ES2491965B1

ES2491965B1 - Procedimiento biológico para la degradación de mezclas complejas de hidrocarburos en fase acuosa

Info

Publication number: ES2491965B1
Application number: ES201330334A
Authority: ES
Inventors: José Luis NIQUI ARROYO; Sonia FERNÁNDEZ CIFUENTES; Amalia De Arrixaca ROCA HERNÁNDEZ; Jennifer Solano Parada
Original assignee: Ingenieria y Economia del Transporte SA; Bio-Iliberis Research and Development SL
Current assignee: Ingenieria y Economia del Transporte SME MP SA; Bio-Iliberis Research and Development SL
Priority date: 2013-03-08
Filing date: 2013-03-08
Publication date: 2015-11-30
Anticipated expiration: 2033-03-08
Also published as: WO2014135735A2; ES2491965A2; ES2491965R1; WO2014135735A3

Abstract

Procedimiento biológico para la degradación de mezclas complejas de hidrocarburos en fase acuosa.#El procedimiento biológico para reducir el contenido de hidrocarburos presentes en un medio acuoso que comprende una mezcla de hidrocarburos que contiene, al menos, un alcano alifático; al menos, un hidrocarburo aromático policíclico (HAP); y, al menos, un hidrocarburo aromático seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno y sus combinaciones, comprende poner en contacto dicho medio acuoso contaminado por dicha mezcla de hidrocarburos con una mezcla bacteriana que comprende, al menos, una bacteria que degrada un alcano alifático; al menos una bacteria que degrada un HAP; y, al menos, una bacteria que degrada dicho hidrocarburo aromático, El procedimiento puede incluir un tratamiento químico o fotoquímico previo al biológico del medio acuoso contaminado. Se describen bacterias capaces de degradar dichos hidrocarburos.

Description

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DESCRIPCION

Procedimiento biologico para la degradation de mezclas complejas de hidrocarburos en fase acuosa.

CAMPO DE LA INVENCION

La invention se relaciona, en general, con la elimination de hidrocarburos presentes en mezclas complejas de hidrocarburos en fase acuosa. En particular, la invencion se relaciona con la degradacion in-situ de una mezcla compleja de hidrocarburos en fase acuosa mediante un procedimiento biologico basado en el uso de unas bacterias capaces de degradar dichos hidrocarburos, opcionalmente combinado con un procedimiento fisicoqulmico o fotoqulmico. La invencion tambien se relaciona con unas bacterias capaces de degradar dichos hidrocarburos, asl como con unas mezclas de dichas bacterias opcionalmente junto con otras bacterias capaces de degradar hidrocarburos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

Durante las ultimas decadas el uso de combustibles fosiles no ha cesado de aumentar paulatinamente en todo el mundo, especialmente en lo que se refiere a los productos derivados del petroleo, tales como gasoil, gasolina, querosenos, etc. Desgraciadamente este aumento de consumo se ha traducido al mismo tiempo en la generation de un mayor volumen de residuos, los cuales deberan ser sometidos necesariamente a algun tipo de tratamiento que minimice sus efectos negativos sobre el medio ambiente. Todas aquellas instalaciones donde se lleven a cabo actividades que generen residuos deberan implantar un sistema de gestion ambiental acorde con los estandares adecuados, requisito este de obligado cumplimiento para la obtencion de la correspondiente certification ambiental o autorizacion de vertido. Una adecuada gestion de todos los residuos generados en cualquier actividad, ya esten catalogados o no como residuos toxicos y peligrosos (RTPs), facilita el desarrollo sostenible de dicha actividad, haciendola compatible al mismo tiempo con el medioambiente. En todo sistema de gestion ambiental, y siempre que las circunstancias particulares lo permitan, la reutilizacion, revalorization y/o reciclaje de dichos residuos debera prevalecer sobre otros tratamientos menos respetuosos con el medio, como por ejemplo la inertization, incineration o deposito en vertederos. Los residuos peligrosos precisan de un mayor control y vigilancia, y a diferencia de los no peligrosos, no pueden ser libremente manipulados y requieren por tanto la intervencion de un gestor autorizado para su retirada y procesamiento.

En el caso particular de fases acuosas contaminadas con hidrocarburos, ambito de aplicacion de esta invencion, e independientemente de la naturaleza de la actividad que genere el residuo, una instalacion tlpica para la separation del hidrocarburo incluye una serie de etapas, en las que por medios meramente flsicos, tales como tamizado, filtration, sedimentation o coalescencia, se lleva a cabo la separacion tanto de los solidos como de los hidrocarburos contenidos en las aguas de entrada a la unidad separadora. Las aguas clarificadas abandonan de forma continua el separador dirigiendose hacia el punto de vertido autorizado. La calidad de estas aguas, de acuerdo con los parametros establecidos por el Plan Hidrologico correspondiente, debera ser avalada mediante analisis flsicos y qulmicos periodicos realizados por un servicio acreditado de control de calidad de aguas. Aun asl, y de forma periodica, un gestor autorizado debera proceder a la retirada de la fase acuosa contaminada que permanece en el separador y eventualmente, cuando sea necesario, tambien de los solidos acumulados en el fondo del separador. No obstante, los gastos generados como consecuencia de la gestion y tratamiento de estos residuos son elevados, debiendo realizarse un numero variable de vaciados anuales, que dependera fundamentalmente del regimen de lluvias registrado y/o del volumen de solidos acumulados en la unidad separadora. Sobre el generador del residuo

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recaen asimismo los costes relacionados con el transporte de este hasta la planta de tratamiento asl como los gastos del tratamiento propiamente dicho.

Los niveles de referencia impuestos por las distintas autoridades medioambientales, con una marcada tendencia a ser cada vez mas restrictivos, han venido impulsando desde hace tiempo el desarrollo de tecnologlas eficaces y de bajo coste que apliquen el principio basico de la elimination del contaminante antes que un cambio de fase o su traslado a una ubicacion diferente. En este contexto, el tratamiento biologico in-situ de los contaminantes organicos es considerado hoy en dla como una alternativa razonable frente a otros tratamientos mas “tradicionales”, siempre y cuando las circunstancias especlficas no requieran una actuation a corto plazo. Estos tratamientos biologicos se basan en la capacidad de ciertos microorganismos, generalmente aerobios, para degradar los compuestos de interes, transformandolos en productos de menor peligrosidad o completamente inocuos. No obstante, para que la degradation biologica tenga lugar deben de cumplirse dos requisitos basicos: 1) disponer de microorganismos capaces de degradar el contaminante o contaminantes objetivo y 2) que el contaminante se encuentre en una forma disponible y accesible para su interaction con el microorganismo, o bien que el propio microorganismo, mediante algun proceso biologico, como por ejemplo la production de biosurfactantes, lo haga biodisponible.

En este sentido, los alcanos alifaticos habitualmente presentes en combustibles de amplio uso tales como gasolina o gasoil, y en otros mas especlficos como Jet A1, de empleo frecuente en aviation comercial, pueden ser aprovechados como fuente de carbono y energla por una relativamente amplia variedad de microorganismos. Esta documentada la capacidad de bacterias de los generos Pseudomonas, Acinetobacter (Singer y Finnerty, “Microbial Metabolism of straight-chain and branched alkanes” (1984), Atlas R.M. Ed. Petroleum Microbiology, McMillan Publishing, Co, USA; 2-32) Arthrobacter y Bacillus (Kachholz y Rehm, “Degradation of long-chain alkanes by Bacilli II. Metabolic pathways”. European Journal of Applied Microbiology, 6; 39-54) para degradar alcanos alifaticos con cadenas de entre 13 y 20 carbonos (Vivas-Jimenez et al., “Identification y caracterizacion de una bacteria degradadora de parafinas”, (2008), Investigation Universitaria Multidisciplinaria, 51-60). Se ha comprobado incluso que la degradacion de algunos compuestos aromaticos por Pseudomonas depende en algunos casos de los metabolitos producidos durante la degradacion de alcanos alifaticos por especies de Acinetobacter (Kamukai-Nakamura et al., “Construction of bacterial consortes that degrade Arabian light crude oil”, (1996), Journal of Fermentation and Bioengineering, 82 (6); 570-574). Sin embargo, no existen demasiados informes sobre microorganismos capaces de degradar alcanos alifaticos de mas de 20 carbonos. Se ha descrito que la cepa Acinetobacter sp M-1 es capaz de degradar compuestos de hasta 44 carbonos (Sakai et al., “Use of long- chain n-alkanes (C13-C44) by an isolate, Acinetobacter sp M-1”, (1994), Biosci. Biotech. Biochem., 58; 2128-2130) en tanto que Acinetobacter calcoaceticus S30 hace lo propio con octacosano, alcano alifatico de 28 carbonos (Lai et al., “Mineralisation of 14C-octacosane by Acinetobacter calcoaceticus S30”, (1996), Can. J. Microbiol., 42; 1225-1231). Asimismo, la cepa Arthrobacter nicotianae KCCB35 degrada compuestos de hasta 40 carbonos (Radwan et al., “Uptake and utilization of n-octacosane and n-nonacosane by Arthobacter nicotianae KCCB35”, (1996), J.Appl. Bacteriol., 80; 370-374) mientras que la cepa Rhodococcus sp. Q15 muestra capacidad para la degradacion a baja temperatura no solo de alcanos alifaticos puros (de 8 a 32 carbonos) sino tambien mezclas de estos, como por ejemplo diesel (Whyte et al., “Biodegradation of variable-chain-length alkanes at low temperature by a psychotropic Rhodococcus”, (1998), Appl. Environ. Microbiol, 64; 2578-2584). Vivas-Jimenez y col. aislaron y caracterizaron la cepa Pseudomonas aeuroginosa AP-1, que mostro actividad degradadora para alcanos alifaticos entre 11 y 40 carbonos, con un maximo para el eicosano, compuesto alifatico de 20 carbonos (Salgado-Brito et al., “Degradacion de n-alcanos por Pseudomonas aeruginosa MGP-1”, (2008), Investigacion Universitaria Multidisciplinaria, 7; 123-132).

Por su parte, los compuestos aromaticos destacan en general por presentar una marcada estabilidad termodinamica, consecuencia de la energla de resonancia asociada a la

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deslocalizacion de los electrones n en los anillos bencenicos (Mastandrea et al., “Hidrocarburos aromaticos policlclicos. Riesgos para la salud y marcadores biologicos”, (2005), Acta Bioquim. Clin. Latinoam., 39 (1); 27-36). Constituidos en su mayorla, y de forma similar a los alcanos, por atomos de carbono e hidrogeno, muestran una elevada hidrofobicidad, lo que unido a su estabilidad les convierte en compuestos especialmente recalcitrantes y persistentes en el medio ambiente. Dentro de los compuestos aromaticos, los BTEX (acronimo de benceno, tolueno, etilbenceno y mezcla de xilenos) y los HAPs (hidrocarburos aromaticos policlclicos) destacan por su amplia distribution en el medioambiente. Los primeros son compuestos metilados derivados del benceno en tanto que los segundos son compuestos que presentan estructuras con un numero variable de anillos bencenicos condensados, ya sea en disposition lineal o angular. La procedencia de estos compuestos es variada pero las fuentes mas importantes son la pirolltica y la petrogenica. En la fuente pirolltica se encuadran todas aquellas combustiones incompletas de la materia organica, bien de forma natural (actividad volcanica, incendios forestales, etc.), o bien antropogenica (uso de combustibles fosiles, ya sea en motores de explosion o en calefaccion, incineration de residuos, procesos industriales, uso de sustancias que incorporen a estos compuestos en su composition, etc.). El calor generado a las elevadas temperaturas alcanzadas durante los procesos de combustion produce la rotura de los compuestos organicos, generandose una serie de fragmentos y radicales que se recombinan para dar lugar a los HAPs.

Se han descrito varios generos bacterianos que tienen la capacidad de degradar hidrocarburos aromaticos policlclicos (HAP), entre los que se encuentran Mycobacterium, Sphingomonas
(Uyttebroek, M.,
Ortega-Calvo, J.J.,
Breugelmans, P y
Springael, D. “Comparison of mineralization of solid-sorbed phenanthrene by polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH)- degrading Mycobacterium spp. and Sphingomonas spp”. Appl Microbiol Biotechnol 72(4):829- 36. 2006), Enterobacter, Pseudomonas, Pantoaea, Stenotrophomonas
(Molina, M.C.,
Gonzalez, N.,
Bautista, L.F.,
Sanz, R.,
Simarro, R.,
Sanchez, I., y
Sanz, J.L. “Isolation and genetic identification of PAH degrading bacteria from a microbial consortium”. Biodegradation 20(6):789-800. 2009) y Acidovorax sp. (Singleton D.R.,
Ramirez, L.G and
Aitken, M.D. “Characterization of a polycyclic aromatic hydrocarbon degradation gene cluster in a phenanthrene-degrading Acidovorax strain”. Appl Environ Microbiol 75(9):2613-20. 2009).

En el caso particular de los alcanos, cuanto menor sea la longitud de la cadena hidrocarbonada menor sera tambien su resistencia a la biodegradation, por lo que la rotura previa de los compuestos con un peso molecular relativamente alto (a partir de 15-20 carbonos) o bien de aquellos alcanos que presenten ramificaciones o estructuras clclicas (cicloalcanos), puede favorecer su biodegradacion en mezclas complejas de hidrocaburos (HCs) sometidas a un posterior tratamiento biologico. Este tratamiento biologico debera ser llevado a cabo preferiblemente por un consorcio o mezcla de microorganismos que en conjunto permitan degradar un amplio espectro de hidrocarburos. De la misma manera se pueden atacar los compuestos aromaticos mono o policlclicos, los cuales podrlan ser mas facilmente biodegradados en el caso de que los anillos fuesen atacados previamente por otros medios.

Los procesos de oxidation avanzados (POAs), como via para promover la rotura inicial de las moleculas de mayor tamano en otras mas pequenas, pueden ser una option interesante para el tratamiento previo de mezclas complejas de hidrocarburos, ya que facilitarlan de una manera significativa el desarrollo de los procesos biologicos que fuesen aplicados posteriormente. De hecho, existen estudios que evidencian un aumento en la biodegradacion de compuestos recalcitrantes, tales como dinitrotolueno y 4-nitroanilina, en efluentes sometidos previamente a un tratamiento de oxidacion con peroxido de hidrogeno y ozono (Saupe et al., “Ozonation of 2,4-dinitrotoluene and 4-nitroaniline as well as improved disolved organic carbon removal by sequential ozonation-biodegradation”, (1998), Wat. Environ. Res., 70; 146-154). Gutierrez et al. tambien encontraron un aumento en el Indice de biodegradabilidad en aguas de formation tras un tratamiento con ozono (Gutierrez et al., “Efecto de la aplicacion de ozono sobre la

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biodegradabilidad de aguas de formation”, (2002), Multiciencias 2; 50-54). Un pretratamiento similar condujo a una mejora en la biodegradabilidad de alpechln, residuo de conocida resistencia al ataque bacteriano (Beltran de Heredia et al., "Treatment of black-olive wastewaters by ozonation and aerobic biological degradation”, (2000), Wat. Res. 34; 3314-3522). Los POAs han ido adquiriendo un mayor protagonismo en el tratamiento de aguas residuales y los estudios sobre sus posibles aplicaciones han aumentado considerablemente en los ultimos anos. Se han mostrado eficaces tambien en el tratamiento de pesticidas (Prado et al, "Comparison of different advanced oxidation processes involving ozone to eliminate atrazine”, (1999), Ozone Science and Engineering, 21; 39-52), productos farmaceuticos (Quispe et al., "Degradation de compuestos farmaceuticos en agua por ozonizacion”, (2008), Rev. Soc. Quim. Peru, 74; 260-268), compuestos organicos clorados, tales como clorobencenos (Cortes et al., "Estudio de degradacion qulmica de clorobencenos mediante tecnicas de oxidation avanzadas”, (1997), Medio Ambiente-RETEMA, 58; 70-74) y derivados del cloroetileno (Kubasake et al., "Destruction rate of volatile organochlorine compounds in water by ozonation with UV radiation”, (1991), Wat. Res. 25; 1199-1203). Un aditivo habitual en los combustibles es el metil tert-butil eter (MTBE), el cual ha sido tambien tratado con exito mediante una mezcla de peroxido de hidrogeno y ozono (Safarzadeh-Amiri et al., "O3/H2O2 treatment of methyl-tert- butyl ether (MBTE) in contaminated waters”, (2001), Wat. Res. 35; 3706-3714).

Los POAs presentan como principales ventajas que: a) pueden aplicarse para el tratamiento de casi la totalidad de aguas residuales que incorporen compuestos organicos recalcitrantes, b) son susceptibles de ser usados de forma individual o bien combinados entre ellos mismos o con tratamientos de agua convencionales y c) son idoneos para la elimination de compuestos formados durante otros tratamientos previos, ya que son efectivos incluso a muy bajas concentraciones de contaminante (Domenech et al., "Procesos avanzados de oxidacion para la eliminacion de contaminantes”, (2001), RED CYTED VIII-G, Comision Nacional de Energla Atomica, Buenos Aires, Capltulo 1, 3-26). Estos tratamientos se basan en general en el fuerte poder oxidante asociado a los radicales libres (R ), especies qulmicas transitorias que se caracterizan por poseer electrones desapareados en la molecula, lo cual les confiere una gran reactividad y por consiguiente, unos tiempos de vida media extremadamente cortos (Glaze et al., "The chemistry of water treatment processes involving ozone, hydrogen peroxide and ultraviolet radiation”, (1987), Ozone Science and Engineering, 9; 335-352). Destaca especialmente el radical hidroxilo (OH), con un potencial de oxidacion de 2,80 V, solo superado por el del fluor, y con capacidad para atacar a practicamente todos los compuestos organicos, siendo su velocidad de reaccion del orden de 106-1012 veces superior a la del ozono (Domenech et al., "Procesos avanzados de oxidacion para la eliminacion de contaminantes”, (2001), RED CYTED VIII-G, Comision Nacional de Energla Atomica, Buenos Aires, Capltulo 1, 3-26). Aunque los procesos radicalarios son por si mismos complejas reacciones en cadena, y por lo tanto, autoalimentados, la eficacia en la generation de nuevos radicales libres puede acelerarse mediante un aporte adicional de energla, generalmente en forma de radiation ultravioleta (UV), normalmente a longitudes de onda (A) de 254 nm o inferiores (POAs fotoqulmicos).

La presente invention se relaciona, por tanto, con la implementation de un sistema de tratamiento in-situ de residuos acuosos contaminados con hidrocarburos mediante un tratamiento biologico del contaminante que, opcionalmente, puede verse complementado con diversos pretratamientos de naturaleza fisicoqulmica o fotoqulmica o bien con diferentes combinaciones de estos. Esto disminuye de forma notable los costes asociados a la gestion de los residuos al tiempo que significa una desaparicion efectiva del contaminante y facilita la reutilizacion de estas aguas para otras actividades o usos.

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COMPENDIO DE LA INVENCION

Los inventores han identificado bacterias de los generos Rhodococcus, Bacillus, Pseudomonas, Acinetobacter y Pseudoxanthomonas, con capacidad para degradar alcanos alifaticos con cadenas de 8 a 36 atomos de carbono, compuestos aromaticos mono- y poli- clclicos de hasta 3 anillos bencenicos (cuando incorporan, por ejemplo, el plasmido TOL (pWW0) e hidrocarburos aromaticos policlclicos (HAPs), por lo que pueden utilizarse solas o combinadas con otros microorganismos para degradar alcanos alifaticos, por ejemplo, octano, dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, triacontano, hexatriacontano, etc., compuestos aromaticos mono- y poli-clclicos de hasta 3 anillos bencenicos, por ejemplo, BTEX, etc., y HAPs, por ejemplo, naftaleno, fenantreno, etc., en un proceso que permite eliminar hidrocarburos en fases acuosas contaminadas. Las bacterias identificadas presentan ademas capacidad de adhesion a un soporte de material plastico, por lo que pueden ser aplicadas a la biorremediacion de fases acuosas contaminadas con hidrocarburos en forma de biofilm o biopellcula adheridos a algun tipo de superficie solida.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

1. Procedimiento biologico para reducir el contenido de hidrocarburos en un medio acuoso que comprende dichos hidrocarburos

En un aspecto, la invencion se relaciona con un procedimiento biologico para reducir el contenido de hidrocarburos presentes en un medio acuoso que comprende una mezcla de hidrocarburos, en adelante “procedimiento de la invencion”, en donde dicha mezcla de hidrocarburos comprende

a) un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, triacontano, hexatriacontano y sus combinaciones;

b) un hidrocarburo aromatico policlclico (HAP) seleccionado del grupo formado por naftaleno y fenantreno, y sus combinaciones; y

c) un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno y sus combinaciones (BTEX),

comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto dicho medio acuoso contaminado por dicha mezcla de hidrocarburos con una mezcla bacteriana que comprende

- al menos una bacteria que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, triacontano, hexatriacontano y sus combinaciones;

- al menos una bacteria que degrada un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones; y

- al menos una bacteria que degrada un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno y sus combinaciones (BTEX).

En el sentido utilizado en esta description, la expresion “reducir el contenido de hidrocarburos presentes en un medio acuoso que comprende una mezcla de hidrocarburos” incluye tanto la elimination practicamente total de los hidrocarburos presentes en dicho medio acuoso que comprende dicha mezcla de hidrocarburos como la reduction de la cantidad de hidrocarburos

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presentes en dicho medio acuoso que comprende dicha mezcla de hidrocarburos, en donde dicha mezcla de hidrocarburos comprende los hidrocarburos cuyo contenido se desea reducir. Ventajosamente, el contenido de hidrocarburos en dicho medio acuoso es reducido, mediante el procedimiento de la invention, hasta niveles permitidos por la legislation o que no resulten nocivos para la salud humana o animal y/o para el medio ambiente. Por tanto, la expresion "reducir el contenido de hidrocarburos presentes en un medio acuoso que comprende una mezcla de hidrocarburos”, en el sentido utilizado en esta description, es sinonima o equivalente a degradar hidrocarburos presentes en un medio acuoso que comprende una mezcla de hidrocarburos, en donde dicha mezcla de hidrocarburos comprende la totalidad o parte de los hidrocarburos a degradar.

El procedimiento de la invencion es un “procedimiento biologico”, es decir, es un procedimiento basado en la capacidad de ciertos microorganismos, generalmente aerobios, para degradar los compuestos de interes, transformandolos en productos de menor peligrosidad o completamente inocuos. Aplicado a la presente invencion, el procedimiento biologico de reduction del contenido (o degradation) de los hidrocarburos presentes en un medio acuoso que comprende una mezcla de hidrocarburos es un procedimiento basado en la capacidad de ciertas bacterias aerobias para degradar dichos hidrocarburos, tales como los alcanos alifaticos, HAPs y BTEX contenidos en la mezcla de hidrocarburos, transformandolos en productos de menor peligrosidad o completamente inocuos.

En el sentido utilizado en la presente descripcion, el termino “mezcla de hidrocarburos” incluye cualquier mezcla de hidrocarburos que comprende:

b) un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno y fenantreno, y sus combinaciones; y

c) un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno y sus combinaciones (BTEX)

La composition concreta de la mezcla de hidrocarburos puede variar ampliamente a nivel de los hidrocarburos presentes en dicha mezcla, aunque debera contener, al menos, un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, triacontano, hexatriacontano y sus combinaciones, al menos, un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno y fenantreno, y sus combinaciones, y, al menos, un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno y sus combinaciones (BTEX).

Asimismo, la cantidad o concentration de cada hidrocarburo presente en dicha mezcla de hidrocarburos puede variar ampliamente dependiendo, entre otros factores, del origen de la mezcla de hidrocarburos. De hecho, las fracciones mayoritarias de hidrocarburos presentes en dicha mezcla de hidrocarburos tambien pueden variar ampliamente; no obstante, en una realization particular, las fracciones mayoritarias comprenden las fracciones de los alcanos alifaticos C2i-C34 y Ci2-C16; es decir, aquellas fracciones de hidrocarburos saturados de cadena lineal que contienen entre 21 y 34 atomos de carbono (C21-C34) o entre 12 y 16 atomos de carbono (C12-C16) [en el sentido utilizado en esta descripcion, la notation “Cn-Cm”, donde “n” y “m” son numeros enteros, se refiere al numero de atomos de carbono (“n”, “m”) presentes en el hidrocarburo; asl una fraction de alcanos alifaticos C21-C34 se refiere a la fraction de alcanos alifaticos que tienen entre 21 y 34 atomos de carbono, ambos inclusive].

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El origen de la mezcla de hidrocarburos puede ser muy variado; a modo ilustrativo, dicha mezcla de hidrocarburos puede proceder de instalaciones petroleras, instalaciones aeroportuarias, estaciones de servicio, talleres mecanicos, aparcamientos o zonas de lavado de vehlculos, marinas o puertos, etc.

En una realization particular, dicha mezcla de hidrocarburos comprende una mezcla de hidrocarburos que puede encontrarse en el petroleo o en sus productos derivados (e.g., gasolinas, gasoleos, fuel-oils, etc.). Aunque puede haber cientos de compuestos en una muestra de petroleo o sus derivados (por ejemplo, alcanos alifaticos, tales como octano, dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, triacontano, hexatriacontano, etc.; HAPs, tales como naftaleno, fenantreno, etc., hidrocarburos aromaticos, tales como BTEX, etc.) no todos los compuestos se encuentran simultaneamente en una determinada muestra de petroleo o sus derivados. Debido a que el petroleo y sus productos derivados incluyen una pluralidad de compuestos qulmicos, entre ellos numerosos hidrocarburos diferentes, no resulta practico medirlos o cuantificarlos cada uno de ellos de forma separada; sin embargo, si resulta util medir la cantidad de hidrocarburos totales de petroleo o “TPH” (del ingles "Total Petroleum Hydrocarbons”) en una determinada muestra de petroleo o sus derivados, o en un medio acuoso que contenga dicha mezcla de hidrocarburos.

En el sentido utilizado en la presente description, la expresion “medio acuoso que comprende una mezcla de hidrocarburos” incluye cualquier medio acuoso (es decir, cualquier fase llquida que comprende agua) que contiene la mezcla de hidrocarburos previamente definida. En una realizacion particular, dicho medio acuoso comprende una mezcla de hidrocarburos que comprende, al menos, un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, triacontano, hexatriacontano y sus combinaciones; al menos, un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones, y, al menos, un hidrocarburo seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno y sus combinaciones (BTEX).

El origen del medio acuoso que comprende dicha mezcla de hidrocarburos puede ser muy variado; de hecho, practicamente cualquier medio acuoso que comprenda una mezcla de hidrocarburos tal como la definida previamente puede ser sometida al procedimiento de la invention. A modo ilustrativo, no limitativo, dicho medio acuoso que comprende dicha mezcla de hidrocarburos puede ser un medio acuoso contaminado con una mezcla de hidrocarburos que comprende, al menos, un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, triacontano, hexatriacontano y sus combinaciones; al menos, un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones, y, al menos, un hidrocarburo seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno y sus combinaciones (BTEX), tal como, por ejemplo, aguas residuales recogidas en una unidad separadora de hidrocarburos (SPH), aguas residuales contaminadas con vertidos de dichos hidrocarburos o de fases organicas que los contengan, tales como gasoil, gasolina, Jet A1, aguas residuales recogidas en las estaciones de servicio o talleres mecanicos, etc.

La concentration inicial de hidrocarburos presente en el medio acuoso que comprende dicha mezcla de hidrocarburos puede variar dentro de un amplio intervalo; no obstante, en una realizacion particular, dicho medio acuoso presenta una concentracion inicial de hidrocarburos comprendida entre aproximadamente 100 partes por millon (ppm) y 500.000 ppm o incluso superiores, tlpicamente entre 150 ppm y 80.000 ppm. La concentracion de hidrocarburos totales (TPHs totales) y de cada una de las fracciones indicadas: alifaticos (C5-C8, C8-C10, C10- C12, C12-C16, C16-C21 y C21-C34) y aromaticos (C8-C10, C10-C12, C12-C16, C16-C21 y C21-C35) puede realizarse por metodos convencionales; en una realizacion particular, la concentracion de TPHs y de cada una de las fracciones indicadas (alifaticos y aromaticos) se determinan mediante un

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metodo de separation de cadenas y cuantificacion de las distintas fracciones mediante la tecnica de cromatografla de gases con detection por espectrometrla de masas (GC-MS). La extraction de los hidrocarburos de la fase acuosa, en una realization particular, se realiza mediante extraction llquido-llquido empleando diclorometano como fase extractante. El contenido en BTEX de las muestras (benceno, tolueno, etilbenceno y formas o-, m- y para- de xilenos) se determina de forma individual para cada uno de los compuestos siguiendo el mismo procedimiento de extraction y medida que el indicado para los TPHs. Las fracciones mayoritarias de los hidrocarburos presentes en dicho medio acuoso que comprende la mezcla de hidrocarburos pueden variar ampliamente; no obstante, en una realization particular, las fracciones mayoritarias comprenden las fracciones de alcanos alifaticos C2i-C34 y Ci2-Ci6. En el Ejemplo 3 se indica la concentration inicial de hidrocarburos (TPHs) presente en un medio acuoso que comprende una mezcla de hidrocarburos procedente de una unidad SPH sometido al procedimiento de la invention, indicando las fracciones mayoritarias presentes asl como la distribution porcentual de las distintas fracciones de hidrocarburos.

El procedimiento de la invention comprende poner en contacto el medio acuoso que comprende una mezcla de hidrocarburos, tal como se ha definido previamente, con una mezcla bacteriana, en adelante “mezcla bacteriana de la invention”, que comprende

Bacterias que degradan alcanos alifaticos

La mezcla bacteriana de la invencion puede contener practicamente cualquier bacteria que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, triacontano, hexatriacontano y sus combinaciones. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas bacterias incluyen bacterias de los generos Acinetobacter, Arthrobacter, Bacillus y Pseudomonas, que degradan alcanos alifaticos de 5 a 44 atomos de carbono tal como se indica en los Antecedentes de la Invention, las cepas: Acinetobacter sp M-1 (que degrada hidrocarburos de hasta 44 atomos de carbonos), Acinetobacter calcoaceticus S30 (que degrada octacosano), Arthrobacter nicotianae KCCB35 (que degrada hidrocarburos de hasta 40 atomos de carbono), Rhodococcus sp. Q15 (que degrada tanto alcanos alifaticos de 8 a 32 atomos de carbono puros como mezclas de dichos alcanos alifaticos), y Pseudomonas aeuroginosa AP-1 (que degrada alcanos alifaticos de entre 11 y 40 atomos de carbono, con un maximo para el eicosano). Ejemplos adicionales incluyen bacterias del genero Pseudomonas que degradan hidrocarburos alifaticos 5 a 12 atomos de carbono (Whyte et al. “Biodegradation of petroleum hydrocarbons by psychrotrophic Pseudomonas strains possessing both alkane (alk) and naphthalene (nah) catabolic pathways” (1997), Appl. Environ. Microbiol., 63 (9) 37193723); cepas de Pseudomonas fluorescens que degradan hidrocarburos alifaticos de 14 a 18 atomos de carbono (Sepic et al., “Biodegradation studies of selected hydrocarbons from diesel oil” (1996), Analyst, 121, 1451-1456); cepas de Pseudomonas aeruginosa que degradan hidrocarburos de 16 atomos de carbono (Shreve et al. “Rhamnolipid biosurfactant enhancement of hexadecane biodegradation by Pseudomonas

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aeruginosa" (1995) Molecular Marine Biology and Biotechnology , 4 (4), 331-337); arqueobacterias halofilas que degradan hidrocarburos alifaticos de 20 atomos de carbono (Bertrand et al. “Biodegradation of hydrocarbons by an extremely halophilic archaebacterium” (1990), Letters in Applied Microbiology, 11(5), 260-263); cepas de Marinobacter hydrocarbonoclasticus que degradan hidrocarburos alifaticos de 20 atomos de carbono (Fernandez-Linares et al. “Effect of Sodium Chloride Concentration on Growth and Degradation of Eicosane by the Marine Halotolerant Bacterium Marinobacter hydrocarbonoclasticus” (1996), Systematic and Applied Microbiology, 19 (1), 260-263); bacterias del genero Cornybacterium sp. 8 que degradan hidrocarburos alifaticos de 20 atomos de carbono (Acquaviva et al., “Effect of a synthetic surfactant on phenanthrene and n-eicosane utilization by two pure marine strains grown separately in batch cultures with or without sand particles” (2001), World Journal of Microbiology and Biotechnology, 17 (5), 481-485); la cepa Acinetobacter calcoaceticus S30 que degrada hidrocarburos alifaticos de 28 atomos de carbono (Banwari et al., “Mineralization of [14C]octacosane by Acinetobacter calcoaceticus S30” (1996), Canadian Journal of Microbiology, 42 (12), 1225-1231); la cepa Arthrobacter nicotianae KCCB35 que degrada hidrocarburos alifaticos de 28 y 29 atomos de carbono (Radwan et al., “Uptake and utilization of n-octacosane and n-nonacosane by Arthrobacter nicotianae KCCB35” (1996), Journal of Applied Bacteriology, 80, 370-374), etc. Otros ejemplos de bacterias que degradan hidrocarburos alifaticos de 12, 16 y 20 atomos de carbono han sido descritos por Olivera et al., “Alkane biodegradation by a microbial community from contaminated sediments in Patagonia, Argentina” (1997), International Biodeterioration & Biodegradation, 40 (1), 75-79. La mezcla bacteriana de la invention tambien puede contener mutantes de dichas bacterias y cepas que conservan la capacidad de degradar los hidrocarburos alifaticos correspondientes.

En una realization particular, la mezcla bacteriana de la invencion comprende una bacteria que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones, tal como una bacteria del genero Rhodococcus con capacidad para degradar dichos alcanos alifaticos. En una realizacion concreta, dicha bacteria del genero Rhodococcus que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones es la bacteria Rhodococcus sp. BIRD 7, depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) con numero de acceso CeCt 8211, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones. Dicha bacteria Rhodococcus sp. BIRD 7 (CECT 8211), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones, ha sido aislada y caracterizada por los inventores, y constituye un aspecto adicional de la presente invencion. Las caracterlsticas de dicha bacteria se mencionan en el apartado 2 de esta description y su obtencion en el apartado 3 de esta descripcion.

En otra realizacion particular, la mezcla bacteriana de la invencion comprende una bacteria que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones, tal como una bacteria del genero Bacillus con capacidad para degradar dichos alcanos alifaticos. En una realizacion concreta, dicha bacteria que degrada un hidrocarburo seleccionado del grupo formado por octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones es la bacteria Bacillus sp. BIRD 8, depositada en la CECT con numero de acceso CECT 8210, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones. Dicha bacteria Bacillus sp.

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BIRD 8 (CECT 8210), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones, ha sido aislada y caracterizada por los inventores, y constituye un aspecto adicional de la presente invention. Las caracterlsticas de dicha bacteria se mencionan en el apartado 2 de esta description y su obtencion en el apartado 3 de esta descripcion.

En otra realization particular, la mezcla bacteriana de la invencion comprende una bacteria que degrada dodecano, tal como una bacteria del genero Pseudomonas con capacidad para degradar dicho alcano. En una realizacion concreta, dicha bacteria que degrada dodecano es la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9, depositada en la CECT con numero de acceso CECT 8212, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano. Dicha bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano, ha sido aislada y caracterizada por los inventores, y constituye un aspecto adicional de la presente invencion. Las caracterlsticas de dicha bacteria se mencionan en el apartado 2 de esta descripcion y su obtencion en el apartado 3 de esta descripcion.

En otra realizacion particular, la mezcla bacteriana de la invencion comprende una bacteria que degrada hexadecano, tal como una bacteria del genero Pseudomonas con capacidad para degradar dicho alcano. En una realizacion concreta, dicha bacteria que degrada hexadecano es la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10, depositada en la CECT con numero de acceso CECT 8213, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano. Dicha bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano, ha sido aislada y caracterizada por los inventores, y constituye un aspecto adicional de la presente invencion. Las caracterlsticas de dicha bacteria se mencionan en el apartado 2 de esta descripcion y su obtencion en el apartado 3 de esta descripcion.

En otra realizacion particular, la mezcla bacteriana de la invencion comprende una bacteria que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones, tal como una bacteria del genero Acinetobacter con capacidad para degradar dichos alcanos alifaticos. En una realizacion concreta, dicha bacteria que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones es la bacteria Acinetobacter sp. BIRD 11, depositada en la CECT con numero de acceso CECT 8214, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano. Dicha bacteria Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones, ha sido aislada y caracterizada por los inventores, y constituye un aspecto adicional de la presente invencion. Las caracterlsticas de dicha bacteria se mencionan en el apartado 2 de esta descripcion y su obtencion en el apartado 3 de esta descripcion.

Bacterias que degradan HAPs

La mezcla bacteriana de la invencion puede contener practicamente cualquier bacteria que degrada un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas bacterias incluyen bacterias de los generos Acidovorax, Enterobacter, Mycobacterium, Pantoaea, Pseudomonas, Sphingomonas y Stenotrophomonas, tal como se indica en los Antecedentes de la Invencion. Ejemplos adicionales incluyen bacterias del genero Pseudomonas que degradan naftaleno (Whyte et al. “Biodegradation of petroleum

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hydrocarbons by psychrotrophic Pseudomonas strains possessing both alkane (alk) and naphthalene (nah) catabolic pathways” (1997), Appl. Environ. Microbiol., 63 (9) 37193723); la cepa Mycobacterium gilvum VM552 que degrada fenantreno (Wick et al., "Influence of the growth substrate on the micolic acid profiles on Mycobacterium’’ (2002), Enviromental Microbiology, 4 (10), 612-616); la cepa Novosphingobium sp. LH128 que degrada fenantreno (Bastiaens et al., "Isolation of adherent polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH)-degrading bacteria using PAH-sorbent carriers” (2000), Applied and Environmental Microbiology, 66, 1834-1843); la cepa Sphingomonas sp. 2MP11 que degrada fenantreno (Acquaviva et al., "Effect of a synthetic surfactant on phenanthrene and n-eicosane utilization by two pure marine strains grown separately in batch cultures with or without sand particles” (2001), World Journal of Microbiology and Biotechnology, 17 (5), 481-485); etc. Ejemplos adicionales de bacterias que degradan naftaleno y fenantreno han sido descritas por Cerniglia, en "Biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons” (1992), Biodegradation, 3 (2-3), 351-368. La mezcla bacteriana de la invencion tambien puede contener mutantes de dichas bacterias y cepas que conservan la capacidad de degradar los HAPs correspondientes.

En una realization particular, la mezcla bacteriana de la invencion comprende una bacteria que degrada un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones, tal como una bacteria del genero Pseudoxanthomonas con capacidad para degradar dichos HAPs. En una realizacion concreta, dicha bacteria del genero Pseudoxanthomonas que degrada un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno y sus combinaciones es la bacteria Pseudoxanthomonas sp. BIRD 3, depositada en la CECT con numero de acceso CECT 7607, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno y sus combinaciones. Dicha bacteria Pseudoxanthomonas sp. BIRD 3 (CECT 7607), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno y sus combinaciones, ha sido aislada y caracterizada por los inventores, y constituye un aspecto adicional de la presente invencion. Las caracterlsticas de dicha bacteria se mencionan en el apartado 2 de esta description y su obtencion en el apartado 4 de esta descripcion.

Bacterias que degradan hidrocarburos aromaticos

La mezcla bateriana de la invencion puede contener practicamente cualquier bacteria que degrada un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno y sus combinaciones (BTEX). Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichas bacterias incluyen bacterias del genero Pseudomonas, tales como la cepa Pseudomonas putida KT2440 que degrada tolueno y xilenos (Nelson et al., "Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440” (2002), Environmental

Microbiology, 4 (12), pags 799-808), la cepa Pseudomonas putida DOT-T1E que degrada tolueno (Ramos et al., "Efflux pumps involved in toluene tolerance in Pseudomonas putida DOT-T1E. Journal of Bacteriology” (1998), 180 (13), 3323-3329; Rojas et al, "Three efflux pumps are required to provide efficient tolerance to toluene in Pseudomonas putida DOT-T1E” (2001), Journal of Bacteriology, 183 (13), 3967-3973), la cepa Pseudomonas putida CCM I 852 que degrada benceno, tolueno y xilenos (Otenio et al., "Benzene, toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida CCM I 852” (2005) , Brazilian Journal of Microbiology, 36, 258-261); la cepa Pseudomonas putida AY-10 que degrada benceno, tolueno, etilbenceno y xilenos (Young Lee et al., "Characterization biodegradation of benzene, toluene, ethylbenzene and xylenes by the newly isolated bacterium Pseudomonas putida AY-10 in rhizosphere of wastewater treatment reed” (2011), 3rd International Conference on Chemical,

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Biological and Environmental Engineering. IPCBEE vol. 20, IACSIT Press, Singapore, 37-41); bacterias que incorporan el plasmido TOL (pWW0) de Pseudomonas putida que confiere capacidad para degradar BTEX (Abril et al, Regulator and enzyme specificities of the TOL plasmid-encoded upper pathway for degradation of aromatic hydrocarbons and expansion of the substrate range of the pathway, 1989; J. Bacteriol., 171; 67826790); etc. La incorporation de dicho plasmido TOL (pWW0) en una bacteria puede realizarse por metodos convencionales, por ejemplo, mediante un mecanismo de conjugation bacteriano durante el cual se produce de una forma natural la transferencia de material genetico desde una celula donadora a otra celula receptora; durante la conjugacion, la celula donadora transmite parte de su material genetico, en este caso un plasmido, a la celula receptora, trasmitiendole nuevas capacidades, que en el caso particular del plasmido tOl (pWW0), consiste en la degradation de hidrocarburos aromaticos tales como benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno, y sus combinaciones. La transferencia de information entre celulas donadoras y receptoras ocurre de una forma natural mediante el contacto directo entre ambas (Abril et al, Regulator and enzyme specificities of the TOL plasmid-encoded upper pathway for degradation of aromatic hydrocarbons and expansion of the substrate range of the pathway (1989), J. Bacteriol., 171; 6782-6790). En una realization particular, la bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWWO) es la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212) a la que se la ha incorporado dicho plasmido TOL (pWW0) mediante un mecanismo de conjugacion bacteriano como el mencionado previamente. En otra realizacion particular, la bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWWO) es la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213) a la que se la ha incorporado dicho plasmido TOL (pWW0) mediante un mecanismo de conjugacion bacteriano como el mencionado previamente. La mezcla bacteriana de la invention tambien puede contener mutantes de dichas bacterias y cepas que conservan la capacidad de degradar los hidrocarburos aromaticos correspondientes.

En una realizacion particular, la mezcla bacteriana de la invencion comprende:

a) al menos, una bacteria que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones, por ejemplo, una bacteria del genero Rhodococcus con capacidad para degradar dichos alcanos alifaticos, tal como la bacteria Rhodococcus sp. BIRD 7 (CECT 8211), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones;

b) al menos, una bacteria que degrada un hidrocarburo seleccionado del grupo formado por octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones, por ejemplo, una bacteria del genero Bacillus con capacidad para degradar dichos alcanos alifaticos, tal como la bacteria Bacillus sp. BIRD 8 (CECT 8210), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones;

c) al menos, una bacteria que degrada dodecano, por ejemplo, una bacteria del genero Pseudomonas con capacidad para degradar dicho alcano, tal como la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CeCt 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano;

d) al menos, una bacteria que degrada hexadecano, por ejemplo, una bacteria del genero Pseudomonas con capacidad para degradar dicho alcano, tal como la

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bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano;

e) al menos, una bacteria que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones, por ejemplo, una bacteria del genero Acinetobacter con capacidad para degradar dichos alcanos alifaticos, tal como la bacteria Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones;

f) al menos, una bacteria que degrada un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones, por ejemplo, una bacteria del genero Pseudoxanthomonas con capacidad para degradar dicho HAP, tal como la bacteria Pseudoxanthomonas sp. BIRD 3 (CECT 7607), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones; y

g) al menos, una bacteria que degrada un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno y sus combinaciones (BTEX), por ejemplo, una bacteria del genero Pseudomonas con capacidad para degradar dicho hidrocarburo aromatico, tal como Pseudomonas putida KT2440, Pseudomonas putida DOT-T1E, Pseudomonas putida CCM I 852, Pseudomonas putida AY-10, etc., y/o una bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWW0) de P. putida que confiere capacidad para degradar BTEX, tal como, por ejemplo, la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212) a la que se la ha incorporado dicho plasmido TOL (pWW0), y/o la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213) a la que se la ha incorporado el plasmido TOL (pWW0), y, por tanto, tienen capacidad para degradar, ademas, BTEX.

En otra realization particular, cuando la bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWW0), que confiere capacidad para degradar BTEX, es (i) la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano, o (ii) la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano, la mezcla bacteriana de la invention comprende:

c) al menos, una bacteria que degrada dodecano, por ejemplo, una bacteria del genero Pseudomonas con capacidad para degradar dicho alcano, tal como la bacteria

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Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano;

d) al menos, una bacteria que degrada hexadecano, por ejemplo, una bacteria del genero Pseudomonas con capacidad para degradar dicho alcano, tal como la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano;

e) al menos, una bacteria que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones, por ejemplo, una bacteria del genero Acinetobacter con capacidad para degradar dichos alcanos alifaticos, tal como la bacteria Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones; y

f) al menos, una bacteria que degrada un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones, por ejemplo, una bacteria del genero Pseudoxanthomonas con capacidad para degradar dicho HAP, tal como la bacteria Pseudoxanthomonas sp. BIRD 3 (CECT 7607), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones;

en donde, al menos, una de dichas bacterias c) Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano, o d) Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano, incorpora el plasmido TOL (pWW0), que confiere capacidad para degradar un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o- xileno, m-xileno, p-xileno y sus combinaciones (BTEX).

En una realizacion mas particular, dicha bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWW0) es la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano. En otra realizacion mas particular, dicha bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWW0) es la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano. En otra realizacion mas particular, las bacterias que incorporan el plasmido TOL (pWW0) son las bacterias Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano, y Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano.

Adicionalmente, si se desea, la mezcla bacteriana de la invencion puede contener microorganismos con capacidad de adhesion a superficies plasticas o minerales (e.g. poliespan, vermiculita, piedra pomez, etc.), microorganismos productores de biosurfactantes, etc. El experto en la materia conoce ejemplos ilustrativos de dichos microorganismos. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos microorganismos incluyen microorganismos pertenecientes a los generos Agromyces, Delftia, etc.

En una realizacion particular, las bacterias presentes en la mezcla bacteriana de la invencion estan formando un consorcio bacteriano, en adelante “consorcio bacteriano de la invencion”. Un “consorcio bacteriano” es una asociacion natural de dos o mas poblaciones bacterianas, de diferentes especies, que actuan conjuntamente como una comunidad en un sistema complejo, donde todos se benefician de las actividades de los demas (Ramos et al, “The behavior of bacteria designed for biodegradation” (1994), Nature Biotechnology, 12, 1349-1356). La asociacion refleja estilos de vida sinergicos o sintroficos en el que el crecimiento y el flujo

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ciclico de nutrientes se conduce mas efectiva y eficientemente que en poblaciones individuales (Lopez, Dominguez & Garcia, (2007). Arreglo estructural de un consorcio microbiano de interes alimentario en la produccion del vinagre. Trabajo presentado en el octavo Congreso Nacional de Microscopla, Octubre, Mexico). Funcionalmente, un consorcio bacteriano supera la suma de sus partes; sus miembros mantienen la compatibilidad metabolica y ecologica siempre y cuando las transformaciones ambientales que se generan permitan que ellos coexistan cercanamente. Un consorcio bacteriano puede desempenar funciones complicadas que poblaciones individuales no podrlan; ademas, la vida en asociacion puede generar mayor resistencia a las fluctuaciones del ambiente y promover la estabilidad de los miembros, en el tiempo. Estos rasgos distintivos dependen de dos caracterlsticas. Primero, los miembros de un consorcio se comunican el uno con el otro. Ya sea por el intercambio de sustancias o por senales moleculares, cada poblacion detecta y responde a la presencia de otras dentro del consorcio, ejerciendo sobre ellas un control positivo o negativo en su crecimiento y/o metabolismo. Aqui, “comunicacion” se refiere a interacciones fisico-qulmicas en las cuales el emisor, el canal y el receptor de la informacion estan identificados. Esta comunicacion permite la segunda caracterlstica importante, la division del trabajo. La produccion total de un consorcio depende de la combination de tareas desempenadas por los constituyentes individuales, es decir, por las poblaciones microbianas involucradas. Otra importante caracterlstica de los consorcios es su habilidad para desempenar funciones que requieren multiples pasos.

En una realization particular, dicho consorcio bacteriano de la invention comprende:

e) al menos, una bacteria que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones, por ejemplo, una bacteria del genero Acinetobacter con capacidad para degradar dichos alcanos alifaticos, tal como la bacteria Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un

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alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones;

f) al menos, una bacteria que degrada un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones, por ejemplo una bacteria del genero Pseudoxanthomonas con capacidad para degradar dicho HAP, tal como la bacteria Pseudoxanthomonas sp. BIRD 3 (CECT 7607), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones; y

g) al menos, una bacteria que degrada un hidrocarburo aromatico, por ejemplo una bacteria del genero Pseudomonas con capacidad para degradar dicho hidrocarburo aromatico, tal como (i) la bacteria Pseudomonas BIRD 9 (CECT 8212) con el plasmido TOL (pWW0), o una mutante de la misma con capacidad para degradar un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno, y sus combinaciones, (ii) la bacteria Pseudomonas BIRD 10 (CECT 8213) con el plasmido TOL (pWW0), o una mutante de la misma con capacidad para degradar un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno, y sus combinaciones, o (iii) ambas bacterias (i) y (ii).

En otra realization concreta, dicho consorcio bacteriano de la invention comprende:

a) al menos, la bacteria Rhodococcus sp. BIRD 7 (CECT 8211), o una mutante de la misma que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones;

b) al menos, la bacteria Bacillus sp. BIRD 8 (CECT 8210), o una mutante de la misma que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones;

c) al menos, la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que degrada dodecano;

d) al menos, la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que degrada hexadecano;

e) al menos, la bacteria Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214), o una mutante de la misma que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones;

f) al menos, la bacteria Pseudoxanthomonas sp. BIRD-3 (CECT 7607), o una mutante de la misma que degrada un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno y sus combinaciones; y

g) al menos, una bacteria que degrada un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno, y sus combinaciones, en donde dicha bacteria se selecciona del grupo formado por (i) la bacteria Pseudomonas BIRD 9 (CECT 8212) con el plasmido TOL (pWW0), o una mutante de la misma con capacidad para degradar un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m- xileno, p-xileno, y sus combinaciones, (ii) la bacteria Pseudomonas BIRD 10 (CECT 8213) con el plasmido TOL (pWW0), o una mutante de la misma con capacidad para

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degradar un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno, y sus combinaciones; y (iii) combinaciones de dichas bacterias (i) y (ii).

En otra realization particular, cuando la bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWW0), que confiere capacidad para degradar BTEX, es (i) la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano, o (ii) la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano, el consorcio bacteriano de la invention comprende:

en donde, al menos, una de dichas bacterias c) Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano, o d) Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar

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hexadecano, incorpora el plasmido TOL (pWW0), que confiere capacidad para degradar un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o- xileno, m-xileno, p-xileno y sus combinaciones (BTEX).

En una realization mas particular, dicha bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWW0) es la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano. En otra realizacion mas particular, dicha bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWW0) es la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano. En otra realizacion mas particular, las bacterias que incorporan el plasmido TOL (pWW0) son las bacterias Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano, y Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano.

Adicionalmente, si se desea, el consorcio bacteriano de la invention puede contener microorganismos con capacidad de adhesion a superficies plasticas o minerales (e.g. poliespan, vermiculita, piedra pomez, etc.), microorganismos productores de biosurfactantes, etc. El experto en la materia conoce ejemplos ilustrativos de dichos microorganismos. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos microorganismos incluyen microorganismos pertenecientes a los generos Agromyces, Delftia, etc.

En una realizacion particular, las bacterias presentes en la mezcla bacteriana de la invencion, o en el consorcio bacteriano de la invencion, estan adheridas a un soporte solido inerte formando un biofilm (pellcula biologica) bacteriano y constituyendo de ese modo un soporte activo ("soporte activo de la invencion”), en donde dicho soporte solido inerte comprende un material que tiene una densidad inferior a la del agua. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de materiales con densidad inferior a la del agua utilizados en la elaboration de dicho soporte solido inerte incluyen materiales plasticos, polixpan, vermiculita, arlita (arcilla expandida), espuma de poliuretano, virutas de madera, etc. Caracterlsticas adicionales de dicho soporte activo de la invencion y de su obtencion se mencionan en el apartado 5 de esta description y se incorporan aqul por referencia.

El procedimiento de la invencion comprende poner en contacto dicho medio acuoso que comprende una mezcla de hidrocarburos con una mezcla bacteriana de la invencion bajo condiciones apropiadas para el desarrollo y crecimiento de las bacterias presentes en la mezcla bacteriana de la invencion, o en el consorcio bacteriano de la invencion, con el fin de que estas puedan realizar su funcion de degradar los hidrocarburos presentes en la mezcla de hidrocarburos a degradar. Dichas condiciones incluyen la operation en condiciones aerobias asl como la selection de temperatura y nutrientes para que las bacterias presentes en la mezcla bacteriana de la invencion, o en el consorcio bacteriano de la invencion, puedan desarrollar su actividad degradadora de hidrocarburos.

En caso de que fuese necesario, el medio acuoso que comprende la mezcla de hidrocarburos junto con la mezcla bacteriana de la invencion, o en el consorcio bacteriano de la invencion, puede ser suplementado con una fuente de carbono y/o con una fuente de nitrogeno y/o nutrientes esenciales, con el fin de facilitar la supervivencia de las bacterias presentes en la mezcla bacteriana de la invencion, o en el consorcio bacteriano de la invencion. A modo ilustrativo, para optimizar el procedimiento de la invencion, pueden anadirse cantidades adecuadas de solution de micronutrientes junto con cantidades apropiadas de magnesio, cobalto, molibdeno y otros metales esenciales, tlpicamente en el orden de concentration micromolar (pM). En cualquier caso, la election y cantidad de nutrientes y/o micronutrientes a anadir al medio acuoso contaminado sera funcion de la composition de dicho medio acuoso y de la demanda bacteriana de cada caso particular. El experto en la materia puede tomar las medidas oportunas para ajustar tales condiciones.

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Si fuera necesario las bacterias presentes en la mezcla bacteriana de la invention, o en el consorcio bacteriano de la invencion, pueden ser sometidas a un tratamiento previo de aclimatacion al medio acuoso que comprende la mezcla de hidrocarburos con el fin de poder realizar el procedimiento de la invencion. Las condiciones para aclimatar dichas bacterias a los hidrocarburos presentes en la mezcla de hidrocarburos presente en el medio acuoso dependen, en general, de diversos factores, por ejemplo, de la naturaleza del hidrocarburo (alcano alifatico, HAP, aromatico, etc.) presente en la mezcla de hidrocarburos, de su contenido en dicha mezcla, etc. Durante esta etapa de aclimatacion previa, al igual que durante el desarrollo del procedimiento de la invencion, puede ser necesario aportar una solution de nutrientes y/o micronutrientes con el fin de favorecer el metabolismo de las bacterias presentes en la mezcla bacteriana de la invencion, o en el consorcio bacteriano de la invencion, capaces de degradar dichos hidrocarburos.

Durante el procedimiento de la invencion, la degradation de algunos hidrocarburos (por ejemplo, de cadena mas larga (mayor peso molecular)) por parte de algunas bacterias presentes en la mezcla bacteriana de la invencion, o en el consorcio bacteriano de la invencion, puede generar otros hidrocarburos (por ejemplo, de cadena mas corta (menor peso molecular)) que pueden ser degradados por otras bacterias presentes en dicha mezcla bacteriana de la invencion, por lo que el procedimiento de la invencion permite degradar y reducir la cantidad de hidrocarburos presentes en la mezcla de hidrocarburos presente en el medio acuoso a tratar, tal como se pone de manifiesto en los Ejemplos 10-13 que acompanan a la presente description. En general, dichas bacterias mineralizan los hidrocarburos (alcanos alifaticos, HAPs, aromaticos) llevandolos a dioxido de carbono y agua como productos finales.

En una realization particular, se mide la concentration de hidrocarburos (e.g., TPHs) presente en el medio acuoso contaminado a tratar para comprobar el funcionamiento del procedimiento de la invencion y de las bacterias que degradan los hidrocarburos de manera que, en caso de que la eficacia del procedimiento de la invencion decaiga, tomar las medidas oportunas conocidas por los tecnicos en la materia para aumentar la eficacia, por ejemplo, aportando nutrientes, etc.

En una realizacion particular, el procedimiento (biologico) de la invencion puede ir precedido de un tratamiento flsico-qulmico o fotoqulmico del medio acuoso que comprende la mezcla de hidrocarburos a tratar antes de proceder a realizar el tratamiento biologico proporcionado por esta invencion. Preferentemente, dicho tratamiento flsico-qulmico o fotoqulmico del medio acuoso que comprende la mezcla de hidrocarburos pertenece al tipo de procesos de oxidation avanzados (POAs). El termino “proceso de oxidacion avanzado” o “POAs”, tal como aqul se utiliza, se refiere a un proceso que implica la generation y uso de especies transitorias con un alto poder oxidante, principalmente radicales hidroxilo (OH ), los cuales actuan como iniciadores del proceso de oxidacion del contaminante (hidrocarburo) (Glaze, Drinking water treatmen with ozone (1987), Environ. Sci. Technol., 21; 224-230). Estos radicales hidroxilo pueden ser tambien generados por medios fotoqulmicos (luz solar incluida) y poseen una alta efectividad para la oxidacion de materia organica.

En una realizacion concreta, dicho tratamiento flsico-qulmico comprende poner en contacto el medio acuoso que comprende dicha mezcla de hidrocarburos con un agente oxidante, en donde dicho agente oxidante es un agente oxidante que oxida y degrada al menos uno de los hidrocarburos presentes en dicha mezcla de hidrocarburos. Aunque practicamente cualquier agente oxidante que cumpla tales condiciones puede ser utilizado, en una realizacion especlfica, dicho agente oxidante se selecciona del grupo formado por peroxido de hidrogeno (H2O2), ozono (O3) y sus combinaciones; por tanto, en una realizacion concreta el agente oxidante es peroxido de hidrogeno (Ejemplo 3); en otra realizacion concreta el agente oxidante es ozono (Ejemplo 4); y en otra realizacion concreta el agente oxidante comprende peroxido de

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hidrogeno y ozono (Ejemplo 5). Cuando el agente oxidante es el peroxido de hidrogeno, este puede ser suministrado por cualquier sistema apropiado para suministrar peroxido de hidrogeno a un medio acuoso; no obstante, en una realization particular, el peroxido de hidrogeno se suministra mediante un sistema de spray o aspersor, manual o automatico, de aire comprimido.

En otra realizacion particular, el procedimiento de la invention puede ir precedido de un tratamiento fotoqulmico del medio acuoso que comprende la mezcla de hidrocarburos a tratar antes de proceder a realizar el tratamiento biologico proporcionado por esta invencion. En una realizacion concreta, dicho tratamiento fotoqulmico comprende poner en contacto el medio acuoso que comprende dicha mezcla de hidrocarburos con (i) un agente oxidante, en donde dicho agente oxidante es un agente oxidante que oxida y degrada al menos uno de los hidrocarburos presentes en dicha mezcla de hidrocarburos, y con (ii) una radiation ultravioleta (UV). Aunque practicamente cualquier agente oxidante que cumpla tales condiciones puede ser utilizado, en una realizacion especlfica, dicho agente oxidante se selecciona del grupo formado por peroxido de hidrogeno (H2O2), ozono (O3) y sus combinaciones. La longitud de onda (A) de la radiacion UV puede variar dentro de un amplio intervalo, tlpicamente entre 172 nm y 436 nm, en funcion del agente oxidante elegido; asl, en una realizacion particular, cuando el agente oxidante es peroxido de hidrogeno (que presenta un maximo de absorcion a una A de 220 nm), se pueden usar lamparas de Xe/Hg que emiten radiacion UV en un intervalo comprendido entre 210 nm y 240 nm o lamparas de mercurio de baja presion que emiten una radiacion policromatica de 220 nm a 436 nm, con un pico de emision destacado a 254 nm (Ejemplo 6); alternativamente, cuando el agente oxidante es ozono (que presenta una capacidad de absorcion superior a la del peroxido de hidrogeno), se pueden usar lamparas que emiten radiacion UV a una A comprendida entre 280 nm y 330 nm o lamparas de mercurio de baja presion que emiten una radiacion policromatica de 220 nm a 436 nm, con un pico de emision destacado a 254 nm (Ejemplo 7); asimismo, cuando el agente oxidante comprende peroxido de hidrogeno y ozono, se pueden usar lamparas de mercurio de baja presion que emiten una radiacion policromatica de 220 nm a 436 nm, con un pico de emision destacado a 254 nm (Ejemplo 8). Alternativamente, puede emplearse el ultravioleta de vaclo como generador de radicales libres a partir de la fotolisis del agua, mediante lamparas de exclmeros de Xe a una A de 172 nm.

Por tanto, en una realizacion particular, la invencion proporciona un procedimiento para reducir, en condiciones aerobicas, el contenido en hidrocarburos (e.g., TPHs) en un medio acuoso que comprende una mezcla de dichos hidrocarburos, que comprende:

- someter dicho medio acuoso que comprende dicha mezcla de hidrocarburos a un tratamiento flsico-qulmico o fotoqulmico tal como se ha indicado previamente para obtener un "medio acuoso oxidado”; y

- poner en contacto dicho medio acuoso oxidado con una mezcla bacteriana de la invencion.

En una realizacion concreta, las bacterias presentes en dicha mezcla bacteriana de la invencion estan formando un consorcio bacteriano.

En otra realizacion concreta, las bacterias presentes en dicha mezcla bacteriana de la invencion, o en dicho consorcio bacteriano de la invencion, estan adheridas a un soporte solido inerte formando un biofilm bacteriano y constituyendo un soporte activo de la invencion, en donde dicho soporte solido inerte comprende un material que tiene una densidad inferior a la del agua, tal como se ha mencionado previamente. El soporte activo de la invencion puede anadirse al medio acuoso contaminado a tratar en cantidad suficiente como para cubrir de forma eficiente la totalidad o parte de la superficie del medio acuoso contaminado a tratar.

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En caso necesario, se adicionan, tal como se ha comentado previamente, al medio acuoso contaminado la cantidad adecuada de nutrientes y/o micronutrientes necesarios para un eficaz desarrollo de la actividad biologica. El tipo y cantidad de nutrientes sera particular en cada caso, y vendra determinado por la demanda bacteriana.

Una vez finalizado el tratamiento biologico, se retira el soporte activo de la invention del medio acuoso contaminado.

2. Bacterias

En otro aspecto, la presente invencion se relaciona con el aislamiento e identificacion de un total de 5 bacterias pertenecientes a los generos Rhodococcus, Bacillus, Pseudomonas (2 cepas) y Acinetobacter, con capacidad para degradar alcanos alifaticos (CnH2n+2) con longitudes de cadena comprendidas entre 8 y 36 atomos de carbono, asl como con el aislamiento e identification de una bacteria perteneciente al genero Pseudoxanthomonas, con capacidad para degradar un HAP. Dichas bacterias se caracterizan por su capacidad para utilizar uno o mas de dichos compuestos como unica fuente de carbono y energla, lo que les permite desarrollarse y colonizar sitios con una alta contamination en dichos hidrocarburos, facilitando su biodegradacion.

El termino “alcano alifatico”, tal como aqu se utiliza, se refiere a un compuesto quimico constituido unicamente por atomos de carbono e hidrogeno, unidos exclusivamente por enlaces simples, y que responden a la formula general CnH2n+2, siendo “n” el numero de atomos de carbono en la molecula. En general, este tipo de compuestos se encuentran presentes en el petroleo, asl como en combustibles derivados de dicha fuente, principalmente gasolina, gasoil, queroseno, etc. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos alcanos alifaticos incluyen octano (n=8), dodecano (n=12), hexadecano (n=16), eicosano (n=20), docosano (n=22), tetracosano (n=24), octacosano (n=28), triacontano (n=30), hexatriacontano (n=36), etc.

La expresion “capacidad de degradar un (hidrocarburo)” o “que degrada un (hidrocarburo)”, aplicada a una bacteria, tal como se utiliza en esta description, significa que dicha bacteria es capaz de utilizar dicho hidrocarburo (e.g., un alcano alifatico) como fuente de carbono, y, en consecuencia, produce la degradation de dicho alcano alifatico. Todos los procesos de biodegradation citados en la presente invencion son de naturaleza aerobica y precisan, por tanto, de la presencia de oxlgeno molecular para su progreso. El mecanismo habitual de biodegradacion de los alcanos alifaticos requiere para su inicio la action de una enzima alcano hidroxilasa especlfica para la degradacion de alcanos alifaticos. Un posterior sistema enzimatico constituido por una serie de enzimas conduce a la generation de intermedios del metabolismo central que son finalmente respirados por los microorganismos (Ri-He Peng et al., Microbial biodegradation of polyaromatic hydrocarbons (2008), FEMS Microbiol. Rev., 32; 927955).

La capacidad de una bacteria para degradar un alcano alifatico puede determinarse por cualquier procedimiento convencional; por ejemplo inoculando dicha bacteria en un medio que contenga el alcano alifatico de interes como unica fuente de carbono y energla, y llevando a cabo la incubation de dicho cultivo bajo las condiciones apropiadas de agitation y temperatura. Un recuento de las bacterias viables o un seguimiento de la densidad optica del cultivo a una longitud de onda de 660 nm (OD660), tal y como se describe en el Ejemplo 1, proporcionara information adecuada sobre el crecimiento de la bacteria. Bajo estas condiciones, un aumento de cualquiera de los dos parametros sera indicativo de que la bacteria es capaz de emplear dicho alcano alifatico como fuente de carbono y energla. Alternativamente, la aparicion de color en el cultivo es indicativo de la metabolizacion del compuesto considerado.

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En un aspecto, la invention proporciona una bacteria del genero Rhodococcus (Rhodococcus sp. BIRD 7), depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) el 25 de septiembre de 2012, con numero de acceso CECT 8211, que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones. Ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que dicha cepa Rhodoccocus sp. BIRD 7 (CECT 8211) (i) es capaz de crecer utilizando dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano o hexatriacontano como unica fuente de carbono (Ejemplo 1), o en mezclas de hidrocarburos donde se hallen presentes dichos compuestos (Ejemplos 9 y 10), y (ii) tiene capacidad de adhesion a un soporte de material plastico (Ejemplo 2), lo que facilita su aplicacion in-situ para el tratamiento de medios acuosos que comprenden mezclas de hidrocarburos. Un cultivo biologicamente puro de dicha bacteria Rhodococcus sp. BIRD 7 (CECT 8211), o de una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones, constituye un aspecto adicional de la presente invencion.

En el sentido utilizado en la presente description, un “cultivo biologicamente puro (de una bacteria)” se refiere a un cultivo en el que la bacteria en cuestion se encuentra en una proportion igual o superior al 99,999% respecto al resto de posibles bacterias que eventualmente pudieran estar presentes en dicho cultivo.

En otro aspecto, la invencion proporciona una bacteria del genero Bacillus (Bacillus sp. BIRD 8), depositada en la CECT el 25 de septiembre de 2012, con numero de acceso CECT 8210, que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones. Ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que dicha cepa Bacillus sp. BIRD 8 (CECT 8210) (i) es capaz de crecer utilizando octano, hexadecano, octacosano o triacontano como unica fuente de carbono (Ejemplo 1), o en mezclas de hidrocarburos donde se hallen presentes dichos compuestos (Ejemplos 9 y 10), y (ii) tiene capacidad de adhesion a un soporte de material plastico (Ejemplo 2), lo que facilita su aplicacion in-situ para el tratamiento de medios acuosos que comprenden mezclas de hidrocarburos. Un cultivo biologicamente puro de dicha bacteria Bacillus sp. BIRD 8 (CECT 8210), o de una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones, constituye un aspecto adicional de la presente invencion.

En otro aspecto, la invencion proporciona una bacteria del genero Pseudomonas (Pseudomonas sp. BIRD 9), depositada en la CECT el 25 de septiembre de 2012, con numero de acceso CECT 8212, que degrada dodecano, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano. Ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que dicha cepa Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212) (i) es capaz de crecer utilizando dodecano como unica fuente de carbono (Ejemplo 1), o en mezclas de hidrocarburos donde se hallen presentes dichos compuestos (Ejemplos 9 y 10), y (ii) tiene capacidad de adhesion a un soporte de material plastico (Ejemplo 2), lo que facilita su aplicacion in-situ para el tratamiento de medios acuosos que comprenden mezclas de hidrocarburos. Un cultivo biologicamente puro de dicha bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o de una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano, constituye un aspecto adicional de la presente invencion.

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En otro aspecto, la invention proporciona una bacteria del genero Pseudomonas (Pseudomonas sp. BIRD 10), depositada en la CECT el 25 de septiembre de 2012, con numero de acceso CECT 8213, que degrada hexadecano, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano. Ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que dicha cepa Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213) (i) es capaz de crecer utilizando hexadecano como unica fuente de carbono (Ejemplo 1), o en mezclas de hidrocarburos donde se hallen presentes dichos compuestos (Ejemplos 9 y 10), y (ii) tiene capacidad de adhesion a un soporte de material plastico (Ejemplo 2), lo que facilita su aplicacion in-situ para el tratamiento de medios acuosos que comprenden mezclas de hidrocarburos. Un cultivo biologicamente puro de dicha bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o de una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano, constituye un aspecto adicional de la presente invencion.

En otro aspecto, la invencion proporciona una bacteria del genero Acinetobacter (Acinetobacter sp. BIRD 11), depositada en la CECT el 25 de septiembre de 2012, con numero de acceso CECT 8214, que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano, y sus combinaciones, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano, y sus combinaciones. Ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que dicha cepa Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214) (i) es capaz de crecer utilizando dodecano, hexadecano, eicosano, docosano o tetracosano como unica fuente de carbono (Ejemplo 1), o en mezclas de hidrocarburos donde se hallen presentes dichos compuestos (Ejemplos 9 y 10), y (ii) tiene capacidad de adhesion a un soporte de material plastico (Ejemplo 2), lo que facilita su aplicacion in-situ para el tratamiento de medios acuosos que comprenden mezclas de hidrocarburos. Un cultivo biologicamente puro de dicha bacteria Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214), o de una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano, y sus combinaciones, constituye un aspecto adicional de la presente invencion.

El termino “hidrocarburo aromatico policlclico” o “HAP”, tal como aqu se utiliza se refiere a un compuesto qulmico organico que se compone de
anillos aromaticos simples que se han unido, y no contiene heteroatomos ni lleva
sustituyentes. En general, se encuentran HAPs en el
petroleo, el
carbon y en depositos de
alquitran y tambien como productos de la utilization de combustibles (ya sean fosiles o biomasa). Como contaminantes han despertado preocupacion debido a que algunos compuestos han sido identificados como
carcinogenos,
mutagenos y
teratogenos. Ejemplos ilustrativos de estos compuestos incluyen antraceno, benzo[a]pireno, coranuleno, coroneno, criseno, fenantreno, naftaceno, naftaleno, pentaceno, pireno, trifenileno, ovaleno, etc. La condition de aromaticidad puede hacerse extensible a sistemas policlclicos que incluyan varios anillos bencenicos condensados, como por ejemplo los hidrocarburos aromaticos policlclicos (HAPs). Ejemplos ilustrativos de estos compuestos incluyen naftaleno (C10H8), fenantreno (C14H10), pireno (C20H12), etc.

La expresion “capacidad de degradar (un HAP)” o “que degrada (un HAP)”, aplicada a una bacteria, tal como se utiliza en esta description, significa que dicha bacteria es capaz de utilizar un HAP como fuente de carbono, y en consecuencia, produce la degradation de dicho HAP. Todos los procesos de biodegradation proporcionados por la presente invencion son de naturaleza aerobica y precisan por tanto de la presencia de oxlgeno molecular para su progreso. El mecanismo habitual de biodegradacion de los HAPs requiere la action de enzimas que degradan hidrocarburos aromaticos y enzimas que generan intermedios del metabolismo central que son finalmente respirados por los microorganismos.

La capacidad de una bacteria para degradar un HAP puede determinarse por cualquier procedimiento convencional; por ejemplo inoculando dicha bacteria en un medio que contenga

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el HAP de interes como unica fuente de carbono y energla, y llevando a cabo la incubacion de dicho cultivo bajo las condiciones apropiadas de agitacion y temperatura. Un recuento de las bacterias viables o un seguimiento de la densidad optica del cultivo a una longitud de onda de 660 nm (OD66o), tal y como se describe en el Ejemplo 1, proporcionara information adecuada sobre el crecimiento de la bacteria. Bajo estas condiciones, un aumento de cualquiera de los dos parametros sera indicativo de que la bacteria es capaz de emplear dicho HAP como fuente de carbono y energla. Alternativamente, la aparicion de color en el cultivo es indicativo de la metabolizacion del compuesto considerado.

En otro aspecto, la invention proporciona una bacteria del genero Pseudoxantohomonas (Pseudoxanthomonas sp. BIRD 3), depositada en la CECT el 9 de septiembre de 2009, con numero de acceso CECT 7607, que degrada un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno y fenantreno, y sus combinaciones, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno y fenantreno, y sus combinaciones. Ensayos realizados por los inventores han puesto de manifiesto que dicha cepa Pseudoxanthomonas sp. BIRD 3 (CECT 7607) (i) es capaz de crecer utilizando naftaleno o fenantreno como unica fuente de carbono (Ejemplo 1), o en mezclas de hidrocarburos donde se hallen presentes dichos compuestos (Ejemplos 9 y 10), y (ii) tiene capacidad de adhesion a un soporte de material plastico (Ejemplo 2), lo que facilita su aplicacion in-situ para el tratamiento de medios acuosos que comprenden mezclas de hidrocarburos. Un cultivo biologicamente puro de dicha bacteria Pseudoxanthomonas sp. BIRD 3 (CECT 7607), o de una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones, constituye un aspecto adicional de la presente invencion.

En otra realizacion particular, se contempla el empleo de una bacteria que degrada un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o- xileno, m-xileno, p-xileno, y sus combinaciones (BTEX), tal como una bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWW0). En una realization concreta, dicha bacteria que degrada dicho hidrocarburo aromatico es la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), que incorporado el plasmido TOL (pWW0), y, por tanto, tiene capacidad para degradar BTEX ademas de dodecano, o la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213) que incorpora el plasmido TOL (pWW0), y, por tanto, tiene capacidad para degradar BTEX ademas de hexadecano. La incorporation del plasmido TOL (pWW0) a las cepas BIRD 9 (CECT 8212) y BIRD 10 (CECT 8213) puede llevarse a cabo por metodos convencionales, por ejemplo, mediante un mecanismo de conjugacion bacteriano, tal como se ha mencionado previamente.

El termino “hidrocarburo aromatico”, tal como aqu se utiliza se refiere a un compuesto qwmico que cumple la Ley de Huckel sobre la distribution de electrones n en el anillo. Todos los compuestos derivados del benceno se consideran como hidrocarburos aromaticos, siempre y cuando se mantenga intacto el caracterlstico anillo bencenico. Ejemplos ilustrativos de estos compuestos incluyen tolueno (C6H5(CH3)), etilbenceno (C6H5(CH2-CH3)), xilenos (C6H4(CH3)2), etc.

La expresion “capacidad de degradar (un hidrocarburo aromatico)” o “que degrada (un hidrocarburo aromatico)”, aplicada a una bacteria, tal como se utiliza en esta description, significa que dicha bacteria es capaz de utilizar un hidrocarburo aromatico como fuente de carbono, y en consecuencia, produce la degradation de dicho hidrocarburo aromatico. Todos los procesos de biodegradacion proporcionados por la presente invencion son de naturaleza aerobica y precisan por tanto de la presencia de oxlgeno molecular para su progreso. El mecanismo habitual de biodegradation de los hidrocarburos aromaticos requiere para su inicio la action de una enzima mono- o di-oxigenasa especlfica para la degradacion de hidrocarburos aromaticos. Un posterior sistema enzimatico constituido por una serie de enzimas conduce a la

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generation de intermedios del metabolismo central que son finalmente respirados por los microorganismos (Ri-He Peng et al., citado supra).

La capacidad de una bacteria para degradar un hidrocarburo aromatico puede determinarse por cualquier procedimiento convencional; por ejemplo inoculando dicha bacteria en un medio que contenga el hidrocarburo aromatico de interes como unica fuente de carbono y energla, y llevando a cabo la incubation de dicho cultivo bajo las condiciones apropiadas de agitation y temperatura. Un recuento de las bacterias viables o un seguimiento de la densidad optica del cultivo a una longitud de onda de 660 nm (OD660), tal y como se describe en el Ejemplo 1, proporcionara information adecuada sobre el crecimiento de la bacteria. Bajo estas condiciones, un aumento de cualquiera de los dos parametros sera indicativo de que la bacteria es capaz de emplear dicho hidrocarburo aromatico como fuente de carbono y energla. Alternativamente, la aparicion de color en el cultivo es indicativo de la metabolizacion del compuesto considerado.

En otro aspecto, la invencion proporciona un cultivo que comprende una mezcla bacteriana de la invention, o un consorcio bacteriano de la invention. Las caracterlsticas de dicha mezcla bacteriana de la invention, as! como las de dicho consorcio bacteriano de la invention, han sido definidas previamente y se incorporan aqul por referencia.

3. Aislamiento de bacterias con capacidad de degradar alcanos alifaticos

En otro aspecto, la invention proporciona un procedimiento para el aislamiento de una bacteria que degrada un alcano alifatico, en adelante “procedimiento de aislamiento de la invention para bacterias degradadoras de alcanos alifaticos”, que comprende las siguientes etapas:

a) anadir a una muestra sospechosa de contener una o mas bacterias degradadoras de alcanos alifaticos, seleccionada entre muestra llquida y una muestra de una suspension de suelo, una fuente de carbono que comprende uno o mas de los alcanos alifaticos susceptibles de ser degradados por las bacterias presentes en dicha muestra;

b) incubar el medio o suspension resultante de la etapa a) bajo condiciones que permitan el crecimiento de bacterias capaces de degradar dichos uno o mas alcanos alifaticos;

c) una vez observada turbidez en el medio resultante de la etapa b) preparar nuevos cultivos llquidos que comprenden medio mineral mlnimo M9 y la fuente de carbono correspondiente, comprendiendo dicha fuente de carbono un alcano alifatico susceptible de ser degradado por las bacterias presentes en el medio resultante en la etapa b), e inocular con una allcuota del medio resultante en la etapa b);

d) incubar la suspension resultante de la etapa c) bajo condiciones que permitan el crecimiento de dicha bacteria capaz de degradar uno o mas alcanos alifaticos;

e) repetir las etapas c) y d) las veces que se considere necesario para favorecer el crecimiento de bacterias degradadoras de alcanos alifaticos;

f) sembrar diluciones seriadas de los medios resultantes en las etapas b), d) y similares en placas de medio solido selectivo suplementadas con la correspondiente fuente de carbono;

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g)

incubar las placas sembradas en la etapa f) durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 4 dlas a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C;

h)

aislar y purificar las colonias de las bacterias que, obtenidas tras la incubacion de la etapa f), son capaces de utilizar uno o mas alcanos alifaticos como unica fuente de carbono en condiciones aerobicas; y

i)

seleccionar, y, opcionalmente, si se desea, caracterizar, las cepas de las colonias aisladas y purificadas en la etapa f).

Brevemente, la muestra utilizada en la etapa a) del procedimiento de aislamiento de la invention para bacterias degradadoras de alcanos alifaticos puede ser cualquier muestra de suelo o agua sospechosas de contener bacterias con capacidad para degradar un alcano alifatico, por ejemplo, una muestra de suelo, tal como un suelo contaminado con hidrocarburos, como consecuencia, por ejemplo, de un derrame de combustible o afectado por la fuga de un tanque de almacenamiento de combustible que comprende dichos hidrocarburos, o bien una muestra de suelo o agua procedente de alguna instalacion en la que se manipulen combustibles que comprenden dichos hidrocarburos, como por ejemplo, refinerlas, estaciones de servicio o lavado, aeropuertos, zonas de aparcamiento, etc. A la suspension o medio se le anade una fuente de carbono que comprende un alcano alifatico susceptible de ser degradado por dicha bacteria. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de compuestos que pueden usarse como fuente de carbono incluyen cualquier alcano alifatico (CnH2n+2), por ejemplo, octano (n=8), dodecano (n=12), hexadecano (n=16), eicosano (n=20), docosano (n=22), tetracosano (n=24), octacosano (n=28), triacontano (n=30), hexatriacontano (n=36), etc., o mezclas complejas de hidrocarburos donde se hallen presentes esos compuestos, tales como gasoil, gasolina, Jet A1, etc., lo que permitira seleccionar bacterias capaces de metabolizar dichos alcanos alifaticos.

La suspension o medio resultante de la etapa a) se incuba bajo condiciones que permitan el crecimiento de dicha bacteria capaz de degradar uno o mas de dichos alcanos alifaticos (etapa

b)). Dichas condiciones dependen, en general, de la bacteria. No obstante, en una realization particular, dichas condiciones comprenden incubar la suspension a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C, de 7 a 15 dlas, en condiciones aerobicas.

Una allcuota de la suspension o medio obtenido en la etapa b) se emplea para inocular un nuevo cultivo preparado exclusivamente con medio mineral mlnimo M9 y que incorpora, al menos, un alcano alifatico como unica fuente de carbono (etapa c)) susceptible de ser degradado por las bacterias presentes en el medio resultante en la etapa b). La sucesiva repetition de los pasos de aislamiento (etapas c) y d)) favorece el crecimiento preferente de las bacterias capaces de degradar al menos un alcano alifatico.

A continuation, se siembran diluciones seriadas de las suspensiones o medios obtenidos en los pasos b), d) y similares, en placas de medio solido selectivo que contienen al menos el alcano alifatico o mezcla de alcanos alifaticos anadido en las etapas a), c) y similares como unica fuente de carbono. Las placas se cultivan a una temperatura comprendida entre 25 °C y 30°C, y durante un periodo de tiempo comprendido entre 1 y 4 dlas (etapa f)).

Posteriormente, se procede a aislar y purificar las colonias de bacterias que, obtenidas tras la incubacion de la etapa g), son capaces de utilizar el hidrocarburo empleado como unica fuente de carbono (etapa h), y a continuacion, si se desea, se procede a seleccionar y, opcionalmente, caracterizar las cepas (etapa i)), aisladas y purificadas en la etapa h). En la practica, resulta recomendable caracterizar las bacterias con el fin de identificar dichas bacterias as! como sus respectivas fuentes de carbono (Ejemplo 1).

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Mediante el procedimiento de aislamiento de la invencion para bacterias degradadoras de alcanos alifaticos, utilizando como fuente de carbono un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, triacontano y hexatriacontano, previamente descrito se han aislado las bacterias:

- Rhodococcus sp. BIRD 7 (CECT 8211), que degrada un alcano alifatico

seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones;

- Bacillus sp. BIRD 8 (CECT 8210), que degrada octano, hexadecano, octacosano, triacontano, tetracontano y sus combinaciones;

- Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), que degrada dodecano;

- Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), que degrada hexadecano; y

- Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214), que degrada un alcano alifatico

seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones.

4. Aislamiento de bacterias con capacidad de degradar HAPs

En otro aspecto, la invencion proporciona un procedimiento para el aislamiento de una bacteria que degrada un hidrocarburo aromatico polidclico (HAP), en adelante “procedimiento de aislamiento de la invencion para bacterias degradadoras de HAPs”, que comprende las siguientes etapas:

a) anadir a cada uno de los pocillos de una placa de fondo profundo el medio de cultivo que se desee emplear en el aislamiento de dicha bacteria;

b) anadir a cada pocillo el HAP para el que se desee realizar la busqueda de bacterias que degradan dicho HAP;

c) inocular los pocillos con allcuotas procedentes de muestras acuosas o suspensiones de suelos sospechosas de contener bacterias degradadoras de HAPs;

d) incubar las placas de fondo profundo bajo condiciones que permitan el crecimiento de bacterias capaces de degradar un HAP;

e) preparar nuevos medios llquidos, preparados con el mismo medio que el anadido en la etapa a), y el HAP para el que se desee buscar bacterias que degradan dicho HAP;

f) inocular los medios resultantes de la etapa e) con allcuotas procedentes de aquellos pocillos de la placa de fondo profundo que hayan presentado turbidez o coloracion durante el desarrollo de la etapa d);

g) incubar los cultivos resultantes de la etapa e) bajo condiciones que permitan el crecimiento de bacterias capaces de degradar un HAP;

h) sembrar diluciones seriadas de los cultivos resultantes de la etapa g) en placas de medio solido selectivo suplementadas con el HAP correspondiente;

i) incubar los medios solidos resultantes de la etapa h) bajo condiciones que permitan el crecimiento de bacterias capaces de degradar un HAP;

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j) aislar y purificar las colonias de las bacterias que, obtenidas tras la incubacion de la etapa i), son capaces de utilizar un HAP como unica fuente de carbono en condiciones aerobicas; y

k) seleccionar y, opcionalmente, si se desea, caracterizar las cepas de las colonias aisladas y purificadas en la etapa j).

En la etapa a) se anade a cada uno de los pocillos de una placa de fondo profundo, tal como una placa Deep-Well, un volumen adecuado del medio de cultivo que se desee emplear para aislar las bacterias que degraden el HAP, tal como medio mineral mlnimo M9, o cualquier otro medio de cultivo que se desee emplear en el aislamiento de dichas bacterias, y, a continuation, a cada uno de dichos pocillos se anade el HAP para el que se desee realizar la busqueda de bacterias que lo degradan. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de compuestos que pueden usarse como fuente de carbono en la busqueda de bacterias degradadoras de HAPs incluyen naftaleno (Ci0H8), fenantreno (Ci4H8), antraceno (Ci4H8), pireno (C2oH12), etc., o mezclas complejas de hidrocarburos donde se hallen presentes estos compuestos, lo que permitira seleccionar bacterias capaces de metabolizar dichos HAPs.

Brevemente, las muestras utilizadas para la inoculation de los cultivos en la etapa c) pueden ser cualquier muestra de suelo o agua sospechosas de contener bacterias con capacidad para degradar un HAP. Por ejemplo, una muestra de suelo, tal como un suelo contaminado con uno o mas HAPs, como consecuencia, por ejemplo, de un derrame de combustible o afectado por la fuga de un tanque de almacenamiento de combustible, o bien una muestra de suelo o agua procedente de alguna instalacion en la que se manipulen combustibles que comprenden dichos HAPs, como por ejemplo, refinerlas, estaciones de servicio o lavado, aeropuertos, zonas de aparcamiento, etc.

La suspension o medio resultante de la etapa c) se incuba bajo condiciones que permitan el crecimiento de una bacteria capaz de degradar un HAP (etapa d)). Dichas condiciones dependen, en general, de la bacteria. No obstante, en una realization particular, dichas condiciones comprenden incubar la suspension a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C, de 15 a 40 dlas, en condiciones aerobicas.

Una allcuota de la suspension o medio obtenido en la etapa d) se emplea para inocular un nuevo cultivo preparado exclusivamente con el medio utilizado en la etapa a), por ejemplo, medio mineral mlnimo M9 o cualquier otro medio de cultivo que se desee emplear, al que se le anade al menos un HAP como unica fuente de carbono (etapa f)).

Los cultivos resultantes de la etapa f) se incuban en condiciones que permitan el crecimiento de bacterias degradadoras de HAPs (etapa g)), y, a continuacion, se siembran diluciones seriadas de las suspensiones o medios obtenidos en la etapa g) en placas de medio solido que incorporen el HAP de interes como unica fuente de carbono. Las placas se cultivan a una temperatura comprendida entre 25°C y 30°C, y durante un periodo de tiempo comprendido entre 2 y 7 dlas (etapa h)).

Posteriormente, se procede a aislar y purificar las colonias de bacterias que, obtenidas tras la incubacion de la etapa i), son capaces de utilizar el HAP como unica fuente de carbono (etapa j)). A continuacion, si se desea, se procede a seleccionar y, opcionalmente, caracterizar las cepas (etapa k)), aisladas y purificadas en la etapa j).

Mediante un procedimiento como el procedimiento de aislamiento de la invencion para bacterias degradadoras de HAPs como el descrito previamente se pudo aislar la bacteria Pseudoxanthomonas sp. BIRD 3 (CECT 7607) que degrada un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno y sus combinaciones.

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5. Soporte activo

Las bacterias proporcionadas por esta invention presentan la capacidad de desarrollar mecanismos de adhesion que les confieren la capacidad de formar un biofilm o biopellcula bacteriana sobre una superficie de un material inerte con capacidad para flotation. Una vez iniciada la formation del biofilm o biopellcula bacteriana, estas bacterias favorecen la adhesion del resto de bacterias que no presenten dicha capacidad. Las bacterias adheridas al soporte inerte conservan su capacidad para degradar alcanos alifaticos (y, en su caso, hidrocarburos aromaticos) o HAPs, por lo que pueden ser empleados, en combination con dicho soporte, para el tratamiento de medios acuosos que comprenden mezclas de dichos hidrocarburos.

Ventajosamente, para la puesta en practica de la presente invencion se seleccionaran bacterias que presenten la capacidad de desarrollar mecanismos de adhesion que les confieren la capacidad de formar un biofilm o biopellcula bacteriana sobre una superficie de material plastico inerte o de cualquier otro material con capacidad para la flotacion.

Por tanto, en otro aspecto, la invencion se relaciona con un soporte activo, en adelante “soporte activo de la invencion”, que comprende un soporte solido inerte y un biofilm (biopellcula) bacteriano.

Dicho soporte debe cumplir algunas caracterlsticas especlficas, tales como:

a) debe ser sustancialmente inerte (es decir, no debe afectar adversamente a las bacterias que tienen que ser soportadas sobre dicho soporte), y

b) debe ser un material con densidad inferior a la del agua, y, por tanto, con su flotabilidad, facilite el contacto de la bacteria con el hidrocarburo, el cual, por razones de densidad, se encuentra preferentemente distribuido de forma heterogenea sobre la superficie del medio acuoso que comprende la mezcla de hidrocarburos.

Ventajosamente, dicho soporte inerte y con una densidad inferior a la del agua, poseera una elevada superficie especlfica con el fin de que pueda disponer de una elevada capacidad de fijacion de dichas bacterias; en general, cuanto mayor sea la superficie especlfica del soporte mas superficie habra para que se pueda desarrollar la actividad bacteriana. Aunque la superficie especlfica puede variar dentro de un amplio intervalo, en una realization particular, la superficie especlfica esta comprendida entre 100 m2/m3 y 3.000 m2/m3, tlpicamente entre 250 m2/m3 y 2.000 m2/m3, ventajosamente entre 500 m2/m3 y 1.500 m2/m3.

Practicamente cualquier soporte que cumpla dichas condiciones puede ser utilizado en la puesta en practica de la presente invencion. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de materiales que pueden ser empleados como soporte incluyen tanto productos naturales como sinteticos, por ejemplo, arlita o LECA (arcilla expandida), vermiculita, etc., materiales plasticos, tales como espumas de poliuretano (BULPREN®, FILTREN®), o poliestireno expandido (Kaldness K1®) o incluso “poliespan”. Otros materiales naturales tales como piedra pomez, virutas de madera, serrln, etc. tambien son susceptibles de ser empleados como soporte. Las densidades de los materiales indicados oscilan entre 0,4 g/cm3 y 0,95 g/cm3 y sus areas especlficas abarcan desde 500 m2/m3 a los 1500 m2/m3 dependiendo del material considerado (Andersson et al., “Assessment of carrier materials for biofilm formation and denitrification” (2008), Vatten, 64, 201-207).

Dicho biofilm bacteriano comprende las bacterias proporcionadas por esta invencion, bien en forma de cultivos biologicamente puros o bien en forma de mezclas bacterianas, por ejemplo, en forma de mezclas bacterianas de la invencion o de un consorcio bacteriano de la invencion.

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Las caracterlsticas de dicha mezcla bacteriana de la invention, o de dicho consorcio bacteriano de la invencion, ya han sido mencionadas previamente y se incorporan aqul por referencia.

Asl, en una realization particular, dicho biofilm bacteriano es un film formado por una bacteria seleccionada del grupo formado por Rhodococcus sp. BIRD 7 (CECT 8211), Bacillus sp. BIRD 8 (CECT 8210), Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214), y Pseudoxanthomonas sp. BIRD 3 (CECT 7607), y cualquiera de sus mezclas.

En otra realizacion particular, dicho biofilm bacteriano es un film formado por una mezcla bacteriana, o por un consorcio bacteriano, que comprende Rhodococcus sp. BIRD 7 (CECT 8211), Bacillus sp. BIRD 8 (CECT 8210), Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), Pseudomonas sp. BIRD 10 (CeCT 8213), Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214), y Pseudoxanthomonas sp. BIRD 3 (CECT 7607). En otra realizacion particular, dicha mezcla bacteriana, o dicho consorcio bacteriano, comprende, ademas, una bacteria que degrada un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o- xileno, m-xileno, p-xileno, y sus combinaciones, tal como una bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWW0) de P. putida que confiere capacidad para degradar BTEX, por ejemplo, una bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212) que incorpora el plasmido TOL (pWW0) y/o una bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213) que incorpora el plasmido TOL (pWW0), con lo que tienen capacidad ademas para degradar BTEX.

El soporte activo de la invencion se puede obtener por metodos convencionales que comprenden la adhesion al soporte inerte de la mezcla bacteriana de la invencion. En una realizacion particular, la adhesion al soporte de la mezcla bacteriana de la invencion, o del consorcio bacteriano de la invencion, se realiza mediante un cultivo secuencial de las bacterias en unos reactores apropiados, por ejemplo, unos reactores de polietileno de 30 L de capacidad, y en presencia del volumen adecuado de soporte para cubrir la superficie de la fase acuosa. Dicho cultivo secuencial comienza con la inoculation del medio de cultivo con las bacterias que presentan mayor capacidad de adhesion al soporte inerte: Rhodococcus sp. BIRD 7 (CECT 8211), Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212) y Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214). Una vez formado un biofilm inicial con esas bacterias, el medio se inocula con aquellas bacterias con menor capacidad para la adhesion al soporte inerte: Bacillus sp. BIRD 8 (CECT 8210), Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213) y Pseudoxhantomonas sp. BIRD 3 (CeCt 7607). Las condiciones creadas por el biofilm formado inicialmente favorecen la adhesion de estas ultimas bacterias. El cultivo se mantiene en condiciones estaticas y a temperatura ambiente durante un perlodo de aproximadamente 2 semanas o bien hasta observar un adecuado crecimiento del biofilm. Tanto el soporte inerte como los reactores de polietileno fueron sometidos antes de su empleo a procesos de esterilizacion, por ejemplo, mediante autoclavado durante 20 min a 121°C en el caso de los soportes y en estufa a 90°C durante 1 hora en el caso de los reactores.

Las bacterias adheridas al soporte inerte (soporte activo de la invencion) mantienen su capacidad para degradar alcanos alifaticos o HAPs, por lo que el soporte activo de la invencion puede ser utilizado en el tratamiento de medios acuosos que comprenden uno o mas de dichos hidrocarburos, por ejemplo, aguas contaminadas con esos hidrocarburos, tales como, por ejemplo, aguas residuales recogidas en una SPH, aguas residuales contaminadas con vertidos de dichos hidrocarburos o de fases organicas que los contengan, tales como gasoil, gasolina, Jet A1, etc.

En una realizacion particular, la mezcla bacteriana de la invencion, o el consorcio bacteriano de la invencion, presente en el soporte activo de la invencion comprende:

a) al menos, una bacteria que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano,

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hexatriacontano y sus combinaciones, por ejemplo, una bacteria del genero Rhodococcus con capacidad para degradar dichos alcanos alifaticos, tal como la bacteria Rhodococcus sp. BIRD 7 (CECT 8211), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones;

g) al menos, una bacteria que degrada un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno, y sus combinaciones, por ejemplo, una bacteria del genero Pseudomonas con capacidad para degradar dicho hidrocarburo aromatico, tal como (i) la bacteria Pseudomonas BIRD 9 (CECT 8212) con el plasmido TOL (pWW0), o una mutante de la misma con capacidad para degradar un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno, y sus combinaciones, (ii) la bacteria Pseudomonas BIRD 10 (CeCt 8213) con el plasmido TOL (pWW0), o una mutante de la misma con capacidad para degradar un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m- xileno, p-xileno, y sus combinaciones, o (iii) ambas bacterias (i) y (ii).

En otra realization particular, cuando la bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWW0), que confiere capacidad para degradar BTEX, es (i) la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano, o (ii) la

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bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano, la mezcla bacteriana de la invencion, o el consorcio bacteriano de la invencion, comprende:

En una realization mas particular, dicha bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWW0) es la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la

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capacidad de degradar dodecano. En otra realization mas particular, dicha bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWW0) es la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano. En otra realization mas particular, las bacterias que incorporan el plasmido TOL (pWW0) son las bacterias Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano, y Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano.

Adicionalmente, si se desea, la mezcla bacteriana de la invention, o el consorcio bacteriano de la invention, puede contener microorganismos con capacidad de adhesion a superficies plasticas o minerales (e.g. poliestireno, poliespan, vermiculita, arlita, piedra pomez, etc.), microorganismos productores de biosurfactantes, etc. El experto en la materia conoce ejemplos ilustrativos de dichos microorganismos. Ejemplos ilustrativos, no limitativos, de dichos microorganismos incluyen microorganismos pertenecientes a los generos Agromyces, Delftia, etc.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la invention y no deben ser considerados como limitativos del alcance de la misma.

EJEMPLO 1

Biodeqradacion bacteriana de alcanos alifaticos, hidrocarburos aromaticos policiclicos (HAPs) y BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno y formas m-, o- y para- de xilenos)

Se estudio la capacidad de algunas bacterias para biodegradar alcanos alifaticos, hidrocarburos aromaticos policiclicos (HAPs) y BTEX (benceno, tolueno, etilbenceno y formas m-, o- y para- de xilenos).

Las bacterias estudiadas fueron:

a) Rhodococcus sp. BIRD 7 (CECT 8211) [con capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones];

b) Bacillus sp. BIRD 8 (CECT 8210) [con capacidad de degradar octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones];

c) Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212) [con capacidad de degradar dodecano] que incorpora el plasmido tOl (pWW0) mediante un mecanismo de conjugation bacteriano (Abril et al., Regulator and enzyme specificities of the TOL plasmid- encoded upper pathway for degradation of aromatic hydrocarbons and expansion of the substrate range of the pathway (1989), J. Bacteriol., 171; 6782-6790), con lo que tiene capacidad ademas para degradar BTEX;

d) Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213) [con capacidad de degradar hexadecano] que incorpora el plasmido TOL (pWW0) mediante un mecanismo de conjugation bacteriano (Abril et al. (1989) citado supra), con lo que tiene capacidad ademas para degradar BTEX;

e) Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214) [con capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones]; y

f) Pseudoxanthomonas sp. BIRD 3 (CECT 7607) [con capacidad de degradar un hidrocarburo aromatico policlclico seleccionado del grupo formado por naftaleno y fenantreno y sus combinaciones].

Los alcanos alifaticos empleados para este estudio abarcaron hasta 15 compuestos distintos con cadenas comprendidas entre 8 (C8H18) y 60 (C60H122) atomos de carbono. Como representantes de los HAPs se emplearon naftaleno (C8H10) y fenantreno (C14H10).

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Para alcanos alifaticos y HAPs se emplearon tubos de vidrio Pyrex® de 15 mL de capacidad, a cada uno de los cuales se adicionaron 3 mL de medio mineral mlnimo M9 y una unica fuente de carbono de entre todas las indicadas. Dicho medio mineral mineral M9 es un medio mlnimo sin fuente de carbono cuya composition especlfica por litro es: 70 g de Na2HPO4x12H2O, 30 g de KH2PO4, 10 g de NH4Cl, 5 g de NaCl, 0,52 g de MgSO4, 0,006 g de citrato ferrico amonico y 2,5 mL de solution A9. La composicion especlfica de la solution A9 por litro es la siguiente: 300 mg de H3BO3, 50 mg de ZnCl2, 30 mg de MnCl2x4H2O, 200 mg de CoCl2, 10 mg de CuCl2x2H2O, 20 mg de NiCl2x6H2O y 30 mg de NaMoO4x2H2O [Abril et al., "Regulator and enzyme specificities of the TOL plasmid-encoded upper pathway for degradation of aromatic hydrocarbons and expansion of the substrate range of the pathway”, 1989; J. Bacteriol., 171; 6782-6790], Para los alcanos alifaticos en estado llquido (de 8 a 16 carbonos) se anadio al tubo con el medio mineral mlnimo un volumen de 100 nL de fase organica. Para los alcanos alifaticos en estado solido con cadenas entre 20 y 24 carbonos se anadio al tubo con el medio un volumen de 150 DL de una disolution en eter dietllico (C4H10O) del alcano. El resto de alcanos alifaticos (hasta 60 atomos de carbono) y los HAPs (naftaleno y fenantreno) se anadieron en forma de lascas a los tubos, asegurando as! una concentration por encima de la solubilidad del compuesto organico. Cada tubo fue inoculado entonces con la cepa deseada y mantenido en agitation en un rotatubo Stuart SB3 a unas 40 rpm por un periodo de tiempo de 9 a 13 dlas. Transcurrido dicho periodo se empleo un espectrofotometro Shimadzu UV-1700 PharmaSpec para medir la densidad optica a una longitud de onda de 660 nm (OD660nm) de cada uno de los cultivos, estimandose as! el crecimiento de cada cepa. Todos aquellos cultivos con un valor de densidad optica a 660 nm menor de 0,5 unidades (OD660nm < 0,5 unidades) fueron considerados como resultado negativo. Como control positivo se empleo un cultivo de cada cepa en medio mineral mlnimo M9 suplementado con glucosa. Un control negativo sin microorganismo pero con la fuente de carbono correspondiente tambien fue empleado en estos ensayos.

Para los BTEX se emplearon erlenmeyers de vidrio Pyrex® con tapon de rosca de 100 mL de capacidad. Un volumen de 25 mL de medio mineral mlnimo M9 fue inoculado con el microorganismo deseado y la fuente de carbono (mezcla de volumenes equivalentes de cada uno de los BTEX) fue anadida a un tubo hueco de vidrio en forma de "U” que se coloco en el interior de cada erlenmeyer. Esta disposition permite la evaporation de la fase organica, que queda as! disponible para su asimilacion por el microorganismo, y, al mismo tiempo, evita el contacto directo con este, disminuyendo posibles efectos toxicos del compuesto organico. El volumen de fase organica anadido a cada tubo de vidrio fue de unos 150 DL y los cultivos se mantuvieron en agitacion a unas 50 rpm durante un periodo de 9-13 dlas transcurridos los cuales se procedio a medir la densidad optica del cultivo, tal y como se ha descrito previamente en este Ejemplo 1. Todos aquellos cultivos con un valor de OD660nm < 0,5 unidades fueron considerados como resultado negativo. Como control positivo se empleo un cultivo de cada cepa en medio mlnimo mineral M9 suplementado con glucosa. Un control negativo sin microorganismo pero con la fuente de carbono correspondiente tambien fue empleado en estos ensayos.

Resultados

Para cada una de las bacterias estudiadas se comprobo su capacidad para degradar cada uno de los compuestos organicos indicados a continuation; entre parentesis se indica el valor maximo de densidad optica alcanzado (OD660nm).

- Rhodococcus sp. BIRD 7 (CECT 8211): dodecano (0,827), eicosano (4,450), docosano (4,010), tetracosano (2,280), octacosano (1,510) y hexatriacontano (0,646).

- Bacillus sp. BIRD 8 (CECT 8210): octano (0,725), hexadecano (1,580), octacosano (1,105) y triacontano (0,650).

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- Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), incorporando el plasmido TOL (pWW0): dodecano (0,654), benceno (1,209), tolueno (1,405), etilbenceno (1,105) y mezcla de xilenos (1,480).

- Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), incorporando el plasmido TOL (pWW0): hexadecano (5,650), benceno (1,105), tolueno (1,455), etilbenceno (1,201) y mezcla de xilenos (1,520).

- Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214): dodecano (1,314), hexadecano (0,836), eicosano (1,650), docosano (1,830) y tetracosano (0,946).

- Pseudoxanthomonas sp. BIRD 3 (CECT 7607): naftaleno (1,182) y fenantreno (0,809).

EJEMPLO2

Estudio de la capacidad de adhesion a un soporte inerte de material plastico

Las bacterias identificadas en el Ejemplo 1 fueron sometidas a un estudio para determinar su capacidad de adhesion a un soporte inerte de material plastico. Para el ensayo de adhesion se emplearon placas multipocillo de material plastico (polipropileno) y 3 diferentes medios llquidos de cultivo:

a) medio LB (Luria Bertani);

b) medio mineral mlnimo M9 suplementado con glucosa (0,5% p/v); y

c) medio mineral mlnimo M9 suplementado con hexadecano (C16H34; 0,5% v/v) como representante de los alcanos alifaticos.

Por cada una de las 6 bacterias a estudiar se prepararon pocillos por triplicado para cada uno de los tres medios ensayados, conteniendo cada uno de ellos un volumen de 90 DL del medio de cultivo correspondiente. Cada pocillo fue inoculado entonces con un volumen de 10 nL de un cultivo de la cepa deseada, previamente incubado en condiciones de agitacion durante 1216 h en el medio llquido mas apropiado para su crecimiento. Las placas multipocillos fueron incubadas entonces por un periodo de 6 h a una temperatura de 30°C y sometidas a una agitacion de 150 rpm. Una vez transcurrido dicho tiempo de incubation, el medio de cultivo fue retirado y sustituido por 150 DL de cristal violeta (mezcla de N-tetra, N-penta y N-hexametil p- rosanilinas) con el fin de tenir los microorganismos que hubiesen quedado adheridos a la placa. Despues de unos 15 minutos de contacto, el colorante sobrante se retira de cada pocillo mediante una serie de lavados suaves con agua destilada. Una vez secos, una inspection visual de los pocillos permite distinguir aquellos microorganismos que presenten capacidad de adhesion, la cual viene indicada por existencia de coloration azul en el pocillo. No obstante, este metodo permite tambien cuantificar, aunque de forma indirecta, la cantidad de biomasa adherida al pocillo por medida de la densidad optica (a una longitud de onda entre 500 y 600 nm) mediante un lector de placas ELISA modelo BioTek Synergy.

Los resultados de adhesion, para cada uno de los 6 microorganimos de la invention estudiados, se recogen a continuacion. Entre parentesis se indica el medio de cultivo utilizado (LB para medio Luria Bertani, M9+G para medio mineral mlnimo suplementado con glucosa y M9+HD para medio mineral mlnimo suplementado con hexadecano). Los valores numericos delante del medio de cultivo indican la absorcion del cristal violeta recuperado de la biomasa. Valores superiores a 0,2 unidades indican una buena adherencia en tanto que los valores de absorcion superiores a 0,5 unidades son indicativos de una adhesion excelente.

- Rhodococcus sp. BIRD 7 (CECT 8211): 0,3733 (LB), 0,5978 (M9+G) y 0,0628 (M9+HD).

- Bacillus sp. BIRD 8 (CECT 8210): 0,2264 (LB), 0,0918 (M9+G) y 0,0912 (M9+HD).

- Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212): 0,7165 (LB), 0,8390 (M9+G) y 0,3275(M9+HD).

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- Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213): 0,1231 (LB), 0,5351 (M9+G) y 0,5266 (M9+HD).

- Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214): 0,06341 (LB), 0,6763 (M9+G) y 0,7125 (M9+HD).

- Pseudoxanthomonas sp. BIRD 3 (CECT 7607): 0,0671 (LB), 0,2327 (M9+G) y 0,0576 (M9+HD)

Como se deduce de los valores anteriores todas las cepas presentan al menos una condition de cultivo que les permite una buena adhesion a un soporte inerte de material plastico.

EJEMPLO3

Tratamiento fisicoquimico de contaminantes con peroxido de hidrogeno (H2O2)

Todos los tratamientos fisicoqulmicos con peroxido de hidrogeno (H2O2, solution acuosa al 30%) se han llevado a cabo en matraces esfericos de vidrio PYREX® con una capacidad de 2 L. Las muestras contaminadas empleadas procedlan de una unidad separadora de hidrocarburos (SPH) operativa en el area de practicas de incendios de una instalacion aeroportuaria de la red de AENA (Aeropuertos Espanoles y Navegacion Aerea). La concentration inicial de hidrocarburos totales de petroleo (TPHs) en las muestras empleadas en estos ensayos oscilo en un rango que abarco desde unas 150 partes por millon (ppm) hasta valores superiores a las 80.000 ppm. Las fracciones mayoritarias fueron las alifaticas C21-C34 y C12-C16, siendo la distribution porcentual de las distintas fracciones de hidrocarburo en las muestras empleadas la indicada a continuacion:

a) Fracciones alifaticas: C5-C8 (<1%), C8-C10 (1-8%), C10-C12 (1-7%), C12-C16 (10-35%), C16- C21 (1-12%) y C21-C34 (60-75%).

b) Fracciones aromaticas: C8-C10 (<1%), C10-C12 (1-7%), C12-C16 (1-3%), C16-C21 (1-3%) y

C21-C35 (<1%).

c) Fraction TPHs GRO C10 (compuestos organicos en el rango de las gasolinas): 2-25%.

d) Fraccion TPHs DRO C10-C35 (compuestos organicos en el rango del diesel): 75-98%.

La mezcla de la muestra contaminada con el peroxido de hidrogeno se ha realizado mediante el empleo de un agitador magnetico Stuart SB161, en condiciones relativamente suaves de agitation (aproximadamente 70 rpm). El volumen total en cada ensayo ha sido de 1.250 mL. En los distintos ensayos realizados con este oxidante se han probado 4 diferentes concentraciones de peroxido (0,1; 1,0; 5,0 y 15,0% v/v) y 3 distintos tiempos de tratamiento (8, 24 y 48 horas).

Los resultados mostraron reducciones comprendidas entre un 40% y un 60% de la concentracion inicial de contaminante para tratamientos con peroxido de hidrogeno al 1% v/v durante periodos de 24 y 48 horas.

Las concentraciones iniciales y finales de hidrocarburos totales de petroleo en cada ensayo se determinaron mediante el metodo de separation de cadenas por la tecnica de cromatografla de gases acoplada a espectrografla de masas (GC-MS).

EJEMPLO 4

Tratamiento fisicoquimico de contaminantes con ozono (O3)

Todos los tratamientos fisicoqulmicos con ozono (O3) se han llevado a cabo en vasos de vidrio PYREX®, de 5 L de capacidad. Las muestras contaminadas empleadas procedlan de una unidad separadora de hidrocarburos (SPH) operativa en el area de practicas de incendios de

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una instalacion aeroportuaria de la red de AENA. El contenido inicial en hidrocarburos totales de petroleo (TPHs), asl como la distribution porcentual de las distintas fracciones de hidrocarburos son los ya indicados en el Ejemplo 3 anterior.

El ozono, generado mediante un ozonizador ECOLOGYC500, ha sido burbujeado en la muestra mediante el empleo de un difusor de material ceramico. El volumen total de muestra en cada ensayo ha sido de 1.250 mL. Para una mayor eficacia en la difusion del gas, la muestra ha sido agitada en condiciones relativamente energicas (aproximadamente 100 rpm) durante todo el tiempo de tratamiento. La concentration de ozono en la muestra ha sido controlada periodicamente mediante medida con fotometro AQUALYTIC AL200 y ha sido estimada en aproximadamente unos 0,15 mg O3/L durante la duration de los ensayos. En los distintos ensayos realizados con ozono se han probado 2 diferentes tiempos de aplicacion del oxidante (1,5 y 3 horas) y 2 distintos pHs iniciales en la muestra a tratar (7 y 10 unidades de pH). El ajuste previo de pH de la muestra hasta alcanzar un valor de 10 unidades se realizo mediante la adicion de un volumen adecuado de una disolucion de hidroxido sodico (NaOH) 3N.

Se obtuvieron reducciones del 50% de hidrocarburo para un tiempo de tratamiento de 1,5 horas, y proximas al 100% para tratamientos a 3 horas. En ambos casos el pH inicial de la muestra estuvo en torno a las 7 unidades y no fue necesario por tanto ajuste previo de pH.

Las concentraciones iniciales y finales de hidrocarburos totales de petroleo en cada ensayo se determinaron mediante el metodo de separation de cadenas por la tecnica de GC-MS.

EJEMPLO 5

Tratamiento flsicoqulmico de contaminantes con peroxido de hidrogeno y ozono (H2O2 +

O3)

Todos los tratamientos fisicoqulmicos con peroxido de hidrogeno (H2O2, solution acuosa al 30%) y ozono (O3) se han llevado a cabo en vasos de vidrio PYREX®, de 5 L de capacidad. Las muestras contaminadas empleadas procedlan de una unidad separadora de hidrocarburos (SPH) operativa en el area de practicas de incendios de una instalacion aeroportuaria de la red de AENA. El contenido inicial en hidrocarburos totales de petroleo (TPHs), asl como la distribucion porcentual de las distintas fracciones de hidrocarburos son los ya indicados en el Ejemplo 3 anterior.

El peroxido de hidrogeno (H2O2) ha sido utilizado siempre a una concentracion del 1% (v/v). El ozono, generado mediante un ozonizador ECOLOGYC500, ha sido burbujeado en la muestra mediante el empleo de un difusor de material ceramico. El volumen total de muestra en cada ensayo ha sido de 1.250 mL. Para una mayor eficacia en la difusion del gas, la muestra ha sido agitada en condiciones relativamente energicas (aproximadamente 100 rpm) durante todo el tiempo de tratamiento. La concentracion de ozono en la muestra ha sido controlada periodicamente mediante medida con fotometro AQUALYTIC AL200 y ha sido estimada en aproximadamente unos 0,15 mg O3/L durante la duracion de los ensayos. En los distintos ensayos realizados de forma simultanea con los dos agentes oxidantes se ha trabajado con dos tiempos de aplicacion de peroxido de hidrogeno (5 y 24 horas) y tres distintos tiempos de aplicacion de ozono (0,5-1,0 y 1,5 horas).

Se obtuvieron reducciones de hidrocarburo comprendidas entre un 80 y un 90% del contenido inicial para tiempos de tratamiento combinado de 5 horas con peroxido de hidrogeno (H2O2) y 0,5 horas con ozono (O3).

Las concentraciones iniciales y finales de hidrocarburos totales de petroleo en cada ensayo se determinaron mediante el metodo de separacion de cadenas por la tecnica de GC-MS.

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EJEMPLO6

Tratamiento fotoquimico de contaminantes con peroxido de hidrogeno (H2O2) y radiacion

ultravioleta (UV)

Los tratamientos fotoquimicos con peroxido de hidrogeno (H2O2) y radiacion ultravioleta (UV) se han llevado a cabo en un reactor de cuarzo de configuration anular, con una capacidad de 700 mL. Las muestras contaminadas empleadas procedlan de una unidad separadora de hidrocarburos (SPH) operativa en el area de practicas de incendios de una instalacion aeroportuaria de la red de AENA. El contenido inicial en hidrocarburos totales de petroleo (TPHs), asl como la distribution porcentual de las distintas fracciones de hidrocarburos son los ya indicados en el ejemplo 3 que acompana a esta invention.

El peroxido de hidrogeno (H2O2) ha sido utilizado siempre a una concentration del 1% (v/v). La mezcla de la muestra contaminada con el peroxido de hidrogeno se ha realizado mediante el empleo de un agitador magnetico Stuart SB161, en condiciones relativamente suaves de agitation (aproximadamente 70 rpm). La radiacion UV fue generada mediante una lampara de mercurio de baja presion Heraeus TQ150, de 150 vatios de potencia, y emitiendo radiacion policromatica en el rango de 200 a 600 nm, con un pico de emision destacado a 254 nm. Para la refrigeration de la lampara se empleo agua destilada recirculada continuamente mediante una bomba peristaltica PERCOM NM. El volumen total de muestra en cada ensayo ha sido de 650 mL. En los distintos ensayos realizados se ha trabajado con dos tiempos de aplicacion de peroxido de hidrogeno (2 y 4 horas) y aporte de radiacion ultravioleta durante el 10% del tiempo de tratamiento total, es decir, 12 y 24 minutos respectivamente.

Se obtuvieron reducciones de hidrocarburo en torno a un 50% del contenido inicial de contaminante para el tratamiento combinado de 4 horas con peroxido de hidrogeno (H2O2) e irradiation con ultravioleta (UV) durante 24 minutos.

Las concentraciones iniciales y finales de hidrocarburos totales de petroleo en cada ensayo se determinaron mediante un metodo de separation de cadenas por la tecnica de GC-MS.

EJEMPLO 7

Tratamiento fotoquimico de contaminantes con ozono (O3) y radiacion ultravioleta (UV)

Los tratamientos fotoquimicos con ozono (O3) y radiacion ultravioleta (UV) se han llevado a cabo en un reactor de cuarzo de configuracion anular, con una capacidad de 700 mL. Las muestras contaminadas empleadas procedlan de una unidad separadora de hidrocarburos (SPH) operativa en el area de practicas de incendios de una instalacion aeroportuaria de la red de AENA. El contenido inicial en hidrocarburos totales de petroleo (TPHs), asl como la distribucion porcentual de las distintas fracciones de hidrocarburos son los ya indicados en el Ejemplo 3 anterior.

El ozono, generado mediante un ozonizador ECOLOGYC500, ha sido burbujeado en la muestra mediante el empleo de un difusor de material ceramico. La difusion del gas en la fase acuosa se ha favorecido mediante el empleo de un agitador magnetico Stuart SB161, en condiciones relativamente energicas de agitacion (aproximadamente 100 rpm). La concentracion de ozono en la muestra ha sido controlada periodicamente mediante medida con fotometro AQUALYTIC AL200 y ha sido estimada en aproximadamente unos 0,15 mg O3/L durante la duration de los ensayos. La radiacion UV fue generada mediante una lampara de mercurio de baja presion Heraeus TQ150, de 150 vatios de potencia, y emitiendo radiacion policromatica en el rango de 200 a 600 nm, con un pico de emision destacado a 254 nm. Para la refrigeracion de la lampara se empleo agua destilada recirculada continuamente mediante una bomba peristaltica PERCOM NM. El volumen total de muestra en cada ensayo ha sido de

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650 mL. En los distintos ensayos realizados se ha trabajado con tres tiempos distintos de tratamiento (15, 30 y 60 minutos) durante los cuales el ozono fue burbujeado de forma continua a la muestra contaminada.

Se obtuvieron reducciones en torno a un 80% del contenido inicial de hidrocarburos para el tratamientos de 30 minutos y muy cercanas al 100% para tratamientos de 60 minutos, con valores de contaminante por debajo de los Ifmites de cuantificacion (LC) del metodo (LC= 100 ng TPHs/L) [TPHs: Total petroleum hydrocarbons].

EJEMPLO8

Tratamiento fotoquimico de contaminantes con peroxido de hidrogeno (H2Q2). ozono (Q3)

y radiacion ultravioleta (UV)

Los tratamientos fotoqufmicos con peroxido de hidrogeno (H2O2), ozono (O3) y radiacion ultravioleta (UV) se han llevado a cabo en un reactor de cuarzo de configuration anular, con una capacidad de 700 mL. Las muestras contaminadas empleadas procedfan de una unidad separadora de hidrocarburos (SPH) operativa en el area de practicas de incendios de una instalacion aeroportuaria de la red de AENA. El contenido inicial en hidrocarburos totales de petroleo (TPHs), asf como la distribution porcentual de las distintas fracciones de hidrocarburos son los ya indicados en el Ejemplo 3 anterior.

El peroxido de hidrogeno (H2O2) ha sido utilizado siempre a una concentration del 1% (v/v). El ozono, generado mediante un ozonizador ECOLOGYC500, ha sido burbujeado en la muestra mediante el empleo de un difusor de material ceramico. La mezcla del peroxido de hidrogeno con la muestra y la difusion del gas en la fase acuosa se han favorecido mediante el empleo de un agitador magnetico Stuart SB161, en condiciones relativamente energicas de agitation (aproximadamente 100 rpm). La radiacion UV fue generada mediante una lampara de mercurio de baja presion Heraeus TQ150, de 150 vatios de potencia, y emitiendo radiacion policromatica en el rango de 200 a 600 nm, con un pico de emision destacado a 254 nm. Para la refrigeration de la lampara se empleo agua destilada recirculada continuamente mediante una bomba peristaltica PERCOM NM. El volumen total de muestra en cada ensayo ha sido de 650 mL. En los distintos ensayos realizados se ha trabajado con un unico tiempo de tratamiento (4 horas) y con burbujeo de ozono e irradiation con ultravioleta durante 30 minutos.

Se obtuvieron reducciones de hidrocarburo muy proximas al 100% en el tiempo indicado (4 horas), con concentraciones de contaminante por debajo de los Ifmites de cuantificacion del metodo (LC = 100 Dg TPHs/L).

EJEMPLO 9

Tratamiento fisicoquimico de contaminantes con peroxido de hidrogeno y ozono (H2Q2 +

03)

Una muestra de agua potable contaminada artificialmente con dos tipos de combustible, gasolina y gasoil, fue empleada para la simulation de un tratamiento fisicoquimico en un separador de hidrocarburos (SPH) operativo en una estacion de servicio. La muestra fue contaminada con un volumen de 1,56 mL de cada uno de los dos combustibles citados y agitada durante un corto periodo de tiempo para favorecer la dispersion del contaminante. La concentracion inicial de hidrocarburos totales de petroleo en dicha muestra fue estimada en

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378.900 mg TPH/L y la distribution porcentual de las distintas fracciones de hidrocarburo en la muestra empleada es la indicada a continuation:

a) Fracciones alifaticas: C5-C8 (<1%), C8-Ci0 (30%), C10-C12 (<1%), Ci2-C16 (5%), C16-C2i (1,5%) y C21-C34 (7%).

b) Fracciones aromaticas: C8-C10 (26%), C10-C12 (18%), C12-C16 (<1%), C16-C21 (<1%) y C21-C35 (<1%).

c) Fraction TPHs GRO C10 (compuestos organicos en el rango de las gasolinas): 85%.

d) Fraccion TPHs DRO C10-C35 (compuestos organicos en el rango del diesel): 15%.

El ataque de la muestra con peroxido de hidrogeno (H2O2) y ozono (O3) se llevo a cabo en las condiciones experimentales similares a las ya descritas en el Ejemplo 5 anterior. Los ataques con peroxido de hidrogeno y ozono se realizaron de forma simultanea durante 24 y 3 horas respectivamente.

La reduction de hidrocarburo obtenida en este ensayo se situo en un 70% aproximadamente.

EJEMPLO 10

Tratamiento bioloqico de contaminantes con un consorcio bacteriano

Los tratamientos biologicos se han realizado en reactores esfericos de vidrio PYREX®, con una capacidad de 2 L. Las muestras contaminadas empleadas procedlan de una unidad separadora de hidrocarburos (SPH) operativa en el area de practicas de incendios de una instalacion aeroportuaria de la red de AENA. El contenido inicial en hidrocarburos totales de petroleo (TPHs), asl como la distribution porcentual de las distintas fracciones de hidrocarburos se indican a continuation:

b) Fracciones aromaticas: C8-C10 (<1%), C10-C12 (1-7%), C12-C16 (1-3%), C16-C21 (1-3%) y C21-C35 (<1%).

c) BTEX: benceno (0,5-1,5%), tolueno (1-15%), etilbenceno (0,1-3%) y xilenos (1-15%)

d) Fraccion TPHs GRO C10 (compuestos organicos en el rango de las gasolinas): 2-25%.

e) Fraccion TPHs DRO C10-C35 (compuestos organicos en el rango del diesel): 75-98%.

Para dichos ensayos, un volumen de muestra de aproximadamente unos 700 mL fue inoculado con un consorcio constituido por las 6 bacterias identificadas en el Ejemplo 1, concretamente:

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c) Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212) [con capacidad de degradar dodecano] que incorpora el plasmido TOL (pWW0), con lo que tiene capacidad ademas para degradar BTEX;

d) Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213) [con capacidad de degradar hexadecano] que incorpora el plasmido TOL (pWW0), con lo que tiene capacidad ademas para degradar BTEX;

Para la formation de este consorcio, y, con unas 24 horas de antelacion al comienzo del tratamiento, cada una de las 6 bacterias previamente indicadas fue cultivada previamente en unos 3 mL de medio Luria Bertani (LB). Una vez crecidas, cada uno de los cultivos fue ajustado a un valor de densidad optica (OD660nm) situado entre 0,05 y 0,2 unidades, tras lo cual un volumen de 0,3 mL de cada uno de estos preinoculos fue anadido a la muestra contaminada. Para favorecer el desarrollo de la masa bacteriana, el medio fue suplementado con nutrientes adecuados (fosfatos, nitrogeno, oligoelementos, etc.) y con un inductor gratuito, no asimilable por los microorganismos, y cuya funcion es la de activar y/o acelerar las rutas de degradation de los alcanos alifaticos, acortando asl los tiempos de aclimatacion necesarios. Estos ensayos biologicos fueron llevados a cabo tanto en condiciones estaticas como de agitacion suave (aproximadamente 70 rpm) mediante el empleo de un agitador magnetico Stuart SB161.

Las reducciones de hidrocarburos totales de petroleo (TPHs) observadas en estos ensayos se situaron entre el 80% y el 90% de la cantidad inicial de contaminante, tras tratamientos biologicos por un perlodo de tiempo comprendido entre los 15 y 20 dlas. Para el conjunto de los BTEX se observaron disminuciones entre el 80% y el 95% del contenido inicial.

EJEMPLO 11

Tratamiento flsicoqulmico-bioloqico de contaminantes con peroxido de hidrogeno y un

consorcio bacteriano

Para los tratamientos biologicos con tratamiento fisicoqulmico previo de la muestra, muestras contaminadas con una mezcla compleja de hidrocarburos fueron sometidas a un pretratamiento fisicoqulmico de oxidation mediante un ataque con peroxido de hidrogeno a una concentration final del 1 % v/v, por un periodo de tiempo de aproximadamente 24 horas, tras lo cual dichas muestras fueron sometidas a un tratamiento biologico segun lo descrito en el Ejemplo 10 anterior. Las muestras contaminadas empleadas procedlan de una unidad separadora de hidrocarburos (SPH) operativa en el area de practicas de incendios de una instalacion aeroportuaria de la red de AENA. El contenido inicial en hidrocarburos totales de petroleo (TPHs), asl como la distribution porcentual de las distintas fracciones de hidrocarburos son los ya indicados en el Ejemplo 3 anterior.

El sistema se mantuvo en agitation suave (aproximadamente 70 rpm) durante los 20 dlas de duration de cada ensayo biologico. Durante el ataque con peroxido de hidrogeno se aprecio en las muestras una reduction proxima a un 50% del hidrocarburo inicialmente presente. El posterior tratamiento biologico aumento hasta el 98% la cantidad de hidrocarburo desaparecida lograndose porcentajes de reduccion ligeramente superiores a los obtenidos en los ensayos exclusivamente biologicos descritos en el Ejemplo 10 anterior.

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EJEMPLO 12

Tratamiento biologico de contaminantes con un soporte activo que comprende un

consorcio bacteriano

Se realizo un tratamiento biologico in-situ de la fase acuosa contaminada con hidrocarburo presente en el separador de hidrocarburos (SPH) del area de extincion de incendios de una instalacion aeroportuaria de la red de AENA. El contenido inicial en hidrocarburos totales de petroleo (TPHs), asl como la distribution porcentual de las distintas fracciones de hidrocarburos son los ya indicados en el Ejemplo 3 anterior.

Dicho tratamiento se llevo a cabo mediante la adicion al separador de un soporte activo proporcionado por esta invention. Este soporte, fabricado en polietileno de alta densidad, tiene forma de rueda dentada con un diametro aproximado de 14 mm. Presenta una densidad aproximada de 0,96 g/cm3, lo cual le confiere capacidad de flotation en fases acuosas y gracias a su forma proporciona un aumento significativo de la superficie disponible para el crecimiento bacteriano, estimado en 650 m2/m3. El area del separador objeto del tratamiento fue la zona comprendida entre la placa deflectora de entrada y la placa filtrante, con una superficie aproximada de unos 0,5 m2 (0,53 x 0,80 m). En esta zona se anadieron unos 40 L de cultivo y suficiente soporte activo para cubrir completamente la superficie de trabajo indicada. El ensayo tuvo una duration de 40 dlas durante los cuales dicho soporte activo fue ampliamente colonizado por el consorcio bacteriano identificado en el Ejemplo 10 anterior.

Para un cultivo a mayor escala del consorcio formado por las 6 bacterias previamente identificadas se utilizaron reactores de 30 L de capacidad con cierre hermetico, cada uno de los cuales fue llenado con unos 15 L de medio mineral mlnimo M9 e inoculado con un consorcio bacteriano constituido por los microorganismos de la invencion, preparados de forma analoga a lo indicado en el ejemplo 10 que acompana a esta invencion. Posteriormente se anadio a cada reactor un volumen de aproximadamente 1 L de soporte, suficiente para cubrir toda la superficie del llquido. Los reactores se mantuvieron en reposo y a temperatura ambiente durante 15 dlas para permitir la colonization del soporte plastico por parte del consorcio. Transcurrido este tiempo el conjunto cultivo/soporte estuvo listo para su aplicacion en el separador.

Una vez finalizado el ensayo, el soporte activo fue retirado del separador y la concentration final de TPHs en la fase acuosa del separador fue determinada mediante el metodo habitual segun lo descrito en los Ejemplos anteriores. Los resultados obtenidos en este ensayo indicaron un porcentaje de desaparicion del contaminante superior al 95%.

EJEMPLO 13

Tratamiento flsicoqulmico-biologico de contaminantes con peroxido de hidrogeno y un soporte activo que comprende un consorcio bacteriano

Se realizo un tratamiento in-situ de la fase acuosa contaminada con hidrocarburo presente en el separador de hidrocarburos (SPH) del area de extincion de incendios de una instalacion aeroportuaria de la red de AENA. El contenido inicial en hidrocarburos totales de petroleo (TPHs), asl como la distribucion porcentual de las distintas fracciones de hidrocarburos son los ya indicados en el Ejemplo 3 anterior.

El area del separador objeto del tratamiento fue la zona comprendida entre la placa deflectora de entrada y la placa filtrante, con una superficie aproximada de unos 0,5 m2 (0,53 x 0,80 m). El

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tratamiento consistio en un pretratamiento fisicoquimico del residuo con peroxido de hidrogeno (H2O2) durante 48 horas, seguido de un posterior tratamiento biologico en las condiciones ya indicadas en el Ejemplo 12. El volumen de peroxido de hidrogeno anadido a la zona de actuation fue de aproximadamente unos 2,5 litros. El agente oxidante se distribuyo de forma superficial sobre la fase acuosa contaminada mediante el uso de un sistema aspersor manual de aire comprimido tipo mochila. Este sistema permite una mayor distribution y dispersion del agente oxidante sobre la superficie a tratar. Tras 15 dlas de tratamiento el soporte activo fue retirado del separador y el contenido en hidrocarburos totales de petroleo se determino de la forma habitual. La reduction de contaminante en este ensayo se estimo en algo mas del 98% con respecto al contenido inicial transcurridos 15 dlas desde el comienzo del tratamiento biologico.

EJEMPLO 14

Determinacion de la cinetica de degradation de un hidrocarburo aromatico policlclico (HAP) mediante cromatoqrafia llquida de alta resolution (HPLC)

Para determinar las cineticas de biodegradation de naftaleno y fenantreno, 200 mg de cada uno de estos HAPs se disolvieron en metanol para disponer de una disolucion stock de 20 mg HAP/mL. Por otro lado, se prepararon una serie de erlenmeyers de 150 mL con tapon de rosca, a los que se anadio un volumen de 15 mL de medio mineral mlnimo M9. A cada uno de los matraces se anadio entonces un volumen de 80 nL del stock de HAP previamente preparado, para obtener una concentration inicial de aproximadamente 105 ng HAP/mL. Tras 1 hora de agitacion para favorecer la homogeneizacion del medio, este fue inoculado con 0,15 mL de un preinoculo de la cepa bacteriana Pseudoxanthomonas sp. BIRD 3 (CECT 7607). Este preinoculo se preparo con 24 horas de antelacion a la inoculation de los medios de forma analoga a lo indicado anteriormente en el ejemplo 10 que acompana a esta invention . Los cultivos fueron incubados durante toda la duration del ensayo a 150 rpm y 30°C de temperatura. Controles sin inocular se prepararon tambien de la misma forma para descartar la desaparicion abiotica del hidrocarburo. No se llevaron a cabo pruebas similares para el resto de las bacterias identificadas en el Ejemplo 1 ya que los estudios preliminares (Ejemplo 1) hablan dado resultados negativos para la biodegradacion de naftaleno y fenantreno.

Con la periodicidad deseada, erlenmenyers por duplicado fueron empleados para la determinacion de la concentracion de HAP. Para ello, a cada uno de los erlenmenyers se anadieron 15 mL de metanol, y la mezcla cultivo/metanol fue mantenida en agitacion durante 2 horas para permitir la extraction del HAP. Tras la agitacion, se tomo una allcuota de 4 mL de mezcla que fue anadida a un tubo de vidrio Pyrex® de 15 mL de capacidad que contenla otros 4 mL de metanol. El tubo fue agitado energicamente durante 2 minutos mediante vortex. Posteriormente la mezcla se centrifugo a 4.000 rpm durante un periodo de 5 minutos para separar la biomasa presente. Un volumen de aproximadamente 1 mL de sobrenadante fue filtrado a traves de un filtro de nylon de 0,22 nm, tras lo cual la muestra quedo lista para su inyeccion en el sistema cromatografico. El equipo empleado fue un Agilent Technologies 1200 Series, equipado con sendos detectores de matriz de diodos (DAD) y de fluorescencia (FLD). La columna cromatografica empleada fue una ZORBAX Eclipse PAH (5 Dm, 4.6x150 mm) especialmente recomendada para la determinacion de estos compuestos. Para la determinacion de los HAPs de forma individual se opero con una fase movil acetonitrilo/agua en regimen isocratico (60/40) y un flujo de 2 mL/min. Los resultados indicaron una degradation del 100% del naftaleno inicial en un periodo de 48 horas y de aproximadamente un 95% de fenantreno inicial en un periodo de unas 96 horas

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REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento biologico para reducir el contenido de hidrocarburos presentes en un medio acuoso que comprende una mezcla de hidrocarburos, en donde dicha mezcla de hidrocarburos comprende

a) un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, triacontano, hexatriacontano y sus combinaciones;

b) un hidrocarburo aromatico policlclico (HAP) seleccionado del grupo formado por naftaleno y fenantreno, y sus combinaciones; y

c) un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno y sus combinaciones (BTEX),

comprendiendo dicho procedimiento poner en contacto dicho medio acuoso contaminado por dicha mezcla de hidrocarburos con una mezcla bacteriana que comprende

- al menos una bacteria que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, triacontano, hexatriacontano y sus combinaciones; y

- al menos una bacteria que degrada un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones; y

- al menos una bacteria que degrada un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno y sus combinaciones (BTEX).
2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicha mezcla bacteriana comprende una bacteria del genero Rhodococcus que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones.
3. Procedimiento segun la reivindicacion 2, en el que dicha bacteria del genero Rhodococcus que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones es la bacteria Rhodococcus sp. BIRD 7, depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) con numero de acceso CECT 8211, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones.
4. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicha mezcla bacteriana comprende una bacteria del genero Bacillus que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones.
5. Procedimiento segun la reivindicacion 4, en el que dicha bacteria del genero Bacillus que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones es la bacteria Bacillus sp. BIRD 8, depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) con numero de acceso CECT 8210, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones.

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6. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicha mezcla bacteriana comprende, ademas, una bacteria del genero Pseudomonas que degrada dodecano.
7. Procedimiento segun la reivindicacion 6, en el que dicha bacteria del genero Pseudomonas que degrada dodecano es la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9, depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) con numero de acceso CECT 8212, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano.
8. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicha mezcla bacteriana comprende, ademas, una bacteria del genero Pseudomonas que degrada hexadecano.
9. Procedimiento segun la reivindicacion 8, en el que dicha bacteria del genero Pseudomonas que degrada hexadecano es la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10, depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) con numero de acceso CECT 8213, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano.
10. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicha mezcla bacteriana comprende una bacteria que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones.
11. Procedimiento segun la reivindicacion 10, en el que dicha bacteria del genero Acinetobacter que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones es la bacteria Acinetobacter sp. BIRD 11, depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) con numero de acceso CECT 8214, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones.
12. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicha mezcla bacteriana comprende una bacteria del genero Pseudoxanthomonas que degrada un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones.
13. Procedimiento segun la reivindicacion 12, en el que dicha bacteria del genero Pseudoxanthomonas que degrada un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones, es la bacteria Pseudoxanthomonas sp. BIRD-3, depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) con numero de acceso CECT 7607, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dicho HAP.
14. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicha bacteria que degrada dicho hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o- xileno, m-xileno, p-xileno, y sus combinaciones (BTEX), es una bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWW0).
15. Procedimiento segun la reivindicacion 14, en el que dicha bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWW0) es la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212) que incorpora dicho plasmido TOL (pWW0), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano e incorpora dicho plasmido TOL (pWW0), o la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), que incorpora dicho plasmido TOL (pWW0), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano e incorpora dicho plasmido TOL (pWW0).
16. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que dicha mezcla bacteriana comprende:

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a) al menos una bacteria del genero Rhodococcus que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones;

b) al menos, una bacteria del genero Bacillus que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones;

c) al menos una bacteria del genero Pseudomonas que degrada dodecano;

d) al menos una bacteria del genero Pseudomonas que degrada hexadecano;

e) al menos una bacteria del genero Acinetobacter que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones;

f) al menos una bacteria del genero Pseudoxanthomonas que degrada un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones; y

g) al menos una bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWW0) que degrada un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno, y sus combinaciones (BTEX).
17. Procedimiento segun la reivindicacion 16, en el que dicha mezcla bacteriana comprende:

a) al menos la bacteria Rhodococcus sp. BIRD 7 (CECT 8211), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones;

b) al menos la bacteria Bacillus sp. BIRD 8 (CECT 8210), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones;

c) al menos la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano;

d) al menos la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano;

e) al menos la bacteria Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones;

f) al menos la bacteria Pseudoxanthomonas sp. BIRD-3 (CECT 7607), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones; y

g) al menos una bacteria seleccionada del grupo formado por (i) la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano, que incorpora el plasmido TOL (pWW0), (ii) la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que

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tiene la capacidad de degradar hexadecano, que incorpora el plasmido TOL (pWW0), y (iii) una combination de las bacterias (i) y (ii).
18. Procedimiento segun la reivindicacion 16, en el que dicha mezcla bacteriana comprende:

a) al menos la bacteria Rhodococcus sp. BIRD 7 (CECT 8211), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones;

b) al menos la bacteria Bacillus sp. BIRD 8 (CECT 8210), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones;

c) al menos la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano;

d) al menos la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano;

e) al menos la bacteria Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones; y

f) al menos la bacteria Pseudoxanthomonas sp. BIRD-3 (CECT 7607), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones;

en donde, al menos, una de dichas bacterias c) Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano, o d) Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano, incorpora el plasmido TOL (pWW0), que confiere capacidad para degradar un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o- xileno, m-xileno, p-xileno y sus combinaciones (BTEX).
19. Procedimiento segun la reivindicacion 1, 17 o 18, en el que dicha mezcla bacteriana es un consorcio bacteriano.
20. Procedimiento segun la reivindicacion 19, en el que dicho consorcio bacteriano comprende:

a) al menos una bacteria del genero Rhodococcus que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones;

b) al menos, una bacteria del genero Bacillus que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones;

c) al menos una bacteria del genero Pseudomonas que degrada dodecano;

d) al menos una bacteria del genero Pseudomonas que degrada hexadecano;

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e) al menos una bacteria del genero Acinetobacter que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones;

f) al menos una bacteria del genero Pseudoxanthomonas que degrada un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones; y

g) al menos una bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWW0) que degrada un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno, y sus combinaciones (BTEX).
21. Procedimiento segun la reivindicacion 20, en el que dicho consorcio bacteriano comprende:

a) al menos la bacteria Rhodococcus sp. BIRD 7 (CECT 8211), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones;

b) al menos la bacteria Bacillus sp. BIRD 8 (CECT 8210), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones;

c) al menos la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano;

d) al menos la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano;

e) al menos la bacteria Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones;

f) al menos la bacteria Pseudoxanthomonas sp. BIRD-3 (CECT 7607), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno y sus combinaciones; y

g) al menos una bacteria seleccionada del grupo formado por (i) la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano, que incorpora el plasmido TOL (pWW0), (ii) la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano, que incorpora el plasmido TOL (pWW0), y (iii) una combination de las bacterias (i) y (ii).
22. Procedimiento segun la reivindicacion 19, en el que dicho consorcio bacteriano comprende:

a) al menos la bacteria Rhodococcus sp. BIRD 7 (CECT 8211), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones;

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b) al menos la bacteria Bacillus sp. BIRD 8 (CECT 8210), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones;

c) al menos la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano;

d) al menos la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano;

e) al menos la bacteria Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones; y

f) al menos la bacteria Pseudoxanthomonas sp. BIRD-3 (CECT 7607), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones;

en donde, al menos, una de dichas bacterias c) Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano, o d) Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano, incorpora el plasmido TOL (pWW0), que confiere capacidad para degradar un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o- xileno, m-xileno, p-xileno y sus combinaciones (BTEX).
23. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que dichas bacterias estan adheridas a un soporte solido inerte formando un biofilm bacteriano, en donde dicho soporte solido inerte comprende un material que tiene una densidad inferior a la del agua.
24. Procedimiento segun la reivindicacion 23, en el que dicho soporte solido inerte comprende un material seleccionado del grupo formado por arcilla expandida, vermiculita, espuma de poliuretano, poliestireno expandido, piedra pomez, virutas de madera, serrln, y combinaciones de los mismos.
25. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, que comprende someter dicho medio acuoso que comprende dicha mezcla de hidrocarburos a un tratamiento fisicoqulmico previo al tratamiento biologico, comprendiendo dicho tratamiento flsicoqulmico poner en contacto dicho medio acuoso con un agente oxidante con capacidad para degradar al menos un hidrocarburo presente en dicha mezcla de hidrocarburos.
26. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 24, que comprende someter dicho medio acuoso que comprende dicha mezcla de hidrocarburos a un tratamiento fotoqulmico previo al tratamiento biologico, comprendiendo dicho tratamiento fotoqulmico poner en contacto dicho medio acuoso con un agente oxidante con capacidad para degradar al menos un hidrocarburo presente en dicha mezcla de hidrocarburos, y una radiacion ultravioleta (UV) a una longitud de onda (A) adecuada en funcion del agente oxidante.
27. Procedimiento segun la reivindicacion 25 o 26, en el que dicho agente oxidante se selecciona del grupo formado por peroxido de hidrogeno, ozono y sus combinaciones.
28. Procedimiento segun la reivindicacion 27, en el que dicho peroxido de hidrogeno se suministra mediante un sistema de spray o aspersor, manual o automatico, de aire comprimido.

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29. Una bacteria del genero Rhodococcus (Rhodococcus sp. BIRD 7), depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) con numero de acceso CECT 8211, que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones.
30. Una bacteria del genero Bacillus (Bacillus sp. BIRD 8), depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) con numero de acceso CECT 8210, que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones.
31. Una bacteria del genero Pseudomonas (Pseudomonas sp. BIRD 9), depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) con numero de acceso CECT 8212, que degrada dodecano, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano.
32. Una bacteria del genero Pseudomonas (Pseudomonas sp. BIRD 10), depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) con numero de acceso CECT 8213, que degrada hexadecano, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano.
33. Una bacteria del genero Acinetobacter (Acinetobacter sp. BIRD 11), depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) con numero de acceso CECT 8214, que degrada un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones.
34. Una bacteria del genero Pseudoxanthomonas (Pseudoxanthomonas sp. BIRD 3), depositada en la Coleccion Espanola de Cultivos Tipo (CECT) con numero de acceso CECT 7607, que degrada un hidrocarburo aromatico policlclico (HAP) seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno y sus combinaciones, o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno y sus combinaciones.
35. Bacteria segun cualquiera de las reivindicaciones 29 a 34, que tiene, ademas, capacidad para desarrollar mecanismos de adhesion a la superficie de un material con una densidad inferior a la del agua.
36. Un cultivo biologicamente puro de una bacteria segun cualquiera de las reivindicaciones 29 a 35.
37. Un cultivo que comprende una mezcla de las bacterias definidas en las reivindicaciones 29 a 35.
38. Cultivo segun la reivindicacion 37, en el que dicha mezcla bacteriana comprende:

a) al menos la bacteria Rhodococcus sp. BIRD 7 (CECT 8211), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del

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grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones;

b) al menos la bacteria Bacillus sp. BIRD 8 (CECT 8210), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones;

c) al menos la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano;

d) al menos la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano;

e) al menos la bacteria Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones; y

f) al menos la bacteria Pseudoxanthomonas sp. BIRD-3 (CECT 7607), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un HAP.
39. Cultivo segun la reivindicacion 36, 37 o 38, en el que dicha mezcla bacteriana comprende, ademas, una bacteria que degrada un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o-xileno, m-xileno, p-xileno, y sus combinaciones.
40. Cultivo segun la reivindicacion 39, en el que dicha bacteria que degrada dicho hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o- xileno, m-xileno, p-xileno, y sus combinaciones, es una bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWW0).
41. Cultivo segun la reivindicacion 40, en el que dicha bacteria que incorpora el plasmido TOL (pWW0) es la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212) que incorpora dicho plasmido TOL (pWW0), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano e incorpora dicho plasmido TOL (pWW0), o la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), que incorpora dicho plasmido TOL (pWW0), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano e incorpora dicho plasmido TOL (pWW0).
42. Cultivo segun cualquiera de las reivindicaciones 36 a 41, en el que dicha mezcla bacteriana forma un consorcio bacteriano.
43. Un consorcio bacteriano que comprende:

a) al menos la bacteria Rhodococcus sp. BIRD 7 (CECT 8211), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones;

b) al menos la bacteria Bacillus sp. BIRD 8 (CECT 8210), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones;

c) al menos la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano;

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d) al menos la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano;

e) al menos la bacteria Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones;

f) al menos la bacteria Pseudoxanthomonas sp. BIRD-3 (CECT 7607), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno y sus combinaciones; y

g) al menos una bacteria seleccionada del grupo formado por (i) la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano, que incorpora el plasmido TOL (pWW0), (ii) la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano, que incorpora el plasmido TOL (pWW0), y (iii) una combination de las bacterias (i) y (ii).
44. Consorcio bacteriano segun la revindication 43, que comprende:

a) al menos la bacteria Rhodococcus sp. BIRD 7 (CECT 8211), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, eicosano, docosano, tetracosano, octacosano, hexatriacontano y sus combinaciones;

b) al menos la bacteria Bacillus sp. BIRD 8 (CECT 8210), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar octano, hexadecano, octacosano, triacontano, y sus combinaciones;

c) al menos la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano;

d) al menos la bacteria Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano;

e) al menos la bacteria Acinetobacter sp. BIRD 11 (CECT 8214), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un alcano alifatico seleccionado del grupo formado por dodecano, hexadecano, eicosano, docosano, tetracosano y sus combinaciones; y

f) al menos la bacteria Pseudoxanthomonas sp. BIRD-3 (CECT 7607), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar un HAP seleccionado del grupo formado por naftaleno, fenantreno, y sus combinaciones;

en donde, al menos, una de dichas bacterias c) Pseudomonas sp. BIRD 9 (CECT 8212), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar dodecano, o d) Pseudomonas sp. BIRD 10 (CECT 8213), o una mutante de la misma que tiene la capacidad de degradar hexadecano, incorpora el plasmido TOL (pWW0), que confiere capacidad para degradar un hidrocarburo aromatico seleccionado del grupo formado por benceno, tolueno, etilbenceno, o- xileno, m-xileno, p-xileno y sus combinaciones (BTEX).
45. Un soporte solido activo que comprende un soporte solido inerte y un biofilm bacteriano, en donde dicho soporte solido inerte comprende un material con una densidad inferior a la del agua, y dicho biofilm bacteriano comprende un cultivo biologicamente puro segun la reivindicacion 36 de cada una de las bacterias definidas en las reivindicaciones 29 a 5 35, o un cultivo bacteriano segun cualquiera de las reivindicaciones 37 a 42, o un consorcio

bacteriano segun la reivindicacion 43 o 44.