ES2411833A2 - Método de pronóstico del carcinoma no microcítico de pulmón de estadio I o II. - Google Patents

Abstract

Método de pronóstico del carcinoma no microcítico de pulmón de estadio I o II. La presente invención se refiere a un método in vitro de obtención de datos Útiles para el pronóstico de cáncer de pulmón no microcítico de estadio I o II caracterizado por la detección y/o cuantificación de perfil de expresión génica de 50 biomarcadores. También se refiere a un método in vitro de pronóstico de cáncer de pulmón no microcítico de estadio I o II que comprende la detección y/o cuantificación de perfil de expresión génica de 50 biomarcadores. Además también se refiere al kit que comprende las sondas capaces de detectar dichos biomarcadores y su uso para la obtención de datos útiles para el pronóstico de cáncer de pulmón no microcítico de estadios I y II.

Description

Método de pronóstico del carcinoma no microcítico de pulmón de estadio I o II.

La presente invención se refiere a un método in vitro de pronóstico en carcinoma no microcítico de pulmón de estadios I

o II basado en la expresión diferencial de 50 genes. Mediante el método de la invención se diferencian pacientes con buen pronóstico y pacientes con mal pronóstico. La presente invención también se refiere a un kit que comprende un conjunto de sondas que reconocen los 50 genes de la invención. Por tanto, la invención se podría encuadrar en el campo de la medicina.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El cáncer de pulmón es la primera causa de muerte por cáncer con una tasa anual de más de 1,1 millones de personas en todo el mundo, y con una tasa de supervivencia a cinco años de sólo el 15%. Aproximadamente el 80% de los casos diagnosticados se clasifican como carcinoma no microcítico de pulmón (CNMP) y el 20% restante corresponden a carcinoma microcítico de pulmón (CMP). En el CNMP, los tipos más frecuentes son el carcinoma epidermoide o escamoso y el adenocarcinoma.

El sistema de estadiaje TNM (7ª edición) basado en el tamaño del tumor (T), la afectación ganglionar (N) y la presencia de metástasis a distancia (M) es, en la actualidad, el factor pronóstico más utilizado en los pacientes con CNMP. En función de estos parámetros, los tumores se clasifican en: estadio I y estadio II (en ambos casos la enfermedad es localizada), estadio III (enfermedad localmente avanzada) y estadio IV (enfermedad metastásica) (Kligerman S. Amerian Journal of Roentgenology 2010. 194:562-573).

En estadios iniciales o tempranos (estadios I y II), la cirugía con intención curativa es el tratamiento de elección encontrándose en continua discusión el beneficio de la quimioterapia adyuvante para disminuir la elevada tasa de recurrencia posterior a la resección quirúrgica que oscila entre un 30-35% de los pacientes. En concreto, en estadios II, la quimioterapia adyuvante basada en platinos, como el cisplatino, ha demostrado mejorar la supervivencia de determinados subgrupos pero, por otro lado, existe un porcentaje de pacientes que a pesar de no recaer tras la cirugía reciben tratamiento adyuvante y que son por lo tanto pacientes tratados en exceso. Este sobretratamiento repercute en problemas en estos pacientes asociados a los efectos secundarios de dichos tratamientos. Respecto a los estadios I (que engloba a los subgrupos IA y IB), y según la guía de consenso elaborada por el “National Comprehensive Cancer Network” (NCCN) en 2011, en el subgrupo IA la quimioterapia adyuvante no está indicada, mientras que en los pacientes del subgrupo IB, sólo está recomendada en aquellos que cumplan factores de riesgo como pobre grado de diferenciación, invasión vascular, resección en cuña y márgenes mínimos. Por lo tanto, debido a la falta de precisión de los métodos actuales para definir el pronóstico de los estadios tempranos del CNMP, en la actualidad existen pacientes que reciben un tratamiento adyuvante que no les beneficia y también pacientes que no reciben un tratamiento adyuvante y que sin embargo tienen una alta probabilidad de recurrencia del tumor.

Actulamente, en el cáncer de pulmón no se conocen marcadores de probado valor pronóstico y predictivo que indiquen cúal será la progresión del paciente (Karapaniagiotou E, et al. Open Lung Cancer J 2009. 2: 24-30). En CNMP se han desarrollado estudios que utilizan plataformas de análisis masivo para la obtención de perfiles de expresión génica que puedan ser utilizadas como biomarcadores pronóstico. Los resultados obtenidos han sido dispares en cuanto a los genes a incluir en el biomarcador, quizás debido al uso de criterios diferentes en cuanto a la inclusión de pacientes en el estudio, la obtención de muestras, la elección de los estadios tumorales, la exclusión o no de subtipos histológicos de gran importancia en el CNMP, así como a la falta, en algunos casos, de validación independiente (Roepman P. et al. Clin Cancer Res 2009. 15:284-290; Chen HY et al. New Engl J Med 2007. 356(1):11-20); Raponi M et al. Cancer Res 2006 66:7466-7472; US20090062144; WO2010007093; Raz DJ et al. Clin Cancer Res 2008 14(17):5565–5570).

Por lo tanto existe la necesidad de desarrollar una herramienta alternativa que pueda ser usada clínicamente, que sea más efectiva que los factores de riesgo estándar en identificar aquellos pacientes completamente resecados y clasificados como estadio I que puedan beneficiarse de la quimioterapia adyuvante y que además permita identificar aquellos pacientes clasificados como estadios II que tengan bajo riesgo de recurrencia y en los que la quimioterapia no sería necesaria. Se requiere por lo tanto un método robusto que sea capaz de estratificar pacientes con CNMP en grupos de buen y mal pronóstico.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

El problema técnico que resuelve la invención es el de proporcionar un método in vitro alternativo que determine el pronóstico del carcinoma no microcítico de pulmón (CNMP) en estadios iniciales para la obtención de un tratamiento personalizado del paciente.

En la presente invención se describe un método in vitro para el pronóstico de CNMP tanto de estadio I como de estadio II que se caracteriza por la detección y/o cuantificación de un producto de expresión del conjunto de 50 genes, que se muestran en la tabla 1 en la muestra biológica de un sujeto. La presente invención también se refiere al uso de los productos de expresión de dichos 50 genes como biomarcadores pronóstico de cáncer de CNMP de estadios I o II.

El método de la invención proporciona un predictor de 50 genes para estadios precoces de CNMP. La estrategia que se utilizó para la obtención de este predictor, comenzó por una detección y/o cuantificación de la expresión génica global de tumores de CNMP en estadios tempranos (I y II). En base a la expresión génica se realizó una clasificación molecular y una asociación con recidiva; la relación de los grupos moleculares con las variables histológicas y clínicas más importantes; la obtención de un predictor que identifica los grupos moleculares generados; la obtención de un predictor que diferencia un grupo de pacientes con buen pronóstico frente a un grupo de pacientes con mal pronóstico; y validación de los predictores con una serie externa. Finalmente, se observó que el método de la invención es útil para el pronóstico de CNMP. El predictor de la invención está constituido por 50 genes que se muestran en la tabla 1, de ahora en adelante, los denominados “50 genes de la invención”.

El término “predictor” se refiere en esta memoria a un perfil de expresión diferencial de genes o perfil de expresión génica.

Se entiende por “perfil de expresión génica” el perfil génico obtenido tras la cuantificación del producto de expresión de los genes de interés. Se entiende por “producto de expresión”, al ARN mensajero (ARNm), el ADN complementario (ADNc), el ARN complementario (ARNc) y/o la proteína producida por los genes de interés o biomarcadores, es decir, por los genes de la tabla 1, en una muestra biológica aislada.

El perfil de expresión de los genes se realiza, preferiblemente, determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción, previa extracción del ARN total presente en la muestra biológica aislada, lo cual puede realizarse mediante protocolos conocidos en el estado de la técnica. La determinación del nivel de ARNm derivado de la transcripción de los genes de la tabla 1 puede realizarse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), RT-PCR cuantitativa, retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; análisis en serie de la expresión génica (SAGE, SuperSAGE); microarrays de ADN o de ARN elaborados con oligonucleótidos o sondas sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de marcaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante resonancia magnética nuclear o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio. El perfil de expresión génica también podría obtenerse mediante la detección y/o cuantificación de las proteínas producto de la traducción del ARNm derivado de la transcripción de los genes de la tabla 1, mediante por ejemplo, pero sin limitarnos, inmunodetección por inmuno blotting, inmunohistoquímica, cromatografía o microarrays.

La presente invención podría referirse también a un método in vitro para el pronostico de CNMP tanto de estadio I como de estadio II que se caracteriza por la detección del número de copias en el ADN de los 50 genes que se muestran en la tabla 1, así como de las alteraciones epigenéticas como la hipermetilación del promotor de los genes o como de la alteración de la estabilidad del ARNm debido entre otros factores a modificaciones transcripcionales que afectan por ejemplo a la cola de Poli Adeninas. La presente invención también se refiere al uso de estas alteraciones de los 50 genes como biomarcadores pronóstico de cáncer de CNMP de estadios I o II.

Finalmente el perfil de expresión génica también podría obtenerse mediante la detección y/o cuantificación del número de copias de los genes presentes en la tabla 1, así como de los niveles de alteraciones epigenéticas como el nivel de metilación del promotor o de los niveles de estabilidad del mensajero de estos mismos genes. Esta detección podría llevarse a cabo, aunque sin limitarse mediante microarrays, CGH (Hibridación genómica comparada) o FISH (hibridación in situ fluorescente).

Esta invención también podría aplicarse para estadios avanzados (III y IV).

Por lo aquí descrito, un primer aspecto de la invención se refiere a un método in vitro de obtención de datos útiles para el pronóstico de CNMP en estadio I o II caracterizado por la detección y/o cuantificación del producto de expresión de los genes de la tabla 1 en la muestra biológica aislada de un sujeto. A partir de ahora nos referiremos a éste como al “método primero de la invención”.

El término “in vitro” se refiere a que el método de la invención se realiza fuera del cuerpo del sujeto.

El término “pronóstico” en la presente invención se refiere a la capacidad de detectar pacientes que presentan una alta o baja probabilidad de recidiva tras la cirugía. Una alta probabilidad de recidiva se asocia a un mal pronóstico mientras que una baja probabilidad de recidiva se asocia a un buen pronóstico. Se entiende por “recidiva” la reaparición de la enfermedad, en este caso de un cáncer de pulmón. Las expresiones “probabilidad de no recidiva” y “probabilidad de ILE (intervalo libre de enfermedad)” se usan indistintamente en la presente memoria.

El término “cáncer de pulmón no microcítico”, “carcinoma no microcítico de pulmón” (CNMP), “carcinoma de pulmón no microcítico” (CPNM), o cáncer pulmonar de células no pequeñas (en inglés “non-small cell lung cancer”, NSCLC) se refiere a un tipo de cáncer o tumor de pulmón según clasificación histológica que comprende el subtipo carcinoma escamoso o epidermoide, adenocarcinoma, adenoescamoso, carcinoma sarcomatoide, y carcinoma de células grandes.

Se entiende por “estadio” la fase o la clasificación del cáncer de pulmón en base a la clasificación TNM. La clasificación TNM se refiere al tamaño del tumor (T), la afectación de ganglios linfáticos (N) y la afectación de otros órganos (M). El 5 estadio I se refiere a los subestadios IA o IB. El subestadio IA se refiere a los tumores de pulmón de clasificación T1N0M0. El subestadio IB incluye los tumores de pulmón de clasificación T2aN0M0. El estadio II se refiere a cualquiera de los subestadios IIA o IIB. El subestadio IIA se refiere a los tumores de pulmón de clasificación T1N1M0, T2aN1M0 y T2bN0M0. El subestadio IIB incluye los tumores de pulmón de clasificación T2bN1M0 y T3N0M0. En la clasificación TNM, T1 se refiere a cuando el tumor  3 cm de dimensión máxima, está rodeado por tejido pulmonar o pleura visceral y 10 sin invasión proximal al bronquio lobar en fibrobroncoscopia. El T1a es un tumor  2cm y el T1b es un tumor > 2cm y  3cm. T2 se refiere a un tumor > 3 cm de dimensión máxima y  7 cm o un tumor con al menos una de las siguientes características: infiltrar el bronquio principal a 2 cm o menos de la carina, invadir pleura visceral o asociarse con atelectasias o neumonitis obstructiva. T2a es un tumor > 3 cm y  5 cm y T2b es un tumor > 5 y  7 cm. T3 se refiere a un tumor > 7 cm o un tumor que afecta a la pared costal (incluidos los tumores de la cisura superior), diafragma, pleura

15 mediastínica o pericardio; sin afectación del corazón, grandes vasos, tráquea, esófago, cuerpos vertebrales; o un tumor del bronquio principal a menos de 2 cm de la carina, sin infiltración de la misma; donde la atelectasia afecta a todo un pulmón y puede existir derrame pleural no maligno. N0 se refiere al tumor de pulmón sin afectación de los ganglios linfáticos. N1 se refiere al tumor que presenta afectación de los ganglios linfáticos peribronquiales o hiliares ipsilaterales

o ambos. M0 se refiere al tumor de pulmón que no presenta metástasis a distancia.

20 En la presente invención los términos “estadios tempranos”, “estadios iniciales” o “estadios precoces” se refieren a estadio I o II de CNMP.

El término “genes de la tabla 1” se refiere a los genes descritos en la tabla 1 que se muestra a continuación.

Los términos “Identificador Entrez” o “ID Entrez” se refieren al número de referencia del gen en la base de datos de genes del NCBI (National Centre for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine).

25 Tabla 1: listado de los 50 genes del predictor de la invención.

ID Entrez

Símbolo Descripción

270

AMPD1 Adenosina monofosfato deaminasa

608

TNFRSF17 Miembro 17 de la superfamilia del receptor de necrosis tumoral

930

CD19 CD19

939

CD27 CD27

952

CD38 CD38

973

CD79A Molécula alfa asociada a inmunoglobulina

974

CD79B Molécula beta asociada a inmunoglobulina

3002

GZMB Granzima B

3493

IGHA1 Inmunoglobulina pesada constante alfa 1

3494

IGHA2 Inmunoglobulina pesada constante alfa 2

3500

IGHG1 Inmunoglobulina pesada constante gamma 1

3512

IGJ Polipéptido J de inmunoglobulina

3535

IGL@ Locus lambda de inmunoglobulina

3543

IGLL1 Polipéptido 1 "like" inmunoglobulina lambda

3662

IRF4 Factor 4 regulador del interferón

3782

KCNN3 Miembro 3 subfamilia N de canales de potasio activados por calcio

3887

KRT81 Keratina 81

4283

CXCL9 Ligando 9 del motivo CXC de quimioquinas

5368

PNOC Preponocipeptina

5450

POU2AF1 Factor 1 asociado a POU clase 2

8419

BFSP2 Faquinina

9834

KIAA0125 KIAA0125

10563

CXCL13 Ligando 13 del motivo CXC de quimioquinas

11040

PIM2 Oncogén Pim2

26952

SMR3A Proteína 3A regulada por glándula submaxilar

28904

IGKV1D-8 Cadena variable kappa 1D-8 de inmunoglobulina

51237

MZB1 Proteína especifica de las células B1 y B de la zona marginal

51303

FKBP11 Proteína 11 de unión a FK506

54900

LAX1 Adaptador 1 transmembrana de linfocitos

57699

CPNE5 Copina V

57823

SLAMF7 Miembro 7 de la familia SLAM

78986

DUSP26 Fosfatasa 26 especifica dual

79368

FCRL2 "like" receptor 2 Fc

80307

FER1L4 Pseudogen 4 "like" fer-1

83416

FCRL5 Receptor Fc "like” 5

84824

FCRLA Receptor Fc "like” A

90925

IGHV5-78 Pseudogen región pesada variable de cadena pesada de inmunoglobulina 5-78

91319

DERL3 Miembro 3 de la familia de dominio parecido a Der-1

92154

MTSS1L "like" supresor metástasis 1

126306

JSRP1 Proteína 1 de retículo sarcoplasmático

140947

C5orf20 Marco de lectura abierta 20 del cromosoma 5

150365

MEI1 Inhibidor de meiosis 1

221188

GPR114 Receptor 114 acoplado a proteína G

401847

LOC401847 Proteína hipotética LOC401847

642424

LOC642424 Región Walker "like" de la cadena kappa V-I de la inmunoglobulina

100132941

LOC100132941 Proteína hipotética LOC100132941

100133862

LOC100133862 Región V35 "like" de la cadena pesada V-I de la inmunoglobulina

100287723

LOC100287723 Región Walker "like" de la cadena kappa V-I de la inmunoglobulina

100290415

IGHV1-24 Inmunoglobulina pesada variable 1-24

100293440

LOC100293440 Similar a la cadena lambda de inmunoglobulina

A continuación se muestra una breve descripción de algunas de las funciones conocidas de los genes presentados en la tabla 1:

AMPD1: Cataliza la deaminación de la adenosina monofosfato (AMP) a inosina monofosfato (IMP) en el músculo esquelético y tiene un importante papel en el ciclo de las purinas.

TNFRSF17: Este receptor se expresa en linfocitos B maduros y es importante para el desarrollo de las células B y en la respuesta autoinmune. Tiene como ligando al miembro 13b de la superfamilia del factor de necrosis tumoral y activa el factor nuclear del potenciador del gen polipetídico de la cadena ligera Kappa en células B (NF-kappaB) y la proteína kinasa activada por mitógeno 8 (MAPK8/JNK). También se une a otros ligandos y envía señales de supervivencia celular y proliferación.

CD19: Molécula que se une al receptor de antígenos de los linfocitos B para disminuir el umbral de estimulación de los linfocitos a través de la estimulación por antígeno.

CD27: Miembro de la superfamilia del receptor del factor de necrosis tumoral. El receptor tiene la función de generar y mantener durante largo tiempo la inmunidad de las células T. El ligando CD70 se une a él y funciona en la activación de las células B y en la síntesis de inmunoglobulinas. Las proteínas adaptadoras denominadas Factor Asociado a Receptores de Factores de Necrosis Tumoral 2 y 5 (TRAF2 y TRAF5) median en este proceso. La proteína de unión a CD27 (SIVA) es una proteína proapoptótica que juega un importante papel en la apoptosis mediada por este receptor.

CD38: Es una ectoenzima multifuncional que se expresa en multitud de células y tejidos especialmente en leucocitos. CD38 también tiene funciones en la adhesión celular, transducción de señales y señalización por calcio.

CD79A y CD79B: codifican para las proteínas Ig-alpha e Ig-beta que son componentes del receptor antigénico de linfocitos B. Las moléculas Ig-alfa e Ig-beta son necesarias para la expresión y función de este receptor.

GZMB: Los linfocitos T citolíticos (CTL) y las células “natural killer” (NK) tienen la habilidad de reconocer, unir y lisar células diana específicas. La GZMB es crucial para la rápida inducción de la apoptosis de las células diana a través de la respuesta inmune generada por los linfocitos T citolíticos.

IGHA1 e IGHA2: Anticuerpo con una importante presencia en las secreciones mucosas y que representa la primera línea de defensa del organismo. Existen dos subclases Inmunoglobulina A1 (IgA1) e Inmunoglobulina (IgA2).

IGHG1: Este gen se encuentra traslocado en la leucemia linfocítica crónica de células B con el gen Ciclina D1 (CCND1) y en subclases de linfomas MALT (Tejido Linfoide Asociado a Mucosa) con los genes "LIM homeobox 4" (LHX4) y "Forkhead box P1" (FOXP1).

IGJ: Su función es unir dos monómeros o bien de Inmunoglobulina M (IgM) o bien de Inmunoglobulina A (IgA). También tiene la función de unir estas inmunoglobulinas al componente secretor.

IGL@: Cada molécula de inmunoglobulina tiene dos cadenas pesadas idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. Hay dos clases de cadenas ligeras que son kappa y lambda. Este gen abarca el locus de la cadena ligera lambda que incluye el segmento V (variable), segmento J (unión) y segmento C (constante).

IGLL1: Es un gen de la superfamilia de las inmunoglobulinas que codifica para la cadena ligera sustitutiva del receptor de células preB. Mutaciones en este gen pueden producir deficiencia de células B o agammaglobulinemia.

IRF4: Pertenece a la familia de factores reguladores del interferón. Es específico de linfocitos y regula negativamente los receptores tipo Toll (o TLR), que es una molécula central en la activación de la respuesta inmune innata y adaptativa.

KCNN3: Regula la excitabilidad neuronal.

KRT81: Es un miembro de la familia de keratinas.

CXCL9: Su función no está bien definida pero parece que está implicado en el tráfico de células T.

PNOC: Es un neuropéptido que actúa como ligando endógeno del receptor "Opiate Receptor-Like 1" (ORL1).

POU2AF1: Es un coactivador específico de células B y su ausencia parece estar relacionada con defectos en el desarrollo de células B y con la falta de centros germinales.

BFSP2: también denominada faquinina, es una proteína estructural de filamentos del citoesqueleto. Junto a la filensina forma el BF ("beaded filament").

CXCL13: Promueve la migración de linfocitos B preferentemente frente a linfocitos T y macrófagos mediante estimulación con calcio.

PIM2: Es una serin/treonin/protein kinasa. Previene apoptosis y promueve supervivencia celular.

SMR3A: Es un homólogo funcional del gen Vcsa1 ("Variable Coding Sequence A1"). Se ha asociado como un marcador de la disfunción eréctil asociada con etiología tanto diabética como no diabética.

MZB1: Está asociada con las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina tipo M (IgM), promoviendo el ensamblaje de la IgM y su secreción.

FKBP11: Pertenece a la familia FKBP las cuales catalizan el plegamiento de los polipéptidos que contienen prolina. Su función es inhibida por FK506 y por rapamicina.

LAX1: Un regulador negativo de la señalización de linfocitos.

CPNE5: Proteína de unión a membrana dependiente de calcio que parece estar implicada en la regulación de fenómenos moleculares en la interfase de la membrana celular y en el citoplasma.

SLAM7: Está implicada en la activación de células NK y en la regulación de la proliferación de linfocitos B durante la respuesta inmune.

DUSP26: Está asociado con la inactivación de la Proteína Kinasa activada por mitógenos 1 y 3 (MAPK1 y MAPK3), así como con la inhibición de la proliferación de células epiteliales, lo que podría sugerir un papel como gen supresor de tumores.

FCRL2: Forma parte de la superfamilia de receptores de inmunoglobulinas. Puede ser un marcador pronóstico de leucemia linfocítica crónica.

FCRL5: También es parte de la superfamilia de receptores de inmunoglobulinas. Está implicado en el desarrollo de células B y en la linfomagénesis.

FCRLA: Este receptor media la destrucción de los antígenos reconocidos por la Inmunoglobulina G (IgG). Es proteína selectiva de células B y puede estar implicada en su desarrollo.

DERL3: Proteína que se ubica en el retículo endoplasmático con la función de degradar glicoproteínas mal plegadas.

MTSS1L: Puede estar implicada en el empaquetamiento de la actina. Pertenece a la familia MTSS1 (Supresores de Metástasis Tipo 1).

JSRP1: El retículo sarcoplasmático es un compartimento celular que controla la concentración de calcio intracelular y está implicado en las funciones de excitación-contracción de este compartimento celular. En ratones se ha visto que esta proteína interacciona con proteínas claves implicadas en estos procesos de excitación-contracción.

C5orf20: Este gen se expresa en células dendríticas, que son potentes células presentadoras de antígenos implicadas en activar las células T nativas para iniciar la respuesta inmune específica de antígeno.

MEI1: Defectos en su expresión están relacionados con parada en meiosis y se asocia a fenómenos de azoospermia.

GPR114: Proteína G asociada a receptores con un extremo N terminal que contiene regiones ricas en serina/treonina. Se ha descrito su expresión en linfocitos citotóxicos.

IGHV5-78, FER1L4, IGKV1D-8, KIAA0125, LOC401847, LOC642424, LOC100132941, LOC100133862, LOC100287723, IGHV1-24 y LOC100293440: a día de hoy, todavía no se conoce la función de estos genes.

El término “muestra biológica” incluye, pero sin limitarnos, tejidos y/o fluidos biológicos de un individuo, obtenidos mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin.

El término “sujeto” se refiere a un individuo, preferentemente humano, que ha sido diagnosticado de CNMP.

Una realización preferida del primer aspecto de la invención se refiere a un método que además comprende la comparación de los datos útiles obtenidos de la muestra biológica aislada de un nuevo sujeto, con los valores de expresión de referencia para los genes de la tabla 1 obtenidos de sujetos con CNMP estadio I o II en los que el pronóstico es conocido (muestra de referencia). La comparación permite la identificación del nuevo sujeto como un sujeto de buen pronóstico o de mal pronóstico. A partir de ahora, nos referiremos a este método como al “método segundo de la invención”.

El término “muestras de referencia” tal como se entiende en la presente invención se refiere, por ejemplo, pero sin limitarse, a las muestras obtenidas de individuos que presenten un perfil molecular conocido. Este perfil molecular puede ser de buen pronóstico o de mal pronóstico.

Un experto en la materia podría clasificar un nuevo paciente en el grupo de buen o en el grupo de mal pronóstico al comparar sus datos de expresión para los 50 genes de la invención con los datos de expresión para los 50 genes en las muestras de referencia. Estas muestras de referencia son un grupo de muestras de las que se conoce el perfil de expresión de los 50 genes y la presencia o no de recidiva. Por ejemplo, pero sin limitarse, un nuevo sujeto cuyo perfil de expresión sea similar al grupo de referencia de buen pronóstico puede ser clasificado como perteneciente al grupo de buen pronóstico, el cual tiene una probabilidad media de ILE a los 3 años del 85% y/o a los 5 años del 79%. Por ejemplo, pero sin limitarse, un nuevo sujeto cuyo perfil de expresión sea similar al grupo de referencia de mal pronóstico puede ser clasificado como perteneciente al grupo de mal pronóstico, el cual tiene una probabilidad media de ILE a los 3 años del 62% y/o a los 5 años del 48%.

La determinación del pronóstico de nuevos pacientes diagnosticados con CNMP en estadios I o II implica la clasificación de esos pacientes en uno de los dos grupos de referencia previamente definidos: grupo de buen pronóstico o grupo de mal pronóstico. Estos grupos de referencia están constituidos por las muestras de referencia.

La comparación de los datos útiles obtenidos de la muestra biológica de un nuevo sujeto, con los valores de expresión de referencia para los genes de la tabla 1 obtenidos de sujetos con CNMP estadio I o II en los que el pronóstico es conocido (muestra de referencia), puede llevarse a cabo mediante cualquier método estadístico de predicción conocido en el estado de la técnica, como por ejemplo, pero sin limitarse, en cualquiera de los métodos descritos en Simon R. et al. J Clin Oncol 2005; 23:7332-41.

En una realización preferida del método segundo de la invención, la comparación se realiza mediante el método del centroide compacto más cercano. En adelante, el “método tercero de la invención”.

Se entiende como el “método del centroide compacto más cercano” (“nearest shrunken centroid method”) el método de clasificación descrito en Tibshirani R. et al. PNAS. 2002, 99:6567-6572 y aplicado a través de la herramienta Predicción de Análisis por Microarrays (“Prediction analysis of microarrays” o PAM). La herramienta “PAM” fue desarrollada por la Universidad de Standford y es de libre acceso.

La determinación del pronóstico de CNMP de estadios I o II puede establecerse, aunque sin limitarse, mediante la determinación de un “valor de referencia” para el grupo de buen pronóstico (valor 1) y de otro para el grupo de mal pronostico (valor 2). El pronóstico puede realizarse estimando la distancia entre los valores de expresión de la nueva muestra y los “valores de referencia” de cada uno de los dos grupos. Si la distancia entre la nueva muestra y el valor 1 es menor que la distancia entre la nueva muestra y el valor 2, se podrá determinar el pronóstico favorable. Por el contrario, si la distancia entre la nueva muestra y el valor 1 es mayor que la distancia entre la nueva muestra y valor 2, se podrá determinar el pronóstico desfavorable.

Los valores de referencia de cada grupo, se pueden calcular en base a los valores de expresión de los 50 genes en las muestras de la matriz de referencia o “matriz de desarrollo” y vendrán expresados por tanto mediante un vector de 50 componentes. El cálculo del valor de referencia de cada grupo (en nuestro caso el grupo de buen pronóstico y el grupo de mal pronóstico), se obtiene de sumar al valor promedio global de todas las muestras, un segundo factor definido como la distancia (estadístico “t”) entre el valor promedio de expresión de los 50 genes de dicho grupo con respecto al valor promedio de expresión de los 50 genes de todas las muestras incluidas en la matriz de entrenamiento. Los datos del segundo factor serán estandarizados teniendo en cuenta, la variabilidad de expresión de cada uno de los 50 genes dentro del grupo analizado y teniendo en cuenta un valor de convergencia ∆ que permite evaluar el poder predictivo de cada uno de los genes. Se entiende como distancia entre dos muestras, grupos o subtipos, la cuantificación de sus diferencias de expresión.

Aunque el valor final de referencia o “shrunken centroid” obtenido para cada grupo se basa en los valores de expresión, su valor real es adimensional y no es directamente proporcional a los datos de fluorescencia inicialmente obtenidos en cada muestra. Dicho valor de referencia, en cada grupo, contiene 50 componentes, una por cada uno de los genes analizados.

Una vez calculados los valores de referencia para cada grupo, el método del “nearest shrunken centroid”, es capaz de asignar nuevas muestras (que en nuestro caso conforman la matriz de validación) a cada uno de los grupos definidos. La distancia entre la nueva muestra y cada uno de los grupos es relativa a la diferencia entre los valores de expresión de los 50 genes en la muestra nueva con respecto a las componentes del centroide compacto (“shrunken centroid”) que representan cada grupo. La cuantificación de las distancias podrían medirse, aunque sin limitarse, mediante la distancia euclidea (Tibshirani R. Diagnosis of multiple cancer types by shrunken centroids of gene expression. PNAS 2002; 99(10):6567-72). Como se mencionó con anterioridad, la nueva muestra será asignada al grupo del que se encuentre a una menor distancia.

Por todo lo aquí descrito, un segundo aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para el pronóstico del CNMP de estadio I o II caracterizado por:

a.

la detección y cuantificación del producto de expresión de los genes de la tabla 1 en una muestra de referencia;

b.

el cálculo de un valor de referencia (valor 1) para cada producto de expresión de los genes de la tabla 1 en las muestras de referencia de pronóstico favorable (grupo de buen pronóstico) y el cálculo de un

valor de referencia (valor 2) en las muestras de referencia de pronóstico desfavorable (grupo de mal pronóstico) mediante el uso del método del centroide más cercano;

c.

la detección y cuantificación del producto de expresión de los genes de la tabla 1 en la muestra biológica de un nuevo sujeto en el que el pronóstico es desconocido (muestra de estudio);

d.

la comparación mediante el uso del método de clasificación del centroide compacto más cercano de los valores obtenidos en la detección y cuantificación del producto de expresión de los genes de la tabla 1 en la muestra de estudio con los valores de referencia obtenidos en los grupos de buen y mal pronóstico.

e.

la asociación de la muestra de estudio al grupo de buen pronóstico o al grupo de mal pronóstico según lo establecido en el método del centroide compacto más cercano.

En adelante este método se denominará “método cuarto de la invención”.

Una realización preferida del método cuarto de la invención se refiere al método donde el método del centroide compacto más cercano se lleva a cabo a través de la aplicación de Predicción de Análisis de Microarrays (PAM).

Una realización preferida del primer y del segundo aspecto de la invención, se refiere al método donde la muestra de referencia y las muestras de estudio han sido previamente normalizadas antes de la comparación.

Se entiende por “normalización” la utilización de una muestra control que sirva para eliminar variaciones experimentales entre las distintas muestras.

Otra realización preferida del primer y del segundo aspecto de la invención, se refiere al método que además comprende la detección y/o cuantificación de al menos un producto de expresión de los genes descritos en la tabla 2.

Otra realización preferida del primer y del segundo aspecto de la invención, se refiere al método donde el producto de expresión es ARN mensajero. Una realización aún más preferida se refiere al método donde la detección y/o cuantificación del ARN mensajero se realiza mediante microarrays. Una realización también más preferida se refiere al método donde la detección y/o cuantificación del ARN mensajero se realiza mediante RT-PCR.

Otra realización preferida del primer y del segundo aspecto de la invención, se refiere al método donde el producto de expresión es una proteína. Una realización aún más preferida se refiere al método donde la detección y/o cuantificación de la proteína se realiza mediante inmuno blotting, inmunohistoquímica, cromatografía o microarrays.

La detección y cuantificación del producto de expresión (ARNm, ARN complementario obtenido a partir de ADNc, ADN complementario o proteína) se puede realizar utilizando los métodos conocidos por el experto en la materia. Por ejemplo, determinando el nivel de ARNm derivado de su transcripción, previa extracción del ARN total presente en la muestra biológica aislada, lo cual puede realizarse mediante protocolos conocidos en el estado de la técnica. Para ello la muestra biológica aislada puede tratarse física o mecánicamente para romper el tejido o las estructuras celulares y liberar los componentes intracelulares a una solución acuosa u orgánica para preparar los ácidos nucleicos para un posterior análisis. Los ácidos nucleicos se extraen de la muestra por procedimientos conocidos por el experto en la materia y comercialmente disponibles. La determinación del nivel de ARNm derivado de la transcripción de los genes de la tabla 1 puede realizarse, por ejemplo, aunque sin limitarnos, mediante amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la polimerasa (RT-PCR), RT-PCR cuantitativa, retrotranscripción en combinación con la reacción en cadena de la ligasa (RT-LCR), o cualquier otro método de amplificación de ácidos nucleicos; análisis en serie de la expresión génica (SAGE, SuperSAGE); microarrays, micromatrices o chips de ADN elaborados con oligonucleótidos depositados por cualquier mecanismo o elaborados con oligonucleótidos sintetizados in situ mediante fotolitografía o por cualquier otro mecanismo; hibridación in situ utilizando sondas específicas marcadas con cualquier método de marcaje; mediante geles de electroforesis; mediante transferencia a membrana e hibridación con una sonda específica; mediante resonancia magnética nuclear o cualquier otra técnica de diagnóstico por imagen utilizando nanopartículas paramagnéticas o cualquier otro tipo de nanopartículas detectables funcionalizadas con anticuerpos o por cualquier otro medio.

En la presente invención se demuestra que la detección y cuantificación del ARNm total de una muestra biológica de un sujeto con CNMP de estadios I o II es útil para el pronóstico de dicha enfermedad. Por todo ello en una realización preferida de este aspecto de la invención el producto de expresión detectado y cuantificado es ARNm.

Por ello, otra realización preferida del primer aspecto de la invención se refiere a un método donde el producto de expresión es ARNm.

Se entiende por “microarray” (microarray de expresión, chip o micromatriz) al conjunto de sondas (oligonucleótidos o ADNc) dispuestas de manera ordenada sobre una superficie sólida, que permite analizar simultáneamente la expresión del genoma completo de un organismo. Cada una de las sondas representa específicamente un gen determinado al poseer una secuencia complementaria al ARNm transcrito por dicho gen, posibilitando así, la medición de los niveles de expresión de todos los genes que conforman el genoma al mismo tiempo y en un único experimento. Para la utilización de microarrays y obtención de datos a partir de ellos, la fase experimental de los microarrays puede constar de los pasos que se describen a continuación. En primer lugar, el ARN total se retrotranscribe usando como cebador un cebador específico para mensajero (PolidT) y una enzima retrotranscriptasa. Utilizando como molde el ADNc de doble cadena obtenido anteriormente, se sintetizó el ARNc, a la vez que se llevaba a cabo el proceso de amplificación y marcaje de la muestra. El ARNc marcado obtenido se purificó mediante columnas. El ARNc es fragmentado en secuencias mas pequeñas e hibridado al microarray. Dicho proceso de hibridación se lleva a cabo en un horno de hibridación durante un periodo largo de tiempo. En este proceso el ARNc marcado se une de manera específica a los oligonucleótidos sintetizados en el microarrays. Posteriormente el microarray es lavado para eliminar todo el ARNc excedente no unido a los oligonucleótidos.

De acuerdo con la presente invención el producto de expresión, preferiblemente ARNm o ADNc o ARN complementario (ARNc) obtenido a partir de ADNc, puede ser marcado o etiquetado mediante técnicas bien conocidas en el estado de la técnica. Etiquetas detectables incluyen, por ejemplo, isótopos radiactivos, etiquetas fluorescentes, etiquetas quimioluminiscentes, etiquetas bioluminiscentes o etiquetas enzimáticas. Las etiquetas fluorescentes pueden ser distintas en el caso del marcaje del producto de expresión de la muestra biológica y del producto expresión de la muestra control.

Por otra parte, la detección y cuantificación también se pueden realizar mediante RT-PCR, por lo que otra realización preferida del primer aspecto de la invención se refiere a un método según la reivindicación 7 donde la detección y/o cuantificación del ARNm se realiza mediante RT-PCR o preferiblemente mediante RT-PCR a tiempo real. El proceso de RT-PCR se puede llevar a cabo en dos fases:

-

Retrotranscripción: se produce la unión entre un cebador y el ARNm mediante un proceso de incubación conjunta de ambos productos. Seguidamente se produce la retrotranscripción propiamente dicha utilizando enzimas de transcripción inversa.

-

PCR posterior: se produce la amplificación del ADNc obtenido en la fase anterior mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para cada muestra y para cada transcrito de los genes analizados se llevará a cabo la reacción de PCR de manera individualizada. Este proceso implica la repetición cíclica de 3 fases: fase de desnaturalización del ADNc, fase de unión específica del oligonucleótido del gen en estudio a la hebra del ADNc desnaturalizado y fase de elongación a partir del oligonucleótido unido mediante la que se sintetizará una hebra nueva de ADNc. Al tratarse de un proceso que se mide en tiempo real, es necesario usar una molécula fluorescente para monitorizar lo que sucede a lo largo del proceso.

La cuantificación por otro lado también se puede realizar determinando el nivel de proteína derivado de la traducción de los ARNm transcritos a partir de los 50 genes de la invención. Esta cuantificación proteica se puede realizar mediante cualquier método conocido por un experto en la materia que sirva para tal fin, como por ejemplo, pero sin limitarnos, métodos de inmunodetección (como western blot, ELISA, inmunohistoquímica, inmunocitoquímica, inmunofluorescencia), métodos basados en marcajes isobáricos (como iTRAQ -isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation-, o ICAT -Isotope-Coded Affinity Tag-) o en marcajes isotópicos (como SILAC -Stable Isotopes Labeling by Amino Acids in Cell Culture-) o basados en marcajes fluorescentes (como 2D-DIGE -Difference in Gel Electrophoresis-), así como métodos basados en espectrometría de masas (MRM, -Multiple Reaction Monitoring-) . Por todo ello en otra realización preferida de este aspecto de la invención es el método donde el producto de expresión es una proteína.

Otra realización preferida del primer y segundo aspecto de la presente invención se refiere al método donde la detección y/o cuantificación de la proteína se realiza mediante inmuno blotting, inmunohistoquímica, cromatografía o arrays de expresión de proteínas.

Los términos “secuencia de aminoácidos” o “proteína” se usan aquí de manera intercambiable, y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, que pueden estar, o no, química o bioquímicamente modificados. El término “residuo” corresponde a un aminoácido.

Otra realización preferida del primer y segundo aspectos de la presente invención se refiere al método donde la muestra biológica se selecciona de la lista que comprende: tejido, sangre, plasma, suero, linfa, lavado broncoalveolar o fluido ascítico.

Otra realización también preferida del primer y segundo aspectos de la presente invención se refiere al método donde la muestra biológica es fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina.

Otra realización preferida del primer y segundo aspectos de la invención se refiere a un método donde el sujeto es un humano.

Un tercer aspecto de la invención se refiere al uso in vitro de los productos de expresión de los genes de la tabla 1 como marcador pronóstico de cáncer de pulmón no microcítico de estadio I o II.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un kit que comprende las sondas que reconocen el ARN mensajero, producto de la expresión de los genes de la tabla 1, o el ARNc o ADNc a dicho ARNm, o anticuerpos que reconocen una proteína producto de expresión de los genes de la tabla 1. La cuantía de sondas utilizadas para cada gen puede variar en número. Preferiblemente el kit comprende sondas, que consisten en las sondas que reconocen el ARN mensajero producto de la expresión de los genes de la tabla 1. Más preferiblemente las sondas son las secuencias descritas como SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 66 y que reconocen específicamente los 50 genes de la tabla 1. En adelante nos referiremos a este kit como al “kit primero de la invención”.

Una realización preferida del cuarto aspecto de la invención se refiere al kit que además comprende al menos una sonda o un anticuerpo que reconoce un producto de expresión de los genes de la tabla 2. En adelante nos referiremos a este kit como al “kit segundo de la invención”.

Otra realización preferida del cuarto aspecto de la invención se refiere a que el kit puede comprender al menos una retrotransciptasa, o una ARN polimerasa o un fluoróforo. Por lo que una realización preferida del tercer aspecto de la invención se refiere a un kit que además comprende al menos unos de los reactivos seleccionados de la lista que comprende: retrotranscriptasa, una ARN polimerasa o un fluoróforo. Además el kit puede comprender una mezcla de deoxinucleótidos tri-fosfato (dNTPs), una mezcla de nucleótidos tri-fosfato (NTPs), deoxiribonucleasa (DNasa), inhibidores de la ribonucleasa (RNasa), Dithiothreitol (DTT), pirofosfatasa inorgánica (PPi) y los tampones necesarios para las enzimas proporcionadas en el kit.

Además, la presente invención también se refiere al kit donde las sondas o los anticuerpos están preferiblemente situados en un soporte sólido, por ejemplo, pero sin limitarse, cristal, plástico, tubos, placas multipocillo, membranas, o cualquier otro soporte conocido. Por lo que una realización preferida del cuarto aspecto de la invención se refiere a un kit donde las sondas o los anticuerpos están preferiblemente situadas en un soporte sólido.

Un quinto aspecto de la invención se refiere al uso del kit del cuarto aspecto de la invención para la obtención de datos útiles para el pronóstico de CNMP estadios I o II. Además, la obtención de datos puede ser útil para la administración de tratamiento adyuvante, por ejemplo quimioterapia. Por lo que también se refiere al uso del kit primero de la invención para la evaluación de la necesidad de suministrar dicho tratamiento.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y figuras se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Muestra la probabilidad de ILE en los dos subtipos histológicos principales de CNMP. Curva de Kaplan-Meier que muestra la probabilidad de ILE de los dos subtipos histológicos principales del CNMP, adenocarcinoma y carcinoma escamoso en la matriz de desarrollo. ILE, intervalo libre de enfermedad; p, es la probabilidad asociada a que las diferencias encontradas en el ILE entre los subgrupos analizados sean debidas al azar.

FIG. 2. Muestra la probabilidad de intervalo libre de enfermedad en estadios I y II. . Curva de Kaplan-Meier que muestra la probabilidad de ILE para estadios I y II de CNMP en la matriz de desarrollo. ILE, intervalo libre de enfermedad; p, es la probabilidad asociada a que las diferencias encontradas en el ILE entre los subgrupos analizados sean debidas al azar.

FIG. 3. Muestra la agrupación jerárquica de las muestras de la matriz de desarrollo analizadas en función de su perfil molecular con 3.232 genes. Se muestra la agrupación (“clustering”) jerárquica de 84 muestras con 3.232 genes (ver filtrado 3 del ejemplo 1) según el método descrito en Quackenbush J. Nat Rev Genet. 2001;2(6):418-27. Las muestras están diferenciadas en función del subtipo histológico: línea continua, subtipo adenocarcinoma; línea rayada, subtipo escamoso; línea continua terminada en *, otros subtipos de CNMP. Se define “perfil molecular”: como el conjunto de datos genómicos (en nuestro casos niveles de expresión del ARNm) capaz de caracterizar e identificar un sujeto o muestra. Los subtipos moleculares encontrados muestran una clara asociación con los subtipos histológicos de los tumores.

FIG. 4. Muestra la probabilidad de ILE en función de los grupos moleculares obtenidos en la matriz de desarrollo a partir de 3.232 genes. Curva de Kaplan-Meier que muestra la probabilidad de ILE de los dos subtipos moleculares principales del CNMP encontrados en la matriz de desarrollo. ILE, intervalo libre de enfermedad; p, es la probabilidad asociada a que las diferencias encontradas en el ILE entre los subgrupos analizados sean debidas al azar.

FIG. 5. Muestra la agrupación jerárquica de las muestras de la matriz de desarrollo analizadas en función de su perfil molecular con 2.160 genes. Análisis del patrón de expresión génica global de los tumores de la matriz de desarrollo para la obtención de grupos moleculares utilizando el listado de 2.160 genes (ver filtrado 4 del ejemplo 1). A, se muestra la agrupación molecular (“clustering”) jerárquica de 84 muestras con 2.160 genes. B, agrupación perfeccionada por el método de “k-means” descrito en Quackenbush J. Nat Rev Genet. 2001;2(6):418-27. En ambos casos resulta en tres grupos moleculares (Grupo 1, 2 y 3) o “clusters”.

FIG. 6. Muestra la probabilidad de ILE en los tres grupos moleculares obtenidos en función de su perfil molecular con 2.160 genes en la matriz de desarrollo. Curva de Kaplan-Meier que muestra la probabilidad de ILE de los tres grupos moleculares obtenidos utilizando el listado de 2.160 genes y la técnica de “k-means”. ILE, intervalo libre de enfermedad; p, es la probabilidad asociada a que las diferencias encontradas en el ILE entre los subgrupos analizados sean debidas al azar. (x), indica el número de muestras que hay en cada uno de los grupos analizados.

FIG. 7. Muestra la probabilidad de ILE en las muestras de la matriz de validación de acuerdo a la clasificación de 3 grupos moleculares. Curva de Kaplan-Meier que muestra la probabilidad de ILE para las muestras de la matriz de validación (serie externa, Roepman et al.) agrupadas en función de los perfiles moleculares (Grupo 1, Grupo 2 y Grupo 3) previamente observados en la matriz de desarrollo y definidos a través de un predictor de 1.000 genes generado con la aplicación “PAM”. ILE, intervalo libre de enfermedad; p, es la probabilidad asociada a que las diferencias encontradas en el ILE entre los subgrupos analizados sean debidas al azar. (x), indica el número de muestras que hay que hay en cada uno de los grupos analizados.

FIG. 8. Muestra la probabilidad de ILE en las muestras de la matriz de validación de acuerdo a la clasificación establecida mediante el predictor de 50 genes. Curva de Kaplan-Meier que muestra la probabilidad de ILE de los dos grupos moleculares obtenidos en la matriz de validación utilizando el predictor de 50 genes. ILE, intervalo libre de enfermedad; p, es la probabilidad asociada a que las diferencias encontradas en el ILE entre los subgrupos analizados son debidas al azar. (x) indica el número de muestras que hay en cada una de las ramas de la curva de Kaplan-Meier.

FIG. 9. Probabilidad de ILE en las muestras de la matriz de validación de acuerdo a la clasificación establecida mediante el predictor de 50 genes de manera independiente para estadios I y II. Curva de Kaplan-Meier que muestra la probabilidad de ILE de los dos grupos moleculares obtenidos en la matriz de validación con el predictor de 50 genes generado con la aplicación “PAM” para: A, el estadio I, y B, estadio II. ILE, intervalo libre de enfermedad; p, es la probabilidad asociada a que las diferencias encontradas en el ILE entre los subgrupos analizados son debidas al azar.

(x) indica el número de muestras que hay en cada una de las ramas de la curva de Kaplan-Meier.

EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

Ejemplo 1: Obtención del predictor de 50 genes

1.1.- Materiales y métodos 1.1.1 Selección de pacientes

En este estudio se han incluido 84 pacientes (12 mujeres y 72 varones con media de edad de 66,5 -rango de 36-82 años-) diagnosticados en estadios iniciales (60 pacientes estadio I y 24 pacientes estadio II) de CNMP durante los años 2001 a 2008 en el Hospital Clinico San Carlos (HCSC) de Madrid. Todos los pacientes cumplieron los siguientes criterios de inclusión: pacientes con tumores completamente resecados, sin afectación de ganglios mediastínicos, sin tratamiento quimioterápico y de los cuales existiera material tumoral congelado en el biobanco del HCSC perteneciente al subprograma RETICS del Instituto de Salud Carlos III (número de expediente RD090076/0102). Los datos recogidos para el estudio se dividen en datos clínicos del paciente (edad de diagnóstico, sexo y hábito tabáquico) y datos histológicos del tumor (subtipo histológico, tamaño tumor, estadio tumoral –7ª Clasificación TNM (Kligerman S. American Journal of Roentgenology 2010. 194:562-573)–, grado de diferenciación, queratinización, presencia de linfocitos polimorfonucleares –PMN-, afectación ganglionar, mutaciones de k-ras, necrosis, estroma tumoral, inflamación crónica, presencia de linfocitos intratumorales –TIL–, localización por lóbulos pulmonares y tipo de recidiva –loco regional o a distancia–).

1.1.2. Muestras tumorales. Extracción y purificación del ARN.

Siguiendo el protocolo de congelación de las muestras incluidas en el biobanco del HCSC, los tumores de CNMP se recogieron inmediatamente después de la cirugía y se congelaron y almacenaron a -80ºC. Se llevó a cabo la revisión histopatológica de los tumores congelados con el fin de que todos los pacientes incluidos en el estudio tuvieran una representación tumoral como mínimo del 70% en la muestra utilizada. Paralelamente, se recogieron de estos mismos pacientes, muestras de parénquima pulmonar no tumoral que también fueron congeladas siguiendo el mismo protocolo. El ARN proveniente de estas últimas muestras se utilizó para crear la muestra control (un pool de ARN de tejidos normales). En todos los casos, el ácido ribonucleico (ARN o RNA) total fue extraído directamente de las muestras congeladas utilizando Trizol® y un homogeneizador de tejidos. Posteriormente fue tratado con DNAsa y cuantificado en el espectofotómetro NanoDrop ND-1000®. La calidad del ARN extraído se midió en Bioanalyzer 2100® mediante el RIN (o Número de Integridad del ARN) y únicamente las muestras con una buena calidad de ARN (RIN > 7,5), fueron incluidas para el estudio.

1.1.3. Perfil de expresión por microarrays.

El perfil de expresión de los 84 tumores se determinó utilizando microarrays de oligonucleótidos de genoma completo de Agilent® (G4112F) siguiendo el protocolo suministrado por el fabricante. Brevemente, se utilizó doble marcaje, con cianina-5 (Cy5) para cada uno de los 84 tumores incluidos en el estudio y con cianina-3 (Cy3) para la muestra control, compuesta por un “pool” de 42 muestras de parénquima no tumoral de pulmón. Esta muestra control se introdujo en cada uno de los experimentos (la misma en todos ellos) para poder identificar y corregir las variaciones técnicas introducidas durante la fase experimental del análisis. Tras esta corrección (denominada normalización) el dato generado es el ratio entre la fluorescencia del tumor y la muestra control.

Durante las etapas de marcaje e hibridación se incluyeron los “SpikeIns”, que son 10 transcritos control sintetizados in vitro que derivan del transcriptoma del Adenovirus E1A, que no interaccionan con el ARNm humano y cuya concentración inicial es conocida. El conocimiento “a priori” de la concentración inicial de cada uno de los “SpikeIns”, nos permite predecir a qué nivel de fluorescencia deberían emitir estos transcritos una vez hibridados en el microarray y por tanto poder utilizarlos como control de calidad de la fase experimental.

Los microarrays fueron escaneados y cuantificados usando el escáner de Agilent® y el programa Feature Extraction®

(10.7.3) respectivamente. Para la normalización de los datos extraídos se utilizó la técnica Lowess o “Locally Weighted Scatterplot Smoothing”. (Cleveland WS: Journal of the American statistical Association 1979, 74:829-836; Cleveland WS, et al. Journal of the American Statistical Association 1988, 83:596-610.)

1.1.4. Análisis de datos

Para la obtención del método de la invención, se partió de un listado inicial de 41.000 sondas presentes en el microarrays de oligonucleótidos de genoma completo de Agilent®. A partir de un proceso de filtrado se llegó hasta una clasificación molecular que finalmente derivó en la creación del predictor de la invención compuesto por sólo 50 genes. El método se desarrolló siguiendo los siguientes pasos de filtrado:

1.- Filtrado por “flags”: exclusión de sondas con baja fluorescencia o con problemas durante el proceso de hibridación en más de un 10% de las muestras. El nuevo listado incluía 24.617 sondas.

2.- Promedio de las sondas con el mismo identificador con el objetivo de trabajar con valores de expresión únicos para cada gen. El nuevo listado incluía 17.881 genes.

3.- Filtrado por expresión: selección de genes con una variación de expresión al menos de 3 veces respecto a la mediana de ese gen en al menos el 10% de las muestras. El nuevo listado incluyó un total de 3.232 genes (Fig. 3). Una vez generados los grupos moleculares a partir de este listado de 3.232 genes, se evaluó la clasificación molecular obtenida para conocer si existía o no asociación con el intervalo libre de enfermedad (ILE) (Fig. 4).

4.- Filtrado histológico: se eliminaron los genes que caracterizan las diferencias histológicas entre los principales subtipos histológicos del CNMP (adenocarcinoma y carcinoma escamoso). Para ello, se seleccionaron los genes diferencialmente expresados (p-valor < 0,01 y diferencia de expresión > 1,5) y el listado generado (1.072 genes) se excluyó del listado inicial (3.232 genes). Se genera por tanto un listado de

2.160 genes que se utilizan para la clasificación molecular final de los 84 tumores.

La estrategia utilizada para el descubrimiento de los grupos moleculares consistió en aplicar en primer lugar un método de análisis no supervisado, agrupamiento o “clustering” jerárquico (Fig. 5A), y a continuación un perfeccionamiento de los grupos moleculares obtenidos mediante un segundo método, método de k-Means (Fig. 5B), el cual permite disminuir la heterogeneidad intra-grupo y aumentar la variabilidad inter-grupo. El listado de 2.160 genes se usa para construir inicialmente la clasificación molecular (que tiene 3 grupos). Una vez generados estos grupos moleculares, se evaluó la clasificación molecular obtenida para conocer si existía o no asociación con el intervalo libre de enfermedad (ILE) (Fig. 6). El ILE se define como el tiempo que transcurre desde la fecha de la cirugía hasta que se confirma la recidiva del paciente.

En el análisis estadístico se han utilizado curvas de Kaplan-Meier y el test log-rank para evaluar la probabilidad de cada subtipo molecular respecto a la recidiva (Clark TG. British Journal of Cancer 2003. 89: 232-238). Además, con el método de regresión proporcional de Cox se calcula el “hazard ratio” para los grupos moleculares.

Asimismo, se realizó un análisis de las vías moleculares que se encuentran alteradas de manera significativa entre los grupos moleculares obtenidos. Se llevó a cabo utilizando la herramienta GSEA (“Gene Set Enrichment Análisis” o análisis de enriquecimiento de conjuntos de genes) (Subramanian A et al. PNAS 2005 102 (43) 15545-15550 y Mootha VK et al. Nat Gen 2003). Sólo se evaluaron las vías moleculares con una representación mínima de más de 15 genes y se utilizaron 100.000 permutaciones para asegurar los resultados. Para obtener los resultados de GSEA se partió del listado original de 17.881 genes ya que cuando se analizan vías moleculares conviene incluir todos los genes disponibles que cumplan los controles de calidad (17.881 genes), ya que diferencias no significativas de expresión en un grupo de genes pueden sin embargo ser claves, para definir qué caminos de señalización (“pathways”) están alterados entre los grupos.

1.1.5. Validación de los 3 grupos moleculares en una serie externa.

Para la validación de la clasificación molecular obtenida, se utilizó la matriz de datos publicada por el grupo de Roepman y colaboradores (Roepman P et al. Clin Cancer Res 2009. 15:284-290). La matriz de validación incluye los datos de expresión de 162 pacientes diagnosticados de los mismos subtipos histológicos que los de la invención.

El termino "matriz de entrenamiento” o “matriz de desarrollo" se refiere a las muestras del biobanco del HCSC (n= 84). El término "matriz de validación" se refiere al conjunto de muestras publicado por Roepman et al utilizado para la validación de la clasificación molecular. Por “matriz” se entiende el conjunto de datos de expresión obtenidos en una serie de pacientes mediante microarrays.

Para la validación se ha generado una matriz de datos común que incluye 246 muestras (84 de la matriz de desarrollo + 162 de la matriz de validación) cada una de ellas con 17.881 genes. Con la matriz de desarrollo se obtuvo un predictor, mediante la aplicación PAM (Análisis de Predicción de Microarray) (Tibshirani R. et al. PNAS 2002; 99(10):6567-72) que fue evaluado en la matriz de validación estudiando su asociación, mediante la curva de Kaplan-Meier, con el ILE. El modelo de regresión proporcional Cox se utilizó para confirmar el poder pronóstico de nuestro predictor.

1.1.6. Obtención y validación del Predictor de 50 genes.

Los 3 grupos moleculares generados mediante el filtrado histológico, se agruparon en 2 grupos, grupo de buen pronóstico o grupo 3 y grupo de mal pronostico o grupo 1+2, debido a la similitud pronóstica de ambos grupos moleculares. Así, con dos grupos y partiendo de 2.160 genes se seleccionan, mediante la aplicación de PAM, 50 genes (los genes de la invención que se muestran en la tabla 1) capaces de clasificar nuevas muestras en base a estos dos grupos pronóstico en CNMP de estadios I o II. En base a este predictor de 50 genes, las muestras de la matriz de validación fueron clasificadas en el grupo de buen pronóstico o en el de mal pronóstico. Las curvas de Kaplan-Meier y el modelo de regresión proporcional de Cox se utilizaron para validar el poder pronóstico de nuestro predictor (Figs.8, 9A y 9B).

1.1.7. Explicación del análisis con PAM (Tibshirani R. et al. PNAS. 2002, 99:6567-6572).

Para ejemplificar esta descripción, utilizaremos como ejemplo la creación del predictor de 50 genes para dos grupos moleculares (buen y mal pronóstico) mencionados en el apartado anterior. Así pues, usando como herramienta de clasificación la aplicación PAM, el proceso de clasificación pronóstica, requiere como punto de partida el cálculo de un “valor de referencia” para cada uno de los dos grupos. Estos “valores de referencia” se obtienen a partir de las muestras de los pacientes que conforman la denominada “matriz de entrenamiento” o “matriz de desarrollo” y de los que “a priori” se conoce su clasificación (pues fueron con ellas con las que se definió lo que era el grupo de buen y mal pronóstico). A partir de los pacientes del grupo de buen pronóstico obtendremos el “valor 1 de referencia” y a partir de los pacientes del grupo de mal pronóstico obtendremos el “valor 2 de referencia”. Cada uno de los valores de referencia vendrá expresado como un vector de 50 componentes (una por cada uno de los genes de la invención) y se calculará como la suma de dos subvectores cada uno de ellos expresados también con 50 componentes. El primer subvector es común para los dos valores de referencia mientras que el segundo es específico para cada uno de los dos valores de referencia que se quieren calcular. El primer subvector consta de 50 componentes, cada una de las cuales corresponde al valor medio de expresión de uno de los 50 genes a lo largo de todas las muestras que conforman la matriz de entrenamiento

o desarrollo independientemente del grupo en el que se encuentren clasificadas (es decir los 84 tumores de nuestra matriz). El segundo subvector también vendrá definido por 50 componentes (cada una de las cuales representa un gen) que vendrán definidas por un estadistico “t” que compara para dicho gen las diferencias entre el primer subvector y el valor medio de expresión de ese gen en las muestras incluidas en el grupo para el que se quiere calcular el valor de referencia (o bien el grupo de buen pronostico (29 muestras) o bien el grupo de mal pronóstico (55 muestras)). Los datos del segundo subvector serán estandarizados teniendo en cuenta, la variabilidad de expresión de cada uno de los 50 genes dentro del grupo analizado y teniendo en cuenta un valor de convergencia ∆ que permite evaluar el poder predictivo de cada uno de los genes. Las transformaciones mencionadas harán que aunque el “valor de referencia” o “shrunken centroid” obtenido para cada grupo se basa en valores de expresión, su valor real sea adimensional y no sea un reflejo de los datos de fluorescencia iniciales de cada muestra. Una vez calculado el “valor de referencia” o “shrunken centroid” para cada grupo, el PAM es capaz de asignar las nuevas muestras, que en este ejemplo conformaron la matriz de validación (162 muestras), a cada uno de los grupos previamente definidos. La aplicación de esta invención para conocer el pronóstico de los nuevos pacientes se realiza calculando la distancia entre los valores de expresión de los 50 genes de la nueva muestra con respecto a las 50 componentes del “valor de referencia” o “shrunken centroid” de cada grupo. Si la distancia entre la nueva muestra y el “valor 1 de referencia” es menor que la distancia entre la nueva muestra y el “valor 2 de referencia”, se podrá determinar el pronóstico favorable para el nuevo paciente. Por el contrario, si la distancia entre la nueva muestra y el “valor 1 de referencia” es mayor que la distancia entre la nueva muestra y “valor 2 de referencia”, se podrá determinar el pronóstico desfavorable para el nuevo paciente. Durante estos últimos cálculos también se introducen factores que corrigen el resultado teniendo en cuenta la variabilidad de expresión dentro de los grupos y la probabilidad de pertenecer a un determinado grupo teniendo en cuenta su tamaño muestral con respecto al de la población analizada. La cuantificación de las distancias se mide utilizando la distancia euclídea.

1.2.- RESULTADOS

1.2.1. Análisis de asociación del ILE con las variables clínicas e histopatológicas.

Se llevó a cabo un primer análisis estadístico para comprobar si existía una asociación entre las variables histopatológicas más importantes en el manejo rutinario del CNMP (la clasificación histológica del tumor, el estadio, etc.), con el ILE. Las curvas de Kaplan-Meier obtenidas no mostraron una asociación estadísticamente significativa del ILE con el tipo histopatológico (Fig. 1), el estadio (Fig. 2) o con cualquier otra variable analizada (datos no mostrados). Solamente la presencia de mutaciones en el gen K-Ras mostró una tendencia hacia la asociación con un peor pronóstico (p=0,07).

1.2.2. Grupos moleculares a partir de 3.232 genes.

Mediante el método de clustering jerárquico (centrado de Pearson y Average linkage (Quackenbush J. Nat Rev Genet. 2001;2(6):418-27) se identifican dos subtipos moleculares principales que muestran una clara asociación con los subtipos histológicos más representados en nuestra serie, separando molecularmente, los tumores del subtipo adenocarcinoma de los tumores del subtipo escamoso (Fig. 3). Estos 2 subtipos moleculares no muestran diferencias estadísticamente significativas con el ILE (p = 0,350) (Fig. 4).

A la vista de estos resultados, concluimos que los grupos moleculares obtenidos utilizando el listado de 3.232 genes (que son los genes que varían su expresión al menos de 3 veces respecto a la mediana de ese gen en al menos el 10% de las muestras; paso 3 del filtrado anteriormente explicado) se encuentran condicionados por la histología de los tumores. Es importante destacar que no existen diferencias estadísticamente significativas en el tiempo de recidiva cuando se comparan ambos grupos moleculares y recordar que tampoco existían cuando se comparaban ambos grupos clasificados según criterios histológicos.

Teniendo en cuenta que el criterio oncológico para el manejo de los pacientes de CNMP nos indica que la histología de los tumores sólo es importante en la enfermedad metastásica (estadio IV) y sólo en relación con el tratamiento indicado, excluimos del listado inicial de 3.232 genes aquellos que caracterizan las diferencias histológicas de los 84 tumores mediante un filtrado que incluía: T-Test a p<0,01 con corrección para comparaciones múltiples de Benjamini and Hochberg (B&H) (Benjamini Y and Hochberg Y. Journal of the Royal Statistical Society. 1995) y una diferencia de expresión de más de 1,5 veces. Los genes que cumplieron estos criterios de filtrado fueron excluidos, resultado un listado de 2.160 genes que se utilizaron para la obtención de la clasificación molecular y que son los genes incluidos en las tablas 1 y 2.

1.2.3. Grupos moleculares con 2.160 genes. Asociación con ILE.

Tras la agrupación de los 84 pacientes según el perfil de expresión génica utilizando el listado de 2.160 genes y el método de clustering jerárquico (Fig. 5A) posteriormente perfeccionado por el método de k-means, se obtuvieron 3 grupos moleculares que se denominaron como Grupo 1, Grupo 2 y Grupo 3 (Fig. 5B).

Estos tres grupos se asociaron de manera estadísticamente significativa con el ILE (log-rank p=0,004), mostrando en la curva de Kaplan-Meier, 2 grupos moleculares de mal pronóstico respecto a la recidiva (Grupo 1 y Grupo 2) y un grupo molecular de buen pronóstico (Grupo 3) (Fig. 6). El “Hazard ratio” (HR, es decir, el riesgo o probabilidad de recaída que tiene un grupo con respecto a otro) de los grupos de mal pronóstico frente al grupo de buen pronóstico es de 6,4 para el Grupo 1 (IC 95%: 1,8-22,3; p = 0,004) y de 4,9 para el Grupo 2 (IC 95%: 1,4-17,8; p = 0,014). No existe diferencia estadísticamente significativa para el riesgo entre el Grupo 1 y el Grupo 2 (p=0,526).

a)- Análisis multivariante

En este análisis se incluyeron las mutaciones para k-ras por presentar tendencia (p=0,07) para la asociación con el ILE y la clasificación por Estadio ya que es el principal factor pronóstico para el CNMP.

Después de ajustar por Estadio y por el estatus de K-ras, el modelo multivariante de riesgos proporcionales de Cox confirmó la clasificación molecular como factor pronóstico independiente para evaluar el riesgo de recidiva (HR Grupo 1 vs. 3 = 11.170; 95% CI: 2,9 a 43,4; p = 4,9E-04; HR Grupo 2 vs. 3 = 7,521; 95% CI: 2,0 a 28,8; p = 0,003); HR Grupo 1 vs. 2= no significativo).

b)-. Estudio de vías moleculares.

Se observó que la clasificación molecular en 3 grupos estaba relacionada con la implicación de vías moleculares relacionadas con sistema inmune como la vía de Células T, Células B, Inflamación y respuesta Th1 que diferencian el Grupo 3 del Grupo 2 y especialmente el Grupo 3 del Grupo 1. Por otro lado, la alteración de genes implicados en vías

de ciclo celular y mecanismos de reparación del ADN confiere las principales diferencias biológicas entre el Grupo 2 y el Grupo 1.

c)- Análisis estadístico de las variables clínicas e histológicas incluidas en el estudio.

Respecto a las variables clínicas de los pacientes incluidas en el estudio, el hábito tabáquico se asoció de manera estadísticamente significativa con la clasificación molecular obtenida (p=0,002). En el caso de las variables histológicas del tumor, la afectación ganglionar (p=0,041), a pesar de tener solamente 3 pacientes diagnosticados con N1, y la inflamación crónica (p=0,001) también se asocian de manera estadísticamente significativa con los subtipos moleculares.

d)- Validación en serie externa y obtención de predictor para 3 grupos moleculares.

Utilizando la matriz de desarrollo (84 tumores) se obtuvo, mediante el uso de PAM, un primer predictor de 1.000 genes que identificaba los pacientes en los 3 grupos moleculares, dos de mal pronóstico (grupo 1 y grupo 2) y uno de buen pronóstico (grupo 3). Para la evaluación del poder pronóstico de dicho predictor, se utilizaron los datos de los 162 tumores de la matriz de validación. Estas muestras fueron clasificadas en los 3 grupos moleculares utilizando dicho predictor (1.000 genes). La curva de Kaplan-Meier para las muestras de la matriz de validación reveló una asociación estadísticamente significativa de estos tres grupos moleculares con el ILE (log-rank p=0,022) (Fig. 7). El “Hazard Ratio” (HR) de los grupos de mal pronóstico frente al de buen pronóstico es de 2,4 veces para el Grupo 1 (p=0,012) y de 2,5 veces para el Grupo 2 (p=0,019).

1.2.4. Obtención del predictor de 50 genes.

Como se observó con anterioridad en los resultados obtenidos en la matriz de desarrollo, de los tres grupos obtenidos mediante análisis de expresión génica, el comportamiento del Grupo 1 y el Grupo 2 es similar respecto a la recidiva, no existiendo diferencia estadística significativa para el riesgo entre estos dos grupos (p=0,526). Por ello, ambos grupos se englobaron en uno sólo y se generó un segundo predictor de 50 genes, mediante PAM, para diferenciar pacientes de mal pronóstico (Grupo 1 y 2) y pacientes de buen pronóstico (Grupo 3). En la tabla 3 se incluye el valor del centroide compacto (“shrunken centroid”) para los grupos de buen y mal pronóstico obtenidos con las muestras de la matriz de desarrollo. Este segundo predictor engloba los denominados "50 genes de la invención" (ver tabla 1) y la evaluación del poder pronóstico del mismo se llevó a cabo de nuevo en la matriz de validación, obteniendo las curvas de Kaplan-Meier que muestran una asociación estadísticamente significativa de los dos grupos obtenidos con el ILE (log-rank p=0,001) (Fig. 8). El HR para el Grupo de mal pronóstico es de 3,4 frente al de buen pronóstico (IC 95%: 1,6-7,3; p=0,001).

Tabla 3. Muestra los valores de referencia de los 50 genes obtenidos con las muestras de la matriz de desarrollo para cada uno de los grupos. Estos valores serán utilizados para clasificar las nuevas muestras en grupo de buen o mal pronóstico.

ID Entrez

Símbolo Buen Pronóstico (“Shrunken centroid”) Mal Pronóstico (“Shrunken centroid”)

3493

IGHA1 0,549 -0,29

100287723

LOC100287723 0,539 -0,284

642424

LOC642424 0,536 -0,282

100132941

LOC100132941 0,52 -0,274

401847

LOC401847 0,517 -0,273

3500

IGHG1 0,504 -0,266

90925

LOC90925 0,487 -0,257

3543

IGLL1 0,481 -0,254

973

CD79A 0,443 -0,234

100290415

LOC100290415 0,44 -0,232

100133862

LOC100133862 0,436 -0,23

608

TNFRSF17 0,433 -0,228

26952

SMR3A 0,428 -0,226

3535

IGL@ 0,428 -0,226

51237

MGC29506 0,428 -0,226

100293440

LOC100293440 0,427 -0,225

3887

KRT81 0,417 -0,22

28904

IGKV1D-8 0,407 -0,214

57823

SLAMF7 0,403 -0,212

91319

DERL3 0,386 -0,204

57699

CPNE5 0,381 -0,201

54900

LAX1 0,379 -0,2

150365

MEI1 0,378 -0,199

9834

KIAA0125 0,372 -0,196

5450

POU2AF1 0,364 -0,192

84824

FCRLA 0,346 -0,183

83416

FCRL5 0,344 -0,181

92154

MTSS1L 0,344 -0,181

3662

IRF4 0,333 -0,176

3782

KCNN3 0,333 -0,176

11040

PIM2 0,326 -0,172

939

CD27 0,322 -0,17

3494

IGHA2 0,32 -0,169

5368

PNOC 0,316 -0,166

79368

FCRL2 0,312 -0,164

51303

FKBP11 0,294 -0,155

8419

BFSP2 0,291 -0,153

270

AMPD1 0,289 -0,152

10563

CXCL13 0,286 -0,151

974

CD79B 0,281 -0,148

930

CD19 0,28 -0,148

3512

IGJ 0,279 -0,147

952

CD38 0,265 -0,14

78986

DUSP26 0,242 -0,128

4283

CXCL9 0,23 -0,121

80307

FER1L4 0,228 -0,12

221188

GPR114 0,228 -0,12

126306

JSRP1 0,22 -0,116

0,215

-

0,113

C5orf20

GZMB

0,208

-

0,11

1.2.5. Utilidad del predictor de 50 genes en CNMP separados por estadio.

Una de las principales críticas aparecidas en el estado del arte (Subramanian J. et al. J Natl Cancer Inst 2010;102:1– 11) respecto a la utilidad de los predictores generados para el CNMP es que es necesario demostrar su utilidad para 5 predecir el pronóstico de los pacientes de manera independiente del estadio en el que se clasificaron. Para ello, separamos los 162 pacientes de la matriz de validación en pacientes clasificados en estadio I (110 pacientes) y clasificados como estadio II (52 pacientes). Se utilizó el predictor de 50 genes para obtener los grupos moleculares de alto y bajo riesgo (es decir, de mal y buen pronóstico, respectivamente) y se estudió su asociación con el ILE mediante las curvas de Kaplan-Meier. Tanto en estadios I por separado (Fig. 9 A) como en estadios II (Fig. 9 B) se observó una

10 asociación estadísticamente significativa de los grupos con el ILE (p=0,013 y p=0,029 respectivamente) y los HR del grupo de mal pronóstico respecto del de buen pronóstico fueron en el estadio I de 3,2 (IC 95%:1,2-8,3; p=0,018) y en el estadio II de 3,5 (IC 95%:1,1-12; p=0,041).

1.2.6. Sensibilidad y especificidad del predictor de 50 genes.

Los valores de sensibilidad y especificidad del predictor para la clasificación de las muestras en los grupos moleculares 15 identificados se muestran en la tabla 4.

Tabla 4. Sensibilidad, Especificidad, Valor Predictivo Positivo (VPP) y Valor Predictivo Negativo (VPN) para la clasificación molecular con el predictor de 50 genes.

Grupos moleculares

Sensibilidad Especificidad VPP VPN

Grupo buen pronóstico

0,966 0,891 0,824 0,98

Grupo mal pronóstico

0,891 0,966 0,98 0,824

Por lo tanto, y en base a los resultados mostrados, la presente invención demuestra la utilidad del método de la

20 invención, así como del uso de los 50 genes descritos en la tabla 1 como marcadores pronóstico del CNMP de estadios I o II.

A continuación se muestra la tabla 2 a la que se ha hecho referencia previamente. Cuando el “ID Entrez” no está indicado o es “-“ o “- -“ se trata de genes de los que no hay información en la base de datos NCBI. En el símbolo del gen se ha indicado el nombre de la sonda del array utilizado.

ID Entrez

Símbolo ID Entrez Símbolo ID Entrez Símbolo

2

A2M 586 BCAT1 1004 CDH6

12

SERPINA3 590 BCHE 1028 CDKN1C

13

AADAC 595 CCND1 1029 CDKN2A

49

ACR 623 BDKRB1 1030 CDKN2B

55

ACPP 624 BDKRB2 1033 CDKN3

58

ACTA1 640 BLK 1036 CDO1

59

ACTA2 641 BLM 1047 CLGN

72

ACTG2 643 CXCR5 1066 CES1

104

ADARB1 650 BMP2 1073 CFL2

124

ADH1A 654 BMP6 1080 CFTR

126

ADH1C 658 BMPR1B 1111 CHEK1

136

ADORA2B 660 BMX 1117 CHI3L2

152

ADRA2C 687 KLF9 1118 CHIT1

154

ADRB2 699 BUB1 1138 CHRNA5

176

ACAN 718 C3 1160 CKMT2

216

ALDH1A1 721 C4B 1191 CLU

220

ALDH1A3 730 C7 1236 CCR7

231

AKR1B1 760 CA2 1264 CNN1

241

ALOX5AP 762 CA4 1268 CNR1

249

ALPL 767 CA8 1277 COL1A1

275

AMT 820 CAMP 1278 COL1A2

284

ANGPT1 828 CAPS 1281 COL3A1

290

ANPEP 857 CAV1 1289 COL5A1

301

ANXA1 858 CAV2 1290 COL5A2

306

ANXA3 862 RUNX1T1 1291 COL6A1

348

APOE 863 CBFA2T3 1292 COL6A2

356

FASLG 873 CBR1 1295 COL8A1

360

AQP3 874 CBR3 1296 COL8A2

362

AQP5 890 CCNA2 1299 COL9A3

367

AR 891 CCNB1 1300 COL10A1

374

AREG 898 CCNE1 1302 COL11A2

384

ARG2 909 CD1A 1305 COL13A1

395

ARHGAP6 911 CD1C 1306 COL15A1

430

ASCL2 925 CD8A 1307 COL16A1

443

ASPA 948 CD36 1311 COMP

444

ASPH 956 ENTPD3 1356 CP

445

ASS1 969 CD69 1359 CPA3

463

ZFHX3 970 CD70 1363 CPE

467

ATF3 971 CD72 1380 CR2

482

ATP1B2 978 CDA 1381 CRABP1

501

ALDH7A1 991 CDC20 1382 CRABP2

563

AZGP1 1000 CDH2 1400 CRMP1

ID Entrez

Símbolo ID Entrez Símbolo ID Entrez Símbolo

1404

HAPLN1 1946 EFNA5 2346 FOLH1

1415

CRYBB2 1948 EFNB2 2352 FOLR3

1468

SLC25A10 1958 EGR1 2353 FOS

1490

CTGF 1960 EGR3 2354 FOSB

1501

CTNND2 1969 EPHA2 2358 FPR2

1511

CTSG 1999 ELF3 2444 FRK

1513

CTSK 2006 ELN 2525 FUT3

1524

CX3CR1 2009 EML1 2537 IFI6

1571

CYP2E1 2026 ENO2 2539 G6PD

1573

CYP2J2 2034 EPAS1 2568 GABRP

1594

CYP27B1 2041 EPHA1 2571 GAD1

1602

DACH1 2042 EPHA3 2579 GAGE7

1608

DGKG 2043 EPHA4 2591 GALNT3

1634

DCN 2059 EPS8 2619 GAS1

1668

DEFA3 2114 ETS2 2621 GAS6

1673

DEFB4A 2115 ETV1 2627 GATA6

1674

DES 2122 MECOM 2628 GATM

1690

COCH 2152 F3 2633 GBP1

1728

NQO1 2153 F5 2635 GBP3

1734

DIO2 2160 F11 2668 GDNF

1735

DIO3 2162 F13A1 2669 GEM

1740

DLG2 2172 FABP6 2681 GGTA1

1748

DLX4 2191 FAP 2719 GPC3

1755

DMBT1 2192 FBLN1 2731 GLDC

1756

DMD 2194 FASN 2735 GLI1

1763

DNA2 2202 EFEMP1 2736 GLI2

1776

DNASE1L3 2205 FCER1A 2781 GNAZ

1789

DNMT3B 2206 MS4A2 2786 GNG4

1805

DPT 2237 FEN1 2791 GNG11

1809

DPYSL3 2239 GPC4 2841 GPR18

1837

DTNA 2246 FGF1 2842 GPR19

1842

ECM2 2247 FGF2 2843 GPR20

1843

DUSP1 2254 FGF9 2850 GPR27

1848

DUSP6 2258 FGF13 2852 GPER

1852

DUSP9 2273 FHL1 2857 GPR34

1869

E2F1 2274 FHL2 2869 GRK5

1870

E2F2 2277 FIGF 2905 GRIN2C

1879

EBF1 2294 FOXF1 2920 CXCL2

1896

EDA 2295 FOXF2 2921 CXCL3

1906

EDN1 2327 FMO2 2922 GRP

1907

EDN2 2328 FMO3 2936 GSR

1945

EFNA4 2335 FN1 2939 GSTA2

ID Entrez

Símbolo ID Entrez Símbolo ID Entrez Símbolo

2944

GSTM1 3400 ID4 3824 KLRD1

2952

GSTT1 3429 IFI27 3833 KIFC1

2953

GSTT2 3434 IFIT1 3834 KIF25

2999

GZMH 3437 IFIT3 3851 KRT4

3001

GZMA 3455 IFNAR2 3880 KRT19

3003

GZMK 3458 IFNG 3892 KRT86

3005

H1F0 3479 IGF1 3898 LAD1

3006

HIST1H1C 3481 IGF2 3902 LAG3

3007

HIST1H1D 3486 IGFBP3 3908 LAMA2

3008

HIST1H1E 3488 IGFBP5 3914 LAMB3

3013

HIST1H2AD 3489 IGFBP6 3925 STMN1

3024

HIST1H1A 3559 IL2RA 3934 LCN2

3042

HBM 3569 IL6 3945 LDHB

3043

HBB 3577 CXCR1 3953 LEPR

3045

HBD 3579 CXCR2 3957 LGALS2

3049

HBQ1 3598 IL13RA2 3998 LMAN1

3053

SERPIND1 3604 TNFRSF9 4015 LOX

3067

HDC 3620 IDO1 4017 LOXL2

3117

HLA-DQA1 3624 INHBA 4023 LPL

3131

HLF 3625 INHBB 4033 LRMP

3149

HMGB3 3627 CXCL10 4045 LSAMP

3161

HMMR 3640 INSL3 4057 LTF

3164

NR4A1 3653 IPW 4062 LY6H

3169

FOXA1 3663 IRF5 4068 SH2D1A

3199

HOXA2 3667 IRS1 4069 LYZ

3201

HOXA4 3679 ITGA7 4071 TM4SF1

3204

HOXA7 3690 ITGB3 4093 SMAD9

3212

HOXB2 3694 ITGB6 4105 MAGEA6

3216

HOXB6 3699 ITIH3 4117 MAK

3225

HOXC9 3706 ITPKA 4118 MAL

3235

HOXD9 3730 KAL1 4128 MAOA

3240

HP 3751 KCND2 4129 MAOB

3250

HPR 3768 KCNJ12 4131 MAP1B

3270

HRC 3772 KCNJ15 4133 MAP2

3292

HSD17B1 3775 KCNK1 4137 MAPT

3294

HSD17B2 3777 KCNK3 4151 MB

3303

HSPA1A 3778 KCNMA1 4166 CHST6

3316

HSPB2 3783 KCNN4 4199 ME1

3357

HTR2B 3800 KIF5C 4223 MEOX2

3371

TNC 3816 KLK1 4233 MET

3373

HYAL1 3821 KLRC1 4239 MFAP4

3397

ID1 3822 KLRC2 4241 MFI2

ID Entrez

Símbolo ID Entrez Símbolo ID Entrez Símbolo

4248

MGAT3 4929 NR4A2 5563 PRKAA2

4256

MGP 4935 GPR143 5569 PKIA

4311

MME 4953 ODC1 5570 PKIB

4316

MMP7 5021 OXTR 5577 PRKAR2B

4318

MMP9 5023 P2RX1 5578 PRKCA

4325

MMP16 5029 P2RY2 5602 MAPK10

4332

MNDA 5046 PCSK6 5625 PRODH

4356

MPP3 5050 PAFAH1B3 5627 PROS1

4477

MSMB 5054 SERPINE1 5630 PRPH

4481

MSR1 5064 PALM 5655 KLK10

4490

MT1B 5087 PBX1 5727 PTCH1

4495

MT1G 5099 PCDH7 5730 PTGDS

4499

MT1M 5122 PCSK1 5740 PTGIS

4502

MT2A 5125 PCSK5 5743 PTGS2

4585

MUC4 5144 PDE4D 5753 PTK6

4599

MX1 5152 PDE9A 5783 PTPN13

4602

MYB 5154 PDGFA 5787 PTPRB

4605

MYBL2 5157 PDGFRL 5789 PTPRD

4606

MYBPC2 5167 ENPP1 5794 PTPRH

4629

MYH11 5172 SLC26A4 5801 PTPRR

4653

MYOC 5187 PER1 5806 PTX3

4674

NAP1L2 5196 PF4 5816 PVALB

4703

NEB 5225 PGC 5874 RAB27B

4739

NEDD9 5226 PGD 5909 RAP1GAP

4744

NEFH 5272 SERPINB9 5918 RARRES1

4751

NEK2 5324 PLAG1 5961 PRPH2

4774

NFIA 5327 PLAT 5990 RFX2

4792

NFKBIA 5328 PLAU 5996 RGS1

4810

NHS 5339 PLEC 5999 RGS4

4811

NID1 5347 PLK1 6019 RLN2

4824

NKX3-1 5348 FXYD1 6036 RNASE2

4837

NNMT 5350 PLN 6098 ROS1

4851

NOTCH1 5376 PMP22 6192 RPS4Y1

4856

NOV 5396 PRRX1 6236 RRAD

4857

NOVA1 5427 POLE2 6275 S100A4

4862

NPAS2 5460 POU5F1 6285 S100B

4881

NPR1 5468 PPARG 6286 S100P

4883

NPR3 5471 PPAT 6288 SAA1

4884

NPTX1 5502 PPP1R1A 6289 SAA2

4885

NPTX2 5507 PPP1R3C 6300 MAPK12

4902

NRTN 5521 PPP2R2B 6327 SCN2B

4907

NT5E 5549 PRELP 6335 SCN9A

ID Entrez

Símbolo ID Entrez Símbolo ID Entrez Símbolo

6339

SCNN1D 6820 SULT2B1 7472 WNT2

6343

SCT 6941 TCF19 7475 WNT6

6354

CCL7 6999 TDO2 7481 WNT11

6355

CCL8 7010 TEK 7504 XK

6356

CCL11 7015 TERT 7538 ZFP36

6357

CCL13 7018 TF 7691 ZNF132

6358

CCL14 7022 TFAP2C 7694 ZNF135

6361

CCL17 7025 NR2F1 7704 ZBTB16

6362

CCL18 7031 TFF1 7762 ZNF215

6363

CCL19 7033 TFF3 7781 SLC30A3

6364

CCL20 7035 TFPI 7837 PXDN

6366

CCL21 7039 TGFA 7849 PAX8

6373

CXCL11 7042 TGFB2 7850 IL1R2

6374

CXCL5 7045 TGFBI 7941 PLA2G7

6376

CX3CL1 7048 TGFBR2 7976 FZD3

6387

CXCL12 7056 THBD 7991 TUSC3

6401

SELE 7058 THBS2 8000 PSCA

6403

SELP 7076 TIMP1 8013 NR4A3

6414

SEPP1 7078 TIMP3 8038 ADAM12

6423

SFRP2 7083 TK1 8076 MFAP5

6424

SFRP4 7093 TLL2 8111 GPR68

6440

SFTPC 7102 TSPAN7 8115 TCL1A

6442

SGCA 7122 CLDN5 8140 SLC7A5

6447

SCG5 7137 TNNI3 8190 MIA

6495

SIX1 7138 TNNT1 8208 CHAF1B

6505

SLC1A1 7139 TNNT2 8277 TKTL1

6518

SLC2A5 7153 TOP2A 8284 KDM5D

6540

SLC6A13 7177 TPSAB1 8302 KLRC4

6583

SLC22A4 7216 TRO 8313 AXIN2

6588

SLN 7262 PHLDA2 8322 FZD4

6590

SLPI 7296 TXNRD1 8325 FZD8

6615

SNAI1 7345 UCHL1 8326 FZD9

6623

SNCG 7356 SCGB1A1 8335 HIST1H2AB

6652

SORD 7365 UGT2B10 8339 HIST1H2BG

6662

SOX9 7367 UGT2B17 8357 HIST1H3H

6678

SPARC 7368 UGT8 8360 HIST1H4D

6689

SPIB 7373 COL14A1 8364 HIST1H4C

6691

SPINK2 7379 UPK2 8365 HIST1H4H

6695

SPOCK1 7391 USF1 8366 HIST1H4B

6696

SPP1 7422 VEGFA 8368 HIST1H4L

6769

STAC 7431 VIM 8395 PIP5K1B

6790

AURKA 7450 VWF 8404 SPARCL1

ID Entrez

Símbolo ID Entrez Símbolo ID Entrez Símbolo

8406

SRPX 9077 DIRAS3 9833 MELK

8434

RECK 9084 VCY 9890 LPPR4

8436

SDPR 9086 EIF1AY 9899 SV2B

8437

RASAL1 9088 PKMYT1 9914 ATP2C2

8464

SUPT3H 9118 INA 9915 ARNT2

8483

CILP 9148 NEURL 9934 P2RY14

8490

RGS5 9156 EXO1 9940 DLEC1

8492

PRSS12 9172 MYOM2 9956 HS3ST2

8503

PIK3R3 9200 PTPLA 9957 HS3ST1

8516

ITGA8 9201 DCLK1 10024 TROAP

8528

DDO 9284 NPIP 10076 PTPRU

8537

BCAS1 9289 GPR56 10082 GPC6

8547

FCN3 9369 NRXN3 10085 EDIL3

8612

PPAP2C 9388 LIPG 10100 TSPAN2

8622

PDE8B 9401 RECQL4 10103 TSPAN1

8638

OASL 9420 CYP7B1 10112 KIF20A

8639

AOC3 9429 ABCG2 10135 NAMPT

8644

AKR1C3 9447 AIM2 10158 PDZK1IP1

8653

DDX3Y 9452 ITM2A 10164 CHST4

8660

IRS2 9455 HOMER2 10170 DHRS9

8685

MARCO 9481 SLC25A27 10186 LHFP

8693

GALNT4 9486 CHST10 10202 DHRS2

8727

CTNNAL1 9508 ADAMTS3 10203 CALCRL

8786

RGS11 9547 CXCL14 10231 RCAN2

8792

TNFRSF11A 9586 CREB5 10234 LRRC17

8835

SOCS2 9590 AKAP12 10253 SPRY2

8840

WISP1 9610 RIN1 10265 IRX5

8847

DLEU2 9612 NCOR2 10290 SPEG

8857

FCGBP 9625 AATK 10309 CCNO

8876

VNN1 9633 MTL5 10319 LAMC3

8908

GYG2 9636 ISG15 10332 CLEC4M

8914

TIMELESS 9639 ARHGEF10 10335 MRVI1

8938

BAIAP3 9700 ESPL1 10351 ABCA8

8942

KYNU 9718 ECE2 10361 NPM2

8968

HIST1H3F 9720 CCDC144A 10365 KLF2

8970

HIST1H2BJ 9721 GPRIN2 10371 SEMA3A

9033

PKD2L1 9732 DOCK4 10417 SPON2

9037

SEMA5A 9735 KNTC1 10418 SPON1

9038

TAAR5 9737 GPRASP1 10439 OLFM1

9060

PAPSS2 9770 RASSF2 10446 LRRN2

9068

ANGPTL1 9787 DLGAP5 10457 GPNMB

9071

CLDN10 9832 JAKMIP2 10462 CLEC10A

ID Entrez

Símbolo ID Entrez Símbolo ID Entrez Símbolo

10512

SEMA3C 22983 MAST1 26108 PYGO1

10529

NEBL 23037 PDZD2 26150 RIBC2

10537

UBD 23066 CAND2 26153 KIF26A

10570

DPYSL4 23089 PEG10 26166 RGS22

10578

GNLY 23194 FBXL7 26172 LOC26172

10579

TACC2 23209 MLC1 26206 SPAG8

10580

SORBS1 23213 SULF1 26232 FBXO2

10606

PAICS 23236 PLCB1 26253 CLEC4E

10615

SPAG5 23242 COBL 26256 CABYR

10631

POSTN 23314 SATB2 26271 FBXO5

10643

IGF2BP3 23327 NEDD4L 26298 EHF

10656

KHDRBS3 23373 CRTC1 26353 HSPB8

10669

CGREF1 23414 ZFPM2 26470 SEZ6L2

10733

PLK4 23460 ABCA6 26577 PCOLCE2

10742

RAI2 23475 QPRT 26579 MYEOV

10744

PTTG2 23541 SEC14L2 26585 GREM1

10874

NMU 23562 CLDN14 26872 STEAP1

10875

FGL2 23587 C17orf81 26960 NBEA

10878

CFHR3 23657 SLC7A11 26974 ZNF285A

10891

PPARGC1A 23704 KCNE4 27074 LAMP3

10894

LYVE1 23743 BHMT2 27111 SDCBP2

10942

PRSS21 23767 FLRT3 27112 FAM155B

10964

IFI44L 23768 FLRT2 27122 DKK3

10974

C10orf116 24137 KIF4A 27123 DKK2

10984

KCNQ1OT1 24141 C20orf103 27129 HSPB7

11005

SPINK5 25791 NGEF 27145 FILIP1

11012

KLK11 25805 BAMBI 27147 DENND2A

11013

TMSB15A 25817 FAM19A5 27151 CPAMD8

11015

KDELR3 25833 POU2F3 27156 RTDR1

11065

UBE2C 25840 METTL7A 27165 GLS2

11082

ESM1 25878 MXRA5 27237 ARHGEF16

11096

ADAMTS5 25884 CHRDL2 27285 TEKT2

11130

ZWINT 25890 ABI3BP 27286 SRPX2

11169

WDHD1 25891 PAMR1 27299 ADAMDEC1

11197

WIF1 25894 PLEKHG4 27303 RBMS3

11226

GALNT6 25945 PVRL3 27306 HPGDS

11227

GALNT5 26002 MOXD1 27344 PCSK1N

11254

SLC6A14 26027 ACOT11 27345 KCNMB4

22801

ITGA11 26040 SETBP1 27443 CECR2

22885

ABLIM3 26049 FAM169A 28231 SLCO4A1

22915

MMRN1 26053 AUTS2 28999 KLF15

22949

PTGR1 26074 C20orf26 29070 CCDC113

ID Entrez

Símbolo ID Entrez Símbolo ID Entrez Símbolo

29089

UBE2T 51678 MPP6 55086 CXorf57

29091

STXBP6 51705 EMCN 55107 ANO1

29126

CD274 51744 CD244 55118 CRTAC1

29128

UHRF1 51751 HIGD1B 55137 FIGN

29775

CARD10 51761 ATP8A2 55138 FAM90A1

29798

C2orf27A 51804 SIX4 55143 CDCA8

29802

VPREB3 53342 IL17D 55165 CEP55

29931

LOH3CR2A 53358 SHC3 55203 LGI2

29948

OSGIN1 53616 ADAM22 55228 PNMAL1

29993

PACSIN1 53832 IL20RA 55231 CCDC87

30001

ERO1L 54206 ERRFI1 55258 THNSL2

30846

EHD2 54360 CYTL1 55273 TMEM100

50486

G0S2 54361 WNT4 55286 C4orf19

50487

PLA2G3 54437 SEMA5B 55304 SPTLC3

50507

NOX4 54463 FAM134B 55344 PLCXD1

50509

COL5A3 54478 FAM64A 55351 STK32B

50617

ATP6V0A4 54551 MAGEL2 55353 LAPTM4B

50636

ANO7 54596 L1TD1 55359 STYK1

50863

NTM 54621 VSIG10 55366 LGR4

51083

GAL 54674 LRRN3 55388 MCM10

51087

YBX2 54682 MANSC1 55450 CAMK2N1

51090

PLLP 54739 XAF1 55510 DDX43

51129

ANGPTL4 54756 IL17RD 55521 TRIM36

51162

EGFL7 54829 ASPN 55545 MSX2P1

51196

PLCE1 54830 NUP62CL 55576 STAB2

51208

CLDN18 54847 SIDT1 55698 RADIL

51284

TLR7 54852 PAQR5 55714 ODZ3

51297

PLUNC 54855 FAM46C 55765 C1orf106

51299

NRN1 54869 EPS8L1 55786 ZNF415

51302

CYP39A1 54894 RNF43 55789 DEPDC1B

51308

REEP2 54906 C10orf18 55799 CACNA2D3

51311

TLR8 54922 RASIP1 55872 PBK

51316

PLAC8 54933 RHBDL2 55966 AJAP1

51348

KLRF1 54959 ODAM 56000 NXF3

51364

ZMYND10 54979 HRASLS2 56121 PCDHB15

51450

PRRX2 55034 MOCOS 56122 PCDHB14

51454

GULP1 55040 EPN3 56126 PCDHB10

51554

CCRL1 55061 SUSD4 56127 PCDHB9

51560

RAB6B 55064 C9orf68 56128 PCDHB8

51561

IL23A 55065 GPR172B 56129 PCDHB7

51659

GINS2 55083 KIF26B 56131 PCDHB4

51673

TPPP3 55084 SOBP 56143 PCDHA5

ID Entrez

Símbolo ID Entrez Símbolo ID Entrez Símbolo

56147

PCDHA1 57758 SCUBE2 79071 ELOVL6

56164

STK31 57817 HAMP 79092 CARD14

56253

CRTAM 58189 WFDC1 79148 MMP28

56256

SERTAD4 58494 JAM2 79153 GDPD3

56477

CCL28 59269 HIVEP3 79173 C19orf57

56603

CYP26B1 59271 C21orf63 79191 IRX3

56649

TMPRSS4 59272 ACE2 79258 MMEL1

56673

C11orf16 59277 NTN4 79365 BHLHE41

56675

NRIP3 59285 CACNG6 79370 BCL2L14

56937

PMEPA1 59353 TMEM35 79413 ZBED2

56944

OLFML3 60437 CDH26 79589 RNF128

56967

C14orf132 63027 SLC22A23 79611 ACSS3

56977

STOX2 63876 PKNOX2 79614 C5orf23

56992

KIF15 63951 DMRTA1 79618 HMBOX1

57101

ANO2 64072 CDH23 79623 GALNT14

57110

HRASLS 64073 C19orf33 79633 FAT4

57188

ADAMTSL3 64093 SMOC1 79642 ARSJ

57194

ATP10A 64094 SMOC2 79645 EFCAB1

57210

SLC45A4 64108 RTP4 79682 MLF1IP

57214

KIAA1199 64131 XYLT1 79692 ZNF322A

57235

KIAA0485 64167 ERAP2 79723 SUV39H2

57335

ZNF286A 64220 STRA6 79739 TTLL7

57348

TTYH1 64283 RGNEF 79772 MCTP1

57393

TMEM27 64288 ZNF323 79774 GRTP1

57402

S100A14 64332 NFKBIZ 79801 SHCBP1

57452

GALNTL1 64344 HIF3A 79819 WDR78

57460

PPM1H 64377 CHST8 79825 CCDC48

57482

KIAA1211 64388 GREM2 79841 AGBL2

57484

RNF150 64399 HHIP 79844 ZDHHC11

57493

HEG1 64506 CPEB1 79852 EPHX3

57501

KIAA1257 64699 TMPRSS3 79875 THSD4

57514

ARHGAP31 64757 MOSC1 79901 CYBRD1

57535

KIAA1324 64849 SLC13A3 79919 C2orf54

57537

SORCS2 64866 CDCP1 79931 TNIP3

57608

KIAA1462 64919 BCL11B 79953 TMEM90B

57616

TSHZ3 65243 ZNF643 79957 PAQR6

57631

LRCH2 65997 RASL11B 79974 C7orf58

57633

LRRN1 66000 TMEM108 79977 GRHL2

57670

KIAA1549 78989 COLEC11 79987 SVEP1

57683

ZDBF2 78995 C17orf53 79992 C6orf59

57705

WDFY4 79006 METRN 79993 ELOVL7

57717

PCDHB16 79019 CENPM 80034 CSRNP3

ID Entrez

Símbolo ID Entrez Símbolo ID Entrez Símbolo

80054

LOC80054 83988 NCALD 85004 RERG

80144

FRAS1 83992 CTTNBP2 85016 C11orf70

80150

ASRGL1 84000 TMPRSS13 85453 TSPYL5

80178

C16orf59 84057 MND1 85455 DISP2

80206

FHOD3 84059 GPR98 85462 FHDC1

80235

PIGZ 84069 PLEKHN1 89765 RSPH1

80237

ELL3 84073 MYCBPAP 89795 NAV3

80258

EFHC2 84152 PPP1R1B 89796 NAV1

80303

EFHD1 84171 LOXL4 89822 KCNK17

80310

PDGFD 84189 SLITRK6 89872 AQP10

80326

WNT10A 84206 MEX3B 89958 C9orf140

80705

TSGA10 84215 ZNF541 90050 FAM181A

80723

TMEM22 84258 SYT3 90362 FAM110B

80726

KIAA1683 84417 C2orf40 90865 IL33

80759

KHDC1 84419 C15orf48 91057 CCDC34

80760

ITIH5 84448 ABLIM2 91120 ZNF682

81029

WNT5B 84553 C6orf168 91133 L3MBTL4

81035

COLEC12 84623 KIRREL3 91543 RSAD2

81501

TM7SF4 84624 FNDC1 91614 DEPDC7

81557

MAGED4B 84627 ZNF469 91683 SYT12

81575

APOLD1 84632 AFAP1L2 91687 CENPL

81578

COL21A1 84649 DGAT2 91851 CHRDL1

81831

NETO2 84667 HES7 91977 MYOZ3

81931

ZNF93 84676 TRIM63 92291 CAPN13

83439

TCF7L1 84688 C9orf24 92304 SCGB3A1

83461

CDCA3 84696 ABHD1 92312 MEX3A

83481

EPPK1 84706 GPT2 92340 C17orf72

83540

NUF2 84707 BEX2 92747 C20orf114

83543

AIF1L 84708 LNX1 92949 ADAMTSL1

83604

TMEM47 84709 C4orf49 93082 NEURL3

83648

FAM167A 84803 AGPAT9 93099 DMKN

83657

DYNLRB2 84830 C6orf105 93273 LEMD1

83661

MS4A8B 84842 HPDL 93517 SDR42E1

83690

CRISPLD1 84848 MGC16121 93986 FOXP2

83849

SYT15 84870 RSPO3 94274 PPP1R14A

83853

ROPN1L 84900 RNFT2 96626 LIMS3

83869

TTTY14 84935 C13orf33 112476 PRRT2

83872

HMCN1 84952 CGNL1 113115 FAM54A

83879

CDCA7 84953 MICALCL 113130 CDCA5

83888

FGFBP2 84962 JUB 113146 AHNAK2

83903

GSG2 84966 IGSF21 113278 C20orf54

83959

SLC4A11 84969 TOX2 113730 KLHDC7B

ID Entrez

Símbolo ID Entrez Símbolo ID Entrez Símbolo

114569

MAL2 126129 CPT1C 142683 ITLN2

114787

GPRIN1 126567 C2CD4C 143662 MUC15

114800

CCDC85A 127495 LRRC39 144193 AMDHD1

114818

KLHL29 127602 DNAH14 144347 FAM101A

114827

FHAD1 128153 SPATA17 144406 WDR66

114880

OSBPL6 128229 C1orf182 144501 KRT80

114899

C1QTNF3 128602 C20orf85 145258 GSC

114905

C1QTNF7 128611 ZNF831 145773 FAM81A

114907

FBXO32 128872 HMGB3L1 146212 KCTD19

115361

GBP4 129790 C7orf13 146330 FBXL16

115362

GBP5 130271 PLEKHH2 146434 ZNF597

115572

FAM46B 130367 SGPP2 146760 RTN4RL1

115908

CTHRC1 130733 TMEM178 146845 WDR16

116028

C16orf75 131177 FAM3D 147166 TRIM16L

116039

OSR2 131450 CD200R1 147372 CCBE1

116159

CYYR1 131578 LRRC15 147463 ANKRD29

116211

TM4SF19 131873 COL6A6 147525 C18orf18

116328

C8orf34 132671 SPATA18 147645 VSIG10L

116372

LYPD1 132864 CPEB2 147744 TMEM190

116442

RAB39B 133022 TRAM1L1 147906 DACT3

116832

RPL39L 133690 CAPSL 147920 IGFL2

116969

ART5 134147 CMBL 147968 CAPN12

117156

SCGB3A2 134265 AFAP1L1 148229 ATP8B3

117157

SH2D1B 134466 LOC134466 148252 DIRAS1

117166

WFIKKN1 135112 NCOA7 148418 SAMD13

117247

SLC16A10 135398 C6orf141 148641 SLC35F3

117248

GALNTL2 135932 TMEM139 149111 CNIH3

118491

TTC18 136306 SVOPL 149351 LOC149351

118663

BTBD16 137872 ADHFE1 149483 CCDC17

118932

ANKRD22 137902 PXDNL 150248 C22orf15

119391

GSTO2 137994 LETM2 150378 FLJ30901

119587

CPXM2 139065 SLITRK4 150696 PROM2

120071

GYLTL1B 139324 HDX 150763 GPAT2

120376

C11orf93 139886 SPIN4 151174 LOC151174

120892

LRRK2 140032 RPS4Y2 151176 FAM132B

122402

TDRD9 140578 CHODL 151242 PPP1R1C

122622

ADSSL1 140597 TCEAL2 151246 SGOL2

124093

CCDC78 140706 C20orf160 151473 SLC16A14

124220

ZG16B 140733 MACROD2 151507 MSL3L2

124602

KIF19 140766 ADAMTS14 151827 LRRC34

124739

USP43 140809 SRXN1 151887 CCDC80

124976

SPNS2 140862 ISM1 151888 BTLA

ID Entrez

Símbolo ID Entrez Símbolo ID Entrez Símbolo

152078

C3orf55 200634 KRTCAP3 256076 COL29A1

153478

PLEKHG4B 200810 ALG1L 256435 ST6GALNAC3

153572

IRX2 200958 MUC20 256691 MAMDC2

153579

BTNL9 201161 CENPV 259173 ALS2CL

154313

C6orf165 201456 FBXO15 259266 ASPM

154796

AMOT 201799 TMEM154 259307 IL4I1

155368

WBSCR27 202333 CMYA5 260293 CYP4X1

157310

PEBP4 202915 TMEM184A 260436 C4orf7

157313

CDCA2 203111 C8orf47 266977 GPR110

157506

RDH10 219348 PLAC9 282679 AQP11

157570

ESCO2 219595 FOLH1B 283120 H19

157773

C8orf48 219736 STOX1 283208 P4HA3

157869

C8orf84 219790 RTKN2 283358 B4GALNT3

157927

C9orf62 220136 CCDC11 283481 LOC283481

158295

MGC24103 220164 DOK6 283518 KCNRG

158326

FREM1 220359 TIGD3 283663 LOC283663

158511

CSAG1 220594 LOC220594 284013 VMO1

159371

TMEM20 220963 SLC16A9 284047 CCDC144B

160364

CLEC12A 221002 RASGEF1A 284119 PTRF

160365

CLECL1 221150 SKA3 284307 ZIK1

160622

GRASP 221303 FAM162B 284339 TMEM145

161725

OTUD7A 221357 GSTA5 284367 SIGLECP3

162632

LOC162632 221424 C6orf154 284654 RSPO1

162963

ZNF610 221476 PI16 284716 RIMKLA

163255

ZNF540 221687 RNF182 284889 LOC284889

163782

KANK4 221806 VWDE 284904 SEC14L4

164832

LONRF2 221914 GPC2 284992 CCDC150

165055

CCDC138 221935 SDK1 285016 FAM150B

167359

MGC42105 221981 THSD7A 285141 LOC285141

167465

ZNF366 222171 PRR15 285489 DOK7

168002

DACT2 222235 FBXL13 285755 PPIL6

169792

GLIS3 245972 ATP6V0D2 286046 XKR6

170679

PSORS1C1 246100 CTAG1A 286527 TMSB15B

171024

SYNPO2 252995 FNDC5 286749 STON1-GTF2A1L

196740

C10orf72 253152 EPHX4 286827 TRIM59

198437

C20orf201 253264 LOC253264 338339 CLEC4D

199675

C19orf59 253650 ANKRD18A 338382 RAB7B

199713

NLRP7 253982 ASPHD1 339145 FAM92B

199786

FAM129C 254910 LCE5A 339184 CCDC144NL

200162

SPAG17 255480 LOC255480 339390 CLEC4G

200172

SLFNL1 255631 COL24A1 339524 LOC339524

200315

APOBEC3A 255743 NPNT 339768 ESPNL

ID Entrez

Símbolo ID Entrez Símbolo ID Entrez Símbolo

339778

C2orf70 401233 LOC401233 728882 FAM182B

339804

C2orf74 401237 FLJ22536 729085 FAM198A

340286

FAM183B 401474 SAMD12 729680 LOC729680

340542

BEX5 402483 tcag7.907 729983 LOC729983

340719

NANOS1 439949 LOC439949 100113384 SNORD123

342035

GLDN 440068 CARD17 100128511 LOC100128511

342979

PALM3 440461 LOC440461 100130967 LOC100130967

344148

NCKAP5 440556 FLJ42875 100131170 LOC100131170

346689

KLRG2 440585 FAM183A 100131541 UNQ6228

347744

C6orf52 440712 C1orf186 100131564 LOC100131564

347902

AMIGO2 440792 LOC440792 100131733 LOC100131733

348751

LOC348751 440823 MIAT 100131997 FAM27E3

352961

HCG26 441027 TMEM150C 100132247 LOC100132247

353189

SLCO4C1 441168 FAM26F 100132885 LOC100132885

374569

ASPG 441208 LOC441208 100133161 LOC100133161

387066

SNHG5 441295 OR2A9P 100133941 CD24

387328

ZNF322B 441317 FAM90A7 100134018 hCG_1774568

387758

FIBIN 441376 C8orf85 100271835 LIMS3-LOC440895

387763

AG2 441631 TSPAN11 100288985 LOC100288985

387885

CCDC42B 441795 LOC441795 100289058 LOC100289058

387914

SHISA2 445328 ARHGEF5L 100293193 LOC100293193

388115

C15orf52 474354 LRRC18 — A_32_P149011

388125

C2CD4B 619279 ZNF704 — A_32_P208200

388135

C15orf59 642236 LOC642236 — A_24_P315862

388242

LOC388242 642477 FLJ39632 — A_23_P121234

388585

HES5 642521 LOC642521 — A_32_P148122

388630

LOC388630 644186 C22orf41 — A_32_P115277

388815

C21orf34 644246 LOC644246 — A_32_P33213

389136

VGLL3 645027 EVPLL — A_32_P124773

389432

SAMD5 645277 LOC645277 — A_32_P105465

389458

LOC389458 645722 LOC645722 — A_24_P5994

389493

LOC389493 650655 ABCA17P — A_23_P28307

389831

LOC389831 653140 C2orf84 — A_24_P890995

389834

LOC389834 653509 SFTPA1 — A_32_P210106

391267

C21orf81 654433 LOC654433 — A_24_P298228

399668

NCRNA00086 654790 PCP4L1 — A_24_P702749

399744

LOC399744 723790 HIST2H2AA4 — A_24_P307375

399948

C11orf92 727832 GOLGA6L6 — A_24_P930088

399959

LOC399959 727916 LOC727916 — A_24_P659980

400043

LOC400043 728215 FAM155A — A_32_P115749

400456

LOC400456 728242 XAGE2B — A_32_P181826

400566

C17orf97 728613 LOC728613 — A_32_P172578

ID Entrez

Símbolo ID Entrez Símbolo ID Entrez Símbolo

—

A_32_P23810 — A_23_P211468 — A_24_P827096

—

A_32_P164917 — A_32_P50973 — A_32_P132194

—

A_24_P233560 — A_24_P936252 — A_32_P186865

—

A_23_P159435 — A_32_P406142 — A_24_P92174

—

A_32_P96752 — A_32_P15288 — A_23_P21907

—

A_24_P67494 — A_24_P204727 — A_32_P73991

—

A_32_P72351 — A_32_P146844 — A_24_P221903

—

A_24_P683861 — A_32_P157504 — A_32_P108033

—

A_24_P643776 — A_32_P227921 — A_32_P88587

—

A_32_P162862 — A_24_P263786 — A_24_P64442

—

A_24_P170136 — A_32_P17343 — A_32_P61298

—

A_23_P170719 — A_24_P110487 — A_32_P226941

—

A_24_P590547 — A_24_P490109 — A_32_P226356

—

A_24_P213134 — A_32_P125402 — A_24_P822869

—

A_32_P194563 — A_32_P35486 — A_32_P99533

—

A_24_P247074 — A_32_P198295 — A_24_P101742

—

A_24_P395415 — A_23_P43649 — A_32_P100947

—

A_32_P32463 — A_32_P227496 — A_23_P250516

—

A_32_P59277 — A_24_P494425 — A_32_P212258

—

A_24_P110618 — A_24_P604784 — A_32_P132748

—

A_32_P5205 — A_32_P126259 — A_24_P558135

—

A_32_P90812 — A_32_P32043 — A_23_P135123

—

A_32_P122715 — A_32_P229818 — A_24_P212024

—

A_32_P155512 — A_32_P118657 — A_24_P517918

—

A_24_P538459 — A_24_P15388 — A_23_P116195

—

A_24_P144346 — A_24_P204374 — A_32_P112100

—

A_24_P178444 — A_24_P92683 — A_24_P478940

—

A_32_P214395 — A_24_P589028 — A_24_P177844

—

A_23_P44053 — A_32_P117322 — A_24_P241996

—

A_32_P152255 — A_24_P929818 — A_32_P117186

—

A_23_P21260 — A_32_P151747 — A_32_P233799

—

A_32_P101623 — A_32_P109078 — A_24_P707102

—

A_32_P188921 — A_24_P484699 — A_23_P32793

—

A_32_P164971 — A_32_P43664 — A_24_P358474

—

A_24_P795230 — A_24_P608268 — A_32_P42224

—

A_24_P267814 — A_24_P24371 — A_24_P100684

—

A_32_P103678 — A_23_P111525 — A_32_P164477

—

A_24_P333306 — A_32_P214565 — A_32_P110485

—

A_32_P215556 — A_32_P1166 — A_24_P460763

—

A_23_P72252 — A_32_P153361 — A_32_P39944

—

A_24_P497843 — A_24_P315941 — A_24_P845631

—

A_24_P916853 — A_23_P158868 — A_32_P166733

ID Entrez

Símbolo ID Entrez Símbolo ID Entrez Símbolo

—

A_32_P157465 — A_24_P927205 — A_32_P39440

—

A_32_P115122 — A_32_P196918 — A_23_P166508

—

A_24_P203418 — A_24_P315854 — A_32_P35303

—

A_23_P21249 — A_23_P435390 — A_32_P33802

—

A_24_P203886 — A_32_P182458 — A_32_P173922

—

A_32_P30874 — A_32_P155984 — A_23_P87421

—

A_32_P108516 — A_24_P478556 — A_32_P40673

—

A_32_P106615 — A_32_P21459 — A_32_P164916

—

A_24_P626951 — A_32_P161755 — A_24_P745352

—

A_24_P306814 — A_24_P8257 — A_32_P139163

—

A_24_P940469 — A_32_P189034 — A_23_P390206

—

A_24_P592060 — A_32_P122951 — A_32_P68055

—

A_24_P42453 — A_24_P565110 — A_24_P825969

—

A_24_P914479 — A_32_P226768 — A_24_P816844

—

A_24_P401124 — A_32_P157927 — A_32_P142602

—

A_24_P372189 — A_32_P114918 — A_23_P170713

—

A_32_P46456 — A_23_P140884 — A_24_P418744

—

A_24_P592591 — A_23_P9997 — A_32_P43959

—

A_24_P384119 — A_32_P330691 — A_24_P16214

—

A_24_P923271 — A_23_P98671 — A_32_P77102

—

A_32_P49552 — A_24_P813550 — A_24_P246825

—

A_32_P108748 — A_32_P47166 — A_23_P84791

—

A_24_P16337 — A_24_P213325 — A_32_P55414

—

A_24_P733308 — A_24_P871940 — A_32_P15081

—

A_24_P76868 — A_24_P677559 — A_24_P930327

—

A_24_P878419 — A_23_P217187 — A_32_P188993

—

A_24_P934162 — A_23_P56868 — A_23_P361654

—

A_24_P592871 — A_24_P932887 — A_32_P229493

—

A_23_P96191 — A_32_P177595 — A_24_P333357

—

A_32_P169550 — A_23_P170830 — A_23_P35546

—

A_24_P484904 — A_32_P68076 — A_32_P12372

—

A_24_P639701 — A_32_P212406 — A_24_P24053

—

A_32_P165990 — A_32_P877 — A_23_P112957

—

A_23_P20328 — A_32_P121537 — A_24_P341546

—

A_32_P214054 — A_23_P21393 — A_32_P43914

—

A_24_P932388 — A_32_P226073 — A_24_P621701

—

A_32_P106864 — A_32_P224586 — A_24_P75994

—

A_32_P45375 — A_24_P152345 — A_24_P665185

—

A_24_P376139 — A_24_P127462 — A_32_P44099

—

A_24_P361816 — A_32_P38313 — A_32_P30004

—

A_24_P919283 — A_24_P519504 — A_24_P916965

—

A_24_P844100 — A_24_P229447 — A_23_P8812

ID Entrez

Símbolo ID Entrez Símbolo ID Entrez Símbolo

—

A_32_P202066 — A_24_P904845 — A_24_P514678

—

A_32_P221641 — A_32_P228886 — A_24_P750327

—

A_32_P9924 — A_23_P210158 — A_24_P358321

—

A_23_P408363 — A_23_P136753 — A_32_P72541

—

A_24_P576445 — A_32_P213678 — A_32_P213418

—

A_32_P97513 — A_32_P30075 — A_32_P214969

—

A_32_P74814 — A_24_P7750 — A_23_P159163

—

A_24_P195974 — A_24_P135841 — A_24_P504939

—

A_32_P722809 — A_24_P169713 — A_24_P862083

—

A_24_P318990 — A_24_P341126 — A_32_P199824

—

A_32_P52227 — A_32_P194704 — A_32_P115518

—

A_32_P42895 — A_24_P161764 — A_24_P16004

—

A_32_P224345 — A_32_P102581 — A_32_P82179

—

A_32_P226205 — A_23_P124313 — A_23_P21800

—

A_32_P36552 — A_32_P193240 — A_32_P79041

—

A_32_P133038 — A_32_P131998 — A_24_P298805

—

A_32_P157671 — A_32_P174214 — A_24_P925422

—

A_32_P76602 — A_32_P1291 — A_32_P227657

—

A_32_P46171 — A_23_P11980 — A_32_P53603

—

A_24_P33341 — A_32_P209582 — A_32_P117185

—

A_32_P104448 — A_32_P127019 — A_32_P29149

—

A_32_P144852 — A_32_P197720 — A_24_P357847

—

A_32_P48149 — A_24_P375691 — A_32_P201434

—

A_24_P195454 — A_24_P927639 — A_32_P134634

—

A_24_P384604 — A_32_P207885 — A_32_P230253

—

A_32_P224888 — A_32_P121234 — A_32_P171253

—

A_32_P130536 — A_24_P264143 — A_32_P185766

—

A_32_P15829 — A_24_P451992 — A_32_P71858

—

A_32_P2883 — A_32_P509964 — A_32_P132766

—

A_23_P3083 — A_23_P58137 — A_32_P8732

—

A_24_P703642 — A_24_P867201 — A_24_P671115

—

A_24_P417352 — A_32_P215143 — A_32_P75867

—

A_24_P109921 — A_32_P35575 — A_24_P139761

—

A_32_P3932 — A_32_P216888 — A_32_P72611

—

A_23_P32583 — A_24_P101226 — A_32_P226525

—

A_32_P49959 — A_32_P105940 — A_32_P61522

—

A_23_P149441 — A_32_P93352 — A_32_P179686

—

A_24_P465799 — A_32_P13823 — A_23_P350782

—

A_24_P472081 — A_32_P89480 — A_32_P429876

—

A_32_P184268 — A_24_P716405 — A_32_P167111

—

A_24_P173566 — A_24_P928306 — A_32_P133090

—

A_32_P12703 — A_32_P51988 — A_23_P357504

ID Entrez

Símbolo ID Entrez Símbolo ID Entrez Símbolo

—

A_32_P47285 — A_23_P136026 — A_32_P71476

—

A_32_P76137 — A_24_P15550 — A_24_P767725

—

A_24_P379629 — A_24_P185516 — A_24_P272146

—

A_24_P358606 — A_24_P281605 — A_24_P128361

—

A_32_P159192 — A_32_P65589 — A_32_P200144

—

A_32_P42329 — A_24_P659202 — A_32_P111072

—

A_24_P23327 — A_24_P649327 — A_24_P323298

—

A_32_P194423 — A_24_P110242 — A_32_P177843

—

A_32_P12065 — A_32_P85593 — A_23_P417363

—

A_24_P741023 — A_32_P94685 — A_24_P67063

—

A_23_P147224 — A_32_P232413

—

A_32_P232682 — A_24_P178834

—

A_32_P214860 — A_32_P65022

—

A_24_P367100 — A_32_P88163

—

A_23_P147578 — A_24_P475753

—

A_24_P488083 — A_32_P44210

—

A_24_P923854 — A_32_P215866

—

A_24_P33055 — A_32_P176036

—

A_23_P259763 — A_24_P918044

—

A_24_P900555 — A_23_P339954

—

A_24_P326084 — A_32_P13337

—

A_24_P68008 — A_32_P91186

—

A_23_P251002 — A_24_P255415

—

A_23_P113056 — A_24_P306905

—

A_24_P524452 — A_32_P74477

—

A_24_P288915 — A_32_P159289

—

A_32_P184039 — A_32_P168727

—

A_32_P35947 — A_32_P209104

—

A_24_P845223 — A_32_P134679

—

A_32_P78488 — A_23_P388146

—

A_32_P121978 — A_24_P204574

—

A_32_P212373 — A_32_P154445

—

A_32_P116488 — A_32_P206308

—

A_32_P144281 — A_24_P179107

—

A_24_P895836 — A_24_P398370

—

A_24_P418216 — A_32_P219581

—

A_32_P35668 — A_32_P175557

—

A_23_P73328 — A_32_P30434

—

A_32_P77742 — A_32_P327750

—

A_32_P191895 — A_32_P109835

—

A_32_P101653 — A_32_P185530

—

A_24_P315594 — A_32_P23731

Claims (24)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Método in vitro de obtención de datos útiles para el pronóstico de cáncer de pulmón no microcítico de estadio I o II caracterizado por la detección y/o cuantificación del producto de expresión de los genes de la tabla 1 en la muestra biológica aislada de un sujeto.

2. 2.

   Método según la reivindicación 1 que además comprende la comparación de los datos útiles con valores de expresión de referencia para el producto de expresión de los genes de la tabla 1 en cáncer de pulmón no microcítico de estadio I o II obtenidos de sujetos en los que el pronóstico es conocido (muestra de referencia) para identificación del sujeto como un sujeto de buen pronóstico o de mal pronóstico.

3. 3.

   Método según las reivindicaciones 1 o 2 donde la comparación se realiza mediante el método del centroide compacto más cercano.

4. 4.

   Método in vitro para el pronóstico de cáncer de pulmón no microcítico de estadio I o II caracterizado por:

   a.

   la detección y cuantificación del producto de expresión de los genes de la tabla 1 en una muestra de referencia;

   b.

   el cálculo de un valor de referencia (valor 1) para cada producto de expresión de los genes de la tabla 1 en las muestras de referencia de pronóstico favorable (grupo de buen pronóstico) y el cálculo de un valor de referencia (valor 2) en las muestras de referencia de pronóstico desfavorable (grupo de mal pronóstico) mediante el uso del método del centroide más cercano;

   c.

   la detección y cuantificación del producto de expresión de los genes de la tabla 1 en la muestra biológica de un nuevo sujeto en el que el pronóstico es desconocido (muestra de estudio);

   d.

   la comparación mediante el uso del método de clasificación del centroide compacto más cercano de los valores obtenidos en la detección y cuantificación del producto de expresión de los genes de la tabla 1 en la muestra de estudio con los valores de referencia obtenidos en los grupos de buen y mal pronóstico.

   e.

   la asociación de la muestra de estudio al grupo de buen pronóstico o al grupo de mal pronóstico según lo establecido en el método del centroide compacto más cercano.

5. 5.

   Método según la reivindicación 4 donde el método del centroide más cercano se lleva a cabo a través de la aplicación de Predicción de Análisis de Microarrays (PAM).

6. 6.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 donde la muestra de referencia y las muestras de estudio han sido previamente normalizadas antes de la comparación.

7. 7.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 que además comprende la detección y/o cuantificación de al menos un producto de expresión de los genes descritos en la tabla 2.

8. 8.

   Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el producto de expresión es ARN mensajero.

9. 9.

   Método según la reivindicación 8 donde la detección y/o cuantificación del ARN mensajero se realiza mediante microarrays.

10. 10.

    Método según la reivindicación 8 donde la detección y/o cuantificación del ARN mensajero se realiza mediante RT-PCR.

11. 11.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 donde el producto de expresión es una proteína.

12. 12.

    Método según la reivindicación 11 donde la detección y/o cuantificación de la proteína se realiza mediante inmuno blotting, inmunohistoquímica, cromatografía o microarrays.

13. 13.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 donde la muestra biológica se selecciona de la lista que comprende: tejido, sangre, plasma, suero, linfa, lavado broncoalveolar o fluido ascítico.

14. 14.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 donde la muestra biológica es fresca, congelada, fijada o fijada y embebida en parafina.

15. 15.

    Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 donde el sujeto es un humano.

16. 16.

    Uso in vitro de los productos de expresión de los genes de la tabla 1 como marcador pronóstico de cáncer de pulmón no microcítico de estadio I o II.

17. 17.

    Kit que comprende sondas que consisten en las sondas que reconocen el ARN mensajero, producto de la expresión de los genes de la tabla 1, o el ADN complementario o ARN complementario a dicho ARN mensajero, o anticuerpos que reconocen una proteína producto de expresión de los genes de la tabla 1.

    41
18. 18. Kit según la reivindicación 17 que comprende sondas, que consisten en las sondas que reconocen el ARN 5 mensajero producto de la expresión de los genes de la tabla 1.

19. 19.

    Kit según la reivindicación 15 donde las sondas son las secuencias SEQ ID NO: 1 a SEQ IDNO: 66.

20. 20.

    Kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19 que además comprende al menos una sonda o un anticuerpo que reconoce un producto de expresión de los genes de la tabla 2.

21. 21.

    Kit según la reivindicación 20 que comprende al menos una sonda que reconoce un producto de expresión de los 10 genes de la tabla 2.

22. 22.

    Kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21 que además comprende al menos unos de los reactivos seleccionados de la lista que comprende: una retrotranscriptasa, una ARN polimerasa o un fluoróforo.

23. 23.

    Kit según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22 donde las sondas están situadas en un soporte sólido.

24. 24.

    Uso del kit según las reivindicaciones 17 a 23 para la obtención de datos útiles para el pronóstico del carcinoma 15 de pulmón no microcítico de estadios I o II.

    42

    43

    FIG.3

    FIG.4

    44

    FIG.5 A

    45

    FIG.7

    p = 0.022

    Grupo 1 (71) —— Grupo 2 (40) — — Grupo3(51) ---

    FIG.8

    p = 0.001

    46

    FIG.9 A

    FIG.9 B

    47