ES2402726A1

ES2402726A1 - Nueva cepa de bacillus subtilis destinada a luchar contra las enfermedades de las plantas.

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Publication number: ES2402726A1
Application number: ES201131743A
Authority: ES
Inventors: Estefania HINAREJOS ESTEVE; Raquel DEL VAL BUEDO; Nuria TARANCON VALERA; Enrique RIQUELME TERRES
Original assignee: Invest Y Aplicaciones Biotecnologicas S L; INVESTIGACIONES Y APLICACIONES BIOTECNOLOGICAS SL
Current assignee: Invest Y Aplicaciones Biotecnologicas S L; INVESTIGACIONES Y APLICACIONES BIOTECNOLOGICAS SL
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2011-10-28
Publication date: 2013-05-08
Anticipated expiration: 2031-10-28
Also published as: US20140314718A1; WO2013060910A1; ES2402726B1; PL2781592T3; EP2781592A4; EP2781592B1; HUE035909T2; EP2781592A1; US9686999B2

Abstract

La presente invención se refiere a una cepa aisladLa presente invención se refiere a una cepa aislada de de Bacillus subtilis IAB/BS03 depositada en la de de Bacillus subtilis IAB/BS03 depositada en la colección de cultivos tipo Alemana DSM con N° dea colección de cultivos tipo Alemana DSM con N° de Acceso DSM 24682, o un mutante de dicha cepa, y t Acceso DSM 24682, o un mutante de dicha cepa, y también depositada en la Colección de Cultivos Tipoambién depositada en la Colección de Cultivos Tipo Española con número de acceso CECT 7254, propieda Española con número de acceso CECT 7254, propiedad de la empresa que presenta la patente, donde dicd de la empresa que presenta la patente, donde dicha cepa y/o su mutante presentan actividad antifúnha cepa y/o su mutante presentan actividad antifúngica y antibacteriana, con un perfil de acción difgica y antibacteriana, con un perfil de acción diferente al de otras cepas de Bacillus subtilis, y cerente al de otras cepas de Bacillus subtilis, y con una potencia mucho mayor en cuanto a su capacidon una potencia mucho mayor en cuanto a su capacidad de actuar como agente de control biológico en cad de actuar como agente de control biológico en campo. La invención incluye también métodos de prevampo. La invención incluye también métodos de prevención y tratamiento de enfermedades fúngicas y baención y tratamiento de enfermedades fúngicas y bacterianas en plantas usando dichas cepas bacteriancterianas en plantas usando dichas cepas bacterianas o sobrenadantes que contienen antibióticos o anas o sobrenadantes que contienen antibióticos o antibióticos puros obtenidos de dichas cepas bacteritibióticos puros obtenidos de dichas cepas bacterianas, donde dichos antibióticos están contenidos eanas, donde dichos antibióticos están contenidos en una composición. n una composición.

Description

NUEVA CEPA DE BACILLUS SUBTILlS DESTINADA A LUCHAR CONTRA LAS ENFERMEDADES DE LAS PLANTAS.

La presente invención se enmarca en el campo de los biopesticidas. Más concretamente, esta invención se relaciona con el descubrimiento de una nueva cepa de Bacillus subtilis, (IAB/BS03), que puede inhibir un amplio abanico de enfermedades fúngicas y bacterianas de plantas. La invención se relaciona también con composiciones fungicidas que contienen esta nueva cepa de Bacillus subtilis, bien sola, bien como parte de una formulación, o bien en combinación con otros pesticidas químicos y biológicos.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

Se sabe que diversos microorganismos exhiben actividad biológica y son útiles en el control de enfermedades de las plantas. Aunque se han hecho progresos en el campo de la identificación y el desarrollo de pesticidas biológicos para controlar diversas enfermedades de plantas de importancia agronómica, como los frutales y diversos productos hortícolas, la mayor parte de los pesticidas en uso son aún compuestos sintéticos. Muchos de estos fungicidas químicos son clasificados como carcinógenos en nuestra actual reglamentación Europea, y también en la EPA, y han demostrado ser tóxicos para la vida salvaje y otras especies que no son su objetivo. Además, estos compuestos químicos de síntesis, producen en muchísimos casos un fenómeno de resistencia, con lo que el/los patógenos tratados repetidamente con estos compuestos, acabarán siendo inmunes y resistentes al tratamiento,. con lo que el control sobre la plaga o enfermedad dejará de ser efectivo (Schwinn y col., p.244, Advances in plant pathology: phytophthora infestans, the cause of late blight of potato (Academic Press, San Diego, 1991).

Se ha descrito la actividad biológica de distintos tipos de microorganismos frente a enfermedades y plagas de las plantas. En concreto se ha descrito ciertas cepas de Bacillus spp (Bacillus spp. incluye B. subtilis, B. cereus, B. thuringiensis, entre otros) que exhiben actividad frente a diversas plagas del campo (Stabb y col. (1990), Applied Environ. Microbiol. 60: 4404-4412). Esta actividad, puede ser debida a distintos mecanismos de acción, entre los que se encuentran la producción de antibióticos que inhiben el desarrollo de hongos y bacterias, o la producción de toxinas que actúan de forma específica y selectiva contra determinadas clases de insectos.

En las patentes en EEUU N° 4999192 Y N° 5208017 se describe que las cepas pesticidas de B. fhuringiensis producen proteínas cristalinas durante la esporulación, que son específicamente tóxicas para ciertos ordenes y especies de insectos y nematodos.

En general, Bacillus subfilis y sus especies cercanas se consideran microorganismos no patógenos, aceptados como GRAS (Generally Regarded As Safe) , por la US Food and Drog Administration (US EPA). Sin embargo, es difícil caracterizar una especie de Bacillus subfilis, para poder diferenciarla de otras especies como Bacillus cereus o de Bacillus fhuringiensis. Bacillus cereus es una especie cercana a Bacillus subfilis, pero que sin embargo causa gastroenteritis e infecciones oportunistas cuando se encuentra como contaminante en la cadena alimentaria. Bacillus fhuringiensis es un microorganismo ampliamente utilizado como bioinsecticida, sin embargo su espectro de acción en cuanto a plagas (insectos) es muy diferente de Bacillus subfilis, cuyo espectro de acción serían, preferentemente, los hongos fitopatógenos.

Existen numerosos documentos de patente, basados en cepas de Bacillus cereus. La Patente en EEUU N° 5049379 de Handelsman y col. describe el revestimiento de semillas con una cepa específica de Bacillus cereus (ATCC 53522), inhibiendo la actividad patogénica del hongo de la podredumbre de la raíz. También describe cómo la aplicación de formulaciones basadas en esporas de ciertas cepas de Bacillus cereus aplicadas a semillas de soja o al suelo que rodea las semillas, mejora el rendimiento de la soja (Osburne y col. (1995), Am. Phytopathol. Soco 79(6); Smith y col. (1993».

En el estado de la técnica, también se ha descrito que la actividad del hongo patógeno de suelo, Pyfhium aphanidermafum, en el cultivo de pepino, puede ser suprimida usando la cepa UW de B. cereus (Plant Disease 77(2), 139-142).

El espectro de acción de los distintos Bacillus, viene determinado, no solo por la especie, sino también, por la cepa concreta que se esté estudiando. Además, el uso de especies como Bacillus cereus o de Bacillus fhuringiensis como agentes de biocontrol no sería adecuada debido a la característica de ser un contaminante de alimentos, prohibida su presencia en la cadena alimentaria.

En cuanto al Bacillus subfilis y otras especies muy cercanas (B. pumilus, B. polymyxa, B. megafherium, etc.), también existen numerosas referencias bibliográficas y documentos de patentes que hacen referencia a su efecto antifúngico por producción de antibióticos (Leifert y col. (1995), J. Appl. Bacteriol.

78: 97-108, Astilbe; Leifert y col. (1997) Patente en EEUU N° 5.597.565; Rossall (1994), Patente EE.UU. N° 5.344.647, Sholberg y col. (1995), Can. J. Microbiol.

41: 247-252; Swinburne y col. (1975), Trans. Brit. Mycol. Soco 65: 211-217; Singh y Deverall (1984), Trans. Br. Mycol. Soco 83: 487-490, y Ferreira y col. (1991), Phytopathology 81: 283-287).

Se ha descrito el uso de Bacillus spp. y de Bacillus subtilis como agentes de biocontrol de patógenos fúngicos de plantas (Baker y col. (1983), Phytopathology

73: 1148-1152, Pusey y col. (1988), Plant Dis. 72: 622-626; Pusey y Robins (Patente EE.UU. N° 5.047.239) Y McKeen y col. (1986), Phytopathology 76: 136139).

Es decir, que la actividad fungicida, por producción de antibióticos de distintas cepas de Bacillus subfilis y otras especies cercanas, es algo que está ampliamente documentado. Incluso se encuentran los registros de esta producción de antibióticos, en concreto, del B. megaferium, por Berdy en el CRC Handbook of Antibiotic Compounds, Vol. I-XIV (CRC Press, Inc., Boca Ratón, FL, 1980-87).

Sin embargo, no se encuentran en el mercado productos comerciales en base a cualquiera de los antibióticos producidos por las distintas cepas de Bacillus. Un grupo de investigadores en base a su trabajo con una serie de cepas de Bacillus productoras de iturinas (antibiótico producido por cepas de Bacillus), afirman que las cantidades de iturinas obtenidas de producción natural son inadecuadas para ser comercialmente viables (Bland col. (1995), Proc. Plant Growth Regulation Soco Am. 22°: 105-107». Por este motivo, las aplicaciones en campo se hacen con formulaciones sólidas o líquidas que contienen esporas de los bacilos, y que ejercen su acción una vez comienzan su desarrollo en el nicho ecológico que se les ofrezca, siempre y cuando tengan los requisitos necesarios para reproducirse.

ES2268774 y EP0981540B1 describen la cepa de Bacillus subtilis AQ713, idéntica a la cepa QST 713, como una cepa productora de antibióticos y metabolitos que exhibe una amplia actividad fungicida y bactericida. Este documento de patente describe el uso de dicha cepa en un método de tratamiento

o de protección de las plantas y frente a infecciones fúngicas y bacterianas. Actualmente, dicha cepa se comercializa en forma de polvo mojable o humectable, es decir, lo que se comercializa es la forma de resistencia de dicha cepa, la espora de Bacillus subtilis QST 713. Sin embargo, Bacillus subtilis cepa QST 713 no presenta actividad fungicida o no es lo suficientemente potente contra la enfermedad fúngica Mildiu de la lechuga (Bremia lactucae), por lo que su aplicación en tratamientos o protección de plantas no es del todo eficaz. En el ejemplo 4 de la presente invención, se emplea un producto comercial con Bacillus subtilis cepa QST 713, y se compara su eficacia como agente fungicida comparada con la cepa de Bacillus subtilis objeto de la presente invención, contra la enfermedad fúngica Mildiu de la lechuga (Bremia lactucae). En el ejemplo 8, párrafo 55 de la patente ES2268774 y EP0981540B1, se observa que la cepa QST 713 no previno el añublo velloso (mildiu o Bremia de la lechuga), mientras que la cepa de Bacillus subtilis objeto de la presente invención, sí tiene efecto contra esta enfermedad. Cabe resaltar que adicionalmente la cepa de Bacillus subtilis objeto de la presente invención presenta los mismos niveles de eficacia que un fungicida químico comercial, macozeb + cimoxamilo 4% (CURTAZE M), utilizándose a una dosis 300 veces menos que la dosis aplicada de Bacillus subtilis cepa QST 713.

Por tanto, actualmente existe la necesidad de identificar una cepa de Bacillus subtilis diferente a Bacillus subtilis cepa QST 713, con distinta actividad bactericida y fungicida, para su uso como biopesticida en el tratamiento y/o protección de las plantas frente a infecciones de patógenos, preferentemente frente a infecciones de hongos fitopat6genos, y más preferentemente, contra el mildiu de la lechuga.

BREVE DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención hace referencia a una cepa de Bacillus subtilis diferente a otras cepas concretas de Bacillus subtilis que actualmente están disponibles en el mercado (como por ejemplo Bacillus subtilis cepa QST 713), y que presenta actividad bactericida y/o fungicida, caracterizada porque los antibióticos que producen poseen una gran potencia y además su combinación produce diferentes especificidades frente a las enfermedades de las plantas. Dicha cepa de Bacillus subtilis se usa en un método de tratamiento o de protección de las plantas frente a infecciones fúngicas y/o bacterianas que consiste en aplicar una cantidad efectiva de la misma, caracterizada por ser menor a la necesaria para otras cepas de Bacillus subtilis actualmente disponibles en el mercado (como por ejemplo Bacillus subtilis cepa QST 713).

La cepa de Bacillus subtilis objeto de la presente invención puede presentarse en cualquiera de las formas conocidas por un experto en la materia: en forma de espora, bien en formulación sólida, granulado o líquido, como cultivo activado, o incluso como el sobrenadante de la suspensión de este cultivo activado, donde estén presentes los metabolitos producidos, etc.

DESCRIPCiÓN DETALLADA DE LA INVENCiÓN

Cepa Bacillus subtilis (DSM 24682)

La siguientes cepa ha sido depositada el 06 de junio de 2011, en la Colección de Cultivos Tipo Alemana (DSMZ), Inhoffenstrape 7 B, 38124 Braunschweig (Alemania), por Dña. Estefanía Hinarejos Esteve, IAB, S.L. (Investigaciones y Aplicaciones Biotecnológicas S.L.), Avda. Paret del Patriarca 11-B, Ap.30, 46113 Moneada, Valencia (España).

El depósito de la cepa depositada cuya referencia es Bacillus subtilis lli:. subtilis designada como IAB/BS03, CECT 7254, fue identificado por la DSMZ con el número de acceso DSM 24682 una vez dicha Autoridad Internacional para el Depósito declaró que dicha cepa en cuestión era viable, bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos con Fines de Procedimiento de Patente.

La cepa DSM 24682 de Bacillus subtilis presenta una amplia actividad antifúngica, más potente que otras cepas de Bacillus subtilis, frente a determinadas enfermedades. La cepa DSM 24682, se identifica como una cepa de Bacillus subtilis diferenciable de otras cepas, no solo de Bacillus spp. (B. cereus y B. thuringiensis), sino también de otras cepas de Bacillus subtilis ampliamente caracterizadas y documentadas, como Bacillus subtilis cepa QST 713. Ambas cepas son productoras de sustancias antibióticas frente a hongos fitopatógenos, pero la cepa DSM 24682 es más potente en cuanto a la especificidad y selectividad de los tratamientos, yen cuanto a su eficacia. La presente invención permite controlar completamente el ataque patógeno con tan solo una pequeña aportación del citado microorganismo. Lo que demuestra que con el mismo número de aplicaciones de dicha cepa, y con una concentración de trabajo menor que la que actualmente se encuentra en el mercado como fitosanitario, presenta igual eficacia que un producto químico de síntesis para ese determinado uso y comparada con otra cepa de la misma especie.

La presente invención tiene como objeto de protección una cepa aislada de Bacillus subtilís IAB/BS03 depositada en la colección de cultivos tipo Alemana DSMZ con N° de Acceso DSM 24682, o un mutante de dicha cepa, y también depositada en la Colección de Cultivos Tipo Española con número de acceso CECT 7254, propiedad de la empresa que presenta la presente invención, donde dicha cepa y/o su mutante presentan actividad antifúngica y/o antibacteriana.

Preferentemente, dicha cepa presenta un perfil de acción diferente al de otras cepas de Bacillus subtilís, y al menos 300 veces más potente en cuanto a su capacidad de actuar como agente de control biológico en campo.

En una realización preferente de la presente invención, se protege la cepa anteriormente descrita, caracterizada porque es la cepa de Bacillus subtilis IAB/BS03 depositada en la colección de cultivos tipo Alemana DSMZ con N° de Acceso DSM 24682.

En otra realización preferente de la presente invención, se protege un cultivo activo (fermentación) en caldo completo de la cepa descrita anteriormente.

En otra realización preferente de la presente invención, se protege un sobrenadante obtenido de un cultivo de la cepa descrito anteriormente caracterizado porque exhibe actividad antifúngica y antibacteriana.

En otra realización preferente de la presente invención, se protege una composición que comprende al menos:

(i): la cepa descrita anteriormente;

(ii): el cultivo activo en caldo completo de la cepa; o

(iii) el sobrenadante descrito anteriormente; pudiendo contener también de manera preferente, un fungicida químico o un pesticida químico o biológico.

En una realización aún más preferente, dicha composición además incluye o bien un fungicida químico o bien un pesticida o plaguicida químico o biológico.

En otra realización preferente de la presente invención, se protege un método de uso para la protección y/o tratamiento de plantas y frutos frente a infecciones fúngicas y/o bacterianas, que comprende aplicar una cantidad efectiva de la cepa, del cultivo activo en caldo completo, del sobrenadante o de la composición, descritos anteriormente.

Preferentemente, dicho método se caracteriza porque se administra al menos una dosis 300 veces menor de la cantidad efectiva de la cepa, del cultivo activo en caldo completo, del sobrenadante o de la composición, descritos anteriormente, para alcanzar la misma potencia fungicida que cuando se administra otra cepa de Bacillus subtilis. La cepa DSM 24682 (IAB/BS03) objeto de la presente invención es al menos 300 veces más potente que Bacillus subti/is cepa aST 713, como ejemplo representativo de otra cepa concreta de la misma especie (de Bacillus subtilis). Además, la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) objeto de la presente invención, tiene propiedades fungicidas equiparables al tratamiento con macozeb

+ cimoxamilo 4% (CURTAZE M), como ejemplo representativo de un tratamiento fungicida químico comercial.

En una realización aún más preferente, dicho método se caracteriza porque las infecciones fúngicas ylo bacterianas están causadas por al menos un microorganismo seleccionado de entre el siguiente grupo: Alternarla sp, Botrytis sp, Fusarium sp, Phytophthora sp, Rhizoctonia sp, Sclerotinia sp, Verlici/lium sp, Leveillula sp, Venturla sp, Plasmopara sp, Uncinula sp, pythium sp, Colletotrlchum sp, Cladosporlum sp, Monilinia sp, Acidovorax sp, Pseudomonas sp, Xanthomonas sp, Erwinia sp, Clavi-bacter sp, Sphaerotheca sp, y Peronospora sp.

Preferentemente, dicho método se caracteriza porque las infecciones están causadas por al menos un microorganismo seleccionado de entre el siguiente grupo: Alternarla sp, Botrytis sp, Fusarlum sp, Phytophthora sp, Rhizoctonia sp, Sclerotinia sp, y Verlici/lium sp.

Más preferentemente dicho método se caracteriza porque las infecciones están causadas por al menos un microorganismo seleccionado de entre el siguiente grupo: Alternarla solani, Alternarla brassiciola, Botrytis cinérea, Fusarlum oxysporum, Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotorlum, Verlicillium lecanií, Leveillula tauriea, Venturla inaequalis, Venturia pyrlna, Plasmopara vitícola, Uneinula necátor, pythium ultimum, Colletotrlchum cocodes, Cladosporium cueumerlnum, Monilinía frueticola, Acidovorax avenae, Pseudomonas syrlngae, Xanthomonas campestris, Erwinia earotovora, Clavibacter michiganense, Sphaerotheea fuliginea, y Peronospora parasitica.

Aún más preferentemente, dicho método se caracteriza porque las infecciones están causadas por al menos un microorganismo seleccionado de entre el siguiente grupo: Alternarla solani, Alternarla brassiciola, Botrytis cinérea, Fusarlum

oxysporum, Phytophthora infestans, Rhizoctonia solani, Sclerotinia sclerotorum, y Verlicillium lecanii.

En una realización aún más preferente, dicho método se caracteriza porque la cepa es aplicada como polvos humectables, gránulos, fluidos o microencapsulaciones.

En una realización aún más preferente, dicho método se caracteriza porque la cepa, el cultivo activo en caldo completo, el sobrenadante o la composición descritos anteriormente, son aplicados en un sitio seleccionado de entre el siguiente grupo: las raíces, las hojas (parte vegetativa), las flores, los frutos y el suelo alrededor de las raíces.

En otra realización preferente de la presente invención, se protege una composición que comprende cualquiera de los antibióticos y metabolitos secundarios producidos por la cepa descrita anteriormente, o sus combinaciones.

La invención incluye también métodos de prevención y tratamiento de enfermedades fúngicas y bacterianas en plantas usando dichas cepas bacterianas o sobrenadantes que contienen antibióticos o antibióticos puros obtenidos de dichas cepas bacterianas, donde dichos antibióticos están contenidos en una composición según se define en las reivindicaciones.

Dado que los efectos frente a dichas enfermedades fúngicas y bacterianas son diferentes a los descritos para Bacillus subtilis cepa aST 713, es perfectamente entendible que la combinación de metabolitos producidos y/o antibióticos producidos por la cepa en cuestión, son diferentes, cualitativa y cuantitativamente (cepa diferenciable y efectos diferentes claramente medibles).

Tal como se usa aquí, "control biológico" se define como control de un patógeno mediante el uso de un segundo organismo. Los mecanismos conocidos de control biológico incluyen bacterias y hongos que son capaces de controlar enfermedades tanto de raíz, como de la parte foliar de las plantas. Se utilizan de estas bacterias y hongos, o bien las toxinas o metabolitos secundarios producidos y aislados, o bien la especie fúngica y/o bacteriana, aplicada in situ, para que dichas toxinas y metabolitos sean producidos una vez la bacteria u hongo, encuentra lo necesario para su reproducción y desarrollo.

El término "hongo" u "hongos", incluye una amplia variedad de organismos portadores de esporas nucleados que están desprovistos de clorofila. Como ejemplos de hongos, se incluyen levaduras, mohos filamentosos y setas.

El término "bacteria" incluye cualquier organismo procariótico que no tenga un núcleo diferenciado.

El término "fungicida o antifúngico" significa la capacidad de una substancia para aumentar la mortalidad o inhibir la tasa de crecimiento de los hongos.

El término "bactericida" significa la capacidad de una substancia para aumentar la mortalidad o inhibir el crecimiento de las bacterias.

El término "antibiótico" incluye cualquier substancia que sea capaz de matar o inhibir un microorganismo. Los antibióticos pueden ser producidos por un microorganismo o por un procedimiento sintético o un procedimiento semisintético. El término, por lo tanto, incluye una substancia que inhibe o mata hongos, por ejemplo la combinación de Iturinas, Surfactinas, Plipastatinas y otros antibióticos, producidos por diferentes cepas de Bacillus.

El término "cultivo" se refiere a la propagación de organismos sobre o en medios de varios tipos. "Cultivo en caldo completo" se refiere a un cultivo líquido que contiene tanto células como medio. "Sobrenadante" se refiere al caldo líquido que queda cuando se separan las células que han crecido en caldo por centrifugación, filtración, sedimentación u otros medios bien conocidos en la técnica.

Una "cantidad efectiva" es una cantidad suficiente para producir resultados beneficiosos o deseados. Una cantidad efectiva puede ser administrada en una o más administraciones. En términos de tratamiento y protección, una "cantidad efectiva" es aquella cantidad suficiente para mejorar, estabilizar, revertir, enlentecer o retrasar la progresión de los estados de la enfermedad fúngica o bacteriana.

El término "control positivo" significa un compuesto que se sabe tiene actividad pesticida. "Controles positivos" incluye, aunque sin limitación, pesticidas químicos comercializados. El término "control negativo" significa un compuesto que se sabe no tiene actividad pesticida. Son ejemplos de controles negativos el agua o el acetato de etilo.

El término "metabolito" se refiere a cualquier compuesto, substancia o subproducto de una fermentación de un microorganismo que tenga actividad pesticida. Antibiótico, según se define aquí, es un metabolito específicamente activo contra un microorganismo.

Otra realización de la presente invención proporciona un método de tratamiento o protección de las plantas frente a infecciones fúngicas y bacterianas, consistente en aplicar una cantidad efectiva de un sobrenadante obtenido de un cultivo en caldo completo de DSM 24682 dentro de la presente invención. El sobrenadante puede ser obtenido por medios bien conocidos en la técnica, incluyendo centrifugación, filtración, sedimentación y similares.

Con objeto de conseguir una buena dispersión y adhesión de composiciones en la presente invención, puede ser ventajoso formular el cultivo en caldo completo, el sobrenadante y/o el metabolito/antibiótico con componentes que ayuden a la dispersión y a la adhesión. Las formulaciones adecuadas serán conocidas para los expertos en la técnica.

Las composiciones de la presente invención pueden ser formuladas como polvos humectables, gránulos y similares, o pueden ser microencapsuladas en un medio adecuado y similar. Como ejemplos de otras formulaciones, se incluyen, aunque sin limitación, polvos solubles, gránulos humectables, fluidos secos, fluidos acuosos, gránulos dispersables humectables, concentrados emulsionables y suspensiones acuosas. Otras formulaciones adecuadas serán conocidas para los expertos en la técnica.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y

5 características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

10 DESCRIPCiÓN DE LAS FIGURAS

FIGURA 1. A Y B. Resultados visuales del efecto fungicida de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) frente a Alternaría sp. y frente a Fusaríum oxysporum,

15 respectivamente, se testa en concreto la capacidad de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de actuar como agente de biocontrol, frente a Alternaría sp y Fusaríum oxysporum.

BIBLIOGRAFíA

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the cause of late blight of potato (Academic Press, San Diego, 1991

5: - Stabb y coL, Applied Environ. Microbiol. 60: 4404-4412, 1990

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Leifert y col. (1995), J. Appl. Bacteriol. 78: 97-108, Astilbe

10: - Sholberg y col. (1995), Can. J. Microbiol. 41: 247-252

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15: - Pusey y col. (1988), Plant Dis. 72: 622-626

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Ratón, FL, 1980-87)

Bland col. (1995), Proc. Plant Growth Regulation Soco Am. 22°: 105-107)

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EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

Los ejemplos que se proporcionan a continuación, constatan y demuestran que el

objeto de protección de la presente invención comprende: una cepa caracterizada, y que esa cepa es única y diferenciable de otras, de la misma especie,

-: que esa cepa tiene capacidad de ser agente de control biológico, pues como se ve en los ensayos in vitro, presenta acción frente a distintos hongos patógenos,

-: que esa cepa tiene un espectro de acción diferente a otras (como por ejemplo) Bacillus subtilis cepa QST 713, tal y como se demuestra en los ensayos llevados a cabo en lechuga, para combatir la Bremia lactucae, o mildiu de la lechuga, la QST 713, según nombran en ES2268774 y EP0981540B1 no presenta efecto frente a Bremia lactucae, mientras que la cepa objeto de la presente invención, sí. Esto indica un espectro de acción diferente, y

-: que la cepa objeto de la presente es hasta 300 veces más potente que Bacillus subtilis cepa QST 713, pues según se muestra en los ejemplos, es capaz de combatir dicha enfermedad (Bremia lactucae), al igual que lo hace un químico de síntesis (macozeb + cimoxamilo 4%), utilizando una dosis al menos 300 veces menor, que la que se emplea con la cepa QST

713.

EJEMPLO 1. Caracterización completa de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) Se ha realizado un análisis "RiboPrint"de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03), mediante el empleo de la enzima de restricción EcoRI, obteniendo los siguientes resultados:

A. La cepa DSM 24682 (IAB/BS03) fue identificada como una cepa de Bacillus subtilis en base a la entrada DUP-12544 en la Librería de Identificación DuPont. Dicho patrón se basa en la cepa DSM 449.

B. El patrón de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) difiere significativamente de los patrones de otros tipos de cepas como Bacillus thuringiensis DSM 2046T (únicamente se obtiene un índice de similitud DuPont ID del 0.17) y de Bacillus cereus DSM 31 T (índice de similitud del 0.15) (ver Tabla 1 A). Bacillus thuringiensis y Bacillus cereus no son diferenciables en base a los patrones EcoRI.

C. Por tanto, con la intención de demostrar la diversidad de los patrones EcoRI de Bacillus subtilis, las cepas DSM 10T, DSM 1970 y DSM 2109 se incluyeron en los ensayos de la comparación (ver Figura 1 B). El patrón de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) está claramente diferenciado de dichas cepas, ya que se obtienen los siguientes índices de similitud: 0.78 respecto a DSM 10T, 0.56 respecto a DSM 2109. Sin embargo es similar a la cepa DSM 1970, con un índice del 0.94 y a la cepa DSM 449 con un índice de 0.94. La cepa DSM 24682 (IAB/BS03) y la cepa DSM 1970 comparten un mismo RiboGroup ECORI 1982445-S-5, lo que indica que el sistema RiboPrinter es incapaz de detectar diferencias entre los patrones EcoRI de ambas cepas. En este ejemplo, se demuestra las diferencias entre los patrones EcoRI de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) respecto a otras cepas de Bacillus subtilis, con la excepción de la cepa DSM 1970, con la que la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) comparte el mismo RiboGroup ECORI 198-2445-S-5.

Así mismo, indicar que las lecturas de los escaneados del ejemplo 1, el número de entrada de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) es el 10-1079, mientras que el de la banda QST 713, es el 11-196.

Tablas 1 A Y B. Caracterización completa de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03), donde se demuestra la diferenciación de la cepa particular de Bacillus subtilis, frente a otras como Bacillus thuringiensis y Bacillus cereus.

Tabla 1 A

Conclusión: La caracterización completa de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03), demuestra la diferenciación de dicha cepa particular de Bacillus subtilis, frente a otras como Bacillus thuríngiensis y Bacillus cereus.

EJEMPLO 2. Comparación de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) frente a la cepa QST 713.

Se realizó un perfil genético de la cepa OSM 24682 (IAB/BS03) frente a Bacillus subtilis cepa QST 713, donde se demuestra específicamente que la similitud que existe entre ambas es solo de 0.24, y que por tanto, son cepas diferentes de Bacillus subtilis. Siguiendo el mismo método descrito en el ejemplo 1, se obtuvo un índice de similitud OuPont ID del 0.24 (ver Tabla 2).

Conclusión: Los resultados del perfil genético demuestran que la cepa DSM 24682 (IAB/BS03), es una cepa distinta que Bacillus subtilis cepa QST 713, ya que el índice de similitud OuPont ID que se obtiene es únicamente del 0.24. Para mejor entendimiento que las lecturas de los escaneados del ejemplo 1, el número de entrada de la cepa OSM 24682 (IAB/BS03) es el 10-1079, mientras que en el ejemplo 2 el de la banda Bacillus subtilis cepa QST 713, es el 11-196.

EJEMPLO 3. Estudio de la actividad de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) frente a distintas enfermedades fúngicas in vitro.

Para determinar si la cepa OSM 24682 (IAB/BS03) es efectiva in vitro, frente a distintos hongos cultivables en laboratorio se realizaron una serie de ensayos "in vitro" en los que se evaluó el potencial de la cepa DSM 24682 aislada como agente de control biológico, estudiando sus efectos frente a los hongos Alternaría solani, Botrytis cinerea, Fusarium oxisporum, Phytophthora spp., Rhizoctonia solaní, Sclerotinía spp. y Verficillium spp.

Tabla 2. Perfil genético de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) frente a la cepa QST 713, donde se demuestra específicamente que la similitud que existe entre ambas es solo de 0.24, y que por tanto, son cepas diferentes de Bacillus subtilis.

Para los ensayos se llevó a cabo la medición cualitativa de la inhibición del crecimiento de diversos hongos fitopatógenos frente a la cepa DSM 24682 (IA8/8S03) de Bacillus subtilis. Se siembra a cada lado de las placas de PDA un Bacillus subtilis DSM 24682 (IA8/8S03) y en el centro al hongo patógeno. Se

5 incuba de 7 a 14 días a 26°C, y se mide la inhibición del crecimiento radial del hongo frente al testigo, en mm, y el % de antagonismo.

A continuación, se detallan los resultados (Tabla3):

10 Tabla 3

Microorganismo: INHIBICION (mm) Antagonismo (%)

Altemaría: 10 67

Botrytis: 10 94

Fusaríum: 5 60

Phytophtora: 3 70

Rhizoctonia: 6 24

Sclerotinia: 6 37

Verlicillium: 9 42

Estos resultados, denotan que la cepa DSM 24682 (IA8/8S03) de Bacillus subtilis tiene producción de antibióticos que inhiben el crecimiento de distintos hongos, por lo que puede utilizarse como agente de control biológico. Los resultados

15 visuales del efecto frente a Alternaría sp. y frente a Fusaríum oxysporum indican que existe una disminución del crecimiento de Alternaría sp. del 59%, y de Fusaríum oxysporum del 60% (ver Figura 1A y 18).

CONCLUSiÓN: Encontramos dos tipos de efecto inhibitorio de la cepa DSM 20 24682 (IA8/8S03) de Bacillus subtilis sobre los distintos hongos:

• Se produce antagonismo directo frente a Fusaríum oxysporum, puesto que se observó cómo en la zona de contacto, el hongo no era capaz de producir micelio aéreo.

25· Se observa también que se produce también una sustancia inhibitoria de crecimiento fúngico frente a Alternaría sp.

Por tanto se concluye que los resultados muestran que la cepa DSM 24682 (IA8/8S03) de Bacillus subtilis tiene un amplio espectro fungicida in vitro y que tanto el caldo completo como el sobrenadante podrían utilizarse para tal efecto, puesto que se ha demostrado la producción de sustancias que inhiben el crecimiento y desarrollo de distintos hongos cultivables en laboratorio.

EJEMPLO 4. Análisis de la actividad de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de Bacillus subtilis objeto de la presente invención frente a Bremia lactucae (hongo fitopatógeno) y comparativa con el producto comercial Bacillus subtilis cepa QST 713.

En la patente EP O981 540 B1 se indica en el párrafo 55, ejemplo 8, que la cepa QST 713 (cepa AQ713) no previno Bremia lactucae, o mildiu de la lechuga, por lo que se ha analizado la efectividad de los tratamientos con la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de Bacillus subtilis contra la enfermedad fúngica Bremia lactucae (ver Tablas 4-7).

CONCLUSiÓN: Los resultados demuestran la efectividad de los tratamientos con la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de Bacillus subtilis objeto de la presente invención contra enfermedades fúngicas, como Bremia lactucae o mildiu de la lechuga, siendo estos iguales a los tratamientos químicos empleados, y obteniendo mejor resultado en cuanto a eficacia, que con otra cepa de Bacillus subtilis (QST 713). La cantidad de inóculo necesaria para obtener los efectos deseados, es mucho más baja, y por tanto la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de Bacillus subtilis es una cepa mucho más potente.

Como explicación y referencia al contenido específico de las Tablas 4-7, se comprueba mediante tratamiento estadístico, que las medias seguidas por la misma letra, no difieren significativamente, y que por lo tanto, los tratamientos pueden considerarse como con la misma eficacia, excepto en la columna 8 de las figuras 4,5,6 y 7, donde el tratamiento a base de la cepa QST 713, que se da a los 14 días de la última aplicación, es significativamente peor, y no comparable al tratamiento químico de referencia (CURZA TE M).

Tabla. 4 Eficacia de los tratamientos 1-5 con la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de Bacillus subtilis contra la enfermedad fúngica Bremia lactucae, o mildiu de la lechuga.

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Tabla. 5 Eficacia de los tratamientos 6-10 con la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de Bacillus subtilis contra la enfermedad fúngica Bremia lactucae, o mildiu de la lechuga.

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Tabla. 6 Eficacia de los tratamientos 11-15 con la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de Bacillus subfilis contra la enfermedad fúngica Bremia lacfucae, o mildiu de la lechuga.

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Tabla. 7 A Eficacia de los tratamientos 16-17 con la cepa DSM 24682 (IAB/BS03)

de Bacillus subtilis contra la enfermedad fúngica Bremia lactucae, o mildiu de la

lechuga.

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Medias seguidas por la misma letra, no tienen diferencias significativas Descripciones t=Mean se describen como unidades transformadas y no son de-transformadas. Comparaciones entre medias solo se llevan a cabo cuando Tratamiento P(F) AOVes significativa en la media de comparación OSL.

10 Nota de pie 4: Eficacia Abbot (%) según incidencia de la enfermedad.

Tabla. 7 B. B. Datos adicionales

Nota de pie 1: Severidad de plaga(%): % de área de la hoja afectado por la enfermedad en 40 plantas de lechuga por parcela. Nota de pie 2: Incidencia de la enfermedad (%).% de hojas afectadas por la enfermedad, en 40 plantas de lechuga. Nota de pie 3: Eficacia Abbot (%) según severidad de la enfermedad Nota de pie 4: Eficacia Abbot (%) según incidencia de la enfermedad.

En el ejemplo al que hacemos referencia, se ha comparado Bacillus subtilis (QST 713) con calidad microbiana de 5,13X1010CFU/g, mientras que el producto formulado con la cepa DSM 24682 (IAB/BS03), contiene 2,04X108 CFU/g (ver

5 certificado de análisis adjunto (Tabla 8). El número de lote empleado en el ensayo, coincide con el número de lote del certificado de análisis incluido en la tabla 2.

Tabla 8. Certificado de análisis del producto formulado con la cepa DSM 24682 10 (IAB/BS03).

I I !

(1) La cantidad de ingrediente activo fue determinado según método analftico validado y descrito en el estudio GLP BT07711

15 Esto certifica que la aplicación del producto con la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) objeto de la presente invención, se está haciendo con una calidad microbiana al menos, 100 órdenes por debajo comparado con el producto comercial Bacillus subtilis cepa QST 713. Si se observan las dosis empleadas en cada aplicación (referencia en cualquiera de las tablas), se aprecia que las dosis empleadas para

20 el producto con la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) objeto de la presente invención, ha sido de 1 00g/1 OOL de agua, a 200g/100L de agua, mientras que las dosis empleadas para el producto comercial Bacillus subtilis cepa QST 713, ha sido de 600g. Es decir, las dosis empleadas para aplicar el producto comercial Bacillus subtilis cepa QST 713, como ejemplo de cepa de B. sub tilis , es 3 veces mayor

25 que la empleada con la máxima dosis para la aplicación del producto con la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) objeto de la presente invención.

Si a esto añadimos la diferencia de calidad microbiana, podemos afirmar que aplicando una dosis 300 veces menor, para el producto que contiene la cepa DSM 30 24682 (IAB/BS03) objeto de la presente invención, los resultados de control de

Bremia lactucae o mildiu de la lechuga, son significativamente mejores, transcurridos 14 días desde la última aplicación. Es decir, que comparado con la cepa Bacillus subtilis cepa OST 713, la cepa Bacillus subtilis IAB/BS03 es al menos 300 veces más potente y efectiva, en cuanto a su permanencia del efecto antifúngico en la planta.

Podemos concluir entonces, que la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) objeto de la presente invención es al menos 300 veces más potente que la cepa OST 713, como ejemplo representativo de otra cepa concreta de la misma especie (de Bacillus subtilis). Además, la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) objeto de la presente invención, tiene propiedades fungicidas equiparables al tratamiento con macozeb

+ cimoxamilo 4%, como ejemplo representativo de un tratamiento fungicida químico comercial.

EJEMPLO 5. Determinación de la eficacia y selectividad de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de Bacillus subtilis contra la enfermedad de Moniliasis en frutas con hueso, con el fin de demostrar el efecto bactericida de la cepa.

Se determinó la eficacia y selectividad de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) de Bacillus subtilis contra la enfermedad de Moniliasis en frutas con hueso, empleando una calidad microbiana de 108 UFC/g WP (ver Tablas 9-12). Al igual que en el ensayo anterior, la calidad microbiana que se utiliza de la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) es menor (en este caso 100 veces menor) que la dosis efectiva del producto comercial Bacillus subtilis cepa OST 713. En dicho ensayo, se emplea tebuconazol (FOLlCUR).

CONCLUSiÓN: En la Figura 11 se aprecia la eficacia del producto que contiene la cepa DSM 24682 (IAB/BS03) objeto de la presente invención en el tratamiento de flores y brotes ante la enfermedad bacteriana Moniliasis en frutales de hueso. Una vez realizado el tratamiento estadístico, se observan unos porcentajes de eficacia del 74,8 al 82,9% en flores, y del 45,8 al 81,7% en brotes. Además, aparecen diferencias significativas frente al testigo (tesis sin tratar), con lo que queda demostrado, el efecto no solo fungicida, sino bactericida de la cepa.

Tabla. 9 A. Descripción del sitio de estudio.

Lugar del ensayo Ciudad: Bullas Latitud de LL esquina 0: 38,024722 N ESP 43,772217 -27,637497 Estado/Prov.: Murcia Longitud de LL esquina 0: 1,673611 W -18,170559 -4,316944 Código postal: 30180 Altitud de LL Esquina, Unit: 637,00 m pais: ESP España Referencia en mapa: Google Earth (WGS84) Angle y-axis to North 0: 290,00 Dirección: -Poligono 11, Parcela 68, Recinto 1 (SIGPAC). Nombre de la Finca: Francés Código oficial de ensayo: AS 02611 F 02 Hecho bajo BPL: Sí Otro código: AS 02611 F 02 Descripción de las guías

1.: PP 1/152(3) Diseño y análisis de ensayos de eficacia

2.: PP 1/181(3) Hacer y reportar ensayos de eficacia mediante normativa BPL

3.: PP 1/38(3) Monilinia laxa

4.: PP 1/135(3) Evaluación de fitotoxicidad

Objectivos: Medida de la eficacia del producto experimental frente a Monilia laxa en albaricoquero Buscar dosis apropiada del producto experimental Comparar con la referencia Folicur 25WG Albaricoquero Variedad: Búlida BBCH Escala: BSTO Fecha de trasplante: 1/4/1991 Método de plantación: TRAHAN transplantado -a mano Dosis, Unidad: 204 P/HA Edad de árbol perenne, Unidad: 20 años Espacio entre árboles, Unidad: 7,0 m Espaciado entre lineas, Unidad: 7,0 m

Descripción de plaga Plaga 1 Tipo: D Codigo: MONILA Monilinia laxa Nombre común: Moniliasis

Sitio y diseño Anchura parcela, Unidad: 7 m Tipo de sitio: ORCHAR (frutal) Anchura parcela, Unidad: 7 m Experimental Unidad: 1 PLOT plot Area de ensayo, Unidad: 49 m2 Tipo de labranza: CONTIL convencional Replicados: 4 para diseño estudio: RACOBL Randomized Complete Block (RCB) Parcelas no tratadas: INCLUIDO control sencillo randomizado por bloques. Comentarios de inicio de ensayo: Riego por goteo según necesidades de los árboles Cultivo en producción comercial Parcela incluye 1 árbol.

Estado de cultivo en el momento de rpimera aplicación BBCH: 57-59

(sépalos abiertos, pétalos visibles, flores con pétalos blancos o rosas todavla cerrados) Mayoria de pétalos en flor, en forma de bola). Cultivo en forma libre Comentario: No se aplica ningún tratamiento agroqulmico en toda el área de ensayo, frente a nin una la a.

Tabla. 9 B. Descripción del sitio de estudio.

Descripción del suelo

% arena: 30,0 % MO: 1,81 Textura: eL arcillosa

% Silicatos: 43,0 pH: 8,3

% arcilla: 27,0 Fert. Nivel: G bueno

Drenaje de suelo: G bueno

Analyzado por:

AgroSoler, S.L.

Otros elementos adicionales

Unidad de cantidad del elemento

Carbono orgánico 1,05 %

% de materia orgánica total 2,35 %

Humedad y condiciones climáticas

Condiciones globales de humedad: ABONOR por encima de lo normal

Estación metereológica cercana: Mula (ML21) Distancia, Unidad: 18,23 km

Tipo Min Max Temp Relativa No. Fecha Cantidad Unidad Tipo Descripcion Temp Temp Unidad Humedad

1.: 15/2/2011 2,7 mm LLUVIA LLUVIA 6,6 12,1 e 80,2

2.: 16/2/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 6,617,1 e 57,8

3.: 17/2/2011 2,0 mm LLUVIA LLUVIA 5,1 16,2 e 52,9 4.18/2/20110,1 mmLLUVIALLUVIA9,320,1 e51,7 5.19/2/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 7,520,4 e 56,2

6.: 20/2/2011 0,5 mm LLUVIA LLUVIA 10,5 20,3 e 59,6

7.: 21/2/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 14,1 20,5 e 44,6

8.: 22/2/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 12,1 22,3 e 49,8

9.: 23/2/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 9,223,9 e 51,7 10.24/2/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 8,6 23,6 e 62,4 11.25/2/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 6,6 21,0 e 65,2 12.26/2/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 9,0 28,6 e 40,7 13.27/2/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 8,718,3 e 47,7 14.28/2/2011 0,3 mm LLUVIA LLUVIA 6,815,7 e 40,7

15.: 1/3/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 2,815,9 e 45,1

16.: 2/3/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 4,4 17,0 e 43,9 17.3/3/2011 4,1 mm LLUVIA LLUVIA 5,815,8 e 58,2 18.4/3/20111,9 mm LLUVIA LLUVIA 7,411,9 e 86,7

19. 5/3/2011 0,9 mm LLUVIA LLUVIA 7,1 14,6 e 81,2 20.6/3/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 6,716,9 e 76,3

21. 7/3/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 6,8 18,1 e 72,5 22.8/3/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 7,914,9 e 79,6

23.: 9/3/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 10,7 13,5 e 78,2

24.: 10/3/2011 0,4 mm LLUVIA LLUVIA 9,6 13,4 e 81,1

25.: 11/3/2011 30,1 mm LLUVIA LLUVIA 9,7 12,3 e 95,2

26.: 12/3/2011 9,1 mm LLUVIA LLUVIA 9,5 18,5 e 85,3

27.: 13/3/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 9,521,2 e 71,2 28.14/3/20114,6 mm LLUVIA LLUVIA 11,419,2 e 85,8 29.15/3/20110,6 mm LLUVIA LLUVIA 11,119,0 e 67,7

30. 16/3/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 10,3 20,0 e 44,0 31.17/3/20110,0 mm LLUVIA LLUVIA 14,8 21,9 e 45,4

32.: 18/3/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 11,4 24,4 e 49,3

33.: 19/3/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 9,4 26,5 e 52,7

34.: 20/3/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 7,520,6 e 67,2

35.: 21/3/2011 0,0 mm LLUVIA LLUVIA 10,6 16,9 e 76,6 36.22/3/20110,2 mm LLUVIA LLUVIA 10,116,0 e 65,3

Tabla. 10 A. Descripción de los tratamientos

Descripción de la aplicación ABC Fechas de aplicación: 2/3/2011 7/3/2011 14/3/2011 Hora del dla: 10:0013:0010:45 Método de aplicación: SPRAY SPRAY SPRAY Momento de aplicación: ATBlST ATBLOO ATBlOO lugar de aplicaciónt: FOLIAR FOLIAR FOLIAR Aplicado por: JSA JSA JSA Temperatura dela ire. Unidad: 4.9 C 13.9 C 13.2 C % Humedad relativa: 78 53 82 Velocidad del viento. Unidad: 0.52 MPS 1.5 MPS OMPS Dirección del Viento: S N Presencia de roclo (Y/N): N no N no N no Temperatura del suelo. Unidad: 5.9 C 8,4 C 9.2 C Humedad suelo: SECO SECO LIGERAMENTE HUMEDO % NUBOSIDAD: 05 100 ultima llUVIA EN: 3/3/2011 10/3/2011 15/3/2011 Estado del cultivo en cada aplicación ABC

Cultivo 1 Codigo. BBCH Escala: PRNAR BSTO PRNAR BSTO PRNAR BSTO Estado de scala empleado: BBCH BBCH BBCH Mayorla de estado. Porcentaje: 579061 7565 100 Minimo estado. Porcentaje: 57 90 59 15 65 100 Máximo estado. Porcentaje: 59 10 62 10 65 100 Diametro. Unidad: 4.5 m 4.5 m 4.5

m

Altura. Unidad: 3.0 m 3,0 m 3.0 m

Altura mlnima. Maxima: 3,0 3,5 3.0 3.5 3.0 3.5

Altura planta, Unidad: 2.0 m 2,0 m 2.0 m

Cobertura de cultivo (%): 25 25 25

Estado de la plaga en cada aplicación

ABC

Plaga 1 Codigo. Tipo. Escala: MONllA D MONllA D MONllA D

mayorfa Estado. Porcentaje: PRINFC 100 PRINFC 100 PRINFC

Equipo de aplicación

ABC Appl. Equipo: MARUYAMA MARUYAMA MARUYAMA Tipo de Equipo: BACSPR BACSPR BACSPR Presión operativa, Unidad: 1200 kPa 1200 kPa 1200 kPa Tipo de boquillas: Sol. cone Sol. cone Sol. cone Tamaño de boquillas: MARTI1.5 MARTI1.5 MARTI1.5 Boquillaslfila: 1 1 1

Calibración de boquillas. Unidad: 3870 MUMIN 3870 ML/MIN 3870 ML/MIN

Velocidad maquinaria. Unidad: 1.3 KPH 1.3 KPH 1,3 KPH

Caldo cultivo: AGYUA AGUA AGUA

Volumen de pulverización. Unidad: 985.8 L/ha 1014,0 L/ha 1011.7 L/ha

Tamaño Mix. Unidad: 22 Litros 22 litros 22 litros

Espray pH: 7,57.57.5

Propulsor: PUMP PUMP PUMP

Mezcla en tanque (Y/N): N no N no N no Comentario sobre el equipo: "Maruyama" es un pulverizador de mochila apropiado

para emplear en zonas reducidas. Trt No Tratamiento Aplicacion Comentario 2, 3 Y4 No problema observado en manejo ni en la disolución del producto en agua.

Tampoco se observan problemas por la dosis 5 Referencia producto. Aplicaciones sin problemas.

DIa por Notas 2/3/2011 JSA Antes del pulverizado las verificaciones necesarias para conocer el volumen real de aplicación apropiado, fueron hechas.

según el protocolo 2/3/2011 JSA Aplicacion (A). Tel equipo se limpió con disolvente orgánico (amoniaco) entre tratamientos con diferentes formulaciones, ingredientes activos, etc. 7/3/2011 JSA Aplicacion (B). 14/3/2011 JSA Aplicacion (C). 22/3/2011 JSA Evaluación en al menos 50 brotes por ensayos: número de brotes sanos, brotes con flores afectadas flores sanas y afectadas.

Tabla. 10 B. Descripción de los tratamientos

información adicional (Lista Validación Comentarios) F, fungicida = fungicidal F, un afio /final = one-yearlfinal16 N, N = Norte W, W=oeste ESP, 43.772217, 27.637497, -18.170559, 4.316944 = Spain m = meters

1.: PP 1/152(3) Diseflo y análisis de ensayos de eficacia

2.: PP 1/181(3) Hacer y reportar ensayos de eficacia mediante normativa BPL

3.: PP 1/38(3) Monilinia laxa

4.: PP 1/135(3) Evaluación de fitotoxicidad PRNAR, BSTO, Prunus armeniaca, = US TRAHAN, transplantedo -mano = transplanted -hand P/HA = plantas por hectarea YR = afio m = metro D, Enfermedad, G-BYRD7, G-DisStg = Enfermedad como hongo, bacteria o virus MONILA, Monilinia laxa, = US ORCHAR, frutal = orchard PLOT, plot = plot CONTIL, labranza convencional = conventional-till RACOBL, Control randomizado por bloques (RCB) = Randomized Complete Block (RCB) INCLUIDO, Control randomizado por bloques= single control randomized in each block CL, arcilla = arcilla G, bueno= good

G, good = bueno / mediio / adecuado dLLUVIAedad con aireacion no previsto daños en crecimiento cultivo w ABONOR, pro encima de normal = above normal

km = kilometro mm = millimetro LLUVIA, LLUVIA = LLUVIA C = Celsius

SPRAY =spray A TBLST = en momento de floración FOLIAR = foliar JSA = Joaquln Soler Álvarez MPS = metro por segundo S = Sur N, no = no DRY =seco ATBLOO = botón floral N =Norte SLlWET =ligeramente húmedo BBCH =BBCH estados uniformes de la planta

57 = sepalos abiertos, petalos visibles; flores aisladas con pétalos rosas/blancos (cerradas)lBSTO 59 = Mayorla de flores con pétalos formando pelotalBSTO 61 =Comienzo de floración: sobre un 10% e flores abiertaslBSTO 62 = sobre 20% de flores abiertaslBSTO 65 = Floración completa: al menos 50% de flores abiertas y carda de primeros pétaloslBSTO PRINFC = Pre-Infeccion

BACSPR = pulverizador de mochila o de mano kPa = kilopascal MUMIN = MiIIilitro por minuto KPH = kilometro por hora WATER =agua Uha =litros por hectarea Litros = litros de mezcla PUMP = bomba Litros =litros de mezcla

Tabla. 11 Valoración de resultados.

Trt Tratamiento Forma Forma Forma Lote Dosis Aplicación

No. Tipo Nombre Conc Unidad Tipo Codigo Descripcion Dosis Unidad Codigo 1 CHK Tesis no tratada no tratado

2 FUNG P. EXPERIMENTAL 100000000 CFU/g WP BS81101011

Bacillus subtilis cepa IAB/BS/03 0,2 kg/100 I ABC

3 FUNG P. EXPERIMENTAL 100000000 CFUlg WP BS81101011

Bacillus subtilis cepa IAB/BS/03 0,5 kg/100 I ABC

4 FUNG P. EXPERIMENTAL 100000000 CFU/g WP BS81101011

Bacillus subtilis cepa IAB/BS/03 1,0 kg/100 I ABC

5 FUNG Folicur 25 WG 25 % WG EQ13000608 Tebuconazole 0,075 kg/100 I ABC

Replicados: 4, elementos no tratados: 1, Hacer bajo BPUBEP: Si (BEP sin protección),

Diseño: Randomized Complete Block (RCB),

Unidades de tratamientos: Tratado 'parcela' tamaño, Forma seca. Unidad: %,

Tratado 'Parcela' tamaño anchura: 7 metros, Tratado 'parcela tamaño' anchura: 7 metros, Aplicación

volumen: 985.8 L/ha, tamaño mezcla: 22 litros, Mezcla total: 2680 mi,

Definiciones formato: G-AII7.def, G-AII7.frm

Tabla. 12 A. Descripción de las eficacias.

Monilinia laxa en árboles de albaricoques: porcentaje de brotes con flores afectadas

y porcentaje de flores afectadas en almenos 50 brotes por parcela. % Brotes con flores afectadas (ANOVA)

% Eficacia (Abbott formula) Tratamiento 22.03.11 (8 DA-C)

22.03.11 (8 DA-C) 1.-no tratado 40,91 a-2.-PRODUCTO EXPERIMENTAL (200 g/hl) 7,00 c 81,7 3.-PRODUCTO EXPERIMENTAL (500 g/hl) 21,51 b 45,8 4.-PRODUCTO EXPERIMENTAL (1000 g/hl) 15,50 b 59,9 5.-FOLlCUR 25 WG (75 g/hl) 5,00 c 88,5 FLORES % FLORES AFECTADAS (ANOVA) % Eficacia (Abbott formula) Treatment 22.03.11 (8 DA-C)

22.03.11 (8 DA-C) 1.-NO TRATADO 8,38 a-2.-PRODUCTO EXPERIMENTAL (200 g/hl) 1,37 b 82,8 3.-PRODUCTO EXPERIMENTAL (500 g/hl) 2,10 b 74,8 4.-PRODUCTO EXPERIMENTAL (1000 g/hl) 1,41 b 82,9 5.-FOLlCUR 25 WG (75 g/hl) 0,42 c 95,2 DA-C: dias después de aplicación C

Tabla. 12 B. Descripción de las eficacias.

Monilinia laxa en albaricoqueros: porcentaje de brotes con flores afectadas

y porcentaje de flores afectadas en al menos 50 brotes por parcela. BROTES % Brotes con flores afectadas (ANOVA) % Eficacia (Abbott formula) Tratamiento 22.03.11 (8 DA-C)

22.03.11 (8 DA-C) 1.-NO TRATADO 96,00 a-2.-PRODUCTO EXPERIMENTAL (200 g/hl) 45,00 b 53,7 3.-PRODUCTO EXPERIMENTAL (500 g/hl) 60,00 b 38,2 4.-PRODUCTO EXPERIMENTAL (1000 g/hl) 47,00 b 51,7 5.-FOLlCUR 25 WG (75 g/hl) 8,50 c 91,1 FLORES % FLORES AFECTADAS (ANOVA) % Efficacia (Abbott formula) Tratamiento 22.03.11 (8 DA-C)

22.03.11 (8 DA-C) 1.-NO TRATADO 74,27 a-2.-PRODUCTO EXPERIMENTAL (200 g/hl) 12,74 b 84,0 3.-PRODUCTO EXPERIMENTAL (500 g/hl) 26,94 b 65,2 4.-PRODUCTO EXPERIMENTAL (1000 g/hl) 30,26 b 62,6 5.-FOLlCUR 25 WG (75 g/hl) 0,92 c 98,6 DA-C: dias después de aplicación C

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Cepa de Bacillus subtilis IAB/BS03 depositada en la colección de cultivos tipo Alemana DSMZ con N° de Acceso DSM 24682, o un mutante de dicha cepa, donde dicha cepa y/o su mutante presentan actividad antifúngica y/o antibacteriana.
2.

La cepa y/o el mutante de dicha cepa según la reivindicación 1, caracterizada porque presenta un perfil de acción diferente al de otras cepas de Bacillus subtilis, y al menos 300 veces más potente en cuanto a su capacidad de actuar como agente de control biológico en campo.
3.

Un cultivo activo en caldo completo de la cepa y/o del mutante de dicha cepa descritos en las reivindicaciones 1 y 2.
4.

Un sobrenadante obtenido de un cultivo de la cepa y/o del mutante de dicha cepa descritos en las reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque exhibe actividad antifúngica y antibacteriana.
5.

Una composición que comprende al menos:

(i)

la cepa y/o el mutante de dicha cepa descritos en las reivindicaciones 1 y2;

(ii)

el cultivo activo en caldo completo descrito en la reivindicación 3; o

(iii) el sobrenadante descrito en la reivindicación 4.
6.

La composición según la reivindicación 5, que además incluye un plaguicida químico o biológico.
7.

Un método de protección o de tratamiento de plantas y frutos frente a infecciones fúngicas y/o bacterianas, que comprende aplicar una cantidad efectiva de la cepa y/o del mutante de dicha cepa descritos en las reivindicaciones 1 y 2, del cultivo activo en caldo completo descrito en la reivindicación 3, del sobrenadante descrito· en la reivindicación 4 o de la composición descrita en la reivindicación 5 y 6.
8.

El método según la reivindicación 7, caracterizado porque se administra al menos una dosis 300 veces menor de la cantidad efectiva de la cepa y/o del mutante de dicha cepa descritos en las reivindicaciones 1 y 2, del cultivo activo en caldo completo descrito en la reivindicación 3, del sobrenadante descrito en la reivindicación 4 o de la composición descrita en la reivindicación 5 y 6; para alcanzar la misma potencia fungicida que cuando se administra otra cepa de

Bacillus subfilis.
9. El método según las reivindicaciones 7 y 8, donde las infecciones fúngicas y/o bacterianas están causadas por al menos un microorganismo seleccionado de entre el siguiente grupo: Alfernaria sp, Bofrytis sp, Fusarium sp, Phytophfhora sp, Rhizocfonia sp, Sclerofinia sp, Verficillium sp, Leveillula sp, Venfuria sp, Plasmopara sp, Uncinula sp, pythium sp, Collefofrichum sp, Cladosporium sp, Monilinia sp, Acidovorax sp, Pseudomonas sp, Xanfhomonas sp, Erwinia sp, Clavi-bacfer sp, Sphaerofheca sp, y Peronospora sp.
10.

El método según las reivindicaciones 7 a 9, donde la cepa es aplicada como polvos humectables, gránulos, fluidos o microencapsulaciones.
11.

El método según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, donde la cepa y/o el mutante de dicha cepa descritos en las reivindicaciones 1 y 2, el cultivo activo en caldo completo descrito en la reivindicación 3, el sobrenadante descrito en la reivindicación 4 o la composición descrita en la reivindicación 5 y 6, son aplicados en un sitio seleccionado de entre el siguiente grupo: las raíces, las hojas, las flores, los frutos y el suelo alrededor de las raíces.
12.

Una composición que comprende los antibióticos y metabolitos secundarios producidos por la cepa y/o el mutante de dicha cepa descritos en las reivindicaciones 1 y 2, o sus combinaciones.
13.

La composición según la reivindicación 12, caracterizada porque los antibióticos se seleccionan de entre el siguiente grupo: ifurinas, surfacfinas, plipasfafinas, o una combinación de los mismos.
14.

La composición según las reivindicaciones 12 y 13, caracterizada porque los metabolitos secundarios se seleccionan de entre el siguiente grupo: compuesto, substancia o subproducto de una fermentación de la cepa y/o el

5 mutante de dicha cepa descritos en las reivindicaciones 1 y 2, que tenga actividad pesticida.

FIG.1

A.

Bacillus-subti/~'versus-Fusarium'oxysporumfl

B. ~.!!.l11!Jil.-cepa·C(Control)lI

Fusariumfl

B. -subtilis-cepa'IAB/BS0311

Disminución.cfel-crecimiento·

de-Fusaríum·92fY§EPru!JJ:del·

60%11