ES2532436B1 - Uso de un compuesto indólico con sustituyentes nucleofílicos en el c3 y sus variantes diméricas en la preparación de una composición farmacéutica útil para el tratamiento de neoplasias linfoides b. - Google Patents

Abstract

Uso de un compuesto indólico con sustituyentes nucleofílicos en el C3 y sus variantes diméricas en la preparación de una composición farmacéutica útil para el tratamiento de neoplasias linfoides B.#La presente invención se refiere al uso de un compuesto indólico con sustituyentes nucleofílicos en el C3 y sus variantes diméricas, que presentan actividad contra neoplasias linfoides B seleccionadas de entre leucemia linfática crónica/linfoma de células B pequeñas, y linfomas B y de Hodgkin dependientes de infección por el herpesvirus de Epstein-Barr y que se utilizan en la preparación de una composición farmacéutica, que presenta utilidad para el tratamiento de dichas patologías.

Description

5

10

15

20

25

30

35

DESCRIPCION

USO DE UN COMPUESTO INDOLICO CON SUSTITUYENTES NUCLEORLICOS EN EL C3 Y SUS VARIANTES DIMERICAS EN LA PREPARACION DE UNA COMPOSICION FARMACEUTICA UTIL PARA EL TRATAMIENTO DE NEOPLASIAS LINFOIDES B

SECTOR Y OBJETO DE LA INVENCION

La presente invencion se situa en el sector de la industria farmaceutica, pues espedficamente se refiere al uso de un compuesto indolico con sustituyentes nucleofflicos en el C3 y sus variantes dimericas en la preparacion de una composicion farmaceutica que los comprende y que es util para el tratamiento de neoplasias linfoides B.

ESTADO DE LA TECNICA

El uso de derivados indolicos con sustituyentes nucleofflicos en el C3 para su uso terapeutico se ha restringido hasta el momento al 1H-indol-3-metanol y su d^ero el 3,3’- diindolilmetano (DIM).

El 1H-indol-3-metanol, mas conocido en el area de la biomedicina como indol-3-carbinol (I3C), es un compuesto derivado de la glucobrassicina o indol-3-glucosinolato. Son compuestos naturales que estan presentes en vegetales crudferos, particularmente en plantas del genero Bmssica como la coliflor y el brocoli. El I3C es una molecula inestable en medio acido, por lo que, una vez ingerido y en contacto con el acido gastrico del estomago, se transforma mediante una reaccion de deshidratacion y condensacion catalizada por el medio acido en varios tipos de oligomeros indolicos, siendo el mas frecuente el 3,3’- diindolilmetano (DIM), pero tambien el indolo[3,2b]-carbazol y otros compuestos trimericos lineales o dclicos o tetramericos dclicos (Aggarwal BB, Ichikawa H. Molecular targets and anticancer potential of indole-3-carbinol and its derivatives. Cell Cycle. 2005;4:1201-1215; Weng JR, Tsai CH, Kulp SK, Chen CS. Indole-3-carbinol as a chemopreventive and anticancer agent. Cancer Lett. 2008;262:153-163.

Numerosos estudios describen la posible utilidad del I3C y derivados, en particular el DIM, como agentes quimiopreventivos (Weng JR, Tsai CH, Kulp SK, Chen CS. Indole-3-carbinol

as a chemopreventive and anti-cancer agent. Cancer Lett. 2008;262:153-163), en lesiones

2

5

10

15

20

25

30

precancerosas en cervix (Bell MC, Crowley-Nowick P, Bradlow HL, et al. Placebo-controlled trial of indole-3-carbinol in the treatment of CIN. Gynecol Oncol. 2000;78:123-129) y en el tratamiento sintomatico de algunas enfermedades autoinmunes (McAlindon TE, Gulin J, Chen T, Klug T, Lahita R, Nuite M. Indole-3-carbinol in women with SLE: effect on estrogen metabolism and disease activity. Lupus. 2001;10:779-783). Tambien se ha visto actividad en cancer de mama y en neoplasia intraepitelial vulvar, aunque los mecanismos de accion que operan en su actividad antitumoral son aun controvertidos, lo que puede deberse tanto a su inestabilidad metabolica como a su complicado comportamiento farmacologico (Bradlow HL. Review. Indole-3-carbinol as a chemoprotective agent in breast and prostate cancer. In Vivo. 2008;22:441-445).

Estudios farmacocineticos en humanos han demostrado la baja toxicidad del I3C y del DIM administrados oralmente (Reed GA, Peterson KS, Smith HJ, et al. A phase I study of indole- 3-carbinol in women: tolerability and effects. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2005;14:1953-1960; Reed GA, Arneson DW, Putnam WC, et al. Single-dose and multiple- dose administration of indole-3-carbinol to women: pharmacokinetics based on 3,3'- diindolylmethane. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2006;15:2477-2481. A los individuos en estos ensayos se les administro hasta 800 mg de I3C al dia (470 mg/m2) durante 4 semanas. Algunos pacientes sufrieron molestias abdominales, nauseas, vomitos y dolor de cabeza, efectos que no correlacionaron con la dosis de I3C, dado que tambien los padecieron individuos a los que se les habia administrado un placebo, concluyendo que no eran debidos al tratamiento. Estos compuestos, a dosis no toxicas (hasta 400 mg en el caso del DIM y 1200 mg en el caso de I3C), alcanzan concentraciones en sangre del rango de micromolar (analizado como la concentration de DIM en suero a las 3 h de la ingestion) (Reed GA, Arneson DW, Putnam WC, et al. Single-dose and multiple-dose administration of indole-3-carbinol to women: pharmacokinetics based on 3,3'-diindolylmethane. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 2006;15:2477-2481). Por ultimo, en varios ensayos clmicos en fase I en humanos se ha comprobado su eficacia en la regresion de lesiones precancerosas inducidas por papilomavirus en cervix (Bell MC, Crowley-Nowick P, Bradlow HL, et al. Placebo-controlled trial of indole-3-carbinol in the treatment of CIN. Gynecol Oncol. 2000;78:123-129), y en laringe (Auborn K, Abramson A, Bradlow HL, Sepkovic D, Mullooly V. Estrogen metabolism and laryngeal papillomatosis: a pilot study on dietary prevention. Anticancer Res. 1998;18:4569-4573), y en el tratamiento sintomatico de algunas enfermedades autoinmunes (McAlindon TE, Gulin J, Chen T, Klug T, Lahita R, Nuite M.

5

10

15

20

25

30

35

Indole-3-carbinol in women with SLE: effect on estrogen metabolism and disease activity. Lupus. 2001;10:779-783).

Diversos estudios han identificado distintos efectos fisiologicos alterados por el I3C y derivados, habiendose descrito que inhibe procesos inflamatorios, proliferativos y la invasion tumoral, y que tiene un efecto inmunomodulador e inductor de apoptosis, entre otros. A nivel molecular, existen evidencias que muestran que el I3C y sus derivados alteran distintas vias de senalizacion, aunque no se ha encontrado ninguna evidencia concluyente que implique a una via concreta con el efecto antitumoral observado. Una de las primeras actividades descritas para el I3C y sus analogos fue como moduladores del receptor de estrogenos y del receptor de androgenos (revisado en Aggarwal BB, Ichikawa H. Molecular targets and anticancer potential of indole-3-carbinol and its derivatives. Cell Cycle. 2005;4:1201-1215). Estas actividades sobre los receptores hormonales han hecho cuestionar recientemente el uso continuado del I3C como suplemento quimioprotector (Bradlow HL. Review. Indole-3- carbinol as a chemoprotective agent in breast and prostate cancer. In Vivo. 2008;22:441- 445). Asi mismo, se ha descrito que el I3C inhibe distintos factores de transcripcion, como NFkB, Nrf2, ATF3, ATF4, p-catenina y STAT3. Tambien induce modulation del ciclo celular alterando la expresion de distintas kinasas de ciclinas (CDK2, CDK6 y p16 CDK) y de la ciclina D1. Se ha descrito tambien que altera la expresion de distintas protemas implicadas en apoptosis. Asi, el I3C y derivados reducen la expresion de BCL2, BCLXl, cIAP, XIAP y FLIP, y aumenta la de los receptores de muerte DR4 y DR5. El I3C y derivados tambien tienen un efecto en la actividad de distintas kinasas, como AKT, JNK y PTEN. Existen numerosas evidencias que indican que el I3C induce la activation del sistema de detoxification p450 e induce la smtesis de protemas antioxidantes. Por ultimo, tambien existen evidencias que indican que el I3C previene la formation de aductos de DNA inducidos por carcinogenos (revisado en Aggarwal BB, Ichikawa H. Molecular targets and anticancer potential of indole-3-carbinol and its derivatives. Cell Cycle. 2005;4:1201-1215; Kim YS, Milner JA. Targets for indole-3-carbinol in cancer prevention. J Nutr Biochem. 2005;16:65-73; Rogan EG. The natural chemopreventive compound indole-3-carbinol: state of the science. In Vivo. 2006;20:221-228).

DESCRIPCION DE LA INVENCION

Breve description de la invention

5

10

15

20

25

El problema tecnico a resolver es el tratamiento de neoplasias linfoides B mediante el uso de un compuesto indolico con sustituyentes nucleofflicos en el C3 y sus variantes dimericas.

Constituye el objeto de la invencion el uso de un compuesto de formula general (I) o (II) sus sales o solvatos farmaceuticamente aceptables, en la preparation de una composition farmaceutica que es util para el tratamiento de neoplasias linfoides B que se seleccionan de entre leucemia linfatica cronica/linfoma de celulas B pequenas, y linfomas B y de Hodgkin dependientes de infection por el herpesvirus de Epstein-Barr,

donde:

R

imagen1

1

(I)

R1 representa un atomo diferente a hidrogeno, de naturaleza electronegativa, libre, como -NH2, -OH, -SH, -PH2, -Cl, -Br, -F, -I, o unido a cadenas alquflicas (-OR, -NR2, -SR, PR2, donde R son preferentemente grupos alquilo); o bien estos mismos grupos mencionados unidos al esqueleto de indol por un atomo de carbono, preferentemente - CH2OH, -CH2NH2, -CH2SH, -CH2PH2, -CH2Cl,-CH2Br, -CH2F, -CH2I; y

R2 representa hidrogeno, o cadenas alquflicas o atomos halogenos como cloro, bromo, fluor o yodo, o atomos electronegativos unido a cadenas alquflicas (-OR, -NR2, -

SR, PR2, donde R son preferentemente grupos alquilo lineales o ramificados); y

donde:

imagen2

R3

R2 y R3 son sustituyentes iguales o distintos y representan hidrogeno, o cadenas alquflicas o atomos halogenos como cloro, bromo, fluor o yodo, o atomos electronegativos unido a cadenas alquflicas (-OR, -NR2, -SR, PR2, donde R son preferentemente grupos alquilo lineales o ramificados).

5

10

15

20

25

30

En un aspecto de la invention, la neoplasia linfoide B es una leucemia linfatica cronica/linfoma de celulas B pequenas de cualquiera de sus variantes y estados.

En otro aspecto de la invencion, la neoplasia linfoide B es un linfoma B que esta asociado a infecciones del herpesvirus de Epstein-Barr, y se selecciona de entre linfoma de Burkitt, linfoma difuso de celulas B grandes del anciano y linfoma plasmablastico del anciano.

En otro aspecto de la invencion, la neoplasia linfoide B es un linfoma de Hodgkin asociado a la infection por el herpesvirus de Epstein-Barr.

El compuesto de formula general (I) se elige de entre- indol-3-carbinol , 1H-indol-3-ol, 1H- indol-3-amina, y (6-metil-1H-indol-3-il)-metanol y preferentemente es indol-3-carbinol.

El compuesto de formula general (II) preferentemente es 3,3’-diindolilmetano.

Description detallada de la invencion:

La presente invencion se basa en que los inventores han descubierto que un derivado indolico con sustituyentes nucleofflicos en el C3 de formula general (I), es un potente inductor de muerte de celulas de pacientes con leucemia linfatica cronica/linfoma B de celulas pequenas (ver Ejemplos 1 a 4). Adicionalmente, tambien se ha observado que tanto dicho compuesto de formula general (I) como su derivado indolico dimerico de formula general (II), presentan actividad frente a lmeas celulares de linfomas de Burkitt positivas (ver Ejemplos 7 a 9, 14, 15 y 16).

Los inventores tambien han observado que el derivado indolico de formula general (I), sinergiza con farmacos utilizados en el tratamiento de la leucemia linfatica cronica/linfoma B de celulas pequenas como la fludarabina (ver Ejemplo 2) o la vincristina (ver Ejemplo 3) y que es capaz de revertir la resistencia a la fludarabina en celulas de pacientes con leucemia linfatica cronica/linfoma B de celulas pequenas con resistencia a este tratamiento (ver Ejemplo 2).

La baja toxicidad demostrada en ensayos preclmicos y clmicos en humanos contra otras patologias, que se pueden encontrar tanto en el estado de la tecnica, como en el Ejemplo

5

10

15

20

25

30

17, convierten al uso de los compuestos de formulas generales (I) o (II) en una estrategia excepcional para el tratamiento de las neoplasias linfoides B reivindicadas.

Los inventores de esta solicitud de patente han observado que los compuestos de formula general (I) o (II) son capaces de inducir muerte celular eficientemente en lmeas celulares derivadas de linfomas de Burkitt infectados con el virus de Epstein-Barr (EBV+), pero no en aquellas lmeas derivadas de pacientes con linfoma de Burkitt esporadico (EBV-), lo que sugiere que la infeccion por el virus predispone a que estos compuestos produzcan un efecto toxico sobre este tipo de celulas tumorales.

Adicionalmente, y tal y como el experto en la materia conocera, la infeccion por herpesvirus y concretamente por el virus Epstein-Barr (EBV) tambien esta implicada en la etiologia de otras neoplasias de celulas B, como por ejemplo en el linfoma difuso de celulas B grandes del anciano, el linfoma plasmablastico del anciano, y en un porcentaje de linfomas de Hodgkin que se situa entre el 20 y 25%.

Por los motivos anteriormente resenados, ejemplos de neoplasias linfoides B que se encuentran dentro del ambito de la presente invencion, son la leucemia linfatica cronica/linfoma B de celulas pequenas de cualquiera de sus variantes y estados; linfomas B espedficamente asociados a infecciones del herpesvirus de Epstein-Barr, como son por ejemplo, el linfoma de de Burkitt, el linfoma difuso de celulas B grandes del anciano y el linfoma plasmablastico del anciano; y el linfoma de Hodgkin asociado a infeccion del virus Epstein-Barr (EBV).

Se entiende por "leucemia linfatica cronica o LLC” a una leucemia de celulas B maduras que es denominada en su fase de linfoma como "leucemia linfatica cronica/linfoma de celulas B pequenas o LLC/linfoma de celulas B pequenas” y que mayoritariamente se caracteriza por la expansion monoclonal u oligoclonal de celulas B que expresan CD5 y CD23 en sangre, medula osea y en organos linfoides secundarios. Es una enfermedad incurable que con los tratamientos actuales presenta una esperanza de vida del paciente entre 2 y 15 anos, dependiendo de la agresividad de la enfermedad. La mayona de pacientes desarrollan con el tiempo resistencia a los tratamientos actuales, lo que eventualmente causa su muerte por la enfermedad.

5

10

15

20

25

30

35

Por “linfoma de Burkitt” se entiende una neoplasia tipo B con translocacion de c-MYC. Es un linfoma B agresivo que representa el 2,5% de los casos de linfoma no Hodgkin. Su mayor incidencia ocurre en Africa y su tratamiento requiere quimioterapia agresiva y hospitalizacion, que no siempre esta al alcance de los afectados, en su mayoria ninos. Los linfomas de Burkitt se pueden dividir en 3 tipos, aquellos en los que el virus de Epstein-Barr tiene un papel en su etiologia y desarrollo, y que son comunes en Africa y otros paises del tercer mundo y que se denominan la variante endemica, aquellos que son mas comunes en paises desarrollados y que en mas de un 80% de los casos no estan asociados a infeccion por EBV (variante esporadica) y los asociados a procesos de inmunodeficiencia (pacientes transplantados o infectados por el virus de la inmunodeficiencia adquirida).

Por “linfoma difuso de celulas B grandes del anciano” se entiende una neoplasia de celulas B grandes que presenta un inmunofenotipo activado, una prominente activacion nuclear del factor de transcripcion NFkB y que es positiva para el virus de Epstein-Barr. Es un linfoma de curso clmico agresivo y de mal pronostico que ocurre en pacientes con una edad media de 71 anos. Es mas frecuente en la poblacion asiatica y tiene una media de supervivencia en esta poblacion de 2 anos.

Por ‘linfoma plasmablastico del anciano’ se entiende un linfoma agresivo de celulas B terminalmente diferenciadas. La mitad de los pacientes presentan infeccion por el virus de Epstein-Barr, y es una enfermedad tambien asociada a infeccion por el virus de la inmunodeficiencia adquirida, a inmunodeficiencias o a inmunosenescencia en ancianos.

Por “linfoma de Hodgkin” se entiende una neoplasia de celulas B que es de las mas frecuentes en adolescentes y jovenes. Existen distintas categorias basadas en las caracteristicas clmico-patologicas. La mas comun es el linfoma de Hodgkin clasico, caracterizado por la presencia de unas celulas denominadas Reed-Sternberg. En torno al 40% de pacientes con linfoma de Hodgkin clasico en paises en desarrollo estan infectados con el virus de Epstein-Barr, que parece tener un papel espedfico en la etiologia de estos tumores.

Las neoplasias de celulas B son causadas por la transformation tumoral de linfocitos B en distintos estadios de maduracion y activacion. Se diferencian de las neoplasias T en los tipos celulares afectados, ya que la ontogenia, desarrollo, diferenciacion y funcion de los

linfocitos B y T son muy diferentes. Aunque existen principios activos anti-tumorales que

8

5

10

15

20

25

30

pueden utilizarse para el tratamiento tanto de algunas neoplasias B como T, es resenable que existen principios activos que son espedficos para el tratamiento de cada una de estas, no pudiendo extrapolarse que el uso de un principio activo que funcione en una neoplasia B lo haga tambien en otros tipos de neoplasias T. Asi por ejemplo, la fludarabina, que es un tratamiento de eleccion para la LLC/linfoma de celulas B pequenas, no se utiliza en el tratamiento de ninguna neoplasia T.

Constituye el objeto de la invencion, el uso de un derivado indolico con sustituyentes nucleofflicos en el C3 de formula general (I), sus sales o pro-farmacos o solvatos farmaceuticamente aceptables, en la preparation de una composition farmaceutica, que es util para el tratamiento de las neoplasias linfoides B definidas en el presente documento, en adelante uso de la invencion:

R1 representa un atomo diferente a hidrogeno, de naturaleza electronegativa, libre, como -NH2, -OH, -SH, -PH2, -Cl, -Br, -F, -I, o unido a cadenas alquflicas (-OR, -NR2, -SR, PR2, donde R son preferentemente grupos alquilo); o bien estos mismos grupos mencionados unidos al esqueleto de indol por un atomo de carbono, preferentemente -

R2 representa hidrogeno, o cadenas alquflicas o atomos halogenos como cloro, bromo, fluor o yodo, o atomos electronegativos unido a cadenas alquflicas (-OR, -NR2, -

SR, PR2, donde R son preferentemente grupos alquilo lineales o ramificados).

En la definition anterior del compuesto de formula general (I), los siguientes terminos tienen el significado indicado.

Los terminos "alquilo”, "alquflico", o "alquflicas" se refieren a cadenas alifaticas, lineales o ramificadas, que tienen de 1 a 10 atomos de carbono, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i- propilo, n-butilo, tert-butilo, sec-butilo, n-pentilo, n-hexilo, etc. Preferiblemente el grupo alquilo tiene entre 1 y 6 atomos de carbono. Los radicales alquilo pueden estar

imagen3

donde:

imagen4

5

10

15

20

25

30

opcionalmente sustituidos por uno o mas sustituyentes tales como un cicloalquilo, arilo, heteroarilo, alcoxilo, halogeno, haloalquilo, nitro, amino, aminoalquilo, aminocicloalquilo, amonioalquilo, amoniocicloalquilo o, en general, cualquier sustituyente situado en cualquier posicion.

En un aspecto de la invention, el uso de la invention tambien incluye un compuesto de estructura dimerica de formula general (II), definido por dos moleculas de la formula general

R2 y R3 son sustituyentes iguales o distintos y representan hidrogeno, o cadenas alquflicas o atomos halogenos como cloro, bromo, fluor o yodo, o atomos electronegativos unido a cadenas alquflicas (-OR, -NR2, -SR, PR2, donde R son preferentemente grupos alquilo lineales o ramificados).

El uso de la invencion, incluye compuestos de formulas generales (I) o (II) que se obtienen o producen mediante una via sintetica qtimica, o a partir de una materia natural de distinto origen, como es la glucobrassicina que esta presente en vegetales crudferos, particularmente en plantas del genero Bmssica como la coliflor y el brocoli.

En una realization preferida del uso de la invencion, el compuesto de formula general (I) incluye un CH2OH en el R1 y un H en R2 y es el indol-3-carbinol o I3C.

En otra realizacion particular del uso de la invencion, el compuesto de formula general (I) incluye un OH en el R1 y un H en el R2 y es el 1H-indol-3-ol o I3-ol.

En otra realizacion particular del uso de la invencion, el compuesto de formula general (I) incluye un NH2 en el R1 y un H en el R2 y es el 1H-indol-3-amina o I3Amina.

(I),

imagen5

(II)

donde:

5

10

15

20

25

30

35

En otra realization particular del uso de la invention, el compuesto de formula general (I) incluye un CH2OH en el R1 y un CH3 en el R2 y es el (6-metil-1H-indol-3-ii)metanol o MI3Metanol.

En otra realizacion particular del uso de la invencion, el compuesto de formula general (II) es el 3,3’-diindolilmetano o DIM.

El uso de la invencion, incluye los compuestos definidos en las formulas generales, en las reivindicaciones y los descritos en los ejemplos.

El uso de la invencion, incluye compuestos de formula general (I) o (II) que se presentan en forma cristalina, o de compuesto libre o de solvato.

El uso de la invencion, tambien incluye a isomeros de los compuestos de formula general (I) o (II), dependiendo de la presencia de enlaces multiples, incluyendo isomeros opticos o enantiomeros, dependiendo de la presencia de centros quirales. Los isomeros, enantiomeros o diastereoisomeros individuales y las mezclas de los mismos caen dentro del alcance de la presente invencion, es decir, el termino isomero tambien se refiere a cualquier mezcla de isomeros, como diastereomeros, racemicos, etc., incluso a sus isomeros opticamente activos o las mezclas en distintas proporciones de los mismos. Los enantiomeros o diastereoisomeros individuales, asi como sus mezclas, pueden separarse mediante tecnicas convencionales.

Dentro del alcance de esta invencion, se encuentran las sales, solvatos y pro-farmacos farmaceuticamente aceptables de los compuestos de formula general (I) o (II) que, cuando se administran a un paciente son capaces de proporcionar (directamente o indirectamente) un compuesto segun se describe en el presente documento. Sin embargo, se apreciara que las sales farmaceuticamente no aceptables tambien estan dentro del alcance de la invencion ya que estas pueden ser utiles en la preparation de sales farmaceuticamente aceptables. La preparation de sales, solvatos, pro-farmacos y derivados puede llevarse a cabo mediante metodos conocidos en la tecnica.

Por ejemplo, sales farmaceuticamente aceptables de compuestos previstos en el presente documento, se sintetizan mediante metodos quimicos convencionales a partir de un

compuesto original que contiene un resto basico o acido. Generalmente, tales sales se

11

5

10

15

20

25

30

35

preparan, por ejemplo, haciendo reaccionar las formas de acido o base libre de los compuestos con una cantidad estequiometrica de la base o acido apropiado en agua o en un disolvente organico o en una mezcla de los dos. Generalmente, se prefieren medios no acuosos como eter, acetato de etilo, etanol, isopropanol o acetonitrilo. Ejemplos de sales de adicion de acidos incluyen sales de acido mineral tales como, por ejemplo, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, sulfato, nitrato, fosfato y sales de adicion de acido organico tales como, por ejemplo, acetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato, mandelato, metanosulfonato y p-toluensulfonato. Ejemplos de sales de adicion de bases incluyen sales inorganicas tales como, por ejemplo, sales de sodio, potasio, calcio, amonio, magnesio, aluminio y litio, y sales de bases organicas tales como, por ejemplo, etilenodiamina, etanolamina, W,W-dialquilenetanolamina, trietanolamina, glucamina y sales de aminoacidos basicos.

El termino "pro-farmaco o pro-droga" se usa en su sentido mas amplio y abarca aquellos derivados que se convierten in vivo en derivados indolicos adecuados para el tratamiento de las neoplasias linfoides B definidas en este documento. Tales derivados seran evidentes para aquellos expertos en la tecnica, e incluyen, dependiendo de los grupos funcionales presentes en la molecula y sin limitacion, los siguientes derivados de los compuestos: esteres, esteres de aminoacido, esteres de fosfato, esteres de sulfonato de sales metalicas, carbamatos y amidas.

Los pro-farmacos particularmente favoritos son aquellos que aumentan la biodisponibilidad de los derivados indolicos cuando se administran tales compuestos a un paciente (por ejemplo, haciendo que un compuesto administrado por via oral se absorba mas facilmente por la sangre), o que potencian la liberacion del compuesto original en un compartimento biologico (por ejemplo, el cerebro o el sistema linfatico) con relacion a la especie original. La preparation de dicho pro-farmaco puede llevarse a cabo mediante metodos convencionales conocidos por los expertos en la materia.

En un aspecto del uso de la invention, adicionalmente se utiliza al menos un excipiente, un adyuvante y/o vehiculos farmaceuticamente aceptables.

En otro aspecto del uso de la invencion, adicionalmente se incluye, al menos, otro principio activo, como por ejemplo la fludarabina.

5

10

15

20

25

30

35

Dentro del ambito de esta invention se incluye cualquier composition farmaceutica util para el tratamiento de neoplasias linfoides B definidas en el presente documento y que se caracteriza por comprender una dosis terapeuticamente eficaz de un derivado indolico con sustituyentes nucleofflicos en el C3 de formula general (I) o un dimero de este derivado indolico de formula general (II), una sal, un solvato o un pro-farmaco del mismo farmaceuticamente aceptables, en adelante composicion farmaceutica de la invencion.

La composicion farmaceutica de la invencion se puede administrar por cualquier via de administration apropiada, por ejemplo, oral, parenteral (subcutanea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, etc.), rectal, etc.

La composicion farmaceutica de la invencion puede estar en una forma farmaceutica de administracion por via oral, bien en forma solida o liquida. Ejemplos ilustrativos de formas farmaceuticas de administracion por via oral incluyen comprimidos, capsulas, granulados, soluciones, suspensiones, etc., y pueden contener los excipientes convencionales, tales como aglutinantes, diluyentes, desintegrantes, lubrificantes, humectantes, etc., y pueden ser preparadas por metodos convencionales. Las composiciones farmaceuticas tambien pueden ser adaptadas para su administracion parenteral, en forma de, por ejemplo, soluciones, suspensiones o productos liofilizados, esteriles, en la forma de dosificacion apropiada; en este caso, dichas composiciones farmaceuticas incluiran los excipientes adecuados, tales como tampones, tensoactivos, etc. En cualquier caso, los excipientes se elegiran en funcion de la forma farmaceutica de administracion seleccionada. Una revision de las distintas formas farmaceuticas de administracion de farmacos y de su preparation puede encontrarse en el libro “Tratado de Farmacia Galenica’’, de C. Fault i Trillo, 10 Edition, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones, o en cualquier libro de similares caracteristicas que exista en cada pais. Como el experto en la materia conocera, la combination de varios principios activos buscando efectos sinergicos o cooperativos en el tratamiento de patologias es una practica habitual dentro del campo de la medicina.

Por ese motivo, en el ambito de la presente invencion, se incluye la administracion de la composicion farmaceutica de la invencion conjuntamente con radiation o combinado con al menos un agente farmacologico, o como terapia adyuvante o neoadyuvante.

Se entiende como terapia adyuvante el uso de la composicion farmaceutica de la invencion

que se administra despues de la terapia principal para potenciar su efecto y/o aumentar la

13

5

10

15

20

25

30

posibilidad de una supervivencia prolongada. Se entiende como terapia neoadyuvante al tratamiento que se administra antes de la terapia principal para potenciar el efecto de esta.

Los agentes farmacologicos se seleccionan de entre los siguientes:

- un alquilante, seleccionado de entre, clorambucil, bendamustina, cisplatino o cualquier otro agente que presente este mecanismo de accion,

- un antimetabolito con actividad citotoxica, seleccionado de entre, metotrexato, fluoropirimidina, citarabina o cualquier otro agente que presente este mecanismo de accion,

- un antimicrotubulo, seleccionado de entre un alcaloide derivado de la vinca, un taxano o cualquier otro agente que presente este mecanismo de accion,

- un inhibidor de la topoisomerasa, seleccionado de entre antraciclina, mitoxantrona, epipodofilotoxina o cualquier otro agente que presente este mecanismo de accion,

- un inhibidor del proteasoma, como el bortezomib o cualquier otro agente que presente este mecanismo de accion,

- otro tipo de agente farmacologico, seleccionado de entre fludarabina, hidroxiurea, epotilonas o cualquier otro agente que presente mecanismos de accion similares,

-un anticuerpo antitumoral, seleccionado de entre Rituximab, Alentuzumab o cualquier otro agente perteneciente a esta familia de compuestos.

En un aspecto de la invention, la composition farmaceutica de la invention potencia sinergicamente el efecto citotoxico de la F-ara-A y/o de la vincristina en celulas de pacientes de LLC/linfoma B de celulas pequenas.

La fludarabina, utilizada de forma estandar en el tratamiento de la LLC/linfoma B de celulas pequenas, se convierte en el higado en F-ara-A, que es el farmaco activo que se utiliza en los ensayos in vitro. Los pacientes de LLC/linfoma B de celulas pequenas desarrollan al cabo del tiempo resistencia a la fludarabina y otros agentes quimioterapeuticos, lo que marca el inicio de la fase terminal de la enfermedad. El mecanismo de accion de la F-ara-A se basa en su funcion como antimetabolito del adenilato, y, como tal, es capaz de inhibir la smtesis de ADN, impidiendo la proliferation celular. No obstante, dado el bajo mdice proliferativo de las celulas de LLC/linfoma B de celulas pequenas, la incorporation de la F- ara-A se supone que se produce mayormente en los procesos de reparation de gaps en el DNA.

5

10

15

20

25

30

Por su parte, la vincristina (VCR) es un farmaco que ejerce sus efectos citotoxicos interfiriendo con los microtubulos que forman los haces mitoticos durante la metafase, interrumpiendo el ciclo celular.

En otro aspecto de la invention, la composition farmaceutica de la invention restaura la sensibilidad a la F-ara-A de celulas de pacientes con LLC/linfoma B de celulas pequenas resistente a fludarabina.

En otro aspecto de la invencion, la composicion farmaceutica de la invencion restaura la sensibilidad a la F-ara-A de las celulas de pacientes con LLC/linfoma B de celulas pequenas con translocation del gen p53.

En otro aspecto de la invencion, la composicion farmaceutica de la invencion, se utiliza conjuntamente con fludarabina o vincristina.

En otra realizacion particular de la invencion, la composicion farmaceutica de la invencion se utiliza para el tratamiento de la LLC/linfoma B de celulas pequenas que es resistente a farmacos, como por ejemplo, fludarabina o vincristina.

En el ambito de la presente invencion, tambien se incluyen aquellos metodos de tratamiento de las neoplasias linfoides B definidas en este documento, que consisten en la administration de un compuesto de formula general (I) o (II), o de la composicion farmaceutica de la invencion, tanto solos como combinados con otros farmacos o tecnicas medicas.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. El I3C induce muerte celular en celulas sangumeas mononucleares de pacientes con LLC/linfoma B de celulas pequenas en mayor proportion que en celulas de donantes sanos. Se muestra la media aritmetica ± error estandar de los resultados de viabilidad obtenidos utilizando las concentraciones indicadas de I3C en 23 pacientes de LLC/linfoma B de celulas pequenas y en 4 donantes sanos a las 24 horas (A) y 48 horas (B) segun el Ejemplo 1.

5

10

15

20

25

30

35

Figura 2. Cooperacion sinergica del I3C con la F-ara-A en la induccion de muerte de las celulas leucemicas de pacientes con LLC/linfoma B de celulas pequenas sensibles o resistentes a Fludarabina. A la izquierda se representan los porcentajes de celulas viables de LLC/linfoma B de celulas pequenas cultivadas por triplicado con fludarabina, I3C o con una combinacion de F-ara-A:I3C con un ratio constante de 1:14 (^M:^M) y la derecha las graficas Fa-CI (fraccion afectada (Fa) frente a mdice combinatorio (CI)) a las 48 horas en un paciente sensible a la F-ara-A (A) y en otro resistente a la F-ara-A (B).

Figura 3. El I3C sinergiza con la vincristina. Se muestran los CI para LD50 (dosis letal 50) del efecto citotoxico de la combinacion de I3C y VCR para 7 pacientes de LLC/linfoma B de celulas pequenas a las 24 y 48 horas.

Figura 4. El I3C solo o en combinacion con fludarabina induce apoptosis en celulas de pacientes con LLC/linfoma B de celulas pequenas como indican la induccion de la rotura de PARP y de las caspasas, el marcaje de apoptosis temprana con anexina V y la proteccion de la muerte celular con Z-VAD-fmk. (A) viabilidad celular mediante luminiscencia a las 24 y 48 horas. (B) viabilidad celular por marcaje con anexina V y con ioduro de propidio a las 24 horas. (C) Analisis de la expresion y procesamiento de caspasas y de PARP mediante Western blot en estractos de celulas de pacientes con LLC/linfoma B de celulas pequenas a las 24 h del tratamiento.

Figura 5. El I3C reduce la expresion de proteinas antiapoptoticas e induce la acumulacion de p53, pero no su fosforilacion en celulas de pacientes con LLC/linfoma B de celulas pequenas (A) Expresion de las proteinas MCL1, XIAP, cIAP y p-actina mediante Western blot en estractos de celulas de pacientes con LLC/linfoma B de celulas pequenas tratadas con I3C durante 24 horas. (B) Expresion de de p53 y de la fosforilacion de p53 en distintos residuos de Ser mediante Western blot en estractos de celulas de pacientes con LLC/ linfoma B de celulas pequenas a las 24 del tratamiento.

Figura 6. El I3C potencia el efecto de la F-ara-A en la acumulacion y activacion de la proteina supresora de tumores p53 en muestras de pacientes de LLC/ linfoma B de celulas pequenas con el p53 no mutado. (A) Dos casos representativos de pacientes con el gen de p53 no mutado. (B) Un caso representativo de una muestra de un paciente con el p53 mutado.

5

10

15

20

25

30

Figura 7. El I3C induce muerte celular en llneas de linfoma de Burkitt positivas para el virus de Epstein-Barr (EBV+ BL) (A), pero no en lmeas de linfoma de Burkitt negativas para el virus de Epstein-Barr EBV- (B) o en lineas linfoblastoides no tumorales (LCL) infectadas con EBV (C).

Figura 8. Analisis comparativo del efecto citotoxico del I3C con el (6-Metil-1H-indol-3- il)metanol, el 1H-Indol-3-ol, el 1H-Indol-3-amina y con otros derivados indolicos con distintos radicales en el C3 en lineas de linfoma de Burkitt EBV-positivas. (A)

Viabilidad de las celulas BL-60.2 y Raji a las 24 del tratamiento determinada mediante colorimetria tomando la condicion control como el 100% de viabilidad. (B) Formulacion de los diferentes compuestos indolicos utilizados.

Figura 9. El 1H-Indol-3-ol (I3-ol) induce muerte celular a dosis mas bajas que el I3C y esta muerte se revierte al incubar las celulas con el inhibidor de las caspasas ZVAD- fmk

Figura 10. El I3C induce muerte celular por un mecanismo apoptotico dependiente de caspasas. (A) Se muestra un caso representativo de celulas de linfoma de Burkit BL-60.2 en las que se observa que el I3C induce apoptosis y la presencia de Z-VAD-fmk protege de la misma. (B) el I3C induce la activacion de las caspasas 3, 8 y 9 y la ruptura de PARP en las lineas de linfoma de Burkitt EBV+ BL60 y Raji, mientras que no lo hace en la lmea Ramos (Burkitt EBV-) o en Dana (linfoblastoide EBV+).

Figura 11. El I3C causa la despolarizacion mitocondrial. Celulas de BL-60.2 y Raji se cultivaron con 200 ^M I3C durante 3, 5 y 8 horas, se marcaron con TMRM y se analizaron por citometria de flujo.

Figura 12. El I3C no afecta al ciclo celular. Celulas de BL-60.2 se cultivaron con 200 ^M

I3C durante 9, 15 y 24 horas, se tineron con ioduro de propidio (IP) y el contenido de DNA se analizo y cuantifico por citometria de flujo.

Figura 13. El I3C modifica la expresion de diversas protelnas senalizadoras y de proteinas pro y antiapoptoticas, como XIAP, cIAP o MCL1, en lineas de linfoma de Burkitt positivas para el virus de Epstein-Barr (EBV+ BL) pero no en lineas de linfoma

5

10

15

20

25

30

35

de Burkitt negativas para EBV (EBV-) o llneas no tumorales (LCL) infectadas con EBV.

(A) BL-60.2. (B) Ramos. (C) Raji. (D) Dana.

Figura 14. El I3C modifica la expresion de diversos factores de transcripcion y protelnas virales en llneas de linfoma de Burkitt positivas para el virus de Epstein- Barr (EBV+ BL) pero no en lineas de linfoma de Burkitt negativas para EBV (EVB-) o en lineas linfoblastoides (no tumorales) (LCL) infectadas con EBV. (A) BL-60.2. (B) Ramos. (C) Raji. (D) Dana.

Figura 15. El tratamiento con I3C o con su dlmero el diindolilmetano (DIM) reduce el tamano tumoral y aumenta la supervivencia de ratones xenotransplantados con celulas de la linea de linfoma de Burkitt positivo para EBV Daudi. (A) Comparacion del peso de los tumores desarrollados por animales tratados con I3C y no tratados. Analisis estadistico t de Student para muestras no pareadas (p = 0.038). (B) Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier entre ratones del grupo tratado con I3C y del grupo control. (C) Curvas de supervivencia de Kaplan-Meier entre ratones del grupo tratado con DIM y del grupo control.

Figura 16. Analisis de la toxicidad causada en ratones por los tratamientos con fludarabina (Flu), I3C o por una combinacion de ambos tratamientos. (A) Medida del peso a lo largo de los tratamientos. (B) Determinacion de la toxicidad hepatica y renal mediante la medida de GOT, GPT y urea antes (dia 0) y despues de los tratamientos (dia 53). (C) Determinacion de la variacion de las poblaciones leucocitarias antes (dia 0) y despues de los tratamientos (dia 53).

MODO DE REALIZACION DE LA INVENCION

Ejemplo 1. El I3C induce muerte celular en celulas mononucleares de pacientes con LLC/linfoma B de celulas pequenas en mayor proporcion que en celulas de donantes sanos

Las celulas de los pacientes diagnosticados con LLC/linfoma B de celulas pequenas y de los donantes sanos se aislaron por centrifugacion en gradiente de densidad y se cultivaron por triplicado en presencia de distintas concentraciones de I3C (5-100 ^M).

5

10

15

20

25

30

35

Se utilizaron muestras de 23 pacientes con LLC/linfoma B de celulas pequenas y de 4 donantes sanos. El porcentaje de viabilidad celular se determino con el kit CellTiter-Glo® de Promega considerando la condicion control (sin I3C) como el 100% de viabilidad.

El I3C fue capaz de inducir apoptosis de celulas de LLC/linfoma B de celulas pequenas con una LD50 (dosis a la cual se induce la muerte del 50% de las celulas) de 38 ^M a las 48 h, mientras que en el caso de las celulas de donantes sanos esta fue superior a 100 ^M. Los analisis estadisticos se realizaron con el test de Student para muestras no pareadas, *p > 0,05 y **p < 0,005 (ver Figura 1).

Ejemplo 2. El I3C sinergiza con la fludarabina y ademas es capaz de revertir la resistencia a fludarabina en pacientes con LLC/linfoma B de celulas pequenas refractaria

Las celulas de LLC/linfoma B de celulas pequenas se cultivaron por triplicado con concentraciones crecientes F-ara-A, que es la forma activa de la fludarabina (0,1, 0,2, 0,5, 1 ^g/ml), de I3C (5, 10, 25, 50 ^M) o con combinaciones de F-ara-A:I3C con un ratio constante de 1:14 (^M:^M) en un paciente sensible a la F-ara-A (paciente A; Figura 2A) y en otro resistente a la F-ara-A (paciente B; Figura 2B).

Se midio la viabilidad celular a las 48 horas mediante luminiscencia utilizando el kit Cell Titer-Glo® (Promega) y se calculo el porcentaje de celulas viables considerando la condicion control (sin ninguna droga) como el 100% de viabilidad.

En las condiciones experimentales seleccionadas, la induccion de muerte tanto por el I3C como por la F-ara-A fue muy moderada en ambos pacientes. Sin embargo, la combinacion del I3C y la F-ara-A indujo muerte celular de las celulas tumorales de ambos pacientes de forma muy eficiente y claramente superior al mero efecto aditivo de ambos farmacos (ver Figura 2).

Se hallaron los indices de combinacion (CI) de las drogas y se determino el efecto sinergico utilizando el programa Calcusyn (Biosoft, Cambridge, USA), segun el modelo descrito por Chou y Talalay (1981) (Chou TC, Talalay P. Generalized equations for the analysis of inhibitions of Michaelis-Menten and higher-order kinetic systems with two or more mutually

exclusive and nonexclusive inhibitors. Eur J Biochem. 1981;115:207-216). Se considera un

19

5

10

15

20

25

30

mdice combinatorio = 1 como efecto aditivo, < 1 sinergico y > 1 antagonico. Se muestra un caso representativo de un paciente de LLC/linfoma B de celulas pequenas no resistente a fludarabina (CI para LD50 = 0,4; sinergismo) (A) y de un paciente de LLC/linfoma B de celulas pequenas resistente a fludarabina (CI para LD50 = 0,77; sinergismo) (B).

Transcurridas 48 horas se comprobo que I3C coopero sinergicamente con la F-ara-A para inducir la muerte de las celulas de LLC/linfoma B de celulas pequenas (mdice combinatorio (CI) para LD50 (dosis letal 50): paciente A = 0,4; paciente B = 0,44) (ver Figura 2). Estos resultados sugieren que los mecanismos moleculares de induction de muerte del I3C y la F- ara-A podrian ser complementarios a nivel farmacologico. Ademas, estos datos indican que la F-ara-A vuelve a ser activa en presencia del I3C incluso en pacientes que habian desarrollado resistencia a este farmaco.

Ejemplo 3. El I3C sinergiza con la vincristina, compuesto alcaloide que inhibe la formation de los microtubulos

Las celulas de LLC/linfoma B de celulas pequenas se cultivaron por triplicado con concentraciones crecientes de vincristina (VCR; 0,01, 0,02, 0,05, 0,1 ^g/ml), de I3C (5, 10, 25, 50 ^M) o con combinaciones de VCR:I3C con un ratio constante de 1:415 (^M:^M).

Se midio la viabilidad celular a las 48 horas mediante luminiscencia utilizando el kit Cell Titer-Glo® (Promega) y se calculo el porcentaje de celulas viables considerando la condition control (sin ninguna droga) como el 100% de viabilidad. Los resultados mostraron los CI para LD50 (dosis letal 50) de 7 pacientes de LLC/ linfoma B de celulas pequenas a las 24 h (media ± desviacion estandar = 0,54 ± 0,38) del efecto citotoxico de la combination de I3C y VCR. y a las 48 h (0,61 ± 0,23) (ver Figura 3).

Se hallaron los indices de combinacion (CI) de las drogas y se determino el efecto sinergico utilizando el programa Calcusyn (Biosoft, Cambridge, USA), segun el modelo descrito por Chou y Talalay (Chou TC, Talalay P. Generalized equations for the analysis of inhibitions of Michaelis-Menten and higher-order kinetic systems with two or more mutually exclusive and nonexclusive inhibitors. Eur J Biochem. 1981;115:207-216). Se considera un CI = 1 como efecto aditivo, < 1 sinergico y > 1 antagonico.

5

10

15

20

25

30

35

Transcurridas 48h se determinaron los CI que fueron < 1, lo que indica que ambos farmacos presentaron un efecto sinergico.

Ejemplo 4. El I3C solo o en combinacion con fludarabina induce apoptosis en celulas de pacientes con LLC/linfoma B de celulas pequenas, como indican la induccion de la rotura de PARP y el procesamiento proteolltico de las caspasas, asl como el marcaje de apoptosis temprana con anexina V y la proteccion de la muerte celular con Z-VAD- fmk

Las celulas de los pacientes diagnosticados con LLC/linfoma B de celulas pequenas se aislaron por centrifugacion en gradiente de densidad y se cultivaron sin otras adiciones o en presencia de I3C (25 ^M), F-ara A (0,5 ^g/ml) o una combinacion de ambos (I3C (25 ^M) ± F-ara A (0,5 ^g/ml)), y en presencia o ausencia de Z-VAD-fmk 100 ^M. Se midio la viabilidad celular mediante luminiscencia a las 24 y 48 horas (ver Figura 4A) o por marcaje con anexina V/ioduro de propidio a las 24 horas (ver Figura 4B). Se calculo el porcentaje de celulas viables considerando la condition control (sin ningun farmaco) como el 100% de viabilidad. En un experimento en paralelo las celulas se lisaron y sonicaron a las 24 horas y se analizo la expresion y procesamiento de PARP y de las caspasas 3, 8 y 9 mediante Western blot (ver Figura C). La expresion de p-actina se utilizo como control de carga.

Como muestran los resultados, la muerte inducida por I3C se previno con la inclusion del inhibidor de caspasas Z-VAD-fmk en el cultivo. Asi mismo, el tratamiento con I3C y F-ara-A indujo un mayor porcentaje de muerte celular que tambien fue parcialmente prevenido con Z-VAD-fmk. Como demostracion adicional de la induccion de apoptosis por el I3C como tratamiento unico y por el tratamiento combinado con F-ara-A, se muestra la exposition en superficie celular de la anexina V (ver Figura B) y la activation proteolrtica de las caspasas 3, 8 y 9, asi como la ruptura de PARP (ver Figura C).

Ejemplo 5. El I3C reduce la expresion de proteinas antiapoptoticas e induce la acumulacion de p53, pero no su fosforilacion

Las celulas de los pacientes con LLC/linfoma B de celulas pequenas se incubaron con concentraciones crecientes de I3C (10-100 ^M). En el caso del I3C a 100 ^M, las celulas se preincubaron en presencia o ausencia del inhibidor de las caspasas Z-VAD-fmk 100 ^M. A

las 24 h las celulas se lisaron y sonicaron y se analizo mediante inmunoblot la expresion de

21

5

10

15

20

25

30

las protemas antiapoptoticas MCL1, XIAP, cIAP y p-actina ,asi como los niveles de expresion de p53 y su fosforilacion en distintos residuos de Ser (p53Ser15, p53Ser37 y p53Ser392). La expresion de p-actina se utilizo como control de carga.

La incubacion de celulas de pacientes con LLC/linfoma B de celulas pequenas con cantidades crecientes de I3C causo la reduction de la expresion de las protemas antiapoptoticas MCL1, XIAP y cIAP1/2 (ver Figura 5A). En el caso de MCL1 y de XIAP, la reduccion en su expresion inducida por el I3C se observo claramente a concentraciones de 100 ^M y se previno parcialmente por la incubacion con el inhibidor de caspasas Z-VAD- fmk. Sin embargo, el efecto del I3C sobre la expresion de la cIAP1/2 fue evidente a concentraciones de I3C de 25 ^M y no fue prevenida por la incubacion con Z-VAD-fmk.

Por otra parte, el I3C causo la acumulacion de p53. Sin embargo, esta acumulacion no vino acompanada de la fosforilacion de p53 en las serinas 15, 37 o 392, (ver Figura 5B) lo que indica que el I3C no induce per se dano en el DNA ni la activation de las kinasas ATR, ATM o DNA-PK, lo que sugiere que la acumulacion de p53 es causada por inhibition de la degradacion de p53 por el proteasoma o por activacion transcripcional.

Ejemplo 6. El I3C potencia el efecto de la F-ara-A en la acumulacion y activacion de la protelna supresora de tumores p53 en muestras de pacientes con el p53 no mutado

Las celulas de los pacientes diagnosticados con LLC/linfoma B de celulas pequenas se aislaron por centrifugation en gradiente de densidad y se incubaron sin otras adiciones o en presencia de I3C (25 ^M), F-ara A (0,5 ^g/ml) o una combination de ambos (I3C (25 ^M) ± F-ara A (0,5 ^g/ml)). En el caso del I3C + F-ara-A las celulas se preincubaron con o sin Z- VAD-fmk 100 ^M. A las 24 h las celulas se lisaron y sonicaron y se analizo la expresion de las protemas indicadas o su fosforilacion en serinas mediante Western blot. La expresion de p-actina se utilizo como control de carga.

Para dilucidar el mecanismo por el cual el I3C coopera con la F-ara-A en la induction de muerte de las celulas de pacientes con LLC/linfoma B de celulas pequenas se procedio a estudiar el efecto en la activacion de p53 de dosis subletales de F-ara-A (0,5 ^g/ml) y de I3C (25 ^M), tanto como tratamiento unico como en combinacion (ver Ejemplo 6).

5

10

15

20

25

30

35

En la Figura 6A se muestran los resultados obtenidos en muestras de 2 pacientes con LLC/linfoma B de celulas pequenas que respondieron al tratamiento con F-ara-A. El tratamiento con I3C (25 ^M) no produjo ningun efecto significativo sobre la acumulacion de p53, su fosforilacion (en los residuos Ser15, 37 o 392) o su activacion, determinada por la induction de la expresion de dos protemas dependientes de p53 como son p21WAF y PUMA. Por otra parte, el efecto del tratamiento con F-ara-A causo unicamente un ligero incremento en estos parametros. Sin embargo, el tratamiento combinado de I3C (25 ^M) y F-ara-A (0,5 ^g/ml) causo un claro incremento en la acumulacion y fosforilacion de p53, asi como en la induccion de la expresion de PUMA y de p21WAF, lo que correlaciona con el efecto sinergico en la induccion de muerte celular observado en el tratamiento combinado de I3C y F-ara-A (ver Ejemplo 2). Este dato sugiere que el I3C potencia la actividad antitumoral de la F-ara-A en muestras de LLC/linfoma B de celulas pequenas sensibles a este farmaco potenciando la activacion de p53. Es interesante el hecho de que el I3C es capaz de sinergizar con la F- ara-A en muestras con p53 mutado. Esta cooperacion no parece ser causada ni por un incremento en la fosforilacion de p53, ni en los niveles de PUMA causado por ambos farmacos. Sin embargo, si se observo que la fosforilacion de H2A.X (que es dependiente de dano al DNA) fue significativamente incrementada por la administration conjunta de I3C y F- ara-A (ver Figura 6B). Estos resultados sugieren que existe un mecanismo de cooperation entre el I3C y la F-ara-A que seria independiente de la activacion de p53 y explicaria por que el I3C restaura el efecto anti-tumoral de la fludarabina en pacientes con p53 mutado y/o resistentes a este farmaco (ver Figura 2).

Ejemplo 7. El I3C induce muerte celular en llneas de linfoma de Burkitt positivas para el virus de Epstein-Barr (EBV+ BL, A), pero no en lmeas de Burkitt negativas para este virus (EBV-) (B) ni en lineas linfoblastoides no tumorales (LCL) infectadas con EBV (C)

Las celulas de las distintas lineas celulares se cultivaron en presencia de concentraciones crecientes de I3C (20-200 ^M) por triplicado. Las lineas celulares fueron: EBV+BL: BL-60, Jijoye, Raji, Mutu-1, Daudi, Namalwa. Akata y Rael; EBV-: BL-2, BL-41, DG-75 y Ramos; EBV+LCL:Alewife, IB4, JY y Dana.

A las 48 horas se midio la viabilidad mediante colorimetria y se determino el porcentaje de celulas vivas tomando la condition control como el 100% de viabilidad. Se realizaron un mmimo de tres experimentos por cada lmea celular.

5

10

15

20

25

30

35

Los resultados indicaron que el I3C fue capaz de inducir muerte celular eficientemente en lmeas celulares derivadas de linfomas de Burkitt infectados con el virus de Epstein-Barr (EBV+) (ver Figura 6A) pero no en aquellas lmeas derivadas de pacientes con linfoma de Burkitt esporadico (EBV-) (ver Figura 6B).

La susceptibilidad al I3C mostrada por los linfomas de Burkitt EBV+ y la resistencia a este farmaco de los EBV- sugiere que la infeccion por el virus estaria implicada en que el I3C tenga un efecto toxico sobre las celulas. Sin embargo, el tratamiento con I3C de lmeas linfoblasticas infectadas con EBV no causo ningun efecto en la viabilidad de estas celulas (ver Figura 6). Este resultado puede deberse a que los genes virales expresados y los niveles de expresion de las distintas protemas virales en las celulas de linfoma de Burkitt RBV+ y en las LCL EBV+ son muy diferentes.

Ejemplo 8. Analisis comparativo del efecto citotoxico del I3C con el (6-Metil-1H-indol- 3-il)metanol, el 1H-Indol-3-metanol y con otros derivados indolicos con distintos radicales en el C3 en lmeas de linfoma de Burkitt EBV+

Las celulas de linfoma de Burkitt EBV-positivo BL-60.2 y Raji se cultivaron por triplicado en presencia de concentraciones crecientes (10-200 ^M) de diferentes compuestos indolicos: Indol-3-carbinol (I3Carbinol), (6-Metil-1H-indol-3-il)metanol (MI3Metanol), 1H-Indol-3-amina (I3Amina), 1H-Indol-3-ol (I3-ol), 2,3-Dihidroindol (Indolina), 1H-Indol-2-metanol (I2Metanol), Acido-indol-3-acetico (AI3Acetico), Indol-3-acetonitrilo (I3Acetonitrilo), 3-Formilindol (3- Formil-I), Acido-indol-3-carboxflico (AI3Carboxilico), 3-Dimetilaminometilindol (Gramina), 3- (2-Hidroxietil)-indol (3-(2-Hidroxietil)-I), 5-Metoxiindol-3-ilacetonitrilo (MetoxI3Acetonitrilo), 2- Metil-1H-indol-3 carboxamida (MI3Carboxamida), 3-(Metoximetil)-1H-indol (3-(Metoximetil)- I), y triptofano (Trp). A las 24 horas se midio la viabilidad mediante colorimetria y se determino el porcentaje de celulas vivas tomando la condition control como el 100% de viabilidad (Figura 8A).

Los resultados indicaron que los compuestos indolicos con sustituyentes nucleofflicos, como el 1H-indol-3-ol y el 1H-indol-3-amina, son citotoxicos a concentraciones inferiores al I3C. Asi, la LD50 a las 48 h del I3C en BL60.2 y Raji fue de 129 ^M y 135 ^M, respectivamente, mientras que la del I3-ol fue 2 ^M y 21 ^M, respectivamente, y la del I3-amina fue 103 ^M y 87 ^M, respectivamente. Es interesante mencionar que la adicion de un radical metilo en

position C6 en el I3C (potencio su efecto citotoxico (LD50= 124 ^M y 96 ^M,

24

respectivamente). Otros compuestos indolicos con sustituciones en C3 no alteraron la viabilidad de estas celulas, ni lo hizo el 1H-indol-2-metanol, lo que es indicativo de la necesidad de un residuo nucleofilico en posicion C3 para el efecto citotoxico.

5 Ejemplo 9. El 1H-Indol-3-ol (I3-ol) induce muerte celular a dosis mas bajas que el I3C y esta muerte se revierte al incubar las celulas con el inhibidor de las caspasas ZVAD- fmk

Las celulas BL-60.2 fueron mantenidas en cultivo sin tratar o fueron preincubadas con 10 ZVAD-fmk a 100 ^M durante 30 min. Posteriormente las celulas se trataron con I3-ol (1, 5 y 10 ^M) y 48 horas despues se midio su viabilidad mediante colorimetria y se determino el porcentaje de celulas vivas tomando la condicion control (sin tratamiento) como el 100% de viabilidad.

15 El I3-ol indujo muerte celular muy eficientemente en celulas BL-60.2. Ademas, la muerte celular a concentraciones de 5 ^M puede revertirse eficientemente con el inhibidor de caspasas ZVAD-fmk, lo que indica que el I3-ol induce apoptosis.

TABLA 1: Efecto del I3C y de la F-ara-A sobre la viabilidad de lmeas celulares 20 derivadas de distintos tipos de neoplasias B

CELULAS

Control I3C I3C F-ara-A

100 mM

200 mM 4 jg/ml TIPO CELULAR

RS11846

100 101 ± 6,1 - 37 linfoma folicular

Raji

100 58 ± 1,7 36 ± 1 34 linfoma de Burkitt EBV positivo

BL-60.2

100 52 ± 3 14 ± 2,6 65 linfoma de Burkitt EBV positivo

RPMI8226

100 104 ± 1,2 103 ± 1,7 59 mieloma/plasmacitoma

RL

100 89 ± 4,2 95 ± 3,3 90 linfoma difuso de celulas B grandes , EBV negativo

Daudi

100 42 ± 2,6 35 ± 1,3 98 linfoma de Burkitt EBV positivo

Ramos

100 105 ± 6,8 99 ± 0,4 57 linfoma de Burkitt EBV negativo

380

100 94 ± 1,4 97 ± 1,9 29 linfoma de celulas preB

SUDHL.4

100 97 ± 4,2 91 ± 3,1 31 linfoma difuso de celulas B grandes, EBV negativo

Granta519

100 103 ± 3,6 93 ± 6,5 53 linfoma de manto

Z138

100 100 ± 1,5 91 ± 2,1 53 linfoma de manto

5

10

15

20

25

30

Ejemplo 10. El efecto citotoxico del I3C en celulas tumorales derivadas de distintas neoplasias de celulas B es diferente al de la F-ara-A

Se comprobo el efecto del I3C sobre distintas lmeas celulares derivadas de linfomas B, incluyendo, ademas de las lmeas B de Burkitt EBV+ (BL-60.2, Raji y Daudi) y EBV- (Ramos), lmeas celulares B derivadas de linfoma folicular (RS11846), de mieloma/plasmacitoma (RPMI8226), de linfoma difuso de celulas B grandes (SUDHL-4 y RL), de linfoma preB (380) y de linfoma de manto (Granta 519 y Z138). Para ello las celulas dejaron sin tratar (control) o se trataron con I3C 100 ^M o 200 ^M o con 4 ^g/ml de F-ara-A durante 48 h antes de determinar la viabilidad celular mediante colorimetria. El porcentaje de viabilidad se determino tomando como referencia la viabilidad de las celulas sin tratar (control). Se realizaron 3 experimentos independientes por triplicado en el caso del I3C (se muestra la media del porcentaje de viabilidad ± la desviacion estandar) o 1 experimento por triplicado en el caso de la F-ara-A.

Los resultados indicaron que el efecto mas significativo del I3C sobre la viabilidad celular ocurrio en las lmeas de Burkitt EBV+. Ademas, tambien se comprobo el efecto de la F-ara-A sobre la viabilidad de estas lmeas celulares, observandose que las celulas sensibles a la F- ara-A no lo fueron al I3C y viceversa. De hecho, es interesante mencionar que las celulas que fueron muy resistentes a la F-ara-A como inductor de muerte, como las celulas Daudi, son altamente sensibles al I3C.

Ejemplo 11. El I3C induce la muerte celular de las celulas de las lmeas de Burkitt EBV+ por un mecanismo apoptotico dependiente de caspasas

Las celulas de la lmea de linfoma de Burkitt BL-60.2 se cultivaron sin ninguna adicion (control) o con I3C 200 ^M en presencia del inhibidor de las capasas Z-VAD-fmk (100 ^M) A las 15 horas se determino el porcentaje de celulas viables por marcaje con anexina V FITC/ioduro de propidio y analisis por citometria de flujo. Los resultados mostraron que la muerte celular inducida por el I3C conlleva la exposicion en la superficie celular de la anexina V, la cual se previene por el inhibidor de caspasas Z-VAD-fmk, lo que demuestra que la muerte celular se debio a apoptosis (ver Figura 10A).

5

10

15

20

25

30

Por otra parte, celulas de las lmeas celulares EBV+BL: BL-60.2, Raji; EBV-BL:Ramos; y EBV+LCL: Dana se cultivaron en presencia de concentraciones crecientes de I3C (20-200 ^M). En el caso del I3C a 200 a ^M las celulas se dejaron sin tratamiento adicional o se preincubaron con Z-VAD-fmk. A las 24 horas las celulas se lisaron y sonicaron y se determino la concentration proteica. Se analizo la expresion y el procesamiento de PARP, caspasa 3, 8 y 9 mediante Western blot. La expresion de p65 NFkB se utilizo como control de carga. Los resultados indicaron que el I3C indujo la activation proteolrtica de las caspasas 3, 8 y 9 y la ruptura de PARP en las lmeas de linfoma de Burkitt EBV+ BL60 y Raji, mientras que no lo hizo en la lmea Ramos (Burkitt EBV-) o en Dana (linfoblastoide EBV+) (ver Figura 10B).

Ejemplo 12. El I3C causa la despolarizacion mitocondrial

Las celulas BL-60.2 y Raji se cultivaron con o sin I3C 200 ^M durante 3, 5 y 8 horas. Posteriormente se marcaron con el reactivo fluorescente tetrametilrodamina metil ester (TMRM), para medir la despolarizacion mitocondrial, y se analizaron por citometria de flujo. Como controles positivos se utilizaron celulas cultivadas con medio en presencia de CCCP 25 ^M. Los resultados indican que el I3C fue capaz de inducir eficientemente la perdida de potencial de membrana en celulas BL-60.2 y Raji, como lo refleja la perdida de tincion mitocondrial con TMRM (ver Figura 11).

Ejemplo 13. El I3C no afecta al ciclo celular en las lmeas de linfoma de Burkitt EBV+ BL-60.2

Las celulas BL-60.2 se cultivaron con o sin I3C 200 ^M durante 9, 15 y 24 horas. Posteriormente se tineron con ioduro de propidio (IP) y el contenido de DNA se analizo por citometria de flujo (ver Figura 12). Aunque se observo la induction de muerte celular (pico subGI), esto no se correspondio con ninguna alteration significativa de los porcentajes de celulas en fase G1, S o G2/M en respuesta al tratamiento con I3C comparadas con las celulas control (tratadas con vehiculo) en ninguno de los tiempos analizados, lo que indica que la muerte celular inducida por el I3C es estas celulas es independiente de la fase de ciclo, dado que el incremento en eventos apoptoticos no correlaciono con la disminucion del porcentaje de celulas en cada una de las fases del ciclo celular.

5

10

15

20

25

30

35

Ejemplo 14. El I3C modifica la expresion de diversas protelnas senalizadoras y protelnas pro y antiapoptoticas, como XIAP, cIAP o MCL1, en llneas de linfoma de Burkitt positivas para el virus de Epstein-Barr (EBV+BL) (A y B), pero no en lmeas de Burkitt EBV- (C) ni en lineas linfoblastoides no tumorales (LCL) infectadas con EBV (D)

Se determino el efecto de distintas concentraciones de I3C en los niveles de expresion de protemas implicadas en el control de la muerte celular, en concreto en una selection de protemas de las familias BCL2, IAP y TRAF, todas ellas implicadas en senalizacion y en el control de la apoptosis, en las lineas celulares de linfoma de Burkitt EBV+ BL-60.2 (Figura 13A) y Raji (Figura 13B), en la lmea de linfoma de Burkitt EBV- Ramos (Figura 13C) y en la lmea linfoblastoide EBV+ Dana (Figura 13D).

Las celulas indicadas se cultivaron en presencia de concentraciones crecientes de I3C (20200 ^M). En el caso de las celulas incubadas con 200 ^M de I3C, estas se preincubaron o no con 100 ^M de Z-VAD-fmk. A las 24 horas las celulas se lisaron y sonicaron y se determino la concentration proteica. Se analizo la expresion de las protemas indicadas mediante Western blot. La expresion de p-actina se utilizo como control de carga.

Como se puede observar en las lineas de linfoma de Burkitt EBV+ BL-60.2 (Figura 13A) y Raji (Figura 13B) que fueron sensibles al I3C, las concentraciones de I3C 150 ^M o superiores fueron capaces de reducir drasticamente los niveles de expresion de la protema antiapoptotica MCL1, aunque no tuvieron un efecto significativo sobre la expresion de BCL2, BCLXl o BAX. Igualmente, los niveles de expresion de los miembros de la familia de los inhibidores de apoptosis XIAP y cIAP1/2 fueron drasticamente reducidos, en particular los de cIAP1/2. En contraste con estos resultados, los niveles de expresion de FLIPl (Flice-like inhibiting protein long form) fueron claramente incrementados por el I3C. Existen multiples evidencias que demuestran que FLIPl puede actuar como un activador de las caspasas apicales 8 y 10, aunque tambien se han descrito ejemplos en los que actua como un modulador de la especificidad de la caspasa 8 para determinados sustratos o incluso como un inhibidor de la activacion de las caspasas apicales. En el caso que nos ocupa, la acumulacion de FLIPl parece correlacionar con la induction de la proteolisis y activation de la caspasa 8 (ver Ejemplo 11), lo que sugiere que actua como un modulador positivo de la actividad caspasa.

5

10

15

20

25

30

35

Tambien se estudio el efecto del I3C sobre miembros de la familia de las protemas asociadas a los receptores de TNF (TRAF)1,2 y 3. El I3C redujo hasta niveles indetectables la expresion de TRAF1 y TRAF3, mientras que afecto parcial pero significativamente la expresion de TRAF2. En todos los casos descritos, los efectos sobre la expresion de las protemas estudiadas no parecieron ser dependientes de apoptosis ni de la actividad caspasa, ya que el Z-VAD-fmk no fue capaz de prevenir estos cambios en expresion. Ademas, en la lmea de linfoma de Burkitt EBV- Ramos (Figura 13C) y en la linfoblastoide EBV+ Dana (Figura 13D), que fueron resistentes a muerte inducida por el I3C (ver Ejemplo 7), no existio ninguna alteration en los niveles de expresion de estas protemas en respuesta al I3C, lo que sugiere que el efecto de este farmaco sobre la expresion de estas protemas esta implicado en la sensibilidad de estas lmeas celulares a apoptosis.

Ejemplo 15. El I3C modifica la expresion de diversos factores de transcripcion y protemas virales en lmeas de linfoma de Burkitt positivas para el virus de Epstein- Barr (EBV+ BL) (A y B), pero no en lmeas de linfoma de Burkitt EBV- (C) ni en lmeas linfoblastoides (no tumorales) (LCL) infectadas con EBV (D)

Las celulas de las lmeas celulares BL-60.2 (A), Raji (B), Ramos (C) y Dana (D) se cultivaron en presencia de concentraciones crecientes de I3C (20-200 ^M). En el caso del I3C a 200 a ^M las celulas se dejaron sin tratamiento adicional o se preincubaron con 100 ^M de Z- VAD-fmk. A las 24 horas las celulas se lisaron y sonicaron y se determino la concentration proteica. Se analizo la expresion de los factores de transcripcion p53, E2F1, E2F4, c-MYC, TCL-1, de la protema represora p130 y de la protema viral EBNA1 mediante Western blot. La expresion de p-actina se utilizo como control de carga.

Los resultados indicaron que, como era previsible, cMYC esta sobreexpresado en las lmeas de linfoma de Burkitt BL-60.2 (ver Figura 14A), Raji (ver Figura 14B) y Ramos (ver Figura 14C), pero no en la linfoblastoide EBV+ Dana (ver Figura 14D). Como se puede observar, el I3C indujo una drastica reduction en la expresion de cMYC a partir de 50 ^M en BL-60.2 y de 100 ^M en Raji, ambas lmeas de linfoma de Burkitt EBV+. Sin embargo, el I3C no tuvo ningun efecto sobre la expresion de cMYC en la lmea de Burkitt EBV- Ramos. La desaparicion de cMYC correlaciona con la induction de muerte celular inducida por I3C. No obstante, el efecto del I3C sobre la expresion de cMYC fue independiente de apoptosis, ya que la inhibition de la actividad caspasa por el Z-VAD-fmk no previene la desaparicion de cMYC.

5

10

15

20

25

30

Otros factores de transcripcion que han sido implicados en la etiologia del linfoma de Burkitt, como son p53, E2F1 y TCL1, no vieron su expresion afectada por el I3C en ninguna de las lmeas celulares estudiadas. Sin embargo, otros, como E2F4 y la proteina represora p130 si presentaron una disminucion en su expresion causada por el I3C en BL-60.2 y en Raji, pero esta inhibicion fue prevenida por el Z-VAD-fmk, lo que sugiere que fue causada una vez se ha inducido el proceso apoptotico. Es interesante mencionar que EBNA1, una proteina del EBV que controla la expresion de genes virales tambien fue afectada en su expresion por el I3C (150 ^M) en las lmeas de Burkitt EBV+ BL-60.2 y Raji, pero nuevamente fue un proceso dependiente de apoptosis (ver Figuras 14A y B). Confirmando este punto, EBNA1 no fue afectada por el I3C en la lmea linfoblastoide EBV+ Dana.

Estos resultados sugieren, sobre todo en el caso de cMYC, que el efecto del I3C sobre su expresion no fue directo, sino que requiere de la participation de algun factor presente unicamente en las lmeas de linfoma de Burkitt infectadas con EBV.

Ejemplo 16. El tratamiento con I3C o con su dlmero el diindolilmetano (DIM) reduce el tamano del tumor en ratones xenotransplantados con celulas de la linea de linfoma de Burkitt EBV+ Daudi y aumenta la expectativa de vida de estos ratones

Se inocularon intraperitonealmente 10 x 106 celulas de linfoma de Burkitt EBV+ Daudi en ratones inmunodeprimidos NOD/SCID (n = 28). Esta linea celular genera linfoma diseminado intraperitoneal que causa la muerte del raton entre los 50 y 70 dias desde su inoculation.

Los ratones comenzaron a tratarse 2 semanas despues del xenotransplante con I3C o con DIM, diariamente y mediante sonda gastrica durante 5 dias y descanso de 2, hasta el sacrificio del animal. En el primer caso las dosis diarias administradas fueron 200 mg/Kg de I3C en etanol:aceite de maiz (1:9 v/v; 150 ^l) (grupo I3C, n = 9) o con etanol:aceite (1:9 v/v; 150 ^l) (grupo control, n = 8).

En el segundo caso, las dosis diarias administradas fueron 200 mg/kg de DIM en etanol:aceite de maiz (1:9 v/v; 150 ^l) (grupo DIM, n = 6) o con etanol:aceite (1:9 v/v) (grupo control, n = 5).

5

10

15

20

25

30

35

Se determinaron las curvas de supervivencia de Kaplan-Meier entre los grupos de ratones tratados con I3C y los tratados con etanol:aceite (ver Figura 15 B). Los ratones control comenzaron a presentar smtomas de enfermedad terminal entre los dias 50 y 70 desde la implantacion del tumor, por lo que se sometieron a eutanasia. .Sin embargo, en el caso de los ratones tratados con I3C, estos sobrevivieron una media de 7 dias mas que los no tratados. Aunque el efecto del I3C en supervivencia no fue significativo (p = 0,2) en este experimento, si lo fue el crecimiento del tumor. Como se observa en la Figura 15 A, el tamano del linfoma en los ratones control fue de 8,9 ± 2,9 g mientras que en los tratados con I3C fue de 3,9 ± 1,9 g en el momento del fallecimiento.

En el caso de los ratones tratados con DIM, si que se observo un incremento muy significativo en supervivencia (p = 0,012), y un 50% de los ratones sobrevivieron hasta la finalizacion del experimento (ver Figura 15C). El analisis patologico de estos ratones tratados con DIM que sobrevivieron demuestra la ausencia de linfoma en la cavidad intraperitoneal de los ratones, lo que sugiere que el DIM fue capaz de eliminar in vivo eficientemente a las celulas de linfoma de Burkitt EBV+ Daudi (panel C).

Aunque existen multiples estudios sobre la actividad del DIM en distintos procesos biologicos, hemos observado que el DIM es altamente insoluble en medios acuosos (precipita a concentraciones superiores a 24 ^M), por lo que no se ha podido realizar ningun estudio in vitro relevante sobre la efectividad antitumoral y el mecanismo de accion del DIM. Ademas, la baja solubilidad del DIM en medio acuosos pone en cuestion las conclusiones de los estudios previamente publicados con concentraciones de DIM superiores a 50 ^M.

Ejemplo 17. Analisis de la toxicidad causada en ratones por los tratamientos con I3C, con fludarabina (Flu), I3C o por una combinacion de ambos farmacos

Ratones C57 (n=24) se pretrataron durante 5 dias con 200 mg/Kg de I3C disuelto en etanol:aceite (1:9, v/v; 150 ^l) o unicamente con etanol:aceite (1:9, v/v; 150 ^l) mediante sonda gastrica. El tratamiento con I3C se continuo durante todo el experimento con una pauta de 5 dias de administration consecutivos y descanso de 2. Transcurrida la semana de pretratamiento con I3C, los ratones se dejaron sin tratar o se inocularon intraperitonealmente con 8,75 mg/Kg o 35 mg/Kg de fludarabina durante 5 dias consecutivos, manteniendose el tratamiento con I3C o con vehiculo. Los grupos de tratamiento fueron: Control, n = 3; I3C, n

= 3; Flu 8,75 mg/Kg, n = 4; Flu 35 mg/Kg, n = 4; Flu 8,75+I3C, n = 5; Flu 35+I3C, n = 5.

31

Despues de 3 semanas se inicio un segundo ciclo de tratamiento con fludarabina de 5 dias consecutivos.

Los resultados indican que los distintos tratamientos no causaron una variacion significativa 5 en el peso de los animales (ver Figura 16A). El analisis de las transaminasas hepaticas glutamato-piruvato-transaminasa (GPT) y glutamato-oxalacetato-transaminasa (GOT) demostro que los tratamientos no produjeron ninguna alteracion patologica de estas enzimas (ver Figura 16B). Igualmente, el analisis de la urea en sangre reflejo que no se produjo toxicidad renal aparente (ver Figura 16B). El analisis de las poblaciones linfocitarias 10 de los ratones antes y despues de los tratamientos, mostro que el tratamiento continuado con I3C no produce ninguna alteracion en el numero de granulocitos, linfocitos B o linfocitos T en sangre, ni lo hace en el numero total de leucocitos (ver Figura 16C). El tratamiento con 35 mg/Kg de fludarabina si causo una disminucion en el numero de granulocitos y linfocitos B, aunque solo en el caso de los linfocitos B esta disminucion fue mayor en el tratamiento 15 conjunto I3C/Fludarabina.

Claims (12)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   REIVINDICACIONES

   1.- Uso de un compuesto de formula general (I)

   imagen1

   Ri

   R2

   N

   H

   (I)

   sus sales o solvatos farmaceuticamente aceptables, en la preparation de una composition farmaceutica que es util para el tratamiento de neoplasias linfoides B que se seleccionan de entre leucemia linfatica cronica/linfoma de celulas B pequenas, y linfomas B y de Hodgkin dependientes de infection por el herpesvirus de Epstein-Barr,

   R1 representa un atomo diferente a hidrogeno, de naturaleza electronegativa, libre, como -NH2, -OH, -SH, -PH2, -Cl, -Br, -F, -I, o unido a cadenas alquflicas (-OR, -NR2, -SR, PR2, donde R son preferentemente grupos alquilo); o bien estos mismos grupos mencionados unidos al esqueleto de indol por un atomo de carbono, preferentemente -

   R2 representa hidrogeno, o cadenas alquflicas o atomos halogenos como cloro, bromo, fluor o yodo, o atomos electronegativos unido a cadenas alquflicas (-OR, -NR2, -

   SR, PR2, donde R son preferentemente grupos alquilo lineales o ramificados).
2. 2.- Uso segun la revindication 1, de un compuesto de estructura dimerica de formula general (II),

   R2 y R3 son sustituyentes iguales o distintos y representan hidrogeno, o cadenas alquflicas o atomos halogenos como cloro, bromo, fluor o yodo, o atomos electronegativos unido a cadenas alquflicas (-OR, -NR2, -SR, PR2, donde R son preferentemente grupos alquilo lineales o ramificados).

   donde:

   imagen2

   imagen3

   (II)

   donde:

   5

   10

   15

   20

   25

   30
3. 3. - Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado por que los compuestos de formula general (I) o (II) tienen origen sintetico o natural.
4. 4. - Uso segun la reivindicacion 3, caracterizado por que los compuestos de formula general (I) o (II) proceden de la glucobrassicina de vegetales crudferos.
5. 5. - Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la neoplasia linfoide B es una leucemia linfatica cronica/linfoma de celulas B pequenas de cualquiera de sus variantes y estados.
6. 6. - Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que el linfoma B esta asociada a infecciones del herpesvirus de Epstein-Barr, y se selecciona de entre linfoma de Burkitt, linfoma difuso de celulas B grandes del anciano y linfoma plasmablastico del anciano.
7. 7. - Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado por que la neoplasia linfoide B es un linfoma de Hodgkin asociado a la infeccion por el herpesvirus de Epstein-Barr.
8. 8. - Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3 a 7, donde dicho compuesto se selecciona de entre:

   - indol-3-carbinol -1H-indol-3-ol,

   -1H-indol-3-amina, y -(6-metil-1H-indol-3-il)-metanol.
9. 9. - Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 2 y 3 a 7, donde dicho compuesto es el 3,3’-diindolilmetano.
10. 10. - Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado por que en la preparation de la composition farmaceutica se utiliza adicionalmente, al menos, un excipiente, un adyuvante y/o vehiculos farmaceuticamente aceptables.
11. 11.- Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por que en la preparation de la composition farmaceutica se utiliza adicionalmente, al menos, otro principio activo.

    5 12.- Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado por su

    utilization como adyuvante o neoadyuvante, administrado conjuntamente con radiation y/o combinado con al menos otro principio activo.
12. 13.- Uso segun una cualquiera de las reivindicaciones 11 y 12, caracterizado por que el 10 principio activo utilizado en combination es la fludarabina.