ES2423499A1 - Sistema para mejorar la producción de polihidroxialcanoatos (bioplástico) por fermentación a partir de glicerol utilizando una cepa de pseudomonas putida modificada genéticamente. - Google Patents

Abstract

Sistema para mejorar la producción de polihidroxialcanoatos (bioplástico) por fermentación a partir de glicerol utilizando una cepa de pseudomonas putida modificada genéticamente. En la presente invención se describe el diseño y realización de un procedimiento para facilitar la producción de sustancias, y en particular de polihidroxialcanoatos (PHAs), en Pseudomonas putida a partir de glicerol. A tal fin se ha construido una cepa mutante derivada de P. putida portadora de una mutación en el cromosoma del gen glpR que permite que la bacteria pueda utilizar el glicerol como fuente de carbono y energía de una manera más eficiente y por lo tanto permite mejorar la producción de biomasa y de sustancias a partir de glicerol como por ejemplo mejorar la producción de los gránulos de PHA reduciendo a la mitad el tiempo de producción.

Description

SISTEMA PARA MEJORAR LA PRODUCCiÓN DE POLlHIDROXIALCANOATOS (BIOPLÁSTICO) POR FERMENTACiÓN A PARTIR DE GLICEROL UTILIZANDO UNA CEPA DE Pseudomonas pUlida MODIFICADA GENÉTICAMENTE.

SECTOR DE LA TÉCNICA La presente invención se encuadra dentro del Área de la Biotecnologia

Industrial en el sector de la Industria Ouimica, y en particular de la denominada Ouimica Sostenible o Quimica Verde, pudiendo afectar tanto al subsector de las

sustancias químicas primarias como al subsector de las sustancias químicas especializadas. El sistema desarrollado para Pseudomonas pUlida hace que sea aplicable a la producción de cualquier sustancia por fermentación en este microorganismo, pero especialmente para la biosíntesis de polihidroxialcanoatos

(PHAs).

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR La tecnología de los bioprocesos ha experimentado en los últimos años un avance considerable tratando de mejorar y adaptar la moderna biotecnología a las

tecnologias clasicas de fermentación. En este sentido, la tecnologia del DNA

recombinante o, en un concepto más amplio, las técnicas de biología molecular,

han sido determinantes para que podamos explotar y manipular un gran número

de organismos para la producción de sustancias de interés. En gran medida, este éxito ha sido posible gracias al desarrollo de sistemas para expresión de genes en

organismos heterólogos mas faciles de manipular y multiplicar. Dentro de las diferentes opciones que se pueden estud iar, cabe destacar aquéllas que no sólo pretenden la expresión de un gen o conjunto de genes sino que, ademas, tratan de facilitar la obtención de un producto de interés biotecnológico y de alto valor añadido, como es el bioplastico. Sin embargo, el uso de este tipo de biopolimeros no se ha implantado hasta ahora en el mercado de forma competitiva debido al bajo coste que aún mantiene la sintesis de los poli meros plásticos derivados del petróleo (Prieto el al. (2007) Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Model Syslem in Biology. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos,

J. L. Y Filloux, A. Springer. 397-428). Actualmente, como consecuencia del problema de contaminación medioambiental que ha generado el uso del plástico

convencional y el incremento del precio del petróleo, se está haciendo una apuesta clara por la implantación de procesos de tipo sostenible para la obtención de energia y la producción de materiales de alto consumo como son los

biopolimeros plásticos, y en particular los polihidroxialcanoatos (PHAs) (Gavrilescu y Chisti (2005). Biolechn%gy Advances 23: 471-499).

Los PHAs, conocidos comúnmente como "bioplásticos", son polímeros biodegradables producidos por ciertas bacterias, que se acumulan en el interior celular en forma de gránulos de reserva de fuente de carbono cuando las condiciones de cultivo no son óptimas para el crecimiento (revisado en Madison y Huisman (1999) Microbio/. Mo/. Bio/. Rev. 63: 21-53; Prieto el al. (2007) Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Mode/ System in Bi%gy. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. Y Filloux, A. Springer. 397-428). Estos biopolimeros son biodegradables y las bacterias los sintetizan a partir de fuentes renovables como por ejemplo la glucosa, la fructosa o los ácidos grasos que forman parte de los aceites vegetales (Prieto et al. (2007) Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Mode/ System in Bi%gy. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. Y Filloux, A. Springer. 397-428). Por tanto, se puede definir el término bioplástico como biopolímero sintetizado a partir de fuentes renovables, que puede ser biodegradado en condiciones controladas y que presenta características físico-químicas similares a los plásticos derivados de la industria petroleoquimica (Sarasa el al. (2009) Bioresour. Techno/.

100: 3764-3768.).

En general, los gránulos de PHA están compuestos por un poliéster (9397% del peso seco del gránulo (PSG) rodeado por fosfolipidos (1-6% del PSG) y proteinas asociadas al gránulo (GAPs) (1-2% del PSG), las cuales forman una fina capa en la superficie del gránulo (Steinbüchel el al. (1995) Can. J. Microbio/.

41: 94-105). Hasta el momento se han definido tres clases de GAPs en bacterias: i) las PHA sintasas, involucradas en la polimerización del PHA, ii) las PHA despolimerasas, responsables de la degradación del bioplástico y iii) las fasinas, las GAPs más abundantes, con una función estructural o reguladora (Prieto el al. (1999a) App/. Environ. Microbio/. 65: 3265-3271 ; Moldes el al. (2004) App/. Environ. Microbio/. 70: 3205-3212). La presencia de una monocapa fosfolipidica en la superficie del gránulo es consecuente con la naturaleza hidrofóbica del PHA, ya que confiere estabilidad al gránulo inmerso en el ambiente hidrofílico del citoplasma celular (de Smet et al. (1983). J. Bacteriol. 154: 870-878).

Los PHAs se clasifican en dos tipos principales de acuerdo a su estructura quimica: los PHAs de cadena corta (scl-PHAs) obtenidos a partir de monómeros con 4 o 5 átomos de carbono y los de cadena media (mcl-PHAs) procedentes de monómeros con 6 a 14 átomos de carbono. Los diferentes PHAs identificados hasta la fecha son poli meros lineales compuestos de 3-hidroxiácidos grasos exclusivamente de la configuración R. El peso molecular de estos polímeros varía entre 50.000-1.000.000 y su diversidad radica en las sustituciones en el carbono asimétrico en posición 3, que le confiere al polímero el carácter quira l. El biopoliéster está formado únicamente por la forma enantiomérica R de los

hidroxialcanoatos (RHA) (Prieto et al. (1999b) J. Bacteriol. 181: 858-868). Los mcl-PHA producidos por el género Pseudomonas están compuestos

mayoritariamente por monómeros de ácido hidroxioctanoico, pero también se pueden encontrar en menor porcentaje una gran diversidad de monómeros que contienen como sustituyentes grupos aromáticos, alifáticos, insaturados,

saturados, con ramificaciones, etc. (Steinbüchel et al. (1995) Can. J. Microbiol. 41: 94-105; Garcia et al. (1999) J. Biol. Chem. 274: 29228-29241 ; Prieto et al. (2007) Synthesis and degradation of polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Model System in Biology. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. Y Filloux, A. Springer. 397-428). Esto es debido principalmente a la gran diversidad metabólica que

caracteriza a estos microorganismos ya que pueden transformar una gran variedad de sustratos en intermediarios 3-hidroxialcanoicos mediante la ruta de ~

oxidación y de sintesis de novo de ácidos grasos (Madison y Huisman (1999) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63: 21-53; Prieto et al. (2007) Synthesis and degradation 01 polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a Model System in Bio/ogy. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. Y Filloux, A. Springer. 397-428).

Se sabe que la composición del poli mero depende de la fuente de carbono

presente en el medio de cultivo utilizado durante la fermentación de la bacteria

productora (Dumer, et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 72: 278-288; Jung et al. (2001) Biotechnol. Bioeng. 72:19-24). Por otra parte, es importante resaltar que las caracteristicas fisico-quimicas de los polimeros varian según la naturaleza química de los monómeros que los componen (Madison y Huisman (1999) Microbiol. Mol. Bio/. Rev. 63: 21-53; Kessler y Witholt (2001) J. Biotechnol. 86: 97104). Teniendo en cuenta que se han descrito más de 140 RHAs diferentes en PHAs producidos por bacterias (Steinbüchel el al. (1995) Can. J. Microbiol. 41: 94-105; Sudesh et al. (2000) Prag. Polym. Sci. 25: 1503-1555), y que el biopolímero después de su obtención por fermentación puede ser sometido a posteriores modificaciones químicas, como a su entrecruzamiento y a la adición de grupos funcionales (Lageveen el al. (1988) Appl. Enviran. Microbiol. 54: 29242932) es fácil imaginar la gran diversidad de bioplásticos y RHAs diferentes que pueden generarse mediante la combinación de todos estos procesos. Es importante señalar que los PHAs también pueden ser útiles para aplicaciones biomédicas como biomateriales (Zinn el al. (2001) Adv. Drug. Defiv. Rev. 53:5-21). Además, el PHA puede ser considerado como una fuente de nuevos compuestos quirales (sintones) de gran utilidad como precursores en la industria farmacéutica , ya que son difíciles de conseguir en estado puro mediante procesos químicos convencionales.

La bacteria Pseudomonas putida KT2440 es una cepa productora de mcl-PHA que posee unas excelentes características para ser utilizada en la producción de bioplásticos a escala industrial ya que, además de su gran diversidad metabólica, esta bacteria está certificada como bacteria GRAS (Gene rally Recognized As Safe) por la American Food and Drug Administration (FDA) para ser utilizada en procesos biotecnológicos en sistemas confinados (Nelson el al. (2002) Environ Microbiol. 4:799-808).

Se sabe que la bacteria P. pulida KT2440 es capaz de producir mcl-PHA a partir de una gran variedad de fuentes de carbono como por ejemplo, glucosa, fructosa, glicerol, octanoato, succinato y otras (Huijberts el al. (1994) J Bacteriol. 176:1661-6; de Waard el al. (1993) J Biol Chem. 268:315-9; Huijberts el al. (1992) Appl Environ Microbiol. 58:536-44, Escapa el al. (2011) Appl Microbiol Biotechnol. 89:1583-98). W02011 /086211Al describe una cepa bacteriana de P. pUlida KT2440 modificada genéticamente en los genes lol-pal para mejorar el proceso de extracción del PHA

Sin embargo, también se sabe que la velocidad de crecimiento y por lo tanto la producción de mct-PHA en esta bacteria P. pulida KT2440 depende de la fuente de carbono elegida, ya que se ha observado que el crecimiento en atgunas de estas fuentes es muy lento, como por ejemplo sucede utilizando como fuente de carbono el glicerol (Velázquez el al. (2007) J Bacteriol. 189:4529-4533). El

glicerol es una fuente de carbono de gran interés en estos momentos pues como consecuencia de la producción de biodiesel se ha generado una gran cantidad de residuos de glicerol de bajo coste que pueden ser revalorizados a través de la fermentación del mismo y su transformación en productos de mayor valor añadido

como es el mcl-PHA (da Silva et al. (2009) Biotechnol Adv. 27:30-39; Solaiman et al. (2006). Appl Microbiol Biotechnol. 71 :783-789). En algunas de las bacterias que emplean el glicerol como fuente de carbono y energía, el glicerol se meta baliza a través de una serie de etapas que

comprenden: el transporte del glicerol al interior celular, su transformación en

glicerol 3-P (G3P) Y su posterior conversión en dihidroxiacetona fosfato (DHAP),

compuesto intermediario de la glicolisis.

En Pseudomonas el metabolismo del glicerol se ha caracterizado

bioquímicamente en el patógeno humano oportunista Pseudomonas aeruginosa,

bacteria en la que el glicerol puede ser utilizado como una fuente de carbono en

los pulmones (Williams et al. (1994) Microbiology. 140:2961-2969). El primer paso en la asimilación del glicerol en esta bacteria esta mediado por la proteina OprB,

una porina de membrana externa, que sirve para facil itar el paso de estas

sustancias al espacio periplásmico (Williams et al , 1994). Posteriormente para transportar el glicerol al interior de las células se necesita un facilitador del transporte de glicerol (GlpF) y una quinasa de glicerol (GlpK) que convierte el glicerol a G3P (Schweizer et al., (1997) Microbiology. 143:1287-1297). Luego, bajo la acción de la G3P deshidrogenasa (GlpD) asociada a la membrana (Schweizer y Po (1994) J Bacteriol. 176 (8):2184-2193), el G3P se transforma DHAP, que se cataboliza por una rama de la via Entner-Doudoroff (McCowen et al. (1981) Current Microbiology 5 (3):191-196; Cuskey y Phibbs, (1985) J Bacteriol. 162 (3):872-880). Todo este sistema está controlado por un complejo sistema de

proteínas reguladoras del que se conoce aun muy poco. Además, se ha sugerido

que el G3P es probablemente el inductor del sistema en P. aeruginosa (Schweizer y Po, (1996)J Bacteriol. 178 (17):5215-5221).

Por otro lado se ha demostrado que el sistema PTS (sistema de transporte fosfoenolpiruvato (PEP)-carbohidrato fosfotransferasa) de P. putida KT2440 puede influir en el metabolismo del glicerol, ya que algunas mutaciones en este sistema retrasan aún más la fase de latencia en glicerol hasta unas 60 horas o la avanzan un poco hasta unas 24 horas, si bien aún sigue siendo mucho tiempo con respecto a los mejores sustratos (Velázquez el al. (2007) J Bacteriol. 189:4529-4533). Por consiguiente, parece que la regulación del metabolismo del

glicerol en P. pulida es muy compleja, ya que intervienen varios sistemas al mismo tiempo.

En la patente US2009325243A 1 se describe el proceso de producción de amino ácidos a partir de glicerol, mediante fermentación bacteriana a partir de residuos de biodiesel , caracterizado porque el microorganismo empleado para dicha producción es una bacteria Escherichia coli modificada genéticamente para mejorar el metabolismo del glicerol mediante la desactivación del gen glpR. Este documento también cita como posible bacteria productora de amino ácidos a partir de glicerol una cepa de Pseudomonas, pero US2009325243A 1 sólo demuestra el efecto regulador del gen glpR en E. coli. Es ampliamente conocido que los elementos reguladores no funcionan igual en todas las bacterias, de hecho, el papel regulador del gen glpR en Pseudomonas es aún motivo de discusión puesto que existen evidencias contradictorias sobre su papel activador

o represor en el metabolismo bacteriano. Algunos estudios preliminares postulan

el papel de GlpR como regulador positivo en P. aeruginosa (Cuskey y Phibbs, (1985) J Bacteriol. 162 (3):872-880), pero otros sugieren que GlpR es un regulador negativo (Schweizer y Po, (1996) J Bacteriol. 178 (17):5215-5221), de manera análoga a como sucede en E. coli (Zeng y Larson , (1996) J Bacteriol 178 (24):7080-7089). Sin embargo, a diferencia de P. pulida KT2440, E. coli no

presenta una larga fase de latencia cuando crece en un medio de cultivo con glicerol. En este contexto hay que señalar que no se registra en la literatura

ningún dato sobre cómo funciona el gen glpR en P. pulida KT2440 y por consiguiente la incertidumbre sobre el papel de este gen en el metabolismo del glicerol es absoluta.

Se ha comprobado que el crecimiento de P. pUlida KT2440 en glicerol es

especialmente lento dado que en presencia de este sustrato la bacteria presenta una fase de latencia muy larga de casi 40 horas cuando se compara con la fase

de latencia en succinato de apenas 2 horas o de algo menos de 10 horas en glucosa (Velázquez el al. (2007) J Bacteriol. 189:4529-4533). Evidentemente, esto supone que la fermentación en glicerol de P. pulida KT2440 debe extenderse por

encima de las 48 horas de cultivo para poder obtener una biomasa similar a la que se obtiene en presencia de otros sustratos mejores en apenas 10 horas, lo

que sin duda constituye un gran hándicap a la hora de realizar cultivos en glicerol con esta bacteria a escala industrial.

Por lo tanto, actualmente existe la necesidad de desarrollar mediante ingeniería genética un derivado de la bacteria P. pulida KT2440 que presente una fase de latencia muy corta en un medio de cultivo que contenga glicerol como única fuente de carbono y que por consiguiente sea capaz de producir grandes cantidades de biomasa y por añadidura de mcl-PHA en la mitad de tiempo que la cepa salvaje y sin necesidad de añadir ningún estimulador de crecimiento al medio de cultivo.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN La presente invención consiste en el diseño y realización de un procedimiento para mejorar y acortar la producción de cualquier sustancia por

fermentación en Pseudomonas pulida a partir de glicerol y en particular para la producción de polihidroxialcanoatos (PHAs). El procedimiento se fundamenta en la construcción de una cepa mutante de P. pulida que prácticamente elimina la

fase de latencia en glicerol y que por lo tanto reduce de manera muy significativa el tiempo de producción de biomasa.

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN En la presente invención se describe el diseño y realización de un procedimiento para facilitar la producción de sustancias, y en particular de

polihidroxialcanoatos (PHAs), en Pseudomonas pulida a partir de glicerol. A tal fin se ha construido una cepa mutante derivada de P. pulida portadora de una mutación en el cromosoma del gen glpR que permite que la bacteria pueda utilizar el glicerol como fuente de carbono y energia de una manera más eficiente y por lo tanto permite mejorar la producción de biomasa y de sustancias a partir de glicerol

como por ejemplo mejorar la producción de los gránulos de PHA reduciendo a la mitad el tiempo de producción.

Con el fin de diseñar nuevos enfoques biotecnológicos para la producción de PHA a partir de glicerol en P. pulida era necesario también desentrañar cómo estaban reguladas estos procesos de asimilación del glicerol, de los cuales por el momento nada se conocía en esta bacteria. Como ya se ha comentado, en P. pulida el crecimiento en glicerol es especialmente lento cuando se compara con

P. aeruginosa u otras bacterias como E. coli, ya que la P. pUlida entra en una fase de latencia muy larga de unas 24 horas que no se produce en estas otras bacterias. Las razones de esta fase de latencia tan larga eran desconocidas pero una de las posibles explicaciones es que la bacteria necesitase mucho tiempo

para expresar las proteinas de transporte del glicerol o las enzimas

metabolizadoras del mismo. Mediante un rastreo del genoma de P. putida con herramientas bioinformáticas se detectó la existencia de un marco de lectura abierto codificante

de una proteina similar al regulador antes mencionado GlpR lo que podria

significar que esta proteína actuase como regulador de los genes del metabolismo

del glicerol en P. putida. Si esta era la proteina reguladora se podria hipotetizar

que si GlpR actuase como un regulador positivo una sobreexpresión de esta proteína podría favorecer la expresión de los genes del metabolismo del glicerol, en tanto que si se trataba de un regulador negativo, su eliminación podría activar el metabolismo del glicerol y quizás reducir la fase de latencia en uno u otro caso.

Hay que señalar que no se ha demostrado en P. putida que la alteración de este regulador GlpR no mejora ni perjudica el crecimiento en glicerol , ni la fase de

latencia y por lo tanto el hecho de alterarlo en dicha bacteria no era una garantía de éxito para solucionar los problemas de su lento crecimiento. La incertidumbre de esta hipótesis era aun mayor si se tiene en cuenta que tampoco se había

demoslrado la funcionalidad en P. pulida del posible gen regulador (glpR)

localizado mediante técnicas bioinformáticas. Por consiguiente, el efecto en P.

putida de la alteración del regulador GlpR era absolutamente imprevisible y en

esto radica el principal elemento inventivo de la presente invención.

Atendiendo a esta hipótesis se probó en primer lugar el efecto que tendria la eliminación del gen que codifica para el regulador GlpR. Para ello se delecionó el supuesto gen glpR mediante el sistema de intercambio de alelos med iante recombinación homóloga con el plásmido movilizable pK18mobsacB (Schafer et al., (1994) Gene 145 (1):69-73). De esta manera se construyo la cepa mutante P. putida KT40GlpR depositada en la Colección Española de Cullivos Tipo como CECT 8037.

Cuando esta bacteria se cultivo en un medio de cultivo que contenía glicerol como ún ica fuente de carbono y energía se pudo comprobar que las

células comenzaban a crecer sin sufrir el largo periodo de latencia que sufría la

bacteria salvaje y por lo tanto eran capaces de producir en 24 horas la misma

cantidad de biomasa y de PHA que la bacteria salvaje en 48 horas (Figura 1, Tabla 5). Es decir se habia reducido a la mitad el tiempo de fermentación ganado

un día completo en el proceso, lo que supone un incremento enorme en la

eficiencia y por lo tanto una reducción enorme en el coste de la fermentación , dado que se puede producir el doble de PHA en la mima cantidad de tiempo.

Como resultado de la presente invención se describe a modo de ejemplo un procedimiento mediante el cual se puede producir sustancias de interés y en particular de PHA, de forma más rápida y económica a partir de una bacteria

mutante de P. putida cultivada en un medio de cultivo con glicerol como única fuente de carbono y energ ía. La presente invención protege una cepa bacteriana de Pseudomonas

putida KT2440 modificada genéticamente, caracterizada porque mejora la

producción de bioproductos mediante fermentación a partir de glicerol, comparada con la estirpe salvaje, se entiende que dicha estirpe salvaje carece de la citada modificación genética.

En la presente invención, se entiende que "mejora de la producción de bioproductos mediante fermentación a partir de glicerol" se refieren a que la modificación genética de dicha cepa bacteriana de Pseudomonas putida KT2440 facilita el crecimiento de la bacteria cuando usa glicerol como fuente de carbono, acorta el periodo de iniciación del crecimiento y permite la producción de bioproductos utilizando este sustrato como precursor a las 24 horas de crecimiento. Además incrementa la acumulación de bioproductos a las 48 horas de cultivo cuando se compara con la estirpe salvaje. Preferentemente, dichos bioproductos son bioplásticos, más preferentemente dichos bioplásticos son polihidroxialcanoatos (PHAs), y aún más preferentemente, dichos PHAs son mclpolihidroxialcanoatos (mcl-PHAs).

Una realización preferente de la presente invención , hace referencia a la

cepa bacteriana de Pseudomonas putida KT2440 modificada genéticamente

descrita anteriormente, caracterizada porque dicha modificación genética es una mutación en el gen glpR. En la presente invención el gen glpR se encuentra

comprendido en el cluster glp en Pseudomonas putida KT2440 definido por SEO ID No 1, concretamente entre los nucleótidos en las posiciones 2505 y 3260 (SEO ID No 2). Preferentemente, dicha mutación en el gen glpR es una mutación de

pérdida de función, aún más preferentemente dicha mutación de pérdida de función es una deleción, la cual puede ser parcial pero preferentemente total. En la presente invención el término "mutación" se refiere a una es una alteración o cambio en la información genética (genotipo) de un ser vivo y que,

por lo tanto, va a producir un cambio de características, que se presenta súbita y

espontáneamente, y que se puede transmitir o heredar a la descendencia.

En la presente invención el término "mutación de pérdida de función" se refiere a aquellas mutaciones que suelen determinar que la función del gen en cuestión no se pueda llevar a cabo correctamente, por lo que desaparece alguna función del organismo que la presenta.

En la presente invención el término "deleción" se refiere a aquella mutación

que consiste en la pérdida de un fragmento de AON.

En la presente invención el término "deleción parcial del gen glpR' se refiere a la pérdida de un fragmento del gen glpR identificado como SEO ID No 2. Mientras que el término "deleción total del gen glpR' se refiere a la pérdida total del gen glpR identificado como SEO ID No 2.

En otra realización preferente de la presente invención, la cepa bacteriana

de Pseudomonas pulida KT2440 modificada genéticamente descrita

anteriormente se caracteriza por ser la cepa Pseudomonas pulida KT40GlpR , con

número de depósito CECT 8037.

Cepa Pseudomonas pulida KT40GlpR (CECT 8037) La siguientes cepa ha sido depositada el 18 de octubre de 2011 , en la

Colección Española de Cultivos Tiplo (CECT) en el Edificio 3 CUE del parque

científico de la Universidad de Valencia, Catedrático Agustín Escardino n' 9, 46980 Paterna, Valencia (España), por Isabel Fernández Escapa, Centro de Investigaciones Biológicas, CONSE.JO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTíFICAS (CSIC), Calle Ramiro de Maeztu, 9, 28006 (Madrid), ESPAÑA.

El depósito de la cepa depositada cuya referencia es Pseudomonas pulida KT40GlpR, fue recibido por la CECT con el número de acceso CECT 8037

una vez dicha Autoridad Internacional para el Depósito declaró que dicha cepa en cuestión era viable. La presente invención también hace referencia al uso de la cepa bacteriana

de Pseudomonas pUlida KT2440 modificada genéticamente definida

anteriormente, para la producción de bioproductos mediante fermentación a partir

de glicerol. Preferentemente, dichos bioproductos son bioplásticos, más

preferentemente dichos bioplásticos son polihidroxialcanoatos (PHAs), y aún más

preferentemente, dichos PHAs son mcl-polihidroxialcanoatos (mcl-PHAs).

La presente invención también hace referencia a un método de producción

de bioproductos que comprende las siguientes etapas:

a) añadir a un medio con glicerol, la cepa bacteriana de Pseudomonas

pulida KT2440 modificada genéticamente y definida anteriormente, b) fermentación del glicerol y obtención de los bioproductos, preferentemente

dichos bioproductos son bioplásticos, más preferentemente dichos

bioplásticos son polihidroxialcanoatos (PHAs), y aún más preferentemente, dichos PHAs son mcl-polihidroxialcanoatos (mcl-PHAs).

Una realización preferente de la presente invención , hace referencia al método de producción de bioproductos descrito anteriormente, caracterizado porque el medio con glicerol descrito en a) se obtiene de residuos procedentes de la producción de biodiesel.

La presente invención también hace referencia a un bioproducto obtenido mediante fermentación a partir de glicerol, caracterizado porque dicha fermentación la realiza una cepa bacteriana de Pseudomonas pUlida KT2440 modificada genéticamente y definida anteriormente. Preferentemente dicho bioproducto es un bioplástico, más preferentemente dicho bioplástico es un

polihidroxialcanoato (PHA), y aún más preferentemente, dicho PHA es un mclpolihidroxialcanoato (mcl-PHA). Aún más preferentemente, dicho bioproducto obtenido mediante

fermentación a partir de glicerol, se caracteriza para ser usado como biomaterial en aplicaciones biomédicas y/o como fuente de nuevos compuestos quirales como precursores en la industria farmacéutica.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y caracteristicas de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la

presente invención.

DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

FIGURA 1. Perfiles lurbidimélricos (00630) en medio M63 0.1 N de células de P. putida KT2440 (circulas blancos) and P. putida KT40GlpR (circulas negros)

utilizando 40 mM glicerol como fuente de carbono. Los valores representados son

la media (n ~ 6) de los datos de 00630 obtenidos en placas multipocillo.

BIBLIOGRAFíA

Bagdasarian, M., Lurz, R., Ruckert, B., Franklin, F.C., Bagdasarian, M.M., Frey, J., and Timmis, K.N. (1981) Specilic-purpose plasmid cloning vectors. 11. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system lor gene cloning in Pseudomonas. Gene 16: 237-247.

Cuskey SM, Phibbs PV (1985) Chromosomal mapping 01 mutations affecting glycerol and glucose catabolism in Pseudomonas aeruginosa PAO. J Bacteriol 162 (3):872-880

da Silva, G.P. , Mack, M., Contiero, J. (2009). Glycerol: A Promising and Abundant Carbon Source lor Industrial Microbiology. Biotechnology Advances, Vol. 27, No. 1, (January-February 2009), pp. 30-39, ISSN 0734-9750

de Smet, M., Eggink, G., Witholt, B., Kingma, J., Wynberg, H. (1983)

Characterization of intracellular inclusions formed by Pseudomonas oleovorans

during growth on octane. J. Bacteriol. 154: 870-878.

de Waard P, van der Wal H, Huijberts GN, Eggink G. (1993) Heteronuclear NMR analysis 01 unsaturated latty acids in poly(3-hydroxyalkanoates). Study 01 betaoxidation in Pseudomonas pulida. J. Biol. Chem. 268:315-319.

de Waard P, van der Wal H, Huijberts GN, Eggink G. (1993) Heteronuclear NMR analysis 01 unsaturated latty acids in poly(3-hydroxyalkanoates). Study 01 betaoxidation in Pseudomonas pulida. J. Biol. Chem. 268:315-319.

Durner, R., Zinn M., Witholt B., Egli T.. (2001) Accumulation 01 poly[(R)-3hydroxyalkanoates) in Pseudomonas o/eovorans during growth in batch and chemostat culture with different carbon sources. Biotechno/. Bioeng. 72: 278-288.

Escapa IF, Morales V, Martino VP, Pollet E, Avérous l , Garcia Jl, Prieto MA.(2011) Disruption 01 ¡3-oxidation pathway in Pseudomonas putida KT2442 to produce new lunctionalized PHAs with thioester groups. App/ Microbio/ Biotechno/. 89:1583-98

García, B., Olivera, E. R., Minambres, B., Fernández-Valverde, M., Canedo, L. M., Prieto, M. A., Garcia, J. l ., Martinez, M. y luengo, J. M. (1999) Novel biodegradable aromatic plastics lrom a bacterial source. Genetic and biochemical studies on a route 01 the phenylacetyl-CoA catabolon. J. Bio/. Chem. 274: 2922829241.

Gavrilescu, M. Y Chisti Y. (2005) Biotechnology; a sustainable alternative lor chemical industry. Biotechno/. Adv. 23: 471-499.

Herrero, M., de Lorenzo, V., Timmis, K. N. (1990) Transposon vectors containing

non-antibiotic resistance selection markers for cloning and stable chromosomal

insertions 01 loreign genes in Gram negative bacteria. J. Bacterio/172: 6557-6567.

Huijberts GN, de Rijk TC, de Waard P, Eggink G. (1994) 13C nuclear magnetic

resonance studies of Pseudomonas pulida fatty acid metabolic routes involved in

poly(3-hydroxyalkanoate) synthesis. J. Bacterio/. 176:1661-1666.

Huijberts GN, Eggink G, de Waard P, Huisman GW, Witholt B. (1992) Pseudomonas putida KT2442 cultivated on glucose accumulates poly(3hydroxyalkanoates) consisting 01 saturated and unsaturated monomers. App/. Environ. Microbio/. 58:536-544.

Jung, K., Hazenberg W., Prieto MA, Witholt B. (2001) Two-stage continuous process development lor the production 01 medium-chain-Iength poly(3hydroxyalkanoates). Biotechno/. Bioeng. 72:19-24.

Kessler, B., V. de Lorenzo, and K. N. Timmis. 1992. A general system to integrate

lacZ fusions inta the chromosames of gram-negative eubacteria: regulation of the

Pm promoter 01 the TOl plasmid studied with all controlling elements in monocopy. Mol. Gen. Gene!. 233:293-301.

Kessler, B., Witholt, B. (2001) Factors involved in the regulatory network 01 polyhydroxyalkanoate metabolism. J. Biotechno/. 86: 97-104.

Lageveen, R. G., Huisman, G. W., Preusting, H., Ketelaar, P., Eggink, G., Witholt

B. (1988) Formation 01 polyesters by Pseudomonas o/eovorans: Ellect 01 substrates on lormation and composition 01 poly-(R)-3-hydroxyalkanoates and poly-(R)-3-hydroxyalkenoates. App/. Environ. Microbio/. 54: 2924-2932.

Madison, L. L, Huisman, G. W. (1999) Metabolic engineering 01 poly(3hydroxyalkanoates): lrom DNA to plastic. Microbio/. Mo/. Bio/. Rev. 63: 21-53.

McCowen SM, Phibbs PV, Feary TW (1981) Glycerol catabolism in wild-type and mutant strains 01 Pseudomonas aeruginosa. Current Microbiology 5 (3):191-196.

Mermod N., Ramos J. L, Lehrbach , P. R., Timm is K. N. (1986) Vector lor regulated expression of cloned genes in a wide range of gram-negative bacteria.

J. Bacterio/. 167: 447-454.

Moldes, C., García, P., Garcia, J. L , Prieto, M. A. (2004) /n vivo immobilization 01 lusion proteins on bioplastics by the novel tag BioF. App/. Environ. Microbio/. 70: 3205-3212.

Nelson KE, Weinel C, Paulsen IT, Dodson RJ, Hilbert H, Martins dos Santos VA, Fouts DE, Gill SR, Pop M, Holmes M, Brinkac L, Beanan M, DeBoy RT, Daugherty S, Kolonay J, Madupu R, Nelson W, White 0, Peterson J, Khouri H, Hance 1, Chris Lee P, Holtzapple E, Scanlan D, Tran K, Moazzez A, Utterback T, Rizzo M, Lee K, Kosack D, Moestl D, Wedler H, Lauber J, Stjepandic D, Hoheisel J, Straetz M, Heim S, Kiewitz C, Eisen JA, Timmis KN, Düsterh6ft A, Tümmler B, Fraser CM. (2002) Complete genome sequence and comparative analysis 01 the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440Environ. Microbio/. 4:799-808. Erratum in: Environ Microbio/. (2003) 5:630.

Prieto, M. A., Buhler, B., Jung, K., Witholt, B., Kessler, B. (1999b) PhaF, a polyhydroxyalkanoate-granule-associated protein 01 Pseudomonas o/eovorans GP01 involved in the regulatory expression system lor pha genes. J. Bacterio/.

181 : 858-868.

Prieto, M. A, de Eugenio, L l., Galán, B., Luengo, J. M., Witholt, B. (2007) Synthesis and degradation 01 polyhydroxyalkanoates. In Pseudomonas: a mode/ system in biofogy. Pseudomonas, vol. V, Eds, Ramos, J. L. Y Filloux, A. Springer. pp 397-428.

Prieto, M. A., Kellerhals, M. B., Bozzato, G. B., Radnovic, D., Witholt, 8., Kessler,

B. (1999a) Engineering 01 stable recombinant bacteria lor production 01 chiral medium-chain-Iength poly-3-hydroxyalkanoates. App/. Environ. Microbio/. 65: 3265-3271.

Sambrook J, Russell DW (2001) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY

Sarasa, J., Gracia, J. M., Javierre, C. (2009) Study 01 the biodisintegration 01 a bioplastic material waste. Bioresour. Techno/. 100: 3764-3768.

ScMler a, Tauch a, Jager W, Kalinowski J, Thierbach G, Pühler a (1994) Small

mobilizable multi-purpose cloning vectors derived from the EschericMa coli

plasmids pK18 and pK19: selection 01 defined deletions in the chromosome 01 Corynebacterium g/utamicum. Gene 145 (1 ):69-73

Schweizer HP, Jump R, Po C (1997) Structure and gene-polypeptide relationships

of the region encoding glycerol diffusion Pseudomonas aeruginosa. Microbiology

143:1287-1297

Schweizer HP, Po C (1994) Cloning and nucleotide sequence 01 the g/pO gene encoding sn-glycerol-3-phosphate dehydrogenase 01 Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol176 (8):2184-2193

Schweizer HP, Po C (1996) Regulation 01 glycerol metabolism in Pseudomonas aeruginosa: characterization 01 the g/pR repressor gene. J Bacteriol. 178 (17):5215-5221

Solaiman, DKY.; Ashby, R.O., Foglia, T., Marmer, W.N. (2006). Conversion 01 agricultural leedstock and coproducts into poly(hydroxyalkanoates). App/. Microbio/ Biotechno/. 71 :783-789.

Steinbüchel, A., Aerts, K., Babel, W., Follner, C., Liebergesell, M., Madkour, M. H., Mayer, F., Pieper-Furst, U., Pries, A., Valentin, H. E. (1995) Con sideration s on the structure and biochemistry 01 bacterial polyhydroxyalkanoic acid inclusions. Can.

J. Microbio/. 41: 94-105.

Sudesh, K., Abe, H., Doi, Y. (2000) Synthesis, structure and properties 01 polyhydroxyalkanoates: biological polyesters. Prog. Po/ym. Sci. 25:1503-1555.

Velázquez, F., Pflüger, K., Cases, l., De Eugenio, U., de Lorenzo. V. (2007) The phosphotranslerase system lormed by PtsP, PtsO, and PtsN proteins controls production 01 polyhydroxyalkanoates in Pseudomonas putida. J Bacterio/. 189:4529-33.

Williams SG, Greenwood Ja, Jones CW (1994) The eflect 01 nutrient limitation on glycerol uptake and metabolism in continuous cultures 01 Pseudomonas aeruginosa. Microbiology 140:2961-2969

Zeng G, Ye S, Larson TJ (1996) Repressor lor the sn-glycerol 3-phosphate regulon 01 Escherichia coli K-12: primary structure and identilication 01 the DNAbinding domain. J Bacteriol178 (24):7080-7089

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

Ejemplo 1. Descripción de los microorganismos y plásmidos empleados Las cepas de Pseudomonas putida y de Escherichia coli utilizadas en este trabajo se detallan en la Tabla 1, donde también se describen los plásmidos

utilizados en este trabajo y sus características más relevantes.

Tabla l. Cepas )' plásmidos empleados

Strains P. pUlida

Phcnotvpc Rcferellcc

KT2440

P. pulida mt~2 sin plásmido TOL, hsdR. Bagdasarian et al., 1981

KT40GlpR

!:J.glpR KT2440 Este trabajo

E. coli

DHI OB

Donador durante la conj ugación y huésped para la construcción del plásmido pK 18mobsacB-GlpR Invitrogcn

HB IOI Portador del plásmido pKR600 Sambrook and Russell,200 1

Plasmids

pRK600

Cmr ColE loriV RK2 Mob+ Tra+; Kessler er al., 1992

pK 18mobsacB

Km r, ColE oriV, Mob+, lacZa, sacB; Schti fer er al .. 1994

pK 18mobsacB-GlpR

Derivado de pK 18mobsacB utilizado para dclec ionar glpR Este trabajo

Ejemplo 2, Medios y condiciones de cultivo empleados El medio rico utilizado para cultivar las células de E. coli y p, pulida fue el

5 Luria-Bertani (LB) (Sambrook y Russell, (2001) Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbar Laboratory Press, NY), El medio minimo utilizado para cultivar las células fue el medio denominado M63 (13,6 g KH,P04: 2 9 (NH4),S04: 0,5 mg S04Fe 7 H,O por litro, pH 7) (Miller, 1972),

Los cultivos en medio líquido se realizaron en matraces en un agitador 10 orbital (New Brunswick Scientific) a 200 rpm . Las células de E. coli y P. pulida se incubaron a 37'C y 30'C, respectivamente. El crecimiento en medio líquido fue seguido por turbidimetría a 600 nm (00600) empleando un espectrofotómetro Beckman OU-520. Durante periodos inferiores a un mes las cepas se conservaron a 4°C en

15 placas de LB o medio mínimo. Para la conservación a largo plazo, las bacterias se congelaron en el medio de cultivo correspondiente con glicerol al 15% (vlv) y se mantuvieron a -80' C.

Para producir PHA se cultivaron las células de P. pulida KT2440 durante 24 h en medio M63 0.1 N cuya composición es similar a la del M63 pero con 0,2 gIl

20 de (NH4),S04 en lugar de 2 gIl, utilizando 15 mM de octanoato o 40 mM de glicerol como única fuente de carbono y suplementado con 1 mM de MgS04y una solución de elementos traza (Moldes el al. , 2004).

Ejemplo 3, Transformación genética de las células utilizadas

25 Las células de E. colifueron modificadas genéticamente por transformación tras hacerlas competentes mediante el método de RbCI (Sambrook y Russell, (2001) Molecular clon ing: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY), o bien mediante electroporación.

Las células de P. pulida se modificaron genéticamente por transformaron por electroporación. Para electroporar las células de P. pulida se recogieron células en cultivo líquido o masa celular proveniente de placas de agar y se realizaron cinco lavados con agua estéril a 4°C. Las condiciones del equipo de electroporación Gene Pul ser/Pulse Controller (Bio-Rad) fueron 2.5 kV, 25 ~F Y 200 O. En algunas circunstancias los plásmidos se movilizaron a P. putida por conjugación bi-o tri-parental siguiendo el método descrito por de Herrero et al. (1990, J. Baeteriol 172: 6557-6567) y utilizando la cepa E. eo/i HB101 (pRK600) como cepa auxiliar. Los conjugantes de P. pulida fueron seleccionados en placas de medio LB con los correspondientes antibióticos o en placas de medio minimo

con

citrato al 0.2% y el correspondiente antibiótico y sacarosa al 5% para

seleccionar

los conjugantes tras la doble recomb inación del plásmido

pK18mobsacB-GlpR.

Ejemplo 4. Técnicas de manipulación de DNA utilizadas Las técnicas utilizadas para la preparación y manipulación del ONA han

sido descritas por Sambrook y Rusell (2001, Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbar Laboratory Press, NY). Las enzimas de restricción se obtuvieron de Amersham, Takara y New England Biolabs. La enzima T4 DNA ligasa fue proporcionada por USB (Amersham), la DNA polimerasa I de Thermus sp. y la Pfu polimerasa fueron suministradas por Biotools B&M Labs. S. A. Todas

las enzimas se emplearon atendiendo a las especificaciones de las diferentes

casas comerciales. Los fragmentos de DNA se purificaron empleando geles de agarosa, mediante el kit GeneC/ean (BIO 101) o el "High Pure '" PCR Product Purification Kit (Roche).

La extracción de DNA plasmidico se llevó a cabo empleando el sistema High Pure P/asmid Purifieation Kit (Rache), de acuerdo con el protocolo del fabricante.

La extracción de DNA genómico se llevó a cabo empleando el GenomicPrepTM Cells and Tissue DNA Isolation Kit (GE Healthcare) de acuerdo a las instrucciones del fabricante.

La amplificación del DNA se realizó en un equipo Mastereyeler Gradient de Eppendorf. Las mezclas de reacción contenian MgCl, 1.5 mM, dNTPs 0.2 mM, dimetilsulfóxido al 10%, 0.5 unidades de ONA polimerasa, 100 ng de ONA molde y oligonucleótidos a una concentración final de 0.5 ~M. Los fragmentos de ONA se purificaron empleando geles de agarosa, usando el kit GeneC/ean (BIO 101) o el kit "High Pure rn PCR Produc/ Purifica/ion Kit' (Roche). Las secuencias

5 nucleotídicas de 833 y 793 pares de bases, de las zonas 5'y 3'del gen g/pR en Pseudomonas pulida KT2440 que se clonaron para construir el vector pk18mobsacB-GlpR, se identifican respectivamente como SEO ID No 3 y SEO ID N04. Los distintos oligonucleótidos empleados en las reacciones de PCR fueron

10 adquiridos en Sigma-Genosys y se indican en la Tabla 2.

Tabla 2. Oligonucleotidos utilizados

Fragment Nombre Cebador nucleotido secuencia o tamaño Descripción

(bp)

FRI -GlpR -5'

SEQ 10 NO 5

OCTCTAOAOGCCAAOCCAAGAATACCTACOO

FRI -GlpR .)'

SEQ 10 NO 6 CGGGATCCGGGCGGTCCTTTGGGGCTG 833 Clonación de las regiones

FR2· GlpR ·5'

SEQ 10 NO 7 CGGGATCCGGGCTGGTGGGTGCATGC 793 nanqueantes de glpR en pK 18mobSacB

FR2-GlpR -3'

SEQ 10 NO 8

CCCAAOCTTCCTCTACACGTTCGGCGCG

Ejemplo 5, Cuantificación de PHA 15 Para cuantificar el PHA presente en los sedimentos celulares se tomaron

de 5 a 10 mg de muestra liofilizada que se metanolizaron durante 4 h a 100'C en presencia de 2 mi de cloroformo y 2 mi de metanol:ácido sulfúrico (85:15, v:v) con 0,5 mg/ml de 3-MB como estándar interno. Tras enfriar los tubos, se añadió 1 mi de agua, se mezcló por agitación vigorosa (vórtex) y se separaron las fases

20 centrifugando suavemente. La fase orgánica obtenida se analizó en un sistema

cromatográfico compuesto por un cromatógrafo de gases Agilent (Waldbronn, Alemania) serie 7890 A acoplado a un detector de masas 5975. 1 ~I de la fase orgánica fue inyectada en el cromatógrafo con un spIi150:1. La separación de los compuestos se llevó a cabo en una columna capilar HP5 MS

25 (5% fenil-95% metil siloxano, 30 m x 0,25 mm Ld. x 0,25 mm). Como gas portador se utilizó helio a un flujo de 0.9 mi/m in, Las temperaturas del inyector y la linea de transferencia fueron de 275 y 300'C, respectivamente. El programa de

temperatura de la columna fue el siguiente: temperatura inicial 80°C durante 2 min

tras lo cual se aplicó una rampa de 10'C/min hasta alcanzar los 200'C. El espectro de masas se recogió en modo full sean (miz 40-550). El análisis

cuantitativo se llevó a cabo calculando los factores de respuesta de los

monómeros con respecto al 3-MB. Para el cálculo de los factores se utilizaron

mezclas de concentraciones conocidas de PHA, obteniéndose para cada uno de

los monómeros cuantificados un factor de respuesta cuyo coeficiente de variación no superó el 5%.

Ejemplo 6. Construcción de las cepas mutantes de P. pulida KT2440

El gen glpR fue desactivado por intercambio de alelas mediante recombinación homóloga con el plásmido movilizable pK18mobsacB (Schafer el al. , (1994) Gene 145 (1 ):69-73). Las parejas de cebadores de PCR utilizados para esta construcción, así como el tamaño de los fragmentos de PCR, se listan en la Tabla 2. Los fragmentos fueron digeridos con las enzimas de restricción apropiadas y se ligaron con la ligasa de T4, de lo que resulta el correspondiente gen delecionado. Este fragmento fue clonado en los correspondientes sitios únicos de pK18mobsacB para producir el plásmido pK18mobsacB-GlpR (Tabla 1). Este plasmido se utiliza para integrar la mutación en el cromosoma de la cepa receptora mediante recombinación homóloga. La conjugación triparental se realizó siguiendo el protocolo descrito por de Herrero et al. (1990, J. Bacteriol 172: 6557-6567.), utilizando E. cofi DH10B como cepa donante, E. cofi HB101 (pRK600) como cepa ayudante y P. pulida KT2440 como cepa receptora. Las cepas resultantes de este evento de recombinación primero fueron confirmadas por PCR y las colonias seleccionadas se cultivaron en LB durante 6 horas y luego se sembraron en placas de M63 con 10 mM citrato suplementado con 5% de sacarosa. Los transconjugantes resistentes a la kanamicina y sensibles a la sacarosa fueron aislados y el evento de entrecruzamiento segundo fue confirmado por PCR. La cepa mutante resultante se lista en la Tabla 1. La cepa mutante KT40GlpR de la Tabla 1 se ha depositado en la Colección Española de Cultivos Tipo como CECT 8037

Ejemplo 7. Estudio del comportamiento de la cepa P. pulida CECT 8037 en

un medio mínimo con glicerol

Con el objetivo de mejorar las estrategias de fermentación de la cepa P.

putida KT2440 en glicerol con fines biotecnológicos, se comprobaron inicialmente

algunos parámetros de la fermentación como la producción de biomasa, densidad

óptica del cultivo y producción de PHA cuando las células se cultivan durante 48

5 horas en glicerol (20mM) y una de las fuentes de carbono preferidas de esta bacteria como el ácido octanoico (7,5 mM) (Tabla 3).

Tabla 3. Parámetros de crecimiento de cultivos de P. pul ida KT2440 en medio M63 a las 48 horas de crecimiento

Biomasa PHA

Substrato DO...

(g!ll {% ~cso scco~

No dctcctado 20 mM Glicerol 2, 12 0,93

«1%) 7,5 mM Octanoato 2,15 0,97 2 1%

10 A las 48 horas de crecimiento, se observa acumulación de PHA de 21 % en

relación al peso seco incluso cuando no hay limitaciones de nutrientes (como en

el medio M63) lo que no ocurre cuando las células se cultivan en glicerol como fuente de carbono. Esto implica que la biomasa final libre de PHA en las células 15 cultivadas en ácido octanoico es de 0,76 mg/ml. La biomasa total (biomasa del

peso seco sin tener en cuenta la correspondiente al contenido en PHA) producida

a las 48 horas de la fermentación es similar en ambos casos (aproximadamente

0.9 mg/ml). La tasa de crecimiento en las primeras 9 horas es 0,132 h-1 cuando las células se cultivan en ácido octanoico y de 0,058 h-1 cuando el glicerol se

20 utiliza como única fuente de carbono. Además cuando el glicerol es utilizado como fuente de carbono se detecta una fase de latencia con mucho retraso en el inicio

del crecimiento de hasta 15 horas. Estos experimentos indican que la cepa KT2440 puede utilizar el glicerol para producir biomasa en 48 horas sin acumular

PHA, pero el proceso es mucho más lento que cuando se utiliza ácido octanoico 25 como fuente de carbono.

Con el objetivo de analizar el papel del regulador transcripcional GlpR en el metabolismo de glicerol de la cepa P. putida KT2440 , se comparó la capacidad de

utilizar este sustrato como fuente de carbono y como precursor de PHA en la

estirpe salvaje y en la cepa P. putida KT40GlpR (CECT 8037), mutante en el gen 30 glpR. Cuando las bacterias se cultivan en medio M63 0.1 N esta bacteria tiene un

perfil de crecimiento en glicerol similar a la observada en la cepa de tipo salvaje

cuando se cultiva en ácido octanoico en cuanto a la ausencia de fase lag en la

curva de crecimiento. La densidad óptica a 630 nm (D0630nm) del cultivo de la cepa P. pulida KT40GlpR comienza a aumentar a las 2 horas de crecimiento

mientras que la D0630nm de la estirpe salvaje comienza a aumentar a las 13

5 horas (Figura 1). La activación de la ruta de Entner-Doudoroff que indica un

catabolismo activo de glicerol se demostró mediante la determinación de la

enzima gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) a las 6 y 22 horas de crecimiento en la estirpe salvaje y en la mutante CECT 8037 (Tabla 4)

demostrándose que este paso enzimático es activo a las 6 horas en la estirpe

10 mutante, a diferencia de la cepa salvaje, donde se detecta a partir de las 22 horas de cultivo.

Tabla 4. Actividad enzimática gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) (runol

mg-I min-') a las 6 y 22 horas de cultivo

P. pUlida KT2440 P. pl/lida KT40GlpR Tiempo 6h 22 h 6h 22 h

Gliccraldehido-3-fosfato dcshidrogcnasa (GAPDH) Substrato (nmol mg-I min-')

40 mM Glicerol 36±2 525± 16 238±6 88±6

Por último, se analizó la biomasa y contenido de PHA de las dos estirpes tras 24 horas y 48 horas de cultivo determinándose que, a las 24 horas, la estirpe mutante es capaz de acumular 0,9 mg/ml de biomasa y 0,21 mg/ml de PHA mientras que la estirpe sa lvaje produce sólo 0,5 mg/ml de biomasa y no produce

20 PHA. A las 48 horas de cultivo la estirpe mutante es capaz de acumular 1,1 mg/ml de biomasa y 0,3 mg/ml de PHA y la estirpe salvaje produce sólo 0,8 mg/ml de biomasa y 0,1 4 mg de PHA. Este ejemplo demuestra que la mutación en el gen glpR de P. pulida KT2440 facilita el crecimiento de esta bacteria cuando usa glicerol como fuente de carbono, acorta el periodo de iniciación del crecimiento y

25 permite la producción de PHA utilizando este sustrato como precursor a las 24 horas de crecimiento. Además incrementa la acumulación de PHA y biomasa a las 48 horas de cultivo cuando se compara con la estirpe salvaje.

24

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES
2. 1 . Una cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 para la producción de bioproductos a partir de glicerol como única fuente de carbono, caracterizada por que en el gen G/pRcon SEO ID No. 2, comprende un mutación de pérdida de

   función .

3. 2.

   La cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 según la reivindicación 1, caracterizada por que dichos bioproductos son bioplásticos.

4. 3.

   La cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 según la reivindicación 2, caracterizada por que dichos bioplásticos son

   polihidroxialcanoatos.
5. 4. La cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 según la reivindicación 3, caracterizada porque dichos polihidroxialcanoatos son met·

   polihidroxialcanoatos.
6. 5. La cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 según las

   reivindicaciones 1 a 4, caracterizada por que dicha mutación de pérdida de

   lunción es una deleción.
7. 6. La cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 según la

   reivindicación 5, caracterizada por que la deleción es parcial o total.

8. 7.

   La cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 según las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada por que es la cepa Pseudomonas pulida KT 40GlpR, depositada el 18 de octubre de 2011 en la Colección Española de Cultivos Tipo {CECT) y cuya referencia es 8037.

9. 8.

   Uso de la cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 definida en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para la producción de bioproductos

   mediante fermentación a partir de glicerol como única fuente de carbono.

   25

10. 9.

    Uso de la cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 según la reivindicación 8, caracterizada por que dichos bioproductos son bioplásticos_

11. 10.

    Uso de la cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 según la reivindicación 9, caracterizada por que dichos bioplásticos son polihidroxialcanoatos.

12. 11 . Uso de la cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 según la reivindicación 10, caracterizada por que dichos polihidroxialcanoatos son mclpolihidroxialcanoatos.
13. 12. Un método de producción de bioproductos que comprende las siguientes

    elapas: a) añadir a un medio con glicerol como única fuente de carbono, la cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 definida en cualquiera de las

    reivindicaciones 1 a 7,

    b) fermentación del glicerol y obtención de los bioproductos.
14. 13. El método de producción de bioproductos según la reivindicación 12,

    caracterizada por que dichos bioproductos son bioplásticos.
15. 14. El método de producción de bioproductos según la reivindicación 13,

    caracterizada por que dichos bioplásticos son polihidroxialcanoatos.

16. 15.

    El método de producción de bioproductos según la reivindicación 14, caracterizada por que dichos polihidroxialcanoatos son mcl-polihidroxialcanoatos.

17. 16.

    El método de producción de bioproductos según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, caracterizado por que el medio con glicerol como única fuente de carbono descrito en a) se obtiene de residuos de biod iesel.

18. 17.

    Un bioproducto obtenido mediante fermentación a parti r de glicerol como

    única fuente de carbono, caracterizado por que dicha fermentación la realiza una

    26

    cepa bacteriana de Pseudomonas pulida KT2440 definida en cualquiera de las

    reivindicaciones 1 a 7.
19. 18. El bioproducto obtenido mediante fermentación a partir de glicerol como

    5 única fuente de carbono según la reivindicación 17, caracterizado por que dicho bioproducto es un bioplástico.
20. 19. El bioproducto obtenido mediante fermentación a partir de glicerol como

    única fuente de carbono según la reivindicación 18, caracterizado por que dicho 10 bioplástico es un polihidroxialcanoato.
21. 20. El bioproducto obtenido mediante fermentación a partir de glicerol como única fuente de carbono según la reivindicación 19, caracterizado por que dicho

    polihidroxialcanoato es un mct-polihidroxialcanoato. 15
22. 21. El bioproducto obtenido mediante fermentación a partir de glicerol como única fuente de carbono según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, para su uso como biomaterial en aplicaciones biomédicas.

    20 22. El bioproducto obtenido mediante fermentación a partir de glicerol como única

    fuente de carbono según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, para su uso como fuente de nuevos compuestos quirales como precursores en la industria

    farmacéutica.