ES2439424A1

ES2439424A1 - Método para aumentar el potencial implantatorio de embriones de mamíferos obtenidos por fecundación in vitro

Info

Publication number: ES2439424A1
Application number: ES201231162A
Authority: ES
Inventors: Ignacio Santiago ÁLVAREZ MIGUEL; Mario Javier PERIANES CARRASCO
Original assignee: Universidad de Extremadura
Current assignee: Universidad de Extremadura
Priority date: 2012-07-20
Filing date: 2012-07-20
Publication date: 2014-01-22
Anticipated expiration: 2032-07-20
Also published as: ES2644756T3; ES2439424B1

Abstract

Método para aumentar el potencial implantatorio de embriones de mamíferos obtenidos por fecundación in vitro. La presente invención contempla un método para aumentar el potencial implantatorio de embriones de mamíferos obtenidos por fecundación in vitro caracterizado porque comprende las siguientes etapas: a) desarrollo in vitro de los embriones obtenidos hasta cualquier fase del desarrollo pre-embrionario y b) cultivo de los embriones obtenidos en a) en un medio de cultivo enriquecido con metabolitos activos del estradiol.

Description

Método para aumentar el potencial implantatorio de embriones de mamíferos obtenidos por Fecundación In Vitro.

Campo de la invención

Esta invención pertenece, de forma general, al campo de la Reproducción Asistida en mamíferos, en concreto a las técnicas de Fecundación In Vitro y Transferencia Embrionaria (FIV-TE). De forma particular, la presente invención se refiere a un nuevo método para la mejora de la implantación embrionaria de embriones obtenidos por Fecundación In Vitro, basado en la suplementación de los medios de cultivo empleados en este tipo de técnicas con metabolitos activos del estradiol.

Antecedentes de la invención

Las necesidades metabólicas del embrión varían a medida que atraviesa las diferentes fases de desarrollo preimplantacional. Por esta razón, en embriones obtenidos por fecundación in vitro, la composición del medio de cultivo adquiere un papel protagonista.

Tradicionalmente, y con el objetivo de optimizar la composición del medio respecto a las necesidades puntuales del embrión en desarrollo, se han diseñado medios de cultivo secuenciales (Artini, P. G., Valentino, V., Cela, V., Cristello, F., Vite, A., Genazzani, A. R., 2004. A randomized control comparison study of culture media (HTF versus P1) for human in vitro fertilization. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 116, 196-200), cuya composición varía en función al grado de desarrollo embrionario. Generalmente, el periodo que comprende desde la fecundación hasta el embrión de 4 a 8 células, requiere de un medio rico en lactatos y piruvatos (Biggers, J.D. (1987). Pioneering mammalian embryo culture. In The Mammalian Preimplantaion Embryo (Ed. B.D.Bavister), Plenum, New York. pp. 1-22.), sin embargo, a partir de este momento, desde que se activa el genoma embrionario y hasta el final de desarrollo embrionario preimplantacional, el embrión aumenta sus necesidades de glucosa y disminuyen las de lactato y piruvato. Por otra parte, la optimización de los medios de cultivo pasa por la adición de aminoácidos esenciales y no esenciales que, junto a las vitaminas, adquieren una importancia especial tras la fase de compactación (Gardner DK, Lane M. Development of viable mammalian embryos in vitro: evolution of sequential media. In: Cibelli JB, Lanza RP, Campbell KHS, West MD, eds. Principles of cloning. Amsterdam: Academic Press, 2002:187–213). Otros componentes, añadidos al medio de cultivo como el EDTA o la Taurina protegen de la oxidación y ayudan a optimizar el desarrollo embrionario (De Silva, M., 1998. Culturing human embryos with and without glucose. Fertil Steril. 69, 970-1).

Existen algunos medios comerciales diseñados para incrementar las posibilidades de adhesión de los embriones transferidos. Éstos incluyen componentes como el hialuronato cuya función, al margen del potencial embrionario de implantación, facilitan el anclaje entre útero y embrión. En este sentido, la posibilidad de incrementar la capacidad propia del embrión para implantarse, supone un avance de

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enormes dimensiones en el ámbito de la reproducción asistida.

Las hormonas que participan en la preparación del útero para la implantación, en cuanto a la sincronización del útero receptivo y la adquisición de competencia por parte del embrión se refiere, son fundamentalmente la Progesterona (P4) (Franco, H. L., Jeong, J. W., Tsai, S. Y., Lydon, J. P., DeMayo, F. J., 2008. In vivo analysis of progesterone receptor action in the uterus during embryo implantation. Semin Cell Dev Biol. 19, 178-86) y el Estradiol (E2) (Ma, W. G., Song, H., Das, S. K., Paria, B. C., Dey, S. K., 2003. Estrogen is a critical determinant that specifies the duration of the window of uterine receptivity for implantation. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2963-8). Éstas disparan la denominada “ventana de implantación”, que se define como el periodo espacio-temporal sincronizado entre el útero y el embrión en el que se lleva a cabo la implantación.

El E2 actúa sobre sus receptores en el endometrio para inducir el estado receptivo y su metabolito el 4hidroxiestradiol (4OHE2) sería el encargado de mediar la activación del embrión mediante la sobreexpresión de los factores de crecimiento epidérmico EGF (Hamatani, T., Daikoku, T., Wang, H., Matsumoto, H., Carter, M. G., Ko, M. S., Dey, S. K. "Global gene expression analysis identifies molecular pathways distinguishing blastocyst dormancy and activation". Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 10326-31, 2004) y la activación de sus receptores (Paria, B.C., Elenius, K., Klagsbrun, M., Dey, S.K., 1999. Heparinbinding EGF-like growth factor interacts with mouse blastocysts independently of ErbB1: a possible role for heparan sulfate proteoglycans and ErbB4 in blastocyst implantation. Development 126, 1997-2005). Se ha puesto de manifiesto recientemente que los factores de crecimiento epidérmico (EGF) son imprescindibles para que el embrión se implante correctamente (Lim, H. J., Dey, S. K., 2009. HB-EGF: a unique mediator of embryo-uterine interactions during implantation. Exp Cell Res. 315, 619-26).

Se ha comprobado que la respuesta del embrión con respecto a los EGF puede ser alterada administrando de manera exógena estrógenos o catecolestrogenos (Paria, B.C., Lim, H., Wang, X.N., Liehr, J., Das, S.K., Dey, S.K., 1998. Coordination of differential effects of primary estrogen and catecholestrogen on two distinct targets mediates embryo implantation in the mouse. Endocrinology 139, 5235-5246.). En este artículo se utiliza 4OHE2 para tratar un modelo experimental de embriones de ratón sin capacidad de implantación (durmientes) obtenidos por ovarioectomia. El modelo se llevó a cabo exclusivamente en este tipo de embriones para comprobar que esta suplementación en el medio sustituye a la falta de este metabolito en las ratas ovarioectomizadas. Según estos experimentos el tratamiento de estos embriones con esta molécula consigue que estos embriones se implanten en ratonas subrogadas. El modelo descrito se lleva a cabo en día 4 (blastocisto). Por lo tanto el ambiente endocrino del útero actúa sobre la síntesis de factores de crecimiento y el estado de afinidad de sus receptores señalando de esta forma el momento y lugar adecuados para la implantación.

Según los datos publicados en el último registro realizado por la Sociedad Española de Fertilidad (SEF), las tasas reflejan un 22% de hijos nacidos por transferencia de embrión, cuando ésta se ha realizado a partir de ovocitos propios. Las causas por las cuales, el porcentaje de éxito tras una fecundación in vitro es tan reducido, pueden ser muchas. Con mucha frecuencia, los abortos se atribuyen a una reducida receptividad endometrial o a una mala calidad embrionaria. En este sentido cobran especial interés, las condiciones en las que se realiza el proceso de fecundación y desarrollo embrionario (Smith, G.D.,

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Monteiro da Rocha, A., 2012. Advances in embryo culture systems. Seminars in reproductive medicine 30, 214-221).

Con el objetivo de mejorar las bajas tasas de éxito en los tratamiento de reproducción asistida, los autores de la presente invención, tras una importante labor de investigación, han demostrado por primera vez la utilidad del empleo de los metabolitos derivados del estradiol para la mejora de la tasa de implantación de los embriones obtenidos por fecundación in vitro, así como de su potencial para unir los factores de crecimiento que dirigen el proceso.

En base a esto, los autores de la presente invención, han desarrollado un método que permite aumentar, hasta en un 25%, el potencial implantatorio de los embriones obtenidos por Fecundación In Vitro. El método de la invención está basado en la suplementación del medio de cultivo, en el que permanecen los embriones antes de ser transferidos, con metabolitos activos derivados del estradiol, ajustando los valores de concentración y el momento de adición del metabolito al medio de cultivo para así optimizar las tasas de implantación en cada caso. Con este método se consigue reactivar la capacidad de implantación, originalmente afectada por el cultivo artificial, en los embriones obtenidos por fecundación in vitro.

El método de la invención permitiría así aumentar la tasa de implantación embrionaria en los ciclos de FIV-TE y de este modo contribuir a solucionar las bajas tasas de éxito que actualmente se producen en estos tratamientos. El empleo de este método en el mercado supondrá un aumento en el éxito de los tratamientos de reproducción asistida, tanto en clínicas de reproducción asistida humana como en veterinaria.

Descripción de los dibujos

Figura 1.- El gráfico representa las diferencias que se reflejan en el porcentaje de adhesión embrionaria entre embriones cultivados en un medio convencional (grupo A) y uno enriquecido con 4-hidroxiestradiol (grupo B). (** p<0,1)

Descripción de la invención

En base a las bajas tasas de éxito de los tratamiento de fertilización, debido principalmente a los problemas derivados de la implantación del embrión en el útero, los autores de la invención han desarrollado un método que permite incrementar el potencial implantatorio de los embriones y por tanto el éxito del tratamiento.

La invención consiste en la suplementación de los medios de cultivo usados para las técnicas de Fecundación In Vitro y Transferencia Embrionaria (FIV-TE) con metabolitos activos del estradiol, en particular derivados hidroxilados del 17b-estradiol. Entre estos metabolitos, se ha comprobado que el 4hidroxiestradiol (4OHE2) es responsable de activar receptores específicos en el embrión que activan la producción de EGF, uno de los principales mediadores que inicia la implantación. Por lo tanto, el objetivo es activar los mecanismos celulares y moleculares que conllevan a la implantación en el embrión cultivado in vitro emulando la situación que ocurre fisiológicamente en el tracto reproductor femenino.

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En una realización principal de la invención se contempla un método para aumentar el potencial implantatorio de embriones de mamíferos obtenidos por fecundación in vitro caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) Desarrollo in vitro de los embriones obtenidos por fecundación in vitro hasta cualquier fase del desarrollo pre-embrionario (cigoto a blastocisto).

b) Cultivo de los embriones obtenidos en a) en un medio de cultivo enriquecido con metabolitos activos del estradiol.

El desarrollo in vitro de los embriones ha de llevarse a cabo en un medio de cultivo apropiado y en condiciones adecuadas de temperatura, humedad y [CO2]. Las condiciones de temperatura y CO2 son condiciones estandarizadas en el estado de la técnica. Los medios empleados suelen ser medios tamponados y con suficientes componentes para asegurar el suplemento de energía y aminoácidos que requiere el embrión en desarrollo pre-implantacional. Entre los componentes mas frecuentes y comunes en estos medios están la glucosa, el tampón bicarbonato, aminoácidos esenciales y no esenciales y otros componentes proteicos como albúmina, que se utiliza también como transportador extracelular. Sin embargo, en ningún caso se incluye en su composición un metabolito activo del estradiol, en particular el 4OHE2, lo que supone la novedad de esta invención.

En una realización particular del método de la invención, el desarrollo in vitro de los embriones (paso a) se lleva a cabo hasta la fase de mórula (previa a la formación del blastocisto). En este caso, se esperan 24 horas para realizar las pruebas de implantación en el día 4, es decir que el tratamiento es previo a la fase en la que el embrión se encontraría en el útero materno con esta molécula.

Gracias a su trabajo de experimentación, los autores de la invención han demostrado que, cuando el tratamiento se produce en fases previas a las que esta molécula se encuentra disponible para el embrión en condiciones naturales (fase de mórula), se produce una mejora en la capacidad de implantación de este tipo de embriones de forma gradual.

En otra realización particular, los metabolitos activos del estradiol se seleccionan de entre 4OHE2 y 2OHE2. En realizaciones preferidas, el metabolito activo empleado es 4OHE2.

La concentración final del metabolito en el medio de cultivo debe ser ajustada según la especie origen de los embriones. Por ejemplo, en el modelo murino, una concentración de 1μg/ml es suficiente para incrementar hasta un 25% el potencial implantatorio de los embriones.

Así, en realizaciones particulares del método de la invención, la concentración de 4OHE2 en el medio de cultivo está comprendida entre 0,01 y 1 μg/ml, preferiblemente 1 μg/ml.

En realizaciones particulares del método de la invención, el periodo de cultivo de los embriones en el paso b) se encuentre comprendido entre 2 y 24 h previo a la transferencia.

Finalmente, se lleva a cabo el paso de los embriones cultivados en el medio enriquecido a un medio apropiado para su transferencia o para realizar las pruebas de implantación in vitro.

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Mediante transferencia embrionaria los embriones resultantes del proceso de fecundación/cultivo in vitro son introducidos por medios mecánicos en el útero materno para su futura implantación.

Ejemplo 1

Método utilizado para obtener embriones por fecundación in vitro y comprobar la utilidad del 4hidroxioestradiol en la mejora del potencial implantatorio embrionario.

a.- Obtención de embriones por fecundación in vitro

Los ovocitos maduros fueron obtenidos a partir de ratones hembra (C57BL/6J X DBA/2J F1), adultas de entre 10-12 semanas de edad, que se mantuvieron bajo condiciones de luz y temperatura controladas: (12h luz/oscuridad) y (20-22ºC). Las ratonas fueron hiperestimuladas mediante inyección intraperitoneal de 10UI de eGC (Sigma Chemical Co.) y 48h más tarde 10UI de hCG (Sigma Chemical Co.). Las ratonas fueron sacrificadas 14h post-hCG por dislocación cervical. Se diseccionaron los oviductos y se extrajeron los ovocitos bajo lupa y por ruptura del ámpula del oviducto, en un medio de cultivo KSOM (Millipore Iberica S.A.U.).

Los espermatozoides utilizados en la fecundación in vitro se obtuvieron a partir de ratones macho (C57BL/6J X DBA/2J F1), adultos de entre 10-12 semanas de edad, que se mantuvieron bajo condiciones de luz y temperatura controladas: (12h luz/oscuridad) y (20-22ºC). Los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical. Se diseccionaron los conductos del tracto reproductor y se extrajo el esperma bajo lupa por presión del epidídimo y los conductos deferentes. Para calcular la concentración espermática de la muestra se utilizó una cámara “Makler” y para realizar los cálculos se tuvieron en cuenta exclusivamente los espermatozoides móviles. La concentración de espermatozoides utilizada en la fecundación in vitro, corresponde a 2x106 espermatozoide/ml. La fecundación in vitro se realizó por cultivo entre gametos (ovocitos y espermatozoides) durante 4 horas en HTF (Millipore Iberica S.A.U.), en condiciones de temperatura y CO2 controladas: (37ºC y 5.5%[CO2]).

Tras el periodo de fecundación los embriones fueron trasladados al medio de cultivo (KSOM) sin espermatozoides, donde fueron cultivados hasta el estadio de mórula compactada.

b.- Cultivo enriquecido con 4-hidroxiestradiol

Una vez que el embrión alcanzó el estadio de mórula, fue trasferido a otra placa con el mismo medio de cultivo (KSOM), esta vez enriquecido con 4-hidroxiestradiol (4-OH-E2) [1μg/ml] donde se mantuvo durante 24h. En las mismas condiciones de temperatura y [CO2]. La eficacia del tratamiento se estimó por comparación mediante pruebas de implantación, con embriones desarrollados completamente en un medio de cultivo convencional en ausencia de 4-OH-E2.

c.- Pruebas de implantación

Para comprobar los efectos del tratamiento sobre el potencial de implantación embrionaria, se realizaron

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cultivos de células endometriales en monocapa, obtenidas a partir de las ratones hembra (C57BL/6J X DBA/2J F1), donadoras de los ovocitos empleados en la fecundación in vitro. Las ratonas fueron sacrificadas 14h post-hCG. Se diseccionaron los hemiúteros y las células endometriales fueron obtenidas por raspado del epitelio luminal. Las muestras se trataron con Colagenasa [0,1%] a 37ºC y fueron filtradas 5 en una maya de 70μm de luz para desechar el epitelio glandular. Después de 2 lavados, las células fueron sembradas a una concentración de 200.000 cél/ml. y llevadas al 100% de confluencia. Los embriones cultivados en medio suplementado con 4-OH-E2 o el grupo control fueron co-cultivados con las células endometriales durante 48-72h. Tras este periodo se comprobó el porcentaje de embriones adheridos a la monocapa de células endometriales (ver figura 1). En dicha figura, se observa como los embriones que

10 han sido cultivados en el medio enriquecido con 4-OH-E2 experimenta un incremento estadísticamente significativo en su potencial de implantación, que supone un aumento de algo más del 50% respecto al grupo de embriones control, que ha sido cultivado en el mismo medio de cultivo sin 4-OH-E2.

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Claims

REIVINDICACIONES

1.- Método para aumentar el potencial implantatorio de embriones de mamíferos obtenidos por fecundación in vitro caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) Desarrollo in vitro de los embriones obtenidos hasta cualquier fase del desarrollo preembrionario.

b) Cultivo de los embriones obtenidos en a) en un medio de cultivo enriquecido con metabolitos

activos del estradiol.
2.- Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el desarrollo de embriones en b) se lleva a cabo hasta la fase de mórula.
3.- Método, según la reivindicación 1, caracterizado porque los metabolitos activos del estradiol se seleccionan de entre 4OHE2 y 2OHE2.
4.- Método según la reivindicación 3, caracterizado porque el metabolito activo es 4OHE2.
5.- Método, según la reivindicación 4, caracterizado porque la concentración de 4OHE2 en el medio de cultivo está comprendida entre 0,01 y 1 μg/ml.
6.- Método, según la reivindicación 5, caracterizado porque la concentración de 4OHE2 es de 1 μg/ml.
7.- Método según la reivindicación 1, caracterizado por que el periodo de cultivo de los embriones en el paso b) se encuentre comprendido entre 2 y 24h previo a la transferencia.
8.- Medio de cultivo que comprende metabolitos activos del estradiol para aumentar el potencial implantatorio de embriones de mamíferos obtenidos por fecundación in vitro.

OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.º solicitud: 201231162

ESPAÑA

Fecha de presentación de la solicitud: 20.07.2012

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categoría

56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

X

PARIA B C, et al. Coordination of differential effects of primary estrogen and catecholestrogen on two distinct targets mediates embryo implantation in the mouse. Endocrinology Dic 1998 VOL: 139 No: 12. Págs: 5235-5246. ISSN 0013-7227 (Impreso). Ver todo el documento, especialmente resumen, introducción, apartados 2º y 3º de materiales y métodos, apartados 1º, 2º y 3º de resultados, y figura 1. 1-4,7,8

A

5,6

X

PAKRASI P L, et al. Catechol estrogens stimulate synthesis of prostaglandins in the preimplantation rabbit blastocyst and endometrium. Biology of reproduction Sep 1983 VOL: 29 No: 2. Págs: 347-354. ISSN 0006-3363 (Impreso). Ver todo el documento. 1-4,7,8

A

5,6

X

HOVERSLAND R C, et al. Catechol estradiol induced implantation in the mouse. Life sciences. 24 May 1982 VOL: 30 No: 21. Págs: 1801-1804. ISSN 0024-3205 (Impreso). Doi:10.1016/0024-3205(82)90316-2. Ver todo el documento, especialmente resumen. 1-4,7,8

A

5,6

Categoría de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categoría A: refleja el estado de la técnica O: referido a divulgación no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentación de la solicitud E: documento anterior, pero publicado después de la fecha de presentación de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nº:

Fecha de realización del informe 30.08.2013

Examinador B. Pérez Esteban Página 1/5

INFORME DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

CLASIFICACIÓN OBJETO DE LA SOLICITUD

C12N5/073 (2010.01) A61K31/565 (2006.01) A61P15/08 (2006.01)

Documentación mínima buscada (sistema de clasificación seguido de los símbolos de clasificación)

A61P

Bases de datos electrónicas consultadas durante la búsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, términos de búsqueda utilizados)

EPODOC, WPI, TXTUS0, TXTUS1, TXTUS2, TXTUS3, TXTUS4, TXTUS5, TXTEP1, TXTGB1, TXTWO1, TXTAU1, TXTCA1, MEDLINE, BIOSIS, NPL, EMBASE, XPESP, XPESP2.

OPINIÓN ESCRITA

Fecha de Realización de la Opinión Escrita: 30.08.2013

Declaración

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986)

Reivindicaciones 1-7 Reivindicaciones 8 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986)

Reivindicaciones 5, 6 Reivindicaciones 1-4, 7, 8 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicación industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y técnico de la solicitud (Artículo 31.2 Ley 11/1986).

Base de la Opinión.-

La presente opinión se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

OPINIÓN ESCRITA

1. Documentos considerados.-

A continuación se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la técnica tomados en consideración para la realización de esta opinión.

Documento

Número Publicación o Identificación Fecha Publicación

D01

PARIA B C, et al. Coordination of differential effects of primary estrogen and catecholestrogen on two distinct targets mediates embryo implantation in the mouse. Endocrinology Dic 1998 VOL: 139 No: 12. Págs: 5235-5246. ISSN 0013-7227 (Impreso). Diciembre 1998

D02

PAKRASI P L, et al. Catechol estrogens stimulate synthesis of prostaglandins in the preimplantation rabbit blastocyst and endometrium. Biology of reproduction Sep 1983 VOL: 29 No: 2. Págs: 347-354. ISSN 0006-3363 (Impreso). Septiembre 1983

D03

HOVERSLAND R C, et al. Catechol estradiol induced implantation in the mouse. Life sciences. 24 May 1982 VOL: 30 No: 21. Págs: 1801-1804. ISSN 0024-3205 (Impreso). Doi:10.1016/0024-3205(82)90316-2. 24.05.1982
2. Declaración motivada según los artículos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecución de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaración

La presente solicitud de patente describe y reivindica un método para aumentar el potencial implantatorio de embriones de mamíferos obtenidos por fecundación in vitro, que consiste en cultivar in vitro los embriones hasta la fase de mórula y transferirlos posteriormente a un medio de cultivo enriquecido en metabolitos activos del estradiol, concretamente 4hidroxiestradiol (4OHE2) o 2-hidroxiestradiol (2OHE2) -preferentemente en 4OHE2- a una concentración de entre 0,01 y 1 !gr/ml, concretamente de 1 !gr/ml. La solicitud reivindica también el medio de cultivo que comprende metabolitos activos del estradiol.

NOVEDAD

El documento D01, considerado el más cercano del estado de la técnica, describe la capacidad del 4OHE2 para activar blastocistos de ratón, y aumentar su capacidad de implantación. El documento incluye el cultivo de blastocistos aislados y de blastocistos obtenidos a partir de embriones de dos células en un medio de cultivo que contiene 4OHE2 como estimulador del potencial implantatorio. Por tanto, la información divulgada en D01 afecta la novedad de la reivindicación 8 de la presente solicitud, que no sería nueva según el artículo 6 de la Ley 11/1986, de Patentes.

Del mismo modo, el documento D02 afecta la novedad de la reivindicación 8 de la solicitud, según el artículo 6 de la Ley de Patentes, pues, como D01, describe un medio de cultivo de embriones que comprende metabolitos del estradiol (2OHE2 y 4OHE2) y que aumenta su capacidad de implantación.

ACTIVIDAD INVENTIVA

Estos mismos documentos D01 y D02 afectan también la actividad inventiva de las reivindicaciones 1 a 4 y 7 de la solicitud, según el artículo 8 de la ley de Patentes. En ambos se divulga la utilidad de los metabolitos activos del estradiol para favorecer la implantación de embriones de mamífero.

En el documento D01 se demuestra, mediante experimentos in vivo e in vitro, que la adición de 4OHE2 al cultivo de los blastocistos antes de ser implantados aumenta de forma sensible el éxito en la implantación de los mismos. Y este efecto de produce tanto en blastocitos asilados como en blastocistos obtenidos a partir de embriones en estadio de dos células. Además, el artículo demuestra que el 4OHE2 es producido en el útero a partir de estradiol, y que este efecto del 4OHE2 se realiza mediante la generación de prostaglandinas. A pesar de que en la solicitud los embriones se obtienen por fecundación in vitro, y que el 4OHE2 se añade al cultivo cuando el embrión está en estado de mórula (el estadio inmediatamente anterior al de blastocito), no hay datos en la memoria que induzcan a pensar que los metabolitos que favorecen la implantación de blastocitos aislados no vayan a hacerlo con embriones en estado de mórula procedentes de fecundación in vitro, por lo que se considera evidente para el experto en la materia aplicar el método descrito en el documento D01 a cualquier tipo de embriones. Por tanto, la información divulgada en D01 afecta la actividad inventiva de las reivindicaciones 1 a 4 y 7 de la solicitud según el artículo 8 de la Ley de Patentes.

OPINIÓN ESCRITA

Sin embargo, las concentraciones de 4OHE2 utilizadas en los cultivos in vitro del documento D01 son apreciablemente más altas que las empleadas en la solicitud. Dado que no resulta evidente que una disminución de 2 órdenes de magnitud en la concentración del compuesto tenga el mismo efecto activador de la implantación, se considera que las reivindicaciones 5 y 6 de la presente solicitud cumplen el requisito de actividad inventiva según el artículo 8 de la Ley de Patentes.

En el documento D02 también se demuestra que la adición de los metabolitos 2OHE2 y 4OHE2 a cultivos in vitro de blastocistos aumenta la liberación de prostaglandinas por parte de los mismos, lo que favorecerá la implantación de los embriones en el útero. Como ya se ha explicado antes para D01, sería obvio para el experto en la materia llegar al método reivindicado en la solicitud a partir de los datos divulgados en D02, por lo que las reivindicaciones 1 a 4 y 7 de la solicitud no tienen actividad inventiva según el artículo 8 de la Ley de Patentes, a la luz de la información divulgada en el documento D02.

Como en el caso del documento D01, también en D02 las concentraciones de 2OHE2 y 4OHE2 empleadas son mayores que las de la solicitud en más de un orden de magnitud. De hecho, la menor concentración de 4OHE2 utilizada en D02, que es más del doble de la reivindicada en la solicitud, no tiene efecto en la liberación de prostaglandinas. Por tanto, tampoco el documento D02 afecta la actividad inventiva de las reivindicaciones 5 y 6 de la solicitud según el artículo 8 de la Ley de Patentes.

Igualmente, el documento D03 describe la capacidad del 2OHE2 y al 4OHE2 para inducir implantación de embriones en ratón en experimentos in vivo. Puesto que resulta evidente trasladar los resultado in vivo a procesos in vitro, también el documento D03 afectará la actividad inventiva de las reivindicaciones 1 a 4, 7 y 8 de la presente solicitud, sin afectar las reivindicaciones 5 y 6, según el artículo 8 de la Ley de Patentes.