ES2537342T3 - Nuevos genes implicados en biosíntesis - Google Patents

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Kerry Ruth Hancock
Margaret Greig
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Abstract

Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica al menos uno de: a) un polipéptido MYB14 que comprende una secuencia con al menos 70% de identidad con SEC ID NO: 14, en el que el % de identidad se calcula a lo largo de toda la longitud de SEC ID NO: 14; y b) un fragmento funcional de SEC ID NO: 14; en la que el polipéptido MYB14 en a) y el fragmento funcional en b) son capaces de incrementar la producción de taninos condensados en plantas.

Description

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También se describe el uso de una molécula de ácido nucleico o polipéptido para identificar otros genes/polipéptidos
reguladores de flavonoides y/o de taninos condensados relacionados. En una realización, se puede manipular el conjunto del tejido vegetal. En una realización alternativa, se puede manipular el tejido epidérmico de la planta. Para los fines de esta memoria descriptiva, el tejido epidérmico se refiere al grupo de monocapa exterior de células, la hoja, los tallos, y raíces y tejidos jóvenes de una planta vascular.
Más preferiblemente, los niveles de taninos condensados alterados por la presente invención son suficientes para proporcionar un beneficio terapéutico o agronómico a un sujeto que consuma la planta con niveles alterados de flavonoides y/o taninos condensados.
Plantas producidas vía los métodos En una realización adicional, la invención proporciona una planta producida mediante un método de la invención. En una realización adicional, la invención proporciona una parte, semilla, fruta, material cosechado, propágulo o
progenie de una planta de la invención. En una realización adicional, la parte, semilla, fruta, material cosechado, propágulo o progenie de la planta se
modifica genéticamente para comprender al menos una molécula de ácido nucleico de la invención, o un constructo de la invención. Fuente de ácidos nucleicos y proteínas de la invención Los ácidos nucleicos y proteínas de la invención pueden derivar de cualquier planta, como se describe más abajo, o
se pueden producir sintética o recombinantemente. Plantas Las células vegetales y plantas de la invención, o aquellas transformadas o manipuladas en métodos y usos de la
invención, pueden proceder de cualquier especie. En una realización, la célula vegetal o planta deriva de especies de planta gimnosperma. En una realización adicional, la célula vegetal o planta deriva de una especie de planta angiosperma. En una realización adicional, la célula vegetal o planta deriva de una especie de planta dicotiledónea. En una realización adicional, la célula vegetal o planta deriva de una especie de planta monocotiledónea. Preferiblemente, las plantas proceden de especies dicotiledóneas. Otras plantas preferidas son especies de plantas forrajeras de un grupo que comprende pero no se limita a los
siguientes géneros: Lolium, Festuca, Dactylis, Bromus, Thinopyrum, Trifolium, Medicago, Pheleum, Phalaris, Holcus,
Lotus, Plantago y Cichorium. Otras plantas preferidas son plantas leguminosas. La planta leguminosa o parte de la misma puede englobar cualquier planta en la familia de plantas Leguminosae o Fabaceae. Por ejemplo, las plantas se pueden seleccionar de legumbres forrajeras que incluyen alfalfa, trébol; leucaena; legumbres de grano que incluyen habas, lentejas, altramuces, guisantes, cacahuetes, haba de soja; legumbres de pruina que incluyen altramuz, legumbres farmacéuticas o industriales; y especies de legumbres de barbecho o de abono natural.
Un género particularmente preferido es Trifolium.
Las especies de Trifolium preferidas incluyen Trifolium repens; Trifolium arvense; Trifolium affine; y Trifolium occidenfale. Una especie de Trifolium particularmente preferida es Trifolium repens. Otro género preferido es Medicago. Especies de Medicago preferidas incluyen Medicago sativa y Medicago truncatula. Una especie de Medicago particularmente preferida es Medicago sativa, conocida habitualmente como alfalfa. Otro género preferido es Glycine. Las especies de Glycine preferidas incluyen Glycine max y Glycine wightii (también conocida como Neonotonia
wightii). Una especie de Glycine particularmente preferida es Glycine max, conocida habitualmente como haba de soja.
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Una especie de Glycine particularmente preferida es Glycine wightii, conocida habitualmente como haba de soja perenne. Otro género preferido es Vigna. La especie de Vigna preferida incluye Vigna unguiculata. Una especie de Vigna particularmente preferida es Vigna unguiculata, habitualmente conocida como frijol de carita. Otro género preferido es Mucana.
La especie de Mucana preferida incluye Mucana pruniens. Una especie de Mucana particularmente preferida es Mucana pruniens, habitualmente conocida como grano de terciopelo.
Otro género preferido es Arachis. Una especie de Arachis preferida incluye Arachis glabrata. Una especie de Arachis particularmente preferida es Arachis glabrata, habitualmente conocida como cacahuete
perenne. Otro género preferido es Pisum. Una especie de Pisum preferida incluye Pisum sativum. Una especie de Pisum particularmente preferida es Pisum sativum, habitualmente conocido como guisante. Otro género preferido es Lotus. Especies de Lotus preferidas incluyen Lotus corniculatus, Lotus pedunculatus, Lotus glabar, Lotus tenuis y Lotus
uliginosus.
Una especie de Lotus particularmente preferida es Lotus corniculatus, habitualmente conocido como loto corniculado. Una especie de Lotus particularmente preferida es Lotus glabar, habitualmente conocido como loto corniculado de
hoja estrecha. Una especie de Lotus particularmente preferida es Lotus pedunculatus, habitualmente conocido como lotera. Una especie de Lotus particularmente preferida es Lotus tenuis, habitualmente conocido como trébol esbelto. Otro género preferido es Brassica. Una especie de Brassica preferida incluye Brassica oleracea. Una especie de Brassica particularmente preferida es Brassica oleracea, habitualmente conocida como berza o
repollo forrajero. El término “planta”, como se usa aquí, se refiere a la planta en su totalidad, y cualquier parte de la misma, puede incluir pero no se limita a: porciones seleccionadas de la planta durante el ciclo de vida de la planta, tales como
semillas vegetales, brotes, hojas, corteza, vainas, raíces, flores, fruto, tallos, y similares. Una “parte de la misma” preferida son las hojas. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En esta memoria descriptiva en la que se ha hecho referencia a memorias descriptivas de patentes, otros
documentos externos u otras fuentes de información, esto es generalmente con el fin de proporcionar un contexto para discutir las características de la invención. Excepto que se señale específicamente de otro modo, la referencia a tales documentos externos no se ha de interpretar como una admisión de que tales documentos, o tales fuentes de información, en cualquier jurisdicción, son técnica anterior, o forman parte del conocimiento general común en la técnica.
El término “que comprende”, como se usa en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones, significa “que consiste al menos en parte en”; es decir, cuando se interpretan afirmaciones en esta memoria descriptiva y en las reivindicaciones que incluyen “que comprende”, las características prologadas por este término en cada afirmación necesitan estar todas ellas presentes, pero también pueden estar presentes otras características. Términos relacionados, tales como “comprender” y “comprendido”, se han de interpretar de manera similar. Sin embargo, en
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realizaciones preferidas, “que comprende” se puede sustituir por “que consiste”.
La expresión “polipéptido MYB14” se refiere a un factor de transcripción MYB de clase R2R3.
Preferiblemente, el polipéptido MYB14 comprende una secuencia con al menos 70% de identidad con SEC ID NO:
14.
El polipéptido MYB14 puede comprender el motivo de secuencia de SEC ID NO: 15.
El polipéptido MYB14 puede comprender el motivo de secuencia de SEC ID NO: 17.
El polipéptido MYB14 puede comprender la secuencia de SEC ID NO: 15 y SEC ID NO: 17, pero carece de la secuencia de SEC ID NO: 16.
Un “gen MYB14” es un gen, por la definición estándar de gen, que codifica un polipéptido MYB14.
La expresión “factor de transcripción MYB” es un término bien entendido por los expertos en la técnica para referirse a una clase de factores de transcripción caracterizada por un dominio de unión a ADN estructuralmente conservado que consiste en repeticiones imperfectas individuales o múltiples.
La expresión “factor de transcripción R2R3” o “transcripción MYB con un dominio de unión a ADN R2R3” es una expresión bien entendida por los expertos en la técnica para referirse a factores de transcripción MYB de la clase de dos repeticiones.
Los términos “proantocianidinas” y “taninos condensados” se pueden usar de forma intercambiable a lo largo de la memoria descriptiva.
La expresión “motivo de secuencia”, como se usa aquí, significa un tramo de aminoácidos o nucleótidos. Preferiblemente, el tramo de aminoácidos o nucleótidos es contiguo.
El término “alterada”, con respecto a una planta con “producción alterada” o “expresión alterada”, significa alterada con respecto a la misma planta, o planta del mismo tipo, en el estado no transformado.
El término “alterada” puede significar incrementada o disminuida. Preferiblemente, alterada es incrementada.
Polinucleótidos y fragmentos
El término “polinucleótido o polinucleótidos”, como se usa aquí, significa un polímero desoxirribonucleotídico o ribonucleotídico monocatenario o bicatenario de cualquier longitud pero preferiblemente al menos 15 nucleótidos, e incluye, como ejemplos no limitantes, secuencias codificantes y no codificantes de un gen, complementos de secuencias sentido y antisentido, exones, intrones, ADN genómico, ADNc, pre-ARNm, ARNm, ARNr, ARNis, miARN, ARNt, ribozimas, polipéptidos recombinantes, secuencias de ADN o ARN de origen natural aisladas y purificadas, secuencias de ARN y ADN sintéticas, sondas, cebadores y fragmentos de ácidos nucleicos.
El término “polinucleótido” se puede usar de forma intercambiable con “molécula de ácido nucleico”.
Un “fragmento” de una secuencia polinucleotídica proporcionada aquí es una subsecuencia de nucleótidos contiguos que tiene una longitud preferiblemente de al menos 15 nucleótidos. Los fragmentos de la invención comprenden preferiblemente al menos 20 nucleótidos, más preferiblemente al menos 30 nucleótidos, más preferiblemente al menos 40 nucleótidos, más preferiblemente al menos 50 nucleótidos, y lo más preferible al menos 60 nucleótidos contiguos de un polinucleótido de la invención. Un fragmento de una secuencia polinucleotídica se puede usar en tecnología antisentido, de silenciamiento génico, de triple hélice o de ribozima, o como un cebador, una sonda, incluido en una micromatriz, o usado en métodos de selección a base de polinucleótidos.
Preferiblemente, los fragmentos de secuencias polinucleotídicas de la invención comprenden al menos 25, más preferiblemente al menos 50, más preferiblemente al menos 75, más preferiblemente al menos 100, más preferiblemente al menos 150, más preferiblemente al menos 200, más preferiblemente al menos 300, más preferiblemente al menos 400, más preferiblemente al menos 500, más preferiblemente al menos 600, más preferiblemente al menos 700, más preferiblemente al menos 800, más preferiblemente al menos 900, más preferiblemente al menos 1000 nucleótidos contiguos del polinucleótido especificado.
El término “cebador” se refiere a un polinucleótido corto, que tiene habitualmente un grupo libre 3’OH, que se hibrida a un molde y se usa para cebar la polimerización de un polinucleótido complementario al molde. Tal cebador tiene preferiblemente al menos 5, más preferiblemente al menos 6, más preferiblemente al menos 7, más preferiblemente al menos 9, más preferiblemente al menos 10, más preferiblemente al menos 11, más preferiblemente al menos 12, más preferiblemente al menos 13, más preferiblemente al menos 14, más preferiblemente al menos 15, más preferiblemente al menos 16, más preferiblemente al menos 17, más preferiblemente al menos 18, más preferiblemente al menos 19, más preferiblemente al menos 20 nucleótidos de longitud.
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Como alternativa, los polinucleótidos variantes de la presente invención se hibridan a una secuencia polinucleotídica especificada, o a sus complementos, en condiciones restrictivas.
La expresión “hibridar en condiciones restrictivas”, y sus equivalentes gramaticales, se refiere a la capacidad de una molécula polinucleotídica para hibridarse a una molécula polinucleotídica diana (tal como una molécula polinucleotídica diana inmovilizada en una mancha de ADN o ARN, tal como una transferencia Southern o una transferencia Northern) en condiciones definidas de temperatura y concentración salina. La capacidad para hibridarse en condiciones de hibridación restrictivas se puede determinar hibridando inicialmente en condiciones menos restrictivas e incrementando después la restricción hasta la restricción deseada.
Con respecto a moléculas polinucleotídicas mayores que alrededor de 100 bases de longitud, las condiciones de hibridación restrictivas típicas son no más de 25 a 30ºC (por ejemplo, 10ºC) por debajo de la temperatura de fusión (Tm) del dúplex nativo (véanse generalmente, Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed. Cold Spring Harbor Press; Ausubel et al., 1987, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing). La Tm para moléculas polinucleotídicas mayores que alrededor de 100 bases se puede calcular mediante la fórmula Tm = 81,5 + 0,41% (G + C-log (Na+). (Sambrook et al., Eds, 1987, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2ª Ed. Cold Spring Harbor Press; Bolton y McCarthy, 1962, PNAS 84:1390). Las condiciones restrictivas típicas para polinucleótido de más de 100 bases de longitud serían condiciones de hibridación tales como prelavado en una disolución de 6X SSC, 0,2% de SDS; hibridación a 65ºC, 6X SSC, 0,2% de SDS toda la noche; seguido de dos lavados de 30 minutos cada uno en 1X SSC, 0,1% de SDS a 65ºC y dos lavados de 30 minutos cada uno en 0,2X SSC, 0,1% de SDS a 65ºC.
Con respecto a las moléculas polinucleotídicas que tienen una longitud menor que 100 bases, las condiciones de hibridación restrictivas ejemplares son 5 a 10ºC por debajo de Tm. De media, la Tm de una molécula polinucleotídica de longitud menor que 100 pb se reduce en aproximadamente (500/longitud del oligonucleótido)ºC.
Con respecto a los miméticos de ADN conocidos como ácidos peptidonucleicos (PNAs) (Nielsen et al., Science. 6 de diciembre de 1991; 254(5037):1497-500), los valores de Tm son mayores que aquellos para híbridos de ADN-ADN o de ADN-ARN, y se pueden calcular usando la fórmula descrita en Giesen et al., Nucleic Acids Res. 1 de noviembre de 1998; 26(21):5004-6. Las condiciones de hibridación restrictivas ejemplares para un híbrido de ADN-PNA que tiene una longitud menor que 100 bases son 5 a 10ºC por debajo de la Tm.
Los polinucleótidos variantes tales como aquellos en constructos de la invención que codifican proteínas a expresar también engloban polinucleótidos que difieren de las secuencias especificadas, pero que, como consecuencia de la degeneración del código genético, codifican un polipéptido que tiene actividad similar a un polipéptido codificado por un polinucleótido de la presente invención. Una alteración de secuencia que no cambie la secuencia de aminoácidos del polipéptido es una “variación silenciosa”. Excepto para ATG (metionina) y TGG (triptófano), se pueden cambiar otros codones para el mismo aminoácido mediante técnicas reconocidas en la técnica, por ejemplo para optimizar la expresión de codones en un organismo hospedante particular.
También se contemplan alteraciones de secuencias polinucleotídicas que dan como resultado sustituciones conservativas de uno o varios aminoácidos en la secuencia polipeptídica codificada sin alterar significativamente su actividad biológica. Un experto estará al tanto de métodos para obtener sustituciones de aminoácidos fenotípicamente silenciosas (véase, por ejemplo, Bowie et al., 1990, Science 247, 1306).
Los polinucleótidos variantes debidos a variaciones silenciosas y sustituciones conservativas en la secuencia polipeptídica codificada se puede determinar usando el programa bl2seq públicamente disponible de la colección de programas BLAST (versión 2.2.5 [noviembre 2002]) de NCBI (ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/) vía el algoritmo tblastx como se describe previamente.
Variantes polipeptídicas
El término “variante”, con referencia a polipéptidos, engloba polipéptidos de origen natural, producidos recombinantemente y producidos sintéticamente. Las secuencias polipeptídicas variantes exhiben preferiblemente al menos 50%, más preferiblemente al menos 51%, más preferiblemente al menos 52%, más preferiblemente al menos 53%, más preferiblemente al menos 54%, más preferiblemente al menos 55%, más preferiblemente al menos 56%, más preferiblemente al menos 57%, más preferiblemente al menos 58%, más preferiblemente al menos 59%, más preferiblemente al menos 60%, más preferiblemente al menos 61%, más preferiblemente al menos 62%, más preferiblemente al menos 63%, más preferiblemente al menos 64%, más preferiblemente al menos 65%, más preferiblemente al menos 66%, más preferiblemente al menos 67%, más preferiblemente al menos 68%, más preferiblemente al menos 69%, más preferiblemente al menos 70%, más preferiblemente al menos 71%, más preferiblemente al menos 72%, más preferiblemente al menos 73%, más preferiblemente al menos 74%, más preferiblemente al menos 75%, más preferiblemente al menos 76%, más preferiblemente al menos 77%, más preferiblemente al menos 78%, más preferiblemente al menos 79%, más preferiblemente al menos 80%, más preferiblemente al menos 81%, más preferiblemente al menos 82%, más preferiblemente al menos 83%, más preferiblemente al menos 84%, más preferiblemente al menos 85%, más preferiblemente al menos 86%, más preferiblemente al menos 87%, más preferiblemente al menos 88%, más preferiblemente al menos 89%, más
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et al., 1988, Plant Genetic Transformation and Gene Expression. A Laboratory Manual. Blackwell Sci. Pub. Oxford, p. 365; Potrykus y Spangenburg, 1995, Gene Transfer to Plants. Springer-Verlag, Berlin.; y Gelvin et al., 1993, Plant Molecular Biol. Manual. Kluwer Acad. Pub. Dordrecht. En Galun y Breiman, 1997, Transgenic Plants. Imperial College Press, Londres, se proporciona un repaso de plantas transgénicas, incluyendo técnicas de transformación.
Las siguientes son publicaciones representativas que describen protocolos de transformación genética que se pueden usar para transformar genéticamente las siguientes especies vegetales: arroz (Alam et al., 1999, Plant Cell Rep. 18, 572); manzana (Yao et al., 1995, Plant Cell Reports 14, 407-412); maíz (Patente US Series nos 5.177.010 y 5.981.840); trigo (Ortiz et al., 1996, Plant Cell Rep. 15, 1996, 877); tomate (Patente US Serie no 5.159.135); patata (Kumar et al., 1996 Plant J. 9: 821); casave (Li et al., 1996 Nat. Biotechnology 14, 736); lechuga (Michelmore et al., 1987, Plant Cell Rep. 6, 439); tabaco (Horsch et al., 1985, Science 227, 1229); algodón (Patentes US Series nos
5.846.797 y 5.004.863); ballico (Bajaj et al., 2006, Plant Cell Rep. 25, 651); gramas (Patentes US nos 5.187.073, 6.020.539); menta piperita (Niu et al., 1998, Plant Cell-Rep. 17, 165); cítricos (Pena et al., 1995, Plant Sci.104, 183); alcaravea (Krens et al., 1997, Plant Cell Rep, 17, 39); plátano (Patente US Serie no 5.792.935); haba de soja (Patente US Serie nos 5.416.011; 5.569.834; 5.824.877; 5.563.04455 y 5.968.830); piña (Patente US Serie no 5.952.543); álamo (Patente US no 4.795.855); monocotiledóneas en general (Patente US nos 5.591.616 y 6.037.522); crucífera (Patente US nos 5.188.958; 5.463.174 y 5.750.871); y cereales (Patente US no 6.074.877); pera (Matsuda et al., 2005, Plant Cell Rep. 24(1):45-51); Prunus (Ramesh et al., 2006, Plant Cell Rep. 25(8):821-8; Song y Sink 2005, Plant Cell Rep. 2006; 25(2):117-23; Gonzalez Padilla et al., 2003, Plant Cell Rep. 22(1):38-45); fresa (Oosumi et al., 2006, Planta.; 223(6):1219-30; Folta et al., 2006, Planta. 14 de abril de 2006; PMID: 16614818), rosa (Li et al., 2003, Planta. 218(2):226-32), Rubus (Graham et al., 1995, Methods Mol Biol. 1995; 44:129-33), clavo (Voisey et al., 1994, Plant Cell Reports 13: 309-314, y alfalfa (Bingham, 1991, Crop Science 31: 1098). También se contempla por la invención la transformación de otras especies. Los métodos y protocolos adecuados para la transformación de otras especies están disponibles en la bibliografía científica.
Métodos para la manipulación genética de plantas
Existe un número de estrategias para manipular genéticamente las plantas (por ejemplo Birch, 1997, Ann Rev Plant Phys Plant Mol Biol, 48, 297). Por ejemplo, se pueden diseñar estrategias para incrementar la expresión de un polinucleótido/polipéptido en una célula vegetal, órgano y/o en una etapa de desarrollo particular en la que/cuando se expresa normalmente, o para expresar ectópicamente un polinucleótido/polipéptido en una célula, tejido, órgano y/o en una etapa de desarrollo particular que/cuando no se expresa normalmente. También se pueden diseñar estrategias para incrementar la expresión de un polinucleótido/polipéptido en respuesta a estímulos externos, tales como estímulos medioambientales. Los estímulos medioambientales pueden incluir estreses medioambientales tales como estreses mecánicos (tal como actividad herbívora), deshidratación, salinidad y temperatura. El polinucleótido/polipéptido expresado puede derivar de la especie vegetal a transformar, o puede derivar de una especie vegetal diferente.
Se pueden diseñar estrategias de transformación para reducir la expresión de un polinucleótido/polipéptido en una célula vegetal, tejido, órgano o en una etapa particular del desarrollo que/cuando se expresa normalmente, o para reducir la expresión de un polinucleótido/polipéptido en respuesta a estímulos externos. Tales estrategias son conocidas como estrategias de silenciamiento génico.
Los constructos genéticos para la expresión de genes en plantas transgénicas incluyen típicamente promotores, tales como polinucleótidos promotores de la invención, para conducir la expresión de uno o más de polinucleótido clonado, terminadores y secuencias marcadoras seleccionables para detectar la presencia del constructo genético en la planta transformada.
Los terminadores ejemplares que se usan habitualmente en constructo genético para la transformación vegetal incluyen, por ejemplo, el terminador del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) 35S, los terminadores de nopalina sintasa u octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens, el terminador del gen zin de Zea mays, el terminador de ADP-glucosa pirofosforilasa de Oryza sativa, y el terminador PI-II de Solanum tuberosum.
Los marcadores seleccionables usados habitualmente en la transformación vegetal incluyen el gen de neomicina fosfotransferasa II (NPT II) que confiere resistencia a kanamicina, el gen aadA, que confiere resistencia a espectinomicina y estreptomicina, el gen de fosfinotricin acetil transferasa (gen bar) para resistencia a Ignite (AgrEvo) y Basta (Hoechst), y el gen de higromicina fosfotransferasa (hpt) para resistencia a higromicina.
También se contempla el uso de constructos genéticos que comprenden genes informadores (secuencias codificantes que expresan una actividad que es extraña al hospedante, habitualmente una actividad enzimática y/o una señal visible (por ejemplo, luciferasa, GUS, GFP) que se pueden usar para el análisis de la expresión del promotor en plantas y tejidos vegetales. La bibliografía sobre genes informadores se repasa en Herrera-Estrella et al., 1993, Nature 303, 209, y Schrott, 1995, en: Gene Transfer to Plants (Potrykus, T., Spangenberg. Eds) Springer Verlag. Berlín, p. 325-336.
Las estrategias de silenciamiento génico se pueden centrar sobre el propio gen o sobre elementos reguladores que afectan a la expresión del polipéptido codificado. “Elementos reguladores” se usa aquí en el sentido más amplio
21
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La Figura 31 muestra el análisis de PCR para la presencia de M14ApHZBAR de ADN genómico aislado de plántulas de crucífera putativamente transformadas. Línea 8, control de crucífera; Línea 18 escalera; Línea 17 y 9-17 crucífera transformada. Los cebadores fueron 35S (promotor) y PMYBR (hasta el extremo 3’ del gen) que amplifican un fragmento de 1.244 pb.
5 La Figura 32 muestra los resultados del cribado mediante DMACA de crucífera de tipo salvaje (Brassica oleracea) (A) y hojas transgénicas (B a D), transformadas con el constructo M14ApHZBARP.
La Figura 33 muestra los cromatogramas SRM de los iones de producto 123, 139 y 165 m/z del SRM de 291,3 m/z (catequina (C) y epicatequina (EC)) en dos controles y una crucífera transgénica que expresa MYB14. Los espectros MS2 de la epicatequina detectada en el control verde y la muestra +ve transgénica se
10 proporcionan como prueba de identificación de estos metabolitos. No se detectó epicatequina en la muestra de control rojo.
La Figura 34 muestra un alineamiento de todas las secuencias de la proteína MYB14 de Trifolium identificadas por el solicitante.
La Figura 35 muestra el porcentaje de identidad entre las secuencias alineadas en la Figura 34.
15 BREVE DESCRIPCIÓN DEL LISTADO DE SECUENCIAS
SEC ID NO:
Descripción Secuencia correspondiente
1
Polinucleótido, Trifolium arvense, ADNc TaMYB14-1 de Secuencia de ADNc de Ta MYB14 de gen expresado
2
Polinucleótido, Trifolium arvense, ADNg TaMYB14-1 de Secuencia genómica de Ta MYB14 1 del alelo 1 de Trifolium arvense.
3
Polinucleótido, Trifolium arvense, ADNg TaMYB14-2 de Secuencia genómica de Ta MYB14 2 del alelo 2 de Trifolium arvense.
4
Polinucleótido, Trifolium affine, ADNg TafMYB14-1 de Secuencia genómica de Taf MYB14 1 del alelo 1 de Triforium affine.
5
Polinucleótido, Trifolium affine, ADNc TafMYB14-1 de Secuencia de ADNc de Taf MYB14 del gen expresado
6
Polinucleótido, Trifolium affine, ADNg TafMYB14-2 de Secuencia genómica de Taf MYB14 2 del alelo 2 de Trifolium affine.
7
Polinucleótido, Trifolium occidentale, ADNg ToMYB14-1 de Secuencia genómica de ToMYB14 1 del alelo 1 e Trifolium occidentale.
8
Polinucleótido, Trifolium occidentale, ADNg ToMYB14-2 de Secuencia genómica de ToMYB14 2 del alelo 2 de Trifolium occidentale.
9
Polinucleótido, Trifolium repens, ADNg TrMYB14-1 de Secuencia genómica de TrMYB14 1 del alelo 1 de Trifolium repens.
10
Polinucleótido, Trifolium repens, ADNg TrMYB14-2 de Secuencia genómica de TrMYB14 2 desde el alelo 2 de Trifolium repens.
11
Polinucleótido, Trifolium repens, ADNg TrMYB14-3 de Secuencia genómica de TrMYB14 3 del alelo 3 de Trifolium repens.
12
Polinucleótido, Trifolium repens, ADNg TrMYB14-4 de Secuencia genómica de TrMYB14 4 del alelo 4 de Trifolium repens.
13
Polinucleótido, Trifolium arvense, ADNc TaMYB14-1 de Secuencia de ADNc que representa la secuencia de ADNc de longitud completa de TaMYB14
14
Polipéptido, Trifolium arvense, TaMYB14-1 traducción de aminoácidos de of TaMYB14
15
Polipéptido, artificial, consenso motivo similar al motivo de subgrupo 5 (Stracke et al., 2001) común a activadores de MYB de CT conocidos
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SEC ID NO:
Descripción Secuencia correspondiente
16
Polipéptido, artificial, consenso motivo común a activadores de MYB de antocianinas conocidos (Motivo de subgrupo 6, Stracke et al., 2001)
17
Polipéptido, artificial, consenso nuevo motivo de MYB de TFs de MYB14
18
Polinucleótido, artificial, cebador Búsqueda del dominio de MYB -MYBFX
19
Polinucleótido, artificial, cebador Búsqueda del dominio de MYB – MYBFY
20
Polinucleótido, artificial, cebador Búsqueda del dominio de MYB -MYBFZ
21
Polinucleótido, artificial, cebador Aislamiento de longitud completa -M14ATG
22
Polinucleótido, artificial, cebador Aislamiento de longitud completa -M14TGA
23
Polinucleótido, artificial, cebador Paseo génico -M14TSP1
24
Polinucleótido, artificial, cebador Paseo génico -M14TSP2
25
Polinucleótido, artificial, cebador Paseo génico -M14TSP3
26
Polinucleótido, artificial, cebador Clonación en el vector-M14FATG
27
Polinucleótido, artificial, cebador Lotus corniculatus -MYBLF
28
Polinucleótido, artificial, cebador Lotus corniculatus -MYBLR
29
Polinucleótido, artificial, cebador Extremo 5’ UTR de MYB14 -MYB148N
30
Polinucleótido, artificial, cebador Extremo 3’ UTR de MYB14 -MYB14RR
31
Polinucleótido, artificial, cebador Cebador para intrón 1 -15
32
Polinucleótido, artificial, cebador Cebador para intrón 1 -13
33
Polinucleótido, artificial, cebador Paseo génico -TSP4
34
Polinucleótido, artificial, cebador Paseo génico -TSP5
35
Polinucleótido, artificial, cebador Sitio de partida de 5’ directo -MYB148F
36
Polinucleótido, artificial, cebador Sitio de partida de 5’ inverso -MYB14RR
37
Polinucleótido, artificial, cebador Análisis de expresión/ vector de slienciamiento -MYB14F
38
Polinucleótido, artificial, cebador Análisis de expresión/ vector de slienciamiento -MYB14R
39
Polinucleótido, artificial, cebador Paseo génico -MYB14R2
40
Polinucleótido, artificial, cebador Paseo génico -MYB14R3
41
Polinucleótido, artificial, cebador Secuenciación -M13 Directo
42
Polinucleótido, artificial, cebador Secuenciación -M13 Inverso
43
Polinucleótido, artificial, cebador Producción de ADNc -BD SMART II™ A Oligonucleotide
44
Polinucleótido, artificial, cebador Producción de ADNc -3’ BD SMAR™ CDS Primer II A
45
Polinucleótido, artificial, cebador Amplificación de ARNm -5’ PCR Primer II A
46
Polipéptido, Trifolium arvense, TaMYB14-2
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SEC ID NO:
Descripción Secuencia correspondiente
47
Polipéptido, Trifolium affine, TafMYB14-1
48
Polipéptido, Trifolium affine, TafMYB14-2
49
Polipéptido, Trifolium occidentale, ToMYB14-1
50
Polinucleótido, Trifolium occidentale, ToMYB14-2
51
Polipéptido, Trifolium repens, TrMYB14-1
52
Polipéptido, Trifolium repens, TrMYB14-2
53
Polipéptido, Trifolium repens, TrMYB14-3
54
Polipéptido, Trifolium repens, TrMYB14-4
55
Polinucleótido, Trifolium arvense, ADNc/ORF de TaMYB14-1
56
Polinucleótido, Trifolium arvense, ADNc/ORF de TaMYB14-2
57
Polinucleótido, Trifolium affine, ADNc/ORF de TafMYB14-1
58
Polinucleótido, Trifolium affine, ADNc/ORF de TafMYB14-2
59
Polinucleótido, Trifolium occidentale, ADNc/ORF de ToMYB14-1
60
Polinucleótido, Trifolium occidentale, ADNc/ORF de ToMYB14-2
61
Polinucleótido, Trifolium repens, ADNc/ORF de TrMYB14-1
62
Polinucleótido, Trifolium repens, ADNc/ORF de TrMYB14-2
63
Polinucleótido, Trifolium repens, ADNc/ORF de TrMYB14-3
64
Polinucleótido, Trifolium repens, ADNc/ORF de TrMYB14-4
65
Polinucleótido, Trifolium arvense, secuencia silenciamiento
66
Polinucleótido, artifical, cebador, MYB F1
67
Polinucleótido, artifical, cebador, MYB R
68
Polinucleótido, artificial, cebador, MYB F
69
Polinucleótido, artifical, cebador, MYB R1
La invención se ilustrará ahora con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.
Ejemplo 1: Identificación de los genes/ácidos nucleicos/proteínas de MYB14 de la invención, y análisis de los perfiles de expresión.
Introducción
Usando cebadores diseñados para el dominio de MYB de especie de legumbre, el solicitante ha amplificado secuencias que codifican nuevos factores de transcripción (TFs) de MYB mediante PCR de ADNc y ADN genómico
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Fuente
Especies Recuento de dominios
Miyake et. al. (2003)
Lotus japonicus 3
Glycine max
1
Nesi et. al. (2001)
Arabidopsis thaliana 10
Zea mays
3
Hordeum vulgare subsp. vulgare
2
Oryza sativa
1
Petunia x hybrida
1
Picea mariana
1
TABLA 1. Dominios vegetales de MYB R2R3 tomados de Miyake et. al. (2003) y Nesi et. al. (2001)
Los conjuntos de secuencias de legumbre buscados se dan en la Tabla 2 a continuación. Antes de la búsqueda, todos los conjuntos de EST y cóntigos de EST se tradujeron en seis marcos para generar secuencias proteicas adecuadas para los análisis de HMM/perfil. Las secuencias proteicas de M. truncatula se usaron tal cual (estas son
5 predicciones génicas de FGENESH obtenidas de TIGR).
Se usó el programa hmmbuild de HMMER para crear un HMM a partir de los dominios de unión a ADN modelo, y se inspeccionó frente a los conjuntos de secuencias de legumbre usando el programa hmmsearch de HMMER (valor E de corte = 0,01). Se usó el programa prophecy de EMBOSS para crear un perfil a partir de los mismos dominios, y también se inspeccionó frente a las secuencias de legumbre usando el programa profit de EMBOSS (corte de
10 puntuación = 50). En la Tabla 2 a continuación se dan los números de aciertos identificados por cada método en cada conjunto de secuencias:
Conjunto de secuencias
Número total de secuencias Número de aciertos – Método de perfil Número aciertos Método HMM de – de Número de aciertos que se hacen pasar a análisis filogenético
Cóntigos de EST de trébol blanco (CS35)
17.758 18 24 17
NR de PG de trébol blanco
159.017 0 9 3
Cóntigos de EST de trébol rojo
38.099 1 2 0
Cóntigo de EST de Lotus
28.460 5 9 4
Cóntigo de EST de haba de soja
63.676 15 40 15
Proteínas predichas de Medicago truncatula
41.315 60 80 69
ESTs de tricoma glandular Medicago sativa
5.647 1 2 1
Total
353.972 100 166 109
TABLA 2: Conjuntos de secuencias de legumbre investigados
El método de HMM pareció ser más sensible que el método del perfil, identificando todos los aciertos del perfil así como muchos aciertos adicionales. Por esta razón, el método de HMM se seleccionó como el método de elección –
15 las proteínas de los aciertos de HMM se usaron para generar los alineamientos y se hicieron pasar al análisis filogenético. Los aciertos del perfil todavía son bastante útiles: el método de perfil es más restrictivo, y por lo tanto hay una mayor probabilidad de que los candidatos del perfil representen aciertos verdaderos.
Generación de alineamientos
Las secuencias de los dominios de unión a ADN se extrajeron de los 166 candidatos de MYB R2R3 de legumbre
20 identificados anteriormente. Los dominios proteicos se alinearon usando el programa de alineamiento hmmalign de HMMER, el cual alinea los dominios usando información en el modelo de HMM original. Los alineamientos
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El análisis de transcritos usando cebadores específicos para TaMYB14 reveló que este gen se expresaba solamente en tejidos que acumulan de forma activa CTs. TaMYB14 se expresó en tejido de hoja madura e inmadura de T. arvense, pero no en el callo (que no sintetiza CTs). Los cebadores diseñados para TaMYB14 también amplificaron un MYB14 en T. repens, que se expresó en hoja de meristemo y tricomas meristemáticos tempranos, en los que los CTs se acumulan de forma activa, pero no se detectaron en tejido de hoja madura o emergente, estolones, internodos, raíces, y pecíolos. MYB14 tampoco se detectó en tejidos maduros de T. occidentale, en los que los CTs solamente están presentes en los tricomas de las hojas. Los resultados del análisis se muestran en la Tabla 3 a continuación:
Especie
Librería Resultado Esperado Ruta
T. repens Huia
hoja madura - - ¿CT?
T. repens Huia
hoja joven - -
T. repens Huia
hoja de meristemo + +
T. repens Huia
tricoma temprano + +
T. repens Huia
nodos e internados de estolón - -
T. repens Huia
Raíces - -
T. repens Huia
floral -+ +
T. repens Huia
pecíolos - -
T. occidentale
planta madura - -
T. repens Isabelle
hoja madura - - Antocianina
T. arvense
callo - - CT-ve
T. arvense
hoja madura + + CT
T. arvense
hoja inmadura + +
TABLA 3: La expresión de MYB14 también coincide con la expresión de antocianidina reductasa (ANR; BAN) y LAR, dos enzimas clave específicas para la biosíntesis de CTs en legumbres.
Las Figuras 3 y 4 también mostraron la comparación de niveles de transcrito en diversos tejidos en la especie de Trifolium; la Figura 3 muestra niveles de transcrito de TaMYB14 en tejidos variados de la especie de Trifolium y variedades de cultivo que se hacen crecer en condiciones idénticas de invernadero; Línea 1, (escalera); Línea 2, librería de ADNc de hoja madura de T. repens (variedad de cultivo Huia); Línea 3, librería de ADNc de raíz madura de T. repens (variedad de cultivo Huia); Línea 4, librería de ADNc de estolón maduro de T. repens (variedad de cultivo Huia); Línea 5, librería de ADNc floral madura de T. repens (variedad de cultivo DC111); Línea 6, ADNc de hoja emergente de T. repens (variedad de cultivo Huia); Línea 7, ADNc de hoja madura de T. repens (variedad de cultivo Isabelle rica en antocianinas); Línea 8, ADNc de hoja inmadura de T. arvense (variedad de cultivo AZ2925); Línea 9, ADNc de hoja madura de T. arvense (variedad de cultivo AZ2925); Línea 10, ADNc floral de meristemo de
T. repens (variedad de cultivo Huia); Línea 11, ADNc de hoja de meristemo de T. repens (variedad de cultivo Huia); Línea 12, ADNc solamente de tricoma de meristemo de T. repens (variedad de cultivo Huia); Línea 13, librería de ADNc de planta (hoja, raíz y estolón) madura de T. occidentale (variedad de cultivo Huia); Línea 14, librería de ADNc de nodo maduro de T. repens (variedad de cultivo Huia); Línea 15, clon de MYB14cDNA de T. arvense clonado en TOPO, Línea 16, clon genómico de MYB14 de T. arvense clonado en TOPO, Línea 17, ADN genómico de T. occidentale; Línea 17, ADN genómico de T. repens; Línea 17, ADN genómico de T. arvense; Línea 20, (escalera).
Mientras, la Figura 4 muestra niveles de transcrito de BANYULS(A) y LAR (B) en tejidos variables de la especie de Trifolium y variedades de cultivo que se hacen crecer en condiciones de invernadero idénticas. Línea 1, (escalera); Línea 2, librería de ADNc de hoja madura de T. repens (variedad de cultivo Huia); Línea 3, librería de ADNc de raíz madura de T. repens (variedad de cultivo Huia); Línea 4, librería de ADNc de estolón maduro de T. repens (variedad de cultivo Huia); Línea 5, librería de ADNc floral madura de T. repens (variedad de cultivo DC111); Línea 6, ADNc de hoja emergente de T. repens (variedad de cultivo Huia); Línea 7, ADNc de hoja madura de T. repens (variedad de cultivo Isabelle rica en antocianinas); Línea 8, ADNc de hoja inmadura de T. arvense (variedad de cultivo AZ2925); Línea 9, ADNc de hoja madura de T. arvense (variedad de cultivo AZ2925); Línea 10, ADNc floral de meristemo de
T. repens (variedad de cultivo Huia); Línea 11, ADNc de hoja de meristemo de T. repens (variedad de cultivo Huia); Línea 12, ADNc solamente de tricoma de meristemo de T. repens (variedad de cultivo Huia); Línea 13, librería de ADNc de planta (hoja, raíz y estolón) madura de T. occidentale (variedad de cultivo Huia); Línea 14, librería de ADNc de nodo maduro de T. repens (variedad de cultivo Huia); Línea 15, clon de BAN o LAR de ADNc de T. arvense
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clonado en TOPO, Línea 16, clon genómico de BAN o LAR de T. arvense clonado en TOPO, Línea 17, ADN genómico de T. occidentale; Línea 17, ADN genómico de T. repens; Línea 17, ADN genómico de T. arvense; Línea 20, (escalera).
Identificación y secuenciación de MYB14 de ADNg de T. arvense, T. affine, T. occidentale y T. repens
5 Usando cebadores diseñados para la región de inicio y parada de TaMYB14 (véase la Tabla 4), los inventores amplificaron homólogos de TaMYB14 mediante PCR de ADNc y ADNg aislados de un abanico de varias especies de Trifolium, a saber, T. arvense, T. affine, T. repens y T. occidentale. El aislamiento de la secuencia de ADN genómico y la secuenciación de longitud completa de los productos de la PCR clonados mostró que T. arvense tiene dos isoformas o alelos de este gen, uno de los cuales corresponde a la secuencia de ADNc expresada, correspondiendo
10 el otro a una variante alélica/isoforma previamente no identificada de TaMYB14.
El alineamiento de estas isoformas o variantes alélicas reveló la presencia de varias supresiones e inserciones de bases en comparación con la secuencia de ADNc de TaMYB14 (véase la Figura 10). La traducción de la secuencia de ADNc putativa reveló que la proteína codificada por esta isoforma o variante alélica también tiene supresiones, inserciones e intercambios de aminoácidos (véase la Figura 9). A la variante alélica se le denominó como TaMYB14
15 2.
Las secuencias de ADNg de longitud completa correspondientes para este gen también se aislaron a partir de otras tres especies de Trifolium: T. affine, T. repens y T. occidentale. Todos los alelos de MYB14 tuvieron tres exones y dos intrones de tamaños variables (véanse las Figuras 10-12). T. affine y T. occidentale tienen ambas un alelo, mientras que T. repens tiene dos alelos. Las secuencias traducidas de MYB14 de las diversas especies fueron 95%
20 homólogas a TaMYB14, con cambios en la composición de aminoácidos. La mayoría de las diferencias de aminoácidos están situadas en la región única de 3’ en dirección 3’ del dominio de MYB.
Uso de cebadores
Código Secuencia del cebador SEC ID NO:
Búsqueda del dominio de MYB
MYBFX 18
Búsqueda del dominio de MYB
MYBFY 19
Búsqueda del dominio de MYB
MYBFZ YTKGGSAACAGGTTGTC 20
Aislamiento de longitud completa
M14ATG 21
Aislamiento de longitud completa
M14TGA 22
Paseo génico
M14TSP1 23
Paseo génico
M14TSP2 24
Paseo génico
M14TSP3 imagen23 25
Clonación en el vector
M14FATG 26
Lotus corniculatus
MYBLF 27
Lotus corniculatus
MYBLR 28
Extremo 5’ UTR de MYB14
MYB148N 29
Extremo 3’ UTR de MYB14
MYB14RR imagen24 30
Cebador para intrón 1
15 31
34
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Uso de cebadores
Código Secuencia del cebador SEC ID NO:
Cebador para intrón 1
13 32
Paseo génico
TSP4 33
Paseo génico
TSP5 34
Sitio de partida de 5’ directo
MYB148F 35
Sitio de partida de 5’ inverso
MYB14RR 36
Análisis de expresión/ vector de slienciamiento
MYB14F 37
Análisis de expresión/ vector de slienciamiento
MYB14R 38
Paseo génico
MYB14R2 39
Paseo génico
MYB14R3 40
Secuenciación
M13 Directo 41
M13 Inverso
42
Producción de ADNc
BD SMART II™ A Oligonucleotide 43
Producción de ADNc
3’ BD SMART™ CDS Primer II A 44
Amplificación del ARNm
5’ PCR Primer II A imagen25 45
TABLA 4: Secuencias de cebadores para PCR, clonación y secuenciación de MYB14 de diversas especies de Trifolium (T. arvense; T. repens; T. affine; T. occidentale).
En resumen, se han identificado y aislado diez nuevas proteínas/genes MYB14, como se resume en la Tabla 5 a continuación, que también muestra la SEC ID NO: asociada con cada secuencia en el listado de secuencias:
SEC ID NO:
Especie, y referencia de secuencia
ADNc de longitud completa ADNg Proteína ORF
Trifolium arvense, TaMYB14-1
1, 13 2 14 55
Trifolium arvense, TaMYB14-2
- 3 46 56
Trifolium affine, TafMYB14-1
5 4 47 57
Trifolium affine, TafMYB14-2
- 6 48 58
Trifolium occidentale, ToMYB14-1
- 7 49 59
Trifolium occidentale, ToMYB14-2
- 8 50 60
Trifolium repens, TrMYB14-1
- 9 51 61
Trifolium repens, TrMYB14-2
- 10 52 62
35
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