ES2537097A1

ES2537097A1 - Metodo de activación química superficial de un soporte sólido en base silicio mediante anclaje covalente directo de al menos una biomolécula de ácido nucleico.

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Publication number: ES2537097A1
Application number: ES201331587A
Authority: ES
Inventors: Maria Jose Bañuls Polo; Angel Maquieira Catala; Ramon Eritja Casadella; Jorge ESCORIHUELA FUENTES; Santiago Grijalvo Torrijo; Rosa Puchades Pla
Original assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Politecnica de Valencia; Centro de Investigacion Biomedica en Red en Bioingenieria Biomateriales y Nanomedicina CIBERBBN
Current assignee: Consejo Superior de Investigaciones Cientificas CSIC; Universidad Politecnica de Valencia; Centro de Investigacion Biomedica en Red en Bioingenieria Biomateriales y Nanomedicina CIBERBBN
Priority date: 2013-10-30
Filing date: 2013-10-30
Publication date: 2015-06-02
Anticipated expiration: 2033-10-30
Also published as: ES2537097B1; WO2015063357A1

Abstract

Método de activación química superficial de un soporte sólido en base silicio mediante anclaje covalente directo de al menos una biomolécula de ácidos nucleicos. La presente invención se refiere a un método de activación química superficial por reacción tiol-eno (TEC) o tiol-ino (WC) de un soporte sólido en base silicio mediante anclaje covalente directo de al menos una biomolécula que es una secuencia de oligonucleótidos de ADN o ARN, donde a) la superficie del soporte está funcionalizada con grupos alqueno o alquino y la biomolécula presenta un grupo tiol terminal, y/o b) la superficie del soporte está funcionalizada con grupos tiol y la biomolécula presenta un grupo alqueno o alquino terminal; dicho método comprendiendo las etapas de: depositar la secuencia de oligonucleótidos sobre la superficie del soporte mediante técnicas de impresión con o sin contacto; y anclar la secuencia de oligonucleótidos a la superficie del soporte por adición radical mediante reacción TEC o TYC provocada por fotoirradiación con luz UV cercana al visible durante un intervalo de tiempo comprendido entre 5 minutos y 3 horas, sin necesidad de emplear crosslinkers y/o catalizadores.

Description

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respectivamente. De esta forma, también debe entenderse que la expresión “funcionalizado con un grupo tiol/alqueno/alquino”, o “presenta un grupo tiol/alqueno/alquino” no tiene por qué referirse a que el sustituyente en cuestión está unido directamente a la superficie del soporte o al extremo de la biomolécula, sino que lo hace por medio de un compuesto o grupo espaciador al que se encuentra unido, tal como se ilustra en la presente memoria.

Cualquier experto en el campo puede conocer, de acuerdo con sus conocimientos medios en el campo y siguiendo las indicaciones aquí aportadas, qué espaciadores pueden emplearse para funcionalizar superficies de silicio mediante grupos tiol, alqueno o alquino, o para funcionalizar biomoléculas de ácido nucleico, con estos tres sustituyentes. No obstante, cabe destacar que cuando se trata de la superficie del soporte en base silicio, los espaciadores empleados con cualquiera de los tres sustituyentes objeto de interés son preferiblemente compuestos organosilanos que comprenden en su extremo una agrupación seleccionada entre tiol, alqueno o alquino, De manera más preferible aún, el compuesto organosilano es un compuesto de fórmula general: R2-Si(Y1)3, siendo: Y1=R1O-, R1- ó Cl-, siendo R1 una cadena hidrocarbonada de 1 a 4 carbonos; y R2 una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada, de entre 1 y 20 átomos, opcionalmente sustituida con uno o varios sustituyentes (como por ejemplo grupos OH, fenilo,…) y que comprende entre 0 y 6 heteroátomos, preferentemente N u O, y que contiene en su extremo uno de los siguientes grupos -SH; -CH=CH2; ó -CΞCH. Entre estos organosilanos, los más preferidos en el ámbito de la presente invención son los clorosilanos o alcoxisilanos. Más preferentemente todavía, los compuestos organosilanos empleados son seleccionados dentro del grupo compuesto por: 3-mercaptopropil trietoxisilano, alil trimetoxisilano, vinil trimetoxisilano y 3glicidoxipropiltrimetoxisilano con propargilamina.

Cuando se trata de las biomoléculas, el espaciador que comprende en su extremo el grupo tiol, alqueno o alquino es preferentemente una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada de entre 1 y 20 átomos, opcionalmente sustituida con uno o varios sustituyentes (como por ejemplo grupos OH, fenilo…), y que comprende entre 0 (por ejemplo, las cadenas alifáticas) y 6 heteroátomos, preferentemente oxígeno. Estos heteroátomos pueden estar en cualquier posición de la cadena; de hecho, pueden estar intercalados en dicha cadena hidrocarbonada, como por ejemplo ocurre en el caso del polietilenglicol, uno de los casos preferidos que se comentan a continuación. Efectivamente, más preferentemente aún, los espaciadores son seleccionados entre un compuesto alquilo alifático de entre 1 y 20 carbonos o un poliglicol, preferentemente polietilenglicol (PEG) de fórmula (CH2CH2O)n(CH2)m siendo n un numero entero entre 1 y 6 y m un número entero entre 1 y 3.

De manera más preferida aún, el compuesto tiolado es un compuesto de fórmula alquilo(C1C20)-SH ó (CH2CH2O)n(CH2)mSH; el compuesto alquenilado es un compuesto de fórmula alquilo(C1-C20)-CH=CH2 ó (CH2CH2O)n(CH2)mCH=CH2; y el compuesto alquinilado es un compuesto de fórmula alquilo(C1-C20)-CΞCH ó (CH2CH2O)n(CH2)mCΞCH; siendo n un numero entero entre 1 y 6 y m un número entero entre 1 y 3. En la realización más preferida, el compuesto alquenilado es un compuesto de fórmula -(CH2CH2O)nCH2CH=CH2 y más preferentemente n es 3. En otra realización preferida, el compuesto tiolado es alquilo(C1C20)-SH, siendo más preferentemente -(CH2)6-SH.

En la Figura 1 se muestra un esquema del método de la invención utilizando la reacción TEC siguiendo cualquiera de las dos estrategias descritas (A y B).

De la presente descripción se debe entender que un mismo soporte puede estar anclado a más de una secuencia de oligonucleótidos, y que éstas pueden ser secuencias tioladas o alqueniladas (o alquiniladas), dependiendo de si la superficie del soporte es alquenilada (o alquinilada) o tiolada, respectivamente. Es decir, debe entenderse de la descripción anterior que cuando el soporte sobre el que se va a realizar el anclaje está funcionalizado con grupos alqueno y/o alquino, la secuencia de oligonucleótidos empleada es una secuencia modificada con grupo tiol (tiolada). De manera alternativa, cuando el soporte está funcionalizado con grupos tiol, la secuencia de oligonucleótidos es una secuencia alquenilada y/o alquinilada (modificada con grupos alqueno o alquino). No obstante, en una tercera alternativa de la invención, la superficie del soporte puede estar funcionalizada con grupos tiol y con grupos alqueno o alquino a la vez, por lo que el método de activación puede llevarse a cabo con secuencias de ambos tipos, alqueniladas o alquiniladas y tioladas, produciéndose un anclaje selectivo con los grupos tiol y alqueno o alquino del soporte, respectivamente. Esto no implica ninguna variación en el método de funcionalización superficial antes descrito. Esto es interesante para el objeto de la invención en la medida en que una parte de la superficie puede estar funcionalizada con uno de los grupos y otra parte por otros grupos diferentes, de tal forma que en la superficie puede anclarse ambos tipos de biomoléculas.

El soporte en base silicio puede ser preferentemente y sin carácter limitante óxido de silicio, nitruro de silicio, silicio o vidrio. Puede presentarse también en forma de nanopartículas, aunque el sustrato en base silicio modificado puede ser en el mejor de los casos un chip, un microarray (biochip), resultando así el método definido en un biochip de ácidos nucleicos, y que como se describe en esta memoria puede tener selectividad espacial mediante irradiación a través de una fotomáscara.

En una realización preferida, el método descrito comprende una etapa previa a la deposición de la biomolécula en la superficie, donde dicha superficie del soporte se modifica o funcionaliza introduciendo los grupos alqueno o alquino y/o los grupos tiol mediante reacción de condensación con compuestos organosilanos, que actúan de espaciadores entre el grupo de funcionalización que se encuentra posicionado en su extremo y la superficie a funcionalizar, como se ha explicado anteriormente. Los compuestos organosilanos más preferidos son de fórmula general R2-Si(Y1)3, siendo: Y1=R1O-, R1-ó Cl-, siendo R1 una cadena hidrocarbonada de 1 a 4 carbonos; y R2 una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada, de entre 1 y 20 átomos, opcionalmente sustituida con uno o varios sustituyentes (como por ejemplo grupos OH, fenilo,…) y que comprende entre 0 y 6 heteroátomos, preferentemente N u O, y que contiene en su extremo uno de los siguientes grupos -SH; -CH=CH2; ó -CΞCH. Más preferentemente aún, los compuestos organosilanos de este tipo son seleccionados entre clorosilanos y alcoxisilanos, siendo los elegidos para esta funcionalización: 3-mercaptopropil trietoxisilano, alil trimetoxisilano, vinil trimetoxisilano y 3glicidoxipropiltrimetoxisilano con propargilamina. Dicha modificación de la superficie puede realizarse de manera preferida de acuerdo con las siguientes etapas (ver Figura 1):

- someter el soporte de silicio a una atmósfera de argón en una disolución del compuesto organosilano a una concentración comprendida entre 0,5% y 5%, durante un tiempo comprendido entre 1 hora y 16 horas a una temperatura comprendida entre 20ºC y los 50ºC;

- lavar el soporte con un disolvente orgánico seleccionado dentro del grupo compuesto por: diclorometano, tolueno, hexano, ciclohexano, etanol, metanol e isporopanol, y secar (por ejemplo, con aire comprimido); y

- curar el soporte a 150ºC durante 30 minutos.

En un caso más particular, la modificación o funcionalización de la superficie se realiza del siguiente modo:

- someter el soporte de silicio a una atmósfera de argón en una disolución seleccionada entre alil trimetoxisilano (2% en tolueno) cuando se desea funcionalizar la superficie con grupos alqueno, 3-glicidoxipropiltrimetoxisilano (2% en tolueno con propargilamina), cuando se desea funcionalizar con grupos alquino, y/o 3mercaptopropil trietoxisilano (2% en tolueno) cuando se desea funcionalizar la superficie con grupos tiol, durante 2 horas a temperatura ambiente;

- lavar el soporte con un disolvente orgánico, preferentemente con 2-propanol y secar (por ejemplo, con aire comprimido); y

- curar el soporte a 150ºC durante 30 minutos.

De esta forma, se obtienen superficies funcionalizadas con grupos alqueno o alquino y/o grupos tiol. Es conveniente eliminar la materia orgánica del soporte de silicio antes de su funcionalización; preferentemente, esta acción se lleva a cabo tratando el soporte con disolución piraña (H2SO4:H2O2:3:1 v/v) durante 1 hora a 50ºC, lavando posteriormente el soporte con agua desionizada y secándolo con aire comprimido, aunque también pueden emplearse otros métodos conocidos en el campo (NaOH 1M, ácido nítrico…).

Por otra parte, la secuencia de ADN/ARN es en el mejor de los casos una sonda de ácidos nucleicos de longitud comprendida entre 5 y 50 bases, preferentemente entre 15 y 25 que presenta un grupo alqueno o alquino, o un grupo tiol terminal. Cuando se indica posición terminal de la secuencia en la presente memoria, esta posición puede ser por ejemplo la posición 3’ o preferiblemente el extremo 5’.

Como se ha dicho, de manera preferida, el grupo tiol, el grupo alqueno o el grupo alquino se encuentra unido a la biomolécula mediante un espaciador que es una cadena hidrocarbonada lineal o ramificada, de entre 1 y 20 átomos, opcionalmente sustituida con uno o varios sustituyentes (como por ejemplo grupos OH, fenilo…), y que comprende entre 0 y 6 heteroátomos, preferentemente oxígeno, y que es más preferentemente seleccionado entre un compuesto alquilo alifático de entre 1 y 20 carbonos o un poliglicol, preferentemente polietilenglicol (PEG) de fórmula (CH2CH2O)n(CH2)m siendo n un numero entero entre 1 y 6 y m un número entero entre 1 y 3. De manera más preferida aún, el compuesto tiolado es un compuesto de fórmula alquilo(C1-C20)-SH ó (CH2CH2O)n(CH2)mSH; el compuesto alquenilado es un compuesto de fórmula alquilo(C1-C20)-CH=CH2 ó (CH2CH2O)n(CH2)mCH=CH2; y el compuesto alquinilado es un compuesto de fórmula alquilo(C1-C20)-CΞCH ó (CH2CH2O)n(CH2)mCΞCH; siendo n un numero entero entre 1 y 6 y m un número entero entre 1 y 3.

En el ejemplo que se presenta como prueba de concepto se han escogido las siguientes secuencias como preferidas, sin ser limitantes de la invención:

- PM: 5’-X- CCCGATTGACCAGCTAGCATT-3’;

- MM1: 5’-X-CCCGATTGACCTGCTAGCATT-3’;

- MM2: 5’-X- CCCGATTGATTAGCTAGCATT-3’ y

-MM3: 5’-X-CCATATTGACCAGCTATCATT-3’, donde X representa un compuesto seleccionado entre un compuesto tiolado (de tal forma que se emplea para las superficies modificadas con alqueno o alquino) y un compuesto alquenilado o alquinilado (de tal forma que se emplea en la invención para las superficies modificadas con grupos tiol) unidos al extremo 5’ a través de un enlace tipo fosfato. En los casos más preferidos, X representa un compuesto tiolado de fórmula alquilo(C1-C20)-SH ó (CH2CH2O)n(CH2)mSH; un compuesto alquenilado de fórmula alquilo(C1-C20)-CH=CH2 ó (CH2CH2O)n(CH2)mCH=CH2; o un compuesto alquinilado de fórmula alquilo(C1-C20)-CΞCH o (CH2CH2O)n(CH2)mCΞCH, estando unidos al extremo 5’ del ácido nucleico a través de un enlace tipo fosfato; y siendo n un numero entero entre 1 y 6 y m un número entero entre 1 y

3.

En la realización más preferida, el compuesto alquenilado es un compuesto de fórmula -(CH2CH2O)nCH2CH=CH2 y más preferentemente n es 3. En otra realización preferida, el compuesto tiolado es alquilo(C1-C20)-SH, siendo más preferentemente -(CH2)6-SH.

Cuando la superficie del soporte está funcionalizada al menos con grupos tiol, la sonda de oligonucleótidos a anclar debe contener un grupo alqueno o alquino terminal, tal y como se han definido anteriormente. A diferencia de algunas sondas de oligonucleótidos modificadas con un grupo tiol terminal, las sondas de oligonucleótidos con esta terminación alqueno o alquino no se encuentran disponibles comercialmente por lo que han de ser sintetizadas, lo que se planteó como uno de los retos fundamentales de la presente invención.

Así, en una realización preferida de la invención cuando el soporte está funcionalizado con grupos tiol, se puede preparar la secuencia de oligonucleótidos con la terminación alqueno o alquino a partir del método del fosforamidito, de forma previa a la deposición de la etapa I).

Así, en primer lugar se sintetiza el fosforamidito de fórmula general 2 conteniendo el alqueno

o alquino deseado, partiendo de un alcohol 1 obtenido de fuentes comerciales o por los métodos habituales conocidos por un experto medio en la materia, tal y como se describe en el Esquema 1 descrito a continuación:

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entre 3 y 6 pmol/cm2, con buena reproducibilidad (desviaciones estándar entre chips inferiores al 15%). El producto obtenido por este método es en realidad el primer soporte activado con biomoléculas, especialmente chip, que posee secuencias oligonucleótidas ancladas directamente al soporte alquenilado y/o tiolado sin intermediarios (crosslinkers, catalizadores) utilizando luz para activar la reacción. Aunque se han descrito soportes derivatizados con compuestos organosilanos, como son sobretodo microarrays usando crosslinkers, no se han datado hasta la fecha chips en los que oligonucleótidos y superficie del soporte estén unidos directamente sin intermediario.

En un caso preferido, dicho soporte activado con biomoléculas es un microarray (biochip) de ácidos nucleicos, y más preferentemente es un microarray de ácidos nucleicos donde las sondas ancladas se localizan selectivamente en las zonas de la superficie donde se ha irradiado con luz. Esto implica asimismo el uso del soporte activado como biochip o microarray para cualquier utilidad ya conocida para un biochip de ADN: medicina forense, detección de organismos genéticamente modificados, identificación de cepas de bacterias (como por ejemplo puede ser la discriminación de microorganismos patógenos como es E. coli), diagnóstico clínico, veterinaria, etc.

Breve descripción de las Figuras Figura 1. Representación esquemática de las estrategias basadas en la reacción TEC. Según la estrategia A se funcionaliza el soporte de silicio con un grupo alqueno y se ensambla un ácido nucleico con un grupo tiol. Según la estrategia B, se se funcionaliza el soporte de silicio con un grupo tiol y se ensambla un ácido nucleico con un grupo alqueno Figura 2. Densidades de inmovilización obtenidas, de acuerdo al procedimiento descrito en el ejemplo 4, para las dos estrategias A y B de modificación y anclaje de oligonucleótidos objeto de protección. Figura 3. a) Ilustración esquemática del patterning en la superficie funcionalizada. Modificación de la superficie: etapa a) silanización; etapa b) aplicación del oligonucleótido marcado con Cy5; etapa c) irradiación a través de una fotomáscara; etapa d) eliminación de la fotomáscara. b) Imagen de fluorescencia obtenida después de la irradiación. Figura 4. Ensayos de discriminación de mismatches en SSC 1× con diferentes concentraciones de formamida (0%, 10% y 25%) para las dos estrategias A (gráfico superior) y B (gráfico inferior) planteadas en la presente invención y utilizando las 4 secuencias de oligonecleótidos descritas en la memoria: PM (barra de color negro), MM1 (barra de líneas diagonales), MM2 (barra de color blanco) y MM3 (barra de líneas verticales).

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El ensamblaje de las sondas de ADN se hizo de la forma habitual en la síntesis de ácidos nucleicos. En el extremo 5’ se añadió el fosforamidito alqueno 2 siguiendo el protocolo estándar para la adición de un nucleótido por el método del fosforamidito que consta de las siguientes etapas: 1) eliminación del grupo protector dimetoxitritilo (DMT) del extremo 5’ con una solución al 3% de ácido tricloroacético en diclorometano, 2) acoplamiento del fosforamidito (0.1M) por activación con una solución 0.4M de 1H-tetrazol en acetonitrilo (Caruthers et al. Chemical synthesis of deoxyoligonucleotides by the phosphoramidite method. Methods in Enzymology 154, 287-313 (1987)). 3) Una vez que el fosforamidito alqueno (2) fue incorporado, se llevó a cabo la reacción de oxidación del P seguido de la desprotección de los grupos protectores de las nucleobases y del fosfito y 4) la liberación de los cuatro conjugados de los soportes sólidos mediante el tratamiento de una disolución de amoniaco (32%) a 55ºC durante toda la noche. Los soportes sólidos se filtraron y los oligonucleótidos modificados obtenidos (PM, MM1, MM2 y MM3 con X=alilo-(OCH2-CH2)3) se pasaron por una columna Sephadex (NAP-10).

Los productos resultantes se analizaron por HPLC y el pico mayoritario obtenido se analizó por la técnica de MALDI-TOF. El análisis por HPLC se realizó en un equipo de HPLC Waters 2998 equipado con un detector de diodos. Columna: XBridge OST C18 semipreparativa (10 x 50 mm, 2.5 micras). Flujo: 3 mL/min. Solución A: 5% de acetonitrilo en acetato de trietilamonio 100 mM (pH 7.0). Solución B: 70% acetonitrilo en acetato de trietilamonio 100 mM (pH 7.0). Gradiente lineal desde el 0% de B hasta el 30% de B durante 10 minutos. El tiempo de retención de los oligonucleótidos se detalla en la Tabla 1.

El análisis del peso molecular mediante espectroscopia de masas se realizó en un equipo de MALDI-TOF Voyager-DE RP (Applied Biosystems) utilizando el detector en el modo negativo utilizando como matriz 2,4,6-trihidroxiacetofenona y citrato amónico como aditivo. En la Tabla 1 se muestran los resultados de los espectros de MALDI-TOF de los oligonucleótidos modificados.

Tabla 1. Caracterización de los oligonucleótidos modelo modificados con grupo alilo terminal (PM, MM1, MM2 y MM3, respectivamente)

Oligonucleótido modificado*: Masa calculada Masa observada Tiempo de

PM: 7925 7920 6.1 min

MM1: 7913 7917 6.9 min

MM2: 7928 7927 7.0 min

MM3: 7938 7939 6.8 min

*X=-(CH2CH2O)3All

Ejemplo 4. Inmovilización de secuencias de oligonucleótidos sobre el soporte de silicio de acuerdo con el método de la presente invención.

Superficie con grupos alqueno (Estrategia A)

Se partió de la superficie funcionalizada con grupos alilo (ejemplo 1A), y se depositaron distintas concentraciones, por impresión, de un oligonucleótido con grupo tiol terminal en el extremo 5’ ((CH2)6-SH), marcado con el fluoróforo Cy5 en el extremo 3’, y de secuencia de bases: CCCGATTGACCAGCTAGCATT adquirido de Aldrich Química (Madrid, España). La impresión se llevó a cabo con un impresor de bajo volumen y no contacto de Biodot (modelo AD1500, Irvine, CA, USA). A continuación, los chips se expusieron a luz UV entre 10 minutos y 2 horas utilizando una lámpara de mercurio de baja presión (365 nm, 6.0 mW/cm2, Jelight) colocada a una distancia aproximada de 0,5 cm, para inducir la fotorreacción e inmovilización mediante la reacción TEC. Tras la exposición a la luz UV, los chips se lavaron con PBS-T, con agua desionizada y finalmente se secaron con aire.

Superficie con grupos tiol (Estrategia B)

Se partió de la superficie funcionalizada con grupos propanotiol (ejemplo 1B), y se depositaron por impresión los oligonucleótidos sintetizados con grupos alqueno terminales (extremo 5´), de secuencia de bases PM y marcados con Cy5 en el extremo 3’. A continuación, se aplicó el mismo protocolo de trabajo que se describe en el párrafo anterior.

Los análisis de dichas superficies se realizaron empleando técnicas de ángulo de contacto, ATR-FTIR, XPS y fluorescencia. La efectividad del anclaje se calculó en función de las intensidades de fluorescencia de las sondas impresas. Los resultados indican que se consigue la derivatización buscada con buen rendimiento en todos los casos (densidades de inmovilización desde 1.8 hasta 3.9 pmol·cm-2) Así, empleando las estrategias A y B basadas en la reacción TEC, se han alcanzado densidades de inmovilización de 3 y 6 pmol/cm2, respectivamente (Figura 2). A su vez, los análisis mediante AFM de las superficies funcionalizadas muestran un buen grado de homogeneidad, con valores de rms (root-mean –square roughness) desde 2.10 hasta 2.70.

Superficie con grupos alquino

En las superficies que contenían grupos alquino, se depositaron, por microimpresión de no contacto, gotas una sonda tiolada y el microarray creado se expuso a luz UV a través de una máscara durante 20 minutos para inducir la fotoinmovilización del oligonucleótido en zonas localizadas del chip. A continuación el chip se lavó con agua destilada y se secó.

Mediante estas tres estrategias, fue posible la inmovilización covalente y de forma selectiva sobre los soportes (Figura 3). De este modo, se consiguió el anclaje selectivo de ANs de una manera simple, limpia y eficiente.

Ejemplo 5. Demostración de la invención: obtención de soportes activados químicamente de acuerdo con el método de la presente invención, con empleo de fotomáscara, para hibridación de secuencias de nucleótidos de ADN, discriminación de mismatches y detección de Escherichia coli. En las superficies que contenían grupos alqueno y/o grupos tiol (es decir, sólo grupos alqueno, sólo grupos tiol o ambos grupos), se depositaron una sonda de oligonucleótidos tiolada marcada con Cy5 (estrategia A) y/o una sonda de oligonucleótidos con un grupo alqueno terminal marcada con Cy5 (estrategia B), y se expusieron a luz UV a través de una máscara para inducir la fotoinmovilización del oligonucleótido en zonas localizadas del chip. Tras la exposición, los chips se lavaron con PBS-T, con agua desionizada y finalmente se secaron con aire.

Ensayos de hibridación

En las superficies que contenían grupos alqueno terminal (estrategia A), se imprimió una sonda tiolada comercial de secuencia SH-(T)15-(CCCGATTGACCAGCTAGCATT) y a continuación se expuso a luz UV para inducir la fotoinmovilización del oligonucleótido. Tras la exposición, los chips se lavaron con PBS-T, con agua desionizada y se secaron con aire. Seguidamente, se aplicó el oligonucleótido diana de secuencia complementaria (AATGCTAGCTGGTCAATCGGG) marcado con Cy5, y se dejó hibridar en una cámara húmeda a 37 °C durante 1 hora. A continuación, los chips se lavaron con PBS-T, con agua desionizada y finalmente se secaron con aire.

Por otra parte, para las superficies funcionalizadas con grupos tiol (estrategia B), se imprimió la sonda sintetizada con un espaciador con un grupo alqueno terminal en la posición 5’, de secuencia (TTGATTACAGCCGGTGTACGACCCT) y a continuación se expuso a luz UV para inducir la fotoinmovilización de la sonda. Tras la exposición, los chips se lavaron con PBS-T, con agua desionizada y finalmente se secaron con aire. Seguidamente, se aplicó el oligonucleótido diana marcado con Cy5 de secuencia complementaria Cy5- (AGGGTCACACCGGCTGTAATCAAA), y se dejó hibridar en una

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Claims

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