ES2428102T3 - Composición de leucocitos activados - Google Patents
Composición de leucocitos activados Download PDFInfo
- Publication number
- ES2428102T3 ES2428102T3 ES10723285T ES10723285T ES2428102T3 ES 2428102 T3 ES2428102 T3 ES 2428102T3 ES 10723285 T ES10723285 T ES 10723285T ES 10723285 T ES10723285 T ES 10723285T ES 2428102 T3 ES2428102 T3 ES 2428102T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- leukocytes
- cells
- composition
- bag
- wound
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 title claims abstract description 124
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 50
- 230000035939 shock Effects 0.000 claims abstract description 20
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 230000007704 transition Effects 0.000 claims abstract description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 claims description 70
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 claims description 69
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 66
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 50
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 50
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 31
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 29
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 17
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 claims description 15
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 14
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 12
- 208000004210 Pressure Ulcer Diseases 0.000 claims description 11
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 11
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 claims description 10
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 208000014674 injury Diseases 0.000 claims description 8
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 101001018097 Homo sapiens L-selectin Proteins 0.000 claims description 7
- 102100033467 L-selectin Human genes 0.000 claims description 7
- 206010011985 Decubitus ulcer Diseases 0.000 claims description 6
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 claims description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 5
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 5
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 claims description 5
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 claims description 5
- 230000008733 trauma Effects 0.000 claims description 5
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 claims description 4
- 210000003752 saphenous vein Anatomy 0.000 claims description 4
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 claims description 4
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 claims description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 3
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 claims description 3
- 206010002153 Anal fissure Diseases 0.000 claims description 2
- 208000016583 Anus disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000009531 Fissure in Ano Diseases 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 210000000581 natural killer T-cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000000250 revascularization Effects 0.000 claims description 2
- 210000001562 sternum Anatomy 0.000 claims description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 2
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims 2
- 208000000558 Varicose Ulcer Diseases 0.000 claims 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 claims 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 28
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 18
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 description 11
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 9
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 8
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 8
- 239000000306 component Substances 0.000 description 8
- 210000001772 blood platelet Anatomy 0.000 description 7
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 7
- 101001070790 Homo sapiens Platelet glycoprotein Ib alpha chain Proteins 0.000 description 6
- 102100034173 Platelet glycoprotein Ib alpha chain Human genes 0.000 description 6
- 206010054880 Vascular insufficiency Diseases 0.000 description 6
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 208000023577 vascular insufficiency disease Diseases 0.000 description 6
- 108010004729 Phycoerythrin Proteins 0.000 description 5
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 5
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 5
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 5
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 5
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 5
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 4
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 4
- 108010004469 allophycocyanin Proteins 0.000 description 4
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 4
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 4
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 4
- 238000003466 welding Methods 0.000 description 4
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 3
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 3
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 2
- -1 CaCl2 dihydrate Chemical class 0.000 description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 2
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 2
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 2
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 2
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 2
- 101150117538 Set2 gene Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 2
- 238000001804 debridement Methods 0.000 description 2
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 2
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 2
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 2
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000000207 lymphocyte subset Anatomy 0.000 description 2
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100035248 Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010001781 Apligraf Proteins 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 1
- 208000003322 Coinfection Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010056340 Diabetic ulcer Diseases 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 101150055229 FTA gene Proteins 0.000 description 1
- 108010080379 Fibrin Tissue Adhesive Proteins 0.000 description 1
- 101001022185 Homo sapiens Alpha-(1,3)-fucosyltransferase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000619542 Homo sapiens E3 ubiquitin-protein ligase parkin Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000622137 Homo sapiens P-selectin Proteins 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000007766 Kaposi sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 102100023472 P-selectin Human genes 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 101150055297 SET1 gene Proteins 0.000 description 1
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010040943 Skin Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 208000033809 Suppuration Diseases 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 206010053692 Wound complication Diseases 0.000 description 1
- 238000012084 abdominal surgery Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 230000000202 analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000036436 anti-hiv Effects 0.000 description 1
- 238000002617 apheresis Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 108010015046 cell aggregation factors Proteins 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 210000000038 chest Anatomy 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 208000029078 coronary artery disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 1
- 238000002635 electroconvulsive therapy Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000003090 exacerbative effect Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 210000004475 gamma-delta t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 239000000416 hydrocolloid Substances 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 229910001410 inorganic ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 239000012948 isocyanate Substances 0.000 description 1
- 230000001418 larval effect Effects 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005389 magnetism Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000000651 myofibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000005305 organ development Effects 0.000 description 1
- 230000000065 osmolyte Effects 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 102000045222 parkin Human genes 0.000 description 1
- 239000006072 paste Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 238000001126 phototherapy Methods 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000010118 platelet activation Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 description 1
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000035752 proliferative phase Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000007115 recruitment Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 102000035025 signaling receptors Human genes 0.000 description 1
- 108091005475 signaling receptors Proteins 0.000 description 1
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004332 silver Substances 0.000 description 1
- 231100000019 skin ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 239000000344 soap Substances 0.000 description 1
- 208000010110 spontaneous platelet aggregation Diseases 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 210000004304 subcutaneous tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003106 tissue adhesive Substances 0.000 description 1
- 229940075469 tissue adhesives Drugs 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 208000037918 transfusion-transmitted disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 1
- 230000008736 traumatic injury Effects 0.000 description 1
- 238000011277 treatment modality Methods 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 1
- 235000012431 wafers Nutrition 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/19—Platelets; Megacaryocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/18—Erythrocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
- A61L26/00—Chemical aspects of, or use of materials for, wound dressings or bandages in liquid, gel or powder form
- A61L26/0057—Ingredients of undetermined constitution or reaction products thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0642—Granulocytes, e.g. basopils, eosinophils, neutrophils, mast cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Surgery (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Obesity (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Materials Engineering (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Un método para fabricar una composición de leucocitos activados que comprende: a. incubar leucocitos humanos a (i) una temperatura de 12° C - 28° C durante un tiempo que varía de aproximadamente 90 minutosa más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 12 a 20 horas o (ii) una temperatura de 12° C - 37° C durante un tiempo que varía de 5-24 horas de manera que losleucocitos hacen la transición de un estado quiescente a un estado funcionalmente activo; b. someter a los leucocitos a un shock hipo osmótico; y c. añadir a los leucocitos de la etapa b, una solución de una sal fisiológicamente aceptable en unacantidad eficaz para restaurar la isotonicidad.
Description
Composición de leucocitos activados.
REFERENCIAS CRUZADAS PARA SOLICITUDES RELACIONADAS
La presente solicitud se relaciona con la solicitud de Nº de serie 61/209.298, presentada el 5 de Marzo de 2009, titulada Composición de leucocitos activados y la solicitud de Nº de serie 61/211.587, presentada el 1 de Abril de 2009, titulada Composición de leucocitos activados para insuficiencias vasculares.
El proceso de cicatrización de una herida envuelve la participación de las células blancas de la sangre, también conocidas como leucocitos. Los leucocitos incluyen linfocitos, granulocitos y monocitos. Tres tipos comunes de linfocitos son las células T, células B y células asesinas naturales. Las células B y las células T juegan un papel importante en el reconocimiento de antígenos en el cuerpo (Parkin, 2001). Las células asesinas naturales (NK) identifican a las células infectadas por medio de alteraciones en los niveles del complejo de histocompatibilidad mayor (MHC), y destruyen las células infectadas (Moretta, 2008). La participación de los linfocitos en el proceso de curación, se asocia en gran medida con su producción de citoquinas y factores de crecimiento (Keen, 2008). Se ha descrito una nueva clase de células gamma-delta-T en la piel (Jameson, 2002. Havran, 2005). Entre los diferentes tipos de granulocitos están los neutrófilos, basófilos y eosinófilos. Los monocitos se diferencian en macrófagos, que son responsables de la destrucción de restos de tejido o de las sustancias extrañas invasivas. Los macrófagos también producen moléculas que controlan la inflamación y la reparación (Riches, 1996).
El proceso de cicatrización de una herida se produce en tres fases superpuestas. (Li, 2007; Broughton, 2006; Tsirogianni, 2006; Singer, 1999; Martin, 1997). La primera fase es la fase inflamatoria. Se caracteriza por el reclutamiento de neutrófilos, seguidos por monocitos a la zona de la herida, donde matan y fagocitan las bacterias (Agaiby, 1999).
La segunda fase de cicatrización de una herida que se conoce como la fase proliferativa, implica la formación de nuevo tejido de granulación. Los fibroblastos proliferan y migran hacia el espacio de la herida y sintetizan colágeno y otros componentes de la matriz extracelular (Greiling, 1997). Al mismo tiempo, se produce la angiogénesis, que proporciona nutrientes y oxígeno al nuevo tejido de granulación metabólicamente activo (Tonnesen, 2000). Los queratinocitos de la epidermis intacta comienzan a migrar a través de la matriz provisional y comienzan a proliferar, abriendo el camino para el nuevo tejido epitelial (Kim, 1992).
La remodelación es la tercera y última fase de la cicatrización de una herida. Se caracteriza por la diferenciación de fibroblastos en miofibroblastos, que contraen y acercan los bordes de la herida entre si (Tomasek, 2002). La remodelación de las fibras de colágeno por degradación y re-síntesis permite que la herida gane fuerza debido a la re-orientación de las fibras de colágeno (un proceso estrechamente controlado por factores de crecimiento) (Werner, 2003).
El reto del tratamiento de las heridas se complica a menudo en los pacientes con múltiples patologías tales como la diabetes, enfermedad de la arteria coronaria e hipertensión. Estas enfermedades tienen el efecto común de exacerbar las complicaciones vasculares debido a diversas condiciones fisiológicas. Las complicaciones de las heridas pueden resultar en un aumento de la morbilidad y la mortalidad (Doshi, 2008).
Tratamientos convencionales para las heridas incluyen el desbridamiento quirúrgico, tratamientos con antibióticos, y diversos apósitos (Moran, 2008; Fonder, 2008). Las heridas resistentes al tratamiento convencional también se conocen como heridas refractarias. Estas heridas conducen a una disminución de la calidad de vida y pueden dar lugar a aumento de la morbilidad y la mortalidad. Por lo tanto, continúa existiendo la necesidad de composiciones y métodos eficaces para la cicatrización de las heridas.
Compendio de la invención
La presente invención se refiere a un método para preparar una composición de leucocitos activados que comprende:
a) incubar los leucocitos humanos (i) a una temperatura de 12° C - 28° C durante un tiempo que varía de aproximadamente 90 minutos a más de aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o de 12 a 20 horas o (ii) una temperatura de 12º C - 37º C durante un período de tiempo en el intervalo de 5-24 horas de modo que se produzca la transición de los leucocitos en estado quiescente a un estado funcionalmente activo;
b) someter los leucocitos a un choque hipo osmótico; y
c) añadir a los leucocitos de la etapa b) una solución de sal fisiológicamente aceptable en una cantidad efectiva para restaurar la isotonicidad.
Un aspecto de la presente invención se dirige a un método para hacer una composición de leucocitos activados (ALC) derivada de la sangre (es decir, obtenible u obtenida a partir de una muestra de sangre entera). El método incluye las etapas de someter los leucocitos, que se pueden obtener a partir de una muestra de sangre humana entera, a una primera incubación durante un período de tiempo y a una temperatura que permite que los leucocitos se activen, que en realizaciones preferidas, es de aproximadamente 8 a aproximadamente 20 horas, y a temperatura ambiente. Después de la incubación, se ponen en contacto los leucocitos con una solución acuosa fisiológicamente aceptable, tal como, agua destilada estéril, para iniciar el choque hipo osmótico, seguido de poner en contacto los leucocitos conmocionados con una solución de sal fisiológicamente aceptable para restablecer la isotonicidad. Esta composición de leucocitos activados (ALC) se puede utilizarse terapéuticamente. Sin embargo, en alguna realización, por separado y sustancialmente concurrente con la primera incubación de los leucocitos, una muestra de plasma, que se puede obtener de la misma o diferente muestra de sangre entera (es decir, del mismo o de un ser humano diferente), se pone en contacto con un agente coagulante a aproximadamente 37° C concurrente con la incubación de los leucocitos, que en realizaciones preferidas, es de aproximadamente 8 a aproximadamente 20 horas, seguido por la separación de suero de la muestra de plasma coagulada. Los leucocitos se re-suspenden en suero recogido de la muestra de plasma coagulada, formando así la ALC. Después de la primera incubación, los leucocitos pueden ser sometidos además a una segunda incubación durante aproximadamente de 60 a aproximadamente 120 minutos a aproximadamente 37° C.
Otro aspecto de la presente invención está dirigido a una ALC derivada de la sangre. La composición de leucocitos activados de la presente invención incluye, en términos de la población de leucocitos presentes en ella, de aproximadamente 40% a aproximadamente 90% de granulocitos, de aproximadamente 5% a aproximadamente 20% de monocitos y de aproximadamente 5% a aproximadamente 30% de linfocitos, basado en el número total de leucocitos en la ALC. Como se muestra en los ejemplos de trabajo, las ALCs de la invención también pueden caracterizarse y distinguirse de las composiciones conocidas en términos del rendimiento mínimo de leucocitos (en relación con la muestra de sangre entera), la viabilidad de los leucocitos, y los niveles mínimos de activación de granulocitos, por ejemplo, como se indica por CD11b. La ALC puede contener, además, niveles residuales de plaquetas (en cantidades de alrededor de 46,8 +/- 39,2 (103/μl) y células rojas de la sangre (en la cantidad de aproximadamente 0,1 +/- 0,06 (106/1l) de la ALC. La población de linfocitos puede incluir de aproximadamente 7% a aproximadamente 25% de células B (CD19+) , de aproximadamente 20% a aproximadamente 30% de células NK (CD3- / CD56+), de aproximadamente 40% a aproximadamente 60% de células T (CD3+), de aproximadamente 0,1%, a aproximadamente 30% de células NKT CD3+ / CD56+, de aproximadamente 8% a aproximadamente 20% de células T auxiliares (CD4+ / CD3+), y de aproximadamente 20% a aproximadamente 30% de células CD8+ / CD3+. Las células pueden suspenderse en un vehículo tal como suero (que puede ser autólogo o alogénico con respecto al receptor) o algún otro líquido fisiológicamente aceptable iso-normal, adecuado para el almacenamiento y la administración de células, tales como la solución utilizada para restablecer la isotonicidad.
La presente invención puede usarse para la promoción de la cicatrización de heridas por medio de la administración
o la aplicación de la ALC a una herida.
La invención descrita logra varios resultados inesperados en comparación con al menos una composición de cicatrización de heridas conocida que contiene células blancas de la sangre. Como se demuestra en los ejemplos de trabajo en este documento, estos resultados incluyen el aumento del rendimiento y la viabilidad de los leucocitos (glóbulos blancos) y mayor porcentaje de granulocitos activados. La invención descrita también se cree que incluye un porcentaje inesperadamente más alto de monocitos activados y un porcentaje relativamente más alto de células T CD4 en comparación con las células T CD8.
Breve descripción de los dibujos
La figura 1 representa esquemáticamente una primera parte de un dispositivo representativo para producir las composiciones de ALC de la presente invención, que incluye bolsas A-C (set - 1), que son bolsas o contenedores de almacenamiento de sangre, en donde la bolsa A contiene glóbulos rojos empaquetados obtenidos a partir de un donante; la bolsa B contiene plasma, y la bolsa C contiene los leucocitos (que después de la separación inicial de la sangre entera forman una capa que comúnmente se conoce como la capa leucocitaria).
La figura 2 representa esquemáticamente una segunda parte del dispositivo representativo para la producción de composiciones de ALC de la presente invención, que incluye un set de 7 bolsas después de que la bolsa A con los glóbulos rojos RBC se retira del sistema y las bolsas B y C de la figura 1 se sueldan a las bolsas 1-5 (set - 2).
Las figuras. 3A y 3B son gráficos que ilustran las tendencias generales de la expresión tanto de CD62L como de CD42b, que son indicadores de la activación de las células.
Descripción detallada
La sangre se define en este documento como la sangre entera o cualquiera de sus partes constituyentes (por ejemplo, plasma, leucocitos, plaquetas o glóbulos rojos). Las cantidades de plaquetas y glóbulos rojos que pueden estar presentes en la ALC de la presente invención pueden ser más bajas que en la sangre entera.
El término "aproximadamente" tal como se utiliza en este documento en conexión con cualquier y todos los valores (incluidos los extremos inferior y superior de los intervalos numéricos) se refiere a cualquier valor que tenga un intervalo aceptable de desviación de +/- 0,5% a +/- 20% (y valores entre los mismos , por ejemplo, ± 1%, ± 1,5%, ± 2%, ± 2,5%, ± 3%, ± 3,5%, ± 4%, ± 4,5%, ± 5%, ± 5,5%, ± 6%, ± 6,5%, ± 7%, ± 7,5%, ± 8%, ± 8,5%, ± 9%, ± 9,5%, ± 10%, ± 10,5%, ± 11%, ± 11,5%, ± 12%, ± 12,5%, ± 13% ± 13,5%, ± 14%, ± 14,5%, ± 15%, ± 15,5%, ± 16%, ± 16,5%, ± 17%, ± 17,5%, ± 18%, ± 18,5%, ± 19%, ± 19,5%, y ± 20%).
Los materiales de partida para producir las ALCs de la invención se pueden obtener de varias fuentes. Sangre entera o uno o más componentes de la misma (por ejemplo, leucocitos y plasma) se pueden obtener a partir de fuentes autólogas o alogénicas. En una realización de la presente invención, la muestra de sangre se recoge del paciente que va a ser tratado en última instancia con la ALC, lo que se denomina en este documento como una muestra de sangre autóloga o una fuente autóloga. En realizaciones en las que la(s) fuente(s), es decir, la sangre o sus componentes, se obtiene a partir de un individuo que no es el destinatario previsto de la ALC, lo que se conoce como una muestra o fuente de sangre alogénica, estos materiales de partida pueden obtenerse convenientemente a partir de un banco de sangre. Las muestras pueden ser examinadas en el banco de sangre para el grupo sanguíneo (ABO, Rh), anticuerpos irregulares a los antígenos de glóbulos rojos, y enfermedades transmisibles por transfusión. Más específicamente, el examen puede llevarse a cabo con anticuerpos utilizando un instrumento Abbott Prism frente a: la hepatitis B, C, VIH 1/2, HTLV y sífilis (-VHC; HBsAg, anti-VIH ½ O+; y anti-HTLV I / II). Las muestras también pueden ser examinadas para VIH, VHC y VHB, mediante métodos moleculares (análisis de ácido nucleico -NAT). El examen molecular se puede realizar usando instrumentación comercialmente disponible, por ejemplo, el sistema TIGRIS de Chiron.
En estas realizaciones que implican fuentes alogénicas, las muestras pueden ser obtenidas de donantes con el mismo tipo de sangre que el destinatario pretendido de la ALC. Alternativamente y como se describe adicionalmente en este documento, las muestras de plasma se pueden obtener de donantes de sangre AB+ y los leucocitos se pueden obtener de pacientes de sangre O-. Los pacientes con sangre AB+ son donantes universales de plasma y los pacientes con sangre O- son donantes universales para los leucocitos. Independientemente de la fuente, todo el procesamiento necesario de la(s) muestra(s) se puede llevar a cabo sin la necesidad de equipo altamente especializado.
Un método preferido de fabricación de la composición de ALC de la presente invención se describe ahora con referencia a las figuras 1 y 2, que ilustran un sistema que contiene dos sets de bolsas de infusión estériles interconectados. El sistema se sella para que no haya exposición al ambiente exterior. Específicamente, los tubos que conectan los dos sets se sueldan entre sí para formar un sistema único utilizando un dispositivo de conexión estéril (por ejemplo, TSCD®-II número de catálogo ME-203AH de Terumo). Más concretamente, para garantizar el cumplimiento de las normas de esterilidad, la soldadura y el corte de los tubos se realiza mediante precalentamiento de obleas especiales, a alrededor de 300° C. Esta alta temperatura aumenta la esterilidad del procedimiento de soldadura. Para garantizar aún más la esterilidad, la soldadura puede llevarse a cabo en una vitrina de seguridad biológica clase 100 dentro de un área de contención de clase 100.000.
Como se ilustra en estas figuras, el sistema contiene dos sets de bolsas estériles. El set 1, que contiene bolsas A, B, y C, es un ensamblaje de triple bolsa estándar, disponible en el mercado de uso común para la transfusión de sangre. Una muestra de sangre humana, por lo general en un volumen de aproximadamente 400 a aproximadamente 550 ml, se recoge en un banco de sangre a través de vía venosa y se coloca en una bolsa A, y después se fracciona en sus partes componentes utilizando técnicas estándar en las bolsas A, B y C. Como ejemplo, la bolsa A que contiene la muestra de sangre se centrifuga. Después de la centrifugación, los componentes de la sangre se separan, por ejemplo, usando un extractor de componentes de sangre fabricado por Baxter. La capa leucocitaria que contiene los leucocitos se coloca en la bolsa C, el plasma se coloca en la bolsa B y los eritrocitos permanecen en la bolsa A. Por lo tanto, como resultado de este proceso, la bolsa de A contiene eritrocitos empaquetados; la bolsa B contiene el plasma, y la bolsa C contiene la capa leucocitaria que contiene los leucocitos (y posiblemente el plasma y los eritrocitos residuales). Alternativamente, los componentes de la sangre pueden ser separados de la sangre entera a través de técnicas de aféresis conocidas en la técnica.
A continuación la bolsa A se desconecta de la serie de tres bolsas. Como se ilustra en la figura 2, las bolsas B y C se sueldan entonces a las bolsas de infusión por encargo 1-5 (set-2) para formar el sistema usado para hacer la composición de leucocitos activados. Como se describió anteriormente, la soldadura se lleva a cabo con un dispositivo estéril de conexión. La bolsa 1 contiene una primera solución acuosa (por ejemplo 200 ml de agua destilada estéril) que se usa para el propósito de exponer las células en la capa leucocitaria al shock hipo osmótico. Esto sirve para lisar los eritrocitos residuales que puedan estar presentes. La bolsa 2 contiene una segunda solución (por ejemplo, 20 ml de solución de cloruro sódico tamponado (8,91% de ClNa, USP), o cualquier otra solución fisiológicamente aceptable que contenga iones inorgánicos, osmolitos orgánicos tales como la sacarosa, o una combinación de los mismos, tal como la solución de Ringers (Hartmans) lacteada, que sirve para restaurar los leucocitos a la isotonicidad tras el choque hipo osmótico. Cuando se añade la solución de cloruro de sodio a 200 ml de agua destilada, se convierte en una solución de ClNa al 0,9%. La bolsa 3 contiene una tercera solución (por ejemplo alrededor de 60 ml de solución de cloruro cálcico tamponado (1,17% CaCl2 dihidrato, USP), que actúa para coagular el plasma en la bolsa B, y para facilitar la separación de las plaquetas y el suero. La bolsa 4 y la bolsa 5 cada una contienen aire filtrado estéril, aproximadamente 60 ml y aproximadamente 500 ml, respectivamente. El set se empaqueta como una unidad única y se esteriliza usando vapor a alta presión, que reduce grandemente el riesgo de infección secundaria en el paciente.
Los leucocitos se transfieren entonces de la bolsa C a la bolsa 4 (o a la bolsa 5) y se incuban preferiblemente en una posición vertical, para permitir que se activen. Para los propósitos de la presente invención, la activación de las células se define como un proceso por medio del cual se permite que las células (leucocitos) lleguen a ser activados y más específicamente, como una transición de un estado quiescente a un estado funcionalmente activo que es acompañada por la síntesis de sustancias biológicamente activas o por la traslocación de sustancias presintetizadas del citoplasma a la membrana celular o por su liberación fuera de las células. Estas sustancias pueden incluir proteínas o polipéptidos, lípidos, azúcares, radicales de oxígeno y otros restos bioquímicos que funcionan como moléculas de adhesión, citoquinas, factores de crecimiento, enzimas, factores de trascripción y receptores de señalización celular y mediadores celulares. Cuando se detectan e identifican en el interior de la célula o en la superficie celular, estas moléculas son llamadas marcadores de activación.
En algunas realizaciones, los leucocitos se incuban simplemente dejándoles reposar a temperatura ambiente. Para los propósitos de la presente invención, la temperatura ambiente se refiere a una temperatura en el intervalo de aproximadamente 12° C a aproximadamente 28° C, y en algunas realizaciones desde aproximadamente 16° C a aproximadamente 25° C. El período de tiempo de incubación, puede variar dependiendo de la temperatura. Los tiempos de incubación serán más cortos a mayor temperatura. El tiempo de incubación necesario para activar los leucocitos será más o menos inversamente proporcional a la temperatura a la que se lleva a cabo la incubación. Por ejemplo, en realizaciones en las que se permite que los leucocitos estén en reposo a la temperatura ambiente, el tiempo de incubación oscila generalmente entre aproximadamente 90 minutos, y hasta 2, 3, 4, 5, 6, 7 o de 8, a aproximadamente 20 horas. En realizaciones preferidas, el tiempo de incubación oscila entre aproximadamente 8 a aproximadamente 20 horas. En una realización más preferida, la incubación de los leucocitos se produce de aproximadamente 18° C a aproximadamente 24° C durante aproximadamente de 8 horas a aproximadamente 12 horas. En otras realizaciones, la incubación de los leucocitos supone la exposición al calor, por ejemplo, a una temperatura por encima de la temperatura ambiente y de hasta aproximadamente 37° C. El período de tiempo para la incubación a temperaturas elevadas por lo general oscila entre 5 horas a alrededor de 24 horas.
Con relación de nuevo a la figura 2, los leucocitos de la bolsa C se trasfieren a la bolsa 4 que es corrientemente más pequeña que la bolsa C (por ejemplo aproximadamente 250 ml a aproximadamente 500 ml). Además las células pueden transferirse dentro de otra bolsa de 500 ml (bolsa 5). Para permitir la activación de los leucocitos, la bolsa 4 (o la bolsa 5) se coloca en una posición vertical y se incuba, durante aproximadamente de 8 a aproximadamente 20 horas a temperatura ambiente.
Después de la incubación, los leucocitos se someten a un choque hipo osmótico que lisa los eritrocitos. En realizaciones preferidas, el choque hipo osmótico se realiza inmediatamente (es decir, tras la finalización de la etapa anterior sin ningún paso intermedio o demora innecesaria, típicamente en menos de 2 minutos). El choque hipo osmótico puede ser iniciado mediante la transferencia del agua destilada de la bolsa 1 a la bolsa 4 (o bolsa 5) que contiene los leucocitos. El tratamiento de choque hipo osmótico se lleva a cabo normalmente durante aproximadamente 45 segundos. Después de esta etapa, y preferiblemente inmediatamente después, se restablece la isotonicidad de los leucocitos mediante la transferencia de la solución de cloruro de sodio de la bolsa 2 a la bolsa 4 (o la bolsa 5). La relación del volumen de solución de cloruro sódico a la suspensión de las células en el agua es generalmente de aproximadamente 1:10. El contenido de la bolsa 4 se transfiere entonces a la bolsa 1 (o se deja en la bolsa 5), que es mayor en volumen que la bolsa 4.Como se describió anteriormente, esta composición puede usarse terapéuticamente en los métodos de la invención.
La realización preferida envuelve al menos una etapa adicional. Por lo tanto, en una etapa separada, que puede llevarse a cabo simultáneamente con la incubación de los leucocitos, el plasma se separa en las plaquetas y en el suero mediante el uso de un coagulante tal como CaCl2, seguido de centrifugación. Por lo tanto, en esta realización representativa, CaCl2 de la bolsa 3 se transfiere a la bolsa B. A la bolsa B, que ahora contiene una composición de plasma y CaCl2, típicamente se le permite coagular a una temperatura de aproximadamente 37° C. El plasma permanece en contacto con el agente coagulante durante sustancialmente el mismo período de tiempo que se incuban los leucocitos.
Después del shock hipo osmótico y de la restauración de la isotonicidad de los leucocitos, y subsiguiente transferencia del contenido de la bolsa 4 a la bolsa 1 (o de permanecer en la bolsa 5), y después de la coagulación del plasma en la bolsa B, todo el dispositivo de las 7 bolsas se centrifuga. En realizaciones preferidas, la centrifugación se realiza inmediatamente después de la transferencia de los leucocitos a la bolsa 1 (o de permanecer en la bolsa 5), a fin de no exponer a las células al hemolizado. Después de la centrifugación, el sobrenadante de la bolsa 1 (o la bolsa 5) se transfiere a la bolsa C, y el sedimento de leucocitos formado en la bolsa 1 (o la bolsa 5) como resultado de la centrifugación se vuelve a suspender en el suero en aproximadamente 20 ml a aproximadamente 50 ml de suero de la bolsa B.
En todavía otra etapa de la realización preferida de la presente invención, los leucocitos activados pueden incubarse en el plasma coagulado mencionado anteriormente antes de que se haga la composición final. En general, este segundo período de incubación se lleva a cabo durante aproximadamente 1-2 horas a 37° C.
En otras realizaciones, la composición de ALC se puede preparar a partir de volúmenes más pequeños de muestras de sangre, con disminuciones proporcionales en los volúmenes de todas las soluciones y el uso de bolsas más pequeñas. Además, el uso de estas bolsas de tamaño diferente proporciona ALCs con diferentes composiciones. Incluso en estas realizaciones, se pueden usar como materiales de partida muestras de sangre alogénica o autóloga. El uso de volúmenes más pequeños proporciona al médico la capacidad de realizar la recogida de sangre de forma autónoma, sin necesidad de utilizar un banco de sangre externo, tal como en situaciones de emergencia en el tratamiento de pacientes con sistemas inmunitarios saludables pero que sufren de algún tipo de herida traumática (por ejemplo, campo de batalla y condiciones de combate). En estas realizaciones, puede prescindirse de las pruebas de enfermedades transmisibles y antígenos. Sin embargo, en tales casos, los pacientes con heridas refractarias no son donantes de sangre clínicamente aceptables para la preparación eficaz de la ALC. Cuando surge esta situación, se produce la ALC a partir de donantes alogénicos por los medios descritos en este documento.
Las ALCs de la presente invención incluyen leucocitos, por ejemplo, granulocitos, monocitos y linfocitos. Los granulocitos incluyen neutrófilos, eosinófilos y basófilos. En su sentido más amplio, la población de leucocitos de la ALC generalmente contiene de aproximadamente 40% a aproximadamente 90% de granulocitos, de aproximadamente 5% a aproximadamente 20% de monocitos y de aproximadamente 5% a aproximadamente 30% de linfocitos. Cantidades específicas de las células pueden diferir en función de las técnicas de análisis empleadas. Cuando el análisis se realiza usando FACS (es decir, usando un análisis gráfico de puntos de dispersión lateral frente a un análisis gráfico de puntos de dispersión frontal), la composición de leucocitos generalmente contiene de aproximadamente 55% a aproximadamente 80% de granulocitos; de aproximadamente 5% a aproximadamente 15% de monocitos y de aproximadamente 5% a aproximadamente 30% de linfocitos, y en algunas realizaciones, comprende aproximadamente 58-76% de granulocitos; aproximadamente 5-11% de monocitos y aproximadamente 9-23% de linfocitos. Cuando el análisis se realiza usando un Analizador Cell Dyn, la composición de leucocitos generalmente contiene de aproximadamente 50% a aproximadamente 90% de granulocitos; de aproximadamente 5% a aproximadamente 15% de monocitos, y de aproximadamente 10% a aproximadamente 25% de linfocitos. La subpoblación de linfocitos de la ALC puede confirmar las siguientes células en los intervalos generales de la siguiente manera: de aproximadamente 7% a aproximadamente 25% de células B (CD19+); de aproximadamente 20% a aproximadamente 30% de células NK (CD3- / CD56+), de aproximadamente 40% a aproximadamente 60% de células T (CD3+); de aproximadamente 0,1% a aproximadamente 30% de células NKT CD3+ / CD56+, de aproximadamente 8% a aproximadamente 20% de células T auxiliares (CD4+ / CD3+), y de aproximadamente 20% a aproximadamente 30% de células CD8+ / CD3+. En realizaciones preferidas, la subpoblación de linfocitos se enriquece con al menos 9% de células CD56+ (CD3- / CD56+; CD3+ / CD56+; CD3+ / CD56+ / CD8+), la cantidad de los linfocitos T auxiliares (CD4+ / CD3+) se reduce a menos de 20%, y/o la relación de células T auxiliares a células T supresoras (CD4+ / CD3+ : CD8+ / CD3+) es menos de 0,8.
Los pacientes que sufren de heridas pueden estar fisiológicamente comprometidos o por otro lado sanos. Por ejemplo, debido a sistemas metabólicos ya con discapacidad, los diabéticos y otros pacientes médicamente comprometidos son candidatos para ALCs derivadas de sangre heteróloga, ya que sus propios leucocitos pueden no ser óptimos para el procedimiento. Sin embargo, los pacientes por lo demás sanos, como en el ejemplo de pacientes con trauma, son también buenos candidatos para las composiciones de ALC de la presente invención.
La presente invención es útil en la promoción de la curación de una multitud de tipos de heridas. Aunque en la práctica se puede utilizar en combinación con otras modalidades de tratamiento, no requiere de ellos para lograr la curación eficaz de la herida. Los inventores han contemplado la aplicación de ALC a cualquier tipo de herida y prevén que no haya limitaciones en cuanto al tipo de herida que puede ser tratada. La facilidad de aplicación, por ejemplo, con una jeringa estándar o un dispositivo de aplicación similar, hace a las composiciones ALC de la invención seguras y fáciles de usar.
Las heridas susceptibles de tratamiento con la invención están típicamente en forma de pinchazos, cortes o desgarros de los tejidos vivos. Las heridas de la piel pueden penetrar la epidermis, dermis o en el caso de heridas de espesor total, el tejido subcutáneo. Por lo tanto, los tipos representativos de heridas susceptibles de tratamiento con las composiciones y métodos de la presente invención incluyen úlceras por decúbito o presión; úlceras diabéticas, heridas del esternón profundas, por ejemplo, después de la cirugía a corazón abierto (para la gran vena safena después de la revascularización coronaria y la cosecha de la gran vena safena), y heridas post-operatorias posteriores a la cirugía abdominal, y cualquier otro tipo de cirugía. Otras heridas son las que se originan por un trauma tal como por disparos de armas, cuchillos o cualquier otro objeto que pueda causar un corte o desgarro en la piel. Las heridas de la cavidad oral (por ejemplo, dientes), así como heridas que surgen como un efecto secundario de la medicación o como un síntoma de diversas patologías (por ejemplo, úlceras asociadas con el sarcoma de Kaposi), así como las heridas internas (por ejemplo, fisuras anales, y las heridas o lesiones en el tracto gastrointestinal, tales como úlceras en el estómago o los intestinos) también pueden ser susceptibles al tratamiento con la presente invención.
La ALC también puede ser utilizada para tratar cualquier herida exacerbada por insuficiencia vascular. La insuficiencia vascular, para los propósitos de la presente invención, se refiere a la circulación sanguínea inadecuada que da como resultado una perfusión insuficiente de las zonas afectadas. Tal insuficiencia puede ser causada por un traumatismo (por ejemplo, daño a la vasculatura adyacente a una fractura del esqueleto), o diversas patologías (por ejemplo, la diabetes y la aterosclerosis). En cualquier caso, sea inducida por el trauma o la enfermedad, la insuficiencia vascular disminuye la probabilidad de curación eficaz de la herida. La ALC puede ser útil en la mejora de los resultados de la cicatrización de heridas en estos pacientes y debe ser administrada según los métodos descritos en este documento. Además, los algoritmos de tratamiento no deben estar limitados por la gravedad o el tipo de herida, o la extensión de la insuficiencia vascular. La ALC puede ser más eficaz en pacientes que se presentan con las heridas más graves y la insuficiencia vascular.
En general, la aplicación de la composición de leucocitos activados se lleva a cabo por medio de una o más inyecciones de la ALC directamente en la herida o el tejido que rodea la herida. La ALC puede aplicarse directamente en una herida abierta.
Para la inyección dentro de la herida, se prefiere utilizar una jeringa Luer-Lock o cualquier otra jeringa disponible comercialmente que tenga un mecanismo de bloqueo entre la jeringa y la aguja. El espacio biológico de una herida, particularmente una herida de presión, es a menudo limitado. Cuando se inyecta en una herida, existe un riesgo de que la presión haga que la jeringa se separe de la aguja. El uso de una jeringa de bloqueo elimina este riesgo.
Cuando la inyección en el tejido de la herida no es posible, la ALC se puede aplicar directamente en la cavidad de la herida. La aplicación en este método se puede hacer utilizando la aplicación directa con una jeringa o tubo.
La ALC se puede aplicar alrededor del lugar de la herida con la ayuda de un apósito. Los apósitos secos incluyen gasas y vendas, mallas no adhesivas, membranas y láminas, espumas y adhesivos tisulares. Los apósitos de barrera que mantienen la humedad incluyen pastas, cremas y ungüentos, membranas o láminas no permeables o semipermeables, hidrocoloides, hidrogeles y productos de combinación. Los apósitos bioactivos incluyen apósitos antimicrobianos, apósitos interactivos, apósitos biológicos de un solo componente y productos de combinación. En algunas realizaciones, la herida se empaqueta con gasa estéril empapada en la ALC. El apósito, por ejemplo, tal como una almohadillas de gasa estéril, puede ser saturado con composiciones tales como la solución de Ringer (Hartman) lacteada, un apósito que contiene alginato, apósito de poliuretano o apósito de carboximetilcelulosa, que se aplica para cubrir la herida, seguido de la aplicación de un apósito seco. Si la herida del sujeto está muy infectada, se pueden aplicar apósitos de plata tales como Silverlon. La elección de apósito después de la inyección se basa en la determinación del médico. La disponibilidad comercial, historia de éxito clínico pasado, y la tolerancia del paciente son todos factores a ser considerados en la selección de un apósito para las heridas. El apósito puede ser retirado periódicamente, por ejemplo, típicamente después de aproximadamente 24 horas, con el fin de irrigar la herida, por ejemplo, con agua estéril y jabón.
En otra realización, la composición de ALC puede colocarse en una matriz o ensamblaje fisiológicamente inerte y/o reabsorbible (por ejemplo, colágeno) e insertarse por medio de un ajuste a presión, en la herida. Esto permite un suministro sostenido de la ALC en el sitio, lo que beneficia al paciente porque las células permanecen un período más largo in situ.
Las composiciones de ALC pueden aplicarse a la herida una vez o más de una vez, por ejemplo, después de 4 semanas, una vez que el médico determina si otra aplicación es necesaria. Los factores que pueden ser tenidos en cuenta incluyen el aumento de dimensiones de la herida (ancho, largo y profundidad), supuración, fiebre o cualquier otro signo o síntoma que indique una infección recalcitrante de tal manera que el re-tratamiento se justifique. Además de repetir el tratamiento, la remisión para el desbridamiento quirúrgico puede estar indicada en cualquier momento el médico considere adecuado.
La ALC se puede utilizar en combinación con cualquier otro tratamiento de heridas convencional, tal como el calentamiento (calor terapéutico), estimulación eléctrica, magnetismo, fototerapia láser, terapia de vibración cicloidal y ultrasonido. También se puede utilizar con terapia biológica, tal como la terapia de larva, sustitutos de la piel, queratinocitos cultivados (Epicel, Genzyme Biosurgery), el reemplazo dérmico humano (Dermagraft, Smith and Nephew, Inc.), dermis procesada derivada de cadáveres (Allodeim, Life Cell Corporation), equivalente a dos capas de piel (Apligraf, Organogenesis Inc.), Transcyte (Smith and Nephew, Inc.), factores de crecimiento (PDGF es actualmente el único factor de crecimiento con licencia para uso tópico), y sellador de fibrina. En algunas realizaciones, la ALC se utiliza en conjunción con VAC, que es una terapia de heridas comercialmente disponible fabricada por KCl. VAC promueve la cicatrización de la herida mediante la aplicación de presión negativa a una herida. En estas realizaciones, ALC se aplica preferiblemente a una herida antes de la terapia de VAC. En aún otras realizaciones, ALC se utiliza en conjunción con la terapia hiperbárica (Thackham, 2008). Por ejemplo, ALC se puede aplicar a una herida justo antes de que un paciente reciba la terapia hiperbárica. ALC también se puede usar en conjunción con terapia de ondas de choque de baja energía (o sea, impulsos de aproximadamente 0,1 mJ/mm2; 5 Hz por centímetro de longitud de la herida). Véase, por ejemplo, Dumfarth, et al., Ann. Thorac. Surg. 86:1909-13 (2008).
Después del tratamiento, las heridas pueden ser evaluadas en cuanto a sus medidas de longitud, anchura y altura. Típicamente, una herida se considera curada cuando todas las mediciones de estos parámetros son insignificantes. La ALC también puede proporcionar un efecto analgésico.
La composición de leucocitos activados es particularmente útil en las heridas que incluyen las úlceras diabéticas delpie y úlceras de decúbito. Úlceras de decúbito son las úlceras por presión causadas por la obstaculización del flujo
de la sangre, por lo general debido a la presión prolongada sobre un área en particular. (Berlowitz, 2007). Las úlceras de decúbito causan morbilidad y mortalidad en las personas de edad avanzada. Al menos el 48% de las úlceras por presión de estadio IV permanecen sin cicatrizar después de un año de tratamiento. (Girouard, 2008). Los pacientes que sufren de úlceras de decúbito también suelen tener patologías concomitantes como la diabetes y la hipertensión. Estas patologías complican aún más el éxito del tratamiento de úlceras de decúbito.
Para el tratamiento de las úlceras de decúbito, la composición se aspira en una jeringa estéril de cualquier tamaño, usando una aguja de calibre 18 (18G). La aspiración se realiza lentamente para minimizar el daño a las células. Mientras que el tamaño de la jeringa y la aguja no son en ningún sentido limitativos, se prefiere una aguja de gran calibre para la aspiración. Esto facilita la transferencia y reduce el daño celular.
La aplicación de la composición de leucocitos activados a la úlcera comprende inyectar la composición en la herida. Toda la muestra de la jeringa puede ser desplegada y el médico puede optar por aplicar ALC adicional si se determina que es necesario en función de los parámetros clínicos.
La aguja de 18G utilizada para la aspiración se intercambia con una aguja que oscila en tamaño de 22 a 35 G. ALC se puede inyectar en la herida en varios lugares. La inyección puede producirse de aproximadamente cada centímetro a aproximadamente cada tres centímetros para toda la longitud de la herida. En cada sitio de la inyección, se inyecta 0,1- 0,3 ml de ALC.
La totalidad de la jeringa puede ser inyectada de una sola vez en un solo sitio dentro de la herida.
Se describirán ahora aspecto(s) de la presente invención de acuerdo con los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplo 1- Análisis de la activación celular
Una composición de leucocitos activados hecha según la realización preferida de la presente invención se cuantificó mediante el análisis de diversos marcadores de superficie celular. Un aumento en la agregación de las plaquetas con cualquiera de los monocitos o granulocitos es un signo de la activación de los monocitos y granulocitos a través de la expresión de la selectina P. CD62L es una proteína de membrana de plasma que se desprende durante la activación y por lo tanto disminuye con la activación de las células. CD42b es un marcador de activación de las plaquetas relacionado con el proceso de la coagulación como un factor de agregación. Interacciona con la matriz extra-celular, así como con las moléculas de adhesión y también se utiliza en la presente invención como un indicador de la activación de los monocitos y granulocitos.
Se tomaron muestras de las células en tres puntos de tiempo: capa leucocitaria fresca (Fr. BC); capa leucocitaria incubada (IBC)), y composición de leucocitos activados final (FP) (Tabla 1).
Tabla 1: Marcadores de superficie celular que indican la activación de leucocitos
- % de células CD62L positivas
- Fr. BC
- IBC FP
- Monocitos
- 68 55 44
- Granulocitos
- 97 47 39
- % de células CD42b positivas
- Monocitos
- 26 74 92
- Granulocitos
- 3 15 39
Fr. BC se tomó inmediatamente después de la preparación de la capa leucocitaria. IBC se tomó después del primer periodo de incubación y FP se tomó del producto final. En cada punto de tiempo, se marcaron las células con anticuerpos monoclonales específicos (anticuerpos anti-CD14 conjugados con aloficocianina (APC), anticuerpos anti–CD42b conjugados con ficoeritrina (PE), y anticuerpos anti–CD62L conjugados con fluoresceínaisotiocianato (FITC), y después se analizaron por FACS.
Las células de cada punto de tiempo se lavaron con solución de tinción de FACS (PBS, 2% de suero de ratón normal; 0,02% de azida de sodio), con alícuotas y tinción según el protocolo de tinción. Brevemente, 0,5 × (106 /μl) células se incubaron con anticuerpos monoclonales apropiados durante 30 minutos a temperatura ambiente (RT)
o a +4º C en la oscuridad. Después de la incubación, la composición celular se trató con tampón de lisis de eritrocitos, se lavó, y finalmente se re-suspendió en PBS para la adquisición por FACS. Para la tinción positiva (+) CD62L, la composición celular se incubó con anticuerpos anti CD14 (APC) humanos y anticuerpos anti CD62L
(FITC) humanos a 4° C. Para la tinción de CD42b + la composición de células se incubó con anti-CD14 (APC) humanos y anti-CD42b (PE) humanos a temperatura ambiente (RT). La composición celular de control negativo se incubó con anti-CD14 humanos y los controles de isotipos adecuados en condiciones relevantes. La dispersión de la luz y fluorescencia asociada con las células se midió con un FACSCalibur (Becton Dickinson). Los monocitos se determinaron como células positivas CD14 y los granulocitos se identificaron por sus propiedades de dispersión de luz características. Las células positivas CD62L o CD42b se definieron como el porcentaje de monocitos y granulocitos con fluorescencia mayor de un umbral, como se determinó por monocitos y granulocitos incubados con anticuerpos de control de isotipo.
Como se muestra en las figuras 3A y 3B y la Tabla 1, los resultados fueron consistentes con la expectativa de que la expresión de CD62L disminuiría a medida que progresaba la activación y la de CD42b aumentaría a medida que progresaba la activación. Estos datos demuestran que los leucocitos se activaron.
Ejemplo 2 - Análisis de una composición de leucocitos activados
Las Tablas 2 y 3 muestran las composiciones celulares de la ALC final tal como se determinó por análisis con un analizador Cell Dyn. Se analizaron las células después de que se volvieron a suspender los leucocitos activados en el suero. Las células viables se tiñeron utilizando exclusión de azul tripán y se observaron en el microscopio.
Tabla 2: Composición de la composición de leucocitos activados
- Plaquetas
- Eritrocitos Leucocitos
- (103/μl)
- (103/μl)
- (103/μl)
- Concentración en ALC final
- 46,8 0,1 6,8
- Desviación estándar
- 39,2 0,06 3,8
Tabla 3: Composición de leucocitos en ALC
- Leucocitos
- Granulocitos
- % de neutrófilos
- % de basófilos % de eosinófilos % de monocitos % de linfocitos
- % en ALC final
- 66,5 1,6 4,6 9,1 18,5
- Desviación estándar
- 8,2 0,3 3 2,1 4,1
- Intervalo
- 52-78 1-2 1-9 6-12 13-24
Los resultados del Cell Dyn, como se muestra en la Tabla 2, mostraron que ALC contenía plaquetas en la cantidad de 46,8 +/- 39,2 (103/μl), eritrocitos en la cantidad de 0,1 +/- 0,03 (106/μl), y leucocitos en la cantidad de 6,8 +/- 3,8 (103/μl). Basado en el análisis de Cell Dyn, se determinó también que la composición de leucocitos de ALC (como se muestra en la Tabla 3) contenía 52%-78% de neutrófilos, 1-2% de basófilos, 1-9% de eosinófilos, 6%-12% de monocitos, y 13%-24% de linfocitos, teniendo en cuenta la desviación estándar. Los intervalos representados en estas tablas representan los resultados altos y bajos después de 8 análisis separados usando el analizador Cell Dyn.
Ejemplo 3
Comparación entre el método de la invención y el proceso anterior de la técnica
Para poner de relieve las diversas ventajas inesperadas asociadas con la presente invención, se compararon realizaciones de la misma con el proceso descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 6.146.890, para Danon ("Danon").
Realizaciones de la invención
Haciendo referencia a las figuras 1 y 2, inmediatamente después de separar la sangre entera en sus componentes primarios, es decir, los glóbulos rojos de la sangre, plasma y capa leucocitaria, la capa leucocitaria se transfirió de la bolsa C a la bolsa 4 y se incubó durante 12 horas ± 2 horas a temperatura ambiente. Este paso fue seguido de la transferencia de agua destilada de la bolsa 1 a la bolsa 4 (o bolsa 5), para los propósitos de llevar a cabo un tratamiento de choque hipo osmótico (que resulta en la producción de un hemolizado). Este tratamiento se llevó a cabo durante aproximadamente 45 segundos. Inmediatamente después, la solución de cloruro de sodio tamponada contenida en la bolsa 2 se transfirió a la bolsa 4 (o bolsa 5) para el propósito de la restauración de la isotonicidad de la capa leucocitaria (leucocitos).
Al mismo tiempo que la incubación de la capa leucocitaria, arriba, se transfirió la solución de cloruro de calcio tamponada de la bolsa 3 a la bolsa B que contenía la porción de plasma, a efectos de permitir la coagulación del plasma. Esto se dejó que tuviera lugar durante el transcurso de 12 horas ± 2 horas, más el tiempo adicional corto durante el cual los leucocitos se sometieron al choque hipo osmótico y luego la restauración de la isotonicidad.
Inmediatamente después de la restauración de la isotonicidad, todo el conjunto de la bolsa se sometió a centrifugación (típicamente de aproximadamente 8 a aproximadamente 10 minutos), seguido de la separación de las células del hemolizado. De este modo, las células fueron expuestas a la influencia del hemolizado durante un período mínimo de tiempo, es decir, aproximadamente 10 minutos. Después de la centrifugación, el sobrenadante de hemolizado en la bolsa 1 (o la bolsa 5) se descartó, y se añadió medio fresco a la bolsa 1 (o bolsa 5), seguido de incubación durante aproximadamente 1-2 horas a 37° C. Después de la incubación, las células se sometieron a una sola etapa de lavado.
Procedimiento comparativo (técnica anterior)
Siguiendo las enseñanzas de Danon, la capa leucocitaria se sometió a un choque hipo osmótico inmediatamente después de procesar la sangre entera y se separó en sus 3 componentes principales, o sea, los glóbulos rojos de la sangre, plasma y capa leucocitaria. Por lo tanto, en agudo contraste con la presente invención, el procedimiento de Danon no implica la incubación de la capa leucocitaria después de la separación de los principales componentes de la sangre y antes de someter a la capa leucocitaria al choque hipo osmótico. El choque hipo osmótico se llevó a cabo mientras que la capa leucocitaria estaba contenida en la bolsa PB3.
Como un paso separado, y después del choque hipo osmótico, la solución de cloruro de calcio tamponada se transfirió de la bolsa PB6 a la bolsa PB2, bolsa que contenía el plasma, seguido de la congelación del plasma en PB2 durante 10 minutos, y de después colocarlo en un baño de agua a 37° C durante un período adicional de 30 minutos de incubación. Durante este tiempo, la fracción de capa leucocitaria que había sido sometida a choque hipo osmótico se dejó en reposo de manera que los leucocitos permanecieron expuestos al hemolizado.
Después de la conclusión de este proceso de coagulación, que en total duró alrededor de 40 minutos, todo el sistema de bolsa fue sujeto a centrifugación, y el hemolizado se descartó. Por lo tanto, las células fueron expuestas al hemolizado durante un período de al menos aproximadamente 55 minutos (es decir, que incluía el periodo de reposo de 40 minutos que coincidió con la coagulación del plasma, y un periodo adicional de 15 minutos para la centrifugación). En contraste, en el método de la invención, los leucocitos se centrifugaron inmediatamente durante alrededor de 5 minutos y por lo tanto fueron expuestos al hemolizado durante mucho menos tiempo, es decir, menos de 10 minutos.
Después de descartar el sobrenadante de PB3, se añadió medio fresco a la misma, seguido de la transferencia de toda la suspensión de nuevo a PB7, que después se incubó durante aproximadamente 17 horas a 37° C. Después de la incubación, las células se lavaron 3 veces. En contraste, en las realizaciones de la presente invención, el período de incubación se llevó a cabo en el plasma coagulado durante 1-2 horas, y se lavó una sola vez.
Hasta que se llevó a cabo la incubación antes mencionada, se llevaron a cabo todos los pasos anteriores en bolsas de transfusión, que eran las bolsas en las que se recogió la sangre entera. En contraste, las realizaciones de la invención implicaron el uso de las bolsas de infusión que se utilizan habitualmente para administrar soluciones intravenosas, tales como solución salina.
El procedimiento de Danon se llevó a cabo 4 veces y se comparó con los resultados generados por la realización de la presente invención. Los resultados que se mencionan a continuación, se promediaron.
Se determinó para cada lote de sangre entera la cantidad total de las células blancas de la sangre (leucocitos) obtenidos a partir de una unidad estándar de sangre, calculada como la concentración final multiplicada por el volumen final de suspensión celular. Los resultados promediados de los 111 lotes de sangre entera procesada según el método de la presente invención, y los 4 lotes que se procesaron según el procedimiento descrito en Danon, se exponen en la Tabla 4.
Tabla 4. Rendimiento de células blancas de la sangre por unidad de sangre – (la presente invención proporcionó aproximadamente rendimientos de 90 veces más cantidad de células blancas.)
- Número de lotes
- Células blancas de la sangre (x 106)
- Promedio
- Desviación estándar
- Invención presente (n=111)
- 449 220
- Danon (n=4)
- 5 4
Los resultados muestran que el método de la presente invención dio como resultado aproximadamente 90 veces más cantidad de leucocitos obtenidos a partir de una unidad de sangre estándar (aproximadamente 450 ml), en comparación con el procedimiento de Danon. Más en general, el presente método da como resultado un rendimiento de al menos aproximadamente 100 × 106, 125 × 106, 150 × 106, 175 × 106, 200 × 106, 225 × 106, 250 × 106, 275 × 106, 300 × 106, 325 × 106, 350 × 106, 375 × 106, 400 × 106, 425 × 106, 450 × 106, 475 × 106, 500 × 106, o más leucocitos por unidad de sangre estándar (incluyendo todos los sub-rangos de los mismos).
El número de células viables contenidas dentro de la población total de células, expresado como un porcentaje, se midió por el método de exclusión de azul tripán. Las células se contaron en un hemocitómetro de Newbauer después de la suspensión en azul de tripán (relación 1:1) para la evaluación del recuento de células y el porcentaje de viabilidad. Los resultados se presentan en la Tabla 5.
Tabla 5.
- Procedimiento
- Viabilidad (% de células vivas)
- Promedio
- Desviación estándar
- Invención presente (n=111)
- 98% 0,02%
- Danon (n=4)
- 77% 6%
Los datos de la Tabla 5 muestran que además de una producción más baja (como se muestra en la Tabla 4), el procedimiento de Danon produjo una suspensión de células con significativamente menor viabilidad. Es decir, casi una cuarta parte (o sea, 23%) de la preparación estaba compuesta de leucocitos muertos (más de un porcentaje de 10 veces de células muertas). En agudo contraste, casi todas las células blancas de la sangre procesadas según el método de la Invención fueron determinadas como viables. Más en general, la ALC de la invención puede contener al menos 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% o más, leucocitos viables sobre la base de este número total de células de leucocitos en la ALC (incluyendo todos los sub-rangos de los mismos).
La Expresión del marcador de activación de CD11b en granulocitos se midió por citometría de flujo, y se presenta como un porcentaje de las células CD11b positivas en la población de granulocitos (Células Positivas CD15). Las células de la muestra del producto final fueron teñidas simultáneamente con anti-CD11b conjugado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y anti-CD15 conjugado con ficoeritrina (PE), y se analizaron usando un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San José, California, Estados Unidos). Se analizó la expresión de CD11b en los granulocitos en las células de 81 lotes de lotes del producto final realizados según el método de la Invención, y de 3 lotes de productos final producidos según el procedimiento de Danon. Tabla 6 Expresión de CD11b en los granulocitos
- Procedimiento
- % de granulocitos expresando el marcador de activación CD11b
- Promedio
- Desviación estándar
- Invención presente (n=81)
- 84,6 6,2
- Danon (n=3)
- 46,9 9,2
Como muestran los datos contenidos en la Tabla 6, el método de la invención produjo casi dos veces más granulocitos activados en términos porcentuales, en comparación con el procedimiento de Danon. Más en general, los ALCs de la presente invención pueden contener al menos 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, o más, granulocitos CD11b (+), en relación con la población total de granulocitos en la ALC (incluyendo todos los sub-rangos de los mismos).
Los resultados de la experimentación comparativa demuestran que la invención descrita actualmente alcanza por lo menos 3 resultados inesperados en comparación con el procedimiento descrito en Danon, a saber, un mayor rendimiento de leucocitos viables, un alto porcentaje de células viables, y un mayor nivel de activación de granulocitos, como se muestra por el aumento de la expresión del marcador de activación CD11b. Estos aumentos son dramáticos e inesperados.
Lista de la bibliografía citada en la solicitud
J. Li, et al., Pathophysiology of Acute Wound Healing. Clinical Dermatol. 2007 Enero-Febrero; 25(1) : 9-18.
G. Broughton 2nd, et al., Wound Healing: An Overview. Plast Reconstr Surg. 2006 Junio; 117 (7 Suppl):1e -S-32e-S.
AK Tsirogianni, et al., Wound Healing: Immunological Aspects. Injury. 2006 Abril; 37 Suppl 1:S5-12. Epub 2006.
AJ Singer, et al., Cutaneous Wound Healing. New Eng. J. Med. 1999; 341(10): 738-46.
P. Martin, Wound Healing—Aiming For Perfect Skin Regeneration. Science 1997; 276 (5309): 75-81.
AD Agaiby, et al., Immuno-Inflammatory Cell Dynamics During Cutaneous Wound Healing. J. Anat. 1999 Noviembre; 195 (Pt 4): 531-42.
DWH Riches, Macrophage Involvement In Wound Repair, Remodeling and ®brosis. En The Molecular and Cellular Biology of Wound Repair, (1996) 1ª edición (ed. Clark RAF), páginas 95±141. Nueva York, Londres: Plenum Press.
D. Greiling, et al., Fibronectin Provides a Conduit for Fibroblast Transmigration from Collagenous Stroma into Fibrin Clot Provisional Matrix. J. Cell. Sci. 1997; 110: 861-70.
MG Tonnesen, et al., Angiogenesis In Wound Healing. J. Investig. Dermatol. Symp. Proc. 2000; 5 (1): 40-6.
JP Kim, et al., Mechanisms of Human Keratinocyte Migration on Fibronectin: Unique Role of RGD Site and Integrins.
J. Cell. Physiol. 1992; 151: 443-50.
JJ Tomasek et al., Myofibroblasts and Mechano-Regulation of Connective Tissue Remodelling. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. (2002) 3: 349-363.
S Werner, et al., Regulation of Wound Healing by Growth Factors and Cytokines. Physiol Rev. 2003 Julio; 83 (3): 835-70.
D. A. Keen, Review of Research Examining the Regulatory Role of Lymphocytes in Normal Wound Healing. J. Wound Care. 2008.
J Jameson, et al., A Role for Skin - T Cells in Wound Repair. Science 296: 747-749, 1992.
W L Havran, et al., Epithelial Cells and Their Neighbors. III. Interactions Between Intraepithelial Lymphocytes and
Neighboring Epithelial Cells. Am. J. Physiol. Gastrointest Liver Physiol. 2005 Octubre; 289 (4): G627-30.
J Parkin, et al., An Overview of the Immune System. Lancet. 2001; 357: 1777-1789.
A Moretta, et al., Human NK Cells: From HLA Class I-Specific Killer Ig-like Receptors to the Therapy of Acute Leukemias. Immunol. Rev. 2008 Agosto; 224: 58-69. BM Doshi, et al., Wound Healing From a Cellular Stress Response Perspective. Cell Stress Chaperones. 2008
Diciembre; 13 (4): 393-9.
G J Moran, et al., Antimicrobial Prophylaxis for Wounds and Procedures in the Emergency Department. Infect. Dis.
Clin. North Am. 2008.
MA Fonder, et al., Treating the Chronic Wound: A Practical Approach to the Care of Nonhealing Wounds and Wound
Care Dressings. J. Am. Acad. Dermatol. 2008 Febrero; 58 (2): 185-206.
JA Thackham, et al., The Use of Hyperbaric Oxygen Therapy to Treat Chronic Wounds: A Review. Wound Repair Regen. 2008, 1998 Mayo - Junio; 16 (3): 321-30. D R Berlowitz, et al., Are all pressure ulcers the result of deep tissue injury? A Review of the Literature. Ostomy
Wound Manage. 2007 Octubre; 53 (10): 34-8.
K. Girouard, et al., The symptom of pain with pressure ulcers: a review of the literature. Ostomy Wound Manage. 2008 Mayo; 54 (5): 30-40, 32.
Todas las publicaciones citadas en la solicitud que incluyen ambas, publicaciones de patentes y publicaciones que no son patentes son indicativas del nivel de conocimiento de aquellos expertos en la técnica a los que esta invención 5 se refiere.
Aunque la invención en esta solicitud se ha descrito en relación a realizaciones particulares, ha de entenderse que estas realizaciones son meramente ilustrativas de los principios y aplicaciones de la presente invención. Debe por lo tanto entenderse que pueden hacerse numerosas modificaciones a las realizaciones ilustrativas y que otros arreglos pueden visualizarse sin abandonar el alcance de la presente invención como se define por las reivindicaciones
10 adjuntas.
Claims (14)
- REIVINDICACIONES1. Un método para fabricar una composición de leucocitos activados que comprende:
- a.
- incubar leucocitos humanos a
- (i)
- una temperatura de 12° C - 28° C durante un tiempo que varía de aproximadamente 90 minutos a más de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, o 12 a 20 horas o
- (ii)
- una temperatura de 12° C - 37° C durante un tiempo que varía de 5-24 horas de manera que los leucocitos hacen la transición de un estado quiescente a un estado funcionalmente activo;
- b.
- someter a los leucocitos a un shock hipo osmótico; y
- c.
- añadir a los leucocitos de la etapa b, una solución de una sal fisiológicamente aceptable en una cantidad eficaz para restaurar la isotonicidad.
-
- 2.
- El método de la reivindicación 1 que además comprende:
poner en contacto una muestra separada de plasma humano con un agente coagulante para obtener suero, en donde los leucocitos y el plasma pueden obtenerse del mismo donante o de donantes diferentes; y mezclar los leucocitos de la etapa c con el suero de la etapa d. -
- 3.
- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en donde los leucocitos se obtienen de un donante que tiene el tipo sanguíneo O negativo y el plasma se obtiene de un donante que tiene el tipo sanguíneo AB positivo.
-
- 4.
- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el shock hipoosmótico comprende poner en contacto los leucocitos con agua, y en donde la solución de sal fisiológicamente aceptable es una solución de cloruro sódico al 0,9%.
-
- 5.
- El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende además incubar los leucocitos en el suero a 37º C.
-
- 6.
- Una composición de leucocitos activados preparada por el método de la reivindicación 1, en donde la composición comprende: a) 40% - 90% de granulocitos;
b) 5% - 20% de monocitos; y c) 5% - 30% de linfocitos. -
- 7.
- La composición de la reivindicación 6, en donde los granulocitos comprenden: a) 52% - 78% de neutrófilos; b) 1% - 9% de eosinófilos; y c) 1% - 2% de basófilos.
-
- 8.
- La composición de la reivindicación 6 o 7, en donde los linfocitos comprenden: a) 7% - 25% de células B (CD 19+); b) 20% - 30% de células NK (CD3- / CD56+); c) 40% - 60% de células T (CD3+); d) 0% - 30% de células NKT (CD3+ / CD56+); e) 8% - 20% de células T auxiliares (CD4+ / CD3+); y f) 20% - 30% de células CD8+ / CD3+.
-
- 9.
- La composición de cualquiera de las reivindicaciones 6-8 para su uso como un medicamento.
-
- 10.
- La composición de cualquiera de las reivindicaciones 6-8 para su uso como un agente de curación de heridas.
-
- 11.
- La composición de cualquiera de las reivindicaciones 6-8 para su uso para tratar heridas.
-
- 12.
- La composición para uso según la reivindicación 11, en donde la herida es una úlcera de decúbito, úlcera de presión, úlcera de las extremidades inferiores en un paciente diabético, una herida profunda del esternón, una herida post operatoria, una herida post operatoria refractaria del área del tronco, una herida a la gran vena safena después de la revascularización coronaria y recolección de la gran vena safena, una herida causada por un trauma, una fisura anal, o una úlcera venosa.
-
- 13.
- Un apósito que comprende una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8.
-
- 14.
- Una matriz o ensamblaje fisiológicamente inerte y/o reabsorbible que comprende una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 6-8.
A Glóbulos rojos empaquetados B PlasmaBolsa 1: agua para dilución (shock hipo osmótico), 200 ml; Bolsa 2: solución tamponada de cloruro sódico, 20 ml; Bolsa 3: cloruro de calcio tamponado, 60 ml; Bolsa 4: aire, 60 ml; Bolsa 5: aire 30 mlFigura 3A: Expresión de CD62L
Applications Claiming Priority (5)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US211587P | 2000-06-15 | ||
| US20929809P | 2009-03-05 | 2009-03-05 | |
| US209298P | 2009-03-05 | ||
| US21158709P | 2009-04-01 | 2009-04-01 | |
| PCT/IB2010/000882 WO2010100570A2 (en) | 2009-03-05 | 2010-03-05 | Activated leukocyte composition |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2428102T3 true ES2428102T3 (es) | 2013-11-05 |
Family
ID=42710060
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES10723285T Active ES2428102T3 (es) | 2009-03-05 | 2010-03-05 | Composición de leucocitos activados |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP2403509B1 (es) |
| JP (2) | JP5713924B2 (es) |
| KR (1) | KR101548783B1 (es) |
| CN (1) | CN102438635B (es) |
| AU (1) | AU2010220132B2 (es) |
| BR (1) | BRPI1006759A2 (es) |
| CA (2) | CA2867976A1 (es) |
| DK (1) | DK2403509T3 (es) |
| ES (1) | ES2428102T3 (es) |
| IL (1) | IL214953A0 (es) |
| MX (1) | MX2011009277A (es) |
| PL (1) | PL2403509T3 (es) |
| RU (2) | RU2548741C2 (es) |
| WO (1) | WO2010100570A2 (es) |
| ZA (1) | ZA201107269B (es) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8574902B2 (en) | 2009-03-05 | 2013-11-05 | Macrocure Ltd. | Activated leukocyte composition and uses for wound healing |
| AU2011300430C1 (en) * | 2010-09-09 | 2014-07-17 | Macrocure, Ltd. | Activated leukocyte conditioned supernatant and uses for wound healing |
| IN2014DN08407A (es) | 2012-03-15 | 2015-05-08 | Macrocure Ltd | |
| WO2013136182A1 (en) | 2012-03-15 | 2013-09-19 | Macrocure, Ltd. | Activated immunostimulatory cell composition and uses thereof |
| EP2781224A1 (en) | 2013-03-18 | 2014-09-24 | Khorionyx | Implantable preparations comrpsing globin insoluble at physiological pH and serum for regeneration of tissues and treatment of wounds. |
| WO2016132357A1 (en) | 2015-02-16 | 2016-08-25 | Nayacure Therapeutics Ltd. | Modified blood clots |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS60120821A (ja) * | 1983-12-05 | 1985-06-28 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 悪性腫瘍治療用白血球刺激材および刺激方法 |
| US4751001A (en) * | 1984-09-24 | 1988-06-14 | Becton Dickinson And Company | Blood partitioning apparatus |
| JPH02167071A (ja) * | 1988-12-19 | 1990-06-27 | Terumo Corp | 非ヒト動物由来白血球系細胞の分離材、分離器および分離方法 |
| JPH07102151B2 (ja) * | 1994-06-03 | 1995-11-08 | 中外製薬株式会社 | 新規なポリペプチドの製造法 |
| US6146890A (en) | 1994-07-03 | 2000-11-14 | Danon; David | Method and system for cultivating macrophages |
| IL110195A (en) * | 1994-07-03 | 2003-10-31 | David Danon | Method and system for cultivating macrophages |
| JP3201610B2 (ja) * | 1995-03-17 | 2001-08-27 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 腫瘍を処置する方法 |
| JPH10259134A (ja) * | 1997-01-16 | 1998-09-29 | Sekisui Chem Co Ltd | 創傷治癒促進剤 |
| RU2143685C1 (ru) * | 1998-05-19 | 1999-12-27 | Коган Александр Харитонович | Способ дифференциального подсчета гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов |
| EP1731175B1 (en) * | 1998-11-12 | 2009-09-30 | International Manufacturing Group, Inc. | Hemostatic cross-linked dextran beads useful for rapid blood coagulation and hemostatis |
| KR101001119B1 (ko) * | 2001-11-21 | 2010-12-14 | 예다 리서치 앤드 디벨럽먼트 캄파니 리미티드 | 인간 단핵 식세포성 백혈구의 제조 방법 |
| JP4108393B2 (ja) * | 2002-07-15 | 2008-06-25 | テルモ株式会社 | 細胞増殖剤の製造方法 |
| JP4245324B2 (ja) * | 2002-10-09 | 2009-03-25 | 旭化成クラレメディカル株式会社 | 単球の分離回収方法 |
| EP2201954A1 (en) * | 2008-12-18 | 2010-06-30 | Aposcience AG | Pharmaceutical preparation |
| EP2198873A1 (en) * | 2008-12-18 | 2010-06-23 | Aposcience AG | Pharmaceutical preparation comprising supernatant of blood mononuclear cell culture |
-
2010
- 2010-03-05 MX MX2011009277A patent/MX2011009277A/es active IP Right Grant
- 2010-03-05 DK DK10723285.2T patent/DK2403509T3/da active
- 2010-03-05 CN CN201080020134.XA patent/CN102438635B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2010-03-05 RU RU2011139016/15A patent/RU2548741C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2010-03-05 RU RU2015102067/15A patent/RU2015102067A/ru not_active Application Discontinuation
- 2010-03-05 BR BRPI1006759A patent/BRPI1006759A2/pt not_active IP Right Cessation
- 2010-03-05 PL PL10723285T patent/PL2403509T3/pl unknown
- 2010-03-05 AU AU2010220132A patent/AU2010220132B2/en not_active Ceased
- 2010-03-05 WO PCT/IB2010/000882 patent/WO2010100570A2/en active Application Filing
- 2010-03-05 KR KR1020117023251A patent/KR101548783B1/ko not_active IP Right Cessation
- 2010-03-05 ES ES10723285T patent/ES2428102T3/es active Active
- 2010-03-05 JP JP2011552537A patent/JP5713924B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2010-03-05 CA CA2867976A patent/CA2867976A1/en not_active Abandoned
- 2010-03-05 CA CA2754190A patent/CA2754190A1/en not_active Abandoned
- 2010-03-05 EP EP10723285.2A patent/EP2403509B1/en not_active Not-in-force
- 2010-03-05 EP EP13176068.8A patent/EP2650001B1/en not_active Not-in-force
-
2011
- 2011-09-04 IL IL214953A patent/IL214953A0/en unknown
- 2011-10-05 ZA ZA2011/07269A patent/ZA201107269B/en unknown
-
2015
- 2015-03-10 JP JP2015046833A patent/JP2015129180A/ja active Pending
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA201107269B (en) | 2014-03-26 |
| WO2010100570A3 (en) | 2010-12-16 |
| RU2548741C2 (ru) | 2015-04-20 |
| DK2403509T3 (da) | 2013-09-16 |
| KR20120002530A (ko) | 2012-01-05 |
| CA2867976A1 (en) | 2010-09-10 |
| AU2010220132A1 (en) | 2011-10-13 |
| KR101548783B1 (ko) | 2015-08-31 |
| JP2015129180A (ja) | 2015-07-16 |
| RU2015102067A (ru) | 2015-06-20 |
| JP5713924B2 (ja) | 2015-05-07 |
| WO2010100570A2 (en) | 2010-09-10 |
| CN102438635B (zh) | 2014-09-17 |
| EP2403509A2 (en) | 2012-01-11 |
| IL214953A0 (en) | 2011-11-30 |
| RU2011139016A (ru) | 2013-04-10 |
| EP2403509B1 (en) | 2013-08-21 |
| EP2650001A1 (en) | 2013-10-16 |
| CN102438635A (zh) | 2012-05-02 |
| MX2011009277A (es) | 2011-12-16 |
| BRPI1006759A2 (pt) | 2016-03-15 |
| EP2650001B1 (en) | 2016-09-07 |
| CA2754190A1 (en) | 2010-09-10 |
| AU2010220132B2 (en) | 2013-10-10 |
| PL2403509T3 (pl) | 2013-11-29 |
| JP2012519681A (ja) | 2012-08-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6892485B2 (ja) | トロンビン血清の調製、その利用およびその調製機器 | |
| ES2428102T3 (es) | Composición de leucocitos activados | |
| US9439950B2 (en) | Activated leukocyte conditioned supernatant and uses for wound healing | |
| US20150352151A1 (en) | Activated leukocyte composition and uses for wound healing | |
| WO2016075542A1 (en) | Methods for extended storage of activated leukocyte compositions |