el gen o bien PMT5 o bien PMT6 o una cepa en la que se han destruido tanto el gen PMT5 como el gen PMT6.
Los ejemplos de métodos para suprimir el gen PMT incluyen un método que implica el uso de ARN antisentido o ARNi y un método que implica la atenuación de un promotor.
Mejores modos para llevar a cabo la invención
A continuación en el presente documento, la presente invención y descripción se describe en detalle con referencia a los ejemplos, aunque el alcance técnico de la presente invención no está limitado a los ejemplos. Los plásmidos, las enzimas de restricción, las enzimas modificadoras de ADN, y similares que se usan en los ejemplos de la presente invención son productos disponibles comercialmente, y estos productos pueden usarse según técnicas convencionales. Además, los procedimientos de clonación de ADN, secuenciación de nucleótidos, transformación de células huésped, cultivo de células huésped transformadas, toma de muestras y purificación de enzimas a partir de productos de cultivo, y similares se conocen ampliamente en la técnica o pueden aprenderse a través de publicaciones existentes.
[Ejemplo 1] Construcción de un vector para la introducción de un gen de anticuerpo
(1) Construcción de un vector para la introducción de un gen de anticuerpo que porta un gen resistente a Zeocin como marcador de selección y que comprende el casete de promotor y terminador de gen GAP
Con el fin de preparar un marcador de gen resistente a Zeocin, se sometió un fragmento de ADN sintetizado mostrado en SEQ ID NO: 15 a digestión doble con las enzimas de restricción HindIII y KpnI para obtener un fragmento de ADN que contenía un gen resistente a Zeocin.
Se escindió pOMexGP1U dado a conocer en el documento WO 2003/091431 con SpeI, se le proporcionaron extremos romos, y entonces se ligó. Se sometieron el sitio SalI y el sitio EcoT22I del plásmido resultante a cambio de ligador con el sitio SpeI y el sitio BamHI, respectivamente. Se obtuvo así el plásmido pOMexGP1USp. Se sometió el pOMexGP1USp resultante a digestión doble con las enzimas de restricción HindIII y KpnI para aislar un fragmento que contenía el promotor del gen GAP y el terminador, y se introdujo en el mismo un fragmento de ADN que contenía el marcador del gen resistente a Zeocin para obtener el plásmido pOMexGP1Z.
Tras añadir las secuencias de nucleótidos de los sitios de enzima de restricción (el sitio XbaI en el lado 5’ y el sitio BamHI en el lado 3’) a ambos extremos del gen de cadena pesada del gen de anticuerpo anti-receptor de TRAIL (documento WO 2001/083560, sintetizado por Takara Bio teniendo en cuenta la frecuencia del uso de codones de
O. minuta), se digirió el fragmento resultante con XbaI y BamHI para obtener un fragmento del gen de cadena pesada de anticuerpo.
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