ES2404665T3 - Polimerasas de ADN que incorporan análogos de nucleótidos marcados con colorante - Google Patents

Abstract

Una polimerasa de ADN modificada genéticamente con una gama más amplia de sustratos siendo capaz lapolimerasa de incorporar una mayor presencia de un análogo de nucleótido marcado con colorante en un ácidonucleico sintetizado por esa polimerasa modificada genéticamente, en comparación con la polimerasa de tiposilvestre a partir de la cual se obtiene, en donde la polimerasa se describe con cualquier secuencia de aminoácidosque tiene al menos 70% de identidad con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las siguientessecuencias: 1, 4, 8, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48, y que comprende lassiguientes mutaciones por sustitución en comparación con la secuencia de aminoácidos de Pfu de tipo silvestre:N400G/N400D y R407I.

Description

Polimerasas de ADN que incorporan análogos de nucleótidos marcados con colorante.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polimerasas de ADN. En particular, la invención se refiere a polimerasas de ADN con una mayor capacidad para incorporar análogos de nucleótidos que son portadores de sustituyentes marcados con agentes de detección. Los usos de tales polimerasas modificadas genéticamente también se describen.

Antecedentes

Una replicación eficaz y precisa del ADN es crucial para el mantenimiento, la transmisión y la expresión de la información genética. Las polimerasas de ADN de gran fidelidad son las principales enzimas responsables de mantener la integridad del genoma. Para evitar las consecuencias negativas de mutaciones (enfermedades hereditarias y esporádicas) las polimerasas de ADN de gran fidelidad realizan una asombrosa proeza de reconocimiento molecular, seleccionando la molécula de nucleótido trifosfato correcta (dNTP) entre un grupo de sustratos muy similares y catalizando su incorporación tal y como está especificada por la base del molde. La síntesis de ADN mediante polimerasas de ADN con una prueba de lectura exonucleolítica insuficiente tiene lugar con tasas de error que van desde 10-3 hasta >10-6 por pareja de bases (Kunkel y Bebenek, 2000; Tippen et al., 2004). Aunque en la naturaleza una gran fidelidad de la polimerasa es vital para una replicación exacta del ADN, tiene serios inconvenientes para muchas aplicaciones biotecnológicas. En concreto, se restringe el uso de bases de nucleótidos no naturales o modificadas y las aplicaciones que permiten.

Las tecnologías que se basan en la fluorescencia han sustituido a la detección radioisotópica como opción preferida para marcar y detectar biomoléculas. La incorporación de nucleótidos marcados con fluorescencia en ácidos nucleicos es fundamental para técnicas, tales como la secuenciación de ADN, el análisis de la expresión génica en micromatrices (Schena et al., 1995) micromatrices de tejidos (TMA; Kononen et al., 1998), hibridaciones comparativas del genoma (CGH; Kallioniemi et al., 1992) e hibridación in situ fluorescente (FISH; McNeil et al., 1991). Las metodologías para marcar el ácido nucleico con fluorescencia se han desarrollado basándose en una modificación enzimática (incorporación directa del colorante fluorescente) o una modificación química (incorporación indirecta del colorante fluorescente).

La incorporación directa de nucleótidos marcados con colorante emplea enzimas polimerasas y está limitada por el hecho de que las enzimas polimerasas han evolucionado para conservar una gran selectividad para su sustrato nucleotídico correcto. Como tales, la mayoría de las enzimas polimerasas presentes en la naturaleza o comercialmente disponibles, discriminan los nucleótidos portadores de grupos laterales voluminosos, tales como restos fluorescentes, o los incorporan con niveles bajos, mostrando un sesgo significativo de la secuencia (Zhu y Waggoner, 1997; Zhu et al., 1994). Por lo tanto, la mayoría de los protocolos para marcar enzimáticamente con fluorescencia utilizan el nucleótido marcado con colorante, marcado con un porcentaje bajo, en una mezcla de reacción estándar (Reid et al., 1992). Sin embargo, incluso con estas condiciones, la enzima polimerasa todavía sigue favoreciendo al nucleótido natural sobre el nucleótido modificado (Zhu et al., 1994).

Para superar las bajas densidades de fluoróforo obtenidas con métodos de marcación directa, se han desarrollado tecnologías de marcación indirecta, en donde un nucleótido menos voluminoso modificado con amina se incorpora directamente en el ácido nucleico y el marcador fluorescente se acopla químicamente con el nucleótido, a través del grupo amino reactivo después de la síntesis del ácido nucleico (Cox y Singer, 2004). Aunque se pueden alcanzar mayores densidades de marcación fluorescente de ácidos nucleicos por métodos de marcación indirecta, no se ha logrado una sustitución completa de cada nucleótido reactivo.

Las sondas de ácido nucleico con una mayor densidad de marcadores (hasta 100% de sustitución) son deseables ya que se espera que incrementen la sensibilidad de la detección. Además, 100% de sustitución de cada base con su equivalente modificado con fluorescencia, es un requisito previo de muchas técnicas de secuenciación de una molécula aislada (Shendure et al., 2004). Con los métodos indirectos actuales para marcar el ADN, que permiten marcar el 100% de las posiciones disponibles, los esfuerzos en la investigación se han centrado en la identificación de enzimas polimerasas de ADN de origen natural o mutante que son menos estrictas con respecto a su especificidad con el sustrato.

Tales esfuerzos han tenido un éxito moderado. Específicamente, varios miembros de las familias evolutivas A (similar a PolI; Brakmann y Nieckchen, 2001; Anderson et al., 2005; Yu et al., 1994; Tasara et al., 2003; Augustin et al., 2001; Ghadessy et al., 2004; Ramanathan et al., 2005) o B (similar a PolII; Anderson et al., 2005; Augustin et al., 2001; Tasara et al., 2003; Földes-Papp et al., 2001; Glick et al., 2002; Jäger y Famulok, 2004; Obayashi et al., 2002; Ono et al., 1997) de enzimas polimerasas de ADN (Zhu e Ito, 1994), han sido identificados por ser capaces de incorporar nucleótidos marcados con fluorescencia. En el caso de enzimas que albergan actividad polimerasa, así como actividad de prueba de lectura, la obtención del ADN marcado con colorante se mejoró mediante el uso de sus mutantes con exonucleasa defectuosa.

La capacidad de la mayoría de las enzimas polimerasas para incorporar nucleótidos marcados con fluorescencia se había investigado solamente por análisis de extensión con cebadores, generando ADN monocatenario marcado con fluorescencia. La incorporación mediante PCR de nucleótidos marcados con fluorescencia permite marcar y amplificar simultáneamente el ADN. Sin embargo, en contraposición a las reacciones de extensión con cebadores, tras unos pocos ciclos de amplificación con PCR, el nucleótido fluorescente también está presente en la hebra del molde. Esto tiene consecuencias para la amplificación con PCR, ya que la polimerasa se detiene con frecuencia o interrumpe la copia y el rendimiento de ADN marcado disminuye a medida que la incorporación de nucleótidos fluorescentes aumenta, presumiblemente debido a efectos de amontonamiento estérico (Zhu y Waggoner, 1994). En consecuencia, existe una necesidad de enzimas polimerasas capaces de incorporar eficazmente análogos de nucleótidos fluorescentes con una densidad elevada, mediante PCR, y sigue existiendo una necesidad en la técnica de polimerasas, en particular de polimerasas de ADN, que sean capaces de incorporar un marcador para la detección con densidad elevada y/o capaces de incorporar el marcador para la detección en fragmentos grandes de ADN bicatenario.

Compendio de la invención

La presente invención modificaba los principios de la autorreplicación compartimentalizada (CSR, del inglés “compartmentalised self replication”; Ghadessy et al., 2001) para reducir la discriminación frente a análogos de nucleótidos marcados con colorante (marcadores con agente de detección), en particular Cy5-dCTP y Cy3-dCTP (los nucleótidos marcados con colorante utilizados más comúnmente para marcar sondas de micromatrices). De esta manera, los inventores fueron capaces de identificar una cantidad de polimerasas que permitieron la síntesis de sondas de ácidos nucleicos con marcadores con agentes de detección relevantes, en particular, agentes de detección con fluoróforo.

Por lo tanto, en el primer aspecto, la presente invención proporciona una polimerasa de ADN modificada genéticamente con una gama más amplia de sustratos, siendo capaz la polimerasa de incorporar una mayor presencia de un análogo de nucleótido marcado con colorante en un ácido nucleico sintetizado por esta polimerasa modificada genéticamente, en comparación con la polimerasa de tipo silvestre a partir de la cual se ha obtenido, en donde la polimerasa se describe con cualquier secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las siguientes: SEQ ID NOs 1, 4, 8, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48, y que comprende las siguientes mutaciones por sustitución en comparación con la secuencia de aminoácidos de Pfu de tipo silvestre: N400G/N400D y R407I.

El término "mutante" se utiliza en esta memoria para referirse a una secuencia polipeptídica o de nucleótidos que tiene una secuencia que difiere de la secuencia de tipo silvestre en una o varias adiciones, sustituciones o deleciones.

La polimerasa modificada genéticamente puede ser una polimerasa Pfu mutante, expresada por los clones seleccionados entre el grupo que consiste en los siguientes: 23, AH12, 55, 15, 33, 34, 35 y E10.

En otra realización de la invención, la Pfu mutante es E10, tal y como se describe en la presente memoria, seleccionada a partir de repertorios de genes Pfu mutados en los motivos A, o A y B, o A y C mediante una variante de CSR, CSR de tramos cortos (spCSR), por una capacidad mejorada para incorporar Cy5-dCTP. Por ejemplo, E10 incorpora Cy5-dCTP cuando se sustituye hasta el 100% de las dCTPs en reacciones de extensión con ELISA y PCR (véanse los ejemplos). Esto es significativo ya que durante la amplificación con PCR, tanto el molde como la cadena producto se van a marcar con moléculas voluminosas de colorante. Ventajosamente, E10 también incorpora Cy3dCTP cuando se sustituye hasta el 100% de dCTP en reacciones de extensión con ELISA y PCR (véanse los ejemplos). El ADN marcado con E10 en reacciones de PCR en donde el 100% de las dCTPs se había reemplazado por Cy3-dCTP, daba como resultado una señal fluorescente 7 veces más intensa que cuando se utilizaba en experimentos de hibridación en micromatrices (véanse los ejemplos). Sorprendentemente, el ADN marcado con E10 en reacciones de PCR, en donde se había sustituido el 10% de las dCTPs por Cy3-dCTP, daba como resultado una señal fluorescente 4 veces más fuerte en experimentos con micromatrices, lo que sugiere que E10 tiene una afinidad mejorada hacia dCTP modificada con Cy3 (véanse los ejemplos).

De acuerdo con la invención descrita en la presente memoria, la presencia de un nucleótido marcado con un agente de detección en una posición dada en el ácido nucleico recién sintetizado, marca eficazmente esa posición del nucleótido. Esta marcación facilita a continuación el uso del ácido nucleico sintetizado en cualquiera de las funciones siguientes: reacción en cadena de la polimerasa (PCR); secuenciación de ADN monocatenario y detección en micromatrices. Los expertos en la técnica conocen otros usos adecuados para el ácido nucleico marcado con agentes de detección, sintetizado de acuerdo con la invención.

La sensibilidad de una cualquiera o de varias de las siguientes técnicas: PCR, ELISA, FISH, FISH con fibras y micromatrices, se puede mejorar utilizando una sonda de ácido nucleico que se ha marcado con Cy5-CTP o Cy3-CTP, utilizando una polimerasa de ácido nucleico, adecuadamente, una polimerasa E10 de acuerdo con la invención.

El marcador de colorante puede ser un marcador de colorante fluorescente. Los marcadores de colorante adecuados son conocidos por los expertos en la técnica y se describen con más detalle en la descripción detallada de la invención. En una realización preferida de los métodos de la invención, el marcador fluorescente es dCTP marcada con Cy3 y/o Cy5.

De acuerdo con la presente invención, la expresión "polimerasa de ADN modificada genéticamente (por ejemplo, mutada)" se refiere a una polimerasa de ADN que tiene una secuencia de ácido nucleico que no es 100% idéntica a nivel de ácido nucleico, a una o varias polimerasas de ADN o fragmentos de las mismas, a partir de las cuales se han obtenido, y que se ha generado utilizando uno o varios métodos sintéticos. Ventajosamente, una polimerasa de ADN modificada genéticamente de acuerdo con la invención es una polimerasa de ADN de la familia pol-B. Más adecuadamente, la polimerasa modificada genéticamente es un mutante de la enzima Pfu. Tal y como se ha mencionado anteriormente, la expresión “polimerasa de ADN modificada genéticamente” también incluye dentro de su alcance fragmentos, derivados y homólogos de una “polimerasa de ADN modificada genéticamente”, tal y como se ha definido en esta memoria, siempre que muestre la propiedad requerida de poseer una gama más amplia de sustratos, tal y como se define en la presente memoria. Además, una característica esencial de la presente invención es que una polimerasa de ADN modificada genéticamente de acuerdo con la invención, incluye no más de 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o sustancialmente 0% (en comparación con la polimerasa de tipo silvestre) de una polimerasa sin actividad exonucleasa 3’-5’, en las condiciones utilizadas para la reacción de polimerización. Tal actividad de prueba de lectura eliminaría cualquier desapareamiento en 3', incorporado de acuerdo con el método de la invención, y por tanto, impediría que una polimerasa de acuerdo con la invención posea una gama más amplia de sustratos, tal y como se define en la presente memoria.

Tal y como se define en esta memoria, la expresión “gama más amplia de sustratos” (de una polimerasa de ADN modificada genéticamente) se refiere a la capacidad de una polimerasa modificada genéticamente de acuerdo con la presente invención, para incorporar una densidad mejorada de análogo de nucleótido marcado con un agente de detección, en el ácido nucleico sintetizado por esa polimerasa modificada genéticamente, en comparación con la polimerasa de tipo silvestre, a partir de la cual se obtiene.

En una realización, una polimerasa modificada genéticamente de acuerdo con la invención puede incorporar 10% de nucleótidos marcados con un agente de detección, expresados como un porcentaje del total de nucleótidos en el ácido nucleico recién sintetizado - tal como ADN. En aún una realización preferida, una polimerasa modificada genéticamente de acuerdo con la invención puede incorporar 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% de nucleótidos marcados con agente de detección, expresados como un porcentaje del total de nucleótidos en el ácido nucleico recién sintetizado, tal como ADN. En una realización, la polimerasa modificada genéticamente incorpora 100% de nucleótidos marcados con agente de detección, expresados como un porcentaje del total de nucleótidos en el ácido nucleico recién sintetizado - tal como ADN.

En aún un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método para incorporar análogos de nucleótidos marcados con un agente colorante en un ácido nucleico recién sintetizado, en donde el método comprende el uso de una polimerasa modificada genéticamente de acuerdo con la invención.

En aún un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de una polimerasa modificada genéticamente de acuerdo con la invención, en la síntesis de ácido nucleico que comprende análogos de nucleótidos marcados con fluorescencia.

En aún un aspecto adicional, la presente invención proporciona el uso de una polimerasa modificada genéticamente con una gama más amplia de sustratos de acuerdo con la invención, en una o varias técnicas en el grupo que consiste en las siguientes: reacción en cadena de la polimerasa (PCR); análisis con micromatrices (tal como el análisis con micromatrices de la expresión génica, micromatrices tisulares, hibridaciones genómicas comparativas en micromatriz); hibridación in situ fluorescente (FISH); FISH con fibras; hibridaciones genómicas comparativas; secuenciación de ADN, secuenciación de ácido nucleico, (p. ej., secuenciación de ácido nucleico monocatenario) y detección de una molécula aislada.

En otra realización la polimerasa modificada genéticamente es una polimerasa Pfu mutante expresada por los clones seleccionados entre el grupo que consiste en los siguientes: 23, AH12, 55, 15, 33, 34, 35 y E10.

En otro aspecto, se proporciona una secuencia de nucleótidos en la que al menos el 90%, de forma adecuada el 100% de los residuos de citidina están marcados con Cy5 y/o Cy3. En otra realización, la secuencia de nucleótidos no comprende un enlazador entre los residuos de C y Cy.

La secuencia de nucleótidos puede tener un origen sintético o recombinante. La secuencia de nucleótidos puede ser bicatenaria o monocatenaria según represente la hebra codificadora o la hebra no codificadora o una combinación de las dos. La secuencia de nucleótidos puede ser ADN. La secuencia de nucleótidos se puede preparar empleando técnicas de ADN recombinante (p. ej., ADN recombinante).

Las secuencias de nucleótidos pueden incluir en ellas nucleótidos sintéticos o modificados. Se conoce en la técnica una variedad de diferentes tipos de modificaciones para oligonucleótidos. Estas incluyen cadenas principales de metilfosfonato y fosforotioato y/o la adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3’ y/o 5’ de la

molécula.

Descripción de las Figuras:

Figura 1: Enriquecimiento de una variante activa de Pfu frente a una variante inactiva cuando está presente en emulsión, con una dilución 1:100.

Se llevó a cabo una PCR en solución o emulsión (CSR) en condiciones modificadas, con células que expresaban una variante activa de Pfu (codificada por pASKpfuexo-2) y una variante inactiva de Pfu (codificada por pASKpfuexo7), presentes en una proporción de 1:100 y los cebadores 40 y 41.

La variante inactiva de Pfu contiene un único sitio para la enzima de restricción XhoI en 1218 pb. La digestión con restricción con XhoI permite distinguir los productos de la PCR obtenidos a partir de los genes inactivos y activos de la polimerasa. En solución no hay compartimentalización de los clones activos e inactivos y la enzima polimerasa activa Pfu amplifica tanto su propio gen codificador como el gen que codifica la variante inactiva de Pfu. Después de la digestión con XhoI, los productos de la PCR amplificados de nuevo se observaron fragmentos resistentes a la digestión (2,4 kb) obtenidos a partir del gen de la polimerasa activa y fragmentos digeridos (1,238 kb y 1,166 kb), después de una electroforesis en gel de agarosa. Por el contrario, en emulsión, se aíslan bacterias individuales que expresan polimerasas Pfu activas o inactivas, en compartimientos acuosos separados que garantizan que la enzima polimerasa activa solo amplifica su propio gen codificante. Los productos de la PCR obtenidos a partir de reacciones realizadas en emulsiones, son resistentes a la digestión con XhoI lo que indica que el fragmento se origina a partir del gen de la polimerasa activa y muestra un claro enriquecimiento del clon activo sobre el clon inactivo.

Figura 2: Actividad de ELISA de variantes de Pfu seleccionadas con Cy5-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A de Pfu.

Lisados con actividad normalizada procedentes de Pfu y de las variantes de Pfu 15, 23, 55 y AH12, seleccionados con Cy5-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A de Pfu, se evaluaron por su capacidad para incorporar (A) 4 Cy3-dCTPs o Cy5-dCTPs consecutivas; cebador 33, (B) 6 Cy3-dCTPs o Cy5-dCTPs consecutivas; cebador 34 o (C) 8 Cy3-dCTPs o Cy5-dCTPs consecutivas; cebador 35. Todos los clones seleccionados son significativamente mejores que Pfu en la incorporación de Cy5-dCTP, a través de cuya actividad fueron seleccionados. Además, todos los clones seleccionados también son más capaces de incorporar Cy3-dCTP que Pfu.

Figura 3: Alineación de los aminoácidos de variantes de Pfu seleccionadas con Cy5-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A de Pfu.

Los ELISAs realizados con los cebadores 33, 34 y 35 identificaron variantes de Pfu 15, 23, 55 y AH12 que tenían una capacidad significativamente mayor para incorporar Cy5-dCTP y Cy3-dCTP (véase la Figura 2). El análisis de la secuencia de estos clones con los cebadores 44, 36 y 37 sobre la región amplificada y clonada después de la selección con Cy5-dCTP, a partir de la genoteca con repertorio de motivos A de Pfu, identificó las siguientes mutaciones: 15 (V337I, E399D, N400D, R407I), 23 (N400D, 1401L, R407I), 55 (N400G, R407I) y AH12 (E399D, N400G, I401L, V402A, R407I, Q572H), en comparación con la secuencia de aminoácidos de Pfu de tipo silvestre.

Figura 4: Actividad de ELISA de variantes de Pfu seleccionados con Cy5-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-B de Pfu.

Lisados crudos procedentes de variantes de Pfu seleccionadas con Cy5-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-B de Pfu, las variantes de Pfu 15, 23 y 55 (seleccionadas con Cy5-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A de Pfu) y Pfu fueron evaluados para estudiar su capacidad para incorporar 8 Cy3-dCTPs o Cy5-dCTPs consecutivos (cebador 35). Los clones aislados a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-B de Pfu son significativamente mejores que Pfu y los clones seleccionados a partir de la primera ronda de selección con Cy5-dCTP (repertorio de motivos A de Pfu: clones 15, 23 y 55) en la incorporación de Cy5-dCTP, actividad para la que fueron seleccionados. Además, todos los clones seleccionados son también más capaces de incorporar Cy3dCTP que Pfu y las variantes de la genoteca de motivos A de Pfu seleccionadas con Cy5-dCTP (15, 23, y 55).

Figura 5: Alineación de aminoácidos de variantes de Pfu seleccionadas con Cy5-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-B de Pfu.

Los ELISAs realizados con el cebador 35 identificaron las variantes de Pfu 2-13 que tenían una capacidad significativamente mayor para incorporar Cy5-dCTP o Cy3-dCTP (véase la Figura 4). El análisis de la secuencia de estos clones con el cebador 36 sobre los motivos A (A) y B (B) diversificados durante la construcción de la genoteca, identificó mutaciones en los motivos A y B en comparación con la secuencia de aminoácidos de Pfu de tipo silvestre. Los moldes utilizados para la construcción de la genoteca con repertorio de motivos A-B de Pfu, se tenían que haber contaminado con alguna secuencia de Pfu de tipo silvestre, ya que no todos los clones seleccionados contenían diversidad en el motivo A, aunque todos los clones seleccionados contenían diversidad en el motivo B. Algunos clones también contenían mutaciones adicionales no codificadas por los cebadores de la diversidad, pero estaban situadas entre los cebadores (27 y 30) utilizados en la selección con Cy5-dCTP.

Figura 6: Actividad de ELISA de variantes de Pfu seleccionadas con Cy5-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-C de Pfu.

Lisados crudos procedentes de variantes de Pfu seleccionadas con Cy5-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-C de Pfu, variantes de Pfu 15, 23, 55 y AH12 (seleccionadas con Cy5-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A de Pfu) fueron evaluados para estudiar su capacidad para incorporar 8 (cebador 35) Cy5-dCTPs o Cy3-dCTPs consecutivas. Los clones aislados a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-C de Pfu son significativamente mejores que los clones seleccionados a partir de la primera ronda de selección con Cy5dCTP (repertorio de motivos A de Pfu: clones 15, 23, 55 y AH12) en la incorporación de Cy5-dCTP, actividad para la que fueron seleccionados. Además, todos los clones seleccionados también son más capaces de incorporar Cy3dCTP que las variantes de la genoteca con motivos A seleccionada con Cy5-dCTP (15, 23, 55 y AH12).

Figura 7: Alineación de aminoácidos de las variantes de Pfu seleccionadas con Cy5-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-C de Pfu.

Se realizan ELISAs con las variantes de Pfu E10, 5, 9, 10, 12, 13, 15, 22, 23, 25, 27 y 28 identificadas con el cebador 35, por tener una capacidad significativamente mayor para incorporar Cy5-dCTP o Cy3-dCTP (véase la figura 6). El análisis de la secuencia de estos clones con el cebador 36 sobre los motivos A (A) y C (B) diversificados durante la construcción de la genoteca, identificó mutaciones en los motivos A y C, en comparación con la secuencia de aminoácidos de Pfu de tipo silvestre. Algunos clones también contenían mutaciones adicionales no codificadas por los cebadores de la diversidad, pero situadas entre los cebadores (27 y 32) utilizados en la selección con Cy5dCTP.

Figura 8: Secuencia de ADN y de aminoácidos de E10.

El clon E10 seleccionado con Cy5-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-C de Pfu fue identificado por tener una capacidad significativamente mayor para incorporar tanto Cy3-dCTP como Cy5-dCTP. La secuenciación de este clon con los cebadores 36, 37, 39, 44, 45 y 46 identificaba 14 mutaciones puntuales, siendo 9 de ellas silenciosas. Las 5 restantes introducen las siguientes mutaciones: V337I, E399D, N400D, R407I y Y546H.

Figura 9: Actividad de ELISA de las variantes de Pfu seleccionadas con Cy3-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-C de Pfu.

Lisados crudos procedentes de variantes Pfu seleccionadas con Cy3-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-C de Pfu, Pfu y las variantes de Pfu 15, 23, 55 y AH12 (seleccionadas con Cy5-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A de Pfu) fueron evaluados para estudiar su capacidad para incorporar 8 Cy5dCTPs o Cy3-dCTPs consecutivas (cebador 35). Todos los clones aislados a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-C de Pfu son significativamente mejores que Pfu en la incorporación de Cy3-dCTP, actividad para la que fueron seleccionados. Además, todos los clones seleccionados también son más capaces de incorporar Cy5-dCTP que Pfu.

Figura 10: Alineación de aminoácidos de variantes de Pfu seleccionadas con Cy3-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-C de Pfu.

Los ELISAs realizados con el cebador 35 identificaban las variantes de Pfu 1-11, por tener una capacidad significativamente mayor para incorporar Cy5-dCTP o Cy3-dCTP (véase la figura 9). El análisis de la secuencia de estos clones con el cebador 36 sobre los motivos A (A) y C (B) diversificados durante la construcción de la genoteca, identificó mutaciones en los motivos A y C en comparación con la secuencia de aminoácidos de Pfu de tipo silvestre. Algunos clones también contenían mutaciones adicionales no codificadas por los cebadores de la diversidad, pero situadas entre los cebadores (27 y 32) utilizados en la selección con Cy5-dCTP.

Figura 11: Actividad de ELISA de variantes de Pfu seleccionadas con Cy5-dCTP y biotina-16-dUTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-B de Pfu.

Lisados crudos procedentes de variantes Pfu seleccionadas con Cy5-dCTP y biotina-16-dUTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-B de Pfu, Pfu y las variantes de Pfu 15, 23, 55 y AH12 (seleccionadas con Cy5-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A de Pfu) fueron evaluados para estudiar su capacidad para incorporar 8 Cy5-dCTPs o Cy3-dCTPs consecutivas (cebador 35). Todos los clones aislados a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-B de Pfu son significativamente mejores que Pfu en la incorporación de Cy5dCTP, actividad para la que fueron seleccionados. Además, todos los clones seleccionados también son más capaces de incorporar Cy3-dCTP que Pfu.

Figura 12: Alineación de aminoácidos de variantes de Pfu seleccionadas con Cy5-dCTP y biotina-16-dUTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-B de Pfu.

Se realizan ELISAs con las variantes de Pfu D1, E1, F1, A2, C2, D2, E2, F2, G2 y A3 identificadas con el cebador 35, por tener una capacidad significativamente mayor para incorporar Cy5-dCTP o Cy3-dCTP (véase la figura 11). El análisis de la secuencia de estos clones con el cebador 36 sobre los motivos A (A) y B (B) diversificados durante la

construcción de la genoteca, identificó mutaciones en los motivos A y B, en comparación con la secuencia de aminoácidos de Pfu de tipo silvestre. Los moldes utilizados para la construcción de la genoteca con repertorio de motivos A-B de Pfu se debían haber contaminado con alguna secuencia de Pfu de tipo silvestre, ya que no todos los clones seleccionados contenían diversidad en el motivo A aunque todos los clones seleccionados contenían diversidad en el motivo B. Algunos clones también contenían mutaciones adicionales no codificadas por los cebadores de la diversidad, pero estaban situadas entre los cebadores (27 y 32) utilizados en la selección con Cy5dCTP.

Figura 13: Análisis con PAGE de los productos de la PCR amplificados utilizando variantes de Pfu seleccionadas en reacciones en las que el 100% de la dCTP está sustituido por Cy5-dCTP o Cy3-dCTP.

Las PCR se realizaron con Pfu con actividad normalizada purificada con heparina, V93Q, y variantes de Pfu seleccionadas con Cy5-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A de Pfu (variante 15), variantes de Pfu seleccionadas con Cy5-dCTP y biotina-16-dUTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-B de Pfu (variantes A3 y D2) o variantes de Pfu seleccionadas con Cy5-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-C de Pfu (variantes 1, 9, 3, 10, 4 y E10). El 100% de la dCTP en la reacción de PCR fue sustituida por Cy3-dCTP (3) o Cy5-dCTP (5). Un fragmento de 410 pb de tamaño se amplificó con los cebadores 38 y 39 que requieren la incorporación de 287 dCTPs marcadas con colorante Cy.

Figura 14: Análisis en micromatrices con Cy3-ADN altamente marcado con E10, purificado por el método de congelación-presión.

La emisión de fluorescencia se midió utilizando un escáner ArrayWoRx E (Applied Precision Instruments) a partir de experimentos en los que cantidades equimolares de ADN de PfuCy510 se hibridaron con ADN de PfuCy310 (A), ADN de E10Cy310 (B) o ADN de E10Cy3100 (C) en portaobjetos con micromatrices sobre los que se habían depositado una serie de diluciones dobles de ADN de la polimerasa Pfu (50-6,25 ng/μL). Un aumento de 4 veces en la señal fluorescente se detectó en el ADN de E10Cy310 y un aumento de 7 veces en la señal de Cy3 se detectó en el ADN de E10Cy3100 (D).

Figura 15: ADN altamente marcado con colorante Cy se reparte en la fase orgánica en presencia de sales en la extracción con fenol.

ADN marcado con Cy5 (Figura 15A) o Cy3 (Figura 15B) amplificado con E10 se resuspendió en H2O (Figuras 15A y B 1), NaCl 100 mM (Figuras 15A y B 2), NaCl 150 mM (Figuras 15A y B 3) o NaCl 200 mM (Figuras 15A y 15 4). Después de la extracción con un volumen igual de fenol equilibrado con Tris HCl (pH 7,4), el ADN marcado con colorante Cy se repartió desde la parte superior de la fase acuosa a la parte inferior de la fase fenol orgánica, en presencia de sales.

Figura 16: Longitud de los fragmentos para obtener la máxima señal a partir de ADN altamente marcado con colorante Cy.

Los diagramas de caja de la señal fluorescente se obtuvieron a partir de experimentos de cohibridación de fragmentos de 270 pb y 1,3 kb, marcados directamente con E10 (50% de sustitución de dCTP) con muestras marcadas indirectamente con Klenow, escaneadas empleando un escáner ArrayWoRx E. E = E10; K = Klenow, 3 = Cy3-dCTP, 5 = Cy5-dCTP.

Figura 17: Densidad de la tinción y elección del escáner para obtener la máxima señal a partir del ADN marcado con colorante Cy.

Diagramas de dispersión de la señal fluorescente obtenida a partir de experimentos de cohibridación de fragmentos de 270 pb marcados directamente mediante E10 en PCRs en donde 10% (E1010), 50% (E1050) o 100% (E10100), de la dCTP se había reemplazado por dCTP marcada con Cy3-dCTP o Cy5-dCTP, con fragmentos de 270 pb marcados directamente por Pfuexo-en PCRs en donde el 10% (Pfu10) de la dCTP había sido reemplazada por dCTP marcada con colorante Cy. Cada punto representa una característica individual de la matriz. Puntos rojos = señal de Cy3 y Cy5 procedente del ADN marcado con Pfuexo al 10%; puntos verdes = señal de Cy5 procedente de ADN marcado con E10; puntos azules = señal de Cy3 procedente de ADN marcado con E10.

Figura 18: Digestión con restricción de ADN marcado mediante E10 con 100% de Cy3-dCTP o Cy5-dCTP.

Carriles 1 y 7 marcador ΦX174 HaeIII, carriles 2 y 5 DdeI; carriles 3 y 6 MseI; carriles 4 y 7 sin cortar.

Figura 19: La contribución de las mutaciones seleccionadas con Cy5-dCTP procedentes del repertorio de motivos A de Pfu (E399D, N400G, R407I y V337I) y de la mutación adicional seleccionada a partir del repertorio de la genoteca de motivos A y C de Pfu (Y546H) a la actividad de E10 tal y como se evaluó por ELISA (Figura 19A) o PCR (Figura 19B).

A) ELISAs realizados con lisados crudos con actividad normalizada de E10 (E10 B y F; E399D, N400G, R407I, V337I, Y546H), clon 15 (15 G y C; E399D, N400G, R407I y V337I), pASKpfuexo-6Y546H (Y546H D y H) o Pfuexo

(A y E; Stratagene) y el cebador 35 y Cy3-dCTP o Cy5-dCTP.

B) Electroforesis en gel de agarosa (1,2% p/v) de los productos de las PCRs realizadas con Pfuexo-con actividad normalizada (1 y 5; Stratagene), E10 (2 y 6), clon 15 (3 y 7) y Y546H (4 y 8) y tiempos de extensión de 30 segundos

o 10 segundos. Con un tiempo de extensión de 10 segundos solo E10 (6) es capaz de amplificar el producto de 270 pb. Marcador = ΦX174 HaeIII (HT Biotechnology Ltd).

Figura 20: Mutaciones del motivo A de E10 pueden compensar la falta de actividad de Tgo Therminator.

A) Alineación de la secuencia de Tgo V93Q exo- (Tgo), Tgo V93Q exo-en la que se han introducido las mutaciones del motivo A de E10 (Tgo E10AMo; V93Q, Exo-, E398D, N399D, R406I), Tgo V93Q exo- Therminator en la que se han introducido las mutaciones del motivo A de E10 (TgoT E10AMo; V93Q, Exo-, A485L, E398D, N399D, R406I).

B) Electroforesis en gel de agarosa (1,2% p/v) de PCRs realizadas con lisados crudos de Tgo E10AMo (Carril 1; V93Q, exo-, E398D, N399D, R406I), Tgo (Carril 2; V93Q, exo-), TgoT E10AMo (Carril 3; V93Q, Exo-, A485L, E398D, N399D, R406I) TgoT (Carril 4: V93Q, Exo-, A485L). Aunque Tgo y Tgo E10AMo son capaces de amplificar el fragmento de 410 pb, TgoT solo es capaz de hacerlo en presencia de mutaciones del motivo A de E10.

Figura 21: E10 es capaz de incorporar el 100% de FITC-12-dATP o el 100% de biotina-16-dUTP.

Electroforesis en gel de agarosa (1,2% p/v) de PCRs realizadas con E10 o Pfuexo-en presencia de 100% de FITC-12-dATP o biotina-16-dUTP. Marcador = ΦX174 HaeIII (HT Biotechnology Ltd).

Figura 22: Actividad de ELISA de variantes de Pfu seleccionadas con biotina-16-dUTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A de Pfu.

Lisados crudos de variantes de Pfu seleccionadas con biotina-16-dUTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A de Pfu y Pfu, fueron evaluados para estudiar su capacidad para incorporar 12 biotina-16-dUTPs consecutivas (cebador 60). Clones aislados a partir de la genoteca con repertorio de motivos A de Pfu son significativamente mejores que Pfu en la incorporación de biotina-16-dUTP, actividad para la que han sido seleccionados.

Figura 23: Alineación de aminoácidos de las variantes de Pfu seleccionas con biotina-16-dUTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A de Pfu.

Se realizaron ELISAs con las variantes de Pfu identificadas con el cebador 60, Bio187, Bio120, Bio94, Bio80, Bio56, Bio33 y Bio32 por tener una capacidad significativamente mayor para incorporar biotina-16-dUTP (véase la Figura 22). El análisis de la secuencia de estos clones con el cebador 36 sobre el motivo A diversificado durante la construcción de la genoteca, identificaba mutaciones en el motivo A, en comparación con la secuencia de aminoácidos de Pfu de tipo silvestre.

Figura 24: Hibridación fluorescente in situ con sondas generadas con E10 para NRG1, WRN o DCTN6 marcados con Cy3, Cy5 o FITC, respectivamente.

La hibridación fluorescente in situ de sondas para NRG1 (A), WRN (B) o DCTN6 (C) sobre extensiones metafásicas de la línea de células de cáncer pancreático humano Suit-2, detecta la localización conjunta de la señal de FITC, Cy3 y Cy5 en un único cromosoma (D; imagen fusionada) sin ser necesaria una amplificación secundaria de la señal.

Figura 25

Formación de imágenes con Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) de ADN y CyADN. (A) se formaron imágenes de fragmentos de ADN y CyADN adsorbidos a mica (ADN, Cy3-ADN, Cy5-ADN de izquierda a derecha) de longitud y secuencias idénticas utilizando AFM en modo de repiqueteo. (B) La AFM se utilizó para determinar la longitud de contorno promedio, la rigidez (longitud de persistencia) y la altura. Aunque el Cy-ADN mostraba valores similares a los del ADN convencional para la longitud de contorno y la rigidez, Cy3-ADN y en particular Cy5-ADN mostraban un aumento sustancial de la altura de contorno promedio, presumiblemente debido a la densa red de colorantes de cianina que rodean la hélice de ADN.

Figura 26: Resultados de FISH con fibras

A Detección directa de la señal de FITC o Cy5 sobre una fibra de ADN teñida con DAPI.

B Organización de sondas de ADN a lo largo del gen Neuregulinl. Se indica la distancia de las sondas 1, 4 y 6 desde las sondas 2, 3, 5 y 7. Las sondas 2, 3, 5 y 7 están separadas por 10 Kb.

C Sonda de información.

Figura 27: Análisis microfluídico

Una solución de 5 pg/μl de productos de la PCR con 270 meros, marcados cada uno con 50% de Cy3-dCTP y 100% de Cy5-dCTP, se bombeó a 30 μl/h en un capilar de sílice fundido, más allá de un sistema de detección sensible a la fluorescencia (véase texto). El rendimiento representativo muestra la fluorescencia (cuentas por segundo -eje vertical) a 670 nm (máximo Cy5 - traza azul) y 570 nm (máximo Cy3 - traza roja) registrada en periodos consecutivos de 20 μs (numerados a lo largo del eje horizontal) y promediados sobre una ventana deslizante de 40 de tales períodos. Nótese que la fluorescencia de Cy3 proporciona una señal menor de "interferencia" en el canal de Cy5.

Descripción detallada de la invención

(A) Principios que subyacen la tecnología de autorreplicación compartimentalizada

Las técnicas de evolución dirigida y autorreplicación compartimentalizada se detallan en el documento GB 97143002, GB 98063936 y GB 01275643, a nombre de los presentes inventores.

Los inventores modificaron los métodos de la autorreplicación compartimentalizada y generaron sorprendentemente polimerasas de ADN que mostraban una gama más amplia de sustratos, tal y como se define en esta memoria.

En particular, los inventores se dieron cuenta de que para la autorreplicación de la polimerasa Pfu, los compartimentos deben permanecer estables a las temperaturas elevadas de termociclado en la PCR. La encapsulación de PCRs se ha descrito anteriormente para vesículas lipídicas (Oberholzer, T., Albrizio, M. & Luisi, P.

L. (1995) Chem. Biol. 2, 677-82 y células y tejidos fijados (Haase, A. T., Retzel, E. F. y Staskus, K. A. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 87, 4971-5; Embleton, M. J., Gorochov, G., Jones, P. T. y Winter, G. (1992) Nucleic Acids), pero con eficacias bajas.

Detalles adicionales del método de autorreplicación compartimentalizada en general, se proporcionan a continuación. De particular importancia en la selección de las polimerasas que presentan una mayor capacidad para incorporar análogos de nucleótidos marcados con colorante, en comparación con la polimerasa a partir de la cual se obtienen, es que el método de autorreplicación compartimentalizada estaba modificado. Estas modificaciones se detallan en la sección (B) a continuación y también en el Ejemplo 3 en la presente memoria.

(i) Microcápsulas.

Las microcápsulas utilizadas para generar las polimerasas de ADN de la invención, requieren propiedades físicas apropiadas.

En primer lugar, para garantizar que los ácidos nucleicos y los productos génicos no puedan difundir entre las microcápsulas, el contenido de cada microcápsula debe estar aislado del contenido de las microcápsulas circundantes, de modo que no hay intercambio o poco intercambio de los ácidos nucleicos y los productos génicos entre la microcápsulas durante el periodo de tiempo del experimento.

En segundo lugar, el método requiere que solo haya un número limitado de ácidos nucleicos por microcápsula. Esto asegura que el producto génico de un ácido nucleico individual se aísle de los otros ácidos nucleicos. Por lo tanto, el acoplamiento entre el ácido nucleico y el producto génico será altamente específico. El factor enriquecimiento es el mayor con un promedio de uno o pocos ácidos nucleicos por microcápsula, siendo la conexión entre el ácido nucleico y la actividad del producto génico codificado lo más estrecha posible, ya que el producto génico de un ácido nucleico individual se aislará de los productos de todos los otros ácidos nucleicos. Sin embargo, incluso si la situación teóricamente óptima con un promedio de un solo ácido nucleico o menos por microcápsula, no se utiliza, una proporción de 5, 10, 50, 100 o 1000 o más ácidos nucleicos por microcápsula puede ser beneficiosa en la clasificación de una genoteca grande. Rondas posteriores de clasificación, incluyendo una nueva encapsulación con una distribución diferente de los ácidos nucleicos, permitirán una clasificación más estricta de los ácidos nucleicos. En una realización, hay un solo ácido nucleico o menos, por microcápsula.

En tercer lugar, la formación y la composición de las microcápsulas no debe suprimir la función de la maquinaria de la expresión de los ácidos nucleicos y la actividad de los productos génicos.

En consecuencia, cualquier sistema de microencapsulación utilizado debe cumplir estos tres requisitos. El(los) sistema(s) apropiado(s) puede variar dependiendo de la naturaleza precisa de los requisitos en cada aplicación de la invención, como será evidente para el experto en la técnica.

Está disponible una amplia variedad de procedimientos de microencapsulación (véase Benita, 1996) y se pueden utilizar para crear las microcápsulas empleadas para generar las polimerasas de ADN de la presente invención. De hecho, se han identificado en la bibliografía más de 200 métodos de microencapsulación (Finch, 1993).

Estos incluyen vesículas acuosas envueltas con una membrana, tales como las vesículas lipídicas (liposomas) (New, 1990) y vesículas tensioactivas no iónicas (van Hal et al., 1996). Éstas son cápsulas membranosas cerradas de bicapas individuales o múltiples de moléculas ensambladas de forma no covalente, estando cada bicapa separada de su bicapa colindante por un compartimento acuoso. En el caso de los liposomas, la membrana está compuesta

de moléculas lipídicas que normalmente son fosfolípidos, pero también se pueden incorporar en las membranas esteroles tales como el colesterol (New, 1990). Una variedad de reacciones bioquímicas catalizadas por enzimas, que incluyen la polimerización del ARN y ADN, se puede realizar dentro de los liposomas (Chakrabarti et al., 1994; Oberholzer et al., 1995a; Oberholzer et al., 1995b; Walde et al., 1994; Wick y Luisi, 1996).

Con un sistema de vesículas envueltas con una membrana, gran parte de la fase acuosa está fuera de las vesículas y por lo tanto no está compartimentalizada. Esta fase acuosa continua se tiene que eliminar o inhibir o destruir los sistemas biológicos dentro de ella (por ejemplo, mediante la digestión de ácidos nucleicos con ADNasa o ARNasa) con el fin de que las reacciones estén limitadas a las microcápsulas (Luisi et al., 1987).

Las reacciones bioquímicas catalizadas por enzimas también se han mostrado en microcápsulas generadas por una variedad de métodos distintos. Muchas enzimas son activas en soluciones micelares inversas (Bru & Walde, 1991; Bru & Walde, 1993; Creagh et al., 1993; Haber et al., 1993; Kumar et al., 1989; Luisi & B., 1987; Mao y Walde, 1991; Mao et al., 1992; Pérez et al., 1992; Walde et al., 1994; Walde et al., 1993; Walde et al., 1988), tales como el sistema AOT-isooctano-agua (Menger & Yamada, 1979).

Las microcápsulas también se pueden generar por polimerización interfacial y formación de complejos interfaciales (Whateley, 1996). Las microcápsulas de este tipo pueden tener membranas rígidas, no permeables, o membranas semipermeables. Las microcápsulas semipermeables que limitan con membranas de nitrato de celulosa, membranas de poliamida y membranas de lípido-poliamida, pueden sostener todas ellas reacciones bioquímicas, incluyendo sistemas multienzimáticos (Chang, 1987; Chang, 1992; Lim, 1984). Las microcápsulas de alginato/polilisina (Lim & Sun, 1980), que pueden formarse en condiciones muy suaves, también han demostrado ser muy biocompatibles, proporcionando, por ejemplo, un método eficaz de encapsulación de células y tejidos vivos (Chang, 1992; Sun et al., 1992).

Los sistemas de microencapsulación no membranosos, basados en el reparto en fases de un entorno acuoso en un sistema coloidal, tal como una emulsión, también se pueden usar.

En una realización, las microcápsulas se forman a partir de emulsiones; sistemas heterogéneos de dos fases líquidas inmiscibles con una de las fases dispersa en la otra como gotitas de tamaño microscópico o coloidal (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).

(ii) Emulsiones.

Las emulsiones pueden producirse a partir de cualquier combinación adecuada de líquidos inmiscibles. La emulsión puede tener agua (que contiene los componentes bioquímicos) como la fase presente en forma de gotitas finamente divididas (la fase dispersa, interna o discontinua) y un líquido hidrófobo, inmiscible (un "aceite") como la matriz en la que estas gotitas están suspendidas (la fase no dispersa, continua o externa). Tales emulsiones se denominan de “agua-en-aceite” (A/A). Esta tiene la ventaja de que toda la fase acuosa que contiene los componentes bioquímicos está compartimentalizada en gotitas discretas (la fase interna). La fase externa, que es un aceite hidrófobo, generalmente no contiene ninguno de los componentes bioquímicos y, por tanto, es inerte.

La emulsión puede estabilizarse mediante la adición de uno o varios agentes tensioactivos (surfactantes). Estos tensioactivos se denominan agentes emulsionantes y actúan en la interfase de agua/aceite para evitar (o al menos retrasar) la separación de las fases. Muchos aceites y emulsionantes se pueden usar para la generación de emulsiones de agua en aceite; una compilación reciente enumeraba más de 16.000 tensioactivos, muchos de los cuales se utilizan como agentes emulsionantes (Ash y Ash, 1993). Los aceites adecuados incluyen tensioactivos de aceites minerales blancos ligeros y no iónicos (Schick, 1966), tales como monooleato de sorbitán (Span® 80; ICI) y poli(monooleato de oxietilensorbitano) (Tween® 80; ICI) y Triton-X-100.

El uso de tensioactivos aniónicos también puede ser beneficioso. Los tensioactivos adecuados incluyen colato de sodio y taurocolato de sodio. Se prefiere particularmente el desoxicolato de sodio, adecuadamente a una concentración de 0,5% p/v o inferior. La inclusión de tales tensioactivos puede aumentar en algunos casos la expresión de los ácidos nucleicos y/o la actividad de los productos génicos. La adición de algunos tensioactivos aniónicos a una mezcla de reacción no emulsionada, suprime completamente la traducción. Sin embargo, durante la emulsificación, el tensioactivo se transfiere desde la fase acuosa a la interfase y la actividad se restaura. La adición de un tensioactivo aniónico a las mezclas que se van a emulsionar asegura que las reacciones se realicen únicamente después de la compartimentalización.

La creación de una emulsión generalmente requiere la aplicación de energía mecánica para forzar la unión de las fases. Existe una variedad de maneras de hacerlo, las cuales utilizan una variedad de dispositivos mecánicos, incluyendo agitadores (tales como barras de agitación magnéticas, agitadores de hélice y turbina, dispositivos de paletas y batidores), homogeneizadores (incluyendo los homogeneizadores de rotor-estator, homogeneizadores de válvula de alta presión y homogeneizadores de chorro), molinos coloidales, ultrasonidos y dispositivos de “emulsificación de membrana” (Becher, 1957; Dickinson, 1994).

Las microcápsulas acuosas formadas en emulsiones de agua en aceite son generalmente estables con poco o ningún intercambio de ácidos nucleicos o productos génicos entre las microcápsulas. Adicionalmente, hemos

demostrado que varias reacciones bioquímicas se realizan en las microcápsulas de emulsión. Además, procesos bioquímicos complicados, principalmente la transcripción y la traducción génica también están activos en las microcápsulas de emulsión. Existe la tecnología para crear emulsiones con volúmenes de todo tipo hasta escalas industriales de miles de litros (Becher, 1957; Sherman, 1968; Lissant, 1974; Lissant, 1984).

El tamaño preferido de la microcápsula variará dependiendo de los requisitos precisos de cualquier proceso de selección individual que se va a realizar. En todos los casos, habrá un equilibrio óptimo entre el tamaño de la genoteca, el enriquecimiento requerido y la concentración requerida de componentes en las microcápsulas individuales para lograr una expresión y una reactividad eficaces de los productos génicos.

Los detalles de emulsión/es usadas cuando se realiza el método, se proporcionan en los Ejemplos.

(iii) Expresión dentro de microcápsulas.

Los procesos de expresión generalmente se producen dentro de cada microcápsula individual. Tanto la transcripción in vitro como la transcripción-traducción acopladas, son menos eficaces con concentraciones subnanomolares de ADN. Debido a la necesidad de que solo esté presente un número limitado de moléculas de ADN en cada microcápsula, esto fija por tanto un límite superior práctico del posible tamaño de la microcápsula. El volumen medio de las microcápsulas puede ser menor que 5,2 x 10-16 m3, (que se corresponde a una microcápsula esférica con un

10-173

diámetro inferior a 10 μm, más adecuadamente menos de 6,5 x m (5 μm), más adecuadamente aproximadamente 4,2 x 10-18 m3 (2 μm) e idealmente aproximadamente 9 x 10-18 m3 (2,6 μm).

La concentración eficaz de ADN o ARN en las microcápsulas se puede incrementar artificialmente por diversos métodos que serán bien conocidos por los versados en la técnica. Estos incluyen, por ejemplo, la adición de productos químicos que excluyen volumen, tales como polietilenglicoles (PEG) y una variedad de técnicas de amplificación génica, que incluyen la transcripción usando polimerasas de ARN que incluyen las que proceden de bacterias tales como E. coli (Roberts, 1969; Blattner y Dahlberg, 1972; Roberts et al., 1975; Rosenberg et al., 1975), eucariotas, por ejemplo, (Weil et al., 1979; Manley et al., 1983) y bacteriófagos tales como T7, T3 y SP6 (Melton et al., 1984); la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Saiki et al., 1988); la amplificación con la replicasa Qβ (Miele et al., 1983; Cahill et al., 1991; Chetverin y Spirin, 1995; Katanaev et al., 1995); la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Landegren et al., 1988; Barany, 1991); y el sistema de replicación autosostenida de secuencias (Fahy et al., 1991) y la amplificación por desplazamiento de cadena (Walker et al., 1992). Incluso las técnicas de amplificación génica que requieren un ciclado térmico, tal como PCR y LCR pueden utilizarse si las emulsiones y la transcripción in vitro o los sistemas acoplados de traducción-transcripción son termoestables (por ejemplo, los sistemas acoplados de traducción-transcripción se podrían preparar a partir de un organismo termoestable tal como Thermus aquaticus).

El aumento de la concentración local eficaz de ácido nucleico permite microcápsulas más grandes para utilizar con eficacia. Esto permite un límite superior práctico preferido para el volumen de la microcápsula de aproximadamente 5,2 x 10-16 m3 (correspondiente a una esfera de 10 μm de diámetro).

El tamaño de la microcápsula debe ser suficientemente grande para acomodar todos los componentes requeridos para las reacciones bioquímicas, que son necesarios para que tengan lugar dentro de la microcápsula. Por ejemplo, in vitro, tanto las reacciones de transcripción como las reacciones acopladas de transcripción-traducción requieren una concentración total de nucleósido trifosfato de aproximadamente 2 mM.

Por ejemplo, para transcribir un gen en una molécula de ARN corta aislada de 500 bases de longitud, esto requeriría un mínimo de 500 moléculas de nucleósido trifosfato por microcápsula (8,33 x 10-22 moles). Para constituir una solución 2 mM, este número de moléculas debe estar contenido dentro de una microcápsula de volumen 4,17 x 10-19 litros (4,17 x 10-22 m3) que si fuera esférica tendría un diámetro de 93 nm.

Además, particularmente en el caso de reacciones que implican traducción, es de señalar que los ribosomas necesarios para que se produzca la traducción, ellos mismos tienen un diámetro de aproximadamente 20 nm. Por lo tanto, el límite inferior preferido para las microcápsulas es un diámetro de aproximadamente 100 nm.

Por lo tanto, el volumen de la microcápsula es adecuadamente del orden de entre 5,2 x 10-22 m3 y 52 x 10-16 m3 que se corresponde a una esfera de diámetro entre 0,1 μm y 10 μm, más adecuadamente entre aproximadamente 5,2 x

10-19

m3 y 6,5 x 10-17 m3 (1 μm y 5 μm). Diámetros de esferas de aproximadamente 2,6 μm son más ventajosos.

No es casualidad que las dimensiones preferidas de los compartimentos (gotitas de diámetro medio 2,6 μm) se parezcan mucho a las de las bacterias, por ejemplo, Escherichia tiene bacilos de 1,1-1,5 x 2,0-6,0 μm y Azotobacter tiene células ovoides de 1,5-2,0 μm de diámetro. En su forma más simple, la evolución darwiniana se basa en un mecanismo de "un genotipo un fenotipo". La concentración de un único gen compartimentalizado, o genoma, disminuye desde 0,4 nM en un compartimento de 2 μm de diámetro, a 25 pM en un compartimento de 5 μm de diámetro. La maquinaria de traducción/transcripción procariótica ha evolucionado para funcionar en compartimentos de ~1-2 μm de diámetro, en donde los genes individuales se encuentran en concentraciones aproximadamente nanomolares. Un solo gen, en un compartimento de 2,6 μm de diámetro tiene una concentración de 0,2 nM. Esta concentración génica es suficientemente alta para que haya una traducción eficaz. La compartimentalización en un

volumen tal también garantiza que, incluso si solo se forma una única molécula del producto génico, esté presente a aproximadamente 0,2 nM, lo que es importante si el producto génico va a tener una actividad modificadora del propio ácido nucleico. El volumen de la microcápsula se tiene que seleccionar por tanto, teniendo en cuenta no solo los requisitos de la transcripción y la traducción del ácido nucleico/ácido nucleico, sino también la actividad modificadora requerida del producto génico. El tamaño de las microcápsulas de la emulsión puede variar simplemente adaptando las condiciones de la emulsión usadas para formar la emulsión, a los requisitos del sistema de selección. Cuanto mayor sea el tamaño de la microcápsula, mayor será el volumen que se requerirá para encapsular un ácido nucleico/genoteca de ácido nucleico dados, ya que el factor limitante será en última instancia el tamaño de la microcápsula y de este modo el número de microcápsulas posibles por unidad de volumen.

El tamaño de las microcápsulas se selecciona no solo teniendo en cuenta los requisitos del sistema de transcripción/traducción, sino también los del sistema de selección empleado para el ácido nucleico/ estructura artificial de ácido nucleico. Por lo tanto, los componentes del sistema de selección, tales como un sistema de modificación química, pueden requerir volúmenes de reacción y/o concentraciones de reactivo que no son óptimas para la transcripción/traducción. Tal y como se establece en la presente memoria, dichos requisitos pueden acomodarse mediante una etapa secundaria de reencapsulación y, además, se pueden acomodar seleccionando el tamaño de la microcápsula con el fin de maximizar la transcripción/traducción y la selección como un todo. Se prefiere la determinación empírica del volumen óptimo de la microcápsula y de la concentración de reactivo, por ejemplo, tal y como se expone en la presente memoria.

Un "ácido nucleico" de acuerdo con la presente invención es, típicamente, una molécula o una estructura artificial seleccionada entre el grupo que consiste en una molécula de ADN, una molécula de ARN, una molécula de ácido nucleico parcial o totalmente artificial que consiste exclusivamente en bases sintéticas o una mezcla de bases naturales y bases sintéticas, una cualquiera de las anteriores ligada a un polipéptido.

La porción de ácido nucleico del ácido nucleico puede comprender secuencias reguladoras adecuadas, tales como las requeridas para una expresión eficaz del producto génico, por ejemplo, promotores, potenciadores, secuencias de iniciación de la traducción, secuencias de poliadenilación, sitios de corte y empalme y similares.

(iv) Selección del producto.

Los detalles de un método preferido para generar polimerasas de ADN de la invención, se proporcionan en los Ejemplos. Sin embargo, los expertos en la técnica apreciarán que los ejemplos dados no son limitantes y los métodos para la selección de productos se describen en términos más generales a continuación.

Un ligando o un sustrato puede conectarse al ácido nucleico mediante una variedad de medios que serán evidentes para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Hermanson, 1996). De acuerdo con el método de la presente invención, el ligando o el sustrato es un “marcador con agente de detección” - tal como un análogo de nucleótido marcado con colorante, en particular Cy3CTP y/o Cy5CTP.

La clasificación se puede realizar por cualquier método que permita la separación preferente, la amplificación o la supervivencia del ácido nucleico marcado con el agente de detección. Ejemplos incluyen la selección mediante la unión (incluyendo técnicas basadas en la separación magnética, por ejemplo, usando Dynabeads®), y por la resistencia a la degradación (por ejemplo, mediante nucleasas, incluyendo las endonucleasas de restricción).

Cuando todas las reacciones se detienen y las microcápsulas se combinan, los ácidos nucleicos que codifican las polimerasas activas modificadas genéticamente, seleccionadas, se pueden enriquecer utilizando un anticuerpo u otra molécula que se une, o reacciona específicamente con, el "marcador con agente de detección". Aunque ambos sustratos y productos tienen el marcador con agente de detección, solo los ácidos nucleicos que codifican el producto génico activo se copurificarán.

Los términos "aislamiento", "clasificación" y "selección", así como variaciones de los mismos, se utilizan en la presente memoria. El aislamiento, según la presente invención, se refiere al procedimiento de separar una entidad a partir de una población heterogénea, por ejemplo, una mezcla, de tal manera que esté exenta de forma sustancial, adecuadamente de forma total, de al menos una sustancia con la que estaba asociada antes del proceso de aislamiento. En una realización, el aislamiento se refiere a la purificación de una entidad, esencialmente hasta la homogeneidad. La clasificación de una entidad se refiere al proceso de aislar preferentemente entidades deseadas frente a entidades no deseadas. En la medida en que se refiera al aislamiento de las entidades deseadas, los términos "aislamiento" y "clasificación" son equivalentes. El método de la presente invención permite la clasificación de ácidos nucleicos deseados a partir de agrupaciones (genotecas o repertorios) de ácidos nucleicos que contienen el ácido nucleico deseado. La selección se usa para referirse al proceso (incluyendo el proceso de clasificación) de aislar una entidad según una propiedad particular de la misma.

La selección inicial de un ácido nucleico a partir de una genoteca de ácidos nucleicos (por ejemplo, una genoteca de Pfu mutante) utilizando la presente invención, requerirá en la mayoría de los casos el escrutinio de un gran número de variantes de ácidos nucleicos. Las genotecas de ácidos nucleicos se pueden crear según una variedad de maneras diferentes, incluyendo las siguientes.

Agrupaciones de ácidos nucleicos presentes en la naturaleza se pueden clonar a partir de ADN genómico o ADNc (Sambrook et al., 1989.); por ejemplo, genotecas de Pfu mutante u otras genotecas de polimerasa de ADN, preparadas mediante repertorios amplificados con PCR, de genes de Pfu o de otras polimerasas de ADN, han demostrado ser fuentes muy eficaces de fragmentos de polimerasa de ADN. En los ejemplos se proporcionan más detalles.

Las genotecas también se pueden preparar mediante la codificación de todos (véase, por ejemplo, Smith, 1985; Parmley y Smith, 1988) o parte de los genes (véase, por ejemplo, Lowman et al., 1991) o agrupaciones de genes (véase, por ejemplo, Nissim et al., 1994) mediante un oligonucleótido sintético aleatorio o no equimolar. Las genotecas también se pueden preparar introduciendo mutaciones en un ácido nucleico o en una agrupación de ácidos nucleicos "al azar", mediante una variedad de técnicas in vivo, que incluyen; emplear 'cepas mutadoras', de bacterias tales como E. coli mutD5 (Liao et al., 1986; Yamagishi et al., 1990; Low et al., 1996). Las mutaciones al azar, también pueden introducirse tanto in vivo como in vitro mediante mutágenos químicos y radiación ionizante o UV (véase Friedberg et al., 1995.), o incorporando análogos de bases mutagénicos (Freese, 1959; Zaccolo et al., 1996). Las mutaciones "aleatorias" también pueden introducirse en genes in vitro durante la polimerización, por ejemplo, mediante el uso de polimerasas propensas a errores (Leung et al., 1989). En una realización preferida del método de la invención, el repertorio de fragmentos nucleicos utilizado es un repertorio mutante de Taq que se ha mutado utilizando PCR propensa a error. Los detalles se proporcionan en el Ejemplo 1. De acuerdo con el método de la invención, el término "aleatoria" puede ser en términos de posiciones aleatorias con repertorio aleatorio de aminoácidos en esas posiciones o pueden ser posiciones seleccionadas (predeterminadas) con un repertorio aleatorio de aminoácidos en esas posiciones seleccionadas.

Se pueden introducir otras diversificaciones mediante el uso de la recombinación homóloga ya sea in vivo (véase Kowalczykowski et al., 1994) o in vitro (Stemmer, 1994a; Stemmer, 1994b).

(v) Microcápsulas/Clasificación.

Además de los ácidos nucleicos descritos anteriormente, las microcápsulas de acuerdo con la invención comprenderán componentes adicionales requeridos para que tenga lugar el proceso de clasificación. Otros componentes del sistema comprenderán, por ejemplo, los necesarios para la transcripción y/o traducción del ácido nucleico. Estos se seleccionan según los requisitos de un sistema específico, entre los siguientes; un tampón adecuado, un sistema de transcripción/replicación in vitro y/o un sistema de traducción in vitro que contiene todos los ingredientes necesarios, enzimas y cofactores, polimerasa de ARN, nucleótidos, ácidos nucleicos (naturales o sintéticos), ARNs de transferencia, ribosomas y aminoácidos, y los sustratos de la reacción de interés con el fin de permitir la selección del producto génico modificado.

Un tampón adecuado será uno en el que todos los componentes deseados del sistema biológico están activos y dependerá por tanto de los requisitos de cada sistema de reacción específico. Los tampones adecuados para reacciones biológicas y/o químicas son conocidos en la técnica y los protocolos se proporcionan en diferentes textos de laboratorio, tales como Sambrook et al., 1989.

El sistema de traducción in vitro comprenderá normalmente un extracto celular, típicamente procedente de bacterias (Zubay, 1973; Zubay, 1980; Lesley et al., 1991; Lesley, 1995), reticulocitos de conejo (Pelham y Jackson, 1976), o germen de trigo (Anderson et al., 1983). Muchos sistemas adecuados están disponibles comercialmente (por ejemplo, en Promega) incluyendo algunos que permitirán una transcripción/traducción acoplada (todos los sistemas bacterianos y el reticulocito y los sistemas de extractos de germen de trigo TNT® de Promega). La mezcla de aminoácidos utilizada puede incluir aminoácidos sintéticos si se desea, para aumentar el posible número o la variedad de proteínas producidas en la genoteca. Esto se puede lograr cargando los ARNt con aminoácidos artificiales y utilizando estos ARNt para la traducción in vitro de las proteínas que se van a seleccionar (Ellman et al., 1991; Benner, 1994; Mendel et al., 1995).

Después de cada ronda de selección, el enriquecimiento de la agrupación de ácidos nucleicos de cara a los que codifican las moléculas de interés, se puede someter a ensayo mediante reacciones de transcripción/replicación in vitro, no compartimentalizadas o reacciones acopladas de transcripción-traducción. La agrupación seleccionada se clona en un vector plasmídico adecuado y el ARN o la proteína recombinante se produce a partir de los clones individuales para una purificación y ensayo adicionales.

(vi) Identificación de microcápsulas.

Las microcápsulas se pueden identificar en virtud de un cambio inducido por el producto génico deseado que se produce o se manifiesta el mismo en la superficie de la microcápsula, o es detectable desde el exterior, tal y como se describe en la sección iii (Clasificación de microcápsulas). Este cambio, cuando se identifica, se utiliza para desencadenar la modificación del gen dentro del compartimento. La identificación de microcápsulas se puede basar en un cambio de las propiedades ópticas de la microcápsula, dando como resultado una reacción que conduce a luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia dentro de la microcápsula. La modificación del gen dentro de las microcápsulas estaría desencadenada por la identificación de la luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia. Por ejemplo, la identificación de la luminiscencia, fosforescencia o fluorescencia puede desencadenar el bombardeo del

compartimento con fotones (u otras partículas u ondas) lo que conduce a la modificación del ácido nucleico. Un procedimiento similar ha sido descrito previamente para la clasificación rápida de células (Keij et al., 1994). La modificación del ácido nucleico puede ser el resultado, por ejemplo, de acoplar un "marcador con agente de detección fluorescente" molecular, confinado por un grupo protector fotolábil, a los ácidos nucleicos: el bombardeo con fotones de una longitud de onda apropiada conduce a la eliminación del confinamiento. Después, todas las microcápsulas se combinan y los ácidos nucleicos se agrupan juntos en un entorno. Los ácidos nucleicos que codifican productos génicos que muestran la actividad deseada, se pueden seleccionar mediante purificación por afinidad, utilizando una molécula que se une específicamente o reacciona específicamente con el "marcador fluorescente".

(vii) Procedimiento de etapas múltiples.

También se apreciará que no es necesario que todos los procesos de transcripción/replicación y/o traducción, y selección procedan en una sola etapa, teniendo lugar todas las reacciones en una microcápsula. El procedimiento de selección puede comprender dos o más etapas. En primer lugar, la transcripción/replicación y/o traducción de cada ácido nucleico de una genoteca de ácido nucleico, puede tener lugar en una primera microcápsula. Cada producto génico se une a continuación al ácido nucleico que lo codifica (que reside en la misma microcápsula). Las microcápsulas se destruyen a continuación, y los ácidos nucleicos fijados a sus productos génicos respectivos, se purifican opcionalmente. Alternativamente, los ácidos nucleicos se pueden fijar a sus respectivos productos genéticos utilizando métodos que no dependen de la encapsulación. Por ejemplo, la presentación en fagos (Smith, G.P., 1985), presentación en polisomas (Mattheakkis et al., 1994), fusión de ARN-péptido (Roberts y Szostak, 1997)

o fusión de péptido represor lac (Cull, et al., 1992).

En la segunda etapa del procedimiento, cada ácido nucleico purificado fijado a su producto génico se coloca en una segunda microcápsula que contiene componentes de la reacción que se va a seleccionar. A continuación se inicia esta reacción. Después de completar las reacciones, las microcápsulas se rompen de nuevo y se seleccionan los ácidos nucleicos modificados. En el caso de reacciones complicadas con múltiples etapas en las que están implicados muchos componentes individuales y etapas de reacción, una o varias de las etapas intermedias pueden llevarse a cabo entre la etapa inicial de creación y la unión del producto génico al ácido nucleico, y la etapa final de generación del cambio seleccionable en el ácido nucleico.

(viii) Amplificación.

En todas las configuraciones anteriores, el material genético comprendido en los ácidos nucleicos se puede amplificar y el procedimiento se repite en etapas iterativas. La amplificación puede ser mediante la reacción en cadena de la polimerasa (Saiki et al., 1988) o empleando una entre una variedad de técnicas diferentes de amplificación de genes que incluyen: amplificación con la replicasa Qβ (Cahill, Foster y Mahan, 1991; Chetverin y Spirin, 1995; Katanaev, Kuraasov y Spirin, 1995); la reacción en cadena de la ligasa (LCR) (Landegren et al., 1988; Barany, 1991); el sistema de replicación autosostenida de la secuencia (Fahy, Kwoh y Gingeras, 1991) y la amplificación por desplazamiento de cadena (Walker et al., 1992).

B) Modificaciones en el procedimiento convencional de CSR.

Las modificaciones del protocolo de CSR descrito previamente son necesarias para permitir la selección de variantes de Pfu y especialmente variantes de Pfu capaces de incorporar análogos de nucleótidos marcados con colorante. Las condiciones de la CSR descrita previamente (Ghadessy et al., 2001), cuando se realiza en tampón de Pfu 1x (KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-Cl 20 mM pH 8,75, de MgSO4 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 μg/ml de BSA; Stratagene Ltd), no enriqueció una variante activa de Pfu (pASKpfuexo-2; véase el ejemplo 1) sobre una variante inactiva (pASKpfuexo-7; véase el ejemplo 1) cuando estaba presente en una proporción de 1:100. La fase acuosa de la emulsión tuvo que ser modificada para incluir cebadores (1 μM), dNTPs (0,1 mM cada uno), ARNasa (10 μg/mL), glicerol (10% v/v), formamida (1% v/v), DTT (1 mM) en tampón de Pfu 1x. Las células que expresaban la variante activa de Pfu (pASKpfuexo-2) se mezclaron en una proporción de 1:100 con la variante inactiva pASKpfuexo-7 y se sometieron a CSR en solución o en emulsión, bajo las condiciones modificadas descritas. En solución no se observó un enriquecimiento significativo de la variante activa, mientras que en emulsión, la variante activa se enriqueció (Figura 1).

(B) Polimerasas de ADN modificadas genéticamente de acuerdo con la invención.

General.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona una polimerasa de ADN modificada genéticamente con una gama más amplia de sustratos, en donde la polimerasa es capaz de incorporar una mayor presencia de un análogo de nucleótido marcado con colorante, en el ácido nucleico sintetizado por esa polimerasa modificada genéticamente, en comparación con la polimerasa de tipo silvestre, a partir de la cual se ha obtenido, en donde la polimerasa se describe por cualquier secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las siguientes: SEQ ID NOs 1, 4, 8, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48, y que comprende las siguientes mutaciones por sustitución en comparación con la secuencia de aminoácidos de Pfu de tipo silvestre: N400G/N400D y R4071.

Tal y como se define en esta memoria, la expresión “gama más amplia de sustratos” (de una polimerasa de ADN modificada genéticamente) se refiere a la capacidad de una polimerasa modificada genéticamente de acuerdo con la presente invención, para incorporar una mayor presencia de un análogo de nucleótido marcado con un agente de detección, en el ácido nucleico sintetizado por esa polimerasa modificada genéticamente, en comparación con la polimerasa de tipo silvestre de la cual se obtiene.

En una realización adicional, una polimerasa modificada genéticamente de acuerdo con la invención puede incorporar 10% de nucleótidos marcados con un agente de detección, expresados como un porcentaje del total de nucleótidos en el ácido nucleico recién sintetizado - tal como ADN. En aún una realización preferida, una polimerasa modificada genéticamente de acuerdo con la invención puede incorporar 20, 30, 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95% de nucleótidos marcados con agente de detección, expresado como un porcentaje del total de nucleótidos en el ácido nucleico recién sintetizado -tal como ADN. En otra realización, la polimerasa modificada genéticamente incorpora 100% de nucleótidos marcados con agente de detección, expresados como un porcentaje del total de nucleótidos en el ácido nucleico recién sintetizado - tal como ADN.

Los análogos de nucleótidos marcados con el agente de detección son análogos marcados con colorante. Los marcadores de colorante pueden fijarse a cualquiera de los siguientes nucleótidos dATP, dCTP, dGTP y dTTP. Ventajosamente, el marcador de colorante es un marcador fluorescente.

Más ventajosamente, el marcador fluorescente es carbocianina (Cy). Los detalles de este nucleótido marcado con fluorescencia se proporcionan en el documento de EE.UU. 6.974.873. Más ventajosamente, el agente fluorescente es Cy1 (Cy3) o Cy5 (Cy5) y el nucleótido es dCTP. Otros nucleótidos marcados con fluorescencia adecuados serán conocidos por los expertos en la técnica e incluyen aquellos que están marcados con colorantes de Alexa Fluor® (Invitrogen, Reino Unido), dietilaminocumarina, tetrametilrodamina, N-metilantraniloilo (MANT), trinitrofenilo, derivados de eteno, biotina o fluoresceína.

(Ci) Mutantes de Pfu seleccionados a partir de la genoteca del motivo A con Cy5-dCTP.

Las selecciones de Cy5-dCTP (véase el ejemplo 5) procedentes de la genoteca con repertorio de Pfu diversificado en el motivo A (véase el ejemplo 4), dan como resultado la selección de 4 variantes de Pfu 23, AH12, 55 y 15, que presentan una capacidad significativamente mayor para incorporar dCTP marcado con Cy5 frente a la enzima de tipo silvestre, tal y como se determina en un ensayo de extensión con ELISA (véase ejemplo 7) con los cebadores 33, 34 y 35 (Figura 2; ELISA). Los clones se secuenciaron con los cebadores 36, 37, 39, 44, 45 y 46 y las mutaciones se identificaron en las regiones diversificadas (Figura 3; Secuencia). Variante 23 de Pfu: N400D, I401L, R407I; variante AH12 de Pfu: E399D, N400G, I401L, V402A, R407I; variante 55 de Pfu: N400G, R407I; variante 15 de Pfu: E399D, N400G, R407I y V337I.

(Cii) Variantes de Pfu seleccionadas a partir de la genoteca de motivos A y B con Cy5-dCTP.

Las variantes de Pfu capaces de incorporar significativamente Cy5-dCTP, en comparación con la capacidad de la enzima de tipo silvestre, se seleccionan a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-B de Pfu (véase el ejemplo 4) con cebadores que se aparean en 5' del motivo A y 3' del motivo B (véase el ejemplo 5). Los clones que muestran una capacidad significativamente mayor para incorporar Cy5-dCTP se clasifican mediante un ensayo de extensión de ELISA con el cebador 35 (véase el ejemplo 7; Figura 4). Los clones se secuenciaron con el cebador 36 y las mutaciones se identificaron en las regiones diversificadas (Figura 5; Secuencia). La genoteca con repertorio de motivos A-B debe estar contaminada con alguna secuencia de Pfu de tipo silvestre, ya que no todos los clones seleccionados contienen diversidad en el motivo A, aunque todos los clones seleccionados contienen diversidad en el motivo B.

(Ciii) Variantes de Pfu seleccionadas a partir de la genoteca con motivos A y C con Cy5-dCTP

Las variantes de Pfu capaces de incorporar significativamente Cy5-dCTP, en comparación con la capacidad de la enzima de tipo silvestre, se seleccionan a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-C de Pfu (véase el ejemplo 4) con cebadores que se aparean en 5' con el motivo A y en 3' con el motivo C (véase el ejemplo 5). Los clones que muestran una capacidad significativamente mayor para incorporar Cy5-dCTP, se clasifican mediante un ensayo de extensión de ELISA con el cebador 35 (véase el ejemplo 7; Figura 6). Los clones se secuencian con el cebador 36 y se identifican mutaciones en las regiones diversificadas (Figura 7; Secuencia). Las selecciones con Cy5-dCTP procedentes de la genoteca de motivos A-C seleccionada para los clones 15, 55, y 23 variantes de Pfu en el motivo A y en combinación con el residuo del motivo C Y546, mutado en H o L en 20 de 20 clones secuenciados.

(Civ) Variante de Pfu capaz de incorporar Cy5dCTP o Cy3dCTP.

Un clon, E10, mostraba una capacidad significativamente mayor para incorporar Cy3-dCTP o Cy5-dCTP (Figura 8; secuencia E10). E10 tiene 14 mutaciones puntuales (además de las introducidas durante la construcción del vector (véase el ejemplo 1) de las cuales 9 son silenciosas. El resto introduce mutaciones en una o varias de las siguientes posiciones: 337, 399, 400, 407 y/o 546, en comparación con la secuencia de tipo silvestre, tal y como se establece en SEQ ID NO 134. Adecuadamente, las mutaciones son mutaciones por sustitución en una o varias de las siguientes posiciones: 337, 399, 400, 407 y/o 546, en comparación con la secuencia de tipo silvestre tal y como se

establece en SEQ ID NO 134. Más adecuadamente, las mutaciones son V337I, E399D, N400D, R407I y/o Y546H en comparación con la secuencia de tipo silvestre tal y como se establece en SEQ ID NO 134.

(D) Usos de las polimerasas de ADN de acuerdo con la invención.

Los presentes inventores han mostrado que el uso de la autorreplicación compartimentalizada de tramos cortos se puede utilizar para seleccionar una cantidad de variantes de polimerasas Pfu (polimerasas de ADN modificadas genéticamente) con una especificidad de sustrato relajada con respecto a la incorporación de análogos de nucleótidos marcados con colorante.

Las propiedades inusuales de las polimerasas de ADN según la presente invención, en particular E10 tal y como se describe en esta memoria, pueden tener usos inmediatos, por ejemplo, para la mejor incorporación de nucleótidos modificados con colorante en la secuenciación y marcación de una matriz y/o la amplificación de dianas de ADN ultra-largas. Pueden resultar útiles en la amplificación de moldes de ADN dañado en medicina forense o paleobiología, pueden permitir una expansión del repertorio químico de aptámeros o desoxirribozimas (Benner, Barbas, Ribozyme review).

Además, las polimerasas de ADN según la invención, en particular la polimerasa E10 tal y como se describe en esta memoria puede servir como un marco útil para la mutagénesis y la evolución hacia polimerasas capaces de utilizar una matriz cada vez más amplia de sustratos de nucleótidos modificados.

(E) Microscopía de Fuerza Atómica.

Ventajosamente, la estructura del CyADN puede determinarse empleando microscopía de fuerza atómica (AFM). Sin embargo, ha resultado difícil preparar muestras de CyADN para el análisis con AFM. Sin embargo, era posible analizar muestras sobre fragmentos de mica que se habían funcionalizado con poli-L-lisina. En consecuencia, la AFM se puede utilizar para analizar el CyADN (por ejemplo, para determinar las características estructurales) descrito en este documento.

Empleando AFM se confirmó que el CyADN existe como ADN bicatenario en forma B.

Se determinaron las longitudes y las alturas de 40 moléculas de ADN no modificadas, 40 moléculas modificadas con Cy3-dCTP (en donde el 100% de la dCTP estaba reemplazada por Cy3) y 71 moléculas de Cy5-dCTP (en donde el 100% de la dCTP estaba reemplazada por Cy5). Hay una pequeña diferencia en la longitud de la molécula entre las moléculas de ADN no modificadas y las modificadas con Cy3-dCTP (104,0 nm ± 0,3 frente a 97,5nm ± 0,25). La altura (ancho) de las moléculas de ADN marcadas con Cy3-dCTP y Cy5-dCTP es sustancialmente mayor que la de las moléculas de ADN no modificadas (véase la Figura 19). Las moléculas de ADN marcadas con Cy5-dCTP son aún más anchas (0,78 nm ± 0,008) que las moléculas de ADN marcadas con Cy3-dCTP (0,620 nm ± 0,008), en consonancia con que Cy5 es un fluoróforo más grande que Cy3.

Los fragmentos de ADN modificados con Cy5-dCTP y los no modificados tienen una persistencia similar de la longitud.

(F)

FISH y FISH con fibras.

Una densidad elevada de marcador no se traducirá necesariamente en un aumento de la fluorescencia debido a los efectos de la reabsorción y la reemisión, y la extinción. Experimentos en micromatrices modelo identificaban que los fragmentos de PCR marcados en PCRs en donde el 50% de la dCTP se había reemplazado por Cy3-dCTP o Cy5dCTP, daban como resultado una señal fluorescente más fuerte que los fragmentos marcados con 100% de sustitución. Por consiguiente, las sondas utilizadas en FISH y FISH con fibras se generaron en PCRs en las que se reemplazó el 50% del nucleótido no marcado por su equivalente fluorescente. Pfu exo- es capaz de incorporar FITC-12-dATP cuando está presente al 100% en las PCRs. E10 conserva esta capacidad. Se realizaron 3 FISH con color con sondas marcadas con Cy3, Cy5 o FITC sobre extensiones metafásicas. Se realizaron 2 FISH con fibras y color con sondas marcadas con Cy5 o FITC.

(G)

Identidad de la secuencia u homología de la secuencia.

La presente invención abarca el uso de secuencias que tienen un grado de identidad de secuencia o de homología de secuencia con una(s) secuencia(s) de aminoácidos de un polipéptido que tiene las propiedades específicas, definidas en la presente memoria, o de cualquier secuencia de nucleótidos que codifica tal polipéptido (en lo sucesivo referida como "secuencia(s) homóloga(s)"). En esta memoria, el término "homólogo" significa una entidad que tiene una cierta homología con las secuencias de aminoácidos objeto y las secuencias de nucleótidos objeto. En esta memoria, el término "homología" puede equipararse a "identidad".

La secuencia de aminoácidos y/o la secuencia de nucleótidos homólogas deberían proporcionar y/o codificar un polipéptido que conserva la actividad funcional y/o mejora la actividad de la polimerasa.

En el presente contexto, una secuencia homóloga se considera que incluye una secuencia de aminoácidos que puede ser al menos 70, 75, 80, 85, 90, 95 o 99% idéntica, preferiblemente al menos 95 o 98% idéntica a la

secuencia objeto (por ejemplo, de tipo silvestre). Típicamente, los homólogos comprenderán los mismos sitios activos, etc. que la secuencia de aminoácidos objeto. Aunque la homología también puede considerarse en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención, se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.

En el presente contexto, una secuencia homóloga se considera que incluye una secuencia de nucleótidos que puede ser al menos 70, 75, 80, 85, 90% idéntica, preferentemente por lo menos 95 o 99% idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido de la presente invención (la secuencia objeto). Típicamente, los homólogos comprenderán las mismas secuencias que codifican los sitios activos, etc., que la secuencia objeto. Aunque la homología también puede considerarse en términos de similitud (es decir, residuos de aminoácidos que tienen propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la presente invención se prefiere expresar la homología en términos de identidad de secuencia.

Las comparaciones de la homología pueden realizarse visualmente o, más normalmente, con ayuda de programas de comparación de secuencias, fácilmente asequibles. Estos programas informáticos disponibles comercialmente, pueden calcular el % de homología entre dos o varias secuencias.

El % de homología puede calcularse sobre secuencias contiguas, es decir, una secuencia se alinea con la otra secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un residuo a la vez. Esto se llama alineación "sin huecos". Típicamente, tales alineaciones sin huecos se realizan solo sobre un número relativamente bajo de residuos.

Aunque este es un método muy simple y coherente, no se toma en consideración, por ejemplo, que en una pareja de secuencias, por lo demás idénticas, una inserción o una deleción provocará que los residuos de aminoácidos siguientes estén fuera de la alineación, por lo tanto, dando potencialmente como resultado una gran reducción en el % de homología cuando se realiza una alineación global. Por consiguiente, la mayoría de los métodos de comparación de secuencias se diseñan para producir alineaciones óptimas que tengan en consideración posibles inserciones y deleciones, sin penalizar indebidamente la puntuación global de la homología. Esto se logra insertando "huecos" en la alineación de la secuencia para intentar maximizar la homología local.

Sin embargo, estos métodos más complejos asignan "penalizaciones por hueco" a cada hueco que se produce en la alineación, de modo que para el mismo número de aminoácidos idénticos, una alineación de la secuencia con el menor número posible de huecos - lo que refleja una mayor relación entre las dos secuencias comparadas - logrará una puntuación más alta que una con muchos huecos. Los "costes por huecos afines" se utilizan típicamente para cargar un coste relativamente alto por la existencia de un hueco y una penalización más pequeña para cada residuo posterior en el hueco. Este es el sistema de puntuación de huecos utilizado más comúnmente. Las penalizaciones elevadas por huecos, producirán por supuesto alineaciones optimizadas con menos huecos. La mayoría de los programas de alineación permiten modificar las penalizaciones por hueco. Sin embargo, se prefiere utilizar los valores por defecto cuando se utiliza tal programa para comparar secuencias.

El cálculo del % máximo de homología requiere en primer lugar, por consiguiente, la producción de una alineación óptima, teniendo en cuenta las penalizaciones por hueco. Un programa informático adecuado para llevar a cabo tal alineación es el Vector NTI (Invitrogen Corp.). Ejemplos de programas que pueden realizar comparaciones de secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete BLAST (véase Ausubel et al., 1999 “Short Protocols in Molecular Biology”, 4ª ed. - Capítulo 18), BLAST 2 (véase FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1):187-8 y tatiana@ncbi.nlm.nih.gov), FASTA (Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410) y AlignX, por ejemplo. Al menos BLAST, BLAST 2 y FASTA están disponibles para búsquedas desconectadas y en línea (véase Ausubel et al 1999, páginas 7-58 a 7-60).

Aunque el % de homología final puede medirse en términos de identidad, el propio proceso de alineación no se basa típicamente en una comparación de las parejas de todo o nada. En su lugar, se utiliza generalmente una matriz de puntuación por similitud a escala que asigna puntuaciones a cada comparación por parejas, basándose en la similitud química o la distancia evolutiva. Un ejemplo de tal matriz utilizada comúnmente es la matriz BLOSUM62 -la matriz por defecto para el conjunto de programas BLAST. Los programas de Vector NTI generalmente utilizan valores por defecto públicos o una tabla de comparación de símbolos personalizada, si se suministra (consultar el manual del usuario para más detalles). Para algunas aplicaciones, se prefiere utilizar los valores por defecto para el paquete de Vector NTI.

Alternativamente, el porcentaje de homología se puede calcular utilizando la característica de alineación múltiple en Vector NTI (Invitrogen Corp.), basada en un algoritmo, análogo a CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244).

Una vez que el programa ha producido una alineación óptima, es posible calcular el % de homología, preferentemente el % de identidad de secuencia. El programa normalmente lo hace como parte de la comparación de secuencias y genera un resultado numérico.

En caso de utilizarse penalizaciones por hueco cuando se determina la identidad de una secuencia, entonces se emplean preferiblemente los siguientes parámetros para la alineación por parejas:

Para BLAST

Inicio del hueco

0

Extensión del hueco

0

Para CLUSTAL

ADN Proteína

Tamaño palabra

2 1 triple K

Penalización por hueco

15 10

Extensión del hueco

6,66 0,1

En una realización, CLUSTAL se puede utilizar con la penalización por hueco y la extensión del hueco, configuradas tal y como se ha definido anteriormente.

Convenientemente, el grado de identidad con respecto a una secuencia de nucleótidos se determina sobre por lo menos 20 nucleótidos contiguos, preferentemente sobre al menos 30 nucleótidos contiguos, preferentemente sobre al menos 40 nucleótidos contiguos, preferentemente sobre al menos 50 nucleótidos contiguos, preferentemente sobre al menos 60 nucleótidos contiguos, preferiblemente sobre al menos 100 nucleótidos contiguos.

Convenientemente, el grado de identidad con respecto a una secuencia de nucleótidos, se puede determinar a lo largo de toda la secuencia.

(H) Kits.

Los materiales para emplear en la generación de polimerasas de ADN de la presente invención, son idealmente adecuados para la preparación de kits.

Un kit tal puede comprender recipientes, cada uno con uno o varios de los diversos reactivos (típicamente en forma concentrada) utilizados en los métodos - tales como tampones, los trifosfatos de nucleótidos apropiados (por ejemplo, dATP, dCTP, dGTP y dTTP; o rATP, rCTP, rGTP y UTP), polimerasa de ADN y uno o varios oligonucleótidos.

Un conjunto de instrucciones también suele estar incluido.

(I) Técnicas generales de ADN recombinante.

La presente invención emplea, a menos que se indique de otro modo, técnicas convencionales de química, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de las capacidades de una persona con experiencia ordinaria en la técnica. Tales técnicas se explican en la bibliografía. Véase, por ejemplo, J. Sambrook, E. F. Fritsch, y T. Maniatis, 1989, “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, segunda edición, libros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al., (1995 y suplementos periódicos; “Current Protocols in Molecular Biology”, cap. 9, 13 y 16, John Wiley & Sons, Nueva York, NY.); B. Roe, J. Crabtree, y A. Kahn, 1996, “DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques”, John Wiley & Sons; M. J. Gait (compilador), 1984, “Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach”, Irl Press; y D. M. J. Lilley y J. E. Dahlberg, 1992, “Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology”, Academic Press.

Ejemplos

La invención se describirá ahora mediante los siguientes ejemplos que no son en modo alguno limitativos de la invención reivindicada en la presente memoria.

Ejemplo 1: Clonación del marco de lectura abierta de la polimerasa Pfu en pASK.

El marco de lectura abierto de la polimerasa Pfu se amplificó por PCR a partir de pETpfu (Lu y Erickson, 1997) usando los cebadores 1 y 2. El fragmento amplificado fue digerido por restricción con NdeI y SalI y se ligó en pASKDpo4 (Skerra, 1994) a partir del cual se había escindido el sitio NdeI en 2421 pb de la cadena principal del vector pASK, mediante mutagénesis dirigida al sitio usando los cebadores 3 y 4, creando así el vector de expresión pASKpfu.

La actividad exonucleasa 3'-5' de la enzima Pfu estaba desactivada por mutagénesis dirigida al sitio del dominio I de la exonucleasa (Derbyshire et al., 1995) usando los cebadores 5 y 6 y pASKpfu como molde, generando así pASKpfuexo-.

El sitio XbaI presente en la secuencia de Pfu en 1683 pb se eliminó por mutagénesis dirigida al sitio, usando los cebadores 7 y 8 y pASKpfuexo-como molde, generando así pASKpfuexo-1.

Para facilitar la construcción de la genoteca mediante iPCR, el sitio BsaI presente en la secuencia de Pfu en 1636 pb fue eliminado por mutagénesis dirigida al sitio usando los cebadores 9 y 10 pASKpfuexo-1 como molde, generando

así pASKpfuexo-2.

Con el fin de subclonar las secuencias seleccionadas por CSR, el sitio BamHI presente en la secuencia de Pfu en 606 pb, se eliminó por mutagénesis dirigida al sitio usando los cebadores 11 y 12 y pASKpfuexo-2 como molde, generando así pASKpfuexo-3. Una mutación silenciosa se introdujo por mutagénesis dirigida al sitio en el gen Pfu para incluir un único sitio para la enzima de restricción BamHl (1416 pb) usando los cebadores 13 y 14 pASKpfuexo3 como molde, generando así pASKpfuexo-4.

La función de detención del uracilo (Fogg et al., 2002) sobre la enzima Pfu se eliminó por mutagénesis dirigida al sitio usando los cebadores 15 y 16 y pASKpfuexo-4 como molde, generando así pASKpfuexo-5.

Para facilitar la clonación de selecciones de motivos A-C de la genoteca, se introdujo una mutación silenciosa por mutagénesis dirigida al sitio en el gen Pfu, para incluir un único sitio de la enzima de restricción XhoI (1726 pb) usando los cebadores 17 y 18, respectivamente, y pASKpfuexo-5 como molde generando así pASKpfuexo-6.

Una variante inactiva de Pfu se construyó para permitir condiciones para la CSR que se va a evaluar. Un sitio XhoI que introduce un desplazamiento del marco +1 en el motivo A en 1218 pb, fue generado por mutagénesis dirigida al sitio usando los cebadores 19 y 20 y pASKpfuexo-4 como molde, generando así pASKpfuexo-7.

Ejemplo 2: Expresión de proteínas de Pfu

Estructuras artificiales de genotecas o plásmidos se transformaron en E coli Ace6 o TG1TR y se expresaron tal y como se ha descrito (Skerra, 1994). Brevemente, las células Ace6 transformadas se dejan crecer durante una noche a 37ºC en 2xTY, 0,1 mg/ml de ampicilina. Para la expresión, los cultivos de una noche se diluyeron 1:50 en 2xTY, 0,1 mg/mL de ampicilina, crecieron hasta una DO595 de 0,6 a 37ºC y se indujeron para la expresión de proteínas mediante la adición de anhidrotetraciclina. La expresión de proteínas se indujo durante 6 horas a 37ºC.

Las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en 20 ml (por litro de cultivo) de tampón A (Tris 50 mM pH 8,0, 1% de glucosa, EDTA 1 mM), el tampón B (Tris 10 mM, pH 8,0, KCl 50 mM, EDTA 1 mM, 0,5% de NP40) se añadió hasta tener un volumen final de 50 ml y las células se lisaron durante 30 minutos a 75ºC. Los desechos se sedimentaron por centrifugación y se añadió NaCl al sobrenadante hasta tener una concentración final de 0,25 M. A continuación, se añadió polietilenamina (PEI) neutralizada hasta tener una concentración final de 0,1% v/v y se precipitó el sedimento por centrifugación. El sobrenadante clarificado se diluyó 5 veces con Tris 20 mM pH 7,5 y se cargó en una columna 6/10 FF de heparina Hi-Prep (Pharmacia) equilibrada con tampón de migración en columna (CRB) (Tris 20 mM pH 7,5, NaCl 50 mM, 10% de glicerol). La columna se lavó con 150 ml de CRB y la polimerasa unida se eluyó con un gradiente de NaCl de 0 a 1 M. Pfu eluyó entre 0,2 M-0,3 M de NaCl, 10% de glicerol. Las muestras de polimerasa eluidas se concentraron usando dispositivos de filtración centrífuga Ultra-15 (Amicon), se dializaron con filtro en tampón de almacenamiento de Pfu 2x (Tris 100 mM, pH 8,0, DTT 2 mM, 0,1% de CHAPS) y se añadió glicerol hasta tener 50% final v/v. Las muestras se almacenaron a -20ºC.

Ejemplo 3: Pfu requiere condiciones de CSR modificadas.

Las modificaciones del protocolo de CSR descrito previamente eran necesarias para permitir la selección de las variantes de Pfu y, especialmente, las variantes de Pfu capaces de incorporar análogos de nucleótidos marcados. Las condiciones de CSR descritas previamente (Ghadessy et al., 2001), cuando se realiza en tampón de Pfu 1x (KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-Cl 20mM pH 8,75, MgSO4 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 μg/ml de BSA; Stratagene Ltd), no enriquecieron una variante activa de Pfu (pASKpfuexo-2; véase el ejemplo 1) frente a una variante inactiva (pASKpfuexo-7; véase el ejemplo 1) cuando estaba presente en una proporción de 1:100. La fase acuosa de la emulsión tuvo que ser modificada para incluir cebadores (1 μM), dNTPs (0,1 mM cada uno), ARNasa (10 μg/mL), glicerol (10% v/v), formamida (1% v/v), DTT (1 mM) en tampón de Pfu 1x. Las células que expresaban la variante activa de Pfu se mezclaron en una proporción de 1:100 con las células que expresaban la variante inactiva de Pfu y se sometieron a PCR con los cebadores 40 y 41, ya sea en solución o en emulsión (CSR) en las condiciones modificadas descritas. Se realizó la PCR en emulsión (CSR) o solución con los siguientes parámetros para la ciclación: 94ºC 5 min 25 veces (94ºC 30 s, 50ºC 1 min, 72ºC 15 min). Una amplificación con éxito daba como resultado un producto de tamaño de 2,5 kb. Después de la amplificación con PCR en emulsión, las emulsiones se extrajeron con 2 volúmenes de éter dietílico. Las amplificaciones con PCR realizadas en emulsión y solución se purificaron usando un kit de purificación de PCR de Qiagen, que incluía una etapa de lavado adicional con 750 μL de clorhidrato de guanidinio al 35%. Los productos purificados se eluyeron en 50 μL de tampón de elución. Para eliminar el ADN plasmídico parental y los cebadores, 7 μL de eluato de la columna se digirieron con Dpnl y ExoSAP-IT. Dos μL de Dpnl y la muestra tratada con ExoSAP-IT se volvieron a amplificar con una mezcla de SuperTaq (HT Biotechnology)/PfuTurbo (Stratagene) (68 partes de Taq : 8 partes de PfuTurbo; 1 μL por reacción) en tampón Taq 1x (Tris-HCl 10 mM pH 9,0, MgCl2 1,5 mM, KCl 50 mM, 0,1% de Triton X-100, 0,01% de estabilizador) con los cebadores 42 y 43 (1 μM cada uno), 1% (v/v) de formamida y dNTPs (0,5 mM cada uno). Los parámetros de la ciclación fueron los siguientes: 94ºC 4 min 18 veces (94ºC 30 s, 50ºC 30 s, 72ºC 3 min) 65ºC 10 min. La variante inactiva de Pfu codificada por pASKpfuexo-7 contiene una mutación A> C en 1220 pb y un marco de lectura +1 en 1218 pb, dando como resultado la inserción de una C creando así un sitio de restricción único para XhoI en 1218 pb. La digestión con restricción con XhoI permite distinguir los productos de la PCR obtenidos a partir de los genes de

polimerasas inactivas y activas. En solución, no se observó un enriquecimiento significativo de la variante activa, mientras que en emulsión, la variante activa estaba enriquecida (Figura 1).

Ejemplo 4: Preparación de repertorios de Pfu con diversidad dirigida a una diana.

La diversidad de la genoteca se dirigió al sitio activo de la polimerasa Pfu que se compone de 3 motivos denominados motivos A, B y C, éstos sujetan el nucleótido entrante y están involucrados en la unión del molde al cebador. Las genotecas se construyeron mediante iPCR. Brevemente, las reacciones de iPCR se iniciaron en caliente mediante la adición de 3,5 U de polimerasa Expand High Fidelity (Roche) a una mezcla de PCR [10 ng de molde de plásmido, cebadores (0,4 μM), dNTPs (0,2 mM), en 1x tampón de High Fidelity Expand con MgCl2 (Roche)]. Los cebadores que incluían diversidad se purificaron con PAGE. Las reacciones se termociclaron [94ºC durante 4 min; 19 veces (94ºC durante 20 s, 65ºC durante 20 s - 1ºC/ciclo, y 68ºC durante 10 min); 15 veces (94ºC durante 20 s, 50ºC durante 20 s, 68ºC durante 10 min); 15 veces (94ºC durante 20 s, 50ºC durante 20 s, 68ºC durante 10 min + 15 s/ciclo)]. Las reacciones con iPCR se purificaron con un kit de purificación de PCR de QIAquick (Qiagen) y se eluyeron en 50 μL de H2O. El ADN purificado fue digerido por restricción durante una noche con Dpnl (New England Biolabs) para eliminar el molde de entrada del plásmido. Las muestras de ADN restringidas se purificaron con un kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) y se eluyeron en 50 μL de H2O. El ADN purificado fue digerido por restricción durante una noche con BsaI (New England Biolabs) después de lo cual las reacciones se purificaron con un kit de purificación de PCR de QIAquick (Qiagen) y se eluyeron en 50 μL de H2O. Se ligaron 150 μL del ADN digerido por restricción durante una noche a 16ºC, con 1200 U de ligasa de ADN T4 (New England Biolabs) en tampón de ligasa de ADN T4 1x (New England Biolabs) en un volumen final de 200 μL. Las reacciones de ligación se sometieron a electroporación en células de E. coli Ace6 o TG1TR que se colocaron sobre placas con 0,1 mg/mL de 2xTY/Amp.

La genoteca de motivos A de Pfu se generó por iPCR usando pASKpfuexo-2 como molde y el cebador 21 de PCR y el cebador 22 degenerado que introduce mutaciones al azar a un ritmo de 10% en los residuos de aminoácidos 404 y 406-412 (L y FRALYPS), evitando el aspartato catalítico conservado (D405). Los residuos 399-403 y el residuo 415 situados adyacentes al motivo A (ENIVY & I) se mutaron para incluir la diversidad de la secuencia presente de forma natural en enzimas polimerasas de la familia B. La genoteca se transformó en E. coli Ace6.

La genoteca de motivos A-B de Pfu fue generada por iPCR usando como moldes los cuatro mejores clones seleccionados con Cy5-dCTP a partir de la genoteca del motivo A de Pfu (15, 23, 55 y AH12; véase el ejemplo 6) y el cebador 23 degenerado por PCR que introduce mutaciones aleatorias en los residuos de aminoácidos 488-500 (KLLANSFYGYYGY) con una tasa del 10% y el cebador 24. El residuo K501 situado adyacente al motivo B, fue mutado para incluir la diversidad de la secuencia presente de forma natural en enzimas polimerasas de la familia B. La genoteca se transformó en E. coli Ace6. El ADN plasmídico se aisló de la genoteca con el repertorio A-B de Pfu en E. coli Ace6 y se transformó en E. coli TG1TR. La genoteca en E. coli TG1TR se utilizó en las selecciones.

La genoteca de motivos A-C de Pfu fue generada por iPCR usando como moldes los cuatro mejores clones seleccionados con Cy5-dCTP a partir de la genoteca de motivos A de Pfu (15, 23, 55 y AH12; véase el ejemplo 6) y el cebador 25 degenerado por PCR que introduce mutaciones aleatorias en los residuos de aminoácidos 537-540, 542 y 544 (VLYI, T y G) con una tasa del 10%, evitando los residuos catalíticos de aspartato (D541 y D543) y el cebador 26 de PCR. Los residuos L545 e Y546 se mutaron para incluir la diversidad de la secuencia presente de forma natural en las enzimas polimerasas de la familia B. La genoteca se transformó en E. coli Ace6. El ADN plasmídico se aisló a partir de la genoteca con el repertorio A-C de Pfu en E. coli Ace6 y se transformó en E. coli TG1TR. La genoteca en TG1TR fue utilizada en las selecciones.

Ejemplo 5: Selección de variantes de Pfu capaces de incorporar Cy5-dCTP a partir de repertorios de Pfu.

Las variantes de Pfu fueron seleccionadas a partir de las genotecas con repertorio (véase el ejemplo 4), por la capacidad para incorporar nucleótidos marcados con colorante, específicamente Cy5-dCTP. Selecciones de spCSR se establecieron tal y como se describe en el ejemplo 3, sin embargo, la dCTP fue reemplazada completamente por 100 μM de Cy5-dCTP. Los cebadores que se apareaban en 5' y 3' de la región diversificada, se emplearon en selecciones con spCSR. La spCSR se realizó debido a la dificultad en incorporar análogos de nucleótidos marcados con colorante, lo que inicialmente imposibilita la amplificación de la secuencia de longitud completa de Pfu.

Las selecciones con Cy5-dCTP de spCSR procedentes de la genoteca con motivos A (94ºC durante 5 min; 20 veces en 94ºC durante 30 s, 50ºC durante 1 min y 72ºC durante 18 min, seguido de una etapa de elongación final a 65ºC durante 10 min) se llevaron a cabo usando los cebadores 27 y 28. La fase acuosa se extrajo tal y como se describe en el ejemplo 3 y los productos purificados de la selección se volvieron a amplificar por PCR (94ºC 2 min; 31 veces en 94ºC durante 30 s, 54ºC durante 1 min, y 72ºC durante 3 min, seguido de una etapa de elongación final a 65ºC durante 10 min), usando los cebadores 29 y 28 tal y como se describe en el ejemplo 3. Los productos de la selección amplificados de nuevo fueron digeridos con EcoRI y BamHI y se subclonaron en pASKpfuexo-4 (véase el ejemplo 1) antes de la transformación en E. coli Ace6.

Las selecciones con Cy5-dCTP de spCSR procedentes de la genoteca con motivos A-B (94ºC durante 5 min; 20 veces a 94ºC durante 30 s, 50ºC durante 1 min y 72ºC durante 10 min) se llevaron a cabo usando los cebadores 27

y 30, tal y como se describe en el ejemplo 3. La fase acuosa se extrajo tal y como se describe en el ejemplo 3 y los productos purificados de la selección se volvieron a amplificar por PCR (94ºC 2 min; 29 veces a 94ºC durante 30 s, 54ºC durante 1 min y 72ºC durante 1 min 30 s) usando los cebadores 29 y 31. Los productos de la selección amplificada de nuevo se digirieron con EcoRI y SacI y se subclonaron en pASKpfuexo-6 antes de la transformación en E. coli Ace6.

Las selecciones con Cy5-dCTP de spCSR procedentes de la genoteca con motivos A-C (94ºC durante 5 min; 20 veces a 94ºC durante 30 s, 50ºC durante 1 min y 72ºC durante 10 min) se llevaron a cabo usando los cebadores 27 y 32. La fase acuosa se extrajo tal y como se ha descrito (Ghadessy et al., 2001) y los productos purificados de la selección se volvieron a amplificar por PCR (94ºC 2 min; 29 veces a 94ºC durante 30 s, 54ºC durante 1 min y 72ºC durante 1 min 30 s) usando los cebadores 29 y 32. Los productos de la selección amplificada de nuevo se digirieron con EcoRI y XhoI y se subclonaron en pASKpfuexo-6.

Ejemplo 6: Selección de variantes de Pfu capaces de incorporar Cy5-dCTP y biotina-16-dUTP.

Las variantes de Pfu fueron seleccionadas a partir de genotecas con repertorios A-B de Pfu (véase el ejemplo 4) para estudiar la capacidad de incorporar Cy5-dCTP y biotina-16-dUTP. Las selecciones de spCSR se establecieron tal y como se ha descrito en el Ejemplo 3, sin embargo, la dCTP fue reemplazada completamente por 100 μM de Cy5-dCTP y la dTTP fue reemplazada completamente por 100 μM de biotina-16-dUTP. Los cebadores que se apareaban en 5' y 3' de la región diversificada, se emplearon en las selecciones de spCSR. La spCSR se realizó debido a la dificultad para incorporar análogos de nucleótidos modificados lo que inicialmente imposibilita la amplificación de la secuencia de longitud completa de Pfu.

Las selecciones de spCSR con Cy5-dCTP y biotina-16-dUTP a partir de la genoteca de motivos A-B (94ºC durante 5 min; 20 veces a 94ºC durante 30 s, 50ºC durante 1 min y 72ºC durante 10 min) se llevaron a cabo usando los cebadores 27 y 30 tal y como se ha descrito en el ejemplo 3. La fase acuosa se extrajo tal y como se ha descrito en el ejemplo 3. Los productos purificados de la selección fueron tratados con Dpnl y ExoSAP (tal y como se ha descrito en el ejemplo 3) y se amplificaron de nuevo usando un procedimiento de recuperación en 2 etapas. La PCR inicial se inició en caliente mediante la adición de 2,5 U de Pfuexo-(Stratagene) a una mezcla de PCR [1 μL de selección purificada tratada con Dpnl/ExoSAP, cebadores 31 y 29 (1 μM de cada uno), tampón de Pfu 1x (KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-Cl 20 mM pH 8,75, MgSO4 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 μg/ml de BSA; Stratagene Ltd), 2% (v/v) de formamida y dNTPs (0,5 mM cada uno)]. Las reacciones se termociclaron (94ºC durante 2 min; 20 veces a 94ºC durante 30 s, 50ºC durante 30 s y 72ºC durante 2 min 30 s). Se empleó 1 μL de la PCR amplificada con Pfuexo-como molde en una segunda PCR con los cebadores 31 y 47 y una mezcla de SuperTaq (HT Biotechnology) / PfuTurbo (Stratagene) (tal y como se describe en el ejemplo 3; 94ºC durante 2 min; 20 veces a 94ºC durante 30 s, 50ºC durante 30 s y 72ºC durante 1 min 30 s). Los productos de la selección amplificados de nuevo se digirieron con EcoRI y SacI y se subclonaron en pASKpfuexo-6 antes de la transformación en E. coli Ace6.

Ejemplo 7: Escrutinio de colonias con ELISA de variantes de Pfu seleccionadas.

Con el fin de clasificar las variantes de Pfu seleccionadas con Cy5-dCTP, se estudió su capacidad para incorporar dCTP marcada con colorante Cy, mediante un ensayo de extensión con ELISA. Brevemente, las células que expresaban Pfu o variantes de Pfu seleccionadas se lavaron dos veces en tampón de Pfu 1x (KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-Cl 20 mM pH 8,75, MgSO4 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 μg/ml de BSA; Stratagene Ltd) y se concentraron 10 veces en tampón de Pfu 1x. Las células se lisaron por incubación a 85ºC durante 10 min y los restos celulares se sedimentaron por centrifugación a 2.000 g durante 10 min.

Lisados aclarados se pueden normalizar en la actividad, en una reacción de extensión por ELISA con el cebador 48 [tampón de Pfu 1x (KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-Cl 20 mM pH 8,75, MgSO4 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 μg/ml de BSA; Stratagene Ltd), dATP (10 μM), dGTP (10 μM), dTTP (9 μM), digoxigenina-11-dUTP (1 μM; Perkin Elmer), dCTP (10 μM), cebador (1 μM), 9 μL de H2O, 2 μL de lisado celular]. El cebador 48 contiene una biotina interna y requiere que se incorporen 20 nucleótidos consecutivos antes de la inserción de digoxigenina-11-dUTP que se utiliza para la detección colorimétrica.

Lisados crudos aclarados o lisados con actividad normalizada se escrutaron según la capacidad de incorporar o bien Cy5-dCTP o Cy3-dCTP en una reacción de extensión con ELISA [tampón de Pfu 1x (KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-Cl 20 mM pH 8,75, MgSO4 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 μg/ml de BSA; Stratagene Ltd), dATP (10 μM), dGTP (10 μM), dTTP (9 μM), digoxigenina-11-dUTP (1 μM; Perkin Elmer), Cy3-dCTP o Cy5-dCTP (10 μM), cebador (1 μM), 9 μL de H2O, 2 μL de lisado celular]. Los cebadores utilizados en la reacción de extensión contienen una biotina interna y requieren que 4 dCTPs consecutivas marcadas con Cy3 o Cy5 (cebador 33), 6 (cebador 34) u 8 (cebador 35) se incorporen antes de la inserción de digoxigenina-11-dUTP que se utiliza para la detección colorimétrica.

La reacción de extensión procedió a 94ºC durante 5 min, 50ºC durante 5 min, 72ºC durante 5 min. A continuación, 5 μL de la reacción de extensión se unieron durante 30 min a temperatura ambiente a través de la biotina, de forma interna al cebador, a una placa de microtitulación (Roche) de 96 pocillos revestida con estreptavidina StreptaWell (de alta capacidad) en 200 μL de 1x PBS-Tween-20 (0,2%). La placa se lavó 5 veces en 1x PBS-Tween-20 (0,2%) y se

añadió a cada pocillo una dilución 1:2.000 (en 200 μL de 1x PBS-Tween-20) de un conjugado de fragmento Fab antidigoxigenina - peroxidasa (Roche) y se unió durante 30 min a temperatura ambiente. A continuación, la placa se lavó 5 veces con 1x PBS-Tween-20 y se añadieron 100 μL de sustrato Ultra TMB-ELISA de 1 etapa (Pierce). El desarrollo de color se detuvo mediante la adición de 100 μL de H2SO4 1 M y se cuantificó midiendo la absorbancia a 450 nm - 650 nm.

Ejemplo 8: Variantes de Pfu seleccionadas a partir de la genoteca de motivos A con Cy5-dCTP.

Selecciones con Cy5-dCTP (véase el ejemplo 5) de la genoteca con repertorio de Pfu, diversificada en el motivo A (véase el ejemplo 4) dieron como resultado la selección de 4 variantes de Pfu 23, AH12, 55 y 15 que mostraban una capacidad significativamente mayor para incorporar Cy5-dCTP, frente a la enzima de tipo silvestre, tal y como se determinó en un ensayo de extensión con ELISA, con lisados con actividad normalizada (véase el ejemplo 7) realizado con los cebadores 33, 34 y 35 (figura 2; ELISA). Los clones se secuenciaron con los cebadores 36, 37, 39, 44, 45 y 46 y se identificaron mutaciones en las regiones diversificadas (Figura 3; Secuencia). Mutaciones adicionales fueron identificadas en los clones 15 (V337I) y AH12 (Q572H), éstas se encuentran entre los cebadores 27 y 28 que se utilizaron en la selección con Cy5-dCTP de tramos cortos. Variante 23 de Pfu: N400D, I401L, R407I; variante AH12 de Pfu: E399D, N400G, I401L, V402A, R407I, Q572H; variante 55 de Pfu: N400G, R407I; variante 15 de Pfu: E399D, N400G, R407I, V337I.

Ejemplo 9: Variantes de Pfu seleccionadas a partir de la genoteca con motivos A y B con Cy5-dCTP.

Las variantes de Pfu capaces de incorporar significativamente Cy5-dCTP en comparación con la capacidad de la enzima de tipo silvestre, fueron seleccionadas a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-B de Pfu (véase el ejemplo 4) con cebadores que se aparean en 5' con el motivo A y en 3' con el motivo B (véase el ejemplo 5). Los clones que mostraban una capacidad significativamente mayor para incorporar Cy5-dCTP, fueron clasificados con un ensayo de extensión con ELISA, con el cebador 35 (véase el ejemplo 7, Figura 4). Los clones se secuenciaron con el cebador 36 y se identificaron mutaciones en las regiones diversificadas (Figura 5; Secuencia). El molde utilizado para la construcción de la genoteca con repertorio de motivos A-B de Pfu, se tiene que haber contaminado con alguna secuencia de Pfu de tipo silvestre ya que no todos los clones seleccionados contienen diversidad en el motivo A aunque todos los clones seleccionados contienen diversidad en el motivo B.

Ejemplo 10: Variantes de Pfu seleccionadas a partir de la genoteca de motivos A y C con Cy5-dCTP.

Las variantes de Pfu capaces de incorporar significativamente Cy5-dCTP en comparación con la capacidad de la enzima de tipo silvestre, fueron seleccionadas a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-C de Pfu (véase el ejemplo 4) con cebadores que se aparean en 5' con el motivo A y en 3' con el motivo B (véase el ejemplo 5). Los clones que mostraban una capacidad significativamente mayor para incorporar Cy5-dCTP, fueron clasificados con el ensayo de extensión de ELISA, con el cebador 35 (véase el ejemplo 7; Figura 6). Los clones se secuenciaron con el cebador 36 y se identificaron mutaciones en las regiones diversificadas (Figura 7; Secuencia). Las selecciones con Cy5-dCTP de la genoteca de motivos A-C fueron seleccionadas para clones de las variantes de Pfu 15, 55 y 23 en el motivo A y en combinación con el residuo Y546 del motivo C mutado en H o L, en 20 de 20 clones secuenciados. Uno de tales clones, E10, mostraba una capacidad significativamente mayor para incorporar Cy3-dCTP o Cy5-dCTP (Figura 8; secuencia de E10). E10 tiene 14 mutaciones puntuales, además de las introducidas durante la construcción del vector (véase el ejemplo 1), de las cuales 9 son silenciosas, y el resto introduce las siguientes mutaciones V337I, E399D, N400D, R407I y Y546H.

Ejemplo 11: Variantes de Pfu seleccionadas a partir de la genoteca de motivos A y C con Cy3-dCTP.

Las variantes de Pfu capaces de incorporar significativamente Cy3-dCTP en comparación con la capacidad de la enzima de tipo silvestre, fueron seleccionadas a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-C de Pfu (véase el ejemplo 4) con cebadores que se aparean en 5' con el motivo A y en 3' con el motivo B (véase el ejemplo 5). Los clones que mostraban una capacidad significativamente mayor para incorporar Cy3-dCTP fueron clasificados con un ensayo de extensión con ELISA, con el cebador 35 (véase el ejemplo 7; Figura 9). Los clones se secuenciaron con el cebador 36 y se identificaron mutaciones en las regiones diversificadas (Figura 10; Secuencia). Las selecciones con Cy3-dCTP de la genoteca de motivos A-C fueron seleccionadas para clones de las variantes de Pfu 15, 55 y 23 en el motivo A en combinación con el residuo Y546 del motivo C mutado en H o L, en 20 de 20 clones secuenciados. Algunos clones contienen mutaciones adicionales situadas fuera de las regiones diversificadas.

Ejemplo 12: Variantes de Pfu seleccionadas a partir de la genoteca de motivos A y B con biotina-16-dUTP y Cy5dCTP.

Las variantes de Pfu capaces de incorporar significativamente Cy5-dCTP en comparación con la capacidad de la enzima de tipo silvestre, fueron seleccionadas con biotina-16-dUTP y Cy5-dCTP a partir de la genoteca con repertorio de motivos A-B de Pfu (véase el ejemplo 4) con cebadores que se aparean en 5' con el motivo A y en 3' con el motivo B (véase el ejemplo 5). Los clones que mostraban una capacidad significativamente mayor para incorporar Cy5-dCTP fueron clasificados con un ensayo de extensión con ELISA, con el cebador 35 (véase el ejemplo 7; Figura 11). Los clones se secuenciaron con el cebador 36 y se identificaron mutaciones en las regiones diversificadas (Figura 12).

Ejemplo 13: Algunas variantes de Pfu seleccionadas con Cy5-dCTP aisladas a partir de genotecas con repertorios de motivos A, motivos A-B o motivos A-C también son capaces de incorporar Cy3-dCTP.

Sorprendentemente algunos clones originalmente seleccionados por una mayor capacidad para incorporar Cy5dCTP o Cy5-dCTP y biotina-16-dUTP, también son capaces de incorporar Cy3-dCTP tal y como se evaluó con un ensayo de extensión con ELISA, con los cebadores 33, 34 y 35 (véase el ejemplo 7; Figuras 2, 4, 6 y 11).

Ejemplo 14: Generación mediante PCR de ADN marcado altamente fluorescente con enzimas seleccionadas.

Ciertas variantes de Pfu identificadas como capaces de incorporar tanto Cy5-dCTP como Cy3-dCTP en ensayos de extensión con ELISA (véanse los ejemplos 8, 10, 12 y 13) y la enzima de tipo silvestre, se expresaron y se purificaron (véase el ejemplo 2). En las enzimas se normalizó la actividad en PCR con los cebadores 36 y 37 y 10 ng de pASKpfu como molde. Enzimas con actividad normalizada se añadieron a reacciones de PCR que contenían: 10 ng de molde de plásmido, tampón de Pfu 1x (KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-Cl 20 mM pH 8,75, MgSO4 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 μg/ml de BSA; Stratagene Ltd), dGTP 50 μM, dATP 50 μM, dTTP 50 μM, Cy3-dCTP 50 μM o Cy5-dCTP 50 μM, cebadores 1 μM, 2% de formamida, H2O hasta 50 μL. Las condiciones de la ciclación fueron las siguientes: 94ºC 2 min, 50 veces a 94ºC durante 10 s, 50ºC durante 30 s y 72ºC durante 20 min. Los fragmentos amplificados se analizaron en geles de poliacrilamida al 6%.

La capacidad de las variantes de Pfu seleccionadas para amplificar un fragmento de 410 pb del gen de la polimerasa Taq (70% de GC) se evaluó con los cebadores 38 y 39. Esto requiere que la enzima polimerasa inserte 287 dCTPs marcadas con colorante Cy (Figura 13 gel PAGE). Varias enzimas seleccionadas identificadas como capaces de incorporar Cy3-dCTP y Cy5-dCTP en ELISA (véanse los ejemplos 8, 10, 12 y 13), también eran capaces de realizar la PCR cuando el 100% de las dCTPs había sido reemplazado con Cy3-dCTP o Cy5-dCTP.

Ejemplo 15: Análisis de micromatrices con ADN altamente marcado con Cy3.

Para evaluar si el ADN altamente marcado con colorante Cy era capaz de hibridarse y dar lugar a un aumento significativo de la señal fluorescente, se realizaron experimentos con micromatrices modelo. El ADN de la polimerasa Pfu se marcó en PCR con E10, usando los cebadores 36 y 37 en reacciones en las que se había reemplazado el 10% o 100% de las dCTPs en la reacción por Cy3-dCTP (E10Cy310 y E10Cy3100, respectivamente) o con Pfuexo-de tipo silvestre en reacciones en las que se había reemplazado el 10% de la dCTP por Cy5-dCTP (PfuCy510). El ADN fue purificado utilizando el método de "congelación-presión". En pocas palabras, el ADN marcado con colorante Cy se sometió a electroforesis sobre un gel de agarosa 1x TBE al 0,8%. El fragmento marcado se escindió del gel. La lámina de gel escindida se colocó en un tubo Eppendorf de 0,6 ml que había sido perforado con una aguja de 25 g cerca de la base del tubo. La tapa del tubo se cerró y el tubo se dejó caer en nitrógeno líquido. La lámina se incubó durante 15 min, después de lo cual el tubo se colocó en un tubo Eppendorf de 1,5 ml y se centrifugó inmediatamente a 12.000 rpm durante 10-20 min a 4ºC. El ADN marcado con colorante Cy se purificó también por precipitación con etanol (2,5x volúmenes de la muestra de etanol 1/10 de volumen de la muestra de acetato de sodio, pH 5,2), seguido de purificación en columnas G50 de Autoseq (Amersham Biosciences). El ADN marcado extraído se recoge en la base del tubo Eppendorf de 1,5 ml. La hibridación de cantidades equimolares de ADN PfuCy510 purificado, ya sea con ADN E10Cy310 o E10Cy3100 en las micromatrices en las que se habían depositado diluciones seriadas de ADN de la polimerasa Pfu, dio como resultado un incremento de 4 o 7 veces en la señal de Cy3, respectivamente (Figura 14).

Materiales y métodos de matriz.

Preparación de la matriz.

Diluciones seriadas (100, 50, 25, 12,5 y 6,25 ng/μl) de moléculas de la sonda (secuencias de Pfu y Taq, y ADN genómico de testículo de salmón fragmentado) se prepararon en NaPO4 150 mM pH 8,5/0,01% de SDS y se depositaron microgotitas por pentuplicado sobre portaobjetos de vidrio recubiertos con GAPSII aminosilano (Corning), empleando una microrrejilla de BioRobotics (Genomic Solutions Ltd). Los portaobjetos impresos se cocieron durante 2 horas a 80ºC, se incubaron con agitación durante 30 minutos a 42ºC en 5x SSC/1% de BSA (Sigma-Aldrich)/0,1% de SDS, se hirvieron durante 2 min en agua ultrapura, se lavaron con 3 cambios de agua ultrapura a temperatura ambiente, se aclararon en propan-2-ol y se secaron por centrifugación.

Hibridación de la matriz.

La nomenclatura de la diana marcada es la siguiente: Pfu con 10% de Cy3 o Pfu con 10% de Cy5 es el ADN diana que se ha marcado empleando la enzima Pfu, en donde el 10% de las dCTPs presentes en la reacción de marcación es Cy3-dCTP o Cy5-dCTP. Asimismo, E10 con 100% de Cy5 o E10 con 10% de Cy5 o E10 con 100% de Cy3 o E10 con 10% de Cy3 es el ADN diana que se ha marcado empleando la enzima E10, en donde el 100% o el 10% de las dCTPs presentes en la reacción de marcación es Cy5-dCTP o Cy3-dCTP.

Las siguientes hibridaciones competitivas se realizaron por duplicado: Pfu con 10% de Cy3 frente a Pfu con 10% de Cy5 se realizó como hibridación testigo; Pfu con 10% de Cy3 frente a E10 con 10% de Cy5 y E10 con 10% de Cy5 frente a Pfu con 10% de Cy5 se realizaron para medir la mejora en la marcación a través de E10 en presencia de

10% de dCTPs marcadas con Cy; Pfu con 10% de Cy3 frente a E10 con 100% de Cy5 y E10 con 100% de Cy3 frente a Pfu con 10% de Cy5 se realizaron para medir la mejora de la señal de hibridación después de marcar a través de E10 en presencia exclusivamente de dCTPs marcadas con Cy.

Se prepararon 5 ng de productos marcados con Cy3 y Cy5 en 20 μl de tampón de hibridación (Tris-HCl 1 mM pH 7,4, pirofosfato de tetrasodio 50 mM, 1x solución de Denhardts, 40% de formamida desionizada, 1% de NP-40, DTT 10 mM, 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado). Cada muestra se calentó a 95ºC durante 5 minutos, se centrifugó durante 2 min, se aplicó a la superficie de una matriz y se cubrió con un LifterSlip de 22 x 22 mm (Erie Scientific). Las hibridaciones se realizaron a 37ºC durante 16 h en una cámara de hibridación (Telechem). Las matrices se lavaron una vez con 2 x SSC/0,1% de SDS a temperatura ambiente durante 5 minutos, y dos veces con 1x SSC a temperatura ambiente durante 5 min. Los portaobjetos se secaron por centrifugación y se escanearon con un lector de micromatrices ArrayWoRx 'e' (Applied Precision Instruments). Para garantizar la capacidad comparativa entre los portaobjetos, se utilizaron unos parámetros de barrido idénticos para todas las matrices. Las imágenes se analizaron usando un instrumento GenePix Pro 4.1 (Axon Instruments) y las características de las matrices afectadas por artefactos locales, se excluyeron manualmente de análisis posteriores.

Estas condiciones de hibridación y lavado se optimizaron para proporcionar las mayores mejoras de la señal procedente de un ADN altamente marcado, sin comprometer la especificidad de la hibridación. Se observaron mejoras menores en condiciones más rigurosas, a saber, una temperatura de hibridación elevada (42ºC) y un lavado más riguroso (0,1x SSC a temperatura ambiente).

Cálculo del aumento de la mejora de la señal.

Se calculó el log2(media de Cy3/media de Cy5) para cada característica de la matriz. Para cada tipo de sonda (Pfu, Taq o ADN de testículo de salmón) en cada experimento (matrices por duplicado de una hibridación competitiva) se calculó la proporción media de log2 para todas las características incluidas en la matriz (máx. 50 características, es decir, 10 características por duplicado cada una en 5 diluciones de la sonda).

Para normalizar los datos con el experimento testigo (Pfu con 10% de Cy5 frente a Pfu con 10% de Cy3), en donde se espera una señal equivalente en ambos canales, la proporción media en log2 de Pfu del experimento testigo se restó de la de cada una de las otras comparaciones. Si las proporciones en log2 resultantes son positivas o negativas, representan mejoras en la señal de Cy3 y Cy5, respectivamente, en comparación con la marcación con Pfu con una concentración de colorante Cy del 10%. Las mejoras aumentadas para Cy3 y Cy5 son, por tanto, respectivamente, la inversa de la proporción media en log2 resultante y el complementario de la inversa de la proporción media en log2 resultante.

Ejemplo 16: El ADN altamente marcado con colorante Cy se reparte en la fase orgánica en presencia de sales en la extracción con fenol.

Los cebadores de PCR 49 y 50 se utilizaron para amplificar un fragmento de 100 pb del gen de la polimerasa de ADN Taq (2152-2251 pb). Las reacciones de la PCR contenían: 10 ng de molde plasmídico (pASK75 Taq), 1x tampón de Pfu (KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-Cl 20 mM pH 8,75, MgSO4 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 μg/ml de BSA; Stratagene Ltd), dGTP 50 μM, dATP 50 μM, dTTP 50 μM, Cy3-dCTP 50 μM o Cy5-dCTP 50 μM, 0,4 μM de cada cebador, 1% (v/v) de formamida, H2O hasta 25 μL. Las reacciones se iniciaron en caliente con la polimerasa E10. Las condiciones de la ciclación fueron las siguientes: 94ºC 2 min, 50 veces a 94ºC durante 10 s y 72ºC durante 20 min. Los fragmentos amplificados se purificaron por precipitación con etanol (2,5x volúmenes de la muestra de etanol 1/10 de volumen de la muestra de acetato de sodio, pH 5,2), seguido de purificación en columnas Autoseq G50 (Amersham Biosciences). Después de la purificación, se añadió NaCl con volúmenes equivalentes de ADN marcado con colorante Cy para proporcionar una concentración final de NaCl 0 mM, NaCl 100 mM o NaCl 150 mM o NaCl 200 mM. Cada muestra se sometió a vórtice con 20 μL de fenol equilibrado con Tris-HCl (pH 7,4). Las muestras se centrifugaron posteriormente durante 10 min a 13.000 g. A diferencia del ADN natural, el ADN altamente marcado se reparte en la fase de fenol orgánica, en presencia de concentraciones de sales que se encuentran generalmente en algunos tampones de enzimas de restricción (por ejemplo, NEB3; New England Biolabs), después de la extracción con fenol (véase la Figura 15). El ADN marcado con 100% de Cy3 se reparte completamente en la fase orgánica en presencia de NaCl 200 mM, en la extracción con fenol, mientras que el ADN con 100% de Cy5 se reparte completamente en la fase orgánica, en presencia de NaCl 100 mM. El ADN marcado se puede recuperar a partir de la fase fenol, diluyendo la fase acuosa que contiene sales con H2O o eliminando la fase que contiene acuosa que contiene sales y sustituyéndola por un volumen equivalente de H2O. Después de agitar con vórtex y centrifugar las muestras durante 10 min a 13.000 g, hace que el ADN marcado con colorante Cy se reparta en la fase acuosa. Esto podría constituir la base de una nueva estrategia para purificar ADN altamente marcado con colorante Cy.

Ejemplo 17: Longitud de los fragmentos para obtener una señal máxima a partir de ADN altamente marcado con colorante Cy.

La influencia de la longitud de los fragmentos sobre la señal fluorescente obtenida a partir de ADN altamente marcado con colorante Cy, se investigó utilizando una matriz modelo en la que se habían depositado una dilución

seriada (200, 100, 50, 25 y 12,5 ng/μl) del gen de la polimerasa Pfu de longitud completa de 2300 pb, una dilución seriada de ADN de testículo de salmón (200, 100, 50, 25 y 12,5 ng/μl) y tampón para depositar microgotitas (los 2 últimos actuando como testigos negativos). El aumento de la señal fluorescente procedente del ADN altamente marcado a través de E10 con colorante Cy, de longitud definida (270 pb o 1,3 kb) se mide en relación con muestras de ADN marcado con Klenow, en donde los fragmentos de ADN de 270 pb o 1,3 kb sin marcar fueron utilizados como moldes. La marcación con Klenow daba como resultado una longitud promedio de ADN marcado de 50-100 pb, independientemente de la longitud del ADN molde.

Marcación del ADN con Klenow:

Los fragmentos del gen de la polimerasa Pfu con longitudes de 1300 pb (que se corresponde al dominio polimerasa) y 270 pb (una porción del dominio polimerasa de 1047-1312 pb) se amplificaron con los cebadores 51 y 52, y 36 y 37 respectivamente. Los fragmentos de ADN se amplificaron con 5 U de SuperTaq (HT Biotechnology Ltd) en reacciones que contenían 1x tampón de PCR (Tris-HCl 10 mM pH 9,0, MgCl2 1,5 mM, 0,1% de Triton X-100, 0,001% de estabilizante; HT Biotechnology Ltd) cebador 1 1 μM y cebador 2 1 μM, 10 ng de pASKpfuexo-5, dNTPs 250 μM y H2O hasta 50 μL. Las reacciones se iniciaron en caliente y se termociclaron de la siguiente manera: 94ºC 2 min, 30 veces a 94ºC durante 30 s, 55ºC durante 30 s y 72ºC durante 3 min. Los productos de ADN de la amplificación con PCR se purificaron usando un kit de purificación de PCR de Qiagen. Se emplearon como moldes 250 ng de producto de la PCR purificado, con una longitud de 270 pb o 1,3 kb en las reacciones de marcación con Klenow (sistema de marcación de ADN de Bioprime; Invitrogen). Las reacciones de marcación con Klenow que contenían 250 ng de producto de la PCR con solución de cebadores aleatorios 1x (Tris-HCl 50 mM pH 6,8, MgCl2 12,5 mM, 2mercaptoetanol 10 mM, 300 μg/mL de cebadores aleatorios oligodesoxirribonucleótidos octámeros; sistema de marcación de ADN Bioprime, Invitrogen), en un volumen final de reacción de 42 μL, se mezclaron mediante agitación con vórtex y se calentaron a 95ºC durante 5 min, después de lo cual se colocaron inmediatamente sobre hielo. A la mezcla de reacción se añadió 200 μM (concentración final) de cada uno de dATP, dTTP y dGTP, 100 μM (concentración final) de dCTP, 100 μM (concentración final) de Cy3-dCTP o Cy5-dCTP y 0,8 U del fragmento grande de Klenow de la polimerasa de ADN 1 (sistema de marcación de ADN Bioprime, Invitrogen). Las reacciones se incubaron durante 2 horas a 37ºC. En estas reacciones convencionales, 20% de la dCTP se sustituye por dCTP marcada con colorante Cy. El tamaño de la distribución de las poblaciones de ADN marcadas con Klenow se analizó usando un bioanalizador Agilent 2100 de Bioanalyser y mostraba un pico entre 50 a 100 pb, independientemente de la longitud del molde.

Marcación del ADN con E10.

Los fragmentos de ADN de longitudes de 1,3 kb o 270 pb fueron marcados con Cy3-dCTP o Cy5-dCTP mediante E10 en PCRs con los cebadores 51 y 52, y 36 y 37 respectivamente. Las PCR se realizaron en tampón de Pfu 1x (KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-Cl 20 mM pH 8,75, MgSO4 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 μg/ml de BSA; Stratagene Ltd), 1% (v/v) de formamida, 1 μM de cada cebador, dATP 50 μM, dGTP 50 μM, dTTP 50 μM, dCTP 25 μM, Cy3-dCTP o Cy5-dCTP 25 μM y 10 ng de pASKpfuexo-5, en un volumen de reacción de 100 μL de H2O. Las reacciones se iniciaron en caliente con E10 y se termociclaron con las siguientes condiciones: 94ºC durante 2 min 50 veces a 94ºC durante 10 s, 50ºC durante 10 s y 68ºC durante 20 min. Los productos de ADN marcados con colorante Cy se purificaron mediante precipitación con etanol (2,5 x volúmenes de la muestra de etanol 1/10 de volumen de la muestra de acetato de sodio pH 5,2), seguido de purificación en columnas Autoseq G50 (Amersham Biosciences). En estas reacciones, 50% de la dCTP se sustituye por Cy3-dCTP o Cy5-dCTP.

Hibridaciones de matrices modelo.

La nomenclatura de la diana marcada es la siguiente:

E10270 Cy3 o E10270 Cy5 se refiere a un ADN diana de 270 pb que se ha marcado empleando la enzima E10, en donde el 50% de la dCTP presente en la reacción de marcación es Cy3-dCTP o Cy5-dCTP.

E101300 Cy3 o E101300 Cy5 es un ADN diana de 1300 pb que se ha marcado empleando la enzima E10, en donde el 50% de la dCTP presente en la reacción de marcación es Cy3-dCTP o Cy5-dCTP.

Klenow270 Cy3 o Klenow270 Cy5 se refiere a un ADN diana de 270 pb que se ha marcado empleando la enzima Klenow en donde el 20% de la dCTP presente en la reacción es Cy3-dCTP o Cy5-dCTP. Klenow1300 Cy3 o Klenow1300 Cy5 se refiere a un ADN diana de 1300 pb que se ha marcado con la enzima Klenow en donde el 20% de la dCTP presente en la reacción es Cy3-dCTP o Cy5-dCTP.

Se realizaron las siguientes hibridaciones competitivas:

1) Klenow270 Cy3 frente a Klenow270 Cy5

2) Klenow1300 Cy3 frente a Klenow1300 Cy5

3) E10270 Cy3 frente a Klenow270 Cy5

4) E10270 Cy5 frente a Klenow270 Cy3

5) E101300 Cy3 frente a Klenow1300 Cy5

6) E101300 Cy5 frente a Klenow1300 Cy3

Las hibridaciones competitivas 1 y 2 se realizaron como hibridaciones testigo y las hibridaciones competitivas 3, 4, 5 y 6 se realizaron para medir la influencia de la longitud de los fragmentos sobre el nivel de señal fluorescente obtenida tras la hibridación.

Se prepararon 10 ng de productos marcados con Cy3 y Cy5 en 20 μl de tampón de hibridación (Tris-HCl 1 mM pH 7,4, pirofosfato tetrasódico 50 mM, 1x solución de Denhardt, 40% de formamida desionizada, 1% de NP-40, TDT 10 mM TDT, 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado). Cada muestra se calentó a 95ºC durante 5 minutos, se centrifugó durante 2 min, se aplicó a la superficie de una matriz y se cubrió con un LifterSlip de 22 x 22 mm (Erie Scientific). Las hibridaciones se realizaron a 37ºC durante 16 h en una cámara de hibridación (Telechem). Las matrices se lavaron una vez con 2 x SSC/0,1% de SDS a temperatura ambiente durante 5 minutos, y dos veces con 1x SSC a temperatura ambiente durante 5 min. Los portaobjetos se secaron por centrifugación y se escanearon con un ArrayWoRx 'e' (Applied Precision Instruments). Para garantizar la capacidad de comparación entre los portaobjetos, se utilizaron parámetros de barrido idénticos para todas las matrices. Las imágenes se analizaron usando GenePix Pro 4.1 (Axon Instruments) y las características de la matriz afectadas por artefactos locales se excluyeron manualmente de un análisis adicional.

Cálculo del aumento de la mejora de la señal.

Se calculó el log2(media de Cy3/media de Cy5) para cada característica de la matriz. Para cada tipo de sonda (Pfu o ADN de testículo de salmón) en cada experimento se calculó la proporción media en log2 para todas las características incluidas en la matriz (máx. 100 características de Pfu, es decir, 20 características por duplicado cada una en 5 diluciones de la sonda de Pfu; máximo de 100 características de ADN de esperma de salmón, es decir, 20 características por duplicado cada una en 5 diluciones de la sonda de ADN de esperma de salmón; máximo de 20 características del tampón para depositar gotitas; máx. 20 zonas sin gotitas). Para normalizar los datos con el experimento testigo (Klenow270 Cy3 frente a Klenow270 Cy5 o Klenow1300 Cy3 frente a Klenow1300 Cy5), en donde se espera una señal equivalente en ambos canales, la proporción media en log2 de Klenow de los experimentos testigos, se restó de la de cada una de las otras comparaciones. Si las proporciones en log2 resultantes son positivas

o negativas, representan mejoras en la señal de Cy3 y Cy5, respectivamente, en comparación con la marcación con Klenow con una concentración de colorante Cy del 20%. Las mejoras aumentadas para Cy3 y Cy5 son, por tanto, respectivamente, la inversa de la proporción media en log2 resultante y el complementario de la inversa de la proporción media en log2 resultante.

La hibridación del fragmento de ADN E10270 Cy3 dio como resultado una señal de 34 veces superior, mientras que la hibridación del fragmento de ADN más largo E101300 Cy3 dio como resultado solo una señal 3,6 veces mayor (véase la Figura 16). La hibridación del fragmento de ADN E10270 Cy5 dio como resultado una señal 20 veces mayor, mientras que la hibridación del fragmento de ADN más largo E101300 Cy5 dio como resultado solo una señal de 2,5 veces superior (véase la Figura 16). Estos experimentos muestran que la hibridación de productos de la PCR marcados con E10 en experimentos con matrices modelo, dan como resultado una señal fluorescente mayor (hasta 32 veces) y se identifica que la longitud de los fragmentos es crucial para obtener una señal máxima a partir de muestras marcadas directamente con E10. No se observa ningún aumento en la fluorescencia de fondo cuando se hibridan muestras de ADN altamente marcadas y número de veces del aumento de la fluorescencia es lineal a través de dilución seriada depositada sobre el portaobjetos.

Ejemplo 18: Densidad de la marcación para obtener una señal máxima a partir de ADN altamente marcado con colorante Cy.

La influencia de la densidad de la marcación sobre la señal fluorescente obtenida a partir de ADN altamente marcado con colorante Cy, se investigó utilizando una matriz modelo en la que se habían depositado una dilución seriada (200, 100, 50, 25 y 12,5 ng/μl) del gen de la polimerasa Pfu de longitud completa de 2300 pb), una dilución seriada de ADN de testículo de salmón (200, 100, 50, 25 y 12,5 ng/μl) y tampón para depositar microgotitas (actuando los 2 últimos como testigos negativos). El aumento de la señal fluorescente procedente de un fragmento de ADN marcado a través de E10 con colorante Cy, de 270 pb en PCRs en donde el 10%, 50% o 100% de la dCTP se sustituye por Cy3-dCTP o Cy5-dCTP, se midió en relación con el fragmento equivalente de 270 pb marcado a través de Pfu con Cy3-dCTP o Cy5-dCTP, amplificado en PCRs, en donde el 10% de la dCTP se sustituye por dCTP marcada con colorante Cy.

Marcación del ADN.

Fragmentos de ADN de 270 pb de longitud fueron marcados con Cy3-dCTP o Cy5-dCTP mediante E10 o Pfu exo(Stratagene) en PCRs con los cebadores 36 y 37, respectivamente. Las PCRs se realizaron en tampón de Pfu 1x (KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-Cl 20 mM pH 8,75, de MgSO4 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 μg/ml de BSA; Stratagene Ltd), 10 ng de pASKpfuexo-5, 1% (v/v) de formamida, 1 μM de cada cebador, dATP 50 μM, dGTP 50 μM,

dTTP 50 μM, Cy3-dCTP o Cy5-dCTP 50 μM (100% de marcación) o dCTP 25 μM y Cy3-dCTP o Cy5-dCTP 25 μM (50% de marcación) o Cy3-dCTP o Cy5-dCTP 5 μM y dCTP 45 μM (10% de marcación) en un volumen de reacción de 50 μL de H2O. Las reacciones se iniciaron en caliente con E10 (100%, 50% y 10% de reemplazo de dCTP) o Pfu exo- (10% de reemplazo de dCTP solamente) y se termociclaron con las siguientes condiciones: 94ºC durante 2 min 50 veces a 94ºC durante 10 s, 50ºC durante 10 s y 68ºC durante 20 min. Los productos de ADN marcados con colorante Cy se purificaron mediante precipitación con etanol (2,5x volúmenes de la muestra de etanol 1/10 de volumen de la muestra de acetato de sodio, pH 5,2), seguido de purificación en columnas Autoseq G50 (Amersham Biosciences).

Hibridaciones de la matriz modelo.

La nomenclatura de la diana marcada es la siguiente:

E10100 Cy3 o E10100 Cy5 se refiere a un ADN diana de 270 pb que se ha marcado empleando la enzima E10, en donde el 100% de la dCTP presente en la reacción de marcación es Cy3-dCTP o Cy5-dCTP.

E1050 Cy3 o E1050 Cy5 es un ADN diana de 270 pb que se ha marcado empleando la enzima E10, en donde el 50% de la dCTP presente en la reacción de marcación es Cy3-dCTP o Cy5-dCTP.

E1010 Cy3 o E1010 Cy5 se refiere a un ADN diana de 270 pb que se ha marcado empleando la enzima E10, en donde el 10% de la dCTP presente en la reacción de marcación es Cy3-dCTP o Cy5-dCTP.

Pfu10 Cy3 o Pfu10 Cy5 se refiere a un ADN diana de 270 pb que se ha marcado empleando la enzima Pfu exo, en donde el 10% de la dCTP presente en la reacción de marcación es Cy3-dCTP o Cy5-dCTP.

Se realizaron las siguientes hibridaciones competitivas:

1) Pfu10 Cy3 frente a Pfu10 Cy5

2) E10100 Cy3 frente a E10100 Cy5

3) E1050 Cy3 frente a E1050 Cy5

4) E1010 Cy3 frente a E1010 Cy5

5) E1010 Cy3 frente a Pfu10 Cy5

6) E1010 Cy5 frente a Pfu10 Cy3

7) E1050 Cy3 frente a Pfu10 Cy5

8) E1050 Cy5 frente a Pfu10 Cy3

9) E10100 Cy3 frente a Pfu10 Cy5

10) E10100 Cy5 frente a Pfu10 Cy3

Las hibridaciones competitivas 1-4 se realizaron como hibridaciones testigo y las hibridaciones competitivas 5-10 se realizaron para medir la influencia de la densidad de la marcación sobre el nivel de señal fluorescente obtenida tras la hibridación.

Se prepararon 10 ng de productos marcados con Cy3 y Cy5 en 20 μl de tampón de hibridación (Tris-HCl 1 mM pH 7,4, pirofosfato tetrasódico 50 mM, 1x solución de Denhardt, 40% de formamida desionizada, 1% de NP-40, TDT 10 mM, 100 μg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado). Cada muestra se calentó a 95ºC durante 5 minutos, se centrifugó durante 2 min, se aplicó a la superficie de una matriz y se cubrió con un LifterSlip de 22 x 22 mm (Erie Scientific). Las hibridaciones se realizaron a 37ºC durante 16 h en una cámara de hibridación (Telechem). Las matrices se lavaron una vez con 2 x SSC/0,1% de SDS a temperatura ambiente durante 5 minutos, y dos veces con 1x SSC a temperatura ambiente durante 5 min. Los portaobjetos se secaron por centrifugación y se escanearon con un ArrayWoRx 'e' (Applied Precision Instruments) y un GenePix 4100A (Axon). Para garantizar la capacidad de comparación entre los portaobjetos, se utilizaron parámetros de barrido idénticos para todas las matrices. Las imágenes se analizaron usando GenePix Pro 4.1 (Axon Instruments) y las características de la matriz afectadas por artefactos locales se excluyeron manualmente de un análisis adicional.

Cálculo del aumento de la mejora de la señal.

Se calculó el log2(media de Cy3/media de Cy5) para cada característica de la matriz. Para cada tipo de sonda (Pfu o ADN de testículo de salmón) en cada experimento se calculó la proporción media en log2 para todas las características incluidas en la matriz (máx. 100 características de Pfu, es decir, 20 características por duplicado cada una en 5 diluciones de la sonda de Pfu; máximo de 100 características de ADN de esperma de salmón, es decir 20 características por duplicado cada una en 5 diluciones de la sonda de ADN de esperma de salmón; máximo de 20

características del tampón para depositar gotitas; máx. 20 zonas sin gotitas). Para normalizar los datos con el experimento testigo (Pfu10 Cy3 frente a Pfu10 Cy5), en donde se espera una señal equivalente en ambos canales, la proporción media en log2 de Pfu de los experimentos testigos, se restó de la de cada una de las otras comparaciones. Si las proporciones en log2 resultantes son positivas o negativas, representan mejoras en la señal de Cy3 y Cy5, respectivamente, en comparación con la marcación con Pfu con una concentración de colorante Cy del 10%. Las mejoras aumentadas para Cy3 y Cy5 son, por tanto, respectivamente, la inversa de la proporción media en log2 resultante y el complementario de la inversa de la proporción media en log2 resultante.

El barrido de portaobjetos con GenePix 4100A (Axon) y el análisis posterior de la señal fluorescente obtenida a partir de experimentos en los que se había hibridado fragmentos de ADN de E1010 Cy3, E1050 Cy3 o E10100 Cy3, dio como resultado una señal fluorescente 1,7, 2,4 o 1,6 veces mayor, respectivamente. El barrido de portaobjetos idénticos con un ArrayWoRx 'e' (Applied Precision Instruments) y el análisis posterior de la señal fluorescente dio como resultado incrementos en la señal fluorescente de 1,85 veces para E1010 Cy3, de 3,8 veces para E1050 Cy3 y de 4,5 veces para E10100. Véase la Figura 17.

El barrido de portaobjetos con GenePix 4100A (Axon) y el análisis posterior de la señal fluorescente obtenida a partir de experimentos en los que se habían hibridado fragmentos de ADN de E1010 Cy5 o E1050 Cy5, dio como resultado en todos una señal fluorescente 2,3 veces o 1,65 veces superior, respectivamente. El barrido de portaobjetos con GenePix 4100A (Axon) y el análisis posterior de la señal fluorescente obtenida a partir de experimentos en los que se habían hibridado fragmentos de ADN de E10100 Cy5, dio como resultado en todos una disminución de 2,2 veces de la señal fluorescente. El barrido de portaobjetos idénticos con un ArrayWoRx 'e' (Applied Precision Instruments) y el análisis posterior de la señal fluorescente dio como resultado en la señal fluorescente un aumento de 2,5 veces para E1010 Cy5, de 2,3 veces para E1050 Cy5 y de 0 veces para E10100. Véase la Figura 17.

Estos experimentos identifican que el aumento de la señal fluorescente es dependiente del tipo de escáner utilizado para obtener los datos, lo que sugiere que los espectros fluorescentes están alterados en las densidades de marcación más elevadas o que la extinción tiene una emisión a densidades más altas de marcación. Una densidad de marcación adicional es importante para obtener una señal máxima a partir de muestras marcadas directamente con E10. No se observa ningún aumento en la fluorescencia de fondo cuando se hibridan muestras de ADN altamente marcadas y el número de veces que aumenta la fluorescencia es lineal a través de la dilución seriada depositada en el portaobjetos.

Ejemplo 19: ADN altamente marcado mediante E10 con colorante Cy se puede digerir con enzimas de restricción.

Fragmentos de ADN de 270 pb de longitud fueron marcados con Cy3-dCTP o Cy5-dCTP mediante E10 en PCRs con los cebadores 36 y 37, respectivamente. Las PCRs se realizaron en 1x tampón de Pfu (KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-Cl 20 mM pH 8,75, de MgSO4 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 μg/ml de BSA; Stratagene Ltd), 10 ng de pASKpfuexo-5, 1% (v/v) de formamida, 1 μM de cada cebador, dATP 50 μM, dGTP 50 μM, dTTP 50 μM, Cy3dCTP o Cy5-dCTP 50 μM en un volumen de reacción de 50 μL de H2O. Las reacciones se iniciaron en caliente con E10 y se termociclaron en las siguientes condiciones: 94ºC durante 2 min 50 veces a 94ºC durante 10 s, 50ºC durante 10 s y 68ºC durante 20 min. Los productos de ADN marcados con colorante Cy se purificaron por precipitación con etanol (2,5x volúmenes de la muestra de etanol 1/10 de volumen de la muestra de acetato de sodio, pH 5,2), seguido de purificación en columnas AutoSeq G50 (Amersham Biosciences). Los productos de ADN marcados fueron digeridos con las enzimas MseI o Ddel (New England Biolabs). La secuencia de reconocimiento para MseI es TTAA y sería de esperar que restringiera el ADN si es bicatenario. Este resultó ser el caso (véase la Figura 18, carriles 3 y 6), e indica que el 100% del ADN marcado con Cy3 o Cy5 es, al menos en parte, bicatenario y con la forma B. La secuencia de reconocimiento para Ddel es CTNAG, se había anticipado que la presencia de una C modificada en este sitio (en la secuencia N también estará modificado en uno de los 2 sitios presentes) evitará la digestión del ADN marcado. Esto resultó ser el caso (véase la Figura 18, carriles 2 y 5). Que el ADN sea resistente a la digestión por restricción presenta una forma novedosa para eliminar el ADN plasmídico parental después de la selección, ya que el ADN marcado no tendrá actividad de restricción (si el sitio de reconocimiento de la enzima contiene una C) mientras que el ADN plasmídico parental sin marcar tendrá actividad de restricción, volviéndose un ADN no amplificable.

Ejemplo 20: Mutaciones de E10 seleccionadas a partir del repertorio de motivos A de Pfu y el repertorio de motivos C de Pfu, son sinérgicas.

Para determinar la contribución de las mutaciones seleccionadas con Cy5-dCTP a partir del repertorio de motivos A de Pfu (E399D, N400G, R407I y V337I) y la mutación adicional seleccionada a partir del repertorio de motivos A y C de Pfu (Y546H) a la actividad de E10, se introdujo la mutación Y546H en Pfu en ausencia de mutaciones del motivo

A. La mutación de E10, Y546H, se introdujo en pASKpfuexo-6 subclonando un fragmento BamHI / XhoI procedente de E10 en pASKpfuexo-6, generando de ese modo pASKpfuexo-6Y546H.

Lisados crudos de E10 (E399D, N400G, R407I, V337I, Y546H), clon 15 (E399D, N400G, R407I y V337I) y pASKpfuexo-6Y546H (Y546H) se prepararon dejando crecer los cultivos durante una noche en 2x TY (100 μg/ml de ampicilina) a 30ºC. La expresión proteica fue inducida por la adición de tetraciclina anhidra (0,4 μg/ml) al cultivo durante una noche y los cultivos se dejaron crecer durante 5 horas a 37ºC. Las células inducidas se sedimentaron

por centrifugación (13.000 g, 5 min) y lisados 10x se prepararon mediante resuspensión en 1/10º del volumen de cultivo de 1x tampón de Pfu (KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-Cl 20 mM pH 8,75, de MgSO4 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 μg/ml de BSA; Stratagene Ltd). Las células se lisaron incubando a 85ºC durante 10 min y los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 13.000 g durante 10 min.

En los lisados crudos así como en Pfuexo-(5 U; Stratagene) se normalizó la actividad con el cebador 48, tal y como se ha descrito en el ejemplo 7. Experimentos de ELISA diseñados para determinar la contribución de las mutaciones seleccionadas a partir del repertorio de motivos A de Pfu (E399D, N400G, R407I, y V337I) y el repertorio de motivos A y C de Pfu (Y546H) a la actividad de E10, se realizaron actividad con lisados crudos con actividad normalizada con el cebador 35 (requiere la incorporación de 8 Cs consecutivas antes de la incorporación de digoxigenina-11dUTP) y Cy3-dCTP o Cy5-dCTP tal y como se ha descrito en el ejemplo 7. Estos experimentos muestran que la contribución de las mutaciones del motivo A (y V337I) y las mutaciones del motivo C son sinérgicas (Figura 19).

En lisados crudos y Pfuexo-(5 U; Stratagene) se normalizó la actividad en PCRs con los cebadores 36 y 37 y 10 ng de pASKpfuexo-5 como molde. La normalización de la actividad de los lisados crudos en PCR se realizó del siguiente modo: 1 μM de cada cebador, 1% (v/v) de formamida, 100 μM de los dNTPs, 1x tampón de Pfu (KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-Cl 20 mM pH 8,75, de MgSO4 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 μg/ml de BSA; Stratagene Ltd). Las reacciones se termociclaron de la siguiente manera: 94ºC durante 2 min 25 veces a 94ºC durante 30 s, 55ºC durante 30 s y 72ºC durante 2 min. Las PCRs se configuraron con lisados crudos con la actividad normalizada y Pfuexo- (5 U; Stratagene), tal y como se ha descrito anteriormente. Las reacciones se termociclaron con tiempos de extensión en disminución (30 s o 10 s a 72ºC; véase la Figura 19). E10 es capaz de amplificar un fragmento de 270 pb con un tiempo de extensión de 10 s mientras que Pfuexo- (Stratagene), clones 15 y pASKpfuexo-6Y546H no pueden.

Ejemplo 21: Mutaciones del motivo A de E10 pueden compensar la disminución de la actividad de la polimerasa Tgo que contiene la mutación Therminator (A485L).

Las mutaciones del motivo A seleccionadas con Cy5-dCTP a partir del repertorio de motivos A de Pfu se introdujeron por iPCR en el gen de la polimerasa de ADN de la familia B procedente de Thermococcus gorgonarius (Tgo), en el que la función de detención del uracilo (V93Q; Fogg et al., 2002) había sido eliminada, así como la función exonucleasa 3'-5' (D141A y E143A; Derbyshire et al., 1995) con y sin la mutación Therminator (A485L; Gardener y Jack, 1999) con los cebadores 53 y 54, tal y como se ha descrito en el ejemplo 4 (véase la Figura 20). Mutaciones del motivo A y la presencia o ausencia de la mutación Therminator se confirmaron mediante secuenciación con el cebador 55 (véase la Figura 20).

Los clones de Tgo (V93Q, Exo-), motivo A de E10 Tgo (V93Q, Exo-, E398D, N399D, R406I), Tgo Therminator (V93Q, Exo-, A485L) y motivo A de E10 Tgo Therminator (V93Q, Exo-, A485L, E398D, N399D, R406I, A485L), se cultivaron durante una noche a 30ºC en 2x TY (Ampicilina 100 μg/mL). La expresión proteica se indujo el día siguiente, añadiendo tetraciclina anhidra (0,4 μg/ml) al cultivo de la noche y se permitió que los cultivos crecieran durante 4 horas a 37ºC. Las células inducidas se sedimentaron por centrifugación (13.000 g, 5 min) y se prepararon lisados 10x mediante resuspensión en 1/10º del volumen de cultivo de tampón de Pfu 1x (KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-Cl 20 mM pH 8,75, de MgSO4 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 μg/ml de BSA; Stratagene Ltd). Las células se lisaron mediante incubación a 85ºC durante 10 min y los restos celulares se eliminaron por centrifugación a 13.000 g durante 10 min.

Las PCRs se iniciaron en caliente con la adición de 2 μL de lisado crudo a una reacción que contenía: 10 ng de pASKTaq, cebador 56 1 μM, cebador 39 1 μM, 1x tampón de Pfu (KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-Cl 20 mM pH 8,75, de MgSO4 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 μg/ml de BSA; Stratagene Ltd), 1% (v/v) de formamida y dNTPs 100 μM en un volumen de reacción de 20 μL. Las condiciones del termociclado fueron las siguientes: 94ºC durante 2 min, 25 veces a 94ºC durante 30 s, 50ºC durante 30 s y 72ºC durante 2 min. Los productos de la PCR se analizaron por electroforesis en gel de agarosa sobre un gel de 1,2% (p/v) (véase la Figura 20). El clon Tgo Therminator no pudo amplificar el producto de 410 pb, mientras que si que pudo el clon Tgo Therminator en el cual se habían introducido las mutaciones del motivo A (E398D, N399D, R406I).

Ejemplo 22: Generación con PCR de ADN altamente marcado con FITC-12-dATP o biotina-16-dUTP utilizando E10.

Pfuexo-es capaz de realizar la PCR con 100% de sustitución de dATP por FITC-12-dATP o biotina-16-dUTP. Para evaluar si E10 conserva estas propiedades, las PCRs se iniciaron en caliente añadiendo 1 μL de E10 o 2,5 U de Pfuexo-(Stratagene) a una reacción de PCR. Para las PCRs con 100% de reemplazo de dATP por FITC-12-dATP, las reacciones contenían: 10 ng de pASKTaq, cebador 56 1 μM, cebador 39 1 μM, 1x tampón de Pfu (KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-Cl 20 mM pH 8,75, de MgSO4 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 μg/ml de BSA; Stratagene Ltd), 1% (v/v) de formamida y dNTPs 50 μM (-dATP) FITC-12-dATP 50 μM en un volumen de reacción de 12,5 μL. Las reacciones con 100% de reemplazo de dTTP con biotina-16-dUTP se realizaron tal y como se ha descrito anteriormente, pero con dNTPs que carecían de dTTP y biotina-16-dUTP 50 μM. Las condiciones del termociclado fueron las siguientes: 94ºC durante 2 min 50 veces a 94ºC durante 10 s, 60ºC durante 30 s y 68ºC durante 20 min. Los productos de la PCR se analizaron mediante electroforesis en gel sobre un gel de de agarosa al 1,2% (p/v) (véase la Figura 21) y mostraron que E10 es capaz de incorporar 100% de FITC-12-dATP o 100% de biotina-16

dUTP.

Ejemplo 23: Selección de variantes Pfu capaces de incorporar biotina-16-dUTP y clonación mediante iPCR.

Variantes de Pfu fueron seleccionadas a partir de genotecas con repertorios de motivos A de Pfu (véase el ejemplo 4) para estudiar la capacidad de incorporar biotina-16-dUTP. Las selecciones de spCSR se establecieron tal y como se describe en el ejemplo 3, sin embargo, la dTTP fue reemplazada completamente por 100 μM de biotina-16-dUTP. Los cebadores que se apareaban en 5' y 3' de la región diversificada, fueron empleados en las selecciones de spCSR.

Las selecciones de spCSR con biotina-16-dUTP procedentes de la genoteca de motivos A de Pfu (94ºC durante 5 min; 20 veces a 94ºC durante 30 s, 50ºC durante 1 min y 72ºC durante 10 min; 1 vez a 65ºC durante 10 min) se llevaron a cabo usando los cebadores 57 y 37, tal y como se ha descrito en el ejemplo 3. La fase acuosa se extrajo tal y como se ha descrito en el ejemplo 3 y los productos de selección purificados se volvieron a amplificar con PCR (94ºC 5 min; 50ºC 5 min; 72ºC 5 min; 26 veces a 94ºC durante 30 s, 50ºC durante 1 min y 72ºC durante 3 min; 1 vez a 65ºC 10 min) usando los cebadores 58 y 37, tal y como se ha descrito en el ejemplo 3. Los productos de la selección amplificados de nuevo se purificaron en gel (kit de extracción en gel QIAquick, Qiagen) y se utilizaron como un cebador en una reacción de iPCR con una cantidad equimolar de cebador 59 y 10 ng de pASKpfuexo-7 como molde. Las reacciones de iPCR se realizaron como sigue: brevemente, las reacciones de iPCR se iniciaron en caliente mediante la adición de 3,5 U de polimerasa Expand High Fidelity (Roche) a una mezcla de PCR [10 ng de molde plasmídico, cebadores (cantidad equimolar dependiente del rendimiento del producto de la selección), dNTPs (0,2 mM), en 1x tampón Expand High Fidelity con MgCl2 (Roche)]. Las reacciones se termociclaron [94ºC durante 4 min; 19 veces (94ºC durante 20 s, 65ºC durante 20 s - 1ºC/ciclo, y 68ºC durante 10 min)] en este punto, 40 μM de cada uno de los cebadores 58 y 59 y 3,5 U adicionales de polimerasa Expand High Fidelity (Roche), se añadieron a las iPCRs, las cuales se sometieron a termociclado adicional [15 veces (94ºC durante 20 s, 50ºC durante 20 s, 68ºC durante 10 min); 15 veces (94ºC durante 20 s, 50ºC durante 20 s, 68ºC durante 10 min + 15 s/ciclo)]. Las reacciones de iPCR se purificaron con un kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) y se eluyeron en 50 μL de H2O. El ADN purificado fue digerido por restricción durante una noche con Dpnl (New England Biolabs) para eliminar el molde plasmídico introducido. Las muestras restringidas de ADN se purificaron con un kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) y se eluyeron en 50 μL de H2O. El ADN purificado fue digerido por restricción durante una noche con BsaI (New England Biolabs) después de lo cual las reacciones se purificaron con un kit de purificación de PCR QIAquick (Qiagen) y se eluyeron en 50 μL de H2O. Cincuenta μL del ADN digerido por restricción se ligaron durante una noche a 16ºC 1600 U de ligasa de ADN de T4 (New England Biolabs) en 1x tampón de ligadas de ADN de T4 (New England Biolabs) con un volumen final de 60 μL. Las reacciones de ligación se extrajeron con un volumen igual de fenol/cloroformo (4:1 v/v), se precipitaron con etanol y luego se electroporaron en células de E. coli Ace6 o TG1TR que se colocaron sobre placas con 0,1 mg/mL de 2xTY/Amp.

Ejemplo 24: Variantes de Pfu seleccionadas a partir de la genoteca de motivos A con biotina-16-dUTP.

Las variantes de Pfu capaces de incorporar significativamente biotina-16-dUTP en comparación con la capacidad de la enzima de tipo silvestre, fueron seleccionadas a partir de la genoteca con repertorio de motivos A de Pfu (véase el ejemplo 23) con cebadores que se aparean en 5' y 3' del motivo A (véase el ejemplo 5). Los clones que mostraban una capacidad significativamente mayor para incorporar biotina-16-dUTP, fueron clasificados mediante un ensayo de extensión con ELISA, con el cebador 60 (véase el ejemplo 7; Figura 22). Los ELISAs se realizaron esencialmente tal y como se ha descrito en el ejemplo 7, sin embargo la reacción de extensión contenía 20 μM de dCTP y dGTP, dATP 18 μM y biotina-16-dUTP 20 μM. El dUTP marcado con DIG en la reacción de extensión se sustituyó con fluoresceína 12-dATP 2 μM. La incorporación de fluoresceína 12-dATP se detectó mediante fragmentos Fab antifluoresceína-POD (Roche). Los clones positivos se identificaron con el kit de sustrato fluorogénico de peroxidasa de QuantaBlu® (Pierce). Los clones positivos fueron secuenciados con el cebador 36 y las mutaciones se identificaron en la región diversificada (Figura 23).

Ejemplo 25: Análisis de la hibridación in situ fluorescente (FISH) con sondas altamente marcadas con FITC, Cy3 o Cy5 generadas por E10.

Extensiones metafásicas procedentes de la línea celular humana de cáncer de páncreas Suit-2, se prepararon sobre portaobjetos de vidrio de Super Frost (BDH), y se desnaturalizaron mediante incubaciones en 50% de formamida/SSC 1x durante 1 min 20 s a 70ºC y en etanol helado durante 3 min. Los cromosomas se deshidrataron mediante incubaciones durante 3 minutos, en cada uno de los etanoles al 70%, 90% y 100% y se secaron al aire a 37ºC hasta la hibridación.

Las sondas de ADN se generaron mediante WRN (chr8:31,150,398 -31,150,474; cebadores 61 y 62, un fragmento de 766 pb marcado con Cy5-dCTP 32% de GC), DCTN6 (chr8:30,133,979-30,134,732; cebadores 63 y 64, un fragmento de 754 pb marcado con FITC-12-dATP 59% de AT) o NRG1 (chr8:32,718,891-32,719,828; cebadores 65 y 66, un fragmento de 938 pb marcado con Cy3-dCTP 42% de GC). Los plásmidos que contienen los fragmentos que se van a marcar se utilizaron como moldes en PCRs en donde 50% de los dNTPs sin marcar fueron sustituidos por su equivalente marcado. Las PCRs se iniciaron en caliente añadiendo 1 μL de E10 purificada a una mezcla de PCR [10 ng de molde de ADN plasmídico, cebadores (0,4 μM cada uno), tampón Pfu 1x (KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10

mM, Tris-Cl 20 mM pH 8,75, de MgSO4 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 μg/ml de BSA; Stratagene Ltd), formamida y dNTPs (0,05 mM cada uno, equivalente sin marcar 0,025 mM), Cy3-dCTP o Cy5-dCTP o FITC-dATP 0,025 mM]. Las PCRs para generar sondas de ADN marcadas para NRG1 o WRN se realizaron con una concentración de formamida final de 2% (v/v) y las PCRs para generar sondas de ADN marcadas para DCTN6 se realizaron con una concentración final de formamida del 1% (v/v). Las reacciones se termociclaron (94ºC durante 2 min; 50 veces a 94ºC durante 10 s, apareamiento durante 1 min y 72ºC durante 20 min). Las temperaturas de apareamiento fueron 60ºC, 55ºC y 58ºC para NRG1, WRN y DCT, respectivamente. Las sondas marcadas se purificaron por precipitación con etanol con 2,5 x vol de etanol 1/10 de volumen de NaAc (pH 5,2) y se resuspendieron en 20 μL de H2O, seguido de purificación en columna G50.

Las sondas marcadas con colorantes Cy o FITC (100-150 ng) se mezclaron con 3 μL de ADN humano Cot-1 (100 ng/μL; Roche) en 14 μL de tampón de hibridación (50% (v/v) formamida, 2x SSC Tris-HCl 10 mM pH 7,5, 0,1% (p/v) de Tween 20, 10% de sulfato de dextrano) y se incubaron a 37ºC durante 30 min. La mezcla de las sondas se desnaturalizó a 95ºC durante 10 min, se enfrió sobre hielo durante 2 min y se incubó a 37ºC durante 1 h. Las sondas se aplicaron a extensiones metafásicas desnaturalizadas y se cubrieron con un cubreobjetos de cristal. Después de hibridar a 37ºC durante una noche, los portaobjetos se sumergieron en 1x SSC para eliminar los cubreobjetos, se lavaron 2 veces 5 min en formamida al 50%/2x SSC a 42ºC y 2 veces 5 min en 1x SSC. Los portaobjetos se incubaron a continuación en 4x SSC, 0,5% de BSA (Sigma), 0,05% de Tween durante 5 min, se montaron con medio de montaje de Vectashield con DAPI (Laboratorios Vectashield), y se observaron con un microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse E800. Las señales de Cy3, Cy5 y FITC procedentes de estas sondas excepcionalmente cortas, se colocalizaron en un único cromosoma en 5 de las 5 células analizadas y se podían detectar directamente, sin necesidad de una amplificación posterior de la señal (Figura 24).

Ejemplo 26: Propiedades del CyADN.

Las propiedades fisicoquímicas del CyADN están alteradas significativamente en comparación con el ADN natural.

El análisis de la temperatura de fusión de un fragmento de 100 pb (70% de GC) marcado con E10 en PCRs en las que se reemplazó el 100% de la dCTP por cualquiera de Cy3-dCTP o Cy5-dCTP, reveló que el CyADN se fusiona a una temperatura más baja que el ADN natural. Fragmentos de ADN (100 pb, 70% de GC) para el análisis de la temperatura de fusión se amplificaron con los cebadores 67 y 68. Las reacciones se realizaron en tampón de Pfu 1x (Stratagene) que contenía 10 ng de molde (pASKwtTaq; Ghadessy et al. 2001), 1% de formamida (v/v), cebadores (0,4 μM cada uno), dNTPs (50 μM cada uno). Los fragmentos de ADN marcados con colorante Cy se amplificaron con E10 y 100% de la dCTP fue reemplazada por Cy3-dCTP o Cy5-dCTP. Las reacciones se iniciaron en caliente con E10 y se termociclaron de la siguiente manera: 94ºC 2 min; 50 veces (94ºC 10 s, 50ºC 10 s, 68ºC 20 min). Los fragmentos de ADN marcados con colorante Cy se concentraron y se purificaron por precipitación con etanol, seguida de una purificación adicional con columnas G50 de illustra Microspin G-50 (GE Healthcare). Las reacciones para generar ADN testigo sin marcar se iniciaron en caliente con Pfu Turbo (Stratagene 2,5 U) y se termociclaron de la siguiente manera: 94ºC 2 min, 30 veces (94ºC 30 s, 50ºC 1 min, 72ºC 1 min). Los productos sin marcar de la PCR se purificaron con columnas de purificación de PCR de QIAquick (QIAGEN Chatsworth CA), seguido de extracción en gel con un kit de extracción en gel de QIAquick (QIAGEN Chatsworth CA). Las temperaturas de fusión de los fragmentos de ADN marcados y testigos (1 μM) se determinaron con un Perkin Elmer Lambda 40, en un intervalo de temperatura de 60ºC-100ºC. El ADN sin marcar se fusiona a 90ºC, mientras que el ADN marcado con Cy5-dCTP se fusiona a 87ºC y el marcado con Cy3-dCTP se fusiona a 84ºC. Esto se corresponde con lo que han observado otros y lo que hemos observado en experimentos con micromatrices modelo, en donde las temperaturas de hibridación y las restricciones del lavado requieren una reducción. Una fusión adicional del CyADN es menos cooperativa que el ADN natural, lo que refleja probablemente la presencia de grupos adicionales en el dúplex.

No es posible purificar eficazmente el CyADN con resinas de sílice en presencia de sales caotrópicas o mediante extracción con fenol en presencia de concentraciones de NaCl, que se encuentran comúnmente en algunos tampones de enzimas de restricción (por ejemplo, NEB3; New England Biolabs). A diferencia del ADN natural, ADN marcado al 100% con Cy3 se reparte completamente en la fase orgánica en presencia de NaCl 200 mM en la extracción con fenol, mientras que ADN marcado al 100% con Cy5 se reparte completamente en la fase orgánica en presencia de NaCl 100 mM. El CyADN se puede recuperar a partir de la fase de fenol en la fase acuosa, ya sea por dilución de la fase que contiene sales con H2O o eliminando la fase acuosa que contiene sales, y sustituyéndola por un volumen equivalente de H2O. El CyADN no se puede clonar lo que refleja una incapacidad de las enzimas polimerasas naturales de E. coli para replicar este ADN artificial. Sin embargo, es posible precipitar el CyADN con etanol.

El CyADN muestra una disminución de la movilidad electroforética en comparación con un fragmento de ADN natural amplificado con los mismos cebadores. Además, el ADN modificado con colorante Cy no se muestra fluorescente con bromuro de etidio. Presumiblemente, la presencia de las modificaciones en la posición 5' de la pirimidina, impide estéricamente la intercalación. Sin embargo, a pesar de la ausencia de intercalación de bromuro de etidio, el CyADN es, al menos en parte, bicatenario y en forma B, tal y como se indica por su digestión con enzimas de restricción, tales como MseI, cuya secuencia de reconocimiento está exenta de Cs modificadas. La presencia de una C modificada con colorante Cy en el sitio de reconocimiento de la enzima de restricción evita la digestión con restricción. Otras evidencias de que el CyADN está en forma bicatenaria B, se obtuvieron por Microscopia de Fuerza

Atómica (AFM). Los resultados de la AFM se muestran en la Figura 26. Los fragmentos de ADN (314 pb) para el análisis por AFM fueron amplificados por PCR con los cebadores 69 y 70. Las reacciones se realizaron en tampón de Pfu 1x (Stratagene) que contenía 10 ng de molde (pASKpfuexo-5), 1% de formamida (v/v), cebadores (1 μM cada uno), dNTPs (50 μM cada uno). Los fragmentos de ADN marcados con colorante Cy se amplificaron con E10 y 100% de las dCTPs fue reemplazado por Cy3-dCTP o Cy5-dCTP (GE Healthcare). Las reacciones se iniciaron en caliente con E10 y se termociclaron de la siguiente manera: 94ºC 2 min; 50 veces (94ºC 10 s, 50ºC 10 s, 68ºC 20 min). Los fragmentos de ADN marcados se concentraron y se purificaron por precipitación con etanol, seguida de una purificación adicional con columnas illustra Microspin G-50 (GE Healthcare). Las reacciones para generar ADN testigo sin marcar se iniciaron en caliente con Pfu exo- (2,5 U Stratagene) y se termociclaron de la siguiente manera: 94ºC 2 min; 25 veces (94ºC 30 s, 50ºC 30 s, 72ºC 2 min). Los productos de la PCR sin marcar se purificaron con columnas de purificación de PCR QIAquick (QIAGEN Chatsworth CA).

Se midieron las longitudes y las alturas (anchura) de las moléculas individuales de CyADN amplificadas con E10 en PCRs, en las que el 100% de las dCTP se había sustituido por Cy3-dCTP o Cy5-dCTP. Para la formación de imágenes con AFM, los fragmentos de ADN modificados y testigos se diluyeron hasta una concentración de 1 nM en tampón X (Tris-HCl 10 mM pH 7,4, MgCl2 10 mM, NaCl 10 mM). Se demostró que era difícil preparar las muestras de CyADN para el análisis sobre fragmentos de mica, debido presumiblemente a la naturaleza hidrófoba de las muestras. Sin embargo, era posible analizar las muestras sobre fragmentos de mica que se habían funcionalizado con poIi-L-lisina. La mica recubierta con poli-L-lisina se formó incubando 50 μL de 0,001% de poli-L-lisina (Sigma, Poole, Reino Unido) sobre mica recién cortada (Goodfellows, Huntingdon, Reino Unido) durante 10 min, seguido de aclarado con 10 ml de agua MiIIiQ (Millipore, Billerica, MA), y secando por soplado con una corriente de nitrógeno. Los fragmentos de ADN se depositaron sobre la mica revestida con poli-L-lisina incubando una gota de 10 μL de solución que contenía ADN sobre la superficie durante 4 min, a continuación la muestra se lavó con 10 mL de agua MiIIiQ y se secó por soplado con una corriente de nitrógeno. La formación de imágenes con AFM se realizó utilizando un AFM multimodo de Veeco con un controlador Nanoscope IlIa (Veeco, Santa Barbara, CA) actuando en modo de repiqueteo, usando voladizos de nitruro de silicio de Olympus CA 160TS con una frecuencia de resonancia de aproximadamente 350 kHz. Las imágenes se adquirieron con una resolución de 512*512 pixeles, con un tamaño de barrido de 3 μm, las tasas de barrido fueron 1,97 Hz. Las imágenes se acoplaron después de la captura para eliminar las compensaciones Z y la inclinación de la muestra. La longitud del contorno del ADN de las moléculas individuales se midió aproximando la estructura principal del ADN como una serie de líneas rectas, utilizando el programa Nanoscope (Veeco). La distancia de extremo a extremo del ADN se midió mediante el trazado de la distancia en línea recta entre los dos extremos de ADN.

Se midieron las longitudes y las alturas de 40 moléculas de ADN no modificadas, 40 moléculas modificadas con Cy3-dCTP y 71 moléculas con Cy5-dCTP. La distribución en la longitud de las moléculas de ADN modificadas con Cy5-dCTP no es gaussiana, esto podría ser debido a la presencia de productos de terminación más pequeños presentes en la amplificación por PCR, dificultando la interpretación de los datos. Es posible, sin embargo, llegar a la conclusión de que hay una diferencia significativa en la longitud de la molécula entre las moléculas de ADN no modificadas y las modificadas con Cy3-dCTP (104,0 nm ± 0,3 frente a 97,5 nm ± 0,25). La altura (anchura) de las moléculas de ADN marcadas con Cy3-dCTP y Cy5-dCTP es significativamente mayor que la de las moléculas de ADN no modificadas (véase la Figura 19). Las moléculas de ADN marcadas con Cy5-dCTP son más anchas (0,78 nm ± 0,008) que las moléculas de ADN marcadas con Cy3-dCTP (0,620 nm ± 0,008), lo que concuerda con que Cy5 es un fluoróforo más grande que Cy3. Además, la longitud de persistencia (rigidez) de las moléculas de ADN no modificadas y las modificadas con Cy5-dCTP se representó usando datos procedentes de la distancia media de extremo a extremo obtenidos, en cada caso a partir de 61 moléculas de ADN (es decir, una línea recta desde un extremo al otro, en lugar de seguir la estructura principal del ADN) - cuanto más larga era la distancia promedio de un extremo a otro, más rígida era la molécula. Se puede concluir que tanto los fragmentos de ADN modificados con Cy5-dCTP, como los fragmentos sin modificar se pueden representar por tener la misma longitud de persistencia. Esto supone que ambos fragmentos se unen a la superficie de la misma manera, ya que una unión más débil es más probable que permita que la molécula se equilibre mejor en la superficie, lo que da como resultado un <R>2 más largo. Se ha demostrado previamente que el ADN modificado se une más débilmente a una superficie de mica sin funcionalizar, por lo tanto los datos de la longitud de persistencia deben interpretarse con precaución.

Ejemplo 27: FISH y FISH con fibras.

Una densidad de marcación elevada no se traducirá necesariamente en un aumento de la fluorescencia debido a los efectos de reabsorción y reemisión y a la extinción. Experimentos en micromatrices modelo identificaban que fragmentos de PCR marcados en PCRs en las que el 50% de la dCTP se había reemplazado por Cy3-dCTP o Cy5dCTP, daban como resultado una señal fluorescente mayor que los fragmentos marcados con 100% de sustitución (véase el Ejemplo 18). Por consiguiente, se generaron sondas utilizadas en FISH y FISH con fibras en PCRs, en las que se había reemplazado el 50% del nucleótido sin marcar por su equivalente fluorescente. Pfu exo- es capaz de incorporar FITC-12-dATP cuando está presente al 100% en las PCRs. E10 conserva esta capacidad (véase el Ejemplo 22)

FISH.

La FISH se realizó tal y como se describe en el Ejemplo 25.

FISH con fibras.

La FISH con fibras se basa en el método descrito por Mann et al. (1997). Brevemente, 10 μL de preparación de metafase fijada procedente de la línea celular de piel humana DRM, se frotó por el ancho de un portaobjetos de recubierto con polilisina (Polyprep, Sigma, Dorset, Reino Unido) aproximadamente 1 cm desde la parte superior de la superficie utilizable del portaobjetos y se dejó secar durante un minuto, antes de sumergirlo verticalmente en tampón de lisis (0,5% (p/v) de SDS, EDTA 50 mM, Tris-HCl 0,2 M pH 7,4) en un frasco Coplin y se dejó reposar con la preparación de células justo debajo de la superficie del tampón. Después de 5 min, etanol al 94% se dejó correr lentamente sobre la superficie del tampón para formar una capa superior hasta que todo el portaobjetos estaba cubierto. Después de incubar durante 10 min, el portaobjetos se retiró lentamente de las soluciones y de manera constante en un ángulo de 30º, se sumergió en etanol al 70%, se incubó durante 30 min, y se deshidrató en una serie con etanol. Los portaobjetos se hibridaron y se analizaron las extensiones metafásicas.

Se generaron sondas de ADN de aproximadamente 900 pb de longitud para el gen NRG1: Sonda 1 (cebadores 71 y 72; chr8:31626471+31627403), sonda 2 (cebadores 73 y 74; chr8:31628404+31629322), sonda 3 (cebadores 75 y 76; chr8: 31639299+31640223), sonda 4 (cebadores 77 y 78; chr8:31645286+31646222), sonda 5 (cebadores 79 y 80; chr8:31650233+31651127), sonda 6 (cebadores 81 y 82; chr8:31653626+31654580), sonda 7 (cebadores 83 y 84; chr8:31661123+31662023). Las sondas 1, 4 y 6 se marcaron con FITC-dATP (Perkin Elmer) y las sondas 2, 3, 5 y 7 se marcaron con Cy5-dCTP (GE Healthcare). Los plásmidos que contenían los fragmentos que se iban a marcar se utilizaron como moldes en PCRs en las que el 50% de los dNTPs sin marcar se había reemplazado por su equivalente marcado. Las PCRs se iniciaron en caliente mediante la adición de 1 μL de E10 purificada a una mezcla de PCR [10 ng de molde de ADN plasmídico, cebadores (1 μM cada uno), tampón de Pfu 1x (Stratagene Ltd), 2% de formamida (v/v) y dNTPs (0,05 mM cada uno, equivalente sin marcar 0,025 mM), Cy5-dCTP o dATP-FITC 0,025 mM]. Las reacciones se termociclaron (94ºC durante 2 min; 50 veces a 94ºC durante 10 s, reasociación durante 1 min, y 72ºC durante 20 min). Las temperaturas de apareamiento eran de 55ºC para las sondas 1, 2, 6 y 7, 60ºC para la sonda 3, 52ºC para la sonda 4 y 58ºC para la sonda 5. Las sondas marcadas se purificaron por precipitación con etanol con 2,5x volúmenes de etanol 1/10 de volumen de NaAc (pH 5,2) y se resuspendieron en 20 μL de H2O, seguido de purificación en columna S-300 (GE Healthcare). Los portaobjetos se hibridaron y se analizaron las extensiones metafásicas. La fluorescencia se pudo detectar a partir de todas estas sondas excepcionalmente cortas, incluyendo las separadas por tan solo 1 kb (sondas 1 y 2), sin necesidad de amplificar la señal (véase la Figura 27).

Ejemplo 28: Detección sensible en un dispositivo de microfluidos.

Fragmentos de ADN de 270 pb de longitud fueron marcados con Cy3-dCTP o Cy5-dCTP mediante E10 en PCRs con los cebadores 36 y 37, respectivamente. Las PCRs se realizaron en tampón de Pfu 1x (KCl 10 mM, (NH4)2SO4 10 mM, Tris-Cl 20 mM pH 8,75, de MgSO4 2 mM, 0,1% de Triton X-100, 100 μg/ml de BSA; Stratagene Ltd), 10 ng de pASKpfuexo-5, 1% (v/v) de formamida, 1 μM de cada cebador, dATP 50 μM, dGTP 50 μM, dTTP 50 μM, Cy3dCTP o Cy5-dCTP 50 μM en un volumen de reacción de 50 μL de H2O Las reacciones se iniciaron en caliente con E10 y se termociclaron con las siguientes condiciones: 94ºC durante 2 min; 50 veces a 94ºC durante 10 s, 50ºC durante 10 s y 68ºC durante 20 min. Los productos de ADN marcados con colorante Cy se purificaron mediante precipitación con etanol (2,5x volúmenes de la muestra de etanol 1/10 de volumen de la muestra de sodio acetato, pH 5,2), seguida de purificación en columnas AutoSeq G50 (Amersham Biosciences).

Para la detección a niveles moleculares individuales o próximos a los mismos, se preparó una solución que contenía 5 pg/μL de cada uno de los productos en agua de la PCR de 270 pb marcados al 100% con Cy5-dCTP y al 50% con Cy3-dCTP. Basándose en la secuencia del producto de la PCR, cada molécula bicatenaria debe ser portadora de un promedio de 102 marcaciones con Cy3 o 102 marcaciones con Cy5.

Esta solución se condujo a través de un capilar de sílice fusionado (diámetro interno ~40 μm) a 30 μL/h, utilizando una bomba de jeringa. La fluorescencia se detectó en un punto fijo en el interior del lumen del capilar, usando una unidad de medida óptica que consistía en una luz de láser de 532/635 nm alimentada con una fibra óptica de sílice en modo sencillo (3/125 μM). Al salir de la fibra, la luz se recogía y se concentraba sobre la muestra usando una combinación de lentes asféricas de 0,3 NA y 0,65 NA lentes asféricas, siendo esta última tanto el objetivo de enfoque y colector para la fluorescencia. La distancia de trabajo del objetivo de la muestra fue de aproximadamente 1,5 mm, y el campo de intensidad en el volumen focal tenía un perfil guassiano con un diámetro 1/e de aproximadamente 2,5 μM (volumen focal eficaz de aproximadamente 8 μm3, o 8fl). La luz recogida se filtró o reflejaba la energía del láser usando una serie en cascada de filtros reflectantes/transmisivos y a continuación se enfocó en una fibra receptora que transmitía la luz a un módulo SPCM de Perkin Elmer para la cuantificación final de la intensidad. Las cuentas para la fluorescencia de Cy3 (570 nm, ancho de banda ~25 nm) y la fluorescencia de Cy5 (670 nm, ancho de banda ~25 nm) se recogieron en periodos consecutivos de 20 μs y se promediaron en una ventana deslizante (ponderada al centro) de 40 períodos.

Una sección representativa de la salida, que abarca un total de 0,2 s, se muestra en la Figura 28. Puesto que las moléculas marcadas pueden pasar ya sea por el centro o por la periferia del volumen de detección gaussiano, las alturas de los picos se espera que sean variables en este sistema. Asimismo, las superposiciones entre los espectros de emisión de Cy3 y Cy5, y el ancho de banda finito de los filtros de detección, significa que la emisión de Cy3 provoca alguna señal en el canal de Cy5 (aunque no viceversa). Esta traza representa una detección fuerte de

una molécula marcada con Cy5 (aproximadamente en el intervalo de 5500), y de una molécula marcada con Cy3 (aproximadamente en el intervalo de 8700); picos más pequeños son visibles, en particular para Cy5 - estos se cree que representan moléculas marcadas que pasan a través de los bordes del volumen de detección gaussiano.

La frecuencia de los eventos de detección es aproximadamente la esperada si se hubieran detectado moléculas 5 marcadas aisladas (en vez de agregados de moléculas múltiples).

Aunque la invención se ha descrito en conexión con realizaciones específicas preferidas, debe entenderse que la invención tal y como se reivindica, no debe limitarse indebidamente a tales realizaciones específicas. En efecto, diversas modificaciones de los modos descritos para llevar a cabo la invención, que son obvias para los expertos en biología molecular o campos relacionados, se pretende que estén dentro del alcance de las reivindicaciones.

10 Clones selected using the methods described herein, DNA and amino acid sequences:

Secuencia de aminoácidos de E10 - SEQ ID NO 1:

Secuencia de nucleótidos de E10 - SEQ ID NO 2:

Clones seleccionados con biotina-16-dUTP. Bio187-SEQ ID NO 3:

Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 4:

Secuencia de Bio-120-nucleótidos: SEQ ID NO 5:

Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 6:

Secuencia de Bio32-nucleótidos: SEQ ID NO 7:

Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 8:

Secuencia de Bio33-nucleótidos: SEQ ID NO 9:

Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 10:

Clon 3 de la genoteca de motivos A-B de Pfu seleccionado con Cy5-dCTP. SEQ ID NO 11:

Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 12:

Clon 4 de la genoteca de motivos A-B de Pfu seleccionado con Cy5-dCTP. SEQ ID NO 13:

Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 14:

Clon 9 de la genoteca de motivos A-B de Pfu seleccionado con Cy5-dCTP. SEQ ID NO 15:

Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 16:

Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 18:

Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 20:

Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 22:

Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 24:

Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 26:

Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 28:

Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 30:

Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 32:

Clon 1 de la genoteca de motivos A-C de Pfu seleccionado con Cy3-dCTP. SEQ ID NO 33:

Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 34:

Clon 2 de la genoteca de motivos A-C de Pfu seleccionado con Cy3-dCTP. SEQ ID NO 35:

Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 36:

Clon 4 de la genoteca de motivos A-C de Pfu seleccionado con Cy3-dCTP. SEQ ID NO 37:

Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 38:

Clon 5 de la genoteca de motivos A-C de Pfu seleccionado con Cy3-dCTP. SEQ ID NO 39:

Secuencia de aminoácidos: SEQ ID NO 40:

Secuencia de ADN del clon 23 seleccionado con Cy5-dCTP a partir de la genoteca de motivos A de Pfu SEQ ID NO

41:

Secuencia de aminoácidos del clon 23 seleccionado con Cy5-dCTP a partir de la genoteca de motivos A de Pfu SEQ ID NO 42:

Secuencia de ADN del clon 15 seleccionado con Cy5-dCTP a partir de la genoteca de motivos A de Pfu SEQ ID NO

43: Secuencia de aminoácidos del clon 15 seleccionado con Cy5-dCTP a partir de la genoteca de motivos A de Pfu SEQ ID NO 44:

Secuencia de ADN del clon 55 seleccionado con Cy5-dCTP a partir de la genoteca de motivos A de Pfu SEQ ID NO

45: Secuencia de aminoácidos del clon 55 seleccionado con Cy5-dCTP a partir de la genoteca de motivos A de Pfu SEQ ID NO 46:

10 Secuencia de ADN del clon AH12 seleccionado con Cy5-dCTP a partir de la genoteca de motivos A de Pfu SEQ ID

NO 47:

Secuencia de aminoácidos del clon AH12 seleccionado con Cy5-dCTP a partir de la genoteca de motivos A de Pfu SEQ ID NO 48:

Secuencia de ADN de la polimerasa de ADN Pfu de tipo silvestre (5’-3’) SEQ ID NO 133: Secuencia de aminoácidos de la polimerasa de ADN Pfu de tipo silvestre (5’-3’) SEQ ID NO 134

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Cebadores

Subrayado el 90% de la secuencia de tipo silvestre, 10% de otra secuencia.

Subrayado el 90% de la secuencia de tipo silvestre, 10% de otra secuencia.

Subrayado el 90% de la secuencia de tipo silvestre, 10% de otra secuencia. En donde P5 es biotina-dT.

En donde P5 es biotina-dT.

En donde P5 es biotina-dT.

En donde P5 es biotina-dT. En donde P5 es biotina-dT.

Claims (17)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Una polimerasa de ADN modificada genéticamente con una gama más amplia de sustratos siendo capaz la polimerasa de incorporar una mayor presencia de un análogo de nucleótido marcado con colorante en un ácido nucleico sintetizado por esa polimerasa modificada genéticamente, en comparación con la polimerasa de tipo silvestre a partir de la cual se obtiene, en donde la polimerasa se describe con cualquier secuencia de aminoácidos que tiene al menos 70% de identidad con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en las siguientes secuencias: 1, 4, 8, 12, 14, 16, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46 y 48, y que comprende las siguientes mutaciones por sustitución en comparación con la secuencia de aminoácidos de Pfu de tipo silvestre: N400G/N400D y R407I.

2. 2.

   Una polimerasa modificada genéticamente según la reivindicación 1, en la que el análogo de nucleótido marcado con colorante es un análogo de nucleótido marcado fluorescente.

3. 3.

   Una polimerasa modificada genéticamente según la reivindicación 2, en la que el marcador fluorescente se selecciona entre el grupo que consiste en colorante Alexa Fluor®, dietilaminocumarina, tetrametilrodamina, N-metilantraniloilo, trinitrofenilo, derivados de eteno, fluoresceína o carbocianina.

4. 4.

   Una polimerasa modificada genéticamente según la reivindicación 3, en la que el análogo de nucleótido marcado con colorante es un análogo de nucleótido marcado con carbocianina.

5. 5.

   Una polimerasa modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el análogo de nucleótido marcado con colorante se selecciona entre el grupo que consiste en Cy5-dNTP y Cy3dNTP.

6. 6.

   Una polimerasa modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que el análogo de nucleótido marcado con colorante se selecciona entre el grupo que consiste en Cy5-dCTP o Cy3-dCTP.

7. 7.

   Una polimerasa modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que la polimerasa tiene una o varias de las siguientes mutaciones: V337I, E399D y/o Y546H.

8. 8.

   Una polimerasa modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que está descrita por la secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO 1 y se designa E10 en esta memoria, o es al menos 70%, 80%, 90% o 99% idéntica a la que se designa E10 en la presente memoria y se describe en SEQ ID NO 1.

9. 9.

   Una secuencia de nucleótidos aislada que codifica una polimerasa modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, y que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 70% de identidad con una secuencia seleccionada entre el grupo que consiste en SEQ ID NOs 2, 3, 5, 9, 13, 15, 17, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 43, 45 y 47.

10. 10.

    Una polimerasa de ADN modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde la polimerasa de ADN modificada genéticamente (i) se obtiene a partir de una polimerasa de ADN mediante sustitución, deleción o inserción de uno o varios aminoácidos; y/o (ii) se selecciona a partir del grupo que consiste en polimerasas polA, polimerasas polB y polimerasas pfu.

11. 11.

    Un método para la incorporación de análogos de nucleótidos marcados con colorante en ácido nucleico recién sintetizado, comprendiendo el método el uso de una polimerasa modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

12. 12.

    El uso de una polimerasa modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la síntesis de ácido nucleico que comprende la detección de análogos de nucleótidos marcados con colorante.

13. 13.

    El uso según la reivindicación 12, en donde el análogo de nucleótido marcado con colorante es un análogo de nucleótido marcado con colorante fluorescente.

14. 14.

    El uso según la reivindicación 13, en donde el análogo de nucleótido marcado con colorante fluorescente se selecciona entre el grupo que consiste en los siguientes: Cy3-CTP, Cy5-CTP.

15. 15.

    El uso de una polimerasa modificada genéticamente con una gama más amplia de sustratos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y 10, en una o varias técnicas biotecnológicas en el grupo que consiste en las técnicas siguientes: reacción en cadena de la polimerasa (PCR); análisis con micromatrices (tal como análisis con micromatrices de expresión génica, micromatrices tisulares, hibridaciones genómicas comparativas en micromatriz); hibridación in situ fluorescente (FISH); FISH con fibras; hibridaciones genómicas comparativas; secuenciación de ADN, secuenciación de ácido nucleico, (p. ej., secuenciación de ácido nucleico monocatenario) y detección de moléculas aisladas.

16. 16.

    El uso según la reivindicación 15, en donde la polimerasa de ADN modificada genéticamente se describe

    por la secuencia de aminoácidos designada SEQ ID NO 1.

17. 17.

    Un kit para incorporar una mayor presencia de análogo de nucleótido marcado con un agente de detección en un ácido nucleico que comprende una polimerasa de ADN aislada modificada genéticamente según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 y 10.