ES2444693T3 - Polipéptido derivado de enterococo y su uso para vacunación - Google Patents

Abstract

Uso de un polipéptido de acuerdo con la SEC ID Nº 1 para la generación de anticuerpos opsónicos contraEnterococcus.

Description

Polipéptido derivado de enterococo y su uso para vacunación

Los enterococos están entre los tres patógenos nosocomiales más comunes y, debido a sus resistencias a múltiples antibióticos, causan morbilidad y mortalidad sustanciales, especialmente entre pacientes de cuidados intensivos y los inmunodeprimidos. Aunque en la última década se han presentado varios nuevos antibióticos, la resistencia contra estos nuevos fármacos se está desarrollando y propagando rápidamente. Una enfermedad sistémica potencialmente letal tal como endocarditis causada por cepas resistentes puede ser, a veces, intratable. Por lo tanto, se necesitan desesperadamente estrategias de tratamiento y prevención alternativas para contrarrestar el incremento de clones resistentes de forma múltiple en hospitales y clínicas particulares en todo el mundo. Una mejor comprensión de las diferentes estructuras de la superficie celular de enterococos ayudará a dirigir nuevos enfoques terapéuticos y profilácticos.

Se sabe que todas las bacterias gram positivas (también aquellas que pertenecen al género Enterococcus) contienen en la pared celular varios carbohidratos y proteínas específicas. En el curso de la presente invención, se ha identificado una proteína que desempeña un posible papel en el equilibrio dinámico de un componente fundamental de la pared celular externa (es decir peptidoglucano). Las proteínas que pertenecen a esta familia pueden actuar como peptidasas de la pared celular que degradan el peptidoglucano de las bacterias durante el crecimiento y la división celular.

Teng Fang et al., (Infection and Immunity 71: 5033-5042, 2003) desvelan un homólogo de Sag A en Enterococcus faecium, que parece estar implicado en el metabolismo de la pared celular. La proteína es inmunógena.

El documento US 6 583 275 describe proteínas de Enterococcus faecium.

Sorprendentemente, se ha comprobado que un polipéptido que probablemente está ubicado en la superficie externa de la célula bacteriana puede usarse para la producción de vacunas, dado que han sido identificados anticuerpos protectores dirigidos contra partes de dicho polipéptido.

La respuesta inmunitaria humoral está mediada por moléculas de anticuerpo secretadas por células plasmáticas. El antígeno que se une al receptor antigénico de células B, señala células B y es, al mismo tiempo, internalizado y procesado a péptidos que activan células T auxiliares armadas. Las señales procedentes del antígeno unido y de la célula T auxiliar inducen a la célula B a proliferar y diferenciarse en células plasmáticas que secretan un anticuerpo específico. Estos anticuerpos protegen al huésped frente a la infección de tres maneras principales. En primer lugar, dichos anticuerpos pueden inhibir los efectos tóxicos o la infectividad de patógenos uniéndose a ellos. Dichos anticuerpos se denominan neutralizantes. En segundo lugar, recubriendo los patógenos, dichos anticuerpos pueden permitir que células accesorias que reconocen las partes Fc de matrices de anticuerpos ingieran e inactiven al patógeno. Este proceso se denomina opsonización. En tercer lugar, los anticuerpos pueden desencadenar la activación del sistema del complemento. Las proteínas del complemento pueden potenciar fuertemente la opsonización o pueden inactivar directamente ciertas células bacterianas.

Para la producción de vacunas, es importante que el antígeno produzca anticuerpos que inhiban la actividad patógena del microorganismo patógeno. Los anticuerpos protectores producidos por una vacuna tienen, por lo tanto, el efecto de neutralización, opsonización y activación del complemento, con lo cual anticuerpos inducidos por un antígeno específico también pueden tener dos o incluso tres de las actividades protectoras.

La presente invención proporciona el uso del polipéptido de acuerdo con la SEC ID Nº 1 y el anticuerpo monoclonal, tal como se definen en las reivindicaciones adjuntas.

La SEC ID Nº 1 tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

(SEC ID Nº 1)

En una realización preferida, el polipéptido de la SEC ID Nº 1 se usa como conjugado, con lo que el antígeno está unido covalentemente a un inmunoportador. Dicho inmunoportador puede ser un polipéptido o una proteína o una molécula que contiene carbohidratos (tal como por ejemplo un polisacárido capsular o glucoconjugado) que mejora la interacción entre células T y B para la inducción de una respuesta inmunitaria contra el antígeno. Esto puede preferirse para vacunas destinadas al uso en pacientes con actividad reducida del sistema inmunitario. Dado que las

infecciones por enterococos son, frecuentemente, un problema en hospitales y clínicas particulares, dichos conjugados son particularmente preferidos para dichos pacientes. Los inmunoportadores adecuados de acuerdo con la presente invención comprenden toxoide tetánico, toxoide diftérico, toxina A de Pseudomonas aeruginosa o sus derivados de la misma. Moléculas que contienen carbohidratos tales como polisacáridos capsulares o ácidos teicoicos también pueden servir como socio de conjugación para el polipéptido mencionado anteriormente o fragmentos del mismo. En una realización espacialmente preferida, se usan dichos fragmentos del inmunoportador que estimulan la respuesta inmunitaria en el paciente a tratar sin tener, sin embargo, el efecto secundario no deseado que dichas proteínas pueden producir cuando se usan en una forma no modificada.

El enlace covalente entre el antígeno y el inmunoportador puede proporcionarse mediante un enlace químico directo

o mediante un separador. Algunas veces, moléculas cortas que tienen dos grupos reactivos en ambos extremos se hacen reaccionar con el antígeno y el inmunoportador para producir una molécula enlazada covalentemente.

En una alternativa, la molécula usada como vacuna (antígeno e inmunoportador) puede producirse de forma recombinante, con lo que fragmentos de genes adecuados son enlazados entre sí y son insertados en un vector apropiado. Dicho vector es introducido en una célula huésped adecuada y la célula huésped (por ejemplo E. coli, Bacillus, levadura o células de insecto) produce el polipéptido o fragmento del mismo tal como se ha definido anteriormente, junto con el inmunoportador como una molécula.

El polipéptido, en solitario o acoplado a un inmunoportador, puede usarse para el tratamiento o la prevención de infecciones bacterianas. Dicho medicamento es una vacuna que comprende preferentemente también un adyuvante farmacéuticamente aceptable. El adyuvante promueve los anticuerpos protectores del subtipo IgG. Los adyuvantes típicos incluyen adyuvante completo de Freund (ACF), adyuvante incompleto de Freund (AIF), alumbre y otros adyuvantes adecuados para uso humano (por ejemplo partículas similares a virus). Polímeros como sulfato de dextrano han demostrado ser también un potente estimulador de anticuerpos IgG contra el antígeno de la superficie celular bacteriana.

Una vacuna activa es administrada al paciente, preferentemente antes de que se produzca una infección. Dicha vacunación puede aplicarse, por lo tanto, regularmente a pacientes en riesgo (por ejemplo ancianos, pacientes antes de un transplante de un órgano sólido o de médula ósea) para estimular su respuesta inmunitaria y para evitar una infección en un hospital o una clínica particular.

En circunstancias específicas también puede ser posible, sin embargo, aplicar la vacuna en fases tempranas de la infección para producir anticuerpos protectores que inactivan las bacterias que pertenecen al género Enterococcus. En una realización preferida, la vacuna de la presente invención proporciona protección contra diferentes cepas de Enterococcus faecium y posiblemente también contra cepas de Enterococcus faecalis, dado que existe una amplia homología de secuencia entre estas especies.

Los anticuerpos inducidos por la proteína de la SEC ID Nº 1 son protectores y facilitan la fagocitosis. Dado que dichos anticuerpos protectores y, en particular, opsónicos son preferidos, se desea usar aquellas partes del polipéptido de la SEC ID Nº 1 que producen anticuerpos que tienen propiedades opsónicas.

La formulación farmacéutica de un medicamento que se usará como vacuna es conocida por el experto en la materia. Habitualmente, una solución del antígeno posiblemente acoplado a un inmunoportador es disuelta en una solución fisiológicamente aceptable como un tampón. La solución debe estabilizarse para evitar una precipitación no deseada de los compuestos inmunológicamente activos. La vacuna es producida preferentemente en forma de una solución adaptada para inyección, preferentemente inyección por vía intramuscular. Otras formas de formulaciones farmacéuticas como emplastos o pulverizados también son aceptables, siempre que el antígeno entre en contacto suficiente con el sistema inmunitario y se desencadene la formación de anticuerpos específicos.

Por otro lado, a veces no es posible tratar pacientes con una vacuna activa, dado que el sistema inmunitario está gravemente alterado. En esas circunstancias el polipéptido de la SEC ID Nº 1 tal como se ha definido anteriormente puede usarse para producir anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales que se unen a u opsonizan Enterococcus. El experto en la materia es muy consciente de cómo pueden prepararse dichos anticuerpos.

El inóculo para la producción de anticuerpos policlonales se prepara típicamente dispersando el antígeno o el conjugado antígeno-inmunoportador en un diluyente fisiológicamente tolerable tal como solución salina, para formar una composición acuosa. Una cantidad inmunoestimuladora del inóculo preferentemente con adyuvante es administrada a un mamífero y el mamífero inoculado es mantenido a continuación durante un periodo de tiempo suficiente para que el antígeno Induzca anticuerpos anti-Enterococcus protectores. Después de periodos de tiempo adecuados, de dos semanas hasta cuatro meses, pueden aplicarse dosis de refuerzo del antígeno-inmunoportador y el valor cuantitativo del antígeno es monitorizado. En un momento adecuado, cuando el valor cuantitativo de los anticuerpos neutralizantes u opsónicos está en su máximo, los anticuerpos son recogidos. Dichos anticuerpos pueden incluir preparaciones de anticuerpos de diversos animales usados habitualmente (tales como ratones, cabras, primates, burros, conejos o caballos) y seres humanos, con lo que los anticuerpos se aíslan a partir de donaciones de sangre.

Los anticuerpos inducidos en el mamífero son recogidos, aislados y purificados en la medida deseada mediante técnicas bien conocidas tales como mediante fraccionamiento alcohólico y cromatografía en columna o preferentemente mediante cromatografía por inmunoafinidad con lo que el antígeno se une a una columna cromatográfica. El antisuero pasa por la columna, con lo que anticuerpos específicos son retenidos y todos los demás componentes del suero son eliminados por lavado. A continuación, los anticuerpos purificados son eluídos con gradientes adecuados. Puede requerirse una purificación adicional.

Como alternativa, pueden prepararse anticuerpos monoclonales de acuerdo con técnicas bien conocidas por el experto en la materia. Cuando se obtiene un anticuerpo monoclonal adecuado, las regiones de unión pueden ser identificadas y pueden proporcionarse toda la molécula de anticuerpo así como derivados del anticuerpo como fragmentos o subfragmentos de anticuerpo. La técnica general para producir anticuerpos monoclonales está ampliamente descrita en libros de texto. Después de haber preparado los hibridomas o haber seleccionado el anticuerpo monoclonal entre bibliotecas o animales modificados genéticamente, debe determinarse a qué parte del polipéptido de la SEC ID Nº 1 se une el mAb. A continuación, debe verificarse si el anticuerpo es opsónico.

Descripción de las figuras

La figura 1 muestra la inactivación opsónica de un antisuero policlonal producido en conejos contra la cepa E155 de Enterococcus faecium. Se ensayaron diferentes diluciones séricas e incluso a diluciones elevadas, podía observarse una actividad opsónica sustancial de los anticuerpos generados.

La figura 2 muestra una Transferencia de Western de anticuerpos contra la cepa E155 de Enterococcus faecium que se hicieron reaccionar con proteínas derivadas de la cepa homóloga. La pista 1 es un marcador de peso molecular. En la pista 2 se aplicó un lisado de células de E. faecium E155. En la pista 3, se aplicó el sobrenadante de cultivo de E. faecium E155.

La figura 3 es una Transferencia de Western con un polipéptido expresado de forma recombinante y purificado que tiene la SEC ID Nº 1. El polipéptido purificado se había obtenido originalmente de la cepa E155 de Enterococcus faecium. Usando cebadores apropiados, el gen se amplificó mediante PCR y se clonó en un vector de expresión para bacterias gram-negativas. La proteína producida por las células huésped se purificó con una columna de Ni a través de un His-Tag. La proteína purificada se usó para la producción de anticuerpos policlonales en conejos. Los anticuerpos se usaron en la Transferencia de Western tal como se muestra en la figura 3 y se ensayó su actividad opsónica. La especificidad de los anticuerpos opsónicos se confirmó mediante absorción con la proteína purificada.

La figura 4 muestra los resultados de un ensayo ELISA realizado con el polipéptido purificado que tiene la SEC ID Nº 1 y, en comparación con ello, con suero generado contra bacterias termoinactivadas (alfa E155) y suero normal de conejo (NSA).

La figura 5 muestra los resultados de la inhibición opsonofagocítica obtenida con el polipéptido que tiene la SEC ID Nº1.

Ejemplo 1:

En un intento de identificar dianas de anticuerpos opsónicos en E. faecium, un conejo se inmunizó con la cepa E155 de E. faecium termoinactivada [Leavis, H.L. et al., (2007). Insertion sequence-driven diversification creates a globally dispersed emerging multiresistant subspecies of E. faecium. PLoS Pathog 3: e7] que pertenece al complejo clonal 17 (CC17) que está asociado con brotes hospitalarios de enterococos resistentes a vancomicina (ERV) [Top, J. et al., (2008). Emergence of CC17 Enterococcus faecium: from commensal to hospital-adapted pathogen. FEMS Immunol Med Microbiol 52: 2997-308]. Las bacterias fueron termoinactivadas a 65ºC durante 1 hora y una concentración final de 1,4 x 1012 ufc/dosis se inyectó i.v. 3 veces por semana durante un total de 3 semanas. Los sueros resultantes eran opsónicos contra la cepa homóloga (77,8% de inactivación a una dilución sérica de 1:100). Los resultados se muestran en la figura 1.

Ejemplo 2:

El análisis por transferencia de Western mostraba una banda de proteína distinta de aproximadamente 54 kD que estaba presente en extractos celulares y aún más pronunciada en el sobrenadante de cultivo. (Los resultados se muestran en la figura 2.).

Ejemplo 3:

Las 5 cepas de E. faecium ensayadas hasta ahora expresaban una banda de proteína del mismo tamaño que la que será detectada mediante el suero de conejo inmune (no se muestran los datos). El análisis Nano LC-ES-MS/MS (análisis a escala nanométrica de cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas en tándem) de la banda de gel teñida con azul de Coomassie dio como resultado datos de secuencia que se compararon con las bases de datos NCBI y MASCOT. La homología más alta (valor 1253) se obtuvo con NLP/P60, una proteína de 55 kD de E. faecium DO (Nº de entrada Gi|69245436) [Anantharaman, V. et al. (2003). Evolutionary history, structural features and biochemical diversity of the NIpC/P60 superfamily of enzymes. Genome Biol 4: R11].

El gen se amplificó posteriormente a partir de E. faecium E155 mediante PCR y se clonó en un vector de expresión His-Tag (Champion pET Directional TOPO Expression Kit, Invitrogen). La proteína expresada se purificó en columnas de níquel en condiciones desnaturalizantes y la proteína purificada demostró ser reactiva con los sueros

5 de conejo generados contra células completas de E. faecium E155. (Los resultados se muestran en la figura 3).

Ejemplo 4:

Un conejo se inmunizó con la proteína purificada (2 veces 10 !g por vía subcutánea (SC) mezclados con adyuvante incompleto de Freuds y administrados a intervalos de 2 semanas y en la tercera semana 3 veces 5 !g IV) sin adyuvante. Dos semanas después de la última inyección, los valores cuantitativos se verificaron mediante ELISA

10 (véase la figura 4), y mediante ensayo opsonofagocítico (véase la figura 5).

Ejemplo 5:

Para confirmar la especificidad, se realizó un ensayo de inhibición opsonofagocítica que mostraba que 100 !g de proteína purificada eran capaces de inhibir la inactivación en casi el 100%, mientras que cantidades inferiores inhibían la inactivación de manera dependiente de la dosis (véase la figura 5). El ensayo opsonofagocítico se realizó 15 tal como se describe en otra parte [Theilacker, C. et al., Opsonic antibodies to Enterococcus faecalis strain 12030 are directed against lipoteichoic acid. Infect Immun (2006) 74: 5703-12]. En resumen, suero de cría de conejo (dilución 1:15), PMN humanos, y diluciones séricas apropiadas se mezclaron con bacterias cultivadas hasta la fase logarítmica (relación bacterias con respecto a PMN 1:1). La mezcla se incubó en una gradilla giratoria a 37ºC. Después de 90 minutos, los leucocitos se lisaron y diluciones apropiadas se colocaron en placas de agar de soja

20 tríptico. Las placas se incubaron durante una noche y al día siguiente se contaron las colonias.

En resumen, estos datos confirman que el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 1 de E. faecium es un candidato a vacuna que induce anticuerpos opsónicos contra aislados clínicos de E. faecium resistente a vancomicina.

Ejemplo 6:

La eficacia protectora de anticuerpos contra el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 1 se demostró en un modelo de

25 bacteriemia en ratón. Ratones balb/c hembra (8 ratones por grupo) recibieron 200 !l de suero normal de conejo (NRS) o suero generado contra el polipéptido que tiene la SEC ID Nº 1 (IRS). Los animales fueron estimulados con

E. faecium E155 después de 24 horas (1,18 x 1010 ufc/ratón) y recibieron una segunda dosis de 200 !l de suero de conejo (NRS o IRS) 2 h después de la inoculación. Los ratones fueron sacrificados 8 horas después de la infección y se determinaron los recuentos de colonias en la sangre. Estos resultados muestran una reducción estadísticamente

30 significativa de los recuentos de colonias de sangre cuando los ratones recibían IRS.

E. faecium posee una proteína asociada a la superficie celular de aproximadamente 54 kD que es secretada al medio de cultivo e induce anticuerpos específicos en conejos inmunizados con E. faecium termoinactivada. La proteína se identificó mediante análisis Nano LC-ES-MS/MS, se amplificó mediante PCR y se clonó en un vector de expresión gram-negativo. La proteína recombinante purificada se usó para inmunizar a un conejo y el antisuero

35 resultante demostró mediante ELISA unirse específicamente a la proteína. Los sueros de conejo inactivaron la cepa homóloga >50% a una dilución sérica de 1:10 y la actividad de inactivación podía absorberse completamente con el antígeno purificado. Dos aplicaciones de suero (24 h antes y 2 h después de la inoculación) reducían estadísticamente los recuentos de colonias en la sangre de ratones, confirmando que este antígeno es una diana de vacuna prometedora para bacteriemia por Enterococcus resistente a vancomicina (ERV).

40 LISTA DE SECUENCIAS

<110> universitatsklinikum Freiburg

<120> Polipéptido derivado de enterococo y su uso para vacunación

<130> ZEE20090202

<160> 1

45 <170> PatentIn versión 3.5

<210> 1

<211> 524

<212> PRT

<213> Enterococo

50 <400> 1

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1. Uso de un polipéptido de acuerdo con la SEC ID Nº 1 para la generación de anticuerpos opsónicos contra

   Enterococcus.
2. 2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polipéptido está enlazado covalentemente a un 5 inmunoportador, en particular una proteína, un carbohidrato y/o un glucoconjugado.

3. 3.

   El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho polipéptido se usa junto con un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

4. 4.

   El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dichos anticuerpos opsónicos son contra Enterococcus faecium o E. faecalis.

   10 5. Uso de un polipéptido de acuerdo con la SEC ID Nº 1 para la preparación de un medicamento para el tratamiento

   o la prevención de una infección bacteriana.

5. 6.

   El uso de acuerdo con la reivindicación 5, en el que el polipéptido está enlazado covalentemente a un inmunoportador, en particular una proteína, un carbohidrato y/o un glucoconjugado.

6. 7.

   El uso de acuerdo con la reivindicación 5 o 6, en el que el medicamento es una vacuna.

   15 8. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en el que dicho polipéptido se usa junto con un adyuvante farmacéuticamente aceptable.

7. 9. Anticuerpo monoclonal que reacciona específicamente con un polipéptido de acuerdo con la SEC ID Nº 1, o dicho polipéptido enlazado covalentemente a un inmunoportador, caracterizado porque el anticuerpo es opsónico contra

   Enterococcus.