ES2423482T3

ES2423482T3 - Inhibidores de proteína fosfatasa 1, de GADD34 y del complejo de proteína fosfatasa 1/GADD34, y usos de los mismos combinados con etopósido o mitomicina C

Info

Publication number: ES2423482T3
Application number: ES07803344T
Authority: ES
Inventors: Guido Kroemer; Laurence Zitvogel
Original assignee: Institut Gustave Roussy (IGR); Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut Gustave Roussy (IGR); Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 2006-09-08
Filing date: 2007-09-07
Publication date: 2013-09-20
Anticipated expiration: 2027-09-07
Also published as: JP2010502681A; EP2059233B1; EP2059233A2; US8129340B2; WO2008028965A2; WO2008028965A3; US20100016235A1

Abstract

El uso de un inhibidor de proteína fosfatasa seleccionado de un inhibidor de la subunidad catalítica de la proteínafosfatasa 1 (PP1), un inhibidor de GADD34, y un inhibidor del complejo de PP1/GADD34, en combinación con unproducto utilizado en un tratamiento de un cáncer seleccionado de etopósido o mitomicina C, para preparar unacomposición farmacéutica para prevenir o tratar un cáncer en un mamífero.

Description

Inhibidores de proteína fosfatasa 1, de GADD34 y del complejo de proteína fosfatasa 1/GADD34, y usos de los mismos combinados con etopósido o mitomicina C

Campo de la invención

La presente descripción se refiere a proteínas aisladas y purificadas, tales como calreticulina (CRT), receptor de KDEL y ERp57, así como a cualquier compuesto que permita o potencie la exposición de CRT, del receptor de KDEL y/o de ERp57 en la superficie de una célula moribunda y, así, induce una reacción del sistema inmunológico. Los inventores, en concreto, han descubierto que dichas proteínas y compuestos pueden utilizarse en combinación con un compuesto citotóxico o un inductor de la apoptosis para preparar una composición farmacéutica para prevenir o tratar un cáncer o una infección en un mamífero, en particular para mejorar la eficacia de una terapia, preferiblemente una terapia del cáncer, en un mamífero que lo necesite.

El presente texto describe además kits, métodos para detectar la exposición de CRT, del receptor de KDEL y/o de ERp57 en la superficie de una célula, métodos para seleccionar un compuesto de interés, así como composiciones farmacéuticas.

Antecedentes de la invención

El cáncer es la principal causa de mortalidad en la mayoría de los países industrializados. Pueden utilizarse diferentes modos de tratamiento del cáncer: cirugía, radioterapia, inmunoterapia, hormonoterapia y quimioterapia. Numerosos laboratorios de investigación están realizando trabajos para descubrir mejoras para la terapia del cáncer. La quimoterapia conduce a la muerte celular. Se conocen dos tipos de muerte celular: la apoptosis y la necrosis.

Desde hace tiempo, se ha establecido la hipótesis de que la muerte celular apoptótica sería muy poco inmunogénica (o incluso tolerogénica), mientras que la muerte celular necrótica sería verdaderamente inmunogénica (Bellamy, C.O., Malcomson, R.D., Harrison, D.J. y Wyllie, A.H., Semin. Cancer Biol., 6, 3-16 (1995); Thompson, C.B., Science, 267, 1456-1462 (1995); Igney, F.H. y Krammer, P.H., Nat. Rev. Cancer, 2, 277-288 (2002)).

Se pensaba que esta diferencia era el resultado de la capacidad intrínseca de las células que mueren por una muerte celular no apoptótica para estimular una respuesta inmunológica, por ejemplo, mediante la estimulación de respuestas inflamatorias locales ("señales de peligro") y/o mediante la activación de la maduración de células dendríticas (DC) (Steinman, R.M., Turley, S., Mellman, I. e Inaba, K., J. Exp. Med., 191, 411-416 (2000); Liu, K. et ál., J. Exp. Med., 196, 1091-1097 (2002)).

Por contraste con la necrosis (que se define por una ruptura brusca de la membrana plasmática), la apoptosis está asociada con una serie de alteraciones sutiles en la membrana plasmática que hacen que las células moribundas sean comestibles para las células fagocíticas (Kroemer, G. et ál., Cell Death Differ, 12, 1463-1467 (2005)). Estas señales de "cómeme", que incluyen la adsorción de proteínas solubles del exterior de la célula (tales como C1q y trombospondina) y la translocación de moléculas desde el interior de la célula hacia la superficie (tales como fosfatidilserina, PS, y calreticulina, CRT), así como la supresión de las señales de "no me comas" (tales como CD47) (Savill, J. y Fadok, V., Nature, 407, 784 (2000); Lauber, K., Blumenthal, S.G., Waibel, M. y Wesselborg, S., Mol. Cell., 14, 277-287 (2004); Yoshida, H. et ál., Nature, 437, 754-758 (2005); Gardai, S.J. et ál., Cell, 123, 321-334 (2005); Henson, P.M. y Hume, D.A., Trends Immunol., 27, 244-250 (2006)) suscitan el reconocimiento y la eliminación de las células apoptóticas por fagocitos profesionales y no profesionales. La eliminación subóptima de células apoptóticas puede activar reacciones inmunológicas injustificadas y conducir a una enfermedad autoinmunológica (Hanayama,

R. et ál., Science, 3004, 1147-1150 (2004); Gaipl, U.S. et ál., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 305, 161-176 (2006)).

No obstante, parece que la dicotomía entre la necrosis inmunogénica frente a la apoptosis tolerogénica es una simplificación excesiva. Así, la muerte de células tumorales no programada (necrótica) puede inducir una inmunosupresión local (Vakkila, J. y Lotze, M.T., Nat. Rev. Immunol., 4, 641-648 (2004)). Además, se ha descubierto que la capacidad de las células tumorales apoptóticas para activar una respuesta inmunológica depende del inductor de la apoptosis, lo cual conduce a la identificación de dos subcategorías de la apoptosis morfológicamente indistinguibles, concretamente la apoptosis inmunogénica frente a la no inmunogénica (Casares, N. et ál., J. Exp. Med., 202, 1691-1701 (2005); Blachere, N.E., Darnell, R.B. y Albert, M.L., PLoS Biol., 3, e185 (2005)).

La mayoría de las quimioterapias convencionales inducen una apoptosis no inmunogénica (Zitvogel, L., Casares, N., Pequignot, M., Albert, M.L. y Kroemer, G., Adv. Immunol., 84, 131-179 (2004); Steinman, R.M. y Mellman, I., Science, 305, 197-200 (2004); Lake, R.A. y van der Most, R.G., N. Engl. J. Med., 354, 2503-2504 (2006)). Así, incluso después de una quimioterapia inicialmente eficaz, los pacientes no desarrollan una respuesta inmunológica antitumoral eficaz, y después son vencidos por variantes tumorales resistentes a quimioterapia. Para mejorar la quimioterapia anticáncer, una vía prometedora es la muerte de células cancerosas inmunogénica. En efecto, la inducción de la muerte de células cancerosas inmunogénica debería ser muy interesante, porque el sistema inmunológico puede contribuir, a través de un "efecto espectador", a erradicar las células cancerosas resistentes a quimioterapia y las células precursoras cancerosas (Steinman, R.M. y Mellman, I., Science, 305, 197-200 (2004);

Lake, R.A. y van der Most, R.G., N. Engl. J. Med., 354, 2503-2504 (2006); Zitvogel, L., Tesniere, A. y Kroemer, G., Nat. Rev. Immunol., en imprenta (2006)).

La eficacia de la quimioterapia y la capacidad de respuesta están relacionadas con los fármacos utilizados y con las moléculas implicadas en la quimioterapia. Los principales fármacos utilizados en la quimioterapia antitumoral pueden dividirse en cuatro grupos: agentes citotóxicos, hormonas, moduladores de la respuesta inmunológica, e inhibidores de la actividad tirosina quinasa. Entre los agentes citotóxicos se pueden encontrar antibióticos citotóxicos, tales como antraciclinas (doxorrubicina, idarrubicina, mitoxantrona, que son inductores de la apoptosis). Los inventores han demostrado, por primera vez, que las antraciclinas son capaces de provocar una apoptosis inmunogénica (Casares, N., Pequignot, M.O., Tesniere, A., Ghiringhelli, F., Roux, S., Chaput, N., Schmitt, E., Hamai, A., Hervas-Stubbs, S., Obeid, M., Coutant, F., Métivier, D., Pichard, E., Aucouturier, P., Pierron, G., Garrido, C., Zitvogel, L., y Kroemer, G., J. Exp. Med., 202, 1691-1701 (2005)). En efecto, mientras que la mayoría de los inductores de la apoptosis, incluyendo los agentes que se dirigen al retículo endoplásmico (RE) (tapsigargina, tunicamicina, brefeldina), las mitocondrias (arsenita, ácido betulínico, C2-ceramida) o el ADN (Hoechst 33343, camptotecina, etopósico, mitomicina C), no inducen una apoptosis inmunogénica, las antraciclinas provocan la muerte celular inmunogénica (tal como se muestra en la figura 1B,C). A pesar del creciente cuerpo de investigación, sigue estando abierta la cuestión de cuáles son las circunstancias bajo las que se activa una respuesta inmunológica contra células tumorales moribundas (Zitvogel, L., Casares, N., Pequignot, M., Albert, M.L. y Kroemer, G., Adv. Immunol., 84, 131179 (2004)).

La presente invención se basa en la observación de que las proteínas denominadas calreticulina (CRT), receptor de KDEL (el receptor de KDEL es un receptor de CRT) y ERp57 son expuestas sobre células que sucumben a la muerte celular inmunogénica, pero no aparecen en la superficie de células que sufren una muerte celular no inmunogénica.

La CRT ya ha sido descrita para la modulación de la respuesta hormonal, otra vía de tratar el cáncer. Las proteínas que modulan la transcripción de genes inducida por el receptor de hormonas están presentes en el núcleo de la célula, e inhiben o estimulan la unión de una hormona a su receptor. La invención descrita en la patente US 2003/0060613 A1 presenta una proteína purificada, eficaz en una terapia anticáncer, que se emplea para modular la capacidad de respuesta a hormonas. La patente US 2003/0060613 A1 describe la CRT como una proteína sintética, una proteína mimética de esta, una molécula de ADN que codifica CRT, un método para tratar una enfermedad, tal como cáncer, y un kit que contiene un producto farmacéutico que comprende una de dichas proteínas. La CRT se describe como presente en el retículo endoplásmico o en el núcleo de una célula. La solicitud de patente describe el mecanismo de acción de la CRT nuclear sobre la transcripción de genes.

ERp57 es una proteína luminal del retículo endoplásmico (RE) y es un miembro de la familia de la proteína disulfuro isomerasa (PDI). En contraste con la PDI arquetípica, se sabe que ERp57 interacciona específicamente con glicoproteínas recién sintetizadas, incluyendo CRT. Oliver et ál. (MBC en línea, vol. 10, publicación 8, 2573-2582, agosto de 1999) indican que ERp57 interacciona con la calnexina y la CRT dentro del lumen del RE para modular el plegamiento de glicoproteínas.

La mayoría de las proteínas residentes en el retículo endoplásmico son retenidas en el retículo endoplásmico (RE) mediante un motivo de retención. Este motivo está compuesto por cuatro aminoácidos en el extremo de la secuencia de la proteína. La secuencia de retención más habitual es KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu). Existen tres receptores de KDEL en las células de mamífero, y tienen un grado muy alto de coincidencia de secuencia. El receptor de KDEL (KDEL-R) está presente habitualmente dentro del RE. Los inventores han demostrado que el receptor de KDEL también puede interaccionar con el motivo KDEL de CRT.

Los inventores han identificado, más concretamente, una alteración concreta en la membrana plasmática de células moribundas: la exposición en la superficie de calreticulina (CRT), receptor de KDEL y/o ERp57. Este acontecimiento solo se produce en la muerte de células cancerosas inmunogénica, es decir, en la muerte de células cancerosas que implica una reacción del sistema inmunológico. En la muerte de células cancerosas inmunogénica, el sistema inmunológico participa así en la eliminación de las células moribundas, además de los otros mecanismos de destrucción de células fisiológicos. La CRT exógena, el receptor de KDEL y/o ERp57, o el suministro externo de señales que inducen la exposición de CRT, del receptor de KDEL y/o de ERp57, confiere inmunogenicidad a la muerte celular, por lo demás no inmunogénica, es decir, movilizan y activan al sistema inmunológico, para permitir una quimioterapia anticáncer óptima.

Descripción detallada de la invención

"Muerte celular inmunogénica"

La presente invención se basa en la identificación de la exposición de CRT, del receptor de KDEL y/o de ERp57 como fundamental para inducir una respuesta del sistema inmunológico dirigida contra células moribundas, y traza una nueva estrategia para prevenir o tratar una enfermedad, tal como un cáncer o una infección. La respuesta del sistema inmunológico se denomina en la presente una "respuesta inmunológica anticáncer" cuando se dirige contra células tumorales. La nueva estrategia de tratamiento también se denomina en la presente un "tratamiento

inmunogénico del cáncer", cuando se dirige contra un cáncer.

CRT y/o ERp57 son capaces de inducir una respuesta del sistema inmunológico dirigida contra cualquier célula moribunda, cuando al menos una de ellas está expuesta sobre su superficie. Esta respuesta del sistema inmunológico favorece la destrucción de las células moribundas. Este fenómeno se denomina "muerte celular inmunogénica" o "apoptosis inmunogénica".

Así, los inventores han demostrado en la presente que cuando CRT está expuesta sobre la superficie de células moribundas estimula su destrucción por fagocitos, tales como células dendríticas. Los fagocitos después interaccionan con el sistema inmunológico que, a su vez, es responsable de la respuesta inmunológica.

Los inventores también han demostrado que este efecto se amplifica cuando la CRT está presente en una mayor cantidad sobre la superficie de células moribundas. En la presente, demuestran que la CRT está presente en una mayor cantidad sobre la superficie de la mayoría de las células tumorales que se han puesto en contacto con un inductor de la muerte celular (inductor de la apoptosis).

Los inventores también han descubierto que las cinéticas de la exposición sobre la superficie celular de CRT, del receptor de KDEL (receptor de CRT) y de ERp57 son idénticas, y que las tres proteínas son inducidas por el mismo patrón de estímulos.

En efecto, una doble tinción de inmunofluorescencia ha revelado que CRT, el receptor de KDEL y ERp57 se coinmunolocalizan en gran medida cuando aparecen juntos sobre la superficie de células tratadas con MTX (figura 8 y figura 10). Los inventores han descubierto que los fibroblastos embriónicos de ratón (MEF) que carecen de CRT no exponen ERp57 sobre la superficie después de un tratamiento com MTX. A la inversa, los MEF que carecen de Erp057 no exponen ecto-CRT sobre la superficie después del tratamiento con MTX (no se muestra). En conjunto, estos resultados indican que ERp57 y CRT se translocan juntas hacia la superficie celular, y que la determinación de la exposición en superficie de ERp57 mediante técnicas inmunológicas refleja de modo preciso la exposición en superficie de CRT (ecto-CRT). Por consiguiente, los inventores han descubierto, por ejemplo, que un tratamiento con tautomicina, que también induce la exposición de ecto-CRT (Obeid et ál., Nat. Med., 2007) también estimula la exposición en superficie de ERp57, según se determina mediante tinción de inmunofluorescencia, seguida de un análisis citofluorométrico (figura 9).

La localización o exposición de CRT, receptor de KDEL y/o ERp57 sobre la superficie celular puede ser el resultado de la translocación de CRT intracelular, receptor de KDEL intracelular y/o ERp57 intracelular hacia la superficie celular y/o el resultado de la translocación de CRT extracelular, receptor de KDEL extracelular y/o ERp57 extracelular hacia la superficie celular.

Los inventores también han demostrado en la presente que CRT y ERp57 pueden conferir propiedades inmunogénicas al fenómeno de la apoptosis. El receptor de KDEL también puede conferir propiedades inmunogénicas al fenómeno de la apoptosis.

En la presente descripción, la CRT puede ser una CRT recombinante, una CRT endógena o un mimético o un variante homólogo de esta.

En la presente descripción, la ERp57 puede ser una ERp57 recombinante, una ERp57 endógena o un mimético o un variante homólogo de esta.

En la presente descripción, el receptor de KDEL puede ser un receptor de KDEL recombinante, un receptor de KDEL endógeno o un mimético o un variante homólogo de este.

En la presente descripción, el término "endógeno" significa que CRT, el receptor de KDEL y ERp57 son producidos por la célula, respectivamente, como CRT de tipo salvaje, receptor de KDEL y ERp57 de tipo salvaje. Las proteínas de tipo salvaje deben distinguirse de la CRT recombinante (rCRT), receptor de KDEL recombinante (receptor rKDEL) y ERp57 recombinante (rERp57), cuyas actividades, en particular con respecto al sistema inmunológico, son sustancialmente idénticas, respectivamente, a las de las proteínas de tipo salvaje mencionadas previamente, pero que necesitan de la intervención humana para ser producidas por la célula.

En la presente descripción, la expresión "variante homólogo" se emplea para denominar cualquier proteína de CRT, receptor de KDEL, o ERp57 que comprende un aminoácido o aminoácidos delecionados o sustituidos, por ejemplo, cualquier fragmento de proteína de CRT, receptor de KDEL, o ERp57 de tipo salvaje o recombinante que muestre las propiedades de la correspondiente proteína de tipo salvaje, en particular que sea capaz de inducir una respuesta del sistema inmunológico, por ejemplo, una apoptosis o muerte celular inmunogénica, tal como se ha definido previamente.

En una realización concreta descrita en la presente, CRT, receptor de KDEL y/o ERp57 pueden utilizarse para prevenir o tratar una infección, preferiblemente seleccionada de una infección vírica, bacteriana, fúngica y parasitaria.

En otra realización concreta descrita en la presente, CRT, receptor de KDEL y/o ERp57 pueden utilizarse para prevenir o tratar cualquier tipo de cáncer o neoplasia.

En la presente descripción, el cáncer que se va a tratar es preferiblemente un cáncer que sea sensible a una de las siguientes terapias: (i) una quimioterapia; (ii) una radioterapia; (iii) una hormonoterapia; (iv) una inmunoterapia; (v) una terapia basada en inhibidores de quinasas específicos; (vi) una terapia basada en agentes antiangiogénicos; y

(vii) una terapia basada en anticuerpos, preferiblemente una terapia basada en anticuerpos monoclonales.

Los cánceres sensibles a la quimioterapia se tratan de manera convencional empleando un compuesto, tal como cualquier agente citotóxico o inductor de la muerte celular, en particular un agente genotóxico. En una realización concreta descrita en la presente, el agente citotóxico es un agente quimioterapéutico, seleccionado preferiblemente, por ejemplo, de una antraciclina, un agente antimitótico, un agente intercalante de ADN, un taxano, gemcitabina, etopósido, mitocina C, un agente alquilante, un componente basado en el platino, tal como cisplatino y preferiblemente oxiliplatino, y un ligando de TLR-3.

Una antraciclina preferida puede seleccionarse, por ejemplo, de doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina y mitoxantrona.

Los cánceres sensibles a la radioterapia se tratan de manera convencional utilizando una irradiación seleccionada, por ejemplo, de rayos X, irradiación gamma y/o irradiación UVC.

Los cánceres sensibles a una hormonoterapia, es decir, a una terapia que conduce a la apoptosis o a ligandos Fas o a TRAIL soluble/unido a membrana o TNF-alfa (TNFa) soluble/unido a membrana, se tratan de manera convencional utilizando un compuesto, tal como una antiaromatasa, por ejemplo.

Los cánceres sensibles a una inmunoterapia se tratan de manera convencional utilizando un compuesto seleccionado, por ejemplo, de IL-2, IFN-alfa (IFNa), y una vacuna.

Los cánceres sensibles a una terapia basada en inhibidores de quinasas específicos se tratan de manera convencional utilizando un compuesto seleccionado, por ejemplo, un inhibidor de tirosina quinasa, un inhibidor de serina quinasa, y un inhibidor de treonina quinasa.

Los cánceres sensibles a una terapia basada en anticuerpos, preferiblemente a una terapia basada en anticuerpos monoclonales, se tratan de manera convencional utilizando un anticuerpo específico tal como, por ejemplo, anti-CD20 o anti-Her2/Neu.

La expresión "de manera convencional" significa que la terapia se aplica o, si no se aplica de forma rutinaria, es apropiada y al menos recomendada por las autoridades sanitarias. El tratamiento "convencional" es seleccionado por el oncólogo dependiendo del cáncer específico que se va a prevenir o tratar.

Por tanto, en la presente invención, el cáncer que se va a tratar puede ser, por ejemplo, un cáncer que es sensible al menos a uno de los anteriores productos terapeúticos mencionados, en particular al menos a uno de los siguientes productos: (i) un agente citotóxico; (ii) un inhibidor de quinasas; (iii) un agente antiangiogénico; (vi) un anticuerpo monoclonal.

El cáncer, en la presente invención, se selecciona preferiblemente de un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un cáncer de colon, un cáncer de riñón, un cáncer de pulmón, un osteosarcoma, un GIST, un melanoma, una leucemia y un neuroblastoma.

Un cáncer de mama preferido es un cáncer de mama que se trata de manera convencional con antraciclinas, taxanos, herceptina y/o un ligando de TLR-3.

Un cáncer de próstata preferido es un cáncer de próstata que se trata de manera convencional con antraciclinas y rayos X.

Un cáncer de colon preferido es un cáncer de colon que se trata de manera convencional con oxaliplatino.

Un cáncer de riñón preferido es un cáncer de riñón que se trata de manera convencional con citoquinas o fármacos antiangiogénicos (sorafenib).

Un cáncer de pulmón preferido es un cáncer de pulmón que se trata de manera convencional con rayos X y platino.

Un osteosarcoma preferido y un GIST preferido son, respectivamente, un osteosarcoma y un GIST que se tratan de manera convencional con antraciclinas y/o Glivec.

Un melanoma preferido es un melanoma que se trata de manera convencional con electroquimioterapia o perfusión de extremidades aislada de altas dosis de TNF-alfa.

La célula tumoral mencionada en la presente invención se selecciona preferiblemente de un carcinoma, un sarcoma,

un linfoma, un melanoma, un tumor pediátrico y un tumor leucémico.

Los inventores han descubierto en la presente invención que si las células tumorales del paciente no exponen de modo espontáneo CRT, receptor de KDEL y/o ERp57 sobre su superficie, es necesario administrar un tratamiento adicional a dicho paciente para favorecer una reacción del sistema inmunológico contra dichas células tumorales. La exposición puede observarse o determinarse antes o después de la administración de cualquier terapia convencional, según se ha descrito previamente. La exposición espontánea de CRT, receptor de KDEL y/o ERp57 sobre la superficie de una célula tumoral se observa preferiblemente después de la administración de dicha terapia convencional apropiada. De nuevo, dicha terapia convencional depende directamente de la naturaleza del tumor.

El tratamiento adicional mencionado anteriormente puede ser, tal como se describe en la presente, un suministro exógeno de CRT, receptor de KDEL y/o ERp57 y/o la administración de un compuesto que permite o potencia la exposición de CRT, del receptor de KDEL y/o de ERp57 sobre la superficie de una célula tumoral (tal como un inhibidor de PP1/GADD34, tal como se explica a continuación), preferiblemente junto con un agente terapéutico convencional utilizado en un tratamiento, tal como se describió anteriormente (para obtener un efecto sinérgico), siendo seleccionado con facilidad dicho tratamiento convencional por el oncólogo, según se ha ejemplificado previamente, según la naturaleza del cáncer que se va a prevenir o tratar.

Tal como se indicó previamente, un objeto descrito en la presente es, por tanto, el uso de CRT, del receptor de KDEL y/o de ERp57 para preparar una composición farmacéutica prevista preferiblemente para la administración en combinación con un producto utilizado en un tratamiento del cáncer, en particular, en un tratamiento convencional del cáncer, tal como se mencionó previamente, para prevenir o tratar un cáncer, según se definió anteriormente, en un mamífero, preferiblemente en un ser humano.

La composición farmacéutica se administra preferiblemente durante y/o después del tratamiento mencionado anteriormente del cáncer.

Otro objeto en la presente describe el uso de CRT, del receptor de KDEL y/o de ERp57 para preparar una composición farmacéutica para prevenir o tratar una infección, según se definió anteriormente, en un mamífero, preferiblemente en un ser humano.

En la presente también se describe un método para seleccionar un compuesto que es capaz de modificar la actividad del sistema inmunológico hacia una célula, comprendiendo dicho método una etapa de detectar y/o medir el nivel de exposición de CRT, del receptor de KDEL y/o de ERp57 en la superficie de la célula en presencia de un compuesto de ensayo, en el que una exposición modificada, comparada con una célula control que no ha sido expuesta o no se ha puesto en contacto con el compuesto de ensayo, es indicativa de la capacidad de dicho compuesto para modificar la actividad del sistema inmunológico hacia dicha célula.

Otro objeto descrito en la presente es el uso de cualquier compuesto o agente terapéutico que permita o potencie la exposición de CRT, del receptor de KDEL y/o de ERp57 en la superficie de una célula moribunda, en particular una célula tumoral, para preparar una composición farmacéutica para prevenir o tratar un cáncer o una infección en un mamífero, preferiblemente en un ser humano. Esta composición farmacéutica está prevista preferiblemente para su administración en combinación con un tratamiento del cáncer, y, tal como previamente se ha explicado, preferiblemente con un tratamiento que, de modo natural, no induce la exposición de CRT y/o ERp57 sobre la superficie de la célula tumoral.

Aunque diferentes agentes quimioterapéuticos pueden matar células tumorales a través de una vía apoptótica aparentemente homogénea, se diferencian en su capacidad para estimular la muerte celular inmunogénica. Así, los inventores han descubierto que las antraciclinas y la irradación gamma provocan la muerte celular inmunogénica e inducen la exposición de CRT y/o ERp57 sobre la superficie de células tumorales (denominadas en la presente, respectivamente, ecto-CRT y ecto-ERp57), mientras que otros agentes proapoptóticos que inducen la muerte célular no inmunogénica (tales como mitomicina C y etopósido) no inducen ecto-CRT y/o ecto-ERp57. La reducción de la cantidad de CRT y/o ERp57 suprime la inmunogenicidad de la muerte celular provocada por las antraciclinas, mientras que el suministro exógeno de CRT y/o ERp57 o el refuerzo de la exposición de CRT y/o ERp57 por agentes farmacológicos que favorecen la translocación de CRT y/o ERp57 hacia la superficie de las células tumorales puede inducir una reacción del sistema inmunológico dirigida contra las células tumorales, es decir, puede potenciar la inmunogenicidad de la muerte celular.

Se sabe que la exposición de CRT es inducida por luz UVC (Gardai, S.J. et ál., Cell, 123, 321-334 (2005)). Los inventores ahora demuestran que la exposición de CRT también es activada por antraciclinas (tal como se muestra en la figura 2) e inhibidores de PP1/GADD34 (tal como se muestra en la figura 5), e implica la translocación de CRT intracelular hacia la superficie celular a través de un mecanismo molecular que implica un KDEL concreto y que, de modo similar, implica la presencia de otros receptores de CRT saturables (Henson, P.M. y Hume, D.A., Trends Immunol., 27, 244-250 (2006)) sobre la superficie celular, que pueden unirse a CRT exógena así como a CRT endógena preformada.

Los inventores demuestran en la presente que esta proteína de CRT es fuertemente inducida (en un factor de 6) por

la doxorrubicina y las antraciclinas en general (tal como se muestra en las figuras 2B y 2C). Unos análisis de inmunotransferencia de geles bidimensionales (no se muestran) y una electroforesis convencional de las proteínas de la superficie de membranas plasmáticas purificadas (tal como se muestra en la figura 2C) confirman la exposición en la superficie de CRT después de un tratamiento con antraciclinas. Esta exposición sobre la superficie de CRT también es detectable mediante tinción de inmunofluorescencia de células vivas tratadas con antraciclinas (tal como se muestra en la figura 2D). La inducción de la exposición de CRT por antraciclinas es un proceso rápido, detectable tan pronto como una hora después del tratamiento (tal como se muestra en la figura 1S A,B) y, así, precede a la exposición de fosfatidilserina (PS) asociada a la apoptosis (tal como se muestra en la figura 1S C,D). Debe notarse que se produjo una fuerte correlación lineal positiva (p<0,001) entre la aparición de CRT en la superficie celular (medida a las cuatro horas) y la inmunogenicidad provocada por el panel de 20 inductores de la apoptosis diferentes (figura 2E).

La inmunogenicidad y la respuesta inmunológica pueden ser mediadas por células específicas, tales como células dendríticas (DC). Los inventores han demostrado que las células tumorales tratadas con antraciclinas adquieren la propiedad de ser fagocitadas por DC unas pocas horas después del tratamiento con doxorrubicina o mitoxantrona (tal como se muestra en la figura 3A, figura 2A suplementaria), que se correlaciona con la inducción rápida de CRT (tal como se muestra en la figura 3B, figura 1S A,B) y la adquisición de inmunogenicidad (tal como se muestra en la figura 2B suplementaria).

En respuesta a la antraciclina mitoxantrona (MTX), una diversidad de líneas de células tumorales exponen CRT y/o ERp57 sobre la superficie de sus células. CRT y ERp57 solo se encuentran habitualmente dentro de la célula, casi siempre asociadas con el retículo endoplásmico. Sin embargo, después de una exposición corta a antraciclinas (5 min o más), puede detectarse CRT y/o ERp57 sobre la superficie de las células tumorales utilizando métodos de tinción de inmunofluorescencia aplicados a células no fijadas (figura 7A y 7B). Se obtienen resultados muy similares tras la irradiación de rayos gamma o radiación UVC o exposición a otras antraciclinas seleccionadas de idarrubicina, daunorrubicina o doxorrubicina.

Por consiguiente, el bloqueo de la CRT presente sobre la superficie de células cancerosas tratadas con mitoxantrona por medio de un anticuerpo específico inhibe su fagocitosis por DC (tal como se muestra en la figura 3C). A la inversa, la adición de una proteína de CRT recombinante (rCRT), que se une a la superficie de las células, revierte el defecto inducido por los anticuerpos. Por tanto, ecto-CRT (CRT expuesta sobre la superficie de las células) provoca la fagocitosis de dichas células por DC. Además, la adsorción de rCRT a la superficie de la membrana plasmática potencia en gran medida la inmunogenicidad de células que habitualmente no inducen una respuesta inmunológica, tales como células tratadas con mitomicina (tal como se muestra en la figura 4C) o células tratadas con etopósido revestidas con rCRT, y provoca una vigorosa respuesta inmunológica antitumoral in vivo (tal como se muestra en la figura 4D). Sin embargo, la adsorción de rCRT sobre la superficie celular sin un tratamiento anterior con un inductor de la muerte celular no provoca una respuesta inmunológica anticáncer.

Los inventores han observado que la exposición de CRT inducida por antraciclinas e inhibidores de PP1/GADD34 fue suprimida por latrunculina A, un inhibidor del citoesqueleto de actina (tal como se muestra en la figura 4 suplementaria). Han demostrado que la inhibición de PP1/GADD34 induce la exposición de CRT, y tambien que esta inhibición puede mejorar la respuesta inmunológica antitumoral, así como los efectos antitumorales mediados por terapias convencionales, en particular quimioterapias, que no son eficaces cuando se utilizan en ausencia de dicha inhibición de PP1/GADD34.

Los inventores han descubierto que CRT, el receptor de KDEL y/o ERp57, así como cualquier compuesto o agente terapéutico que permita o potencie la exposición de CRT, del receptor de KDEL y/o de ERp57 en la superficie de una célula tumoral, son capaces de mejorar la eficacia de una terapia del cáncer, en particular de una terapia convencional, tal como se describió anteriormente, en un mamífero que lo necesita, mediante la inducción de la exposicion, preferiblemente una mayor exposición de CRT, del receptor de KDEL y/o de ERp57 sobre la superficie de la célula tumoral, siendo responsable dicha exposición de la inducción de una apoptosis inmunogénica.

Un compuesto o agente terapéutico que permita o potencie la exposición de CRT, del receptor de KDEL y/o de ERp57 en la superficie de una célula tumoral puede ser un agente citotóxico o un inductor de la muerte celular, tal como se ha descrito previamente.

Un compuesto o agente terapéutico preferido que permita o potencie la exposición de CRT, del receptor de KDEL y/o de ERp57 en la superficie de una célula tumoral puede seleccionarse de (i) CRT, (ii) receptor de KDEL, (iii) ERp57, (iv) un inhibidor de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1), (v) un inhibidor de la subunidad reguladora 15A de la proteína fosfatasa 1 (GADD34), (vi) un inhibidor del complejo de PP1/GADD34, y (vii) una antraciclina.

Un inhibidor preferido de la subunidad catalítica de PP1 puede seleccionarse, por ejemplo, de tautomicina, caliculina A y un ARNmc apropiado (es decir, un ARNmc que inhiba la traducción de PP1 o GADD34).

Un inhibidor del complejo de PP1/GADD34 preferido puede seleccionarse, por ejemplo, de salubrinal y péptidos concretos, tal como se explica a continuación.

Por tanto, el presente texto describe el uso de al menos un compuesto seleccionado de (i) CRT, (ii) receptor de KDEL, (iii) ERp57, (iv) un inhibidor de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1), (v) un inhibidor de la subunidad reguladora 15A de la proteína fosfatasa 1 (GADD34), (vi) un inhibidor del complejo de PP1/GADD34, y

(vii) una antraciclina, para preparar una composición farmacéutica para prevenir o tratar un cáncer o una infección, según se ha definido previamente en la presente solicitud, en un mamífero, en particular en un ser humano. La composición farmacéutica prevista para prevenir o tratar un cáncer está prevista preferiblemente para ser administrada con un producto utilizado en un tratamiento del cáncer, según se ha explicado previamente.

La presentre solicitud describe a continuación otros compuestos que permiten o potencian la exposición de de CRT, del receptor de KDEL y/o de ERp57 en la superficie de una célula moribunda, en particular de una célula tumoral.

Inhibidores de proteína fosfatasa

La presente solicitud se refiere, en concreto, al uso de un inhibidor de proteína fosfatasa seleccionado de un inhibidor de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1), un inhibidor de GADD34 y un inhibidor del complejo de PP1/GADD34, para preparar una composición farmacéutica para prevenir o tratar un cáncer en un mamífero, en el que la composición farmacéutica está prevista para la administración en combinación con un producto utilizado en un tratamiento de un cáncer.

El inhibidor de proteína fosfatasa se selecciona preferiblemente de:

-: un inhibidor de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1), que puede seleccionarse, por ejemplo, de tautomicina, caliculina A y un ARNmc apropiado (es decir, un ARNmc que inhibala traducción de PP1),

-: un inhibidor de GADD34, tal como un ARNmc apropiado (es decir, un ARNmc que inhiba la traducción de GADD34), y

-: un inhibidor del complejo de PP1/GADD34, tal como salubrinal o un péptido tal como se describe a continuación, en particular un péptido en forma de un fragmento de GADD23, tal como se describe a continuación.

La composición farmacéutica está prevista preferiblemente para ser utilizada en combinación con un producto terapéutico, tal como se describió anteriormente, que puede utilizarse en un tratamiento terapéutico convencional del cáncer, en particular con un producto o agente quimioterapéutico, preferiblemente con un agente quimioterapéutico que no induce, de forma natural, la exposición de CRT y/o ERp57 sobre la superficie de una célula tumoral.

En la presente también se describe un inhibidor de proteína fosfatasa seleccionado de un inhibidor de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1), un inhibidor de GADD34 y un inhibidor del complejo de PP1/GADD34, en combinación con un producto utilizado en un tratamiento de un cáncer, para prevenir o tratar un cáncer en un mamífero.

En efecto, los inventores demuestran en la presente que las proteína fosfatasas tienen un espectro catalítico más amplio que las quinasas. En efecto, la especificidad de las fosfatasas aumenta mediante su interacción no covalente con cofactores no catalíticos que determinan el reconocimiento del sustrato. Los inventores han estudiado más en concreto la proteína fosfatasa 1 (PP1) y su subunidad GADD34. Han descubierto, de modo sorprendente, que la inhibición de PP1, GADD34 o su complejo (PP1/GADD34) induce una mayor localización de CRT y/o ERp47 en la superficie celular (tal como se muestra en la figura 5 para CRT).

La presente descripción se refiere al uso de cualquiera de los inhibidores de proteína fosfatasa mencionadas anteriormente, para preparar una composición farmacéutica prevista para ser utilizada en combinación con un producto terapéutico, preferiblemente utilizado en un tratamiento convencional del cáncer, en particular en una quimioterapia, para prevenir o tratar un cáncer (tal como se definió previamente), en un mamífero, en particular en un ser humano.

Una composición farmacéutica particular descrita en la presente comprende un inhibidor de proteína fosfatasa seleccionado de un inhibidor de PP1, un inhibidor de GADD34 y un inhibidor del complejo de PP1/GADD34, en asociación con un excipiento o diluyente farmacéuticamente aceptable.

Esta composición farmacéutica está prevista preferiblemente para su administración en combinación con un producto utilizado en un tratamiento del cáncer, por las razones explicadas previamente.

La presente descripción también se refiere al uso de cualquiera de los inhibidores de proteína fosfatasa mencionados anteriormente para preparar una composición farmacéutica para prevenir o tratar una enfermedad infecciosa, tal como se ha descrito previamente, en un mamífero, en particular en un ser humano. La composición farmacéutica preferiblemente comprende además un producto utilizado en un tratamiento de un cáncer, tal como se definió previamente, preferiblemente en una quimioterapia, tal como se definió previamente.

Un inhibidor de proteína fosfatasa concreto de la presente invención puede seleccionarse de tautomicina, caliculina A, salubrinal, ARNmc apropiado (tal como se definió previamente), e inhibidores peptídicos del complejo PP1/GADD34 descritos a continuación.

Inhibidores peptídicos de PP1/GADD34

Otro inhibidor de proteína fosfatasa descrito en la presente es un péptido que consiste o comprende un fragmento de GADD34, en el que dicho péptido inhibe la formación o la actividad del complejo de PP1/GADD34 en una célula, o un variante homólogo de este que comprende un aminoácido o aminoácidos sustituidos que no afectan a su capacidad para inhibir la formación o la actividad del complejo de PP1/GADD34.

En el sentido de la presente invención, un péptido que inhibe la formación del complejo de PP1/GADD34 es un péptido capaz de competir con GADD34 para formar un complejo con PP1 y, así, hacer que dicho complejo no sea funcional, es decir, no sea capaz de ser expresado sobre la superficie de una célula y después inducir una reacción del sistema inmunológico.

En el sentido de la presente invención, un péptido que inhibe la actividad del complejo de PP1/GADD34 es un péptido que es responsable para la no expresión de dicho complejo sobre la superficie de una célula y/o para la no inducción de una reacción del sistema inmunológico o para una menor reacción del sistema inmunológico comparado con su reacción en ausencia de dicho péptido.

El fragmento, tal como se mencionó previamente, de GADD34 preferiblemente es un fragmento de SEQ ID NO:1 (GADD34 humana), es decir, mapgqaphqa tpwrdahpff llspvmglls rawsrlrglg plepwlveav kgaalveagl egeartplai phtpwgrrpg eeaedsggpg edretlglkt ssslpeawgl lddddgmyge reatsvprgq gsqfadgqra plspsllirt lqgsdknpge ekaeeegvae eegvnkfsyp pshreccpav eeeddeeavk keahrtstsa lspgskpstw vscpgeeenq atedkrters kgarktsvsp rssgsdprsw eyrsgeasee keekaheetg kgeaapgpqs sapaqrpqlk swwcqpsdee esevkplgaa ekdgeaecpp cipppsaflk awvywpgedt eeeedeeede dsdsgsdeee geaeassstp atgvflkswv yqpgedteee ededsdtgsa edereaetsa stppasaflk awvyrpgedt eeeededvds edkeddseaa lgeaesdphp shpdqsahfr gwgyrpgket eeeeaaedwg eaepcpfrva iyvpgekppp pwapprlplr lqrrlkrpet pthdpdpetp lkarkvrfse kvtvhflavw agpaqaarqg pweqlardrs rfarriaqaq eelspcltpa ararawarlr npplapipal tqtlpsssvp sspvqttpls qavatpsrss aaaaaaldls grrg.

El fragmento de GADD34 está comprendido preferiblemente entre las posiciones de los aminoácidos 500 y 600, preferiblemente entre las posiciones de los aminoácidos 530 y 580, aún más preferiblemente entre las posiciones 540 y 570, en particular entre las posiciones 550 y 565, preferiblemente entre las posiciones 551 y 562 de SEQ ID NO:1.

La secuencia del fragmento de GADD34 comprende preferiblemente entre 5 y 35 aminoácidos, preferiblemente entre 10 y 35 aminoácidos, aún más preferiblemente entre 5 y 15 aminoácidos de SEQ ID NO:1.

En una realización preferida, el inhibidor del complejo de PP1/GADD34 es un fragmento de GADD34 que consiste en una secuencia que comprende entre 5 y 35 aminoácidos de SEQ ID NO:1.

Un péptido particularmente preferido según la presente invención comprende la siguiente secuencia: LKARKVRFSEKV (SEQ ID NO:2), que es un fragmento de GADD34.

El péptido mencionado anteriormente según la invención puede comprender también un motivo de translocación a la membrana plasmática que es capaz de unirse a la membrana plasmática sobre la superficie de una célula. Este motivo puede utilizarse para dirigir el péptido según la invención a una célula diana, por ejemplo, una célula tumoral

o una célula infectada, si es necesario.

La célula tumoral diana preferiblemente es de un carcinoma, un sarcoma, un linfoma, un melanoma, un tumor pediátrico o un tumor leucémico.

Un motivo de translocación que puede utilizarse en la presente invención para dirigirse a una célula tumoral comprende la siguiente secuencia: VKKKKIKREIKI (SEQ ID NO:3), que es una secuencia de DPT-sh1 N-terminal.

Un péptido concreto según la invención comprende la siguiente secuencia: VKKKKIKREIKI-LKARKVRFSEKV (SEQ ID NO:4), que incluye un fragmento de GADD34 y un motivo de translocación.

Este péptido se ha ensayado para su capacidad para estimular la exposición de CRT (ecto-CRT), el receptor de KDEL y/o ERp57 (ecto-ERp57) sobre la superficie de células, lo cual es, tal como se ha explicado previamente, una de las rápidas consecuencias bioquímicas de la inhibición de PP1/GADD34.

Tal como se refleja en las figuras 7A y 7B, el péptido descrito anteriormente que comprende SEQ ID NO:4 es capaz de inducir la exposición de calreticulina (según se mide mediante tinción de inmunofluorescencia de las células, seguida de un análisis citofluorométrico) en dos líneas celulares diferentes, concretamente células de cáncer de colon HCT116 y células de cáncer de colon CT26 murino. Se obtuvieron resultados similares con células HeLa y fibroblastos embrionarios de ratón (no se muestran). Como control interno, los inventores generaron un péptido

mutante (secuencia completa: VKKKKIKREIKI-lkaravafsekv), en el que dos aminoácidos de la secuencia derivada de GADD34 han sido reemplazados por alaninas. Este péptido control mutante no induce la exposición de calreticulina, lo cual confirma la especificidad de la reacción.

También se describe en la presente un método, de modo ventajoso un método in vitro, para seleccionar un péptido, según se definió anteriormente, capaz de inhibir la formación o la actividad del complejo de PP1/GADD34 en una célula. Este método comprende las etapas de:

a) proporcionar un péptido de ensayo que comprende un fragmento de secuencia dentro de SEQ ID NO:1, o un fragmento homólogo de este,

b) poner en contacto el péptido de ensayo de la etapa a) con la célula, y

c) detectar y/o medir el nivel de exposición de la calreticulina (CRT), del receptor de KDEL y/o de ERp57 sobre la superficie de dicha célula, en el que una mayor exposición, en comparación con una célula control que no se ha puesto en contacto o no se ha expuesto al péptido de ensayo, o que se ha puesto en contacto o se ha expuesto a un mutante de dicho péptido de ensayo, es indicativa de una inhibición de la formación o la actividad del complejo de PP1/GADD34 en la célula.

El fragmento de secuencia de la etapa a) se selecciona del interior de SEQ ID NO:1. Dicha secuencia está comprendida preferiblemente entre las posiciones de los aminoácidos 500 y 600, preferiblemente entre las posiciones 530 y 580, aún más preferiblemente entre las posiciones 540 y 570, en particular entre las posiciones 550 y 565, preferiblemente entre las posiciones 551 y 562 de SEQ ID NO:1, tal como se describió anteriormente.

Tal como se describió anteriormente, el fragmento de secuencia seleccionado del interior de SEQ ID NO:1 comprende preferiblemente entre 5 y 35 aminoácidos, preferiblemente entre 10 y 35 aminoácidos, aún más preferiblemente entre 5 y 15 aminoácidos de SEQ ID NO:1.

La presente descripción proporciona también un método para mejorar la actividad del péptido seleccionado con un método, según se describió anteriormente, que comprende la etapa de sustituir al menos un aminoácido por un aminoácido diferente que potencia la capacidad de la secuencia para inhibir la formación o la actividad del complejo de PP1/GADD34.

Dicho al menos un aminoácido diferente que potencia la capacidad de la secuencia para inhibir la formación o la actividad del complejo de PP1/GADD34 puede ser cualquier aminoácido (i) que proporcione al péptido una mayor resistencia frente a enzimas, tales como peptidasas o proteasas, (ii) que mejore la biodisponibilidad del péptido y/o

(iii) que potencie su función inhibidora contra la formación o la actividad del complejo de PP1/GADD34.

Los expertos en la técnica conocen varios métodos que pueden utilizarse para detectar CRT, el receptor de KDEL y/o ERp37 sobre la superficie celular.

Para detectar CRT, el receptor de KDEL y/o ERp37 sobre la superficie celular puede aplicarse la inmunotransferencia (en particular, la transferencia Western) o la proteómica, así como cualquier otro método conocido por los expertos en la técnica, a un especimen tumoral (tal como, por ejemplo, una biopsia, un aspirado celular recolectado de un lecho tumoral, células centrifugadas (Cytospin) o células tumorales en circulación en el caso de una leucemia).

Con respecto a la proteómica, la exposición de CRT, el receptor de KDEL y/o ERp37 puede detectarse utilizando biodetectores basados en anticuerpos, preparados con un anticuerpo seleccionad de un anticuerpo anti-CRT, un anticuerpo antirreceptor de KDEL y un anticuerpo anti-ERp57, siendo capaz dicho anticuerpo de detectar la forma endógena de CRT, el receptor de KDEL y/o ERp37, sus formas recombinantes, así como sus variantes homólogos o miméticos. El anticuerpo, de modo ventajoso, se acopla con un conjugado detectable. Para detectar la CRT, el receptor de KDEL y/o ERp37, la presente descripción proporciona un kit que permite la detección de dichas proteínas sobre la superficie celular. Este kit comprende al menos un anticuerpo anti-CRT, un anticuerpo antirreceptor de KDEL y un anticuerpo anti-ERp57.

La tinción de inmunofluorescencia o los análisis FACS ("Fluorescent Activated Cell Sorting", clasificación de células activadas por fluorescencia) son un ejemplo de un método apropiado para detectar la translocación de CRT, el receptor de KDEL y/o ERp37 desde el interior hacia la superficie de una célula tumoral, en particular de una célula tumoral que previamente se ha sometido a un tratamiento terapéutico del cáncer.

El péptido seleccionado obtenible mediante un método, según se describió anteriormente, después puede modificarse para incorporar un motivo de translocación a la membrana plasmática, según se definió previamente. Así, la presente descripción también proporciona un método para preparar dicho péptido modificado, que comprende la fusión de (i) un péptido seleccionado que comprende un fragmento de SEQ ID NO:1, o un variante homólogo de este, y (ii) un motivo de translocación a la membrana plasmática que se une a la superficie de una célula.

Los péptidos descritos anteriormente, así como los péptidos obtenibles mediante un método de selección, tal como

se describió previamente, o sus variantes homólogos, se proporcionan cada uno en la presente como nuevos medicamentos.

La presente descripción también incluye el uso de un inhibidor de proteína fosfatasa, tal como se describió previamente, en particular un inhibidor de la subunidad cataliítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1), tal como tautomicina y caliculina A, un inhibidor de GADD34 y/o un inhibidor del complejo de PP1/GADD34, tal como salubrinal y un péptido, tal como se definió anteriormente, para preparar una composición farmacéutica para prevenir

: o tratar un cáncer, en particular un cáncer seleccionado de un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un cáncer de colon, un cáncer de riñón, un cáncer de pulmón, un osteosarcoma, un GIST, un melanoma, una leucemia y un neuroblastoma.

En la presente también se describe un inhibidor de proteína fosfatasa, según se definió anteriormente, en combinación con un producto utilizado en un tratamiento de un cáncer, según se definió previamente, para prevenir

: o tratar un cáncer seleccionado preferiblemente de un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un cáncer de colon, un cáncer de riñón, un cáncer de pulmón, un osteosarcoma, un GIST, un melanoma, una leucemia y un neuroblastoma, en un mamífero.

Las composiciones farmacéuticas descritas en la presente, preferiblemente, por las razones expuestas anteriormente, están previstas para la administración en combinación con un producto utilizado en un tratamiento convencional del cáncer, según se definió anteriormente, en particular con un tratamiento convencional del cáncer, tal como un agente quimioterapéutico.

En la presente también se proporciona una composición farmacéutica que comprende dicho inhibidor de proteína fosfatasa y, preferiblemente, un producto utilizado en un tratamiento de un cáncer, tal como se definió previamente, en asociación con un excipiente o un diluyente farmacéuticamente aceptable.

El excipiente, diluyente o vehículo apropiado que puede utilizarse en la presente invención puede seleccionarse, por ejemplo, de disolución salina, disoluciónes isotónicas, estériles o tamponadas, etc. También puede comprender agentes estabilizantes, edulcorantes y/o tensioactivos, etc. Puede formularse en forma de ampollas, botellas, comprimidos o cápsulas, utilizando técnicas galénicas conocidas.

El tratamiento convencional del cáncer, tal como se explicó previamente, se selecciona preferiblemente de (i) una quimioterapia; (ii) una radioterapia; (iii) una hormonoterapia; (iv) una inmunoterapia; (v) una terapia basada en inhibidores de quinasas específicos; (vi) una terapia basada en agentes antiangiogénicos; y (vii) una terapia basada en anticuerpos monoclonales. Un tratamiento del cáncer particularmente preferido es la quimioterapia. La quimioterapia emplea preferiblemente un producto seleccionado de una antraciclina, un modulador de la respuesta inmunológica, una hormona y un inhibidor de tirosina quinasa. La antraciclina se selecciona preferiblemente de doxorrubicina, daunorrubicina, idarrubicina y mitoxantrona.

En un aspecto particular, la presente descripción se refiere al uso de cualquiera de los inhibidores de proteína fosfatasa mencionados anteriormente para preparar una composición farmacéutica para prevenir o tratar un cáncer (tal como se describió previamente) o una infección (tal como se definió previamente) en un mamífero, en particular en un ser humano.

En un aspecto concreto, el inhibidor de proteína fosfatasa o la composición farmacéutica que comprende dicho inhibidor de proteína fosfatasa, o una mezcla de varios inhibidores de proteína fosfatasa, están previstos para la administración en combinación con un tratamiento del cáncer, según se definió anteriormente, preferiblemente un tratamiento convencional del cáncer, tal como se definió previamente.

Activadores de quinasas

Por otra parte, elF2alfa es una proteína que generalmente se hiperfosforila bajo un estrés en el retículo endoplásmico debido a la activación de quinasas de estrés (Zhang, K. y Kaufman, R.J., J. Biol. Chem., 279, 2593525938 (2004)). En otro aspecto, los inventores han observado que las quinasas, conocidas por fosforilar elF2alfa, pueden estar implicadas en la mayor translocación y exposición de CRT, el receptor de KDEL y/o ERp37 en la superficie celular. Han descubierto que dichas quinasas pueden seleccionarse de las quinasas del factor eucariótico de inicio de la traducción 2-alfa, por ejemplo, inhibidor regulado por hemo (HRI, también denominado quinasa del factor de inicio sensible a hemina 2-alfa, o quinasa 1 del factor eucariótico de inicio de la traducción 2-alfa), proteína quinasa activada por ARN (PKR, también denominada quinasa 2 del factor eucariótico de inicio de la traducción 2alfa), quinasa de tipo PKR localizada en el RE elF2alfa (PERK, también denominada quinasa 3 del factor eucariótico de inicio de la traducción 2-alfa) y GCN2 (también denominado quinasa 4 del factor eucariótico de inicio de la traducción 2-alfa).

La presente descripción también se refiere a un activador de quinasas, seleccionado de un compuesto que activa (i) una quinasa del factor eucariótico de inicio de la traducción 2-alfa (HRI), (ii) una proteína quinasa activada por ARN (PKR), tal como ligandos del receptor de tipo Toll 3 (TLR-3), (iii) una quinasa de tipo PKR localizada en el RE elF2alfa, y (iv), GCN2, como un medicamento.

En un aspecto concreto, la presente descripción incluye el uso de un activador de quinasas, según se mencionó anteriormente, para preparar una composición farmacéutica para prevenir o tratar un cáncer o una infección, tal como se mencionó previamente en la presente solicitud, en un mamífero, en particular en un ser humano.

En la presente también se describe un activador de quinasas, tal como se mencionó anteriormente, para prevenir o tratar un cáncer o una infección en un mamífero, en particular en un ser humano.

La composición farmacéutica para prevenir o tratar un cáncer es preferiblemente una composición que está prevista para su administración en combinación con un producto utilizado en un tratamiento del cáncer, preferiblemente en un tratamiento convencional del cáncer, según se definió previamente.

Aunque la CRT adsorbida sobre la superficie de células vivas potencia la fagocitosis por células dendríticas (DC) in vitro (tal como se muestra en la figura 3E), la CRT debe combinarse con un inductor de la muerte celular para provocar una respuesta inmunológica local (tal como se muestra en la figura 4C) o sistémica in vivo (tal como se muestra en la figura 4D, figura 6). Los inventores han demostrado que la combinación de un inductor de la muerte celular (etopósido o mitomicina C) y calreticulina recombinante (rCRT), receptor de KDEL recombinante o ERp57 recombinante (rERp57) fue capaz de provocar la regresión de tumores, en animales inmunocompetentes (pero no inmunodeficientes). De modo similar, el etopósido o la mitomicina C pueden combinarse con fármacos que inducen la exposición de CRT, del receptor de KDEL y/o de ERp57 (salubrinal o tautomicina), que conduce a la estabilización de la enfermedad o regresión completa del tumor en hospedantes inmunocompetentes (pero no atímicos) (tal como se muestra en la figura 6A, B). Las células CT26 vivas no pudieron crecer en animales que habían sido curados de tumores CT26, lo cual indica el establecimiento de una respuesta inmunológica antitumoral permanente. Tal como se demuestra en la presente, este conocimiento puede emplearse para estimular una respuesta inmunológica antitumoral eficaz, en la que un agente quimioterapéutico no inmunogénico (seleccionado de un agente terapéutico utilizado en un tratamiento convencional del cáncer, tal como se ejemplificó previamente) se vuelve inmunogénico cuando se combina con uno de los compuestos descritos anteriormente, por ejemplo, rCRT, receptor de rKDEL, rERp57 y/o un inhibidor de PP1/GASS34. Estos resultados trazan una estrategia de "quimioterapia inmunogénica" para curar un cáncer establecido, tales como los mencionados anteriormente, o para curar una infección, tal como una infección vírica, bacteriana, fúngica o parasitaria.

Anticuerpos anti-CRT y anti-ERp57

En trastornos autoinmunológicos, tales com el lupus eritematoso sistémico (SLE), la artritis reumatoide, la dermatitis, la alergia, la enfermedad del injerto frente al receptor, el rechazo de transplantes, o una inmunogenicidad demasiado fuerte en la apoptosis forzada, es decir, una inmunogenicidad excesiva y no deseada inducida por uno de los compuestos descritos anteriormente que favorecen la exposición de CRT y/o ERp57 en la superficie de una célula moribunda, resulta interesante, al contraro que los objetivos previamente descritos, limitar la acción del sistema inmunológico sobre la muerte celular. Los inventores han observado que esto puede obtenerse mediante una menor translocación de CRT y/o ERp57 hacia la superficie celular utilizando anticuerpos anticalreticulina y/o anti-ERp57 bloqueantes o neutralizantes. Un péptido inhibidor o competitivo que interfiera con la translocación de CRT y/o ERp57 también puede disminuir la cantidad de CRT y/o ERp57 en la superficie celular y así reducir la respuesta inmunológica en estas situaciones.

Por tanto, el presente texto también describe un anticuerpo o anticuerpos anti-CRT y/o anti-ERp57 bloqueantes o neutralizantes y un péptido inhibidor/competitivo que interfiere con la mayor translocación de CRT y/o ERp57 como medicamentos y, en particular, su uso respectivo para preparar una composición farmacéutica para prevenir o tratar, en particular, un trastorno autoinmunológico, tal como se describió anteriormente, una alergia, la enfermedad del injerto frente al receptor, o el rechazo de transplantes en un mamífero, preferiblemente en un ser humano.

El presente texto también describe una composición farmacéutica concreta que comprende un anticuerpo anti-CRT, antirreceptor de KDEL o anti-ERp57 bloqueante o neutralizante, o un péptido inhibidor/competitivo que interfiere con la mayor translocación de CRT y/o ERp57 hacia la superficie celular, en asociación con un excipiente o diluyente farmacéuticamente aceptable. La composición farmacéutica está prevista preferiblemente para su administracón en combinación con un tratamiento del cáncer por las razones explicadas previamente.

Método para prevenir o tratar una enfermedad

La presente descripción también se refiere a un método para prevenir o tratar una enfermedad, en particular un cáncer o una infección, tal como se define en la presente, que comprende la administración a un mamífero, en particular un ser humano, que lo necesite, de al menos un compuesto seleccionado de (i) CRT, (ii) receptor de KDEL, (iii) ERp57, (iv) un inhibidor de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1), (v) un inhibidor de la subunidad reguladora 15A de la proteína fosfatasa 1 (GADD34), (vi) un inhibidor del complejo de PP1/GADD34, (vii) una antraciclina, y (viii) un activador de quinasas seleccionado de las quinasas mencionadas anteriormente.

Este método puede aplicarse en combinación con un tratamiento diferenciado del cáncer, tales como los descritos previamente.

El anterior método para prevenir o tratar una enfermedad puede comprender una etapa de inyectar directamente el compuesto o compuestos seleccionados en el tumor del sujeto que lo necesite.

Descripción de la invención

Así, la presente invención se refiere a la calreticulina para su uso como una medicación para el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, induciendo dicha medicación una mayor localización de calreticulina en la superficie celular.

La presente invención se basa en la identificación de la exposición de CRT como característica determinante de respuestas inmunológicas anticáncer, y traza una estrategia de quimioterapia inmunogénica.

La localización de la CRT en la superficie celular puede ser el resultado de la translocación de CRT intracelular hacia la superficie de la célula, o el resultado de la translocación de CRT extracelular hacia la superficie de la célula. Así, la presente descripción se refiere a la aplicación como medicación, en la que la translocación de la calreticulina (la forma endógena, la forma recombinante o la forma mimética) se realiza desde el citoplasma hacia la membrana de las células, o desde el medio extracelular hacia la membrana de las células.

Como forma mimética debe entenderse una forma truncada de la calreticulina o una parte o partes de la calreticulina

o híbridos, que muestren las mismas propiedades que la forma nativa de calreticulina (es decir, localización en la superficie celular).

Además, los inventores han demostrado que la calreticulina presente en una mayor cantidad en la superficie celular hace que las células moribundas sean comestibles para las células fagocíticas, tales como células dendríticas. Estas células interaccionan con el sistema inmunológico y después inducen una respuesta inmunológica que hace que la calreticulina sea un inductor de la apoptosis inmunogénica. La presente descripción también se refiere a la calreticulina para su uso como medicación para el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, induciendo dicha medicación una apoptosis inmunogénica.

Preferiblemente, mediante esta aplicación como medicación, la enfermedad tratada es un cáncer, tal como cáncer de mama, cáncer de próstata, melanoma, cáncer de colon, etc., o una infección, tal como una infección vírica, bacteriana, fúngica o parasitaria.

La presente descripción expone la calreticulina para su uso como una medicación para el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, mejorando dicha medicación la eficacia de la quimioterapia en un mamífero que necesite dicha quimioterapia, mediante la inducción de una mayor localización de CRT en la superficie celular y/o la inducción de la apoptosis inmunogénica.

Se sabe que la exposición de CRT es inducida por luz UVC (Gardai, S.J. et ál., Cell, 123, 321-334 (2005)).

Pero parece que la exposición de CRT también es activada por antraciclinas (tal como se muestra en la figura 2) e inhibidores de PP1/GADD34 (tal como se muestra en la figura 5), que implica la translocación de CRT intracelular hacia la superficie celular a través de un mecanismo molecular que no se comprende por complete, y que, de modo similar, implica la presencia de receptores de CRT saturables (Henson, P.M. y Hume, D.A., Trends Immunol., 27, 244-250 (2006)) sobre la superficie celular que pueden unirse a CRT exógena y a CRT endógena preformada.

En efecto, los inventores han demostrado que esta proteína de CRT es fuertemente inducida (en un factor de 6) por la doxorrubicina y las antraciclinas en general (tal como se muestra en las figuras 2B y 2C). Unos análisis de inmunotransferencia de geles bidimensionales (no se muestran) y una electroforesis convencional de las proteínas de la superficie de membranas plasmáticas purificadas (tal como se muestra en la figura 2C) confirman la exposición en la superficie de CRT después de un tratamiento con antraciclinas. Esta exposición sobre la superficie de CRT también es detectable mediante tinción de inmunofluorescencia de células vivas tratadas con antraciclinas (tal como se muestra en la figura 2D). La inducción de la exposición de CRT por antraciclinas es un proceso rápido, detectable tan pronto como una hora después del tratamiento (tal como se muestra en la figura 1S A,B) y, así, precede a la exposición de fosfatidilserina (PS) asociada a la apoptosis (tal como se muestra en la figura 1S C,D). Debe notarse que se produjo una fuerte correlación lineal positiva (p<0,001) entre la aparición de CRT en la superficie celular (medida a las cuatro horas) y la inmunogenicidad provocada por el panel de 20 inductores de la apoptosis diferentes (figura 2E).

La inmunogenicidad y la respuesta inmunológica pueden ser mediadas por células específicas, tales como células dendríticas (DC). Los inventores han demostrado que las células tumorales tratadas con antraciclinas adquieren la propiedad de ser fagocitadas por DC unas pocas horas después del tratamiento con doxorrubicina o mitoxantrona (tal como se muestra en la figura 3A, figura 2A suplementaria), que se correlaciona con la inducción rápida de CRT (tal como se muestra en la figura 3B, 1S A,B) y la adquisición de inmunogenicidad (tal como se muestra en la figura 2B suplementaria).

Por consiguiente, el bloqueo de la CRT presente sobre la superficie de células cancerosas tratadas con mitoxantrona por medio de un anticuerpo específico inhibe su fagocitosis por DC (tal como se muestra en la figura

3C). A la inversa, la adición de una proteína de CRT recombinante (rCRT), que se une a la superficie de las células, puede revertir el defecto inducido por el bloqueo de la CRT por los anticuerpos. Por tanto, la CRT en la superficie provoca la fagocitosis por DC. Además, la adsorción de rCRT a la superficie de la membrana plasmática potencia mucho la inmunogenicidad de células que habitualmente no inducen una respuesta inmunológica, tales como células tratadas con mitomicina (tal como se muestra en la figura 4C) o células tratadas con etopósido revestidas con rCRT, y provoca una vigorosa respuesta inmunológica antitumoral in vivo (tal como se muestra en la figura 4D). Sin embargo, la adsorción de rCRT sobre la superficie celular sin un tratamiento anterior con inductores de la muerte celular no provoca una respuesta inmunológica anticáncer. La presente descripción trata de la calreticulina recombinante para su uso como una medicación para el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, induciendo dicha medicación, después de la administración de un inductor de la muerte celular (tal como etopósido o mitomicina C), una apoptosis inmunogénica.

Por consiguiente, la presente descripción también se refiere a un inhibidor de proteína fosfatasa, tal como un inhibidor de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1), un inhibidor de GADD34 o un inhibidor del complejo de PP1/GADD34, para su uso como una medicación para el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, induciendo dicho inhibidor una mayor localización de calreticulina endógena en la superficie celular.

Además, la presente descripción se dirige a un inhibidor de proteína fosfatasa, tal como un inhibidor de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1), un inhibidor de GADD34 o un inhibidor del complejo de PP1/GADD34, para su uso como una medicación para el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, induciendo dicho inhibidor una apoptosis inmunogénica mediante una mayor translocación de calreticulina hacia la superficie celular (tal como se muestra en la figura 5).

Los inventores han observado que la exposición de CRT inducida por antraciclinas e inhibidores de PP1/GADD34 fue suprimida por latrunculina A, un inhibidor del citoesqueleto de actina y exocitosa (tal como se muestra en la figura 4 suplementaria). También han demostrado que no solo la inhibición de PP1/GADD34 induce la exposición de CRT, sino también que este proceso puede mejorar la respuesta inmunológica antitumoral.

La presente descripción también se refiere a un inhibidor de proteína fosfatasa, tal como un inhibidor de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1), un inhibidor de GADD34 o un inhibidor del complejo de PP1/GADD34, para su uso como una medicación para el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, mejorando dicho inhibidor la eficacia de la quimioterapia en un mamífero que necesita dicha quimioterapia, mediante la inducción de una mayor localización de calreticulina en la superficie celular y/o una apoptosis inmunogénica.

Además, la cantidad de dicho inhibidor de PP1 o de GADD34 o del complejo de PP1/GADD34 descrito anteriormente puede utilizarse en una composición farmacéutica que estimule una mayor translocación de la proteína de calreticulina desde el citoplasma hacia la membrana celular que, así, induce una respuesta inmunológica durante la apoptosis en un mamífero.

Dicha composición farmacéutica que comprende un inhibidor que estimula una mayor translocación de la calreticulina desde el citoplasma hacia la superficie celular también puede mejorar la respuesta a la quimioterapia en un mamífero.

El inhibidor de PP1 o de GADD34 o del complejo de PP1/GADD34 se selecciona, de modo ventajoso, entre tautomicina, caliculina A o salubrinal.

Por otra parte, elF2alfa es una proteína que generalmente se hiperfosforila bajo un estrés en el retículo endoplásmico debido a la activación de quinasas de estrés (Zhang, K. y Kaufman, R.J., J. Biol. Chem., 279, 2593525938 (2004)). Los inventores han observado que las quinasas, conocidas por fosforilar elF2alfa, pueden estar implicadas en la mayor translocación y exposición de calreticulina en la superficie celular. Estas quinasas son las quinasas del factor eucariótico de inicio de la traducción 2-alfa, por ejemplo, inhibidor regulado por hemo (HRI, también denominado quinasa del factor de inicio sensible a hemina 2-alfa, o quinasa 1 del factor eucariótico de inicio de la traducción 2-alfa), proteína quinasa activada por ARN (PKR, también denominada quinasa 2 del factor eucariótico de inicio de la traducción 2-alfa), quinasa de tipo PKR localizada en el RE elF2alfa (PERK, también denominada quinasa 3 del factor eucariótico de inicio de la traducción 2-alfa) y GCN2 (también denominado quinasa 4 del factor eucariótico de inicio de la traducción 2-alfa).

La presente descripción también se refiere a un activador de quinasas, tal como un compuesto que activa una de las quinasas del factor eucariótico de inicio de la traducción 2-alfa, por ejemplo, un inhibidor regulado por hemo (HRI, también denominado quinasa del factor de inicio sensible a hemina 2-alfa, o quinasa 1 del factor eucariótico de inicio de la traducción 2-alfa), proteína quinasa activada por ARN (PKR, también denominada quinasa 2 del factor eucariótico de inicio de la traducción 2-alfa), quinasa de tipo PKR localizada en el RE elF2alfa (PERK, también denominada quinasa 3 del factor eucariótico de inicio de la traducción 2-alfa) y GCN2 (también denominado quinasa 4 del factor eucariótico de inicio de la traducción 2-alfa), para su uso como una medicación para el tratamiento de una enfermedad, tal como un cáncer o una infección vírica en un mamífero, induciendo dicho activador una mayor localización de calreticulina endógena en la superficie celular.

La enfermedad tratada mediante dicho uso de la medicación que comprende este activador es un cáncer (cáncer de mama, cáncer de próstata, melanoma, cáncer de colon, etc.), o una infección (una infección vírica, bacteriana, fúngica o parasitaria).

La presente descripción también proporciona la aplicación como una medicación, que comprende al menos calreticulina, o un inhibidor de PP1, GADD34 o PP1/GADD34, o una antraciclina, o un activador de dichas cuatro quinasas, o anticuerpos anticalreticulina, o un péptido inhibidor/competitivo, mejorando dicha medicación el tratamiento de un cáncer, tal como tumores sensibles a VP16/etopósido, radioterapia o inmunoterapia, es decir, melanoma, cáncer de riñón, cáncer de colon, tumores de mama o pulmón, osteosarcoma.

En trastornos autoinmunológicos, tales como el lupus eritematoso sistémico (SLE), la artritis reumatoide, la dermatitis, la alergia, la enfermedad del injerto frente al receptor, el rechazo de transplantes, o una inmunogenicidad demasiado fuerte en la apoptosis forzada, sería interesante limitar la inmunogenicidad de la muerte celular. Los inventores han observado que esto puede obtenerse mediante una menor translocación de la calreticulina hacia la superficie celular mediante el uso de anticuerpos bloqueantes o neutralizantes anticalreticulina. Un péptido inhibidor

o competitivo que interfiera con la tranlocación de la calreticulina también puede disminuir la cantidad de calreticulina en la superficie celular y, así, reducir la inmunogenicidad y la respuesta inmunológica en estas enfermedades.

Así, la presente descripción también se refiere a un anticuerpo bloqueanto o neutralizante anticalreticulina, o a un péptido inhibidor/competitivo, que interfiere con la mayor translocación de calreticulina y, por tanto, con la inmunogenicidad de la muerte celular, para su uso como una medicación para el tratamiento de trastornos autoinmunológicos (SLE, artritis reumatoide, dermatitis…), alergias, enfermedad del injerto frente al receptor, rechazo de transplantes.

En un aspecto de la descripción, también puede utilizarse la antraciclina, como agente de muerte celular, para la preparación de una medicación para el tratamiento de una enfermedad en un mamífero, induciendo dicha medicación una mayor localización de la calreticulina en la superficie celular.

La antraciclina también puede utilizarse para la preparación de una medicación para el tratamiento de una enfermedad, tal como un cáncer o una infección vírica en un mamífero, estimulando dicha medicación una inducción de la apoptosis inmunogénica mediante una mayor translocación de calreticulina en la superficie celular.

La presente descripción también trata del uso de antraciclinas para la preparación de una medicación para el tratamiento de una enfermedad, tal como un cáncer o una infección vírica, en un mamífero, mejorando dicha medicación la eficacia de la quimioterapia en un mamífero que necesite dicha quimioterapia, mediante la inducción de una mayor localización de calreticulina en la superficie celular y/o una apoptosis inmunogénica.

Además, la presente descripción se refiere también a una composición farmacéutica que comprende una cantidad de una antracicilina que estimula una mayor translocación de la proteína de calreticulina desde el citoplasma hacia la membrana celular que, así, induce una respuesta inmunológica durante la apoptosis en un mamífero.

Dicha composición farmacéutica que comprende antraciclina que estimula una mayor translocación de la calreticulina desde el citoplasma hacia la superficie celular también puede mejorar la respuesta a la quimioterapia en un mamífero.

La presente descripción también proporciona un método que estimula la respuesta al tratamiento por quimioterapia en un mamífero, que incluye la administración de la composición farmacéutica que comprende una cantidad de antraciclina a un mamífero que lo necesite, mediante la inducción de una mayor localización de calreticulina hacia la superficie celular y/o una apoptosis inmunogénica.

La antraciclina puede ser doxorrubicina, idarrubicina o mitoxantrona.

Aunque la CRT adsorbida sobre la superficie de células vivas potencia su fagocitosis por DC in vitro (tal como se muestra en la figura 3E), la CRT debe combinarse con un inductor de la muerte celular para provocar una respuesta inmunológica local (tal como se muestra en la figura 4C) o sistémica in vivo (tal como se muestra en la figura 4D, figura 6). En productos terapéuticos, los inventores han demostrado que la combinación de un inductor de la muerte celular (etopósido o mitomicina C) más calreticulina (rCRT) fue capaz de provocar la regresión de tumores, en animales inmunocompetentes (pero no inmunodeficientes). De modo similar, el etopósido o la mitomicina C pueden combinarse con fármacos que inducen la exposición de CRT (salubrinal o tautomicina), que conduce a la estabilización de la enfermedad o regresión completa del tumor en hospedantes inmunocompetentes (pero no atímicos) (tal como se muestra en la figura 6A, B). Las células CT26 vivas no pudieron crecer en animales que habían sido curados de tumores CT26, lo cual indica el establecimiento de una respuesta inmunológica antitumoral permanente. Tal como se demuestra en la presente, este conocimiento puede emplearse para estimular una respuesta inmunológica antitumoral eficaz, en la que un agente quimioterapéutico no inmunogénico se vuelve inmunogénico cuando se combina con rCRT o inhibidores de PP1/GASS34. Estos resultados trazan una estrategia de quimioterapia inmunogénica para curar un cáncer establecido, tal como cáncer de mama, cáncer de próstata, melanoma, cáncer de colon, etc., o para curar una infección (una infección vírica, bacteriana, fúngica o parasitaria).

La presente descripción también se refiere a un producto que contiene un agente quimioterapéutico y calreticulina recombinante como un producto de combinación para su uso en el tratamiento de una enfermedad.

La presente descripción también se refiere a un producto que contiene un agente quimioterapéutico y los inhibidores (tales como un inhibidor de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1), un inhibidor de GADD34 o un inhibidor del complejo de PP1/GADD34) como un producto de combinación para su uso en el tratamiento de una enfermedad. Este producto de combinación puede utilizarse para el tratamiento de una enfermedad, tal como un cáncer (cáncer de mama, cáncer de próstata, melanoma, cáncer de colon, etc.), o una infección (una infección vírica, bacteriana, fúngica o parasitaria).

El agente quimioterapéutico puede ser etopósido, mitomicina C, antraciclina y otros muy conocidos en los productos terapéuticos. La presente descripción también proporciona un producto de combinación descrito anteriormente (un agente quimioterapéutico y calreticulina o un agente de muerte celular y dicho inhibidor), en el que dicho producto mejora el tratamiento de un cáncer, tales como tumores sensibles a VP16/etopósido, radioterapia o inmunoterapia, es decir, melanoma, cáncer de riñón, cáncer de colon, tumores de mama o pulmón, osteosarcoma.

La presente descripción también se refiere a un método que induce una mayor translocación de calreticulina desde el citoplasma hacia la superficie celular para potenciar una respuesta inmunológica en el fenómeno de la apoptosis en un mamífero, comprendiendo dicho método la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de un inhibidor, tal como un inhibidor de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1), un inhibidor de GADD34 o un inhibidor del complejo de PP1/GADD34.

De forma diferente, la presente descripción también incluye un método para inducir una mayor translocación de calreticulina desde el citoplasma hacia la superficie celular para potenciar una respuesta inmunológica en el fenómeno de la apoptosis en un mamífero, comprendiendo dicho método la administración de una cantidad farmacéuticamente eficaz de una antraciclina.

La mayor translocación de calreticulina es preferiblemente desde el citoplasma hacia la membrana de células tumorales.

El método mejora el tratamiento de un cáncer, preferiblemente tumores sensibles a VP16/etopósido, radioterapia o inmunoterapia, es decir, melanoma, cáncer de riñón, cáncer de colon, tumores de mama o pulmón, osteosarcoma, etc.

Preferiblemente, este método se dirige a tratar cánceres quimiosensibles, así como cánceres inmunosensibles.

Este método muestra una mayor eficacia de la quimioterapia en un mamífero que necesita dicha quimioterapia.

Preferiblemente, el mamífero tratado es un ser humano.

Además, la localización de la proteína de calreticulina sobre la superficie celular puede realizarse mediante anticuerpos anticalreticulina que detectan la forma endógena de calreticulina, una forma recombinante y la forma mimética. Un método de detección de todas las formas de la proteína de calreticulina en la superficie celular también es un objeto de la presente invención. Eseto puede realizarse in vitro, ex vivo o in vivo. Los métodos utilizados para detectar esta proteína de calreticulina en la superficie celular son muy conocidos por los expertos en la técnica. Estos métodos comprenden inmunoquímica de secciones de tejidos (congelados o en parafina), ensayos EIA, tales como ELISA de lisados tumorales, inmunofluorescencia confocal o análisis de citometría de flujo de células centrifugadas (Cytospin), aspirados celulares recolectados de lechos tumorales o lesiones autoinmunológicas… Un objeto de la presente descripción también consiste en desarrollar un método de detección cuantitativa de la calreticulina (todas las formas) en la superficie celular. La inmunogenicidad de la apoptosis se correlaciona con la cantidad de calreticulina presente en la superficie celular. Cuanta más calreticulina haya sobre la superficie celular, mayor será la apoptosis inmunogénica. Este método de detección puede servir para predecir la inmunogenicidad de la apoptosis. Además, la eficacia de una quimioterapia se correlaciona con la eficacia de la respuesta inmunológica, y por tanto la inmunogenicidad de la apoptosis. Cuanta mayor sea la apoptosis inmunogénica, mayor será la eficacia de una quimioterapia. Este método de detección de calreticulina en la superficie celular puede utilizarse para la predicción de la apoptosis inmunogénica y también para la eficacia terapéutica de una quimioterapia. La calreticulina, en estos métodos, se emplea como marcador predictivo de la apoptosis inmunogénica y de la eficacia terapéutica de una quimioterapia. Este método de detección cuantitativa también puede ser ventajoso para predecir los riesgos de una apoptosis forzada que se convierte en demasiado inmunogénica. La inhibición de la translocación de la calreticulina en la superficie celular puede disminuir la inmunogenicidad de la calreticulina y, así, reducir o bloquear (en el mejor caso) la respuesta inmunológica.

Existe una cantidad basal de calreticulina en la superficie celular, y la mayor cantidad de calreticulina permite predecir una apoptosis inmunogénica y/o la eficacia terapéutica de una quimioterapia. Mediante la comparación entre la situación antes y después de la quimioterapia, la cantidad de calreticulina en la superficie celular generalmente aumenta en gran medida, y el aumento será un buen marcador predictivo para la apoptosis inmunogénica, la eficacia terapéutica de una quimioterapia, una infección vírica inmunogénica, pero también para

enfermedades autoinmunológicas o rechazo de transplantes/enfermedad de GVH (injerto frente al receptor). La presente descripción también proporciona un método de detección de la calreticulina en la superficie celular, en el que la calreticulina en la superficie celular se emplea como marcador predictivo de una infección vírica inmunogénica

o enfermedades autoinmunológicas o rechazo de transplantes/enfermedad de GVH.

Además, para detectar la calreticulina, la presente descripción también proporciona un kit de detección de la proteína de calreticulina en la superficie celular, según el método descrito anteriormente, comprendiendo dicho kit al menos anticuerpos anticalreticulina. En una realización de la descripción, este kit de detección también puede ser un kit cuantitativo para la detección cuantitativa de la calreticulina en la superficie celular, comprendiendo dicho kit al menos anticuerpos anticalreticulina.

La presente descripción también se refiere a un kit de predicción de la apoptosis inmunogénica de células tumorales y/o de la eficacia terapéutica de una quimioterapia, que comprende al menos anticuerpos anticalreticulina para la detección de la proteína de calreticulina en la superficie celular. Cuando se detecta una gran cantidad de calreticulina, la apoptosis de células tumorales será inmunogénica y la eficacia de la quimoterapia será mejorada. En la presente descripción también se proporciona un kit de predicción de una infección vírica inmunogénica o enfermedades autoinmunológicas o rechazo de transplantes/enfermedad de GVH, comprendiendo dicho kit al menos anticuerpos anticalreticulina para la detección de la proteína de calreticulina en la superficie celular.

La presente descripción también se refiere a un método de detección de la proteína de calreticulina en la superficie celular para la selección de fármacos inmunogénicos directos o indirectos, y el método de seleccionar fármacos inmunogénicas incluye una etapa de detección de la proteína de calreticulina en la superficie celular, que comprende al menos anticuerpos anticalreticulina para la selección de fármacos inmunogénicos directos o indirectos.

La selección de fármacos inmunogénicos directos o indirectos puede conducir a descubrir más agentes antitumorales eficaces. Para el método directo, deben elegirse líneas de células tumorales humanas y, después, su incubación con un panel de fármacos debería permitir detectar si se ha producido una translocación de CRT espontánea desde el citoplasma hacia la superficie celular mediante citometría de flujo o confocal. Para el método de selección indirecto, los inventores eligieron líneas de células tumorales humanas en las que la apoptosis se obtiene después de un tratamiento con etopósido, pero no se produce translocación de CRT hacia la superficie celular. Después se emplea un panel de fármacos para detecta cuál de ellos revierte este fenómeno. Esto puede utilizarse para descubrir nuevos inhibidores del complejo de PP1/GADD34 o nuevos activadores de quinasas GCN2, HRI, PERK, PKR.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1: La figura 1 muestra la muerte celular inmunogénica inducida por antraciclinas.

Figura 1A: Frecuencia de células muertas y moribundas después de un tratamiento con distintos agentes quimioterapéuticos. Se cultivaron células CT26 durante 24 horas en presencia de los agentes indicados, según se describe en "Materiales y métodos", y después se tiñeron con Annexin V-FITC y el tinte vital DAPI.

Figura 1B: Identificación de inductores de la muerte celular inmunogénica. Células CT26, cultivadas como en la figura 1A, se inyectaron en el flanco izquierdo, seguido de una inyección de células tumorales vivas en el flanco derecho 8 días después. Se determinó el porcentaje de ratones sin tumores 120 días después, como en la figura 1C.

Figura 1C: Incidencia de los tumores después de la inoculación de células moribundas. Los datos muestran la frecuencia real de ratones sin tumores, para el experimento resumido en la figura 1B. El día 1 se considera el día de la inoculación de las células tumorales moribundas, una semana antes de la exposición a las células tumorales moribundas.

Figura 1S. Disociación de la exposición de CRT y exposición de fosfatidilserina.

Figura 1SA, figura 1SB: Cinética de la exposición de CRT. Se trataron células CT26 con mitoxantrona durante el periodo indicado, seguido de una tinción de inmunofluorescencia con un anticuerpo específico de CRT y análisis citofluorométricos. Se muestran pictogramas representativos en la figura 1SA, y los datos cuantitativos se indican en la figura 1SB.

Figura 1SC, figura 1SD: Cinética de la exposición de PS y muerte celular. Se cultivaron células como en la figura 1Sa y figura 1SB durante el periodo indicado, seguido de una tinción con Annexin V (que reconoce la fosfatidilserina sobre la superficie de células moribundas) más DAPI (que tiñe las células muertas) y un análisis FACS.

Figura 2: Exposición de CRT sobre la superficie en la muerte celular inmunogénica.

Figura 2A-figura 2D: Identificación de CRT como una molécula expuesta en la superficie provocado por antraciclinas. Las células se trataron durante 4 h con doxorrubicina sola (DX) o en combinación con Z-VAD-fmk (DXZ), seguido de una biotinilación de la superficie celular y una purificación de las proteínas biotiniladas, una electroforesis en gel bidimensional (figura 2A e insertos en la figura 2A que muestran parte del gel con un mayor aumento) e

identificación con espectroscopía de masas de una mancha inducida por doxorrubicina como CRT (flechas en la figura 2A y péptidos subrayados en la secuencia de la proteína de CRT en la figura 2B), detección con inmunotransferencia de CRT en la fracción de proteínas de la membrana plasmática o el lisado de células completas (figura 2C) o detección de inmunofluorescencia de CRT sobre la superficie celular (en células vivas no permeabilizadas) o dentro de la célula (después de la permeabilización y la fijación) (figura 2D). Nótese que los núcleos de las células no tratadas se visualizaron con Hoechst 33342 (azul), mientras que las células tratadas con doxorrubicina emiten una fluorescencia roja (figura 2D). Los círculos en la figura 2A indican la posición de ERP57.

Figura 2E: Correlación entre la exposición de CRT y la inmunogenicidad. La exposición de CRT en la superficie se determinó mediante una citometría de inmunofluorescencia, excluyendo las células viables (negativas a yoduro de propidio) (insertos), y se correlaciona con la inmunogenicidad de la muerte celular (según se determina en la figura 1). CO, control; Tg, tapsigargina; Tu, tunicamicina.

Figura 2S (figura 2S A, figura 2S B): Cinética de la fagocitosis e inmunogenicidad provocada por antraciclinas. Se cultivaron células CT26 durante diferentes periodos con mitoxantrona o doxorrubicina y después se confrontaron con DC para medir su fagocitosis (figura 2SA), como en la figura 3A, o se inyectaron en ratones, una semana antes de la exposición a células vivas (figura 2SB). Los números en cada columna de la figura 2S B indican el número de ratones que fueron inmunizados.

Figura 3: Necesidad de la existencia de CRT en la superficie para la fagocitosis de células tumorales por DC.

Figura 3A, figura 3B: Correlación entre fagocitosis de células tumorales y exposición de CRT. Se cultivaron células tumorales con Cell Tracker Green, con DC que expresan CD11c, y se determinó el porcentaje de DC que captan células tumorales (A) y se correlacionó con la exposición de CRT en la superficie (B), medido como en la figura 2E.

Figura 3C: El bloqueo de CRT inhibe la fagocitosis mediada por DC. Se incubaron células tratadas con mitoxantrona

o control con un anticuerpo anti-CRT de pollo bloqueante, seguido de una detección de la fagocitosis mediante CD.

Figura 3D, figura 3E, figura 3F: La inactivación de CRT inhibe la fagocitosis mediada por DC y la rCRT restablece la fagocitosis. Se transfectaron células con los ARNmc indicados y opcionalmente se trataron con rCRT, seguido de una detección de inmunotransferencia (figura 3D) de la CRT sobre la superficie (figura 3E) y una fagocitosis por DC (figura 3F). Los resultados son triplicados (X±DE) y son representativos de tres experimentos independientes. * indica diferencias estadísticamente significativas utilizando el ensayo de la t de Student a p<0,001.

Figura 3S: Perfil inhibidor de la exposición de CRT. Se trataron células con mitoxantrona o inhibidores de PP1/GADD34 después de una incubación durante 1 h con los inhibidores indicados de la síntesis de proteínas (cicloheximida), la síntesis de ARN (actinomicina D), los microtúbulos (nocodazol), o el citoesqueleto de actina (latrunculina A). Después se determinó la expresión de CRT mediante inmunocitofluorometría. Los resultados son la media de triplicados ± DE para un experimento representativo de tres experimentos.

Figura 4: Necesidad de la CRT para la respuesta inmunológica contra células tumorales moribundas.

Figura 4A: La vacunación anticáncer in vivo depende de CRT. Células de cáncer de colon CT26 se transfectaron con los ARNmc indicados, después se trataron con rCRT y/o mitoxantrona (como en la figura 3D), y se midió la respuesta antitumoral mediante una exposición simultánea de ratones BALB/c a células tumorales tratadas con mitoxantrona en un flanco, y células tumorales vivas no tratadas en el flanco opuesto.

Figura 4B: El cebado de las respuestas de células T depende de CRT. Células tumorales CT26 se dejaron sin transfectar o se transfectaron con los ARNmc indicados, después se trataron solo con medio, mitomicina C o mitoxantrona, y se inyectaron en la almohadilla de la pata derecha de ratones Balb/c. Cinco días después, se expusieron células mononucleares de nódulos linfáticos poplíteos de drenaje a células CT26 congeladas y descongeladas, y se evaluó la secreción de IFN-γ a las 72 horas.

Figura 4C: El suministro exógeno de CRT potencia la inmunogenicidad de células moribundas negativas a CRT. Células CT26 que carecen de expresión de CRT después de la reducción de la cantidad de CRT con un tratamiento con ARNmc y mitoxantrona, o después de un tratamiento con mitomicina, se revistieron con rCRT (insertos), y después se inyectaron en la almohadilla de la pata derecha, seguido de la evaluación de la secreción de IFN-γ por las células de nódulos linfáticos de drenaje, como en la figura 4B.

Figura 4D: Mejora mediada por CRT de la respuesta inmunológica contra células tumorales tratadas con etopósido. Se trataron células CT26 durante 24 h con etopósido (o PBS), y se adsorbió opcionalmente rCRT sobre la superficie celular (insertos), seguido de la inyección simultánea de las células tumorales tratadas con etopósido ± rCRT y células tumorales vivas en flancos opuestos, y se controló el crecimiento tumoral.

Figura 5: Inducción de la exposición de calreticulina y muerte celular inmunogénica mediante la inhibición del complejo de PP1/GADD34.

Figura 5A: Exposición de CRT después de un tratamiento con antraciclina en ausencia de núcleo. Células intactas o células enucleadas (citoplastos) se trataron durante 2 horas con mitoxantrona, seguido de la detección por inmunofluorescencia de la exposición de CRT. Los insertos muestran la eliminación eficaz de núcleos que pueden teñirse con Hoechst 33342 de los citoplastos.

Figura 5B: Fosforilación de elF2alfa después de un tratamiento con antraciclinas. Las células se trataron durante cuatro horas con mitoxantrona o doxorrubicina, seguido de la detección con inmunotransferencia de elF2alfa fosforilado independientemente de su estado de fosforilación y GAPDH como control de carga.

Figura 5C-figura 5D: Inducción de la exposición de CRT mediante la inactivación de PP1. Se transfectaron células con ARNmc específicos para las transcripciones indicadas, y se trataron 36 h después durante 2 h con mitoxantrona antes de una inmunotransferencia (figura 5C) y tinción de la superficie celular (figura 5D).

Figura 5E: Cinética de la exposición de CRT determinada mediante análisis FACS después de la incubación de células con los agentes indicados.

Figura 5F-figura 5G: Los inhibidores de PP1/GADD34 hacen que la célula sea inmunogénica a través de CRT. Primero se transfectaron células tumorales con un ARNmc control o un ARNmc específico de CRT, y después se trataron in vitro con etopósido, solo o en combinación con inhibidores de PP1/GADD34. Dos horas después, se detectó la CRT en la superficie para demostrar la expresión eficaz de CRT sobre células transfectadas con ARNmc control tratadas con etopósido solo o con etopósido más inhibidores de PP1/GADD34 (figura 5F), y después las células se inyectaron como en la figura 1A para determinar su capacidad para inhibir el crecimiento de células tumorales vivas inoculadas una semana después (figura 5G). Los resultados representan el porcentaje de ratones sin tumores (que comprende un total de 12 a 18 ratones por grupo).

Figura 6 (figura 6A, figura 6B, figura 6C): Efecto terapéutico de CRT o inhibidores de PP1/GADD34 inyectados en tumores. Tumores CT26 establecidos en ratones Balb/c de tipo salvaje inmunocompetentes (figura 6A) o nu/nu atímicos (figura 6B) se inyectaron localmente con las combinaciones indicadas de mitoxantrona, etopósido, mitomicina C, rCRT, salubrinal o tautomicina, seguido del control del crecimiento tumoral. Cada curva representa un ratón. Los números en la esquina inferior derecha de cada gráfica indican el número de ratones que manifiestan una involución completa de los tumores en el día 45. En la figura 6C, se estableció un escenario experimental idéntico utilizando etopósido intratumoral más inyección subcutánea contralateral de rCRT. Las gráficas muestran un experimento representativo de dos, que comprenden 5 ratones/grupo.

Figura 7 (figura 7A, figura 7B): Expresión de ERp57/CRT en presencia o ausencia de un péptido inhibidor de PP1/GADD34. Se cultivaron células HCT116 (figura 7A) o células CT26 (figura 7B) en medios completos suplementados con suero de ternera fetal al 10% solo o en presencia del péptido control (VKKKKIKREIKIlkaravafsekv) o del péptido inhibidor de PP1/GADD34 (VKKKKIKREIKI-lkarkvrfsekv, denominado péptido de PP1) durante 2 horas. Las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron en PFA (al 4% en p/v) durante 5 min. Las células se tiñeron con un anticuerpo contra calreticulina (pAb de Abcam, ab2907) a una dilución de 1:200 o control de isotipo, en tampón de tinción (PBS, FCS al 1%) durante 30 minutos en hielo, seguido de un lavado. Se añadió un conjugado de inmunoglobluina anti-conejo Alexa fluor 488 (Molecular Probes-Invitrogen) diluido a 1:500 durante 30 min más en hielo antes de lavar y analizar mediante una citometría de flujo (FACScan, Becton Dickinson). Se añadió yoduro de propidio (50 μg/ml, Becton Dickinson) a las muestras para marcar y excluir las células permeabilizadas (muertas).

Figura 8: La calreticulina y ERp57 se colocalizan sobre la superficie de células tratadas con MTX. Se cultivaron células HeLa sobre cubreobjetos y se trataron con o sin mitoxantrona (MTX) 1 μM durante dos horas. Las células HeLa se tiñeron para la detección de calreticulina (CRT) (mAb de Abcam, ab22683) y para ERp57 (pAb de Abcam, ab10827), revelados por conjugados de inmunoglobluina de cabra anti-ratón Alexa fluor 568 y anti-conejo Alexa fluor 488 (Molecular Probes-Invitrogen). Los núcleos se marcaron con medio de montaje DAPI (Vectashield). La microscopía de fluorescencia se analizó con un microscopio Leica IRE2 equipado con una cámara DC300F con un aumento de 63x. El tamaño de las barras indica 10 μm.

Figura 9: Detección citométrica de flujo de ERp57. Se trataron células HeLa con o sin mitoxantrona (MTX, 1 μM) o tautomiina (Tau, 150 nM, Sigma) durante 2 h. Las células se lavaron dos veces con PBS y se fijaron en PFA (al 4% en p/v) durante 5 min. Las células HeLa se tiñeron con un anticuerpo contra ERp57 (pAb de Abcam, ab10827) a una dilución de 1:200 o control de isotipo, en tampón de tinción (PBS, FCS al 1%) durante 30 minutos en hielo, seguido de un lavado. Se añadió un conjugado de inmunoglobluina anti-conejo Alexa fluor 488 (Molecular Probes-Invitrogen) diluido a 1:500 durante 30 min más en hielo antes de lavar y analizar mediante una citometría de flujo (FACScan, Becton Dickinson). Se añadió yoduro de propidio (50 μg/ml, Becton Dickinson) a las muestras para marcar y excluir las células permeabilizadas (muertas). Se empleó el programa informático CellQuest para analizar la intensidad media de fluorescencia (MFI) y el porcentaje de células positivas a ERp57.

Figura 10: Análisis de inmunofluorescencia y microscopía confocal del receptor de KDEL sobre células HeLa tratadas con antraciclinas. Figura 10(A): control, y figura 10(B): células HeLa tratadas con MTX. Las células HeLa se

cultivaron sobre cubreobjetos y se trataron sin (A) o con (B) mitoxantrona 1 μM (MTX, Sigma) durante dos horas. Las células se fijaron con paraformaldehído (al 4% en p/v) sobre hielo durante 5 min. Las células se tiñeron para la detección del receptor de KDEL (KDEL-R) (mAb de Abcam, ab12224) y CRT (pAb de Abcam, ab2907), mediante conjugados de inmunoglobluina de cabra anti-ratón Alexa fluor 568 y anti-conejo Alexa fluor 488 (Molecular Probes-Invitrogen). Los núcleos se marcaron con medio de montaje DAPI (Vectashield). La microscopía de fluorescencia se analizó con un microcopio Leica IRE2 equipado con una cámara DC300F. Tamaño de las barras: 10 μm.

Figura 11: Necesidad de Bax y Bak para la exposición de ERp57. Se cultivaron células HeLa en placas de 24 pocillos y se transfectaron a una confluencia del 80% con reactivo de oligofectamina (Invitrogen), en presencia de 20 nM de ARNmc específicos de Bax humana (sentido: 5'-GGUGCCGGAACUGAUCAGATT-3' - SEQ ID NO:5, antisentido: 5'-UCUGAUCAGUUCCGGCACCTT-3' -SEQ ID NO:6) y/o Bak (sentido: 5'-ACCGACGCKATGACTCAGAGTTC-3' - SEQ ID NO:7, antisentido: 5'-ACACGGCACCAATTGATG-3' - SEQ ID NO:8) y una secuencia irrelevante (sentido: 5'-GCCGGUAUGCCGGUUAAGU-3' - SEQ ID NO:9, antisentido: 5'-ACUUAACCGGCAUACCGGC-3' - SEQ ID NO:10) como control. Los efectos del ARNmc se controlaron mediante inmunotransferencias con anticuerpos adecuados específicos de Bax y Bak. Después de 36 h de transfección, las células se trataron con MTX (1 μm) durante 2 h. La MFI de las células positivas a ERp57 en superficie se analizó como se describe en la figura 9.

Figura 12: Efectos terapéuticos sinérgicos in vivo de la combinación de péptidos inhibidores de PP1/GADD34 junto con mitomicina C contra un cáncer de colon CT25 establecido. Se inyectaron CT26 por vía subcutánea en ratones BALB/c. A un tamaño de 20 mm2, los tumores palpables se inocularon directamente in situ con 10 microgramos de cualquiera de los tres péptidos siguientes (véase a continuación) solos o junto con un tratamiento sistémico con mitomicina C (según se describe en Obeid et ál., Nat. Med., 2007) o PBS.

1.: Péptido inhibidor de PP1 penetrable en células VKKKKIKREIKI-LKARKVRFSEKV

2.: Péptido control penetrable en células VKKKKIKREIKI-LKARKVRFSEKV

3.: Secuencia de penetración en la células VKKKKIKREIKI sola mezclada con el péptido inhibidor de PP1 LKARKVRFSEKV solo.

Se controló el tamaño de los tumores dos veces semanales, y se muestra la curva de supervivencia para un experimento representativo (de dos que producen resultados similares). Se incluyeron 5 animales/grupo en este experimento.

La inhibición de PP1/GADD34 (que induce ecto-CRT) sinergiza con el inductor de la muerte celular mitomicina C que, per se, no estimula la exposición de CRT sobre la superficie de células tumorales (no se muestra en la presente). El péptido pertinente debe condensarse con un péptido penetrable en células para que entre en el citosol.

Parte experimental

Materiales y métodos

Líneas celulares e inducción de la muerte celular

Se cultivaron células CT26 a 37 ºC bajo CO2 al 5% en medio RPMI 1640 suplementado con FCS al 10%, penicilina, estreptomicina, piruvato 1 mM y HEPES 10 mM en presencia de doxorrubicina (DX, 24 h, 25 μM), mitoxantrona (Mitox, 24 h, 1 μM, Sigma), idarrubicina (24 h, 1 μM, Aventis, Francia), mitomicina C (30 μM, 48 h, Sanofi-Synthelabo, Francia) y/o zVAD-fmk (50 μM, 24 h, Bachem), tunicamicina (24 h, 65 μM), tapsigargina (24 h, 30 μM), brefeldina A (24 h, 50 μM, Sigma), etopósido (48 h, 25 μM, Tava Classics), MG132 (48 h, 10 μM), ALLN (48 h, μM), ácido betulínico (24 h, 10 μM), Hoechst 33343 (24 h, 0,2 μM), camptotecina (24 h, 15 μM), lactacistina (48 h, 60 μM), BAY 11-8072 (24 h, 30 μM), estaurosporina (24 h, 1,5 μM), bafilomicina A1 (48 h, 300 nM), trióxido de arsénico (24 h, 30 μM), C2-ceramida (C2-C, 24 h, 60 μM), caliculina A (48 h, 30 nM), o tautomicina (48 h, nM, Sigma) y/o salubrinal (48 h, μM, Calbiochem).

Ensayos de muerte celular

Las células se tripsinizaron y se sometieron a un análisis citofluorométrico con un FACS Vantage después de teñir con 4,6-diamino-2-fenilindol (DAPI, 2,5 mM, 10 min, Molecular Probes) para la determinación de la viabilidad celular, y Annexin V conjugado con isotiocianato de fluoresceína (Bender Medsystems) para la evaluación de la exposición a fosfatidilserina (Zamzami, N. y Kroemer, G., Methods Mol. Biol., 282, 103-116 (2004)).

ARNmc y manipulación de la CRT de la superficie

Se diseñaron heterodúplex de ARNmc rCrCrGrCUrGrGrGUrCrGrArAUrCrRrArATT-3'rCrArGrGrArGrCrArGrAUrCrArGrAUrArGrATT-3': - específicos SEQ SEQ para ID ID CRT (hebra NO:25), NO:26), sentido: GADD34 PPICalfa 5'-(5'-(5'-

rGrCUrGrGrCrCUrAUrArArGrAUrCrArGrATT-3' -SEQ ID NO:27) o un control no relacionado (5'rGrCrCrGrGUrAUrGrCrCrGrGUUrArArGUTT-3' - SEQ ID NO:28) en los laboratorios de los inventores y fueron sintetizados por Sigma-Proligo. Se transfectaron células CT26 con los ARNmc a una concentración final de 100 nM utilizando HiPerFect (Qiagen). Treinta y seis horas después de la transfección, las células CT26 se evaluaron para el contenido total en CRT mediante inmunotransferencia. Para restablecer la expresión de CRT, las células se expusieron a rCRT, producida como se ha descrito (Culina, S., Lauvau, G., Gubler, B. y van Endert, P.M., Calreticulin promotes folding of functional human leukocyte antigen class I molecules in vitro, J. Biol. Chem., 279, 54210-54215 (2004)), a 3 μg/106 células en PBC sobre hielo durante 30 min, seguido de tres lavados.

Detección de fluorescencia de la CRT en la superficie celular

En primer lugar, células CT26 (sobre un cubreobjetos o en placas de 12 pocillos) se lavaron con tampón FACS (1x PBS, suero bovino fetal al 5%, y azida sodio al 0,1%) y después se incubaron con anticuerpo anti-CRT de ratón de conejo (1:100, Stressgen) en tampón FACS a 4 ºC durante 30 min. Las células se hicieron reaccionar con conjugados de IgG (H+L) anti-conejo Alexa fluor 488 (1:500) en tampón FACS a 4 ºC durante 30 min. Después de lavar tres veces con tampón FACS, se detectó la CRT en la superficie mediante un análisis citofluorométrico en un FACS Vantage. En algunos experimentos, las células se fijaron con paraformaldehído al 4%, se contratiñeron con Hoechst (2 μM, Sigma), seguido de una evaluación microscópica de la fluorescencia con un microscopio Leica equipado con una cámara DC300F.

Análisis de inmunotransferencia

Las células se lavaron con PBS frío a 4 ºC y se lisaron en un tampón que contenía Tris HCl 50 mM, pH 6,8, glicerol al 10% y SDS al 2%. Los anticuerpos primarios que detectan CRT (dilución 1/2000, Stressgen), CD47 (dilución 1/500, BD Biosciences), EIF2alfa, EIF2alfa-P y PP1cα (dilución 1/2000, Cell Signaling Technology), y GADD34 (dilución 1/2000, Abcam), fueron revelados con el anticuerpo secundario marcado con peroxidasa de rábano apropiado (Southern Biotechnologies Associates) y se detectaron mediante ECL (Pierce). Se empleó antiactina o anti-GAPDH (Chemicon) para controlar la carga idéntica.

Vacunación antitumoral y tratamiento de tumores establecidos

Todos los animales se mantuvieron en condiciones exentas de patógenos específicas y todos los experimentos siguieron las directrices de FELASA. Se inocularon por vía subcutánea 3 x 106 células CT26 tratadas en 200 ml de PBS en ratones hembra de seis semanas BALB/c (Charles River, Francia) en el flanco inferior, mientras que 5 x 105 células control no tratadas se inocularon en el flanco contralateral. Para el ensayo de la tumorigenicidad, 3 x 106 células CT26 tratadas o no tratadas se inyectaron por vía subcutánea en ratones nu/nu (instalaciones para animales IGR). Para evaluar la especifidad de la respuesta inmunológica contra CT26, los inventores inyectaron 5 x 105 o 5 x 106 de CT26 (para los ratones inmunizados con un protocolo convencional o un protocolo de vacunación, respectivamente). Los tumores se evaluaron cada semana, utilizando un calibrador. En una serie de experimentos, ratones BALB/c (de tipo salvaje o nu/nu) que portan tumores CT26 palpables (implantados 14 días antes para el tipo salvaje, o 7 días antes para los ratones nu/nu mediante inyección de 106 células tumorales) recibieron una única inyección intratumoral de PBS 1000 μM que contenía la misma concentración de agentes anticáncer e inhibidores de PP1/GADD34 que la utilizada in vitro, así como rCRT (15 μg). Para la evaluación de la respuesta inmunológica local, 3 x 105 células se inyectaron en 50 μl en la almohadilla de la pata de los ratones. Cinco días después, los ratones se sacrificaron, y se recolectaron los nódulos linfáticos de drenaje. Se cultivaron 1 x 105 células de nódulos linfáticos durante 4 días solas o con 1 x 104 células CT26 muertas mediante un ciclo de congelación-descongelación en 200 μl en placas de 96 pocillos de fondo redondo. Se determinó el IFN-γ mediante ELISA (BD Pharmingen).

Generación de BMDC

Se enjuagaron células BM de las tibias y los fémures de ratones BALB/c con un medio de cultivo compuesto de medio RPMI 1640 (Invitrogen Life Technologies), suplementado con FBS inactivado por calor al 10% (Invitrogen), piruvato de sodio, 2-ME 50 μM (Sigma), HEPES 10 mM (pH 7,4), y penicilina/estreptomicina (Invitrogen). Después de una centrifugación, las células BM se resuspendieron en Tris-cloruro de amonio durante 2 min para lisar los eritrocitos. Después de una centrifugación más, las células BM (1 x 106 células/ml) se cultivaron en medio suplementado con ligando FLT3 de ratón recombinante 100 ng/ml (R&D Systems) en placas de 6 pocillos (Costar Corning). Después de 7 días, las células no adherentes y débilmente adherentes se recolectaron con Versene, se lavaron y se trasladaron a placas de 12 pocillos (1,5 x 106 células/placa) para un cocultivo con células tumorales.

Ensayos de fagocitosis

En placas de 12 pocillos, 25 x 106 células CT26 adherentes se marcaron con Celltracker Green (Calbiochem) y después se incubaron con fármacos. En algunos experimentos, CT26 viables fueron revestidas con 2 μg/106 células de anticuerpo anti-CRT de pollo (ABR Affinity BioReagents) o un control de isotipo durante 30 min antes de un lavado y una alimentación a células dendríticas. Como alternativa, células CT26 fueron revestidas con 2 μg/106 células de rCRT en hielo durante 30 minutos y se lavaron dos veces antes de la adición a las células dendríticas.

Las células después se recolectaron, se lavaron tres veces con medio suplementado con FBS y se cocultivaron con DC inmaduras durante 2 horas a una proporción de 1:1 y 1:5. Al final de la incubación, las células se recolectaron con Versene, se reunieron con las células no adherentes presentes en el sobrenadante, se lavaron y se tiñeron con anticuerpo CD11c-FITC. La fagocitosis se evaluó mediante análisis FACS de células doble positivas. Los índices fagocíticos se refieren a la proporción entre los valores obtenidos a 4 ºC y los valores obtenidos a 37 ºC de coincubación de DC y células tumorales.

Análisis estadísticos

Los datos se presentan como medias aritméticas ± desviación estándar (DE) o porcentajes. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando el programa informático JMP (SAS Institute Inc.). Se empleó el ensayo de la t de Student para comparar las variables continuas (comparación del crecimiento tumoral), y el ensayo de Chi cuadrado para las variables no paramétricas (comparación de cohortes de animales). Para todos los ensayos, el nivel de significancia estadística se ajustó a 0,05.

Métodos bioquímicos

La purificación de las proteínas de la membrana plasmática, la espectroscopía de masas y la generación de citoplastos se detalla a continuación.

Biotinilación de proteínas de la superficie de células CT26

Se realizó la biotinilación y la recuperación de las proteínas de la superficie celular con un método adaptado de Gottardi et ál. (Gottardi, C.J., Dunbar, L.A. y Caplan, M.J., Biotinylation and assessment of membrane polarity: caveats and methodological concerns, Am. J. Physiol., 268, F285-295 (1995)) y Hanwell et ál. (Hanwell, D., Ishikawa, T., Saleki, R. y Rotin, D., Trafficking and cell surface stability of the epithelial Na+ channel expressed in epithelial Madin-Darby canine kidney cells, J. Biol. Chem., 277, 9772-9779 (2002)). Brevemente, 20 x 106 células CT26 cultivadas en un matraz de 75 cm2 se colocaron en hielo y se lavaron tres veces con PBS-Ca2+-Mg2+ enfriado en hielo (PBS con CaCl2 0,1 mM y MgCl2 1 mM). Después las proteínas de la membrana se biotinilaron mediante una incubación durante 30 min a 4 ºC con NHS-SS-biotina 1,25 mg/ml (Pierce) recién diluido en tampón de biotinilación (trietanolamina 10 mM, CaCl2 2 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) con agitación suave. Las células CT26 se enjuagaron con PBS-Ca2+-Mg2+ + glicina (100 mM) y se lavaron en este tampón durante 20 min a 4 ºC para extinguir la biotina no reaccionada. Las células después se enjuagaron dos veces con PBS-Ca2+-Mg2+, se rasparon en PBS frío, y se sedimentaron a 2.000 rpm a 4 ºC. Los sedimentos se solubilizaron durante 45 min en 500 μl de tampón de lisis (Triton X-100 al 1%, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, Tris 50 mM, pH 7,5) que contenía inhibidores de proteasas. Los lisados se aclararon mediante centrifugación a 14.000 x g durante 10 min a 4 ºC, y los sobrenadantes se incubaron durante la noche con esferas de agarosa-estreptavidina cargadas para recuperar las proteínas biotiniladas. Las esferas después se sedimentaron mediante centrigugación, y se tomaron partes alícuotas de los sobrenadantes para representar el conjunto de proteínas no unidas intracelulares. Las proteínas biotiniladas se eluyeron de las esferas mediante un calentamiento hasta 100 ºC durante 5 min en tampón de muestras de SDS-PAGE antes de cargarlas en un gel de SDS al 10%-PAGE según se describió anteriormente. Para asegurarse de la ausencia de filtración de biotina hacia el interior de las células, los inventores verificaron sistemáticamente la ausencia de la proteína actina intracelular y GAPDH en los extractos biotinilados.

Análisis de electroforesis en gel bidimensional e identificación de las proteínas mediante espectrometría de masas

Las proteínas purificadas se precipitaron utilizando el kit de limpieza Ettan 2-D (GE Healthcare) y después se resuspendieron en tampón urea (urea 7 M, tiourea 2 M, CHAPS al 2%, sulfobetaína SB3-10 al 1%, amidosulfobetaína ASB14 al 1%, DTT 50 mM). Para la primera dimensión de la seperación de proteínas se realizó un enfoque isoeléctrico (IEF) utilizando tiras de gradiente de pH no lineal inmovilizadas de 18 cm (pH 3 a 10, GE Healthcare) en una unidad de electroforesis IPGphor II (GE Healthcare). Las proteínas (100 μg) se cargaron mediante rehidratación en gel durante 9 h, utilizando un voltaje bajo (30 V) y después se ensayaron utilizando un programa en el que el voltaje estaba ajustado para 1 h a 100 V, 2 h a 200 V, 1 h a 500 V, 1 h a 1.000 V, 2 hrs, 2 hrs de gradiente de voltaje de 1.000-8.000 V, y 4 h a 8.000 V. Antes de la electroforesis en la segunda dimensión, las tiras de gel IPG se equilibraron durante 10 min a temperatura ambiente en ditiotreitol al 1% para reducir las proteínas, y después los grupos sulfhidrilo se derivatizaron utilizando yodoacetamida al 4% (ambas disoluciones se prepararon en Tris 50 mM (pH 8,8)-urea 6 M-glicerol al 30%-SDS al 2%-azul de bromofenol al 2%). Las tiras se trasladaron a geles de poliacrilamida al 10% (en p/v) de 1,0 mm de espesor (20 x 20 cm), y los geles en la segunda dimensión se ensayaron a 50 μA durante 6 h. Los geles se tiñeron con Sypro Ruby (BioRad) y se visualizaron utilizando un escáner Typhoon 9200 (GE Healthcare). Se empleó el analizador Investigator HT (Genomic Solutions Inc.) para la correspondencia y el análisis de las manchas de proteína visualizadas entre los geles diferenciales. Se empleó una resta del fondo para normalizar el valor de intensidad que representa la cantidad de proteína por mancha.

Las manchas expresadas diferencialmente se cortaron de los geles con un recolector de manchas automático (Investigator ProPic, Genomic Solutions Inc.), se colocaron en tubos Eppendorf, y se destiñeron lavando durante 5 min con 50 μl de NH4HCO3 0,1 M. Después se añadieron 50 μl de acetonitrilo al 100%, incubando durante 5 min

más. El líquido se desechó, las etapas de lavado se repitieron una vez más, y los lechos cortos del gel se encogieron mediante la adición de acetonitrilo puro. Los trozos de gel secados se volvieron a hinchar con tripsina 4,0 ng/μl (Promega, Madison, WI) en NH4HCO3 50 mM, y se digirieron durante la noche a 37 ºC. Los péptidos se concentraron con puntas de pipetas ZipTip®μC18. La coelución se realizó directamente sobre una diana MALDI con 1 μl de matriz de ácido alfa-ciano-4-hidroxicinámico (5 μg/ml en acetonitrilo al 50%, TFA al 0,1%). Se realizó un MALDI-MS y un MALDI-MS/MS en un analizador proteómico Applied Biosystems 4700 con una óptica de iones TOF/TOF. Los espectros se adquirieron en el modo de reflector de MS positivo y se calibraron externamente utilizando cinco picos de patrón (mezcla de calibración ABI4700) o internamente utilizando los picos de péptidos de autolisis de tripsina porcina (iones [M+H]+ 842,51, 1045,56 y 2211,10). Los espectros de masas se obtuvieron a partir de cada mancha de muestra mediante la acumulación de 30 subespectros (cada uno consiste en 50 disparos de láser) en un intervalo de masas de 750 a 4000. Se seleccionaron los cinco mejores picos de señal frente al ruido de cada espectro para el análisis de MS/MS. Para los espectros de MS/MS, la energía de colisión fue de 1 keV y el gas de colisión fue el aire (Medzihradszky, K.F. et ál., The characteristics of peptide collision-induced dissociation using a high-performance MALDI-TOF/TOF tandem mass spectrometer, Anal. Chem., 72, 552-558 (2000)).

Los datos de MS y MS/MS se interpretaron utilizando el programa informático GPS Explorer (versión 2.1, Applied Biosystems), que actúa como una interfase entre la base de datos de Oracle que contiene los espectros brutos y una copia local del motor de búsqueda MASCOT (versión 1.8). Se emplearon las huellas digitales de masas de los péptidos obtenidas en el análisis MS para la identificación de proteínas en la base de datos no redundante Swiss Prot. Todos los valores de masas de los péptidos se consideraron monoisotópicos, y la tolerancia de masas se ajustó a <50 ppm. Se administró tripsina como la enzima de digestión, se permitió 1 sitio de ruptura no realizada, se supuso que la metionina estaba parcialmente oxidada y la serina, la treonina y la tirosina parcialmente fosforiladas. Unas puntuaciones Mascot (Matrix Science) mayores que 71 se consideraron significativas (p<0,005). Para el análisis de MS/MS, todos los picos con una proporción de señal frente al ruido mayor que 5 se buscaron frente a la base de datos Swiss Prot utilizando las mismas modificaciones que la base de datos MS. Se consideró una tolerancia a fragmentos menor que 0,3 Da.

Preparación de citoplastos

Células CT26 tripsinizadas se enuclearon según se describe en la publicación de Andreau, K. et ál., Contagious apoptosis facilitated by the HIV-1 envelope. Fusion-induced cell-to-cell transmission of a lethal signal, J.. Cell. Sci., 117, 5643-5653 (2004). Brevemente, las células se trataron con 2 ml de medio RPMI completo que contenía citocalasina B (10 μg/ml, Sigma) y ADNasa I (80 U/ml, Sigma). La suspensión celular se ajustó a una concentración final de 5 x 106/ml y se incubó a 37 ºC durante 45 minutos antes de ser cargada sobre un gradiente de densidad de Ficoll discontinuo previamente preparado (Pharmacia) (3 ml del 100%, en 1 ml del 90% y 3 ml del 55% de capa de Ficoll Paque que contiene citocalasina B 5 μg/ml y ADNasa I 40 U/ml; los gradientes se prepararon en tubos de ultracentrífuga y se preequilibraron a 37 ºC en un incubador de CO2 durante la noche). Los gradientes que contienen las suspensiones celulares se centrifugaron en un rotor Beckman SW41 precalentado a 25.000 rpm durante 20 minutos a 30 ºC. La fracción enriquecida en citoplastos se recogó de la interfase entre la capas de Ficoll al 90% y al 100%, se lavó en medio RPMI completo, y se incubó a 37 ºC. Las células se incubaron con MTX, CA, Sal y TA durante el periodo de tiempo indicado en el experimento. Después se detectó la CRT en la superficie celular (véase "Materiales y métodos") y se determinó la viabilidad con tinción de yoduro de propidio (2 μl/ml, Sigma) durante 5 min, seguido de un análisis citofluorométrico. Como alternativa, los citoplastos se cocultivaron con DC inmaduras durante 2 horas a una proporción de 1:1 y 1:5. Al final de la incubación, las células se recolectaron con Versene, se reunieron con las células no adherentes presentes en el sobrenadante, se lavaron y se tiñeron con anticuerpo CD11c-FITC. La fagocitosis se evaluó mediante un análisis FACS de las células doble positivas.

Se ofrecen diferentes ejemplso para completar e ilustrar la invención de la presente solicitud.

Ejemplo 1: La exposición de CRT define la muerte celular inmunogénica

Células tumorales CT26 moribundas expuestas a un panel de aproximadamente 20 inductores de la apoptosis diferentes (todos los cuales inducen aproximadamente 70 ± 10% de apoptosis, según se determina mediante tinción doble con el tinte vital DAPI y el tinte de unión a PS Annexin V, figura 1A) se inyectaron en un flanco de ratones BALB/c inmunocompetentes, seguido de una reexposición de los animales a células tumorales vivas inyectadas en el flanco opuesto 8 días después. Después, la protección frente al crecimiento tumoral se interpretó como una señal de vacunación antitumoral (figura 1B), porque dicha protección no se observó en ratones BALB/c atímicos (nu/nu) (Casares, N. et ál., J. Exp. Med., 202, 1691-1701 (2005), los datos no se muestran). La mayoría de los inductores de la apoptosis, incluyendo los agentes que se dirigen al retículo endoplásmico (RE) (tapsigargina, tunicamicina, brefeldina), las mitocondrias (arsenita, ácido betulínico, C2-ceramida) o el ADN (Hoechst 33342, camptotecina, etopósido, mitomicina C), no inducen una apoptosis inmunogénica, mientras que las antraciclinas (doxorrubicina, idarrubicina, mitoxantrona) provocan una muerte celular inmunogénica (figura 1B,C). Para identificar los cambios en el proteoma de la membrana plasmática, los inventores purificaron por afinidad proteínas de la superficie biotiniladas a partir de células que no fueron tratadas o que habían sido tratadas a corto plazo (4 h) con doxorrubicina o doxorrubicina más Z-VAD-fmk, un inhibidor de pan-caspasa que reduce la inmunogenicidad de la muerte celular provocada por doxorrubicina (Casares, N. et ál., J. Exp. Med., 202, 1691-1701 (2005) y figura 1B). La comparación

de electroforesis bidimensionales (figura 2A), seguido de un análisis espectroscópico de masas, condujo a la identificación de la CRT (figura 2B) como una proteína que es fuertemente inducida (en un factor de 6) por la doxrrubicina, pero menos (en un factor de 1,8) por la doxorrubicina combinada con Z-VAD-fmk. Otra proteína cuya exposición en superficie es inducida específicamente por la doxorrubicina se identificó como ERp57 (figura 2A), una chaperona que interacciona con CRT (Bedard, K., Szabo, E., Michalak, M. y Opas, M., Int. Rev. Cytol., 245, 91-121 (2005)). Unos análisis de inmunotransferencia de geles bidimensionales (no se muestran) y una electroforesis convencional de las proteínas de la superficie de la membrana plasmática purificadas (figura 2C), confirman la exposición en la superficie de CRT después de un tratamiento con antraciclinas. Esta exposición sobre la superficie de CRT también se detectó mediante tinción de inmunofluorescencia de células vivas tratadas con antraciclinas (figura 2D) y no vino acompañada de un aumento general en la abundancia de CRT intracelular (figura 2C,D). La inducción de la exposición de CRT por antraciclinas fue un proceso rápido, detectable tan pronto como 1 h después del tratamiento (figura 1S A,B), y así precede a la exposición de fosfatidilserina (PS) asociada a la apoptosis (figura 1S C,D). La exposición de CRT no se correlaciona con alteraciones en la expresión de CD47 (figura 2C). Nótese que existe una fuerte correlación lineal positiva (p<0,001) entre la aparición de la CRT en la superficie celular (medida a las 4 h) y la inmunogenicidad provocada por el panel de 20 inductores de la apoptosis diferentes (figura 2E).

Ejemplo 2: Necesidad de la CRT para el reconocimiento mediado por DC de células tumorales moribundas

A la vista del papel establecido de la CRT como una señal de "cómeme" (Gardai, S.J. et ál., Cell, 123, 321-334 (2005); Ogden, C.A. et ál., J. Exp. Med., 194, 781-795 (2001)), los inventores decidieron investigar más a fondo la posible implicación de la CRT en la fagocitosis de células tumorales tratadas con antraciclina por DC, un tipo celular que es rigurosamente necesario para montar una respuesta inmunológica contra células tumorales apoptóticas (Steinman, R.M., Turley, S., Mellman, I. e Inaba, K., J. Exp. Med., 191, 411-641 (2000); Casares, N. et ál., J. Exp. Med., 202, 1691-1701 (2005)). Las células tumorales tratadas con antraciclinas adquieren la propiedad de ser fagocitadas por DC con rapidez, bastante antes de la manifestación de cambios apoptóticos, a las pocas horas después del tratamiento con doxorrubicina o mitoxantrona (figura 3A, figura 2S A), que se correlaciona con la rápida inducción de CRT (figura 3B, figura 1S A,B) y la adquisición de inmunogenicidad (figura 2S B). La presencia de CRT sobre la superficie de células tumorales tratadas con un panel de inductores de la muerte celular diferentes se correlaciona firmente con su fagocitosis mediada por DC, lo cual sugiere que la CRT es importante para mediar en la captación de células tumorales por DC (figura 3B). Por consiguiente, el bloqueo de la CRT presente sobre la superficie de células cancerosas tratadas con mitoxantrona por medio de un anticuerpo específico de origen aviar (que no puede interaccionar con receptores de Fc de ratón) inhibe su fagocitosis por DC (figura 3C). De modo similar, la inactivación de CRT con un ARNmc específico (figura 3D, E) suprime la fagocitosis de células tumorales tratadas con antraciclina (figura 2F). La adición de una proteína de CRT recombinante (rCRT), que se une a la superficie de las células, puede revertir el defecto inducido por el ARNmc específico de CRT, tanto al nivel de expresión de CRT (figura 3E) como de la fagocitosis por DC (figura 3F). Debe notarse que la rCRT sola no estimula la maduración de DC ex vivo a través de un amplio intervalo de concentraciones. Por tanto, la CRT en la superficie provoca la fagocitosis por DC.

Ejemplo 3: Necesidad de la CRT para la inmunogenicidad de células tumorales moribundas

La inactivación de CRT compromete la inmunogenicidad de células CT26 tratadas con mitoxantrona, y este defecto fue restablecido cuando se emplea rCRT para complementar el defecto de CRT inducido por el ARNmc específico de CRT. Este resultado fue obtenido en dos sistemas experimentales distintos, concretamente (i) cuando las células tumorales CT26 se inyectan en el flanco de ratones Balb/c (o las células MCA205 se inyectan en ratones C57BI/6, no se muestra) para evaluar la eficacia de la vacunación antitumoral (figura 4A), y (ii) cuando las células tumorales se inyectan en la almohadilla de la pata para medir la producción de interferón-γ por células T del nódulo linfático poplíteo (figura 4B). En este último sistema, la adsorción de rCRT a la superficie de la membrana plasmática potencia en gran medida la inmunogenicidad de células que habitualmente no inducen una respuesta inmunológica, tales como células tratadas con mitomicina (figura 4C). De modo similar, las células tratadas con etopósido revestidas con rCRT provocan una vigorosa respuesta inmunológica antitumoral in vivo, en condiciones en las que células con revestimiento simulado tratadas con etopósido son muy poco inmunogénicas (figura 4E). Sin embargo, la adsorción de rCRT sobre la superficie celular sin un tratamiento anterior con inductores de la muerte celular no provoca una respuesta inmunológica anticáncer, y las células pretratadas con rCRT vivas inoculadas en ratones formaron tumores, en ratones inmunocompetentes (figura 4E) e inmunodeficientes (no se muestra). Así, la CRT determina, de modo crucial, la inmunogenicidad de la muerte celular in vivo pero no determina la muerte celular como tal.

Ejemplo 4: Los inhibidores de PP1/GADD34 inducen la exposición de CRT e inducen inmunogenicidad

Puesto que la exposición de CRT inducida por antraciclinas es un proceso bastante rápido (en 1 h, figura 1SA, 1SB), los inventores sospecharon que las antraciclinas podrían ejercer efectos que no son mediados por el estrés genotóxico. En respuesta a la mitoxantrona, las células enucleadas (citoplastos) expusieron con rapidez (en 1 h) la CRT (figura 5A), y fueron presa de las DC (no se muestra) de un modo tan eficaz como las células intactas (figura 3A), lo cual indica la existencia de una diana de antraciclinas citoplásmica (no nuclear). Las antraciclinas no indujeron un estrés mitocondrial inmediato (no se muestra), pero provocaron la rápida fosforilación de elF2alfa

(figura 5B), una proteína que generalmente se hiperfosforila bajo un estrés en el retículo endoplásmico debido a la activación de quinasas de estrés (Zhang, K. y Kaufman, R.J., J. Biol. Chem., 279, 25935-25938 (2004)). La inactivación de las cuatro quinasas conocidas por fosforilar elF2alfa (GCN2, HRI, PERK, PKR) no inhibe la exposición de CRT estimulada por antraciclinas (no se muestra). Por contraste, la inactivación de GADD34 o de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1) (figura 5C), que juntas forman el complejo de PP1/GADD34 implicado en la desfosforilación de elF2alfa, es suficiente para inducir la exposición de CRT (figura 5D y no mostrado). La exposición de CRT activada por la reducción de la cantidad de PP1 o GADD34 no fue más potenciada por la mitoxantrona (figura 5D), lo cual sugiere que PP1/GADD34 y las antraciclinas actúan en la misma vía para provocar la translocación de CRT hacia la superficie celular. La exposición de CRT fue inducida, de modo eficaz, por inhibidores de PP1/GADD34 químicos, concretamente tautomicina, caliculina A (ambas inhiben la subunidad catalítica de PP1) (Gupta, V., Ogawa, A.K., Du, X., Houk, K.N. y Armstrong, R.W., J. Med. Chem., 40, 3199-3206 (1997)), así como por salubrinal (que inhibe el complejo de PP1/GADD34) (Boyce, M. et ál., Science, 307, 935-939 (2005)) (figura 5E). Todos estos inhibidores de PP1/GADD34 inducen la exposición de CRT con una rápida cinética similar a las antraciclinas, en células (figura 5E) y en citoplastos. La mitoxantrona y el salubrinal inducen la exposición de CRT sobre un panel de líneas celulares tumorales de origen murino (MCA205, B16F10, J558) o humano (HeLa, A549, HCT116). La exposición de CRT inducida por antraciclinas e inhibidores de PP1/GADD34 no se vio afectada por los inhibidores de la transcripción, la traducción o los microtúbulos, pero fue eliminada por la latrunculina A, un inhibidor del citoesqueleto de actina y la exocitosis (figura 3S). La inhibición del complejo de PP1/GADD34 con salubrinal, caliculina A o tautomicina no fue suficiente para inducir la muerte celular inmunogénica (figura 5F, G) (y las células, que no murieron, formaron tumores letales cuando se inyectaron en animales). Sin embargo, estos inhibidores potenciaron en gran medida la exposición de CRT (figura 5F) y el potencial inmunogénico de las células que sucumben al etopósido (figura 5G) o mitomicina C (no se muestra), y este efecto inmunoestimulador fue abrogado por la inactivación de CRT (figura 5G). En conjunto, estos resultados demuestran que la inhibición de PP1/GADD34 induce la exposición de CRT, que, a su vez, puede estimular la respuesta inmunológica antitumoral.

Ejemplo 5: Quimioterapia inmunogénica mediante la aplicación in vivo de CRT o inhibidores de PP1/GADD34

Una única inyección intratumoral de mitoxantrona en tumores CT26 de 14 días establecidos fue capaz de provocar la regresión permanente en algunos casos, pero no en todos, si los tumores estaban establecidos en ratones BALB/c inmunocompetentes (figura 6A). Sin embargo, no se produce curación con la mitoxantrona si los tumores son portados por ratones nu/nu inmunodeficientes (figura 6B). La inyección intratumoral de rCRT, salubrinal, tautomicina, etopósido o mitomicina C no produjo un efecto terapéutico importante en ratones inmunocompetentes ni en ratones nu/nu. Sin embargo, la combinación de un inductor de la muerte celular (etopósido o mitomicina C) más rCRT fue capaz de provocar la regresión tumoral en animales inmunocompetentes (pero no en inmunodeficientes). Para obtener un efecto terapéutico, la rCRT debe inyectarse en el tumor. La rCRT inyectada en un sitio distante no mejora los efectos antitumorales del etopósido inyectado intratumoralmente (figura 6C). De modo similar, el etopósido o la mitomicina C pueden combinarse con fármacos que inducen la exposición a CRT (salubrinal o tautomicina), conduciendo a la estabilización de la enfermedad o regresión completa del tumor en hospedantes inmunocompetentes (pero no atímicos) (figura 6A, B). Las células CT26 vivas no pudieron crecer en animales que habían sido curados de tumores CT26, lo cual indica el establecimiento de una respuesta inmunológica antitumoral permanente. Se obtuvieron resultados similares cuando se trataron sarcomas MCA205 (en ratones C57BI/6) o carcinomas de colon PRO (en ratas BDIX) establecidos mediante inyecciones locales de inductores de la muerte celular débilmente inmunogénicos más rCRT o inhibidores de PP1/GADD34 (no se muestra). Estos resultados trazan una estrategia de quimioterapia inmunogénica para la curación de un cáncer establecido.

LISTA DE SECUENCIAS

5: <110> Institut Gustave Roussy and Institut National de la Santé Et de la Recherche Médicale <120> Inhibidores de proteína fosfatasa 1, de GADD34 y del complejo de proteína fosfatasa 1/GADD34, preparación y sus usos. su

<130> B0556WO

10: <160> 15

<170> PatentIn versión 3.3

15: <210> 1 <211> 674 <212> PRT <213> Artificial

20: <220> <223> Humano GADD34

<400> 1

<210> 2 5 <211> 12

<212> PRT

<213> artificial

<220> 10 <223> Fragmento de GADD34

<400> 2

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> artificial

<220>

<223> secuencia de DPT-sh1 N-terminal

<400> 3

<210> 4

<211> 24

<212> PRT 30 <213> artificial

<220>

<223> Secuencia artificial que incluye un fragmento de GADD34 y un motivo de translocación

35 <400> 4

40: <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> artificial

<220> <223> siRNA sentido específico de Bax humana

45: <400> 5 ggugccggaa cugaucagat t 21

5: <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> artificial <220> <223> siRNA antisentido específico de Bax humana

<400> 6 ucugaucagu uccggcacct t: 21

15: <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> artificial

<220> <223> siRNA sentido específico de Bak

<400> 7 accgacgcka tgactcagag ttc: 23

25: <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> artificial

<220> <223> siRNA antisentido específico de Bak

<400> 8 acacggcacc aattgatg: 18

35: <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> artificial

<220> <223> Secuencia de siRNA sentido control

<400> 9 gccgguaugc cgguuaagu: 19

45: <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> artificial

<220> <223> Secuencia de siRNA antisentido control

55: <400> 10 acuuaaccgg cauaccggc <210> 11 <211> 35 <212> DNA <213> artificial 19

<220> <223> siRNA sentido específico de CRT

65: <400> 11 rcrcrgrcur grgrgurcrg raraurcrrr aratt 35

30

5: <210> 12 <211> 38 <212> DNA <213> artificial

<220> <223> siRNA específico de GADD34.

10: <400> 12 rcrargrgra rgrcrargra urcrargrau rargratt 38

15: <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> artificial

20: <220> <223> siRNA específico de PPICalfa. <400> 13 rgrcurgrgr crcuraurar argraurcra rgratt 36

25: <210> 14 <211> 35 <212> DNA <213> artificial

30: <220> <223> siRNA control

<400> 14 rgrcrcrgrg uraurgrcrc rgrguurara rgutt: 35

35: <210> 15 <211> 416 <212> PRT <213> artificial

40: <220> <223> secuencia de la proteína CRT.

<400> 15

Claims

REIVINDICACIONES

1.- El uso de un inhibidor de proteína fosfatasa seleccionado de un inhibidor de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1), un inhibidor de GADD34, y un inhibidor del complejo de PP1/GADD34, en combinación con un producto utilizado en un tratamiento de un cáncer seleccionado de etopósido o mitomicina C, para preparar una composición farmacéutica para prevenir o tratar un cáncer en un mamífero.
2.- Un inhibidor de proteína fosfatasa seleccionado de un inhibidor de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1), un inhibidor de GADD34, y un inhibidor del complejo de PP1/GADD34, en combinación con un producto utilizado en un tratamiento de un cáncer seleccionado de etopósido o mitomicina C, para su uso para prevenir o tratar un cáncer en un mamífero.
3.- El uso o la composición para el uso según la reivindicación 1 o 2, en el que el inhibidor es un inhibidor de la subunidad catalítica de la proteína fosfatasa 1 (PP1) seleccionado de tautomicina y caliculina A.
4.- El uso o la composición para el uso según la reivindicación 1 o 2, en el que el inhibidor es un inhibidor del complejo de PP1/GADD34 seleccionado de salubrinal y un fragmento de GADD34 que consiste en una secuencia que comprende entre 5 y 35 aminoácidos de SEQ ID NO:1.
5.- El uso o la composición para el uso según la reivindicación 4, en el que el fragmento de GADD34 tiene la secuencia LKARKVRFSEKV (SEQ ID NO:2).
6.- El uso o la composición para el uso según la reivindicación 4 o 5, en el que el fragmento de GADD34 comprende también un motivo de translocación hacia la membrana plasmática que es capaz de unirse a la superficie de una célula tumoral.
7.- El uso o la composición para el uso según la reivindicación 6, en el que la célula tumoral procede de un carcinoma, un sarcoma, un linfoma, un melanoma, un tumor pediátrico y un tumor leucémico.
8.- El uso o la composición para el uso según la reivindicación 6 o 7, en el que la secuencia del motivo de translocación es VKKKKIKREIKI (SEQ ID NO:3).
9.- El uso o la composición para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, en el que la secuencia del péptido es VKKKKIKREIKI-LKARKVRFSEKV (SEQ ID NO:4).
10.- El uso o la composición para el uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el cáncer se selecciona de un cáncer de mama, un cáncer de próstata, un cáncer de colon, un cáncer de riñón, un cáncer de pulmón, un osteosarcoma, un GIST, un melanoma, una leucemia y un neuroblastoma.
11.- Un método in vitro para seleccionar un péptido capaz de inhibir la formación o la actividad del complejo de PP1/GADD34 en una célula, que comprende las etapas de:

a) proporcionar un péptido de ensayo que comprende un fragmento de secuencia dentro de SEQ ID NO:1, o un fragmento homólogo de este,

b) poner en contacto el péptido de ensayo de la etapa a) con la célula, y

c) detectar y/o medir el nivel de exposición de la calreticulina (CRT), del receptor de KDEL y/o de ERp57 sobre la superficie de dicha célula, en el que una mayor exposición, en comparación con una célula control que no se ha puesto en contacto con el péptido de ensayo, o que se ha puesto en contacto con un mutante de dicho péptido de ensayo, es indicativa de una inhibición de la formación o la actividad del complejo de PP1/GADD34 en la célula.
12.- El método según la reivindicación 11, en el que la secuencia de la etapa a) comprende entre 5 y 35 aminoácidos.