ES2527887A1 - Procedimiento para cuantificar la presencia de un antígeno de Helicobacter pylori en una muestra biológica de origen fecal y kit para cuantificar la presencia de dicho antígeno mediante dicho método - Google Patents

Procedimiento para cuantificar la presencia de un antígeno de Helicobacter pylori en una muestra biológica de origen fecal y kit para cuantificar la presencia de dicho antígeno mediante dicho método Download PDF

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Abstract

Procedimiento para cuantificar la presencia de un antígeno de helicobacter pylori en una muestra biológica de origen fecal y kit para cuantificar la presencia de dicho antígeno mediante dicho método. El procedimiento comprende las etapas de; a) dispersar una muestra de heces en una solución de extracción de dicho antígeno (3), b) diluir una cantidad predeterminada de la dispersión de la etapa a) en una solución diluyente que comprende un compuesto potenciador que incluye polivinil pirrolidona, c) añadir una cantidad predeterminada de una suspensión de reactivo a la dilución de la etapa b) para obtener una mezcla, comprendiendo dicha suspensión de reactivo una dispersión de partículas (1) de látex que están unidas a un anticuerpo (2) monoclonal específico contra dicho antígeno (3), d) detectar en la mezcla de la etapa c) una señal resultante de la formación de un inmunocomplejo (7) antígeno (3)-anticuerpo (2) sobre las mencionadas partículas (1) de látex, potenciando dicho compuesto potenciador la formación de dicho inmunocomplejo (7) sobre dichas partículas (1), e) determinar la concentración de antígeno (3) de dicha muestra de heces.

Description

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DESCRIPCIÓN
PROCEDIMIENTO PARA CUANTIFICAR LA PRESENCIA DE UN ANTÍGENO DE HELICOBACTER PYLORI EN UNA MUESTRA BIOLÓGICA DE ORIGEN FECAL Y KIT 5 PARA CUANTIFICAR LA PRESENCIA DE DICHO ANTÍGENO MEDIANTE DICHO MÉTODO
La presente invención se refiere a un procedimiento y a un kit para implementar dicho procedimiento que permite cuantificar la presencia de un antígeno de Helicobacter pylori en
10 una muestra biológica de origen fecal, como por ejemplo, una muestra de heces humanas.
Antecedentes de la invención
Helicobacter pylori es una bacteria que reside en la parte superior del tracto gastrointestinal
15 del ser humano y está implicada en trastornos gastrointestinales como úlceras pépticas, gastritis, y otras enfermedades que finalmente pueden derivar a cáncer de estómago.
La detección y el diagnóstico de la infección por Helicobacter pylori Ag se puede llevar a cabo mediante técnicas invasivas y no invasivas.
Las técnicas invasivas se basan en biopsias gástricas (supone una pequeña intervención al
20 paciente con el objetivo de obtener una muestra gástrica) y cultivo posterior de las muestras, examen histológico, prueba de la ureasa o métodos de PCR. Todas ellas muestran la presencia del microorganismo de forma directa o indirecta. Aunque desde el punto de vista diagnóstico, estas técnicas pueden ser métodos suficientemente sensibles y específicos, la dificultad de la obtención de la muestra, la incomodidad para el paciente (hay que practicar
25 endoscopia), el tiempo necesario y el coste del método, dificultan en gran medida el uso de estas técnicas. Además, a diferencia de otros microorganismos fecales que pueden cultivarse fácilmente en medios de cultivo ordinarios, en el caso de Helicobacter pylori, este cultivo presenta ciertas dificultades y el microorganismo tiene la capacidad de mutar a formas morfológicas distintas, por lo que es preferible que acudir a otras formas más
30 sencillas de detección del microorganismo.
Entre las técnicas no-invasivas se encuentra la técnicas EIA o técnicas de enzymainmunoensayo que ofrecen la posibilidad de detectar antígenos o anticuerpos de H. pylori o Hp que genera el cuerpo del paciente debido a la infección. Las técnicas EIA que detectan anticuerpos anti-H. pylori emplean antígenos de H. pylori. Sin embargo, se ha
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observado que algunos de los antígenos mayoritarios de H. pylori utilizados en los inmunoensayos EIA son comunes a otras bacterias del mismo grupo que H. pylori, como Campylobacter jeuni y Campylobacter coli, por lo que pueden resultar reacciones inespecíficas. Otro de los problemas de utilizar el antígeno como elemento reactivo de los inmunoensayos para detectar el anticuerpo, es la variabilidad de cepas de este microorganismo que conlleva una gran variación antigénica, por lo que para que el ensayo sea lo suficientemente sensible y específico se precisa utilizar mezclas antigénicas constituidas por diferentes fragmentos de antígenos Helicobacter pylori. Además, los métodos que detectan anticuerpo anti-Helicobacter pylori, son sólo indicativos de la respuesta del paciente frente a la infección, por lo que habiendo eliminado el antígeno (paciente curado) puede ser que el título (concentración de anticuerpos en sangre) sea todavía elevado, cosa que sucede normalmente, ya que el anticuerpo se mantiene algún tiempo después de haberse eliminado la infección (en muchos casos después de 6 meses). Por este motivo, los métodos que detectan anticuerpos son sólo válidos en el estudio de la evolución de la enfermedad, siendo necesario, en la mayoría de casos que se observa un título elevado de anticuerpos anti-Helicobacter pylori, un ensayo invasivo (biopsia) para confirmar el diagnostico.
Los métodos que detectan el antígeno son mejores que los que detectan anticuerpos, puesto que suministran una información real del estado de la infección. La presencia del antígeno en la muestra fecal, significa que la infección persiste.
Entre los métodos que detectan el antígeno de H. pylori en heces, se encuentran métodos cualitativos o de “screening” y métodos cuantitativos. Entre cualitativos destacan los métodos inmunocromatográficos, cuyos resultados muestran la presencia o ausencia del antígeno, con tiempos de ensayo de unos 10-15 min. Los métodos EIA, cuyos tiempos de ensayo son próximos a las 2 horas y precisan instrumentación apropiada, detectan la presencia de antígeno de forma cualitativa y cuantitativa. Sin embargo, estos métodos EIA son bastante más costosos que los anteriores, aunque son mejores en cuanto a sensibilidad y especificidad.
Descripción de la invención
El objetivo de presente invención es el de resolver los inconvenientes mencionados proporcionando un procedimiento y kit para cuantificar la presencia de un antígeno de Helicobacter pylori en un rango de concentraciones del orden de µg/L (ng/mL) que presenta
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la ventaja de ser rápido, automatizable y fácil de usar.
De acuerdo con este objetivo, según un primer aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para cuantificar la presencia de un antígeno de Helicobacter pylori en una
5 muestra biológica de origen fecal que comprende las etapas de; a) dispersar la muestra de heces en una solución de extracción de dicho antígeno, b) diluir una cantidad predeterminada de la dispersión de la etapa a) en una
solución diluyente que comprende un compuesto potenciador que incluye polivinil pirrolidona,
10 c) añadir una cantidad predeterminada de una suspensión de reactivo a la dilución de la etapa b) para obtener una mezcla, comprendiendo dicha suspensión de reactivo una dispersión de partículas de látex que están unidas a un anticuerpo monoclonal específico contra dicho antígeno, d) detectar en la mezcla de la etapa c) una señal resultante de la formación de un
15 inmunocomplejo antígeno-anticuerpo sobre las mencionadas partículas de látex, potenciando dicho compuesto potenciador la formación de dicho inmunocomplejo sobre dichas partículas, y
e) determinar la concentración de antígeno de dicha muestra de heces mediante una curva de calibración que correlaciona dicha señal con la concentración de 20 antígeno de Helicobacter pylori.
De acuerdo con el mismo objetivo, según un segundo aspecto, la presente invención proporciona un Kit para cuantificar la presencia de un antígeno de Helicobacter pylori en una muestra biológica de origen fecal, que se caracteriza por el hecho de que comprende;
25 -una solución diluyente para diluir una cantidad predeterminada de muestra dispersa en una solución de extracción de dicho antígeno, comprendiendo dicha solución un compuesto potenciador que incluye polivinil pirrolidona, y -una suspensión de reactivo para añadir a dicha solución diluyente al objeto de
30 obtener una mezcla, comprendiendo dicha suspensión de reactivo una pluralidad de partículas de látex que están unidas a un anticuerpo monoclonal anti-Hp específico contra dicho antígeno, siendo susceptible de potenciar dicho compuesto potenciador la formación de inmunocomplejos antígeno-anticuerpo sobre dichas partículas de látex.
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Opcionalmente, este kit puede comprender un tubo de toma de muestras con una cavidad
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para depositar la muestra que está provista de una solución de extracción de dicho antígeno. Esta solución de extracción está formulada para evitar las reacciones cruzadas con otros microorganismos fecales y, preferiblemente, comprende un compuesto diluyente seleccionado entre un tampón fosfato, un tampón glicina, un tampón borato y un tampón tris,
5 una sustancia estabilizadora de dicho antígeno seleccionada entre una albúmina bovina, un suero fetal bovino, una caseína, una gelatina, un glicerol y un suero de caballo.
El procedimiento de la presente invención presenta la ventaja de que permite cuantificar de un modo muy rápido y eficiente una baja concentración de Helicobacter pylori de una
10 muestra fecal de heces humanas, en un orden de magnitud de µg/L o ng/mL.
Se ha observado que la adición del mencionado compuesto potenciador en la solución diluyente favorece e incrementa la unión del antígeno disperso presente en la muestra fecal con los complejos anticuerpo-partícula de látex. Esto se traduce en un incremento de la
15 avidez de la formación del inmunocomplejos y en consecuencia un aumento significativo de la sensibilidad del ensayo.
Gracias a todo ello, el procedimiento de la presente invención permite cuantificar concentraciones de Helicobacter pylori en un orden de magnitud de µg/L o ng/mL, y en un
20 tiempo de reacción muy corto, del orden de unos minutos. De este modo se proporciona un procedimiento de cuantificación alternativo a los existentes que permite facilitar al paciente resultados en tiempo real. Al tratarse de un procedimiento que cuantifica la presencia del antígeno, a diferencia de los métodos cualitativos, este procedimiento es una herramienta fiable y muy útil para que el médico pueda dar en tiempo real su diagnóstico al paciente.
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Descripción detallada de la invención
Según una realización preferida, el compuesto potenciador de la solución diluyente comprende polivinil pirrolidona de peso molecular igual o superior a 50.000 Da.
30 Preferiblemente, dicho compuesto potenciador está presente en la solución diluyente de la etapa b) en una concentración comprendida entre 1 g/L y 15 g/L.
Según la misma realización preferida, dicha solución diluyente de la etapa b) incluye,
35 además del mencionado compuesto potenciador, un compuesto diluyente seleccionado entre un tampón fosfato, un tampón glicina, un tampón borato y un tampón tris.
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Esta formulación de la solución diluyente ayuda a reducir las reacciones inespecíficas durante la formación del inmunocomplejo. Opcionalmente, la adición de moléculas inertes y estabilizadoras tales como albúmina bovina, suero fetal bovino, caseína, gelatina, suero de caballo, o un compuesto detergente no-iónico como los de nombre comercial Tritón X-100, Tween-20, Tween-80 de la casa Sigma, contribuye a evitar la unión indeseada en las partículas de látex de partículas contaminantes que están presentes en la muestra fecal.
El compuesto diluyente tipo tampón puede estar presente en la solución diluyente en un rango de concentraciones comprendido entre 20 mmol/L y 200 mmol/L, mientras que las sustancias estabilizadoras de tipo proteico pueden estar presentes en un rango de concentraciones comprendido entre 1g/L y 10 g/L. En caso de añadir detergentes, como por ejemplo los de nombre comercial Triton X-100 o Tween-20 o Tween 80, la concentración de éstos en la solución diluyente será del orden del 0,05% a 2% en peso. . El pH de esta solución diluyente oscila entre 6 y 9.
Preferiblemente, en la etapa d) del procedimiento, la señal que se detecta es un incremento de absorbancia de la mezcla producido por la formación del inmunocomplejo después de un tiempo de incubación T. Este incremento de absorbancia puede ser medido mediante un instrumento espectrofotómetro o un analizador automático similar. El tiempo de incubación T puede ser igual o inferior a 12 minutos.
El procedimiento de la presente invención emplea un anticuerpo monoclonal específico de un antígeno de Helicobacter pylori para formar un inmunocomplejo que provoca una aglutinación o turbidez de la mezcla que contiene la muestra de heces. Esta aglutinación o turbidez es detectada como un incremento de absorbancia durante un tiempo de incubación
T.
El mencionado anticuerpo monoclonal se obtiene comercialmente de la casa Certest Biotec
S.L. para reaccionar de forma cruzada con diferentes cepas de Helicobacter pylori a través de un antígeno común a todas ellas.
El anticuerpo está unido a un sustrato consistente en una pluralidad de partículas de látex que están dispersas en la solución de reactivo. Las partículas de látex pueden ser de polímeros de polistireno sin grupos funcionales o de polímeros con superficie modificada químicamente (grupos –COOH, -HN2, -OH, -CHO, -CONHNH2, –SO3H, -CH2Cl, -SO4H), o polimetilmetacrilato. El tamaño de las partículas de látex está comprendido entre 70 y 350
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nm. La relación entre la cantidad de anticuerpo y la cantidad de látex utilizado puede variar entre 50 y 120 mg de anticuerpo por g de látex.
Preferiblemente, la solución de reactivo de la etapa c) del procedimiento reivindicado posee una concentración de partículas de látex sensibilizadas (complejos látex/anticuerpo) que está comprendida entre el 0,05% y el 0,5% en peso de la solución.
A continuación se describe los pasos realizados para unir el anticuerpo monoclonal anti-Hp a las partículas de látex.
El anticuerpo monoclonal se diluye a una determinada concentración (2 a 6 g/L) en un tampón de los utilizados comúnmente en aplicaciones biológicas. Las partículas de látex se diluyen a una determinada concentración (0,3% a 3% en peso) en el mismo tampón que el anticuerpo.
La unión del anticuerpo monoclonal a las partículas de látex se efectúa por la mezcla de volúmenes adecuados de cada una de las soluciones o suspensiones anteriores, mediante agitación y manteniendo la mezcla (incubación) durante un cierto periodo de tiempo (30 min a 2 h) y a una determinada temperatura (ambiente a 56 ºC).
Con el propósito de eliminar el anticuerpo no absorbido, el complejo de látex y anticuerpo (partículas de látex sensibilizadas con anticuerpo) se somete a unas etapas de lavado mediante centrifugación y posterior resuspensión de las partículas en un tampón que contiene sustancias bloqueantes como albumina bovina BSA, gelatina, caseina, suero de caballo, suero fetal bovino, suero normal de cabra, suero normal de cobaya, compuestos detergentes no iónicos como Tween-20, Triton X-100. Otros métodos de lavado que pueden ser útiles, son la diafiltración, la diálisis y los métodos de filtración por columna.
El inmunocomplejo, libre de anticuerpo en solución, se somete a un proceso de estabilización mediante compuestos estabilizantes de proteínas (“cross-linking” compuestos, como el glutaraldehido y la carbodiimida), con posteriores lavados por centrifugación y resuspensión de los complejos látex-anticuerpo en un tampón de conservación. La concentración final de los complejos látex/anticuerpo en el tampón de conservación o solución de reactivo de la etapa d) puede variar entre 0,05% – 0,5% en peso.
El sedimento de complejos látex-anticuerpo se somete a un proceso de dispersión mediante el uso de sonicador, cuya misión es la disgregación de agregados de látex producidos en el proceso de centrifugación.
Como ejemplos del tampón de dilución del anticuerpo y las partículas de látex se citan:
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tampón glicina, tampón borato, tampón fosfato, tampón tris (Tris[Hidroximetil] aminometano), tampón carbonato, tampón HEPES (N-[2-Hidroxietyil]piperazine-N’-[3-ac. propanosulfonic]), tampón MES (2-[N-morfolino] ac. etanesulfonico), tampón PIPES (Piperazine-N,N’-bis[2-ac. hidroxipropanosulfónico]), tampón acetato, con valores de pH
5 comprendidos entre 5 y 9.
Preferiblemente, la solución de reactivo que comprende la dispersión de partículas de látex sensibilizadas con el anticuerpo, comprende un compuesto diluyente seleccionado entre un tampón glicina, tampón borato, tampón tris, tampón fosfato, , y moléculas estabilizantes de tipo proteico que ayudan a reducir las reacciones cruzadas con otros microorganismos.
10 Entre estas moléculas podemos citar albumina bovina (BSA), suero fetal bovino, suero normal de cabra, suero normal de cobaya, suero normal de caballo, caseína, gelatina y compuestos detergentes no iónicos de nombre comercial Tween-20, Tritón X-100 a concentraciones entre 1g/L y 10 g/L.
15 En la presente invención, por muestra biológica de origen fecal se entenderá preferiblemente una muestra de heces humanas.
Por compuesto potenciador, se entenderá preferiblemente moléculas de polímeros hidrosolubles, como la polivinil pirrolidona, de peso molecular igual o superior a 50.000 Da.
20
Breve descripción de las figuras
Para mejor comprensión de cuanto se ha expuesto se acompañan unos dibujos en los que, esquemáticamente y tan sólo a título de ejemplo no limitativo, se representa un caso
25 práctico de realización.
La figura 1 es una representación gráfica esquemática que muestra la lectura óptica del incremento de absorbancia (Luz transmitida – Luz incidente). Este incremento de absorbancia se produce debido a la turbidez que genera la formación del inmunocomplejo.
30
La figura 2 es una representación gráfica de una curva de calibración que correlaciona una señal de incremento de absorbancia (A) con la concentración de antígeno (µg/L)o (ng/mL) presente una serie de diluciones de calibración.
35 La figura 3 es una representación esquemática que muestra la formación del
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inmunocomplejo antígeno-anticuerpo sobre las partículas de látex.
Descripción de un ejemplo
5 A continuación se describe un ejemplo del procedimiento de la presente invención para cuantificar la presencia de Helicobacter pylori en una muestra de heces fecales humanas. En este ejemplo se emplea un analizador o espectrofotómetro que mide el incremento de unidades de absorbancia (A) producido por la diferencia entre la luz incidente (LI) en la mezcla y la luz transmitida (LT).
10 Toma de muestra
La toma de muestra de heces se lleva a cabo en un tubo recolector que incluye una cavidad provista de una solución de extracción del antígeno, y una varilla recolectora para que el paciente deposite de forma cómoda la muestra de heces en el interior de dicha cavidad.
En el ejemplo que se describe, la solución de extracción incluye 10 mmol/L de tampón
15 fosfato, 85 mmol/L de cloruro sódico, 50 g/L de glicerol y 0,95 g/L de azida sódica, con un pH global comprendido entre 9,0 y 9,6.
Curva de calibración
Para elaborar la curva de calibración se utiliza un reactivo calibrador con una concentración de antígeno aproximada de 600 µg/L.. A partir de este reactivo se preparan las siguientes
20 diluciones en solución salina 9 g/L.
Calibrador 1……..sin diluir…....................600 µg/L Calibrador 2……. dilución 1/2…………....300 µg/L Calibrador 3..........dilución 1/4..................150 µg/L Calibrador 4..........dilución 1/8…….............75 µg/L
25 Calibrador 5……...dilución 1/16…..............37,5 µg/L Calibrador 6…… agua destilada..................0 µg/L
Ensayos de calibración y de la muestra
Tras agitar el tubo recolector para homogeneizar bien la muestra en la solución de
30 extracción se procede a retirar la lámina de aluminio del tubo que sella la cavidad que aloja la solución extractora. Alternativamente, el tubo recolector puede ser insertado directamente
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en el instrumento analizador en aquellos instrumentos provistos de esta modalidad diferencial. Los instrumentos dotados del sistema “cap piercing”, realizan automáticamente el retirado de la lámina de sellado, previo al ensayo de la muestra.
A continuación se procede del siguiente modo; -Ajustar el cero del instrumento a una longitud de onda de 650 nm con agua destilada. -Pipetear por orden de adición en la cubeta de reacción :
Solución diluyente
875 µL
Solución extractora con la muestra o Calibrador o Agua (Blanco)
125 µL
Suspensión de reactivo
125 µL
-Mezclar bien y leer la absorbancia inmediatamente (A1) y a los 10 minutos (A2) de la primera lectura.
10 -Calcular la diferencia de absorbancias (A2-A1) de cada punto de la curva de calibración y representar los valores obtenidos frente a las concentraciones de antígeno H.pylori de cada dilución del calibrador. La concentración de antígeno H.pylori en la muestra se calcula por interpolación de su incremento de absorbancia (A2-A1) en la curva de calibración.
15
En el ejemplo que se describe, la solución diluyente incluye 0,1 mol/L de tampón borato, 85 mmol/L de cloruro sódico, 10 g/L de polivinil pirrolidona y 0,95 g/L de azida sódica, con un pH global de 6,8 a 7,4.
Por lo que se refiere a la solución de reactivo, ésta incluye una mezcla de 1,25 g/L
20 partículas de látex poliestireno con 125 mg/L de anticuerpo monoclonal anti-Helicobacter pylori en 0,1 mol/L de tampón borato, 85 mmol/L de cloruro sódico, 5 g/L de albúmina bovina o BSA y 0,95 g/L de azida sódica, con un pH global comprendido entre 7,9 -8,3. En esta solución el porcentaje en peso de partículas de látex sensibilizadas con el anticuerpo es del 0,125%.
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Tabla 1 de resultados de los ensayos de calibración, expresados como incremento de unidades de absorbancia A:
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Calibrador Hp
Concentración antígeno Helicobacter pylori (µg/L) A1 A2 A2-A1
6
0 0,750 0,750 0,000
5
37,5 0,756 0,776 0,020
4
75 0,768 0,809 0,041
3
150 0,752 0,834 0,082
2
300 0,761 0,917 0,156
1
600 0,758 1,038 0,280
La figura 2 muestra la representación gráfica de los valores de la Tabla 1 de la curva de calibración.
Tabla 2 de resultados del ensayo de la muestra de heces humanas, expresados como incremento de unidades de absorbancia A:
Muestra
A1 A2 A2-A1
X
0,759 0,909 0,150
Para determinar la concentración de antígeno Helicobacter pylori en la muestra de heces se procede a extrapolar el incremente de absorbancia A2-A1 de la muestra en la curva de
10 calibración. En el ejemplo que se describe, para un incremento de absorbancia de 0,150 unidades A se obtiene una concentración de 300 µg/L de antígeno Helicobacter pylori (ver figura 2).
El incremento de absorbancia se produce como consecuencia de la turbidez que provoca el inmunocomplejo 7 formado a partir de la aglutinación de las partículas de látex 1 15 sensibilizadas con el anticuerpo y el antígeno especifico, que produce un cambio en la transmisión de la luz incidente 5 de la mezcla. La figura 3 muestra una representación esquemática del fenómeno de formación del inmunocomplejo 7 sobre las partículas de látex 1 que incluyen el anticuerpo monoclonal 2 específico contra el antígeno 3 de Helicobacter pylori. El cambio de absorción o variación entre la luz incidente 5 y la luz transmitida 6 se
20 mide mediante un espectrofotómetro 4 (ver figura 1).

Claims (8)

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    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para cuantificar la presencia de un antígeno (3) de Helicobacter pylori en una muestra biológica de origen fecal que comprende las etapas de; 5 a) dispersar una muestra de heces en una solución de extracción de dicho antígeno (3),
    b) diluir una cantidad predeterminada de la dispersión de la etapa a) en una solución diluyente que comprende un compuesto potenciador que incluye polivinil pirrolidona,
    10 c) añadir una cantidad predeterminada de una suspensión de reactivo a la dilución de la etapa b) para obtener una mezcla, comprendiendo dicha suspensión de reactivo una dispersión de partículas (1) de látex que están unidas a un anticuerpo (2) monoclonal específico contra dicho antígeno (3), d) detectar en la mezcla de la etapa c) una señal resultante de la formación de
    15 un inmunocomplejo (7) antígeno (3)-anticuerpo (2) sobre las mencionadas partículas (1) de látex, potenciando dicho compuesto potenciador la formación de dicho inmunocomplejo (7) sobre dichas partículas (1), y
    e) determinar la concentración de antígeno (3) de dicha muestra de heces mediante una curva de calibración que correlaciona dicha señal con la 20 concentración de antígeno (3) de Helicobacter pylori.
  2. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho compuesto potenciador está presente en la solución diluyente de la etapa b) en una concentración comprendida entre 1 g/L y 15 g/L.
    25
  3. 3. Procedimiento según la reivindicación 1, donde, en la etapa b), el compuesto potenciador de la solución diluyente comprende polivinil pirrolidona de peso molecular igual o superior a 50.000 Da.
    30 4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha solución diluyente de la etapa b) incluye además,
    -un compuesto diluyente seleccionado entre un tampón fosfato, un tampón glicina, un tampón borato y un tampón tris.
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  4. 5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, en la etapa d), dicha señal es un incremento de absorbancia de dicha mezcla producido por la formación de dicho inmunocomplejo (7) después de un tiempo de incubación (T), siendo susceptible dicho incremento de absorbancia de ser medido mediante un instrumento
    5 espectrofotómetro o similar.
  5. 6. Procedimiento según la reivindicación 5, en el que dicho incremento de absorbancia se lleva a cabo después de un tiempo de incubación (T) igual o inferior a 12 minutos.
    10 7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dichas partículas (1) de látex que están unidas a dicho anticuerpo (2) monoclonal anti-Helicobacter pylori están presentes en la suspensión de reactivo de la etapa d) en un porcentaje en peso comprendido entre 0,05% y 0,5%.
    15 8. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que dichas partículas de látex (1) son de un tamaño comprendido entre 70 nm y 350 nm.
  6. 9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, en la etapa a), la dispersión de la muestra de heces fecales se lleva a cabo en una solución de
    20 extracción de dicho antígeno (3) que está contenida en un tubo de toma de muestra de dichas heces.
  7. 10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que, en la etapa a), dicha solución de extracción comprende;
    25
    -un compuesto diluyente seleccionado entre un tampón fosfato, un tampón glicina, un tampón borato y un tampón tris, y -una sustancia estabilizadora de dicho antígeno seleccionada entre albúmina bovina (BSA), suero fetal bovino, caseína, gelatina y suero de caballo, suero 30 de cabra y glicerol.
  8. 11. Kit para cuantificar la presencia de un antígeno (3) de Helicobacter pylori en una muestra biológica de origen fecal según el procedimiento de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado por el hecho de que comprende;
    35
    -una solución diluyente para diluir una cantidad predeterminada de muestra
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    dispersa en una solución de extracción de dicho antígeno (3), comprendiendo dicha solución un compuesto potenciador que incluye polivinil pirrolidona, y
    -una suspensión de reactivo para añadir a dicha solución diluyente al objeto de obtener una mezcla, comprendiendo dicha suspensión de reactivo una
    5 pluralidad de partículas (1) de látex que están unidas a un anticuerpo (2) monoclonal específico contra dicho antígeno (3), siendo susceptible de potenciar dicho compuesto potenciador la formación de un inmunocomplejo
    (7) antígeno (3)-anticuerpo (2) sobre dichas partículas (1) de látex.
    10 12. Kit según la reivindicación 11, que comprende un tubo de toma de dicha muestra, incluyendo dicho tubo una cavidad provista de una solución de extracción de dicho antígeno (3).
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