ES2426034T3

ES2426034T3 - Truncamientos y proteínas recombinantes de Porphyromonas gingivalis

Info

Publication number: ES2426034T3
Application number: ES01925217T
Authority: ES
Inventors: Ian George Barr; Larissa Czajkowski; Bruce Carter Ross
Original assignee: CSL Ltd; University of Melbourne
Current assignee: CSL Ltd; University of Melbourne
Priority date: 2000-04-28
Filing date: 2001-04-27
Publication date: 2013-10-18
Anticipated expiration: 2021-04-27
Also published as: JP5209166B2; CA2407603C; US7204991B2; NZ521797A; EP1276762A4; JP2003531634A; AUPQ718200A0; CA2407603A1; DK1276762T3; CA2750984A1; EP1276762B1; EP1276762A1; US20030215402A1; WO2001083530A1

Abstract

Un polipéptido soluble de P. gingivalis que consiste en un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada delgrupo que consta de los residuos 86 a 223 de la SEC ID nº 3, los residuos 191-322 de la SEC ID nº 3, los residuos224-391 de la SEC ID nº 3, los residuos 213-380 de la SEC ID nº 4, los residuos 224-306 de la SEC ID nº 3, y losresiduos 281 a 384 de la SEC ID nº 3, o una variante de dicha secuencia que es capaz de generar una respuestainmune contra P. gingivalis, en el que el polipéptido soluble no es una proteína de fusión de los residuos 192 a 290de la adhesina r-Rgp44 de P. gingivalis vinculada a los residuos 286-380 de la SEC ID nº 4.

Description

Truncamientos y proteínas recombinantes de Porphyromonas gingivalis

5 Campo de la invención

La presente invención se refiere a secuencias de nucleótidos de P. gingivalis y a polipéptidos de P. gingivalis. Los polipéptidos y nucleótidos de P. gingivalis se pueden utilizar en compuestos para su uso en generar una respuesta inmune en un sujeto contra P. gingivalis y para tratamiento, prevención o reducción de la gravedad de la afección

10 conocida como periodontitis o de otras afecciones relacionadas con la infección con P. gingivalis.

Antecedentes de la invención

Las enfermedades periodontales son enfermedades inflamatorias asociadas a infección bacteriana de los tejidos de

15 soporte de los dientes, y abarcan desde la forma relativamente suave de la gingivitis, la inflamación reversible inespecífica de tejido gingival, hasta las formas más agresivas de la periodontitis que se caracterizan por la destrucción de las estructuras de soporte del diente. La periodontitis se asocia con una infección subgingival de un consorcio de bacterias específicas gramnegativas que lleva a la destrucción del periodonto y que supone un problema principal de salud pública. Una bacteria que ha atraído un considerable interés es P. gingivalis, ya que la

20 recuperación de este microorganismo en lesiones de periodontitis del adulto puede ser de hasta el 50% de la flora subgingival anaeróbicamente cultivable, mientras que P. gingivalis rara vez es recuperable, luego en bajo número, de sitios sanos. Un aumento proporcional en el nivel de P. gingivalis en la placa subgingival se ha asociado con un aumento de la gravedad de la periodontitis, y la erradicación del microorganismo de la población microbiana subgingival cultivable se acompaña de la solución de la enfermedad. La progresión de las lesiones de periodontitis

25 en primates no humanos se ha demostrado con la implantación subgingival de P. gingivalis. Estos hallazgos tanto en animales como en seres humanos sugieren un papel principal de P. gingivalis en el desarrollo de la periodontitis en el adulto.

Más recientemente, ha habido un aumento de la vinculación de la enfermedad periodontal con la enfermedad

30 cardiovascular y, por lo tanto, del vínculo entre la infección por P. gingivalis y la enfermedad cardiovascular. Se puede encontrar más información con relación a esta vinculación en Beck JD et al. Ann Periodontol 3: 127-141, 1998 y en Beck J et al. J. Periodontol. 67; 1123-37,1996.

P. gingivalis es un bacilo anaeróbico asacarolítico proteolítico gramnegativo pigmentado de negro que obtiene

35 energía a partir del metabolismo de aminoácidos específicos. El microorganismo tiene un requisito absoluto de hierro para el crecimiento, preferentemente en forma de hemo o de su producto de oxidación de Fe (III) hemina, y cuando crece bajo condiciones de exceso de hemina es altamente virulenta en animales experimentales. Varios factores de virulencia han sido implicados en la patogenicidad de P. gingivalis incluyendo la cápsula, las adhesinas, las citotoxinas y las enzimas hidrolíticas extracelulares.

40 Con el fin de desarrollar una vacuna eficaz y segura para prevenir, eliminar o reducir la colonización de P. gingivalis, es necesario identificar y producir antígenos que están implicados en la virulencia y que tienen utilidad como inmunógenos posiblemente a través de la generación de anticuerpos específicos. Si bien es posible intentar aislar antígenos directamente a partir de cultivos de P. gingivalis, esto es, a menudo, difícil. Por ejemplo, como se

45 mencionó anteriormente, P. gingivalis es un anaerobio estricto y puede ser difícil de aislar y de hacerlo crecer. Es también conocido que, para varios organismos, cuando se cultivan in vitro, muchos genes de virulencia están regulados y las proteínas codificadas ya no se expresan. Si se aplicaron técnicas de química convencionales para purificar candidatos potencialmente importantes de vacunas, las moléculas (protectoras) no se pueden identificar Con la secuenciación de ADN, ya que el gen está presente (pero no transcrito) incluso cuando el organismo se hace

50 crecer in vitro, puede ser identificado, clonado y producido como una proteína de ADN recombinante. Del mismo modo, un antígeno protector o un objetivo terapéutico se puede expresar transitoriamente por el organismo in vitro o producirse en bajos niveles, haciendo la identificación de estas moléculas extremadamente difícil por métodos convencionales.

55 Con la identificación serológica de objetivos terapéuticos, uno se limita a esas respuestas que son detectables usando métodos estándares tales como Western blot o ELISA. La limitación aquí es tanto el nivel de respuesta que se genera por el animal o por el ser humano como determinar si esta respuesta es protectora, perjudicial o irrelevante. Una limitación tal no está presente con un enfoque de secuenciación para la identificación de los posibles objetivos terapéuticos o profilácticos.

60 También es bien conocido que P. gingivalis produce una gama de proteasas ampliamente activas (solicitud internacional de patente nº WO 97/16542, y patentes de EE.UU. nº 5.475.097 y nº 5.523.390), que hacen difícil la identificación de proteínas intactas debido a su degradación por estas proteasas. El documento WO 01/47961 es parte de la técnica anterior de acuerdo con el artículo 54(3) CPE y describe una proteína de fusión de los residuos

65 192 a 290 de la adhesina r-Rgp44 de P. gingivalis enlazada a los residuos 286 a 380 de la SEC ID nº 4 .

Sumario de la invención

Los presentes inventores han identificado ahora fragmentos de las proteínas PG32 y PG33 de P. gingivalis que exhiben una solubilidad mejorada en comparación con las proteínas en toda su longitud. Usando un modelo murino 5 de lesión de infección, los presentes inventores han encontrado que estos fragmentos solubles son capaces de proteger contra la exposición a P. gingivalis.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido soluble de P. gingivalis que consiste en un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consta de los residuos 86 a 223 de la SEC ID nº 3,

10 los residuos 191-322 de la SEC ID nº 3, los residuos 224-391 de la SEC ID nº 3, los residuos 213-380 de la SEC ID nº 4, los residuos 224-306 de la SEC ID nº 3 y los residuos 281-384 de la SEC ID nº 3, o una variante de dicha secuencia que es capaz de generar una respuesta inmune contra P. gingivalis, en el que la variante no es una proteína de fusión de los residuos 192 a 290 de la adhesina r-Rgp44 de P. gingivalis enlazada a los residuos 286380 de la SEC ID nº 4.

15 En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una construcción quimérica o de fusión que comprende un polipéptido soluble del primer aspecto.

En un tercer aspecto, la presente invención proporciona una molécula de ADN aislada, comprendiendo la molécula 20 de ADN una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido soluble del primer aspecto.

En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona un vector recombinante de expresión que comprende la molécula de ADN del tercer aspecto de la presente invención enlazada operativamente a un elemento regulador de la transcripción.

25 En un quinto aspecto, la presente invención proporciona una célula que comprende un vector recombinante de expresión del cuarto aspecto.

En un sexto aspecto, la presente invención proporciona un método para producir un polipéptido de P. gingivalis que 30 comprende cultivar una célula del quinto aspecto bajo condiciones que permiten la expresión del polipéptido.

En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona una composición para su uso en generar una respuesta inmune provocada, bajo P. gingivalis, en un sujeto, comprendiendo la composición una cantidad eficaz de al menos un polipéptido del primer aspecto, y/o al menos una molécula de ADN del tercer aspecto de la presente invención, y

35 un portador farmacéuticamente aceptable.

En una realización preferida del séptimo aspecto, el portador farmacéuticamente aceptable es un adyuvante.

En un octavo aspecto, la presente invención proporciona una composición del séptimo aspecto para su uso en la 40 reducción o la prevención de la incidencia o de la gravedad de la infección por P. gingivalis en un sujeto.

Dado el aumento de vinculación de la enfermedad periodontal con la enfermedad cardiovascular (ECV), y la posible relación, por lo tanto, de la infección por P. gingivalis con las ECV, la composición del séptimo aspecto de la presente invención puede usarse también en la terapia profiláctica para reducir la incidencia o la gravedad de las

45 ECV o como un complemento en el tratamiento de las ECV.

En un noveno aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo generado y dirigido contra un polipéptido soluble, consistiendo el polipéptido en una secuencia seleccionada del grupo que consta de los residuos 191-322 de la SEC ID nº 3, los residuos 224-391 de la SEC ID nº 3, los residuos 213-380 de la SEC ID nº 4, los residuos 224

50 306 de la SEC ID nº 3, y los residuos 281-384 de la SEC ID nº 3.

El anticuerpo del noveno aspecto puede ser policlonal o monoclonal.

En un décimo aspecto, la presente invención proporciona una composición que comprende un anticuerpo del 55 noveno aspecto y un portador farmacéuticamente aceptable.

En una realización preferida del décimo aspecto, la composición se selecciona del grupo que consiste en una composición de pasta de dientes, enjuague bucal, polvo de dientes, dentífrico líquido, colutorio, trocisco, goma de mascar, pasta dental, crema de masaje gingival, tableta para hacer gárgaras, producto lácteo y otros productos

60 alimenticios.

En un undécimo aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo del noveno aspecto para su uso en el tratamiento o prevención de la infección por P. gingivalis en un sujeto, en el que el anticuerpo se genera y dirige contra un polipéptido soluble que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consta de los residuos 224

65 391 de la SEC ID nº 3 y los residuos 213-380 de la SEC ID nº 4.

En un duodécimo aspecto, la presente invención proporciona un método de diagnóstico para detectar la presencia o ausencia de un polipéptido P. gingivalis en una muestra, comprendiendo el método poner a la muestra en contacto con un anticuerpo del noveno aspecto bajo condiciones suficientes para que el anticuerpo forme un complejo inmune con un polipéptido de P. gingivalis de la muestra, y para detectar la presencia o ausencia de un complejo inmune.

5 En un aspecto decimotercero, la presente invención proporciona un método de diagnóstico para detectar la presencia o ausencia de un anticuerpo de P. gingivalis en una muestra, comprendiendo el método poner a la muestra en contacto con un polipéptido soluble del primer aspecto, o con una construcción quimérica o de fusión del segundo aspecto en condiciones suficientes para que el fragmento soluble de un polipéptido forme un complejo inmune con un anticuerpo de la muestra, y para detectar la presencia o ausencia de un complejo inmune.

En un decimocuarto aspecto, la presente invención proporciona un conjunto de útiles que comprende un polipéptido soluble del primer aspecto o una construcción quimérica de fusión del segundo aspecto y/o un anticuerpo del noveno aspecto.

15 En un decimoquinto aspecto, la presente invención proporciona el uso de un polipéptido del primer aspecto para generar un anticuerpo.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra los resultados de tres experimentos separados en los que toda la longitud de r-PG32 (construcción 1; aa21-391 en 0,5 M de urea) (figura 1a) y toda la longitud de r-PG33 (construcción 2; aa22-380 en urea 2 M) (figura 1b) se utilizaron para inmunizar ratones y se compararon con fragmentos de r-PG32 (construcción 21; aa224-391 en PBS) y de r-PG33 (construcción 22; aa213-380 en PBS) (figura 1c). A los ratones de control se les

25 dieron células enteras (FK 33277) muertas con formalina de la cepa 33277 de P. gingivalis o un lisado completo de

E. coli (E. coli).

La figura 2 muestra resultados de Western blot de un 12% de gel SDS-PAGE (Novex) que se han hecho reaccionar con un anti-GST monoclonal de ratón (B14; Santa Cruz Biotechnology) (figura 2a) y un resultado que se ha hecho reaccionar con sueros de ratones inmunizados con PG32 (aa224-391) en FIA (figura 2b). Los límites del anticuerpo se rastrearon utilizando sueros de Ig-HRP de oveja anti-ratón a 1:2000 (Silenus) y se detectaron con un substrato (KPL) de peroxidasa de membrana TMB.

Descripción detallada de la invención

35 La bacteria intra-oral Porphyromonas gingivalis contiene en su superficie las principales proteínas PG32 y PG33 de la membrana externa. En un modelo de absceso de ratón, los fragmentos solubles truncados de estas proteínas proporcionan una protección mejorada contra la exposición a P. gingivalis cuando se comparan con las proteínas en toda su longitud. De manera acorde, en un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un fragmento soluble del polipéptido de PG32 o de PG33, como se define en la reivindicación 1.

Según se usa en este documento, "soluble" significa soluble al menos en un 5% y, preferiblemente, más soluble que un 10%, según se determina por el método siguiente.

45 Los niveles y la solubilidad de las proteínas recombinantes o de sus truncamientos pueden ser evaluados tomando una pequeña cantidad (5 a 20 ml) del cultivo recombinante de células de E. coli, granulando las células por centrifugación y resuspendiendo las células en 1,5 ml de tampón TE a pH 8,0. Después las células se someten a ultrasonidos de 2 x 10 ráfagas por segundo usando un sonicador equipado con una microsonda (por ejemplo, un disruptor celular ultrasónico Virosonic Digital 475 ajustado al nivel 5, modelo perteneciente a The Virtis Company, Nueva York). Después de centrigugsar durante 15 minutos (a 13.000 rpm), se recoge el sobrenadante, y esta fracción representa la fracción soluble. El gránulo se lava y después se resuspende en tampón TE pH 8,0, y esto representa la fracción insoluble. Se puede llevar a cabo el análisis de las diversas fracciones para determinar el nivel de proteína recombinante presente en cada fracción usando análisis de SDS-PAGE y de Western blot y, si la proteína recombinante se purifica, los ensayos de proteínas estándar pueden ser también utilizados. El nivel de

55 solubilidad se evalúa determinando las cantidades relativas de la proteína recombinante de la fracción "soluble" en comparación con la cantidad de la fracción "insoluble", habiéndose recuperado el total que representa el 100% del total de la proteína recombinante. En algunos casos, ciertos detergentes no iónicos, tales como NOG y CHAPS, a niveles de 0,1-1% w/v o 0,1-1% de Tween-20 v/v, se pueden añadir al proceso de sonicación para ayudar en la solubilización de la proteína recombinante. Para la expresión a mayor escala y con fines de purificación, se pueden granular 500 ml de cultivos de E. coli por centrifugación y resuspender en 40 ml de un tampón adecuado (por ejemplo, 5 mM de imidazol, 500 nM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, a pH 7,9). Después las células se someten a ultrasonidos a 6 X 10 ráfagas por segundo usando una microsonda (0,5 ") ajustada a 8 [disruptor celular ultrasónico Virosonic Digital 475, The Virtis Company, Nueva York]. Después de centrigugar durante 15 minutos (a 13.000 rpm), el sobrenadante que contiene la proteína recombinante soluble se recoge para su posterior análisis o para su

65 purificación. Si se encontrara que toda la proteína recombinante está en la fracción soluble, entonces esto representaría una proteína 100% soluble, y, a la inversa, si se encontrara que toda la proteína recombinante está en

la fracción insoluble, entonces esto representaría una proteína 0% soluble.

El nivel de solubilidad de las proteínas recombinantes o de truncamientos expresado en la levadura se puede determinar usando el siguiente procedimiento. Una muestra de un cultivo de levadura que expresa una proteína 5 recombinante puede ser extraída por centrifugación (3000 g durante 5 minutos) y resuspendida en tampón de ruptura de 500 ul (50 mM de dihidrógeno ortofosfato de sodio, EDTA 1 mM, 5% de glicerol, a pH 7,4, que contiene 1 mM de PMSF, 10 mM de E-64, Sigma). Se llenan tres cuartas partes de un frasco de tapón de rosca de 2,0 ml (Biospec) con perlas de vidrio de 0,5 mm (Biospec) y el volumen restante del frasco se llena con células resuspendidas. La mezcla se homogeneiza, a continuación, en un disruptor celular de minibatidora de cuenta (por ejemplo, Biospec para 8 x 30 segundos fijado a 5.000 rpm) con una incubación de 30 segundos en hielo entre las batidas. Las perlas se dejan sedimentar y a las células rotas de levadura se les permite recuperarse. Después de una centrifugación durante 5 minutos (3.000 g) se recoge el sobrenadante, y esto representa la fracción soluble. El gránulo restante resuspendido en el tampón de ruptura representa la fracción insoluble. En algunos casos, se pueden añadir detergentes no iónicos, tales como NOG y CHAPS, a niveles de 0,1-1% w/v o 0,1-1% de Tween-20

15 v/v, para ayudar en la solubilización de las proteínas recombinantes. Las fracciones se analizan usando análisis SDS-PAGE y de Western blot, de una manera similar al material derivado de la E. coli con el fin de evaluar las cantidades relativas de proteína recombinante presentes en las fracciones soluble e insoluble.

En el primer aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido soluble de P. gingivalis que consiste en un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consta de los residuos 86 a 223 de la SEC ID nº 3, los residuos 191-322 de la SEC ID nº 3, los residuos 224-391 de la SEC ID nº 3, los residuos 213-380 de la SEC ID nº 4, los residuos 224 a 306 de la SEC ID nº 3, y los residuos 281 a 384 de la SEC ID nº 3, o una variante de dicha secuencia que es capaz de generar una respuesta inmune contra P. gingivalis, en el que la variante no es una proteína de fusión de los residuos 192 a 290 de la adhesina r-Rgp44 de P. gingivalis enlazada a los residuos 286 a

25 380 de la SEC ID nº 4.

En una realización preferida, el polipéptido del primer aspecto está en forma de proteína quiméria o de fusión.

La presente invención también abarca variantes solubles y derivados de los polipéptidos del primer aspecto. Los términos "variante" o "derivado", en relación con las secuencias de aminoácidos de la presente invención, incluye cualquier sustitución, variación, modificación, reemplazo, deleción o adición de uno (o más) aminoácidos de o a la secuencia, proporcionando que la secuencia de aminoácidos resultante sea capaz de generar una respuesta inmune contra P. gingivalis, teniendo, preferiblemente, al menos del 25 al 50% de la actividad que los polipéptidos presentan en las listas de secuencias; más preferiblemente, al menos, sustancialmente, la misma actividad.

35 Se pueden preparar mutantes de la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de la presente invención introduciendo cambios apropiados de nucleótidos en una secuencia de ácido nucleico, o mediante síntesis in vitro del polipéptido deseado. Tales mutantes incluyen, por ejemplo, deleciones, inserciones o sustituciones de residuos dentro de la secuencia de aminoácidos. Se puede hacer una combinación de deleción, inserción y sustitución para llegar a la construcción final, siempre que el producto de proteína final posea las características deseadas.

En el diseño de mutantes de la secuencia de aminoácidos, el emplazamiento del sitio de mutación y la naturaleza de la mutación dependerán de la(s) característica(s) que se van a modificar. Los sitios para la mutación se pueden modificar individualmente o en serie, por ejemplo (1) sustituyendo primero con elecciones conservadoras de

45 aminoácidos y, después, con selecciones más radicales, dependiendo de los resultados conseguidos, (2) eliminando el residuo de diana, o (3) insertando otros residuos adyacentes al sitio del emplazamiento.

Las deleciones de la secuencia de aminoácidos oscilan generalmente desde aproximadamente 1 a 30 residuos, más preferiblemente desde aproximadamente 1 a 10 residuos, y típicamente desde aproximadamente 1 a 5 residuos contiguos.

Los mutantes de sustitución tienen al menos un residuo de aminoácido retirado de la molécula de polipéptido, y un residuo diferente insertado en su lugar. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis sustitutiva incluyen los sitios identificados como la región o las regiones antigénica(s) determinante(s), y el sitio o los sitios activo(s). Otros sitios

55 de interés son aquéllos en los que ciertos residuos particulares, obtenidos de diversas especies, son idénticos. Estas posiciones pueden ser importantes para la actividad biológica. Estos sitios, especialmente aquéllos que caen dentro de una secuencia de al menos otros tres sitios conservados de manera idéntica, se sustituyen preferiblemente de una manera relativamente conservadora. Dichas sustituciones conservadoras se muestran en la tabla 1 bajo el título de "substituciones ejemplares".

Tabla 1. Sustituciones ejemplares Además, si se desea, se pueden introducir aminoácidos no naturales o análogos químicos de aminoácidos, como una sustitución o adición, en el polipéptido de la presente invención. Tales aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, los isómeros D de los aminoácidos comunes, ácido 2,4-diaminobutírico, el ácido α-amino isobutírico, ácido 4

Residuo original: Substituciones ejemplares

Ala (A): val; leu; ile; gly

Arg (R): lys; gln; asn

Asn (N): gln; his; lys; arg

Asp (D): glu

Cys (C): ser

Gln(Q): asn; his

Glu (E): asp

Gly (G): pro; ala

His (H): asn; gln; lys; arg

Ile (I): leu; val; ala; met; phe

Leu (L): ile; val; met; ala; phe

Lys (K): arg; gln; asn

Met (M): leu; phe; ile

Phe (F): leu; val; ala; ile; tyr; trp

Pro (P): gly

Ser (S): thr

Thr (T): ser

Trp (W): tyr; phe

Tyr (Y): trp; phe; thr; ser

Val (V): ile; leu; met; phe; ala

5 aminobutírico, ácido 2-aminobutírico, ácido 6-amino hexanoico, ácido 2-amino isobutírico, ácido 3-amino propiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homocitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, tbutilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, β-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos de diseño tales como aminoácidos β-metilo, aminoácidos Cα-metilo, aminoácidos Nα-metilo, y análogos de aminoácidos en general.

10 También se incluyen, dentro del alcance de la invención, los polipéptidos de la presente invención que se modifican diferencialmente durante o después de la síntesis, por ejemplo por biotinilación, bencilación, glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación, derivatización mediante grupos conocidos de protección/bloqueo, escisión proteolítica, enlace a una molécula de anticuerpo o a otro ligando celular, etc. Estas modificaciones pueden servir para aumentar la estabilidad y/o bioactividad del polipéptido de la invención.

15 También se incluyen, dentro del alcance de la invención, fragmentos biológicamente activos de los polipéptidos de la presente invención. Por "fragmento biológicamente activo" nos referimos a un fragmento soluble, de una secuencia de los aspectos segundo o tercero, que conserva al menos una de las actividades del polipéptido nativo. Lo más preferiblemente, un "fragmento biológicamente activo" de la presente invención es capaz de generar una respuesta

20 inmune contra P. gingivalis cuando el fragmento se administra a un sujeto.

Se apreciará que las técnicas para identificar un fragmento biológicamente activo o un mutante de un polipéptido de la presente invención, que es capaz de generar una respuesta inmune contra P. gingivalis en un sujeto, son bien conocidas en la este campo. Por ejemplo, se pueden hacer sustituciones y/o deleciones al polipéptido de la presente

25 invención, y se puede testar la capacidad del fragmento/mutante resultante para generar una respuesta inmune contra P. gingivalis en el sujeto.

La invención también proporciona proteínas quiméricas o de fusión. Según se usan en este documento, una "proteína quimérica" o una "proteína de fusión" comprenden un primer polipéptido de la presente invención

30 operativamente enlazado a un polipéptido asociado. El término "operativamente enlazado" pretende indicar que el primer polipéptido y el polipéptido asociado están fusionados en bastidor entre sí. El polipéptido asociado puede fusionarse en el extremo N-terminal o en el extremo C-terminal del polipéptido de la presente invención.

El polipéptido asociado se puede derivar del mismo organismo o de uno diferente, y puede ser el mismo polipéptido

35 que el primero u otro diferente. De manera acorde, la proteína de fusión puede comprender al menos dos polipéptidos de la presente invención.

En una realización, la proteína de fusión es un polipéptido de la presente invención que contiene una secuencia heteróloga de señal en su extremo N-terminal. En ciertas células huésped (por ejemplo, células huésped de mamífero), la expresión y/o la secreción de un polipéptido se puede aumentar mediante el uso de una secuencia heteróloga de señal.

5 En otra realización, la proteína de fusión comprende un polipéptido de la presente invención enlazado a una proteína de unión a maltosa (MPB) o a una proteína de glutationa transferasa (GST). Se pueden hacer proteínas MBP de fusión usando el sistema New England Biolabs pMal de expresión. Se ha demostrado que la fusión de MBP o de GST con las proteínas recombinantes facilita, en algunos casos, el plegado del polipéptido asociado recombinante de fusión y, por consiguiente, puede aumentar la solubilidad de la proteína de fusión, en comparación con los polipéptidos recombinantes no fusionados de P. gingivalis de la presente invención.

Preferiblemente, una proteína quimérica o de fusión de la invención se produce por técnicas estándares recombinantes de ADN. Por ejemplo, los fragmentos de ADN que codifican las diferentes secuencias de polipéptidos

15 se ligan juntos en bastidor de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo empleando términos con extremos romos o extremos escalonados para la ligación, digestión con enzimas de restricción para proporcionar términos apropiados, rellenado de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una unión indeseable, y ligación enzimática. En otra realización, el gen de fusión se puede sintetizar por técnicas convencionales incluyendo sintetizadores de ADN automatizados.

Alternativamente, se puede llevar a cabo una amplificación por PCR de fragmentos de genes usando iniciadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos consecutivos de gen que pueden consecuentemente hibridarse y reamplificarse para generar una secuencia quimérica de gen (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992). Lo que es más, hay muchos

25 vectores de expresión comercialmente disponibles que codifican ya una porción proteínica específica de fusión (por ejemplo, un polipéptido GST). Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de la presente invención se puede clonar en un vector tal de expresión tal que la porción proteínica específica de fusión quede enlazada en bastidor a un polipéptido de la presente invención.

La presente invención también proporciona secuencias de nucleótidos que codifican los péptidos solubles de la invención, equivalentes funcionales de dichas secuencias de nucleótidos y sondas de ácido nucleico para dichas secuencias de nucleótidos.

La invención también incluye dentro de su alcance diversas aplicaciones y usos de los nucleótidos anteriores y 35 productos recombinantes que incluyen polipéptidos recombinantes quiméricos o de fusión.

De acuerdo con una realización de la presente invención, usando técnicas recombinantes de ADN, se incorpora una secuencia génica que codifica un fragmento soluble de PG32 o de PG33 de la invención en un vector de expresión, y el vector recombinante se introduce en una célula huésped apropiada dirigiendo por ello la expresión de la secuencia a esa célula huésped particular. El sistema de expresión, que comprende el vector recombinante introducido en la célula huésped, se puede usar (a) para producir fragmentos solubles de PG32 o de PG33 que se pueden purificar para su uso como inmunógenos en formulaciones de vacunas; (b) para producir fragmentos solubles de PG32 o de PG33 para su uso como antígenos para inmunoensayos de diagnóstico o para generar antisueros específicos de P. gingivalis de valor terapéutico y/o diagnóstico; (c) o si el vector recombinante de 45 expresión es un virus vivo tal como el Vaccinia virus, puede ser utilizado el vector en sí mismo como una preparación de vacuna viva o inactivada para ser introducida en las células del huésped para la expresión de fragmentos solubles de PG32 o de PG33; (d) para su introducción en células bacterianas vivas atenuadas o bacterias comensales intra-orales genéticamente manipuladas, que se utilizan para expresar fragmentos solubles de PG32 o de PG33 para vacunar individuos; (e) o para su introducción directamente en un individuo para inmunizarle contra las proteínas PG32 o PG33 solubles codificadas y expresadas. En particular, la vacuna bacteriana recombinante se puede basar en un habitante comensal de la cavidad oral humana o animal si la vacuna es para prevenir la enfermedad periodontal en animales. La vacuna bacteriana recombinante que expresa fragmentos solubles de PG32 o de PG33 se puede usar para colonizar la cavidad oral, la placa supragingival o la subgingival. La bacteria intra-oral se puede aislar del paciente con periodontitis y ser manipulada genéticamente para expresar los 55 fragmentos solubles de PG32 o de PG33. Los fragmentos solubles de PG32 o de PG33 estimularán los tejidos linfoides asociados a la mucosa (MALT) para producir anticuerpos específicos para P. gingivalis. Los fragmentos solubles de PG32 o de PG33 de la invención se pueden utilizar como inmunógenos en formulaciones de vacunas profilácticas y/o terapéuticas contra cepas patogénicas de P. gingivalis, tanto si el inmunógeno se sintetiza químicamente, se purifica a partir de P. gingivalis, o se purifica a partir de un sistema de vector recombinante de expresión. Alternativamente, se puede incorporar un segmento de gen, que codifica un fragmento soluble de PG32 o de PG33 de la invención, a una vacuna bacteriana o viral, que comprende bacterias o virus recombinantes que están manipulados para producir uno o más fragmentos solubles de PG32 o de PG33, o en combinación con epítopos inmunogénicos de otros microorganismos patógenos. Además, se puede introducir, directamente en seres humanos, un gen que codifica un fragmento soluble de PG32 o de PG33, enlazado operativamente a uno o más elementos 65 reguladores, para expresar el fragmento soluble y provocar una respuesta inmune protectora. Una vacuna se puede basar también en un componente recombinante de un fragmento soluble de PG32 o de PG33 incorporado a un

vector apropiado y expresado en un huésped adecuado transformado (por ejemplo, E. coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, células COS, células CHO y células HeLa) que contiene el vector. La vacuna se puede basar en una vacuna intra-oral bacteriana recombinante, en la que la bacteria recombinante que expresa un fragmento soluble de PG32 o de PG33 es un habitante comensal de la cavidad oral.

5 Una realización preferida de la invención es una vacuna basada en un polipéptido soluble del primer aspecto y adyuvante adecuado que se entrega por aerosol nasal, por vía oral o por inyección para producir una respuesta inmune específica contra las proteínas PG32 o PG33. Una vacuna se puede basar también en un componente recombinante de un fragmento soluble, del primer o del segundo aspecto, que se incorpora en un vector apropiado y se expresa en un huésped adecuado transformado (por ejemplo, B. coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, células COS, células CHO y células HeLa), que contiene el vector.

La presente invención proporciona también anticuerpos generados y dirigidos contra ciertos polipéptidos solubles de la presente invención.

15 Cuando se usa en este documento, el término "anticuerpo" incluye fragmentos de anticuerpos completos que conservan su actividad de unión para un antígeno diana. Tales fragmentos incluyen los fragmentos Fv, F(ab') y F(ab')2, así como anticuerpos de cadena sencilla (scFv). Además, los anticuerpos y fragmentos designados con este término pueden ser anticuerpos humanizados, como se describe, por ejemplo, en el documento EP-A-239400.

Los polipéptidos solubles de PG32 y PG33 de la presente invención se pueden usar para generar anticuerpos usando técnicas estándares. Los animales utilizados para la generación de anticuerpos pueden ser conejos, cabras, gallinas, ovejas, caballos, vacas, etc. Cuando se detecta un alto título de anticuerpos contra un fragmento soluble mediante inmunoensayo, se sangran los animales o se recogen los huevos o la leche, y se prepara el suero y/o se

25 purifica el anticuerpo utilizando técnicas estándares o se producen anticuerpos monoclonales fusionando células de bazo con células de mieloma utilizando técnicas estándar. El anticuerpo (fracción de inmunoglobulina) se puede separar del cultivo o fluido de ascitis, suero, leche o huevos por precipitación salina, filtración de gel, intercambio iónico y/o cromatografía de afinidad, y similares, siendo preferida la precipitación salina. En el método de precipitación salina, el antisuero o la leche se saturan con sulfato de amonio para producir el precipitado, seguido por una diálisis del precipitado contra la solución salina fisiológica para obtener la fracción de inmunoglobulina purificada con el anti-PG32 o el anti-PG33 específico. El anticuerpo preferido se obtiene a partir del antisuero equino, del antisuero bovino y de la leche. En esta invención, el anticuerpo contenido en el antisuero y la leche obtenido mediante la inmunización del animal con los fragmentos solubles se mezcla en la composición oral. En este caso, se pueden usar el antisuero y la leche, así como el anticuerpo separado y purificado del antisuero y de la

35 leche. Cada uno de estos materiales se puede usar en solitario o en combinación con dos o más. Los anticuerpos contra PG32 y PG33 se pueden utilizar en composiciones orales tales como pasta de dientes y colutorio. Los anticuerpos se pueden usar también para la detección temprana de P. gingivalis en muestras de placa subgingival mediante una técnica en consulta de Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) o Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas.

Para las composiciones orales, se prefiere que la cantidad de los anticuerpos anteriores administrados sea 0,000150 g/kg/día y que el contenido de los anticuerpos anteriores sea 0,0002-10% en peso, preferiblemente 0,002-5% del peso de la composición. La composición de esta invención que contiene el anticuerpo antes mencionado del suero o de la leche se puede preparar y usar en diversas formas aplicables para la boca tales como dentífrico, incluyendo

45 pastas de dientes, polvos dentales y dentífricos líquidos, colutorios, trociscos, dispositivos de irrigación de las bolsas periodontales, gomas de mascar, pastas dentales, cremas de masaje gingival, tabletas para hacer gárgaras, productos lácteos y otros productos alimenticios. La composición oral de acuerdo con esta invención puede incluir adicionalmente ingredientes adicionales bien conocidos, dependiendo del tipo y de la forma de la composición oral particular.

En ciertas formas altamente preferidas de la invención, la composición puede ser sustancialmente de carácter líquido, tal como un colutorio o enjuague. En una preparación tal, el portador es típicamente una mezcla de agua y alcohol que incluye, de manera deseable, un humectante como se describe posteriormente. Generalmente, la relación en peso de agua y alcohol está en el intervalo de desde aproximadamente 1:1 hasta aproximadamente

55 20:1. La cantidad total de mezcla de agua y alcohol en este tipo de preparación está típicamente en el intervalo de desde aproximadamente 70% hasta aproximadamente 99,9% del peso de la preparación. El alcohol es típicamente etanol o isopropanol. Se prefiere el etanol.

El pH de tal líquido y otras preparaciones de la invención está generalmente en el intervalo de desde aproximadamente 4,5 hasta aproximadamente 9 y típicamente de desde aproximadamente 5,5 hasta 8. El pH está preferiblemente en el intervalo de desde aproximadamente 6 hasta aproximadamente 8,0, preferiblemente 7,4. El pH se puede controlar con un ácido (por ejemplo, ácido cítrico o ácido benzoico), con una base (por ejemplo, hidróxido de sodio) o tamponado (como con citrato de sodio, benzoato, carbonato o bicarbonato, fosfato de hidrógeno disódico, dihidrógeno fosfato de sodio, etc.).

65 En otras formas deseables de esta invención, la composición puede ser de carácter sustancialmente sólido o pastoso, tal como polvo de dientes, una tableta dental o un dentífrico, esto es, una pasta de dientes (crema dental) o gel dentífrico. El portador de tales preparaciones orales sólidas o pastosas contiene generalmente material dentalmente aceptable de pulido. Ejemplos de materiales de pulido son metafosfato de sodio insoluble en agua, metafosfato de potasio, fosfato tricálcico, fosfato de calcio dihidratado, fosfato dicálcico anhidro, pirofosfato de calcio,

5 ortofosfato de magnesio, fosfato de trimagnesio, carbonato de calcio, alúmina hidratada, alúmina calcinada, silicato de aluminio, silicato de zirconio, sílice , bentonita y mezclas de ellos. Otros materiales adecuados de pulido incluyen resinas termoendurecibles en partículas, tales como formaldehídos de melanina, fenólicos y de urea, y poliésteres y poliepóxidos reticulados. Los materiales de pulido preferidos incluyen sílice cristalina que tiene un tamaño de partícula de hasta aproximadamente 5 micras, un tamaño medio de partícula de hasta aproximadamente 1,1 micras, y un área de superficie de hasta aproximadamente 50.000 cm2/gm, gel de sílice o sílice coloidal, y complejo amorfo de aluminosilicato de metal alcalino.

Cuando se emplean geles visualmente claros, los agentes de pulido de sílice coloidal, tales como los vendidos bajo la marca comercial SYLOID, como Syloid 72 y Syloid 74, o bajo la marca comercial SANTOCEL, como Santocel 100,

15 complejos alcalinos metálicos de alumino-silicato, son particularmente útiles, ya que que tienen índices de refracción cercanos a los índices de refracción de los sistemas gelificantes de agente-líquido (incluyendo agua y/o humectante) usados comúnmente en dentífricos.

Muchos de los llamados materiales de pulido "insolubles en agua" son de carácter aniónico e incluyen también pequeñas cantidades de material soluble. De este modo, se puede formar metafosfato de sodio insoluble de cualquier manera adecuada, como se ilustra mediante el Diccionario Thorpe de Química Aplicada, [Thorpe's Dictionary of Applied Chemistry, Volumen 9, 4ª edición, pp. 510-511]. Las formas de metafosfato de sodio insoluble conocidas como sal de Madrell y sal de Kurrol son ejemplos adicionales de materiales adecuados. Estas sales de metafosfato exhiben sólo una solubilidad de minutos en agua, y por lo tanto son referidas comúnmente como

25 metafosfatos insolubles (IMP). Está presente en ellas una cantidad menor de material de fosfato soluble como impurezas, normalmente un pequeño porcentaje tal como de hasta un 4% en peso. La cantidad de material de fosfato soluble, que se cree incluye un trimetafosfato de sodio soluble en el caso del metafosfato insoluble, se puede reducir o eliminar mediante lavado con agua si se desea. El metafosfato alcalino de metal insoluble se emplea típicamente en forma de polvo, con un tamaño tal de partícula que no más del 1% del material es mayor de 37 micras.

El material de pulido está presente generalmente en las composiciones sólidas o pastosas, en concentraciones en peso de desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 99%. Preferiblemente, está presente en cantidades de desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 75% en la pasta de dientes, y de desde aproximadamente

35 70% hasta aproximadamente 99% en el polvo dental. En las pastas de dientes, cuando el material de pulido es de naturaleza silícea, está generalmente presente en una cantidad de aproximadamente 10-30% en peso. Otros materiales de pulido están típicamente presentes en una cantidad de aproximadamente 30-75% en peso.

En una pasta de dientes, el portador líquido puede comprender agua y humectante típicamente en una cantidad que oscila desde aproximadamente 10% hasta aproximadamente 80% del peso de la preparación. Glicerina, propilenglicol, sorbitol y propilenglicol ejemplifican humectantes/vehículos adecuados. También son ventajosas las mezclas líquidas de agua, glicerina y sorbitol. En geles claros, donde el índice de refracción es una consideración importante, se emplean preferiblemente aproximadamente 2,5-30% de peso húmedo de agua, desde 0% hasta aproximadamente 70% de peso húmedo de glicerina y aproximadamente 20-80% de peso húmedo de sorbitol.

45 Pastas de dientes, cremas y geles contienen típicamente un agente espesante o gelificante natural o sintético en proporciones de desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 10, preferiblemente de desde aproximadamente 0,5% hasta aproximadamente 5% de peso húmedo. Un espesante adecuado es la hectorita sintética, una arcilla compleja de silicato de metal alcalino y magnesio, coloidal y sintética, disponible, por ejemplo, como Laponite (por ejemplo, CP, SP 2002, D) comercializada por Laporte Industries Limited. Laponite D es, aproximadamente, en peso, 58,00% de SiO2, 25,40% de MgO, 3,05% de Na2O, 0,98% de Li2O, y algo de agua y trazas de metales. Su gravedad específica real es 2,53 y tiene una densidad aparente de 1,0 g/ml al 8% de humedad.

55 Otros espesantes adecuados incluyen musgo irlandés, carragenina iota, goma de tragacanto, almidón, polivinilpirrolidona, hidroxietilpropilcelulosa, hidroxibutil metil celulosa, hidroxipropil metil celulosa, hidroxietil celulosa (por ejemplo, disponible como Natrosol), carboximetilcelulosa de sodio, y sílice coloidal tal como Syloid (por ejemplo, 244) finamente molido. Se pueden también incluir agentes solubilizantes tales como polioles humectantes (tales como propilenglicol, dipropilenglicol y hexilenglicol), cellosolves (tales como metil cellosolve y etil cellosolve), aceites vegetales y ceras que contienen al menos aproximadamente 12 átomos de carbono en una cadena lineal (tales como aceite de oliva, aceite de ricino y vaselina) y ésteres (tales como acetato de amilo, acetato de etilo y benzoato de bencilo).

Se entenderá que, como es convencional, las preparaciones orales han de ser vendidas o, de otro modo,

65 distribuidas en paquetes adecuados etiquetados. De este modo, un frasco de enjuague bucal tendrá una etiqueta describiéndolo, en sustancia, como un enjuague bucal o colutorio y albergando instrucciones para su uso; y una pasta de dientes, una crema o un gel estarán normalmente en un tubo aplastable, típicamente de aluminio, forrado de plomo o plástico, o en otro dispensador de apretón, de bomba o de presión, para dosificar el contenido, que tenga una etiqueta que lo describa, en sustancia, como pasta de dientes, gel o crema dental.

5 Se usan agentes orgánicos tensioactivos en las composiciones de la presente invención para conseguir un aumento de la acción profiláctica, ayudar a conseguir una dispersión a fondo y completa del agente activo a lo largo de la cavidad oral, y hacer las composiciones instantáneas más aceptables cosméticamente. El material orgánico tensioactivo es preferiblemente de naturaleza aniónica, no iónica o de anfolito, que no desnaturaliza el anticuerpo de la invención, y se prefiere emplear como agente tensioactivo un material detergente que imparte a la composición propiedades detergentes y espumantes al mismo tiempo que no desnaturaliza el anticuerpo. Ejemplos adecuados de surfactantes aniónicos son las sales solubles en agua de monosulfatos de monoglicéridos de ácidos grasos superiores (tales como la sal de sodio del monoglicérido monosulfatado de ácidos grasos hidrogenados de aceite de coco), alquil sulfatos superiores (tales como lauril sulfato de sodio), alquil aril sulfonatos (tales como dodecil benceno de sodio sulfonato), alquilsulfoacetatos superiores, ésteres de ácidos grasos superiores de 1,2-dihidroxi propano

15 sulfonato, y las amidas acilo alifáticas superiores, sustancialmente saturadas, de compuestos de aminoácidos carboxílicos alifáticos inferiores, tales como los que tienen de 12 a 16 carbonos en el ácido graso, radicales alquilo o acilo, y similares. Ejemplos de las últimas amidas mencionadas son N-lauroil-sarcosina, y las sales de sodio, potasio, y etanolamina de sales de N-lauroil, N-miristoil o N-palmitoil sarcosina, que deben estar sustancialmente libres de jabón o material similar de ácido graso superior. El uso de estos compuestos de sarconite en las composiciones de la presente invención es particularmente ventajoso, ya que estos materiales exhiben un marcado efecto prolongado en la inhibición de la formación de ácido en la cavidad oral debido a la ruptura de carbohidratos, además de ejercer alguna reducción en la solubilidad del esmalte dental en soluciones ácidas. Ejemplos de surfactantes no iónicos solubles en agua adecuados para su uso con anticuerpos son productos de condensación de óxido de etileno con diversos compuestos reactivos que contienen hidrógeno reactivos con ellos, que tienen largas

25 cadenas hidrófobas (por ejemplo, cadenas alifáticas de aproximadamente 12 a 20 átomos de carbono), cuyos productos de condensación ("etoxámeros") contienen porciones proteínicas específicas de polioxietileno hidrófilo, tales como productos de condensación de poli (óxido de etileno) con ácidos grasos, alcoholes grasos, amidas grasas, alcoholes polihidroxilados (por ejemplo monoestearato de sorbitán) y óxido de polipropileno (por ejemplo, materiales plurónicos).

El agente tensioactivo está típicamente presente en una cantidad de aproximadamente 0,1-5% en peso. Es de destacar que el agente tensioactivo puede ayudar en la disolución del anticuerpo de la invención y, por ello, disminuir la cantidad de humectante solubilizante necesitado.

35 Se pueden incorporar otros materiales diversos en las preparaciones de esta invención, tales como agentes blanqueantes, conservantes, siliconas, compuestos de clorofila y/o material amoniacal tal como urea, fosfato de diamonio, y mezclas de ellos. Estos adyuvantes, cuando están presentes, se incorporan a las preparaciones en cantidades que no afectan sudstancialmente de manera adversa a las propiedades y características deseadas.

Se puede también emplear cualquier material adecuado saborizante o edulcorante. Ejemplos de constituyentes saborizantes adecuados son aceites saborizantes, por ejemplo aceite de menta verde, menta, gaulteria, sasafrás, clavo, salvia, eucalipto, mejorana, canela, limón, y naranja, y salicilato de metilo. Los agentes edulcorantes adecuados incluyen sacarosa, lactosa, maltosa, sorbitol, xilitol, ciclamato de sodio, perillartina, AMP (aspartil-fenilalanina, éster metílico), sacarina, y similares. Adecuadamente, los agentes saborizantes y edulcorantes pueden

45 hacer comprender cada uno o conjuntamente desde aproximadamente el 0,1% hasta el 5% más de la preparación.

En una práctica preferida de esta invención, una composición de acuerdo con esta invención, tal como colutorio o dentífrico, que contiene la composición de la presente invención, se aplica preferiblemente con regularidad en las encías y en los dientes, tal como cada día o cada dos o tres días o, preferiblemente, de 1 a 3 veces al día, a un pH de desde aproximadamente 4,5 hasta aproximadamente 9, generalmente de desde aproximadamente 5,5 hasta aproximadamente 8, preferiblemente de desde aproximadamente 6 hasta 8, durante al menos 2 semanas y hasta 8 semanas o más, hasta toda la vida.

Las composiciones de esta invención se pueden incorporar en pastillas, o en goma de mascar o en otros productos,

55 por ejemplo mediante agitación en una base de goma caliente o recubrimiento de la superficie exterior de una base de goma, ilustrativas de las cuales pueden mencionarse gelutong, látex de caucho, resinas de vinilita, etc, deseablemente con plastificantes o suavizantes convencionales, azúcar u otros edulcorantes tales como glucosa, sorbitol y similares.

Las composiciones de esta invención también incluyen portadores dirigidos de entrega tales como dispositivos de irrigación de las bolsas periodontales, colágeno y elastina, o esponjas sintéticas, membranas o fibras colocadas en la bolsa periodontal, usadas como membrana de barrera o aplicadas directamente en la raíz del diente.

La presente invención también proporciona un método de diagnóstico para detectar la presencia de P. gingivalis,

65 caracterizado por el uso de un anticuerpo o de un antígeno cualquiera o de una combinación de ellos, como se ha definido antes en este documento, comprendiendo la aplicación de técnicas conocidas, incluyendo, por ejemplo, el

ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas.

A lo largo de esta memoria descriptiva, la palabra "comprenden", o variaciones tales como "comprende" o "comprendiendo", se entenderá que implican la inclusión de un elemento, número entero o paso indicados, o de un 5 grupo indicado de elementos, de números enteros o de pasos, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o paso, o grupo de elementos, de números enteros o de pasos.

Cualquier discusión de documentos, actas, materiales, dispositivos, artículos o similares que se han incluido en la presente memoria descriptiva es con el único fin de proporcionar un contexto para la presente invención. No debe

10 ser tomada como una admisión de que cualquiera o la totalidad de estas cuestiones forman parte de la base de la técnica anterior o eran conocimientos comunes generales en el campo relevante para la presente invención, como existían en Australia antes de la fecha de prioridad de cada reivindicación de esta solicitud.

Con el fin de que la naturaleza de la presente invención se pueda comprender más claramente, se describirán 15 ciertas formas preferidas de ella con referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1: Clonación y análisis de las proteínas recombinantes PG32 y PG33 de P. gingivalis y fragmentos o truncamientos de estas proteínas

20 (a) Clonación de proteínas truncadas de P. gingivalis

PG32 (número de acceso GenBank AF175 714) y PG33 (número de acceso GenBank AF175715) han sido previamente descritas como proteínas inmunorreactivas de la cepa W50 de P. gingivalis. La secuencia completa de ADN y la secuencia de la proteína para PG32 se dan en las SEC ID nº 1 y nº 3, respectivamente, y para PG33 en las

25 SEC ID nº 2 y nº 4, respectivamente.

Ambas proteínas recombinantes PG32 y PG33 junto con varios truncamientos de estas proteínas (tabla 2) fueron clonados y expresados en E. coli.

30 utilizando los iniciadores de oligonucleótidos listados en la tabla 2, las enteras longitudes de PG32 y de PG33 (con su secuencias líder eliminadas) y varios fragmentos de PG32 y PG33 se han amplificado por PCR a partir de la purificación de ADN genómico de P. gingivalis W50 usando Pfu ADN polimerasa (Promega) y un PTC-100 termociclador (MJ Research). Las reacciones de PCR usan las siguientes condiciones: 30 ciclos de desnaturalización (95 °C, 1 min), recocido (50 °C, 2 min), y extensión (72 °C, 6 min). Cada producto de PCR fue

35 tratado con proteinasa K (Boehringer Mannheim) y purificado usando el equipo QIAquick de PCR de purificación (Qiagen). El ADN se digirió después en los sitios EcoRI y NotI de enzimas de restricción introducidos por iniciadores. El fragmento de ADN se purificó seguido de una electroforesis a través de un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% (Bio-Rad) y se extrajo usando el equipo de extracción de gel QiaexII (Qiagen). El ADN purificado se ligó al vector plásmido purificado QIAEXII de expresión pET24a(+) (Novagen) que había sido previamente digerido con

40 EcoRI y NotI. Los productos de ligación se transformaron en células competentes de calcio de E. coli BL21 DE3 (Stratagene) y los transformantes se seleccionaron en una LB que contenía 50 μg de kanamicina. PG32, PG33 y los truncamientos de estas proteínas se expresaron a partir de pET24a(+), que contenía una etiqueta de hexahistidina fusionado al extremo N-terminal de la proteína recombinante expresada. La expresión de la proteína fue inducida por adición de IPTG y purificada mediante cromatografía de afinidad con níquel (véase posteriormente).

45 Tabla 2. Iniciadores de oligonucleótidos (F = hacia adelante y R = marcha atrás) utilizados para la amplificación de las secuencias de nucleótidos que codifican PG32 y PG33 o porciones de estos genes. aa se refiere al número de aminoácido como se da en la SEC ID nº 3 para PG32 y en la SEC ID nº 4 para PG33.

SEC ID nº: Proteínas recombinantes F/R Iniciadores

5 6: PG32 (aa21-391) F R 5' CGCAGAATTCCAGGAGAATACTGTACCGGCAACG 3' 5' CTATGCGGCCGCCTTGGAGCGAACGATTACAACAC 3'

7 8: PG33 (aa22-380) F R 5' TGCAGAATTCCAAGAAGCTACTACACAGAACAAA 3' 5' CTATGCGGCCGCTTCCGCTGCAGTCATTACTACAA 3'

5 .9: PG32 (aa21-223) F R 5' CGCAGAATTCCAGGAGAATACTGTACCGGCAACG 3' 5' TTTTGCGGCCGCCATCCCCTGGAATCCATT 3'

10 11: PG33 (aa22-212) F R 5' TGCAGAATTCCAAGAAGCTACTACACAGAACAAA 3' 5' TTTTGCGGCCGCCATTACAGGGAAGTCTGC 3'

12 9: PG32 (aa86-223) F R 5' TTTTGAATTCCCTTTCTTTGCAACTCGT 3' 5' TTTTGCGGCCGCCATCCCCTGGAATCCATT 3'

13 11: PG33 (aa84-212) F R 5' TTTTGAATTCCCTTATTTCGGTACTCGT 3' 5' TTTTGCGGCCGCCATTACAGGGAAGTCTGC 3'

5 14: PG32 (aa21-152) F R 5' CGCAGAATTCCAGGAGAATACTGTACCGGCAACG 3' 5' AAAAGCGGCCGCTTTGTGTTGGTAGCCAAC 3'

10 15: PG33 (aa22-150) F R 5' TGCAGAATTCCAAGAAGCTACTACACAGAACAAA 3' 5' AAAAGCGGCCGCGAATTTATAACCAAATCC 3'

16 17: PG32 (aa153-306) F R 5' TTTTGAATTCTTCATCGGTAGCGAATGG 3' 5' TTTTGCGGCCGCCAATTGATCTTTGTCCAC 3'

18 19: PG33 (aa151-285) F R 5' TTTTGAATTCCATAGCGAAAACGCCAA 3' 5' TTTTGCGGCCGCGATACGGAAGTAAACCAC 3'

20 21: PG32 (aa191-322) F R 5' TTTTGAATTCGCTCACTCCAATCTCAAT 3' 5' AAAAGCGGCCGCCTCGTTAGTTTCTTTTAC 3'

22 23: PG33 (aa193-310) F R 5' TTTTGAATTCTTTGCCGGAAAGATGAAC 3' 5' AAAAGCGGCCGCTGCGTTGTTGGTCTTCGC 3'

12 17: PG32 (aa86-306) F R 5' TTTTGAATTCCCTTTCTTTGCAACTCGT 3' 5' TTTTGCGGCCGCCAATTGATCTTTGTCCAC 3'

13 19: PG33 (aa84-285) F R 5' TTTTGAATTCCCTTATTTCGGTACTCGT 3' 5' TTTTGCGGCCGCGATACGGAAGTAAACCAC 3'

12 21: PG32 (aa86-322) F R 5' TTTTGAATTCCCTTTCTTTGCAACTCGT 3' 5' AAAAGCGGCCGCCTCGTTAGTTTCTTTTAC 3'

13 23: PG33 (aa84-310) F R 5' TTTTGAATTCCCTTATTTCGGTACTCGT 3' 5' AAAAGCGGCCGCTGCGTTGTTGGTCTTCGC 3'

16 21: PG32 (aa153-322) F R 5' TTTTGAATTCTTCATCGGTAGCGAATGG 3' 5' AAAAGCGGCCGCCTCGTTAGTTTCTTTTAC 3'

18 23: PG33 (aa151-310) F R 5' TTTTGAATTCCATAGCGAAAACGCCAA 3' 5' AAAAGCGGCCGCTGCGTTGTTGGTCTTCGC 3'

20 17: PG32 (aa191-306) F R 5' TTTTGAATTCGCTCACTCCAATCTCAAT 3' 5' TTTTGCGGCCGCCAATTGATCTTTGTCCAC 3'

22 19: PG33 (aa193-285) F R 5' TTTTGAATTCTTTGCCGGAAAGATGAAC 3' 5' TTTTGCGGCCGCGATACGGAAGTAAACCAC 3'

24 6: PG32 (aa224-391) F R 5' GATCGAATTCGCTACAGCAGGTCTTAATTTCC 3' 5' CTATGCGGCCGCCTTGGAGCGAACGATTACAACAC 3'

25 8: PG33 (aa213-380) F R 5' GATCGAATTCGCTACAGCAGGTCTAACGTTCAA 3' 5' CTATGCGGCCGCTTCCGCTGCAGTCATTACTACAA 3'

26 8: PG33 (aa286-380) F R 5' GATCCGAATTCGAATAGTGCAAAGATTGAT 3' 5' CTATGCGGCCGCTTCCGCTGCAGTCATTACTACAA 3'

24 17: PG32 (aa224-306) F R 5' GATCGAATTCGCTACAGCAGGTCTTAATTTCC 3' 5' TTTTGCGGCCGCCAATTGATCTTTGTCCAC 3'

25 19: PG33 (aa213-285) F R 5' GATCGAATTCGCTACAGCAGGTCTAACGTTCAA 3' 5' TTTTGCGGCCGCGATACGGAAGTAAACCAC 3'

27: PG32 (aa281-384) F 5' GATCGAATTCACTAAGACAGAAAATATACTGA 3'

28: R 5' TTTTGCGGCCGCACGATTCCAAGCTTTCTT 3'

29 30: PG33 (aa306-372) F R 5' GATCGAATTCAAGACCAACAACGCACCGATCA 3' 5' TTTTGCGGCCGCACGATTCCAAGCGTTCTC 3'

(b) La expresión de proteínas recombinantes en E. coli

Una única colonia transformante se utilizó para inocular 20 ml de caldo de Luria-Bertani (LB) que contenía 50 μg/ml

5 de kanamicina, y se agitó a 37 °C durante la noche. Este inóculo se utilizó después para inocular 500 ml de caldo Terrific (que contenía fosfatos de potasio y 50 μg/ml de kanamicina), y se agitó a 37 °C hasta que la densidad óptica (DO600) fue de 2,0. El cultivo se indujo con IPTG 0,1 mM. Después de un período de inducción 1-4 horas a 30 °C o 37 °C, el cultivo se recogió por centrifugación a 4000 rpm durante 10 min a 4 °C, y el gránulo se almacenó a -70 °C para la determinación de la solubilidad de la proteína recombinante.

(c) Determinación de la solubilidad de las proteínas recombinantes

Los niveles de expresión y la solubilidad de las proteínas r-PG32 o r-PG33 o de sus truncamientos fueron evaluados seguidos de la inducción IPTG. Aproximadamente, 14 ml del cultivo recombinante de células de E. coli se granularon 15 por centrifugación y se resuspendieron en 1,5 ml de TE a pH 8,0. Las células se sometieron después a sonicación de 2 X 10 ráfagas por segundo, usando una microsonda en un entorno de 5 (mediante un disruptor celular por ultrasonidos Virosonic Digital 475, The Virtis Company, Nueva York). Seguido de una centrifugación durante 15 minutos (13.000 rpm), se recogió el sobrenadante, que representa la fracción soluble. El gránulo se lavó y después se resuspendió en TE a pH 8,0, y esto representó la fracción insoluble. Se llevó a cabo el análisis de las diversas 20 fracciones utilizando análisis de Western blot y SDS-PAGE. Los resultados de estos experimentos se muestran en la tabla 3. En algunos casos se añadieron detergentes no iónicos tales como NOG y CHAPS al 0,1-1% al proceso de sonicación para ayudar en la solubilización de la proteína recombinante. Para la expresión a gran escala y con fines de purificación, se granularon 500 ml de cultivos de E. coli por centrifugación y se resuspendieron en 40 ml de 1x tampón de unión (5 mM de imidazol, 500 nM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, a pH 7,9). Después, las células se

25 sometieron a ultrasonidos de 6 X 10 ráfagas por segundo usando una microsonda (0,5") en un entorno de 8 (disruptor celular por ultrasonidos Virosonic Digital 475, The Virtis Company, Nueva York). Seguido de una centrifugación durante 15 minutos (13.000 rpm), el sobrenadante que contenía la proteína recombinante soluble se recogió purificado como se describe posteriormente.

30 (d) Aislamiento y solubilización de cuerpos de inclusión o proteínas recombinantes insolubles

Cuando se encontró que la r-proteína era insoluble, como en el caso de las enteras longitudes de PG32 (SEC ID nº 3; residuos 21-391) y de PG33 (SEC ID nº 4, los residuos 22 a 380), el gránulo de E. coli recombinante se descongeló en hielo y se resuspendió en tampón de unión, después se sometió a ultrasonidos y se centrifugó a

35 20.000 xg para recoger los cuerpos de inclusión. El gránulo se resuspendió en tampón de unión y se repitió dos veces más el proceso de sonicación y centrifugación para liberar proteína adicionalmente. El gránulo se resuspendió después en un tampón de unión que contenía urea 6 M y se incubó en hielo durante 2-3 h, agitando para disolver completamente las proteínas. Todo el material insoluble que quedaba se retiró centrifugando a 39.000 xg durante 20 min. El sobrenadante se filtró a través de una membrana de 0,45 μm antes de la purificación en columna.

(e) Purificación de ácido níquel-nitrilotriaectic (Ni-NTA) y replegamiento de proteínas recombinantes

Se usó una cromatografía de afinidad de metal con Ni-NTA para purificar las proteínas recombinantes mediante la etiqueta H6. En resumen, las proteínas fueron lotes unidos a la resina de Ni-NTA equilibrada (Qiagen), que se vertió

45 en una pequeña columna, y las proteínas no unidas se eluyeron por gravedad. Después, la columna se lavó con 10 ml de tampón de unión seguido de 6 ml de tampón de lavado (60 mM de imidazol, 500 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, a pH 7,9). Después, la proteína unida se eluyó en un tampón que contenía 1 M de imidazol, 500 mM de NaCl, 20 mM de Tris-HCl, a pH 7,9). Si se estaban purificando los cuerpos de inclusión solubilizados o la proteína recombinante insoluble, se añadían 6 M de urea a los tampones anteriormente mencionados.

(f) Renaturalización de la proteína recombinante

Para las preparaciones que no contenían urea, las fracciones de proteína eluidas de la resina de Ni-NTA se juntaron antes de la diálisis con 0,5 M de Tris-HCl y 50 mM de NaCl para retirar trazas de imidazol.

55 Para los preparados que contenían urea, las fracciones de proteína eluidas de la resina de Ni-NTA se juntaron y se replegaron mediante una diálisis escalonada de 6 M a 4 M a 2 M a 0,5 M a 0 M de urea contenida en el siguiente tampón: 50 mM de Tris-HCl, 0,5 M de NaCl y 8% de glicerol. Se llevó a cabo la diálisis durante un mínimo de 2 horas en cada concentración diferente de urea. Se añadieron también diversos detergentes al tampón de diálisis, en

60 algunos casos para mejorar la solubilidad, tales como 0,5-1% de NOG o 0,5% -1% de CHAPS.

(g) Electroforesis en gel de poliacrilamida y realización de Western blot

La electroforesis SDS-PAGE se realizó esencialmente como se recomienda en Novex. Las muestras se mezclaron con un volumen igual de 2 x tampón de muestra de reducción (Novex), se hirvió durante 10 min a 100 °C y se aplicó 5 a geles de Tris-glicina 4-20% (Novex). Los estándares de peso molecular (SeeBlueTM) también se adquirieron en Novex. Se prepararon resultados de Western blot mediante proteínas de electrotransferencia sobre nitrocelulosa durante 1 hora a 100 voltios seguido de electroforesis. Las membranas se bloquearon en PBS con 5% de leche desnatada antes de la incubación con anticuerpo anti-conejo diluido a 1/5000 o con anticuerpo anti-rata diluido a 1/1000 en PBS con 5% de leche desnatada. Más tarde, las membranas se lavaron y se incubaron con un anticuerpo

10 de cabra anti-conejo conjugado con HRP (KPL) o un anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con HRP (KPL), se lavaron y se desarrollaron con sustrato TMB con peroxidasa de membrana (KPL).

Ejemplo 2: Antisueros

15 Se generó un antisuero policlonal para las proteínas recombinantes purificadas mediante dosificación BALB/c de ratones con 2 x 20 μg de la proteína recombinante PG32 (constructo 21) en adyuvante incompleto de Freund (FIA, Sigma) con tres semanas de diferencia. Los ratones se sangraron una semana después de la segunda dosis, y el antisuero generado se utilizó para cribar los resultados de Western blot de células enteras de P. gingivalis W50 realizadas bajo condiciones reductoras y de desnaturalización. También se generaron antisueros en conejos

20 mediante inmunización con 3 dosis de células enteras de P. gingivalis (cepa W50) o de fracciones insolubles enriquecidas con Sarkosyl (un método que enriquece las proteínas de la membrana externa de los organismos gram negativos) de P. gingivalis (cepa W50) en FIA. También se generaron antisueros en ratas seguido de inmunización con células enteras de P. gingivalis W50 en adyuvante incompleto de Freund. Las ratas fueron después expuestas por vía oral a células vivas de P. gingivalis (cepa ATCC 33277) y se sangraron 6 semanas más tarde. Estas ratas,

25 más tarde, demostraron estar protegidas de la pérdida ósea alveolar alrededor de los dientes molares tras la exposición en comparación con las ratas de control.

Tabla 3. Determinación de la solubilidad, de los niveles de expresión y de la reactividad a Western blot con proteínas recombinantes PG32 y PG33 y sus fragmentos.

Construcción Nivel de Tamaño de Reactividad a Western blot **

Nº % Solubilidad

en pET24a(+) expresión* proteína (kDa) Etiqueta de 6xHis Ser humano Rata Conejo 22 PG33 (aa213-380) +++++ 18,6 10-15% + -+ +

1: PG32 (aa21-391) ++ 43,8 Insoluble + - + +

2: PG33 (aa22-380) + 43 Insoluble + - + +

3: PG32 (aa21-223) ++ 22,6 Insoluble + - - -

4: PG33 (aa22-212) +++ 21,2 Insoluble + - - -

5: PG32 (aa86-223) ++++ 15,4 10% + - - +/-

6: PG33 (aa84-212) + 14,3 Insoluble + - - +

7: PG32 (aa21-152) + 14,6 Insoluble + - - +

8: PG33 (aa22-150) +++++ 14,3 Insoluble + - - -

9: PG32 (aa153-306) ++ 17,2 Insoluble + - - +

10: PG33(aa151-285) + 15 Insoluble + - - +

11 PG32 (aa191-322): +++++ 14,6 10% + - - +/-

12 PG33 (aa193-310): +++ 10,9 <5% + - +/- +

13: PG32 (aa86-306) +++++ 24,6 Insoluble + - +/- +

14: PG33 (aa84-285) +++ 22,4 Insoluble + - - +

15: PG32 (aa86-322) ++++ 26,3 Insoluble + - +/- +

16: PG33 (aa84-310) ++++ 25,2 Insoluble + - +/- +

17 PG32 (aa153-322): + 18,4 Insoluble + - - -

18 PG33 (aa151-310): ++++ 17,7 Insoluble + - +/- +

19 PG32 (aa191-306): ++++ 13 <5% + - - +

20 PG33 (aa193-285): +++++ 8,1 Insoluble + - +/- +

21 PG32 (aa224-391): ++++++ 18,5 10-15% + - + +

23 PG33 (aa286-380) +++ 10,5 <5% + --+

24 PG32 (aa224-306) +++ 9,3 20% + --+/-

25 PG33 (aa213-285) +++ 8,1 <5% + --+

26 PG32 (aa281-384) +++++ 11,4 50% + --+

27 PG33 (aa306-372) ++ 7,3 10% + ---

* Niveles de expresión: + = nivel bajo ++++++ = niveles extremadamente altos de expresión ** Reactividad a Western blot: +/- = nivel bajo de reactividad + = reactividad claramente positiva

Ejemplo 3: modelo murino de lesión

5 Grupos de 10 ratones BALB/c hembra (6-8 semanas de edad) fueron inmunizados (20 μg/dosis) por vía subcutánea con cada proteína recombinante, PG32 (Construcción 1, en 0,5 M de urea), PG33 (Construcción 2, en 2 M de urea), fragmento de PG32 (Construcción 21) y fragmento de PG33 (Construcción 22). A los ratones de control se les dieron células muertas de P. gingivalis con formalina (aproximadamente 2x109) o lisado de E. coli (20 μg/dosis); todo

10 emulsionado en adyuvante incompleto de Freund (Sigma). Las inmunizaciones se dieron por vía subcutánea en la base de la cola, y se produjeron cuatro semanas y una semana antes de la exposición a P. gingivalis. Dos días antes de la exposición, los ratones se sangraron del plexo retrobulbar. Los ratones BALB/c fueron expuestos a 7,5 x 109 células viables de P. gingivalis 33277, por vía subcutánea, en la región ventral de la abdomen. Tras la exposición, los ratones fueron examinados diariamente del número y del tamaño de las lesiones durante un periodo

15 de siete días. Se midieron diariamente las lesiones desarrolladas en el abdomen de los ratones en torno al sitio de la inyección y otras lesiones.

La figura 1 muestra los resultados de 3 experimentos separados en los que la entera longitud r-PG32 (Construcción 1; aa21-391 en 0,5 M de urea), véase la figura 1a, y la entera longitud r-PG33 (Construcción 2; aa22-380 en urea 2 20 M), véase la figura 1b, se usaron para inmunizar ratones y se compararon con los fragmentos de r-PG32 (Construcción 21; aa224-391 en PBS) y de r-PG33 (Construcción 22; aa213-380 en PBS), véase la figura 1c. A los ratones de control se les dieron células enteras muertas de la cepa 33277 de P. gingivalis con formalina (FK 33277)

o lisado completo de E. coli (E. coli). Se obtuvieron reducciones significativas en el tamaño de la lesión sólo con el

uso de la vacunación con células enteras muertas de P. gingivalis con formalina (cepa 33277) y los fragmentos de r25 PG32 (Construcción 21; aa 224-391 en PBS, p <0,01) y de r-PG33 (Construcción 22; aa 213-380 en PBS, p <0,05).

Ejemplo 4: Expresión de PG32 (aa224-391) en la levadura

Clonación de fragmento PG32 (aa224-391). PG32 (Construcción 21) se amplificó por PCR y se extrajo como se

30 describe en el ejemplo 1. El ADN purificado se ligó en GST purificado en QIAEXII al vector de expresión de levadura pYEX4T-1 (Amrad), que había sido previamente digerido con EcoRI y NotI. El producto de ligación se transformó en

E. coli BL21 DE3 competente de calcio (Stratagene) y se seleccionó en placas LB que contenían 50 μg de ampicilina. Una única colonia de células de E. coli que contenía el plásmido recombinante se inoculó en un cultivo de 100 ml que contenía caldo Terrific conteniendo ampicilina durante la noche, y el plásmido se purificó con un equipo

35 QIAGEN Maxi Plasmid antes de ser transformado en levadura.

Transformación de la levadura. Una muestra de S. cerevisiae DY150 almacenada en glicerol se extendió sobre una placa de YPD y se colocó a 30 °C durante 3-4 días. Una única colonia se inoculó en 20 ml de medio YPD y se agitó a 30 °C durante 24 horas. Un volumen de 5001l del cultivo de la noche se centrifugó a 3000 rpm durante 5 min y el

40 gránulo DY150 se lavó en 1 ml de dH20. El gránulo se resuspendió en 10 mg/ml de ADN de timo de ternera (Sigma), al que se añadió 1 ug de ADN plásmido junto con 500 ul de la solución de la placa, y la mezcla se incubó a 25 °C durante 24 horas. Las células se centrifugaron a 3000 rpm durante 5 min y la solución de la placa se retiró. La levadura se lavó en 1 ml de dH20, se colocó en una placa YNBS y se incubó a 30 °C durante 4-5 días.

45 Expresión a pequeña escala en la levadura. Se utilizó una única colonia transformante para inocular 5 ml de caldo YNBS y se agitó a 30 °C durante 48 horas. Un inóculo de 0,5 ml se añadió a 5 ml de caldo fresco YNBS y se indujo con 0,5 mM de CuSO4. Después de un periodo de inducción de 3 horas a 30 °C, el cultivo se recogió por centrifugación y se resuspendió en tampón de ruptura 500 ul (que contenía PMSF 1 mM y E-64 10 mM, Sigma). Un vial de tapón de rosca de 2,0 ml (Biospec) se llenó tres cuartos de su capacidad con perlas de vidrio de 0,5 mm

50 (Biospec) y el volumen vial restante se llenó con células. La mezcla se homogeneizó en un disruptor celular de minibatidora de cuenta (Biospec) para 8 x 30 s (a 5.000 rpm) con una incubación de 30 segundos en hielo entre las batidas. Las perlas se dejaron reposar y se recuperaron las células rotas de levadura. Seguido de la centrifugación durante 5 minutos (3000 g), se recogió el sobrenadante y se tomón nota de la fracción soluble. El gránulo se resuspendió en tampón de ruptura para producir la fracción insoluble. Las fracciones se analizaron usando análisis

55 SDS-PAGE y Western blot.

Los resultados de la expresión en la levadura del fragmento PG32 (aa224-391) se muestran en las figuras 2a y 2b. La línea 1 en ambas figuras contiene marcadores de peso molecular pre-teñidos (Novex, SeeBlue), mientras que la línea 2 contiene sobrenadante de levadura recombinante alterada que expresa sólo GST. Las líneas 3-7 representan clones individuales expandidos de células alteradas de levadura que contienen GST fusionado con el gen PG32 5 (aa224-391), sin (línea 3) y con el gen PG32 optimizado para el uso de codones de levadura (líneas 4-7, véase el ejemplo 5). Obsérvese que la reactividad se ve sólo en la posición del GST solo (véase la flecha de línea 2, figura 2ª, en aproximadamente 27.5kDa) cuando la membrana se sondeó con anti-GST, en comparación con la banda dominante de mayor peso molecular vista cuando el GST se fusionó con PG32 (aa224-391), líneas 3-7 (véase la flecha en aproximadamente 48 kDa de la figura 2a). Cuando el resultado de Western blot se hizo reaccionar con el

10 antisuero anti-PG32 (véase la figura 2b) no se vio reactividad alguna en la levadura que expresa el GST solo (línea 2) pero se vio una fuerte reactividad en aproximadamente 46-48kDa (véase la flecha) con algo de reactividad con otras bandas. El peso molecular previsto para la proteína de fusión era aproximadamente 46kDa, y esto corresponde a la banda de fuerte tinción en las líneas 3-7 (indicada con la flecha en la figura 2b).

15 Ejemplo 5: Construcción y clonación de PG32 (aa224-391) sintética para la expresión óptima de la proteína en la levadura

Se construyó un gen sintético de PG32 truncada (correspondiente a PG32 aa224-391) utilizando el uso de un codon previsto de S. cerevisiae para mejorar la expresión de la proteína P. gingivalis en S. cerevisiae. Los oligonucleótidos 20 que cubrían toda la secuencia de ADN de doble cadena, como se listan en la tabla 4, fueron diseñados con codones de alta predisposición de expresión para expresión en levaduras (Sharp, P.M., y Cole, E. (1991) Yeast. 7, 657-678). Los iniciadores A y B de oligonucleótidos se convirtieron a un fragmento de ADN de doble cadena por PCR con de ADN polimerasa de precisión TaqPlus (Stratagene) usando las siguientes condiciones: 20 ciclos de desnaturalización (96 °C, 1 min), recocido (53 °C, 1 min) y extensión (72 °C, 2 min), con la duración del paso de 25 extensión aumentado en 5 segundos en cada ciclo (Di Donato, A., de Nigris, M., Russo, N., Di Biase, S., y D'Alessio,

G. (1993) Analytical Biochemistry. 212, 291-293). Una parte alícuota 1/20 de la mezcla del núcleo se usó en una segunda realización PCR con iniciadores C y D de oligonucleótidos, funcionando para alargar la plantilla de núcleo. El procedimiento se repitió con cada par de iniciadores hasta que se generó un producto de 500 bp. Este producto de PCR se trató con proteinasa K (Boehringer Mannheim), se purificó usando el equipo de purificación QIAquick de 30 PCR (Qiagen) y se digirió en los sitios EcoRI y NotI de enzimas de restricción introducidos por el iniciador. El fragmento de ADN se purificó mediante electroforesis a través de un gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1% (Bio-Rad) y se extrajo usando el equipo de extracción en gel QiaexII (Qiagen). El ADN purificado se ligó en GST purificado en QIAEXII al vector de expresión de levadura pYEX4T-1 (Amrad), que había sido previamente digerido con EcoRI y NotI. Los productos de ligación se transformaron E. coli BL21 DE3 competente de calcio (Stratagene) y 35 se seleccionaron en placas LB que contenían 50 μg de ampicilina. La integridad del codon inserto reemplazado se confirmó mediante análisis de secuencia de ADN. La transformación de la levadura y la expresión de PG32 se realizaron como se describió anteriormente. La figura 2 muestra la expresión y la inmunorreactividad de la PG32 (aa224-391) sintética expresada en la levadura fusionada con GST. En las figuras 2a y 2b, la línea 3 contiene los codones no modificados de P. gingivalis expresados en la levadura, y las líneas 4, 5, 6 y 7 contienen los clones que

40 han tenido sus codones optimizados para la expresión en la levadura como se describió anteriormente. Parece haber cierta expresión e inmunorreactividad mejoradas cuando se emprendió la optimización de codón, como se evidencia por el aumento de la reactividad en las bandas a aproximadamente 48kD (véanse las flechas), especialmente cuando se usó el antisuero para PG32 (figura 2b).

45 Tabla 4. Múltiples iniciadores de oligonucleótidos superpuestos usados para la generación de ADN de PG32C reemplazado con codon de alta predisposición de expresión.

Oligonucleótidos para PG32-C sintética

Oligonucleótido: Secuencia de ADN (5'-3') SEC ID nº

Superposición AC

A (62-mer): GGCTGTTTTGTTCAGATTCGATTCTCACGTTGTT 31

GATAAGGATCAATTGATTAACTTGTACG: 32

Superposición AB

Superposición BD

B (57-mer): GGTTCGTTAGTTTCCTTAACGAATTGAGCAACA 33

TCGTACAAGTTAATCAATTGATCC: 34

Superposición BA

Superposición CE

C (62-mer): CCAGAAGTTACTCCAGTTACTAAGACTGAAAA 35

CATTTTGACTGAAAAGGCTGTTTTGTTCAG: 36

Superposición CA

Superposición DF

D (61-mer): GTATTGAGTGTTACCAGTTGGATCAGCGTAACC 37

AACAACAGTAATTGGTTCGTTAGTTTCC: 38

Superposición DB

Superposición EG

E (60-mer): GAAGTTGAAGAATTGTCTAAGAGACCAGTTTCT 39

TGTCCAGAATGTCCAGAAGTTACTCCA: 40

Superposición EC

Superposición FH

F (62-mer): AACATCAACAACAGCCTTAGCTCTTCTTTCAGA 41

CAACTTTTCGTTGTATTGAGTGTTACCAG: 42

Superposición FD

Superposición GI

G (64-mer): CGCTTTGATTAACGATTTGAACGGTCAAATTAA 43

CAGATTGAGATCTGAAGTTGAAGAATTGTCT: 44

Superposición GE

Superposición HJ

H (64-mer): CCATTCAACAGAAATCAATTCAGATGGAACAC 45

CGTACTTACCAGTCAAAACATCAACAACAGCC: 46

Superposición HF

Superposición IK

I (54-mer): GTGCTGTTGGTTTCAACGCTATTGAACCAATGG 47

ATTACGCTTTGATTAACGATT: 48

Superposición IG

Superposición JL

J (55-mer): CAAGCCTTCTTAGAGAATGGTTGAGTAGAATCA 49

CCCTTCCATTCAACAGAAATCA: 50

Superposición JH

EcoRI

K (54-mer): GATCGAATTCGCTACTGCTGGTTTGAACTTCAG 51

ATTGGGTGCTGTTGGTTTCAA: 52

Superposición KI

NotI

L (55-mer): CTATGCGGCCGCTTAGATCTAACAATAACAAC 53

TCTGTTCCAAGCCTTCTTAGAGA: 54

Superposición LJ

Lista de secuencias

<110> CSL Limitado 5 <120> Proteínas recombinantes y truncamientos de Porphyromonas gingivalis

<130> P34581EP-K/NJL

<140> EP01925217.0

<141> 2001-04-27

<150> AU PQ 7182 10 <151> 2000-04-28

<160> 54

<170> PatentIn Ver. 2.1

<210> 1

<211> 1173 15 <212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 1

<210> 2 20 <211> 1140

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 2

<210> 3

<211> 391

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 3 <210> 4

<211> 380

<212> PRT

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 4

5: <210> 5

<211> 34

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 5

10: cgcagaattc caggagaata ctgtaccggc aacg 34

<210> 6

<211> 35

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

5: <400> 6

ctatgcggcc gccttggagc gaacgattac aacac: 35

<210> 7

<211> 34

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 7

tgcagaattc caagaagcta ctacacagaa caaa: 34

<210> 8

<211> 36

15: <212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 8

ctatgcggcc gcttccgctg cagtcattac ttacaa: 36

<210> 9

<211> 30

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 9

ttttgcggcc gccatcccct ggaatccatt 30

25: <210> 10

<211> 34

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 10

tgcagaattc caagaagcta ctacacagaa caaa: 34

<210> 11

<211> 30

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

35: <400> 11

ttttgcggcc gccattacag ggaagtctgc 30

<210> 12

<211> 28

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 12

ttttgaattc cctttctttg caactcgt 28

<210> 13

<211> 28

45: <212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 13

ttttgaattc ccttatttcg gtactcgt 28

<210> 14

<211> 30

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 14

aaaagcggcc gctttgtgtt ggtagccaac 30

55: <210> 15

<211> 30

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 15

aaaagcggcc gcgaatttat aaccaaatcc 30

<210> 16

<211> 28

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

65: <400> 16

ttttgaattc ttcatcggta gcgaatgg 28

<210> 17

<211> 29

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

5 <400> 17 ttttgcggcc gccaattgat ctttgtcca 29

<210> 18

<211> 27

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 18 ttttgaattc catagcgaaa acgccaa 27

<210> 19

<211> 30 15 <212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 19 ttttgcggcc gcgatacgga agtaaaccac 30

<210> 20

<211> 28

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 20

ttttgaattc gctcactcca atctcaat 28 25 <210> 21

<211> 30

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 21 aaaagcggcc gcctcgttag tttcttttac 30

<210> 22

<211> 28

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

35 <400> 22 ttttgaattc tttgccggaa agatgaac 28

<210> 23

<211> 30

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 23 aaaagcggcc gctgcgttgt tggtcttcgc 30

<210> 24

<211> 32 45 <212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 24 gatcgaattc gctacagcag gtcttaattt cc 32

<210> 25

<211> 33

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 25

gatcgaattc gctacagcag gtctaacgtt caa 33 55 <210> 26

<211> 30

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 26 gatccgaatt cgaatagtgc aaagattgat 30

<210> 27

<211> 32

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

65 <400> 27 gatcgaattc actaagacag aaaatatact ga 32

<210> 28

<211> 30

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

5 <400> 28 ttttgcggcc gcacgattcc aagctttctt 30

<210> 29

<211> 32

<212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 29 gatcgaattc aagaccaaca acgcaccgat ca 32

<210> 30

<211> 30 15 <212> ADN

<213> Porphyromonas gingivalis

<400> 30 ttttgcggcc gcacgattcc aagcgttctc 30

<210> 31

<211> 34

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

25 <400> 31 ggctgttttg ttcagattcg attctcacgt tgtt 34

<210> 32

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

<400> 32

gataaggatc aattgattaa cttgtacg 28 35 <210> 33

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

<400> 33 ggttcgttag tttccttaac gaattgagca aca 33

<210> 34

<211> 24 45 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

<400> 34 tcgtacaagt taatcaattg atcc 24

<210> 35

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 55 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

<400> 35 ccagaagtta ctccaggtac taagactgaa aa 32

<210> 36

<211> 30

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

65 <400> 36 cattttgact gaaaaggctg ttttgttcag 30

<210> 37

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 5 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

<400> 37 gtattgagtg ttaccagttg gatcagcgta acc 33

<210> 38

<211> 28

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

15 <400> 38 aacaacagta attggttcgt tagtttcc 28

<210> 39

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

<400> 39

gaagttgaag aattgtctaa gagaccagtt tct 33 25 <210> 40

<211> 27

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

<400> 40 tgtccagaat gtccagaagt tactcca 27

<210> 41

<211> 33 35 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

<400> 41 aacatcaaca acagccttag ctcttctttc aga 33

<210> 42

<211> 29

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 45 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

<400> 42 caacttttcg ttgtattgag tgttaccag 29

<210> 43

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

55 <400> 43 cgctttgatt aacgatttga acggtcaaat taa 33

<210> 44

<211> 31

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

<400> 44

cagattgaga tctgaagttg aagaattgtc t 31 65 <210> 45

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

5 <400> 45 ccattcaaca gaaatcaatt cagatggaac ac 32

<210> 46

<211> 32

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

<400> 46

cgtacttacc agtcaaaaca tcaacaacag cc 32 15 <210> 47

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

<400> 47 gtgctgttgg tttcaacgct attgaaccaa tgg 33

<210> 48

<211> 21 25 <212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

<400> 48 attacgcttt gattaacgat t 21

<210> 49

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial 35 <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

<400> 49 caagccttct tagagaatgg ttgagtagaa tca 33

<210> 50

<211> 22

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

45 <400> 50 cccttccatt caacagaaat ca 22

<210> 51

<211> 33

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

<400> 51

gatcgaattc gctactgctg gtttgaactt cag 33 55 <210> 52

<211> 21

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

<400> 52 attgggtgct gttggtttca a 21

<210> 53

<211> 32 65 <212> ADN

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

<400> 53

ctatgcggcc gcttagatct aacaataaca ac 32 5 <210> 54

<211> 23

<212> ADN

<213> Secuencia artificial

<220> 10 <223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótidos

<400> 54 tctgttccaa gccttcttag aga 23

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un polipéptido soluble de P. gingivalis que consiste en un polipéptido que tiene una secuencia seleccionada del grupo que consta de los residuos 86 a 223 de la SEC ID nº 3, los residuos 191-322 de la SEC ID nº 3, los residuos

5 224-391 de la SEC ID nº 3, los residuos 213-380 de la SEC ID nº 4, los residuos 224-306 de la SEC ID nº 3, y los residuos 281 a 384 de la SEC ID nº 3, o una variante de dicha secuencia que es capaz de generar una respuesta inmune contra P. gingivalis, en el que el polipéptido soluble no es una proteína de fusión de los residuos 192 a 290 de la adhesina r-Rgp44 de P. gingivalis vinculada a los residuos 286-380 de la SEC ID nº 4.

10 2. Una construcción quimérica o de fusión que comprende un polipéptido soluble de la reivindicación 1.
3. Una molécula aislada de ADN, comprendiendo la molécula de ADN una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido soluble de la reivindicación 1 o de la reivindicación 2.

15 4. Un vector recombinante de expresión que comprende la molécula de ADN de la reivindicación 2, vinculado operativamente a un elemento regulador de la transcripción.
5. Una célula que comprende el vector recombinante de expresión de la reivindicación 4.

20 6. Un método para producir un polipéptido de P. gingivalis, que comprende cultivar la célula de la reivindicación 5 bajo condiciones que permitan la expresión del polipéptido.
7. Una composición para su uso en generar una respuesta inmune dirigida contra P. gingivalis en un sujeto,

comprendiendo la composición una cantidad eficaz de al menos un polipéptido soluble de la reivindicación 1 y/o al 25 menos una molécula de ADN de la reivindicación 3, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
8. Una composición según la reivindicación 7, en la que el vehículo farmacéuticamente aceptable es un adyuvante.
9. Una composición según la reivindicación 7 o la reivindicación 8, para su uso en la reducción o en la prevención de 30 la incidencia o de la gravedad de la infección por P. gingivalis en un sujeto.
10. Un anticuerpo generado y dirigido contra un polipéptido soluble, consistiendo el polipéptido en una secuencia seleccionada del grupo que consta de los residuos 191-322 de la SEC ID nº 3, los residuos 224-391 de la SEC ID nº 3, los residuos 213-380 de la SEC ID nº 4, los residuos 224-306 de la SEC ID nº 3, y los residuos 281-384 de la SEC

35 ID nº 3.
11. Un anticuerpo según la reivindicación 10, que es un anticuerpo monoclonal.
12. Un anticuerpo según la reivindicación 10, que es un anticuerpo policlonal. 40
13.

Una composición que comprende el anticuerpo de las reivindicaciones 10, 11 o 12 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
14.

Un anticuerpo según las reivindicaciones 10, 11 o 12, para su uso en el tratamiento o en la prevención de la

45 infección por P. gingivalis en un sujeto, en el que el anticuerpo se genera y se dirige contra un polipéptido soluble que consiste en una secuencia seleccionada del grupo que consta de los residuos 224 a 391 de la SEC ID nº 3 y los residuos 213-380 de la SEC ID nº 4.
15. Un método de diagnóstico para detectar la presencia o ausencia de un polipéptido de P. gingivalis en una

50 muestra, comprendiendo el método poner en contacto la muestra con el anticuerpo de la reivindicación 10, 11 o 12 bajo condiciones suficientes para que el anticuerpo forme un complejo inmune con un polipéptido de P. gingivalis de la muestra, y detectar la presencia o ausencia de un complejo inmune.
16. Un método de diagnóstico para detectar la presencia o ausencia de un anticuerpo de P. gingivalis en una

55 muestra, comprendiendo el método poner en contacto la muestra con el polipéptido soluble de la reivindicación 1 o con la construcción quimérica o de fusión de la reivindicación 2, bajo condiciones suficientes para que el fragmento soluble del polipéptido forme un complejo inmune con un anticuerpo de la muestra, y detectar la presencia o ausencia de un complejo inmune.

60 17. Un equipo que comprende el polipéptido soluble de la reivindicación 1, o la construcción quimérica o de fusión de la reivindicación 2, y/o el anticuerpo de las reivindicaciones 10, 11 o 12.
18. El uso del polipéptido de la reivindicación 1 para generar un anticuerpo.