ES2449941T3 - Procedimiento y kit para la determinación de metabolitos en muestras de manchas de sangre seca - Google Patents
Procedimiento y kit para la determinación de metabolitos en muestras de manchas de sangre seca Download PDFInfo
- Publication number
- ES2449941T3 ES2449941T3 ES10803457.0T ES10803457T ES2449941T3 ES 2449941 T3 ES2449941 T3 ES 2449941T3 ES 10803457 T ES10803457 T ES 10803457T ES 2449941 T3 ES2449941 T3 ES 2449941T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- adenosine
- deoxyadenosine
- extraction
- water
- sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 49
- 239000008280 blood Substances 0.000 title claims abstract description 47
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 title claims abstract description 47
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 title claims abstract description 20
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims abstract description 240
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 claims abstract description 64
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 claims abstract description 64
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 41
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 33
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 29
- PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-O (R)-carnitinium Chemical compound C[N+](C)(C)C[C@H](O)CC(O)=O PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-O 0.000 claims abstract description 25
- 229960004203 carnitine Drugs 0.000 claims abstract description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 15
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 9
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 9
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 6
- 238000002641 enzyme replacement therapy Methods 0.000 claims description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 43
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 27
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 25
- -1 Acryl Chemical group 0.000 description 20
- 102000055025 Adenosine deaminases Human genes 0.000 description 20
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 19
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 12
- 101710101148 Probable 6-oxopurine nucleoside phosphorylase Proteins 0.000 description 10
- 102000030764 Purine-nucleoside phosphorylase Human genes 0.000 description 10
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 10
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 9
- 208000002491 severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 9
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 9
- KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 7H-purine Chemical compound N1=CNC2=NC=NC2=C1 KDCGOANMDULRCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 8
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 description 8
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 8
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 6
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 6
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 4
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 4
- 206010061598 Immunodeficiency Diseases 0.000 description 4
- 208000029462 Immunodeficiency disease Diseases 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-O S-adenosyl-L-methionine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H]([NH3+])C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-O 0.000 description 4
- 230000007813 immunodeficiency Effects 0.000 description 4
- PXQPEWDEAKTCGB-UHFFFAOYSA-N orotic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC(=O)NC(=O)N1 PXQPEWDEAKTCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 3
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000036556 autosomal recessive T cell-negative B cell-negative NK cell-negative due to adenosine deaminase deficiency severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 3
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 3
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 3
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 3
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 3
- WYEPBHZLDUPIOD-UHFFFAOYSA-N 4,6-dioxoheptanoic acid Chemical compound CC(=O)CC(=O)CCC(O)=O WYEPBHZLDUPIOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 5,6-dihydrouracil Chemical compound O=C1CCNC(=O)N1 OIVLITBTBDPEFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 9H-xanthine Chemical compound O=C1NC(=O)NC2=C1NC=N2 LRFVTYWOQMYALW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N N-Heptane Chemical compound CCCCCCC IMNFDUFMRHMDMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N Uridine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-XVFCMESISA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 2
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 2
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001360 collision-induced dissociation Methods 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 125000002801 octanoyl group Chemical group C(CCCCCCC)(=O)* 0.000 description 2
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 2
- 229960005010 orotic acid Drugs 0.000 description 2
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001501 propionyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 2'-deoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 88755TAZ87 Chemical compound NCC(=O)CCC(O)=O ZGXJTSGNIOSYLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTRQQBHATOEIAF-UHFFFAOYSA-N AICA riboside Natural products NC1=C(C(=O)N)N=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 RTRQQBHATOEIAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDZOASGQNOPSCU-WDSKDSINSA-N Argininosuccinic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC\N=C(/N)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O KDZOASGQNOPSCU-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 description 1
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 1
- 208000028782 Hereditary disease Diseases 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- XIGSAGMEBXLVJJ-YFKPBYRVSA-N L-homocitrulline Chemical compound NC(=O)NCCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O XIGSAGMEBXLVJJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 1
- JSJWCHRYRHKBBW-UHFFFAOYSA-N N-carbamoyl-beta-alanine Chemical compound NC(=O)NCCC(O)=O JSJWCHRYRHKBBW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NRXIKWMTVXPVEF-BYPYZUCNSA-N N-formimidoyl-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC=N NRXIKWMTVXPVEF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 description 1
- 208000035415 Reinfection Diseases 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 208000009642 Severe combined immunodeficiency due to adenosine deaminase deficiency Diseases 0.000 description 1
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RTRQQBHATOEIAF-UUOKFMHZSA-N acadesine Chemical compound NC1=C(C(=O)N)N=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 RTRQQBHATOEIAF-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 1
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N beta-L-uridine Natural products O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@@H]1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-PSQAKQOGSA-N 0.000 description 1
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 125000004063 butyryl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 150000003857 carboxamides Chemical class 0.000 description 1
- 125000001721 carboxyacetyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- HLPUHEJQIIHQDF-UHFFFAOYSA-N cyclodecane-1,2-dione Chemical compound O=C1CCCCCCCCC1=O HLPUHEJQIIHQDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 125000003074 decanoyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N desoxyinosine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N desoxyuridine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 MXHRCPNRJAMMIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005584 early death Effects 0.000 description 1
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 206010014599 encephalitis Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011134 hematopoietic stem cell transplantation Methods 0.000 description 1
- 125000000268 heptanoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003104 hexanoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 230000000155 isotopic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 125000000400 lauroyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005645 linoleyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 230000004199 lung function Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 125000001419 myristoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000001402 nonanoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 125000001117 oleyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])/C([H])=C([H])\C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000004144 purine metabolism Effects 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 208000026425 severe pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 238000000935 solvent evaporation Methods 0.000 description 1
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 125000003696 stearoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- VKGZCEJTCKHMRL-VWJPMABRSA-N succinyladenosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O)=C2N=C1 VKGZCEJTCKHMRL-VWJPMABRSA-N 0.000 description 1
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 1
- DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N uracil arabinoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C=C1 DRTQHJPVMGBUCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 1
- 229940045145 uridine Drugs 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 229940075420 xanthine Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- H—ELECTRICITY
- H01—ELECTRIC ELEMENTS
- H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
- H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
- H01J49/02—Details
- H01J49/04—Arrangements for introducing or extracting samples to be analysed, e.g. vacuum locks; Arrangements for external adjustment of electron- or ion-optical components
- H01J49/0459—Arrangements for introducing or extracting samples to be analysed, e.g. vacuum locks; Arrangements for external adjustment of electron- or ion-optical components for solid samples
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/66—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood sugars, e.g. galactose
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/483—Physical analysis of biological material
- G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
- G01N33/49—Blood
- G01N33/492—Determining multiple analytes
-
- H—ELECTRICITY
- H01—ELECTRIC ELEMENTS
- H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
- H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes
- H01J49/004—Combinations of spectrometers, tandem spectrometers, e.g. MS/MS, MSn
- H01J49/0045—Combinations of spectrometers, tandem spectrometers, e.g. MS/MS, MSn characterised by the fragmentation or other specific reaction
- H01J49/005—Combinations of spectrometers, tandem spectrometers, e.g. MS/MS, MSn characterised by the fragmentation or other specific reaction by collision with gas, e.g. by introducing gas or by accelerating ions with an electric field
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Ecology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Un procedimiento para la determinación analítica, mediante EM, de Adenosina y Desoxiadenosina a partir de unamuestra de sangre seca, comprendiendo dicho procedimiento la extracción de Adenosina y Desoxiadenosina enunas condiciones que permiten la extracción simultánea de otros metabolitos tales como aminoácidos, carnitina libreo acilcarnitinas, estando dicho procedimiento caracterizado por el uso de una mezcla de extracción que comprendeuna mezcla de agua y un monoalcohol C1-3 de cadena lineal o ramificada en el que el agua está presente al menosal 10 % v/v.
Description
Procedimiento y kit para la determinación de metabolitos en muestras de manchas de sangre seca
[0001] La presente invención se refiere a un procedimiento y a un kit para la determinación de metabolitos en muestras de manchas de sangre seca (como las tarjetas de Guthrie), en particular dichos metabolitos incluyen también aquellos debidos a un defecto en la desaminasa de adenosina (ADA) o a un defecto en la fosforilasa de nucleósidos de purina (PNP).
[0002] La inmunodeficiencia combinada grave (SCID) es un grupo de enfermedades graves que afectan al sistema
15 inmunitario. Los niños con SCID nacen sanos pero mueren por una infección grave recurrente en la infancia salvo que se proporcione una terapia adecuada. Desafortunadamente, la mayoría de los niños con SCID no son identificados en el periodo previo a la infección: el diagnóstico se hipotetiza habitualmente cuando se produce una infección grave. Sin embargo, en ese momento, aunque se inicia una intervención terapéutica correcta, ya puede haber daños presentes debidos a una infección grave (tales como meningitis, encefalitis, neumonía grave) y las secuelas permanentes pueden ser una importante carga tanto para los pacientes como para la familia y la sociedad.
[0003] El SCID debido a un defecto en la desaminasa de adenosina (ADA) o en la fosforilasa de nucleósidos de purina (PNP) es un trastorno hereditario en el metabolismo de la purina. La deficiencia genética de la enzima natural de purina ADA da como resultado unos grados variables de inmunodeficiencia que varían entre una
25 inmunodeficiencia combinada grave de inicio neonatal hasta una inmunodeficiencia de inicio tardío que puede determinar una afectación grave de la función pulmonar en adolescentes o en adultos.
[0004] En su forma típica, la ausencia de la enzima ADA permite la acumulación de metabolitos tóxicos resultantes por un lado de un grave defecto del sistema inmunitario, y por otro lado, de un daño permanente de otros órganos y sistemas tales como el cerebro o el hígado. En estos casos, la SCID-ADA es mortal en los primeros meses de vida si no se trata, y está asociada con graves secuelas si se trata tarde.
[0005] También se ha descrito una ADA-SCID de inicio tardío. En estos casos, los pacientes experimentan infecciones graves recurrentes y enfermedad pulmonar crónica durante la infancia o la adolescencia. Las
35 consecuencias clínicas del defecto en la PNP son muy similares.
[0006] En ambos casos, el transplante de células madre hematopoyéticas es curativo, pero depende de una buena compatibilidad con el donante. La terapia de sustitución enzimática está disponible y determina la eliminación de los metabolitos tóxicos y una buena reconstitución del sistema inmunitario. La terapia génica también es una opción para los pacientes. En cualquier caso, cualquiera que sea la terapia elegida, debería comenzar lo más pronto posible tras el nacimiento con objeto de obtener un buen efecto terapéutico. Por lo tanto, los procedimientos diagnósticos que permitan la realización de un diagnóstico seguro en los primeros días de vida son extremadamente importantes.
[0007] El diagnóstico temprano de la deficiencia en ADA es necesario porque las terapias oportunas (trasplante de
45 células madre, terapia de sustitución enzimática) pueden ser curativas, mientras que la enfermedad es rápidamente mortal si no se trata. El diagnóstico se puede realizar buscando la actividad enzimática de la ADA o la acumulación de metabolitos debida a la deficiencia en la ADA. La evaluación de la actividad de la ADA es compleja y a menudo puede aportar unos resultados engañosos: de hecho, se puede encontrar un defecto grave en la actividad de la ADA en sujetos con una función inmunitaria absolutamente normal, debido a que la actividad residual variable de la ADA expresada en células distintas a las células inmunitarias puede ser suficiente para mantener una función inmunitaria correcta. Por esta razón, la dosis de metabolitos es absolutamente obligatoria para conseguir el diagnóstico de la inmunodeficiencia debida a una deficiencia en ADA o en PNP. Además, la dosificación de metabolitos permite monitorizar la reducción de su actividad tóxica tras el comienzo de la terapia de sustitución enzimática.
55 [0008] La medición de los metabolitos de purina y de pirimidina presenta problemas complejos para las separaciones. Se usan diferentes procedimientos para la medición en la práctica clínica, que varían desde una HPLC hasta una cromatografía en capa fina. Otros procedimientos incluyen una electroforesis capilar e incluso una HPLC en fase inversa con espectrometría de masas en tándem con ionización por electronebulización.
[0009] Sin embargo, todos estos procedimientos se aplican sobre muestras de orina y se usan cuando ya se ha formulado una sospecha clínica de inmunodeficiencia debido al inicio de infecciones graves. Existe un serio inconveniente en los procedimientos, dado que los niños afectados deberían ser diagnosticados antes del inicio de las infecciones para maximizar la oportunidad de un tratamiento que les salve la vida. Los antecedentes familiares pueden ayudar a realizar un diagnóstico temprano, pero los datos obtenidos en los estados unidos muestran que
65 únicamente el 18 % de los pacientes afectados tienen unos antecedentes familiares positivos. El número es probablemente incluso menor en Italia, donde la mayoría de las familias únicamente tienen un hijo.
[0010] El uso de la espectrometría de masas (EM) en los laboratorios clínicos ha aumentado mucho al comienzo del siglo XXI. Este desarrollo es debido obviamente a los grandes avances en las aplicaciones de la espectrometría de masas en los últimos quince años. La espectrometría de masas permite una medición muy rápida de diferentes metabolitos en diferentes muestras biológicas mediante el uso de manchas en papel de filtro o directamente en
5 diferentes fluidos biológicos. Debido a su elevada sensibilidad, esta técnica se puede usar para los análisis cualitativos y cuantitativos de muchos analitos tales como purinas y pirimidinas, aminoácidos y acilcarnitinas, homocisteína, ácido orótico, succinilacetona etc., con los estándares internos apropiados.
[0011] La EM se usa ampliamente para el análisis de metabolitos procedentes de manchas de sangre seca tomadas
10 al nacer (tarjetas de Guthrie), pero entre los metabolitos detectados, aquellos debidos a una deficiencia en la ADA no son detectados porque los procedimientos de extracción no son eficaces. El procedimiento clásico usado habitualmente para un cribado ampliado del recién nacido se realiza mediante el uso de un monoalcohol C1-3 de cadena lineal o ramificada (preferiblemente metanol) (Millington DS, y col., J Inherit Metab Dis. 1990; 13 (3): 321 - 4; Donald H. y col. Clin. Chem., noviembre de 2003; 49: 1797 - 1817; la Marca G. y col., Rapid Commun Mass
15 Spectrom. 2003; 17 (23): 2688 - 92).
[0012] El propósito de la presente invención es proporcionar un procedimiento analítico que podría permitir también la determinación de metabolitos de purina y de pirimidina (incluyendo, en particular, metabolitos por una deficiencia en ADA o en PNP) junto con la determinación de otros metabolitos que se determinan habitualmente en el cribado
20 de metabolitos, especialmente los cribados realizados en manchas de sangre seca tomadas al nacer.
Definiciones y abreviaturas
25 ADA: desaminasa de adenosina Ado: adenosina D-Ado: desoxiadenosina EM: espectrometría de masas
30 PNP: fosforilasa de nucleósidos de purina SCID: inmunodeficiencia combinada grave
35 [0014] El objeto de la presente invención es un procedimiento capaz de individualizar, mediante una EM, con una elevada sensibilidad y especificidad, metabolitos de purina y de pirimidina (incluyendo especialmente metabolitos por una deficiencia en ADA o en PNP) procedentes de sangre seca. El procedimiento descrito en este documento puede usarse para extraer Adenosina y Desoxiadenosina a partir de una muestra de sangre seca en unas condiciones que permiten extraer simultáneamente otros metabolitos, tales como otras purinas y pirimidinas, aminoácidos, carnitina
40 libre o acilcarnitinas. El procedimiento de la invención se caracteriza por el uso de una mezcla de extracción que comprende una mezcla de agua y un monoalcohol C1-3 de cadena lineal o ramificada (preferiblemente metanol) en la que hay presente agua al menos al 10 % v/v. El procedimiento puede usarse, junto con otros cribados neonatales, sobre manchas de sangre seca, preferiblemente absorbidas en una tarjeta, y más preferiblemente en tarjetas de Guthrie, incluso más preferiblemente en las tarjetas de Gurthie obtenidas en el ll - IV día de vida, o durante la terapia
45 de sustitución enzimática (para monitorizar la eficacia de la terapia).
[0015] El procedimiento es fiable y reproducible, fácil de realizar y proporciona una respuesta definitiva en poco tiempo (1 - 2 días). El procedimiento permite evitar unas condiciones de extracción molestas (tales como una extremada acidez y elevada temperatura).
50 [0016] Por primera vez se ofrece la posibilidad de obtener el diagnóstico de ADA-SCID al nacer, antes del inicio de una enfermedad infecciosa. El diagnóstico temprano de la SCID permite tratar a los pacientes afectados muy pronto, de forma que se eviten las graves complicaciones debidas a una enfermedad infecciosa que se esperan siempre en el seguimiento de los pacientes inmunodeficientes. Los costes humanos y monetarios de una hospitalización
55 prolongada, un cuidado intensivo y una muerte temprana que son el resultado de un retraso en el diagnóstico de una SCID, podrían evitarse diagnosticando el paciente afectado al nacer mediante el procedimiento descrito en este documento.
[0017] Un objeto adicional de la invención es un kit según se define en las reivindicaciones. Los kits son útiles para
60 preparar muestras para la detección y/o la medición (mediante el uso de espectrometría de masas en tándem) de Adenosina y Desoxiadenosina junto con otros múltiples analitos (por ejemplo, otras purinas y pirimidinas, aminoácidos, carnitina libre y acilcarnitina) en una muestra de sangre seca.
Breve descripción de los dibujos
5 La Fig. 1 muestra un barrido de pérdida neutra de m/z 46 en el que se detectan varios aminoácidos en la misma muestra (panel B) y un barrido precursor de m/z 85 en el que se detectan varias acilcarnitinas en la muestra (panel A); en la muestra también había presentes estándares internos, análogos de isótopos pesados estables de Adenosina y Desoxiadenosina (Panel C).
[0019] La divulgación presenta procedimientos para la extracción de Adenosina y Desoxiadenosina junto con uno o más analitos adicionales (por ejemplo, otras purinas y pirimidinas, aminoácidos, acilcarnitinas y carnitina libre) de la muestra en una única etapa, de forma que las concentraciones de Adenosina y Desoxiadenosina y de uno o más
15 analitos adicionales (por ejemplo, otras purinas y pirimidinas, aminoácidos, carnitina libre y acilcarnitinas) en el extracto reflejen sus respectivas concentraciones en la muestra.
[0020] Después de la extracción, la presencia o la cantidad de Adenosina y Desoxiadenosina puede ser determinada junto con uno o más analitos adicionales (por ejemplo, carnitina libre, acilcarnitinas y aminoácidos) mediante el uso de espectrometría de masas (por ejemplo, espectrometría de masas en tándem).
[0021] El procedimiento puede incluir poner en contacto una muestra con una disolución de extracción que contiene un monoalcohol C 1-3 de cadena lineal o ramificada (por ejemplo, metanol, etanol, propanol o isopropanol) y agua.
25 [0022] La Adenosina y la Desoxiadenosina no son solubles en alcohol absoluto ni en una disolución que contenga menos de un 10 % de agua. Para extraer (liberar) la Adenosina y la Desoxiadenosina junto con uno o más analitos adicionales de una muestra (por ejemplo, una muestra biológica tal como una mancha de sangre) en una única etapa, la muestra puede ponerse en contacto con una disolución de extracción que contiene un monoalcohol C 1-3 de cadena lineal o ramificada (por ejemplo, metanol, etanol, propanol o isopropanol) con al menos un 10 % de agua.
[0023] Preferiblemente, el procedimiento de la invención se realiza añadiendo la disolución de extracción en dos etapas: en la primera etapa se pone en contacto la muestra con un monoalcohol C 1 -3 de cadena lineal o ramificada que se corresponde con el 100-x % v/v del volumen final; en la siguiente segunda etapa se añade a la muestra agua, que se corresponde con el x % v/v del volumen final v/v; en el que x es el porcentaje de agua en v/v, que varía 35 desde el 10 hasta el 90 %. Preferiblemente, la disolución de extracción contiene un 30 - 50 % v/v de agua; más preferiblemente, la mejor condición analítica se obtiene cuando una disolución de extracción contiene un 60 % de metanol y un 40 % de agua. Además, se obtiene el máximo rendimiento para la extracción de Adenosina y de Desoxiadenosina cuando la adición de la disolución de extracción se realiza en las dos siguientes etapas: en la primera etapa se pone en contacto la muestra con metanol que se corresponde con un 60 % v/v del volumen final. En la siguiente segunda etapa se añade a la muestra agua que se corresponde con un 40 % v/v del volumen final. La primera etapa fijaba proteínas, péptidos y hemoglobina a la celulosa de la tarjeta de Guthrie, reduciendo sistemáticamente su extracción. Las proteínas, los péptidos y la hemoglobina podían ser una interferencia relevante en el análisis por espectroscopia de masas. El procedimiento también puede incluir poner en contacto la muestra directamente con una disolución de extracción que contiene metanol y agua al 60/40 v/v. Pero en este caso la
45 concentración de agua debe ser tal que la disolución de extracción reconstituya algunas de las proteínas y los péptidos, mientras que al mismo tiempo disuelva otros analitos (por ejemplo, Adenosina,
[0024] Desoxiadenosina, acilcarnitinas, carnitina libre y aminoácidos) presentes en la muestra. La disolución de extracción también puede contener un ácido orgánico, tal como ácido acético y/o fórmico, a una concentración de 1 5 mM (preferiblemente de 2,5 - 3,5 mM).
[0025] La disolución de extracción también puede contener, opcionalmente, uno o más estándares internos para, por ejemplo, aminoácidos, carnitina libre, acilcarnitinas y Adenosina y Desoxiadenosina, a unas concentraciones conocidas.
55 [0026] La mezcla de muestra puede incubarse entonces durante un periodo predeterminado de tiempo de al menos 15 minutos (y preferiblemente de no más de 120 minutos) para permitir la extracción de aminoácidos, carnitina libre y acilcarnitinas, así como la extracción de Adenosina y Desoxiadenosina.
[0027] Entonces el extracto puede ser transferido a un pocillo sin usar de una placa de microtitulación, y después las muestras se analizan mediante espectrometría de masas en tándem, opcionalmente con la ayuda de un dispositivo de manipulación de líquidos para la inyección de la muestra.
[0028] Entonces se establecen los ajustes instrumentales en el espectrómetro de masas en tándem para detectar
65 los respectivos metabolitos de interés (aminoácidos, acilcarnitinas, carnitina libre y Adenosina y Desoxiadenosina), así como sus correspondientes estándares internos de forma múltiple.
[0029] Los analitos adicionales que pueden ser detectados y/o medidos junto con Adenosina y Desoxiadenosina incluyen, por ejemplo, alanina, arginina, citrulina, glicina, leucina, metionina, ornitina, fenilalanina, prolina, tirosina, valina, y acilcarnitinas tales como libre, Acetilo, Acrililo, Propionilo, Butirilo, Tiglilo, Isovalerilo, 3-OH-butirilo, Hexenoílo, Hexanoílo, 3-OH-Isovalerilo, Heptanoílo, Octenoílo, Octanoílo, Nonanoílo, Malonilo, Decatrienoílo,
5 Decadienoílo, Decenoílo, Decanoílo, Metilmalonilo, Glutarilo, 3-OH-Decanoílo, Dodecenoílo, Dodecanoílo, Deshiroadipilo, Adipilo, 3-OH-Dodecanoílo, Tetradecadienoílo, Tetradecenoílo, Miristoílo, Deshidrosuberilo, Suberilo, 3-OH-Tetradecanoílo, Hexadecenoílo, Palmitoílo, Deshidrosabacilo, Sebacilo, 3-OH-Hexadecanoílo, Linoleílo, Oleílo, Estearoílo. Otras purinas y pirimidinas incluyen, pero no se limitan a, Uracilo, Citosina, Timina, Adenina, Guanina, Uridina, Citidina, Timidina, Guanosina, Hipoxantina, Desoxiguanosina, Desoxiinosina, Desoxiuridina, 5-OH-Meuracilo, AICAR (Aminoimidazol-4-carboxamida ribótido), Dihidrouracilo, p-Alanina, Inosina, ácido Úrico, ácido Orótico, ácido p-Aminoisobutírico, Dihidrotimina, Ureidopropionato, Xantina, SAICAr (Succinil-aminoimidazol-4carboxamida ribósido) y Succinil-adenosina.
15 [0030] La espectrometría de masas en tándem puede usarse para detectar y/o medir Adenosina y Desoxiadenosina y uno o más analitos adicionales (por ejemplo, carnitina libre, acilcarnitinas y aminoácidos) en una muestra (por ejemplo, una muestra biológica). En la espectrometría de masas en tándem se conectan en serie dos analizadores de masas a través de una célula de colisión. El primer analizador de masas (primer cuadrupolo) se usa para seleccionar un ión de interés (por ejemplo, un ión con una proporción entre masa y carga en particular (m/z)). Los iones seleccionados se transfieren entonces a una célula de colisión donde son fragmentados mediante colisiones con un gas inerte (por ejemplo, nitrógeno o helio o argón). Este proceso se denomina disociación activada por colisión (CAD) y se realiza en la célula de colisión del espectrómetro de masas. Una vez que los iones precursores se han fragmentado, se usa el segundo analizador de masas (tercer cuadrupolo) bien para barrer y detectar todos
25 los iones producto producidos, o bien para seleccionar y detectar fragmentos de iones en particular.
[0031] Según se detalla en los Ejemplos anexos, se usó la espectrometría de masas en tándem para ionizar las moléculas precursoras de Adenosina y Desoxiadenosina y varios aminoácidos, fragmentar los iones y detectar picos específicos que son indicativos de la presencia de estas moléculas en la muestra. La detección mediante espectrometría de masas en tándem puede llevarse a cabo de varias formas. En un tipo de espectrometría de masas en tándem (realizada habitualmente con espectrómetros de masas en tándem de cuadrupolo triple) los iones que se fragmentan para producir los iones (fragmento) productos habituales pueden ser detectados como una clase mediante la realización de un "barrido de iones precursores", en el que mediante la selección de una masa apropiada para la fragmentación habitual en la célula de colisión, todos los iones que producen los iones fragmento 35 comunes son detectados. Este tipo de barrido se puede usar para detectar las acilcarnitinas en una muestra (y a un precursor de barrido de m/z 85). En una forma diferente de la espectrometría de masas en tándem, los iones que se fragmentan para producir una pérdida neutra común pueden ser detectados como una clase mediante la realización del denominado barrido de pérdida neutra, en el que, estableciendo una compensación de masa apropiada igual a la pérdida neutra común entre el primer y el tercer cuadrupolo, todos los iones que se fragmentan para producir la pérdida neutra especificada son detectados. Este tipo de barrido se realiza para detectar aminoácidos en una muestra (pérdida neutra de m/z 46 si los analitos de la muestra extraída eran ésteres no butilados). La Fig. 1 muestra un barrido de pérdida neutra de m/z 46 en el que se detectaron varios aminoácidos procedentes de la misma muestra y un barrido precursor de m/z 85 en el que se detectaron varias acilcarnitinas en la muestra. En otro tipo más de espectrometría de masas en tándem, conocido como monitorización de reacción múltiple (MRM), se
45 selecciona un ión precursor de interés en el primer cuadrupolo, se fragmenta en la célula de colisión y se selecciona un ión fragmento específico resultante de la activación por colisión en el tercer cuadrupolo, y finalmente se detecta.
[0032] El primer y el tercer cuadrupolo se fijan para que seleccionen respectivamente los correspondientes pares de iones precursores y fragmentos de interés para una cantidad predeterminada de tiempo (unos pocos milisegundos). Si se requiere la detección de analitos adicionales, pueden introducirse transiciones de detección adicionales en el experimento. Los datos de todas las transiciones de masas seleccionadas pueden ser adquiridos secuencialmente para obtener la información deseada. La detección y la cuantificación de Adenosina y de Desoxiadenosina en una mezcla pueden obtenerse empleando la transición de masa específica para cada uno de estos compuestos como sigue: para la Adenosina: primer cuadrupolo fijado para seleccionar y transmitir el ión precursor a m/z 268, tercer
55 cuadrupolo fijado para seleccionar y trasmitir el ión producto específico a m/z 136 (transición 1 de MRM); para la Desoxiadenosina: primer cuadrupolo fijado para seleccionar y transmitir el ión precursor a m/z 252, tercer cuadrupolo fijado para seleccionar y trasmitir el ión producto específico a m/z 136 (transición 2 de MRM). Estas dos transiciones de MRM pueden ser medidas secuencialmente a partir de la misma muestra durante una cantidad predeterminada de tiempo para detectar la presencia y/o la concentración de una mezcla de estos compuestos en dicha muestra.
[0033] A la muestra se pueden añadir estándares internos estables de isótopos marcados para Adenosina y, mediante lo que puede llevarse a cabo la cuantificación de Adenosina y de Desoxiadenosina, y por lo tanto de las propias Adenosina y Desoxiadenosina. Dichos marcajes de Adenosina y Desoxiadenosina derivatizadas con isótopos estables da como resultado un desplazamiento de la masa, mientras se conservan unas propiedades 65 fisicoquímicas muy similares entre los compuestos marcados y no marcados. Generalmente se pueden añadir uno o más estándares internos a una concentración conocida a una muestra para permitir la cuantificación del analito de interés (por ejemplo, Adenosina y Desoxiadenosina). Por ejemplo, para una muestra analizada mediante el uso de espectrometría de masas en tándem, se puede usar la proporción entre las señales producidas por la Adenosina y la Desoxiadenosina y su correspondiente estándar interno para determinar las cantidades de este compuesto en la muestra. El estándar interno también puede añadirse para distinguir las moléculas naturales (endógenas). Al igual 5 que anteriormente, los estándares internos pueden prepararse en una disolución de extracción antes de mezclar una muestra (por ejemplo, una muestra de sangre) con la disolución de extracción. Alternativamente, los estándares internos pueden añadirse a la mezcla en cualquier etapa de la preparación de la muestra que asegure que estos estándares internos no serán eliminados de la mezcla durante el procesado de la muestra (por ejemplo, después de una extracción líquido-líquido o de una extracción en fase sólida). Los estándares internos para un analito de interés (u otras moléculas, por ejemplo, las biomoléculas descritas en este documento) detectados por un procedimiento descrito en este documento pueden ser cualquier modificación o análogo de esa molécula analito que sea detectable mediante espectrometría de masas. Un estándar interno es detectable por separado de la molécula gracias a sus características físicas únicas, tales como una masa o una proporción entre masa y carga únicas. Un estándar interno usado habitualmente en espectrometría de masas es una forma estable marcada isotópicamente o un derivado 15 químico de un analito de interés (por ejemplo, si el analito es Adenosina y Desoxiadenosina, el estándar interno puede ser Adenosina y Desoxiadenosina marcadas isotópicamente). Lo mismo para los analitos adicionales descritos en este documento y referidos como aminoácidos y acilcarnitinas. Por ejemplo, pueden usarse análogos marcados con isótopos estables para cuantificar el correspondiente analito de interés mediante el uso de la técnica conocida como espectrometría de masas por dilución de isótopos, en la que el analito y los estándares internos son procesados en la misma muestra. Los estándares internos pueden ser diseñados de forma que 1) el marcaje provoque un desplazamiento en la masa de al menos 1 unidad de masa, y 2) ninguno de los marcadores del isótopo estable estén ubicados en sitios lábiles, para evitar un intercambio. Los marcadores pueden ser 2H (D), 15N, 13C u 18O en cualquier combinación. La ubicación real de los marcadores en la molécula puede variar siempre que se cumpla el prerrequisito 2 (anterior). Además, también se puede usar la posición de los marcadores y el potencial
25 cambio en la masa de los iones fragmento para confirmar la separación entre el estándar interno y los analitos. Algunos ejemplos de potenciales estándares internos útiles en los procedimientos descritos en este documento incluyen, pero no se limitan a, un marcaje isotópico de: Adenosina y Desoxiadenosina (por ejemplo, Ribosina-1-13C-Adenosina y 13C5 Desoxiadenosina), carnitina, acilcarnitina o un aminoácido (por ejemplo, fenilalanina, citrulina, ácido glutámico). La detección del estándar interno marcado específico en una mezcla puede obtenerse empleando la transición de masa específica para cada uno de estos compuestos como sigue: para Ribosina-1-13C-Adenosina: primer cuadrupolo fijado para seleccionar y transmitir el ión precursor a m/z 269, tercer cuadrupolo fijado para seleccionar y transmitir el ión producto específico a m/z 136 (transición 3 de MRM); para 13C5 Desoxiadenosina: primer cuadrupolo fijado para seleccionar y transmitir el ión precursor a m/z 257, tercer cuadrupolo fijado para seleccionar y transmitir el ión producto específico a m/z 136 (transición 4 de MRM).
[0034] Las muestras adecuadas para los procedimientos descritos en este documento incluyen sangre seca absorbida sobre un papel o un sustrato polimérico.
[0035] Se han obtenido tres pares de manchas de sangre seca (tarjetas de Guthrie) a partir de tres pacientes con SCID-ADA procedentes de aquellas almacenadas en el Neonatal Screening Center de la región de Tuscany. Todos
45 los pacientes habían sido diagnosticados en el primer año de vida mediante el uso de procedimientos convencionales con orina o con muestras sanguíneas obtenidas mediante punción venosa. El diagnóstico fue confirmado mediante el uso de un análisis genético del ADN. Todos los padres de los 3 pacientes resultaron ser portadores de la mutación génica asociada con la SCID-ADA.
[0036] El procedimiento descrito en la presente invención permitió la detección de metabolitos tóxicos de la ADA en los 3 casos, con un análisis cuantitativo. Los niveles de los metabolitos tóxicos eran 10.000 - 30.000 veces mayores que los niveles encontrados en sujetos normales. El procedimiento también se aplicó a 5.000 manchas de sangre seca procedentes de sujetos sanos. En ninguna de ellas se encontró un aumento en el nivel de metabolitos tóxicos de la ADA. En resumen, los resultados obtenidos con el procedimiento de la invención demostraron que la SCID
55 ADA puede ser diagnosticada con la mayor sensibilidad (100 %) y especificidad (100 %) a partir de manchas de sangre seca tomadas al nacer a través de un espectrómetro de masas de cuadrupolo triple con una fuente TurbolonSpray.
[0037] Por lo tanto, la tecnología descrita en este documento es aplicable al cribado, el diagnóstico, el pronóstico, la terapia de monitorización y de cumplimiento, y a cualquier otra aplicación en la que es útil la determinación de la presencia o de la cantidad de conjuntos de dos o más biomoléculas, tales como Adenosina y Desoxiadenosina y una
o más de un aminoácido, carnitina libre o una acilcarnitina.
65 [0038] En este documento también se proporcionan kits según se definen en las reivindicaciones, útiles para la
preparación de las muestras para la detección y/o la medición (mediante el uso de espectrometría de masas en tándem) de Adenosina y Desoxiadenosina junto con otros múltiples analitos (por ejemplo, otras purinas y pirimidinas, aminoácidos, carnitina libre y acilcarnitina) en una muestra de sangre seca. Los kits incluyen uno o más estándares internos y/o controles para su uso en el subsiguiente análisis por espectrometría de masas según se define en las 5 reivindicaciones. Por ejemplo, los kits pueden incluir Adenosina y Desoxiadenosina como control y una forma
13C5
derivatizada (por ejemplo, marcada con un isótopo) de Ribosina-1-13C-Adenosina y de Desoxiadenosina) marcada como un estándar interno. La Adenosina y la Desoxiadenosina y/o la Adenosina y la Desoxiadenosina derivatizadas pueden proporcionarse cada una en el kit en forma líquida o seca (por ejemplo, liofilizada). La Adenosina y la Desoxiadenosina pueden proporcionarse en una cantidad de 0,1 - 5 mmol. Los kits pueden incluir Adenosina y Desoxiadenosina en un recipiente que contiene uno o más controles o estándares internos adicionales. Por ejemplo, el kit puede incluir un recipiente con un control de Adenosina y la Desoxiadenosina, uno o más controles de aminoácidos y uno o más controles de carnitina (por ejemplo, carnitina libre y acilcarnitinas).
[0039] Una o más de las disoluciones contenidas en el kit pueden almacenarse, por ejemplo, en viales de vidrio
15 silanizado. Uno o más de los componentes del kit puede almacenarse en un recipiente que evite o minimice la pérdida de material o la evaporación de disolvente. Por ejemplo, el recipiente puede estar precintado con un tapón.
[0040] Los kits pueden incluir, por ejemplo, manchas de sangre seca útiles como control. Por ejemplo, la mancha de sangre seca puede estar enriquecida con uno o más analitos (por ejemplo, uno o más analitos a unas concentraciones conocidas) tales como Adenosina y Desoxiadenosina, uno o más aminoácidos, carnitina libre o una
o más acilcarnitinas.
[0041] Los kits también pueden incluir, opcionalmente, una disolución de extracción tal como cualquiera de las disoluciones de extracción descritas en este documento. La disolución de extracción puede contener un
25 monoalcohol C 1-3 lineal o ramificado con al menos un 25 % de agua. Los kits también pueden incluir una o más disoluciones disolvente que contienen, por ejemplo, acetonitrilo o isopropanol. Las disoluciones disolvente también pueden contener agua, por ejemplo, una disolución disolvente contiene un 80 % de acetonitrilo y un 20 % de agua.
SECCIÓN EXPERIMENTAL
Ejemplo 1
35 [0042] Se prepararon manchas de sangre estándar de referencia (sangre completa) mediante el uso de sangre completa agrupada obtenida a partir de 5 sujetos. La sangre fue procesada mediante el ajuste de la concentración de hemoglobina a 17 mg/dl y la adición de Adenosina y Desoxiadenosina a la sangre a unas concentraciones conocidas. La sangre procesada fue dispensada en tarjetas de papel de filtro para formar manchas de sangre sobre la matriz de papel de filtro. Cada mancha de sangre fue generada mediante la dispensación de 25 μl de sangre procesada. Las manchas de sangre se dejaron secar durante una noche.
[0043] Se perforó un pequeño disco de 3,2 mm de una mancha de sangre seca y se depositó en un pocillo de una placa de micropocillos. La muestra se extrajo dispensando 200 μl de una disolución de extracción que consistía en una mezcla de metanol y agua a una proporción volumétrica relativa aproximada de un 60 % de metanol y un 40 %
45 de agua. También había presentes estándares internos, análogos de isótopos pesados estables de Adenosina y Desoxiadenosina en la disolución de extracción. Los estándares internos incluidos en la disolución están indicados en el barrido de la espectrometría de masas en tándem mostrado en la Fig. 1.
Ejemplo 2.
[0044] Se prepararon manchas de sangre estándar de referencia (sangre completa) mediante el uso de sangre completa agrupada obtenida a partir de 5 sujetos. La sangre fue procesada mediante el ajuste de la concentración de hemoglobina a 17 mg/dl y la adición a la sangre de varios aminoácidos, carnitina, acilcarnitinas y Adenosina y Desoxiadenosina a unas concentraciones conocidas. La sangre procesada fue dispensada en tarjetas de papel de
55 filtro para formar manchas de sangre sobre la matriz de papel de filtro. Cada mancha de sangre fue generada mediante la dispensación de 25 μl de sangre procesada. Las manchas de sangre se dejaron secar durante una noche.
[0045] Se perforó un pequeño disco de 3,2 mm de una mancha de sangre seca y se depositó en un pocillo de una placa de micropocillos. La muestra se extrajo dispensando 200 μl de una disolución de extracción que consistía en una mezcla de metanol y agua a una proporción volumétrica relativa aproximada de un 60 % de metanol y un 40 % de agua. También había presentes estándares internos (análogos de isótopos pesados estables de los analitos de interés) para diversos aminoácidos, carnitina, acilcarnitinas y Adenosina y Desoxiadenosina en la disolución de extracción. La muestra extraída se inyectó en un espectrómetro de masas en tándem con cuadrupolo de 65 electronebulización triple con la ayuda de un dispositivo de manipulación de líquidos automatizado. Los datos de los espectros de masas de los aminoácidos se adquirieron mediante un barrido de pérdida neutra de 46 Da. Los datos
de los espectros de masas para la Adenosina y Desoxiadenosina se adquirieron mediante una monitorización de reacción múltiple. La definición de cada uno de los analitos puede encontrarse en la Tabla 1). El porcentaje de recuperación de cada analito se determinó mediante la comparación con un estándar interno para cada analito.
5 [0046] La imprecisión del ensayo se determinó analizando las muestras descritas en la tabla 1. Cada análisis de la muestra consistió en funciones por sextuplicado de cada muestra, que fueron procesadas y medidas según se describe en el Ejemplo 2. El estudio incluía seis de dichos análisis al día durante un total de seis días. Con esta información se determinaron los siguientes componentes de imprecisión: en el análisis, entre análisis en el día y entre días, a partir de lo que se determinó la imprecisión total. Los resultados de los análisis de imprecisión de 10 Adenosina y Desoxiadenosina se muestran en la Tabla 2.
[0047] Estos datos demuestran que los procedimientos descritos en este documento se pueden usar para extraer y cuantificar simultáneamente Adenosina y Desoxiadenosina, aminoácidos, carnitina, acilcarnitinas, mediante el uso de espectrometría de masas en tándem. 15 Tabla 1
- Nombre del compuesto
- Símbolo [M + H]+ Masa butilada
- Purinas
- Adenosina
- Ado 268,2
- Desoxiadenosina
- D-Ado 252,2
- Aminoácidos
- Alanina
- Ala 90,0 146,1
- Aloisoleucina
- Allo-lle 132,1 188,2
- Arginina
- Arg 175,1 231,2
- Ácido argininosuccínico
- Asa 291,1 459,3
- Asparagina
- Asn 133,1 189,1
- Ácido aspártico
- Asp 134,0 246,2
- beta-Alanina
- 90,0 146,1
- Citrulina
- Cit 176,1 232,2
- Ácido glutámico
- Glu 148,1 260,2
- Glutamina
- Gin 147,1 203,1
- Glicina
- Gly 76,0 132,1
- Histidina
- His 156,1 212,1
- Hidroxiprolina
- HO-Pro 132,1 188,1
- Isoleucina
- lle 132,1 188,2
- Leucina
- Leu 132,1 188,2
- Lisina
- Lys 147,1 203,2
- Metionina
- Met 150,1 206,1
- Ornitina
- Orn 133,1 189,2
- Fenilalanina
- Phe 166,1 222,2
- Prolina
- Pro 116,1 172,1
- Ácido piroglutámico
- 130,0 186,1
- Tirosina
- Tyr 182,1 238,1
- Valina
- Val 118,1 174,2
- Aminoácidos
- Succinilacetona
- SA 155,1 211,2
- Ácido formiminoglutámico
- Figlu 231,2 287,2
- Homocitrulina
- Hcit 190,1 246,2
- Hawkinsina
- Hawk 348,3 404,4
- Ácido deltaaminolevulínico
- D-AL 122,1 188,1
- Acilcarnitinas
- Libre
- CO 162,1 218,2
- Acetil
- C2 204,1 260,2
- Acrilil
- C3:1 216,1 272,2
- Propionil
- C3 218,1 274,2
- Butiril
- C4 232,2 288,2
- Tiglil
- C5:1 244,2 300,2
- Isovaleril
- C5 246,2 302,2
- 3-OH-butiril
- C4-OH 248,1 304,2
- Hexenoil
- C6:1 258,2 314,2
- Hexanoil
- C6 260,2 316,3
- 3-OH-lsovaleril
- C5-OH 262,2 318,2
- Heptanoil
- C7 274,2 330,3
- Octenoil
- C8:1 286,2 342,3
- Octanoil
- C8 288,2 344,3
- Nonanoil
- C9 302,2 358,3
- Malonil
- C3DC 248,1 360,2
- Decatrienoil
- C10:3 310,2 366,3
- Decadienoil
- C10:2 312,2 368,3
- Decenoil
- C10:1 314,2 370,3
- Decanoil
- C10 316,2 372,3
- Metilmalonil
- C4DC 262,1 374,3
- Glutaril
- C5DC 276,1 388,3
- 3-OH-Decanoil
- C10-OH 332,2 388,3
- Dodecenoil
- C12:1 342,3 398,3
- Dodecanoil
- C12 344,3 400,3
- Deshiroadipil
- C6:1 DC 288,1 400,3
- Adipil
- C6DC 290,2 402,3
- 3-OH-Dodecanoil
- C12-OH 360,3 416,3
- Tetradecadienoil
- C14:2 368,3 424,3
- Tetradecenoil
- C14:1 370,3 426,4
- Miristoil
- C14 372,3 428,4
- Deshidrosuberil
- C8:1 DC 316,2 428,3
- Suberil
- C8DC 318,2 430,3
- 3-OH-Tetradecanoil
- C14-OH 388,3 444,4
- Hexadecenoil
- C16:1 398,3 454,4
- Palmitoil
- C16 400,3 456,4
- Deshidrosebacil
- C10:1DC 344,2 456,3
- Sebacil
- C10DC 346,2 458,4
- 3-OH-Hexadecanoil
- C16-OH 416,3 472,4
- Linoleil
- C18:2 424,3 480,4
- Oleil
- C18:1 426,4 482,4
- Estearoil
- C18 428,4 484,4
Tabla 2
- Metabolito investigado
- Adición nmoles/l Precisión intradía (n = 6) % Precisión interdía (n = 6) % Lecturas promediadas Moles/l Precisión n = 6
- Adenosina
- 0 0 0,0 0,0
- Adenosina
- 33 3,5 3,1 34,0 103,1
- Adenosina
- 165 4,9 3,7 158,0 95,8
- Adenosina
- 330 7,8 6,0 336,2 101,9
- Adenosina
- 3300 3,8 4,8 3299,7 100,0
- Adenosina
- 6600 2,1 2,6 6594,2 99,9
- Adenosina
- 9900 2,3 2,0 9899,9 100,0
- Desoxiadenosina
- 0 0 0,0 0,0
- Desoxiadenosina
- 33 19,6 16,9 32,8 92,9
- Desoxiadenosina
- 165 6,6 4,8 169,6 100,3
- Desoxiadenosina
- 330 5,2 3,6 325,4 100,6
- Desoxiadenosina
- 3300 5,6 6,7 3300,2 100,3
- Desoxiadenosina
- 6600 3,4 3,4 6599,2 100,0
- Desoxiadenosina
- 9900 3,1 3,1 9904,9 100,0
Claims (10)
- REIVINDICACIONES1. Un procedimiento para la determinación analítica, mediante EM, de Adenosina y Desoxiadenosina a partir de unamuestra de sangre seca, comprendiendo dicho procedimiento la extracción de Adenosina y Desoxiadenosina en 5 unas condiciones que permiten la extracción simultánea de otros metabolitos tales como aminoácidos, carnitina libreo acilcarnitinas, estando dicho procedimiento caracterizado por el uso de una mezcla de extracción que comprende una mezcla de agua y un monoalcohol C1-3 de cadena lineal o ramificada en el que el agua está presente al menos al 10 % v/v.10 2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 que se realiza añadiendo la mezcla de extracción en dos etapas: en la primera etapa se pone en contacto la muestra con el monoalcohol C 1-3 de cadena lineal o ramificada que se corresponde con el 100-x % v/v del volumen final; en la siguiente segunda etapa se añade a la muestra agua, que se corresponde con el x % v/v del volumen final; donde x es el porcentaje de agua en v/v que varía desde el 10 hasta el 90 %.
-
- 3.
- Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicho monoalcohol es metanol.
-
- 4.
- Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3 en el que dicha mezcla de extracción
contiene un 30 - 50 % v/v de agua. 20 - 5. Procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 3 y 4 en el que la mezcla de extracción contiene un 60 % v/v de metanol y un 40 % v/v de agua.
- 6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 5 en el que la disolución de extracción 25 también contiene un ácido orgánico a una concentración de 1 - 5 mM.
- 7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -6 en el que la mezcla de extracción contiene uno o más estándares internos, por ejemplo, para aminoácidos, carnitina libre, acilcarnitinas y Adenosina y Desoxiadenosina, a unas concentraciones conocidas.
- 8. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 7 en el que después de la extracción puede determinarse la presencia o la cantidad de Adenosina y Desoxiadenosina junto con uno o más analitos adicionales (por ejemplo, carnitina libre, acilcarnitinas y aminoácidos) mediante el uso de espectrometría de masas (por ejemplo, espectrometría de masas en tándem).
- 9. Un kit adecuado para el procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8 para la preparación de muestras para la detección y/o la medición, mediante el uso de espectrometría de masas en tándem, de Adenosina y Desoxiadenosina junto con otros múltiples analitos en una muestra de sangre seca; comprendiendo dicho kit:
- -
- al menos un recipiente que contiene como control Adenosina y Desoxiadenosina y uno o más aminoácidos, carnitina libre, o una o más acilcarnitinas o más analitos como controles adicionales o estándares internos;
- -
- al menos un recipiente que contiene una mezcla de extracción que comprende una mezcla de agua y un
monoalcohol C1-3 de cadena lineal o ramificada en el que el agua está presente al menos al 10 % v/v. 45 - 10. Kit de acuerdo con la reivindicación 9 en el que hay comprendida adicionalmente al menos una mancha de sangre seca útil como control, en el que dicha mancha de sangre seca está enriquecida con Adenosina y Desoxiadenosina, uno o más aminoácidos, carnitina libre o una o más acilcarnitinas o más analitos, a unas concentraciones conocidas.
- 11. Un procedimiento para el diagnóstico de la SCID a partir de manchas de sangre seca, preferiblemente en tarjetas de Guthrie obtenidas en el ll - IV día de vida, o para monitorizar la eficacia de la terapia durante una terapia de sustitución enzimática, comprendiendo dicho procedimiento el procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 - 8 o el uso de un kit de acuerdo con la reivindicación 9.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ITFI20090272 | 2009-12-23 | ||
| ITFI2009A000272A IT1397866B1 (it) | 2009-12-23 | 2009-12-23 | Metodo e kit per la determinazione di metaboliti su campioni di sangue depositato su carta bibula (dried blood spot). |
| PCT/EP2010/070517 WO2011076859A1 (en) | 2009-12-23 | 2010-12-22 | Method and kit for determining metabolites on dried blood spot samples |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2449941T3 true ES2449941T3 (es) | 2014-03-21 |
Family
ID=42271945
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES10803457.0T Active ES2449941T3 (es) | 2009-12-23 | 2010-12-22 | Procedimiento y kit para la determinación de metabolitos en muestras de manchas de sangre seca |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US9234894B2 (es) |
| EP (1) | EP2517016B1 (es) |
| ES (1) | ES2449941T3 (es) |
| IT (1) | IT1397866B1 (es) |
| WO (1) | WO2011076859A1 (es) |
Families Citing this family (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10384206B2 (en) | 2012-10-09 | 2019-08-20 | Waters Technologies Corporation | Apparatus and method for analyte extraction |
| GB2530569A (en) * | 2014-09-25 | 2016-03-30 | Osama Aldirbashi | Methods of detecting adenosine deaminase deficiency |
| WO2019075460A1 (en) * | 2017-10-13 | 2019-04-18 | Perkinelmer Health Sciences, Inc. | METHODS FOR SEQUENTIALLY PREPARING DIFFERENT TEST SAMPLES FROM A SAME SAMPLE OF DRIED BLOOD |
| JP7359772B2 (ja) * | 2017-11-01 | 2023-10-11 | ザ ボード オブ トラスティーズ オブ ザ レランド スタンフォード ジュニア ユニバーシティー | 検体検出方法 |
| CN108051494A (zh) * | 2017-11-17 | 2018-05-18 | 深圳华大生命科学研究院 | 一种同时检测多种遗传代谢疾病相关物质的方法和试剂盒 |
| US10656059B2 (en) | 2018-03-07 | 2020-05-19 | Alcala Pharmaceutical, Inc. | Method for qualitative and quantitative multiplexing of drug analytes from biological samples |
| CN109709248B (zh) * | 2018-12-29 | 2020-10-27 | 中国人民解放军总医院 | 试剂和吸附柱在制备用于检测干血片样本中的待检测物的试剂盒中的用途 |
| CN110208429A (zh) * | 2019-07-09 | 2019-09-06 | 延边大学 | 一种人体唾液中尿酸干纸片法检测试剂盒 |
| CN111650314A (zh) * | 2020-06-05 | 2020-09-11 | 深圳华大临床检验中心 | 非衍生法串联质谱检测遗传代谢疾病相关物质的试剂盒和方法 |
| WO2022256850A1 (en) * | 2021-06-04 | 2022-12-08 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Systems and methods to assess neonatal health risk and uses thereof |
| CN117074589A (zh) * | 2023-08-23 | 2023-11-17 | 山东英盛生物技术有限公司 | 母体羊水中琥珀酰丙酮、氨基酸和肉碱的检测方法 |
-
2009
- 2009-12-23 IT ITFI2009A000272A patent/IT1397866B1/it active
-
2010
- 2010-12-22 ES ES10803457.0T patent/ES2449941T3/es active Active
- 2010-12-22 EP EP10803457.0A patent/EP2517016B1/en active Active
- 2010-12-22 US US13/517,316 patent/US9234894B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2010-12-22 WO PCT/EP2010/070517 patent/WO2011076859A1/en active Application Filing
-
2015
- 2015-12-15 US US14/969,065 patent/US10141171B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2517016B1 (en) | 2013-12-04 |
| EP2517016A1 (en) | 2012-10-31 |
| US10141171B2 (en) | 2018-11-27 |
| US20120273671A1 (en) | 2012-11-01 |
| US20160172175A1 (en) | 2016-06-16 |
| US9234894B2 (en) | 2016-01-12 |
| IT1397866B1 (it) | 2013-02-04 |
| ITFI20090272A1 (it) | 2011-06-24 |
| WO2011076859A1 (en) | 2011-06-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2449941T3 (es) | Procedimiento y kit para la determinación de metabolitos en muestras de manchas de sangre seca | |
| JP7399214B2 (ja) | 液体クロマトグラフィー質量分析による体液中のアミノ酸分析 | |
| ES2392629T3 (es) | Métodos de distinción de isómeros mediante espectrometría de masas | |
| ES2446266T3 (es) | Método de detección y/o de medición de hepcidina en una muestra | |
| Hu et al. | Urinary analysis of 8-oxo-7, 8-dihydroguanine and 8-oxo-7, 8-dihydro-2′-deoxyguanosine by isotope-dilution LC-MS/MS with automated solid-phase extraction: Study of 8-oxo-7, 8-dihydroguanine stability | |
| ES2527306T3 (es) | Métodos de espectrometría de masas para la detección simultánea de actividad de enzimas metabólicas y niveles de metabolitos | |
| US10175208B2 (en) | Analysis of amino acids in body fluid by liquid chromotography-mass spectrometry | |
| CA2839281A1 (en) | Analysis of total homocysteine and methylmalonic acid in plasma by lc-ms/ms from a plasma separator device (psd) | |
| Hušková et al. | Determination of creatinine in urine by tandem mass spectrometry | |
| US10962550B2 (en) | Analysis of amino acids in body fluid by liquid chromotography-mass spectrometry | |
| He et al. | 1-Naphthylhydrazine hydrochloride: A new matrix for the quantification of glucose and homogentisic acid in real samples by MALDI-TOF MS | |
| Zhang et al. | Development and validation of a highly sensitive LC–MS/MS assay for the quantification of arginine vasopressin in human plasma and urine: application in preterm neonates and child | |
| Min et al. | Rapid and sensitive determination of the intermediates of advanced glycation end products in the human nail by ultra-performance liquid chromatography with electrospray ionization time-of-flight mass spectrometry | |
| Jovanov et al. | Hydrophilic interaction chromatography coupled to tandem mass spectrometry as a method for simultaneous determination of guanidinoacetate and creatine | |
| Thevis et al. | New drugs and methods of doping and manipulation | |
| ES2400253T3 (es) | Procedimiento in vitro para la detección y la detección precoz y para el control acompañante de la terapia de lesiones hepáticas inducidas por medicamentos y drogas adictivas | |
| ES2332218T3 (es) | Metodo para la determinacion de arginina, argininas metiladas y sus derivados. | |
| Li et al. | Therapeutic drug monitoring of vancomycin and voriconazole by liquid chromatography-tandem mass spectrometric method | |
| Ahmed et al. | Quantitative determination of azithromycin in human plasma by liquid chromatography mass spectrometry and its application in Pharmackokinetic study | |
| US20210407269A1 (en) | Analysis of amino acids in body fluid by liquid chromotography-mass spectrometry | |
| CN115754062A (zh) | 一种甲硫氨酸循环关键代谢物的绝对定量分析方法及应用 | |
| CN116391128A (zh) | 人血浆中麦角酸二乙基酰胺（lsd）和2,3-二氢-3-羟基-2-氧代麦角二乙胺（o-h-lsd）的定量方法 | |
| Magiera et al. | A rapid method for determination of 22 selected drugs in human urine by UHPLC/MS/MS for clinical application | |
| Wu et al. | Development and validation of a UPLC–MS/MS method for simultaneous quantification of polymyxins and caspofungin in human plasma for therapeutic drug monitoring | |
| US20240110923A1 (en) | Biochemical medical diagnostic kit |