ES2402217T3

ES2402217T3 - Moléculas de unión humanas que pueden neutralizar el virus influenza H5N1 y usos de las mismas

Info

Publication number: ES2402217T3
Application number: ES07803310T
Authority: ES
Inventors: Edward Norbert Van Den Brink; Cornelis Adriaan De Kruif; Mark Throsby
Original assignee: Crucell Holand BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 2006-09-07
Filing date: 2007-09-06
Publication date: 2013-04-29
Anticipated expiration: 2027-09-06
Also published as: SG174773A1; EP2450378B1; EP2455398B1; BRPI0716983A2; EP2450376A2; EP2450376A3; MY165458A; EP2455399B1; DK2450379T3; EP2455398A2; EP2450376B1; PT2059532E; SI2059532T1; MX343198B; BRPI0716983B8; DK2450378T3; BRPI0716983B1; DK2455398T3; EP2455399A3; NZ574581A

Abstract

Anticuerpo humano aislado, o fragmento de unión a Anticuerpo humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que puede reconocer y unirse aantígeno del mismo, que puede reconocer y unirse a unepítopo en la subunidad HA2 de la proteína hema unepítopo en la subunidad HA2 de la proteína hemaglutinina (HA) de influenza, caracterizado porque glutinina (HA) de influenza, caracterizado porque dicho anticuerpoo fragmento de unión a antígeno dedicho anticuerpoo fragmento de unión a antígeno del mismo tiene actividad neutralizante contra un vil mismo tiene actividad neutralizante contra un virus influenza que comprendeHA del subtipo H5, tal rus influenza que comprendeHA del subtipo H5, tal como H5N1, H5N2, H5N8 y H5N9, y porque el anticuercomo H5N1, H5N2, H5N8 y H5N9, y porque el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno delmismo comprepo o fragmento de unión a antígeno delmismo comprende una región variable de cadena pesada que comprnde una región variable de cadena pesada que comprende los aminoácidos 1-121 de SEQ ID NO: 65y una rende los aminoácidos 1-121 de SEQ ID NO: 65y una región variable de cadena ligera que comprende los egión variable de cadena ligera que comprende los aminoácidos 1-112 de SEQ ID NO: 91. aminoácidos 1-112 de SEQ ID NO: 91.

Description

Moléculas de unión humanas que pueden neutralizar el virus influenza H5N1 y usos de las mismas

5 Campo de la invención

La invención se refiere a la medicina. En particular, la invención se refiere al diagnóstico, la profilaxis y/o el tratamiento de una infección por virus influenza H5N1.

Antecedentes de la invención

Los virus influenza consisten en tres tipos, A, B y C. Los virus influenza A infectan a una amplia variedad de aves y mamíferos, incluyendo seres humanos, caballos, mamíferos marinos, cerdos, hurones y pollos. En animales la mayoría de los virus influenza A provocan infecciones localizadas leves de las vías respiratorias y el tracto intestinal.

15 Sin embargo, existen cepas altamente patogénicas de influenza A tales como H5N1 que provocan infecciones sistémicas en aves de corral en las que la mortalidad puede alcanzar el 100%. Los animales infectados con influenza A actúan a menudo como reservorio para los virus influenza y se ha mostrado que ciertos subtipos cruzan la barrera entre especies hacia los seres humanos.

Los virus influenza A pueden clasificarse en subtipos basándose en variaciones alélicas en regiones antigénicas de dos genes que codifican para glicoproteínas de superficie, concretamente, hemaglutinina (HA) y neuraminidasa (NA) que se requieren para la unión viral y la liberación celular. Otras proteínas virales principales incluyen la nucleoproteína, la proteína estructural de la nucleocápsida, proteínas de membrana (M1 y M2), polimerasas (PA, PB y PB2) y proteínas no estructurales (NS1 y NS2).

25 Actualmente, se conocen dieciséis subtipos de HA (H1-H16) y nueve variantes antigénicas de NA (N1-N9) del virus influenza A. Anteriormente, sólo se conocía que tres subtipos circulaban en seres humanos (H1N1, H1N2 y H3N2). Sin embargo, en los últimos años, se ha notificado que el subtipo patogénico H5N1 de influenza aviar A cruza la barrera entre especies e infecta a seres humanos, tal como se documentó en Hong Kong en 1997 y 2003, conduciendo a la muerte de varios pacientes.

En seres humanos, el virus influenza aviar infecta a células de las vías respiratorias así como del tracto intestinal, hígado, bazo, riñones y otros órganos. Los síntomas de la infección por influenza aviar incluyen fiebre, dificultades respiratorias incluyendo dificultad para respirar y tos, linfopenia, diarrea y dificultades para regular los niveles de

35 glucemia. A diferencia de la influenza estacional el grupo con más riesgo son los adultos sanos que constituyen el grueso de la población. Debido a la alta patogenicidad de ciertos subtipos de influenza aviar A, particularmente H5N1, y su capacidad demostrada de cruzar para infectar a seres humanos, hay un riesgo económico y de salud pública significativo asociado a estas cepas virales, incluyendo una amenaza epidémica y pandémica real. La escala de la amenaza se ilustra por la pandemia de influenza de 1918 que mató a más de 50 millones de personas.

Actualmente, no hay vacunas eficaces disponibles para la infección por H5N1, de modo que la inmunoterapia pasiva con inmunoglobulinas puede ser una estrategia alternativa. Se notifica que el uso de inmunización pasiva durante la pandemia de 1918 disminuyó la tasa de mortalidad a la mitad. En vista de su beneficio terapéutico en seres humanos, hay por tanto una necesidad de moléculas de unión, preferiblemente moléculas de unión humanas, que

45 puedan neutralizar a H5N1. La presente invención proporciona estas moléculas de unión y muestra que pueden usarse en medicina, en particular para el diagnóstico, la prevención y/o el tratamiento de infecciones por H5N1.

Descripción de las figuras

En la figura 1 se presenta el análisis por inmunotransferencia de diferentes hemaglutininas (HA) usando anticuerpos CR6307 (parte izquierda), CR6323 (parte central) y CR5111 (parte derecha). Se sometieron HA recombinantes a análisis por SDS-PAGE reductora y análisis por inmunotransferencia. En los carriles 1 se muestra sHA de H5N1TV; en los carriles 2 se muestra HA recombinante, subtipo H5 (A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)); en los carriles 3 se muestra HA recombinante, subtipo H3 (A/Wyoming/3/2003(H3N2)); y en los carriles 4 se muestra HA recombinante,

55 subtipo H1 (A/New Caledonia/20/99 (H1N1)). También se indica la posición en la que pueden encontrarse HA0, HA1 y HA2.

La figura 2 muestra la puntuación clínica promedio por grupo de ratones en un estudio (ejemplo 12) en el que, un día antes de la infección con virus influenza H5N1, se trataron ratones profilácticamente con tres anticuerpos monoclonales contra H5N1 humanos CR6261, CR6323 y CR6325, en diferentes dosis.

La figura 3 muestra el cambio en el peso corporal durante el tratamiento profiláctico de ratones con anticuerpos anti-H5N1 durante 21 días tras la infección (ejemplo 12).

65 La figura 4 muestra el número de ratones supervivientes en los diferentes grupos en el estudio de las figuras 2 y 3 (ejemplo 12).

La figura 5 muestra la tasa de mortalidad en relación con la dosis administrada de anticuerpos anti-H5N1 en el estudio de la figuras 2-4 (ejemplo 12).

5 La figura 6 muestra la puntuación clínica promedio por grupo de ratones en un estudio (ejemplo 13) en el que se infectaron ratones con una dosis letal de virus influenza H5N1 y se trataron en diferentes puntos de tiempo tras la infección (4 h, 1, 2 y 3 días) con anticuerpo monoclonal anti-H5N1 CR6261, o un anticuerpo no relacionado CR2006 (administrado en el día 1 tras la infección).

La figura 7 muestra el número de animales supervivientes en cada grupo del estudio descrito en la figura 6. Todos los animales del grupo 1-4, excepto un animal en el grupo 1, sobrevivieron todo el estudio hasta el día 21 tras la infección. Todos los animales del grupo 5 habían muerto en el día 9.

La figura 8 muestra el peso corporal promedio de los ratones en cada grupo durante el estudio tal como se describe

15 para la figura 6. La medición del peso corporal de los ratones en el grupo 5 se detuvo en el día 9 ya que todos los ratones en ese grupo habían muerto en ese momento. Todos los ratones que quedaban en los grupos 1-4 alcanzaron niveles normales de peso corporal en el día 21 tras la infección, aunque la rapidez con la que se recuperó cada grupo dependió del tiempo de tratamiento.

La figura 9 muestra el porcentaje de animales supervivientes en cada grupo de un estudio en el que se infectaron ratones con una dosis letal de virus influenza H1N1 y se trataron en diferentes puntos de tiempo (1 día antes, 1, 2 y 3 días tras la infección) con anticuerpo monoclonal anti-H5N1 CR6261, o un anticuerpo no relacionado CR57 (administrado en el día 1 tras la infección).

25 La figura 10 muestra el peso corporal promedio de los ratones en cada grupo durante el estudio, tal como se describe para la figura 9. La medición del peso corporal de los ratones en el grupo 5 se detuvo en el día 9 ya que todos los ratones en ese grupo habían muerto en ese momento. Todos los ratones que quedaban en los grupos 1-4 alcanzaron niveles normales de peso corporal en el día 21 tras la infección, aunque la rapidez con la que se recuperó cada grupo dependió del tiempo de tratamiento.

Descripción de la invención

A continuación en el presente documento siguen definiciones de términos tal como se usan en la invención.

35 Tal como se usa en el presente documento, el término “molécula de unión” se refiere a una inmunoglobulina intacta, incluyendo anticuerpos monoclonales, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos, humanizados o humanos, o a un dominio de unión a antígeno y/o variable que comprende un fragmento de una inmunoglobulina que compite con la inmunoglobulina intacta por la unión específica a la pareja de unión de la inmunoglobulina, por ejemplo H5N1. Independientemente de la estructura, el fragmento de unión a antígeno se une al mismo antígeno que se reconoce por la inmunoglobulina intacta. Un fragmento de unión a antígeno puede comprender un péptido o polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de al menos 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200 ó 250 residuos de aminoácido contiguos de la secuencia de aminoácidos de la molécula de unión.

El término “molécula de unión”, tal como se usa en el presente documento, incluye todas las clases y subclases de

45 inmunoglobulina conocidas en la técnica. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, las moléculas de unión pueden dividirse en las cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de éstas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgA1, IgA2, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4.

Los fragmentos de unión a antígeno incluyen, entre otros, Fab, F(ab’), F(ab’)2, Fv, dAb, Fd, fragmentos de región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena simple (scFv), anticuerpos de cadena simple bivalentes, anticuerpos de fago de cadena simple, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos, (poli)péptidos que contienen al menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específica al (poli)péptido, etc. Los fragmentos anteriores pueden producirse sintéticamente o mediante escisión enzimática o

55 química de inmunoglobulinas intactas o pueden diseñarse por ingeniería genética mediante técnicas de ADN recombinante. Los métodos de producción se conocen bien en la técnica y se describen, por ejemplo, en Antibodies: A Laboratory Manual, editado por: E. Harlow y D, Lane (1988), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York. Una molécula de unión o fragmento de unión a antígeno de la misma pueden tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes.

La molécula de unión puede ser una molécula de unión desnuda o no conjugada pero también puede ser parte de un inmunoconjugado. Se pretende que una molécula de unión desnuda o no conjugada se refiera a una molécula de unión que no está conjugada, operativamente unida o física o funcionalmente asociada de otro modo a una etiqueta

o resto efector, tal como, entre otros, una sustancia tóxica, una sustancia radiactiva, un liposoma, una enzima. Se

65 entenderá que moléculas de unión desnudas o no conjugadas no excluyen moléculas de unión que se han estabilizado, multimerizado, humanizado o manipulado de cualquier otra manera, distinta a la unión de una etiqueta o resto efector. Por consiguiente, se incluyen en el presente documento todas las moléculas de unión desnudas y no conjugadas modificadas postraduccionalmente, incluyendo en las que las modificaciones se realizan en el entorno de células productoras de moléculas de unión natural, mediante una célula productora de moléculas de unión recombinante, y se introducen artificialmente tras una preparación inicial de moléculas de unión. Por supuesto, el

5 término molécula de unión desnuda o no conjugada no excluye la capacidad de la molécula de unión de formar asociaciones funcionales con células y/o moléculas efectoras tras su administración al organismo, ya que algunas de tales interacciones son necesarias con el fin de ejercer un efecto biológico. La falta de etiqueta o grupo efector asociado se aplica por tanto en la definición a la molécula de unión desnuda o no conjugada in vitro, no in vivo.

Tal como se usa en el presente documento, el término “muestra biológica” abarca una variedad de tipos de muestras, incluyendo sangre y otras muestras líquidas de origen biológico, muestras de tejido sólido tales como una muestra de biopsia o cultivos celulares, o células derivadas de los mismos y la progenie de las mismas. El término también incluye muestras que se han manipulado de cualquier manera tras su obtención, tal como mediante tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento con determinados componentes, tales como proteínas o

15 polinucleótidos. El término abarca diversos tipos de muestras clínicas obtenidas de cualquier especie y también incluye células en cultivo, sobrenadantes celulares y lisados celulares.

El término “regiones determinantes de la complementariedad” (CDR) tal como se usa en el presente documento significa secuencias dentro de las regiones variables de moléculas de unión, tales como inmunoglobulinas, que habitualmente contribuyen en gran medida al sitio de unión a antígeno que es complementario en cuanto a su forma y distribución de carga al epítopo reconocido en el antígeno. Las regiones CDR pueden ser específicas para epítopos lineales, epítopos discontinuos o epítopos conformacionales de proteínas o fragmentos de proteína, o bien tal como están presentes en la proteína en su conformación nativa o bien, en algunos casos, tal como están presentes en las proteínas desnaturalizadas, por ejemplo, mediante solubilización en SDS. Los epítopos también

25 pueden consistir en modificaciones postraduccionales de proteínas.

El término “deleción”, tal como se usa en el presente documento, indica un cambio en una secuencia o bien de aminoácidos o bien de nucleótidos, en el que están ausentes uno o más residuos de aminoácido o de nucleótido, respectivamente, en comparación con la molécula original, a menudo la que se produce de manera natural.

El término “secuencia de ácido nucleico reguladora de la expresión” tal como se usa en el presente documento se refiere a secuencias de polinucleótido necesarias para, y/o que afectan a, la expresión de una secuencia codificante operativamente unida en un organismo huésped particular. Las secuencias de ácido nucleico reguladoras de la expresión, tales como, entre otras, secuencias de iniciación, terminación, promotoras, potenciadoras de la

35 transcripción apropiadas; secuencias represoras o activadoras; señales de procesamiento de ARN eficaces tales como señales de corte y empalme y de poliadenilación; secuencias que estabilizan ARNm citoplasmático, secuencias que potencian la eficacia de la traducción (por ejemplo, sitios de unión a ribosoma); secuencias que potencian la estabilidad de las proteínas; y cuando se desea, secuencias que potencian la secreción de proteínas, pueden ser cualquier secuencia de ácido nucleico que presente actividad en el organismo huésped de elección y pueden derivarse de genes que codifican para proteínas, que son o bien homólogos o bien heterólogos para el organismo huésped. La identificación y empleo de secuencias reguladoras de la expresión es rutinaria para el experto en la técnica.

El término “variante funcional”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una molécula de unión que

45 comprende una secuencia de nucleótidos y/o aminoácidos que está alterada en uno o más nucleótidos y/o aminoácidos en comparación con las secuencias de nucleótidos y/o aminoácidos de la molécula de unión original y que todavía puede competir por la unión a la pareja de unión, por ejemplo H5N1, con la molécula de unión original. En otras palabras, las modificaciones en la secuencia de aminoácidos y/o nucleótidos de la molécula de unión original no afectan o alteran significativamente las características de unión de la molécula de unión codificada por la secuencia de nucleótidos o que contiene la secuencia de aminoácidos, es decir la molécula de unión todavía puede reconocer y unirse a su diana. La variante funcional puede tener modificaciones de secuencia conservativas, incluyendo sustituciones, adiciones y deleciones de nucleótidos y aminoácidos. Estas modificaciones pueden introducirse mediante técnicas convencionales conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR al azar, y pueden comprender nucleótidos y aminoácidos naturales así como no

55 naturales.

Las sustituciones de aminoácidos conservativas incluyen aquellas en las que el residuo aminoácido se reemplaza por un residuo de aminoácido que tiene propiedades estructurales o químicas similares. Se han definido en la técnica familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales ramificadas en beta (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano). Quedará 65 claro para el experto en la técnica que también pueden emplearse otras clasificaciones de familias de residuos de aminoácido distintas a la usada anteriormente. Además, una variante puede tener sustituciones de aminoácidos no

conservativas, por ejemplo, reemplazo de un aminoácido por un residuo de aminoácido que tiene diferentes propiedades estructurales o químicas. Variaciones minoritarias similares también pueden incluir deleciones o inserciones de aminoácidos, o ambas. Pueden encontrarse directrices para determinar qué residuos de aminoácido pueden sustituirse, insertarse o delecionarse sin suprimir la actividad inmunológica usando programas informáticos

5 bien conocidos en la técnica.

Una mutación en una secuencia de nucleótidos puede ser una única alteración realizada en un locus (una mutación puntual), tal como mutaciones por transición o transversión, o alternativamente, pueden insertarse, delecionarse o cambiarse múltiples nucleótidos en un único locus. Además, pueden realizarse una o más alteraciones en cualquier

10 número de loci dentro de una secuencia de nucleótidos. Las mutaciones pueden realizarse mediante cualquier método adecuado conocido en la técnica.

Se pretende que el término “huésped”, tal como se usa en el presente documento, se refiera a un organismo o una célula en el que se ha introducido un vector tal como un vector de clonación o un vector de expresión. El organismo

15 o la célula puede ser eucariota o procariota. Debe entenderse que se pretende que este término se refiera no sólo al organismo o la célula objeto particular, sino también a la progenie de un organismo o célula de este tipo. Ya que pueden ocurrir ciertas modificaciones en las generaciones descendientes debido o bien a mutación o bien a influencias ambientales, tal progenie puede no ser, de hecho, idéntica al organismo o la célula original, pero todavía se incluye dentro del alcance del término “huésped” tal como se usa en el presente documento.

20 El término “humano”, cuando se aplica a moléculas de unión tal como se definen en el presente documento, se refiere a moléculas que o bien se derivan directamente de un ser humano, o bien se basan en una secuencia humana. Cuando una molécula de unión se deriva de, o se basa en, una secuencia humana y se modifica posteriormente, todavía ha de considerarse humana tal como se usa a lo largo de toda la memoria descriptiva. En

25 otras palabras, se pretende que el término humano, cuando se aplica a moléculas de unión, incluya moléculas de unión que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de líneas germinales humanas o basadas en regiones variables o constantes que se producen en un ser humano o linfocito humano y modificadas de alguna forma. Por tanto, las moléculas de unión humanas pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de líneas germinales humanas, comprenden sustituciones y/o

30 deleciones (por ejemplo, mutaciones introducidas, por ejemplo, por mutagénesis al azar o específica de sitio in vitro

o por mutación somática in vivo). “Basado en” tal como se usa en el presente documento se refiere a la situación en la que una secuencia de ácido nucleico puede copiarse exactamente a partir de un molde o con mutaciones minoritarias, tal como mediante métodos de PCR propensa a errores, o prepararse sintéticamente correspondiendo con exactitud al molde o con modificaciones minoritarias. También se considera que moléculas semisintéticas

35 basadas en secuencias humanas son humanas tal como se usan en el presente documento.

El término “inserción”, también conocido como el término “adición”, indica un cambio en una secuencia de aminoácidos o de nucleótidos que da como resultado la adición de uno o más residuos de aminoácido o de nucleótido, respectivamente, en comparación con la secuencia original.

40 El término “aislado”, cuando se aplica a moléculas de unión tal como se definen en el presente documento, se refiere a moléculas de unión que están sustancialmente libres de otras proteínas o polipéptidos, particularmente libres de otras moléculas de unión que tienen diferentes especificidades antigénicas, y también están sustancialmente libres de otro material celular y/o productos químicos. Por ejemplo, cuando las moléculas de unión se producen de manera

45 recombinante, preferiblemente están sustancialmente libres de medio de cultivo, y cuando las moléculas de unión se producen mediante síntesis química, preferiblemente están sustancialmente libres de precursores químicos u otros productos químicos, es decir, están separadas de los precursores químicos u otros productos químicos que participan en la síntesis de la proteína. Se pretende que el término “aislado” cuando se aplica a moléculas de ácido nucleico que codifican para moléculas de unión tal como se definen en el presente documento, se refiera a

50 moléculas de ácido nucleico en las que las secuencias de nucleótidos que codifican para las moléculas de unión están libres de otras secuencias de nucleótidos, particularmente secuencias de nucleótidos que codifican para moléculas de unión que se unen a parejas de unión diferentes de H5N1. Además, el término “aislado” se refiere a moléculas de ácido nucleico que están sustancialmente separadas de otros componentes celulares que acompañan de manera natural a la molécula de ácido nucleico nativa en su huésped natural, por ejemplo, ribosomas,

55 polimerasas o secuencias genómicas con las que está asociada de manera natural. Además, las moléculas de ácido nucleico “aisladas”, tales como moléculas ADNc, pueden estar sustancialmente libres de otro material celular, o medio de cultivo cuando se producen mediante técnicas recombinantes, o sustancialmente libres de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetizan químicamente,

60 El término “anticuerpo monoclonal” tal como se usa en el presente documento se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de una única composición molecular. Un anticuerpo monoclonal presenta una única especificidad de unión y afinidad por un epítopo particular. Por consiguiente, el término “anticuerpo monoclonal humano” se refiere a un anticuerpo que presenta una única especificidad de unión que tiene regiones variables y constantes derivadas de, o basadas en, secuencias de inmunoglobulina de líneas germinales humanas o derivadas

65 de secuencias completamente sintéticas. El método de preparación del anticuerpo monoclonal no es relevante.

La expresión “que se produce de manera natural” tal como se usa en el presente documento aplicada a un objeto, se refiere al hecho de que un objeto puede encontrarse en la naturaleza. Por ejemplo, una secuencia de polipéptido o polinucleótido que está presente en un organismo, que puede aislarse de una fuente en la naturaleza y que no se ha modificado intencionalmente por el ser humano en el laboratorio, se produce de manera natural.

5 El término “molécula de ácido nucleico” tal como se usa en la presente invención se refiere a una forma polimérica de nucleótidos e incluye las cadenas tanto sentido como antisentido de ARN, ADNc, ADN genómico, y formas sintéticas y polímeros mixtos de los anteriores. Un nucleótido se refiere a un ribonucleótido, desoxinucleótido o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término también incluye formas monocatenaria y bicatenaria de ADN. Además, un polinucleótido puede incluir cualquiera de nucleótidos que se producen de manera natural y modificados, o ambos, unidos entre sí por uniones de nucleótidos que se producen de manera natural y/o que no se producen de manera natural. Las moléculas de ácido nucleico pueden estar modificadas química o bioquímicamente

o pueden contener bases de nucleótidos no naturales o derivatizadas, tal como apreciarán fácilmente los expertos en la técnica. Tales modificaciones incluyen, por ejemplo, etiquetas, metilación, sustitución de uno o más de los 15 nucleótidos que se producen de manera natural por un análogo, modificaciones internucleotídica tales como uniones sin carga (por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotriésteres, fosforamidatos, carbamatos, etc.), uniones cargadas (por ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc.), restos colgantes (por ejemplo, polipéptidos), agentes intercalantes (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), quelantes, alquilantes y uniones modificadas (por ejemplo, ácidos nucleicos alfaanoméricos, etc.). También se pretende que el término anterior incluya cualquier conformación topológica, incluyendo conformaciones monocatenaria, bicatenaria, dúplex parcial, tríplex, en horquilla, circular y en candado. También se incluyen moléculas sintéticas que imitan a polinucleótidos en cuanto a su capacidad de unirse a una secuencia designada mediante puentes de hidrógeno y otras interacciones químicas. Tales moléculas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, aquellas en las que uniones de péptido sustituyen a las uniones fosfato en la estructura principal de la molécula. Una referencia a una secuencia de ácido nucleico abarca su complemento a

25 menos que se especifique lo contrario. Por tanto, debe entenderse que una referencia a una molécula de ácido nucleico que tiene una secuencia particular abarca su cadena complementaria, con su secuencia complementaria. La cadena complementaria también es útil, por ejemplo, para terapia anti-sentido, sondas de hibridación y cebadores de PCR.

El término “unido operativamente” se refiere a dos o más elementos de secuencia de ácido nucleico que habitualmente están unidos físicamente y están en relación funcional entre sí. Por ejemplo, un promotor está unido operativamente a una secuencia codificante si el promotor puede iniciar o regular la transcripción o expresión de una secuencia codificante, en cuyo caso debe entenderse que la secuencia codificante está “bajo el control” del promotor.

35 Por “excipiente farmacéuticamente aceptable” quiere decirse cualquier sustancia inerte que se combina con una molécula activa tal como un fármaco, agente, o molécula de unión para preparar una forma farmacéutica conveniente o agradable. El “excipiente farmacéuticamente aceptable” es un excipiente que no es tóxico para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas, y es compatible con otros componentes de la formulación que comprende el fármaco, agente o molécula de unión. En la técnica se aplican ampliamente excipientes farmacéuticamente aceptables.

El término “unión específica”, tal como se usa en el presente documento, con referencia a la interacción de una molécula de unión, por ejemplo un anticuerpo, y su pareja de unión, por ejemplo un antígeno, significa que la

45 interacción depende de la presencia de una estructura particular, por ejemplo un determinante antigénico o epítopo, en la pareja de unión. En otras palabras, el anticuerpo se une o reconoce preferiblemente la pareja de unión incluso cuando la pareja de unión está presente en una mezcla de otras moléculas u organismos. La unión puede estar mediada por interacciones covalentes o no covalentes o una combinación de ambas. En otras palabras, el término “unión específica” significa unión inmunoespecífica a un antígeno o a un fragmento del mismo y no unión inmunoespecífica a otros antígenos. Una molécula de unión que se une inmunoespecíficamente a un antígeno puede unirse a otros péptidos o polipéptidos con menor afinidad, tal como se determina, por ejemplo, mediante radioinmunoensayo (RIA), ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), BIACORE, u otros ensayos conocidos en la técnica. Las moléculas de unión o fragmentos de las mismas que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno pueden tener reactividad cruzada con antígenos relacionados. Preferiblemente, las moléculas de unión

55 o fragmentos de las mismas que se unen inmunoespecíficamente a un antígeno no tienen reactividad cruzada con otros antígenos.

Una “sustitución”, tal como se usa en el presente documento, indica el reemplazo de uno o más aminoácidos o nucleótidos por aminoácidos o nucleótidos diferentes, respectivamente.

El término “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad de la molécula de unión tal como se define en el presente documento que es eficaz para prevenir, mejorar y/o tratar un estado que resulta de una infección con H5N1.

65 El término “tratamiento” se refiere al tratamiento terapéutico así como a medidas profilácticas o preventivas para curar o detener o al menos retrasar la progresión de la enfermedad. Aquellos que necesitan tratamiento incluyen aquellos ya afectados por un estado que resulta de una infección con H5N1 así como aquellos en los que tiene que prevenirse la infección con H5N1. Sujetos parcial o totalmente recuperados de una infección con H5N1 también pueden necesitar tratamiento. La prevención abarca inhibir o reducir la propagación de H5N1 o inhibir o reducir la aparición, el desarrollo o la progresión de uno o más de los síntomas asociados con la infección por H5N1.

5 El término “vector” indica una molécula de ácido nucleico en la que puede insertarse una segunda molécula de ácido nucleico para su introducción en un huésped en el que se replicará y, en algunos casos, se expresará. En otras palabras, un vector puede transportar una molécula de ácido nucleico a la que se ha unido. Se contemplan en el término “vector”, tal como se usa en el presente documento, vectores de clonación así como de expresión. Los vectores incluyen, pero no se limitan a, plásmidos, cósmidos, cromosomas artificiales bacterianos (BAC) y cromosomas artificiales de levadura (YAC) y vectores derivados de bacteriófagos o virus de plantas o animales (incluyendo seres humanos). Los vectores comprenden un origen de replicación reconocido por el huésped propuesto y, en caso de vectores de expresión, regiones promotoras y otras reguladoras reconocidas por el huésped. Un vector que contiene una segunda molécula de ácido nucleico se introduce en una célula mediante

15 transformación, transfección o usando mecanismos de entrada viral. Ciertos vectores pueden realizar replicación autónoma en un huésped en el que se introducen (por ejemplo, vectores que tienen un origen de replicación bacteriano pueden replicarse en bacterias). Otros vectores pueden integrarse en el genoma de un huésped después de su introducción en el huésped, y de ese modo se replican junto con el genoma del huésped.

Sumario de la invención

La invención proporciona moléculas de unión humanas que pueden unirse específicamente a virus influenza H5N1 y que muestran actividad neutralizante contra H5N1 tal como se define en las reivindicaciones. La invención también proporciona moléculas de unión que se unen a un epítopo en la proteína hemaglutinina que se comparte entre

25 subtipos de influenza y por tanto se refiere a moléculas de unión que reaccionan de manera cruzada entre subtipos basados en influenza H5, H1, H2, H6 y H9, tales como H5N1, H1N1 y otras cepas de influenza que contienen la proteína HA con esos epítopos particulares tal como se define en las reivindicaciones. La invención también se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican para al menos la región de unión de las moléculas de unión humanas. La invención proporciona además el uso de las moléculas de unión humanas de la invención en la profilaxis y/o el tratamiento de un sujeto que tiene, o está en riesgo de desarrollar, una infección por H5N1. Además de eso, la invención se refiere al uso de las moléculas de unión humanas de la invención en el diagnóstico/detección de H5N1.

Descripción detallada

35 En un primer aspecto la presente invención abarca moléculas de unión que pueden unirse específicamente a virus influenza A, particularmente subtipo H5N1 del virus influenza A tal como se define en las reivindicaciones. Las moléculas de unión son moléculas de unión humanas. Las moléculas de unión de la invención presentan actividad neutralizante contra subtipo H5N1 del virus influenza A. En un aspecto adicional las moléculas de unión de la invención pueden unirse específicamente a y/o tienen actividad neutralizante contra cepas de virus influenza H5N1 diferentes. Estas cepas pueden ser un miembro de cepas de virus influenza H5N1 de clado 1, clado 2 o clado 3. Análisis filogenéticos de los genes de HA de los brotes de H5N1 de 2004 y de 2005 mostraron dos linajes diferentes de genes de HA, denominados clados 1 y 2. Los virus en cada uno de estos clados se distribuyen en regiones geográficas no solapantes de Asia. Los virus H5N1 de la península de Indochina están estrechamente agrupados

45 dentro del clado 1, mientras que los aislados de H5N1 de diversos países circundantes son distintos de los aislados del clado 1 y pertenecen al clado 2 más divergente. Se aislaron virus H5N1 del clado 1 de seres humanos y aves en Vietnam, Tailandia y Cambodia, pero sólo de aves en Laos y Malasia. Los virus del clado 2 se encontraron en virus aislados exclusivamente de aves en China, Indonesia, Japón y Corea del Sur. Virus aislados de aves y seres humanos en Hong Kong en 2003 y 1997 constituyen los clados 1’ (también clasificado en la categoría de clado 1) y 3, respectivamente (véase WHO Global Influenza Program Surveillance Network, 2005). Las hemaglutininas de los clados se diferencian en sus secuencias de aminoácidos. Los ejemplos de cepas del clado 1 incluyen, pero no se limitan a, A/Hong Kong/213/03, A/Vietnam/1194/04, A/Vietnam/1203/04 y A/Thailand/1(KAN-1)/2004. Los ejemplos de cepas del clado 2 incluyen, pero no se limitan a, A/Indonesia/5/05, A/bar headed goose/Qinghai/1A/05, A/turkey/Turkey/1/05 y A/Anhui/1/05. Los ejemplos de cepas del clado 3 incluyen, pero no se limitan a, A/Hong

55 Kong/156/97 y A/goose/Guangdong/1/96. Pueden encontrarse otras cepas, por ejemplo, en WHO Global Influenza Program Surveillance Network, 2005 y en http://www.who.int/csr/disease/avian_influenza/guidelines/recommendationvaccine.pdf Preferiblemente, las moléculas de unión de la invención pueden unirse específicamente a, y tienen actividad neutralizante contra, cepas del clado 1, clado 2 y clado 3. Las moléculas de unión de la invención pueden unirse específicamente a virus influenza H5N1 que son viables, están vivos y/o son infecciosos o que están en forma inactivada/atenuada. En la técnica se conocen bien métodos para inactivar/atenuar virus influenza H5N1 e incluyen, pero no se limitan a, tratamiento con formalina, β-propiolactona (BPL), mertiolato y/o luz ultravioleta.

Las moléculas de unión de la invención también pueden unirse específicamente a uno o más fragmentos de virus

65 influenza H5N1 tales como, entre otros, una preparación de una o más proteínas y/o (poli)péptidos derivados del subtipo H5N1 o una o más proteínas y/o polipéptidos de H5N1 producidos de manera recombinante. Para métodos

de tratamiento y/o prevención de infecciones por H5N1 preferiblemente las moléculas de unión pueden unirse específicamente a proteínas accesibles en la superficie de H5N1 tales como las glicoproteínas de superficie, hemaglutinina (HA), que se requiere para la unión viral y la liberación celular. Pueden unirse específicamente a la subunidad HA1 y HA2 de la molécula de HA. Pueden unirse específicamente a epítopos lineales o estructurales y/o 5 conformacionales en la subunidad HA1 y/o HA2 de la molécula de HA. La molécula de HA puede purificarse de virus

o producirse de manera recombinante y opcionalmente aislarse antes de su uso. Alternativamente, puede expresarse HA sobre la superficie de células.

En otra realización las moléculas de unión de la invención pueden unirse específicamente a un fragmento de las proteínas y/o polipéptidos mencionados anteriormente, comprendiendo el fragmento al menos un determinante antigénico reconocido por las moléculas de unión de la invención. Un “determinante antigénico” tal como se usa en el presente documento es un resto que puede unirse a una molécula de unión de la invención con afinidad suficientemente alta como para formar un complejo detectable de antígeno-molécula de unión. Las moléculas de unión de la invención pueden unirse específicamente a la parte extracelular de HA (también denominada en el

15 presente documento HA soluble (sHA)).

Las moléculas de unión de la invención pueden ser moléculas de inmunoglobulina intactas tales como anticuerpos policlonales o monoclonales o las moléculas de unión pueden ser fragmentos de unión a antígeno incluyendo, pero sin limitarse a, Fab, F(ab’), F(ab’)2, Fv, dAb, Fd, fragmentos de la región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena simple (scFv), anticuerpos de cadena simple bivalentes, anticuerpos de fago de cadena simple, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y (poli)péptidos que contienen al menos un fragmento de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir unión a antígeno específica a cepas de virus influenza H5N1 o un fragmento del mismo. En una realización preferida las moléculas de unión de la invención son anticuerpos monoclonales humanos.

25 Las moléculas de unión de la invención pueden usarse en forma no aislada o aislada. Además, las moléculas de unión de la invención pueden usarse solas o en una mezcla que comprende al menos una molécula de unión (o variante o fragmento de la misma) de la invención. En otras palabras, las moléculas de unión pueden usarse en combinación, por ejemplo, como composición farmacéutica que comprende dos o más moléculas de unión de la invención, variantes o fragmentos de las mismas. Por ejemplo, pueden combinarse moléculas de unión que tienen actividades diferentes, pero complementarias, en una única terapia para lograr un efecto profiláctico, terapéutico o de diagnóstico deseado, pero alternativamente, también pueden combinarse moléculas de unión que tienen actividades idénticas en una única terapia para lograr un efecto profiláctico, terapéutico o de diagnóstico deseado. Opcionalmente, la mezcla comprende además al menos otro agente terapéutico. Preferiblemente, el agente

35 terapéutico tal como, por ejemplo, inhibidores de M2 (por ejemplo, amantidina, rimantadina) y/o inhibidores de neuraminidasa (por ejemplo, zanamivir, oseltamivir) es útil en la profilaxis y/o el tratamiento de una infección por virus influenza H5N1.

Normalmente, las moléculas de unión según la descripción pueden unirse a sus parejas de unión, es decir virus influenza H5N1 o fragmentos del mismo, con una constante de afinidad (valor de Kd) que es inferior a 0,2x10-4 M, 1,0x10-5 M, 1,0x10-6 M, 1,0x10-7 M, preferiblemente inferior a 1,0x10-8 M, más preferiblemente inferior a 1,0x10-9 M, más preferiblemente inferior a 1,0x10-10 M, incluso más preferiblemente inferior a 1,0x10-11 M, y en particular inferior a 1,0x10-12 M. Las constantes de afinidad puede variar para isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, unión con afinidad para un isotipo IgM se refiere a una afinidad de unión de al menos aproximadamente 1,0x10-7 M. Las constantes de

45 afinidad pueden medirse por ejemplo usando resonancia de plasmón superficial, por ejemplo usando el sistema BIACORE (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia).

Las moléculas de unión según la invención se unen a virus influenza H5N1 o un fragmento del mismo en forma soluble tal como por ejemplo en una muestra o en una suspensión o pueden unirse a virus influenza H5N1 o un fragmento del mismo unido o fijado a un portador o sustrato, por ejemplo, placas de microtitulación, membranas y perlas, etc. Los portadores o sustratos pueden fabricarse de vidrio, plástico (por ejemplo, poliestireno), polisacáridos, nailon, nitrocelulosa o teflón, etc. La superficie de tales soportes puede ser maciza o porosa y de cualquier forma conveniente. Además, las moléculas de unión pueden unirse a virus influenza H5N1 en forma purificada/aislada o no purificada/no aislada.

55 Las moléculas de unión de la invención muestran actividad neutralizante. La actividad neutralizante puede medirse por ejemplo tal como se describe en el presente documento. Ensayos alternativos que miden la actividad neutralizante se describen por ejemplo en WHO Manual on Animal Influenza Diagnosis and Surveillance, Geneva: World Health Organisation, 2005, versión 2002,5. La presente invención se refiere a una molécula de unión humana aislada que puede reconocer y unirse a un epítopo en la subunidad HA2 de la proteína hemaglutinina (HA) de influenza, caracterizada porque dicha molécula de unión tiene actividad neutralizante contra un virus influenza que comprende HA del subtipo H5 tal como se define en la reivindicación 1. Ejemplos de cepas de influenza que contienen tal HA del subtipo H5 y que son cepas importantes, a la vista de las amenazas pandémicas, son H5N1, H5N2, H5N8 y H5N9. El anticuerpo murino conocido que se describió en la técnica (C179) que también se une al

65 mismo epítopo en el dominio HA2 también depende de la unión a un epítopo en el dominio HA1 de la proteína HA. Esto es una desventaja porque contribuye a la posibilidad de mutantes de escape que ya no se reconocen por el anticuerpo. Además, varios anticuerpos de la presente descripción (tales como CR6307 y CR6323) no dependen de epítopos conformacionales y reconocen el epítopo de HA2 incluso en una forma reducida (cuando se usan en inmunotransferencia de tipo Western). Esto es una ventaja con respecto a los anticuerpos de la técnica porque cuando se induce un cambio conformacional en la proteína HA debido a cualquier mutación en otra parte de la

5 proteína, tal cambio conformacional lo más probablemente no dificultará la unión de los anticuerpos de la presente invención al epítopo de HA2, mientras que es muy posible que los anticuerpos que sí dependen de la conformación no puedan unirse cuando se producen tales mutaciones.

La molécula de unión según la invención también tiene actividad neutralizante contra un virus influenza que comprende HA del subtipo H1, y preferiblemente teniendo también dicha molécula de unión actividad neutralizante contra un virus influenza que comprende HA del subtipo H2, H6 y/o H9. Se ha mostrado en el presente documento que las moléculas de unión de la presente invención interaccionan con un epítopo presente en los epítopos de HA2 presentes en los subtipos H5, H1, H2, H6 y H9, y se ha mostrado que las moléculas de unión de la presente invención neutralizan de manera cruzada entre subtipos de influenza debido a que se comparten estos epítopos. Se

15 concluye que las moléculas de unión de la presente invención que dependen de la unión a esa parte particular en el dominio HA2 (y no en otro epítopo (propenso a mutaciones) en HA1) pueden neutralizar de manera cruzada entre subtipos de virus influenza ya que no parecen depender de la unión a dominios dentro de HA1, lo que puede alterarse significativamente debido a derivas antigénicas. El experto en la técnica, basándose en lo que se ha descrito en el presente documento, puede ahora determinar si un anticuerpo realmente reacciona de manera cruzada con proteínas HA de diferentes subtipos y también determinar si pueden neutralizar los virus influenza de diferentes subtipos in vivo.

En otro aspecto preferido de la invención la molécula de unión de la presente invención se une a un epítopo en la subunidad HA2 que se selecciona del grupo que consiste en la secuencia de aminoácidos: GVTNKVNSIIDK (SEQ 25 ID NO: 368), GVTNKVNSIINK (SEQ ID NO: 369), GVTNKENSIIDK (SEQ ID NO: 370), GVTNKVNRIIDK (SEQ ID NO: 371), GITNKVNSVIEK (SEQ ID NO: 372), GITNKENSVIEK (SEQ ID NO: 373), GITNKVNSIIDK (SEQ ID NO: 374) y KITSKVNNIVDK (SEQ ID NO: 375). Tal como puede concluirse a partir de los datos mostrados en la tabla 13, determinadas moléculas de unión de la presente descripción, CR6261, CR6325 y CR6329, interaccionan con el epítopo GVTNKVNSIIDK (SEQ ID NO: 368) presente en H5N1, y no se ven afectadas por una mutación en el epítopo TGLRN en HA1 que sí que influye en la unión de C179. Además, algunas moléculas de unión, tales como CR6307 y CR6323, no se ven afectadas ni siquiera por un mutante de escape, tal como se da a conocer en Okuno et al. (1993) con una mutación de valina -> ácido glutámico en la posición 6 (mostrado a modo de ejemplo por GVTNKENSIIDK (SEQ ID NO: 370)). Este epítopo es parte de una hélice alfa extendida en la región HA2. Los residuos en este supuesto epítopo que se predice que son los más expuestos a disolvente están subrayados en

35 negrita: GVTNKENSIIDK (SEQ ID NO: 370). Estos aminoácidos serán los más accesibles para una molécula de unión y, por tanto, pueden formar la región más importante del epítopo. Concordando con esta noción, los aminoácidos destacados están absolutamente conservados en cuanto a su identidad y posición en todas las secuencias presentadas. Puede usarse este conocimiento para predecir epítopos de unión en subtipos de influenza que no llevan las mismas secuencias que las anteriores (es decir cepas H3, H7 y B).

En el presente documento se dan a conocer moléculas de unión que se seleccionan del grupo que consiste en: a) una molécula de unión que comprende una región CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 1, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 2, y una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 3, b) una molécula de unión que comprende una región CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 16, una región CDR2 de cadena pesada 45 de SEQ ID NO: 17, y una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 18, c) una molécula de unión que comprende una región CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 1, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 22, y una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 23, d) una molécula de unión que comprende una región CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 27, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 28, y una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 29, e) una molécula de unión que comprende una región CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 39, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 40, y una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 41, f) una molécula de unión que comprende una región CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 45, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 46, y una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 47, g) una molécula de unión que comprende una región CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 1, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 49, y una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 55 50, h) una molécula de unión que comprende una región CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 52, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 53, y una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 54, i) una molécula de unión que comprende una región CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 262, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 263, y una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 264, j) una molécula de unión que comprende una región CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 268, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 269, y una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 270, k) una molécula de unión que comprende una región CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 274, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 275, y una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 276, l) una molécula de unión que comprende una región CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 280, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 281, y una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 282, m) una molécula de unión que comprende 65 una región CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 286, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 287, y una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 288, n) una molécula de unión que comprende una región

CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 292, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 293, y una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 294, o) una molécula de unión que comprende una región CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO: 304, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 305, y una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 306, y p) una molécula de unión que comprende una región CDR1 de cadena

5 pesada de SEQ ID NO: 310, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO: 311, y una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO: 312.

En una realización preferida, la molécula de unión según la invención es para su uso como medicamento y preferiblemente para el tratamiento de diagnóstico, terapéutico y/o profiláctico de infección por influenza. En un aspecto de tal uso, dicha infección por influenza está provocada por un virus influenza que está asociado con un brote pandémico, o tiene el potencial de asociarse con un brote pandémico (véase el documento WO 2007/045674 y las tablas en ese documento). Preferiblemente, la cepa de virus influenza que está asociada con un brote pandémico y en la que la enfermedad provocada por esas cepas puede tratarse mediante las moléculas de unión de la presente invención, se selecciona del grupo que consiste en H1N1, H5N1, H5N2, H5N8, H5N9, virus basados en H2, y H9N2.

15 La presente invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende una molécula de unión según la invención, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

En aún otra realización la invención se refiere a un uso de una molécula de unión según la invención en la preparación de un medicamento para el diagnóstico, la profilaxis y/o el tratamiento de una infección por virus influenza. Tales infecciones pueden producirse en pequeñas poblaciones, pero también pueden extenderse por todo el mundo en epidemias estacionales o, peor, en pandemias globales en las que millones de individuos están en riesgo. La invención proporciona moléculas de unión que pueden neutralizar la infección por cepas de influenza que provocan tales epidemias estacionales así como posibles pandemias. Resulta importante que ahora pueden 25 considerarse la protección y el tratamiento con las moléculas de unión de la presente invención en relación con múltiples cepas de influenza ya que se ha dado a conocer que debido a la unión de un epítopo que se comparte entre proteínas HA de diferentes cepas de influenza, ahora es posible la neutralización cruzada entre tales cepas usando las moléculas de unión de la presente invención. Esto es altamente ventajoso ya que las moléculas de unión pueden proteger a mamíferos cuando se administran o bien antes o bien después de la infección (tal como se da a conocer en los ejemplos), y por tanto también cuando no está claro (en fases iniciales de aparición) si la infección está provocada por una cepa basada en H1, H2, H5, H6 o H9. Los profesionales sanitarios, fuerzas militares así como la población general pueden tratarse de manera profiláctica, o tratarse tras la infección, con las moléculas de unión de la presente invención. Potencialmente, las moléculas de unión de la presente invención pueden prepararse y almacenarse en enormes reservas ya que esto proporcionará protección contra diferentes cepas pandémicas, y

35 esto será beneficioso en el nivel de preparación para posibles pandemias de influenza en el futuro.

En una realización preferida, las moléculas de unión humanas tal como se reivindican comprenden una región CDR1 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, una región CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, una región CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, una región CDR1 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, una región CDR2 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 y una región CDR3 de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15.

En una realización específica las moléculas de unión tal como se reivindican comprenden una región CDR1 de

45 cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, una región CDR2 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y una región CDR3 de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3. Las regiones CDR de las moléculas de unión de la descripción se muestran en la tabla 7. Las regiones CDR son según Kabat et al. (1991) tal como se describe en Sequences of Proteins of Immunological Interest. En una realización de la presente invención las moléculas de unión pueden comprender dos, tres, cuatro, cinco o las seis regiones CDR tal como se da a conocer en el presente documento. Preferiblemente, una molécula de unión según la presente descripción comprende al menos dos de las CDR dadas a conocer en el presente documento.

En una realización las moléculas de unión de la descripción comprenden la línea germinal de VH VH1-69 (véase

55 Tomlinson IM, Williams SC, Ignatovitch O, Corbett SJ, Winter G. V-BASE Sequence Directory. Cambridge United Kingdom: MRC Centre for Protein Engineering (1997)). En aún otra realización, las moléculas de unión según la descripción comprenden una cadena pesada que comprende la cadena pesada variable de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 59, SEQ ID NO: 61, SEQ ID NO: 63, SEQ ID NO: 65, SEQ ID NO: 67, SEQ ID NO: 69, SEQ ID NO: 71, SEQ ID NO: 73, SEQ ID NO: 75, SEQ ID NO: 77, SEQ ID NO: 79, SEQ ID NO: 81, SEQ ID NO: 83, SEQ ID NO: 317, SEQ ID NO: 321, SEQ ID NO: 325, SEQ ID NO: 329, SEQ ID NO: 333, SEQ ID NO: 337, SEQ ID NO: 341, SEQ ID NO: 345, SEQ ID NO: 349, SEQ ID NO: 353, SEQ ID NO: 357, SEQ ID NO: 361 y SEQ ID NO: 365. En una realización adicional, las moléculas de unión según la descripción comprenden una cadena ligera que comprende la cadena ligera variable de la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 85, SEQ ID NO: 87, SEQ ID NO: 89, SEQ ID NO: 91, SEQ ID

65 NO: 93, SEQ ID NO: 95, SEQ ID NO: 97, SEQ ID NO: 99, SEQ ID NO: 101, SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 319, SEQ ID NO: 323, SEQ ID NO: 327, SEQ ID NO: 331, SEQ ID NO: 335, SEQ ID NO: 339, SEQ ID NO: 343, SEQ ID NO: 347, SEQ ID NO: 351, SEQ ID NO: 355, SEQ ID NO: 359, SEQ ID NO: 363 y SEQ ID NO: 367. La tabla 8 especifica las regiones variables de cadena pesada y ligera de la molécula de unión de la descripción.

5 Otro aspecto de la descripción incluye variantes funcionales de las moléculas de unión tal como se definen en el presente documento. Se considera que las moléculas son variantes funcionales de una molécula de unión según la invención, si las variantes pueden competir por la unión específica a virus influenza H5N1 o a un fragmento del mismo con las moléculas de unión originales. En otras palabras, cuando las variantes funcionales todavía pueden unirse a virus influenza H5N1 o a un fragmento del mismo. Preferiblemente, las variantes funcionales pueden competir por la unión específica a al menos dos (o más) cepas de virus influenza H5N1 diferentes o fragmentos de las mismas a las que se unen específicamente las moléculas de unión originales. Además, se considera que las moléculas son variantes funcionales de una molécula de unión según la descripción, si tienen actividad neutralizante contra virus influenza H5N1, preferiblemente contra las al menos dos (o más) cepas de virus influenza H5N1 contra las que la molécula de unión original muestra actividad neutralizante. Las variantes funcionales incluyen, pero no se

15 limitan a, derivados que son sustancialmente similares en la secuencia estructural primaria, pero que contienen por ejemplo modificaciones in vitro o in vivo, químicas y/o bioquímicas, que no se encuentran en la molécula de unión original. Tales modificaciones incluyen, entre otras, acetilación, acilación, unión covalente de un nucleótido o derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o derivado de lípido, reticulación, formación de puentes disulfuro, glicosilación, hidroxilación, metilación, oxidación, pegilación, procesamiento proteolítico, fosforilación, y similares.

Alternativamente, las variantes funcionales pueden ser moléculas de unión tal como se definen en la presente descripción que comprenden una secuencia de aminoácidos que contiene sustituciones, inserciones, deleciones o combinaciones de las mismas de uno o más aminoácidos en comparación con las secuencias de aminoácidos de las 25 moléculas de unión originales. Además, las variantes funcionales pueden comprender truncamientos de la secuencia de aminoácidos en cualquiera o ambos de los extremos amino o carboxilo terminal. Las variantes funcionales según la invención pueden tener afinidades de unión iguales o diferentes, o bien superiores o bien inferiores, en comparación con la molécula de unión original pero todavía pueden unirse a virus influenza H5N1 o a un fragmento del mismo. Por ejemplo, las variantes funcionales según la descripción pueden tener afinidades de unión aumentadas o disminuidas para virus influenza H5N1 o un fragmento del mismo en comparación con las moléculas de unión originales. Preferiblemente, se modifican las secuencias de aminoácidos de las regiones variables, incluyendo, pero sin limitarse a, regiones de entramado, regiones hipervariables, en particular las regiones CDR3. Generalmente, las regiones variables de cadena ligera y de cadena pesada comprenden tres regiones hipervariables, que comprende tres CDR, y regiones más conservadas, las denominadas regiones de entramado 35 (FR). Las regiones hipervariables comprenden residuos de aminoácido de CDR y residuos de aminoácido de bucles hipervariables. Las variantes funcionales que se pretende que se encuentren dentro del alcance de la presente descripción tienen de al menos aproximadamente el 50% a aproximadamente el 99%, preferiblemente de al menos aproximadamente el 60% a aproximadamente el 99%, más preferiblemente de al menos aproximadamente el 70% a aproximadamente el 99%, incluso más preferiblemente de al menos aproximadamente el 80% a aproximadamente el 99%, lo más preferiblemente de al menos aproximadamente el 90% a aproximadamente el 99%, en particular de al menos aproximadamente el 95% a aproximadamente el 99%, y en particular de al menos aproximadamente el 97% a aproximadamente el 99% de homología de secuencia de aminoácidos con las moléculas de unión originales tal como se definen en el presente documento. Pueden usarse algoritmos informáticos tales como, entre otros, Gap o Bestfit, conocidos por un experto en la técnica, para alinear de manera óptima secuencias de aminoácidos para

45 compararlas y para definir residuos de aminoácido similares o idénticos. Pueden obtenerse variantes funcionales alterando las moléculas de unión originales o partes de las mismas mediante métodos de biología molecular generales conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, PCR propensa a errores, mutagénesis dirigida por oligonucleótidos, mutagénesis dirigida al sitio e intercambio de cadena pesada y/o ligera. En una realización las variantes funcionales de la descripción tienen actividad neutralizante contra virus influenza H5N1. La actividad neutralizante puede o bien ser idéntica, o bien ser superior o inferior en comparación con las moléculas de unión originales. En lo sucesivo, cuando se usa el término molécula de unión (humana), esto también abarca variantes funcionales de la molécula de unión (humana).

En aún un aspecto adicional, la invención incluye inmunoconjugados, es decir moléculas que comprenden al menos

55 una molécula de unión tal como se reivindica y que comprende además al menos una etiqueta, tal como, entre otras, un resto/agente detectable. También se contemplan en la presente invención mezclas de inmunoconjugados según la invención o mezclas de al menos un inmunoconjugado según la invención y otra molécula, tal como un agente terapéutico u otra molécula de unión o inmunoconjugado. En una realización adicional, los inmunoconjugados de la invención pueden comprender más de una etiqueta. Estas etiquetas pueden ser iguales o distintas entre sí y pueden unirse/conjugarse de manera no covalente a las moléculas de unión. La(s) etiqueta(s) también puede(n) unirse/conjugarse directamente a las moléculas de unión humanas mediante enlace covalente. Alternativamente, la(s) etiqueta(s) puede(n) unirse/conjugarse a las moléculas de unión por medio de uno o más compuestos de unión. Los expertos en la técnica conocen bien técnicas para conjugar etiquetas a moléculas de unión.

65 Las etiquetas de los inmunoconjugados de la presente invención pueden ser agentes terapéuticos, pero también pueden se restos/agentes detectables. Etiquetas adecuadas en terapia y/o prevención pueden ser toxinas o partes

funcionales de las mismas, antibióticos, enzimas, otras moléculas de unión que potencian la fagocitosis o estimulación inmunitaria. Pueden usarse inmunoconjugados que comprenden un agente detectable como diagnóstico, por ejemplo, para evaluar si un sujeto se ha infectado por una cepa de virus influenza H5N1 o para monitorizar el desarrollo o la progresión de una infección por virus influenza H5N1 como parte de un procedimiento 5 de pruebas clínicas, por ejemplo, para determinar la eficacia de un régimen de tratamiento dado. Sin embargo, también pueden usarse para otros fines de detección y/o analíticos y/o de diagnóstico. Los restos/agentes detectables incluyen, pero no se limitan a, enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes, materiales bioluminiscentes, materiales radiactivos, metales que emiten positrones e iones de metales paramagnéticos no radiactivos. Las etiquetas usadas para etiquetar las moléculas de unión para fines de detección y/o analíticos y/o de diagnóstico dependen de las técnicas y/o métodos de detección/análisis/diagnóstico específicos usados tales como, entre otros, tinción inmunohistoquímica de muestras (tisulares), detección por citometría de flujo, detección por citometría por barrido con láser, inmunoensayos fluorescentes, ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos (RIA), bioensayos (por ejemplo, ensayos de fagocitosis), aplicaciones de inmunotransferencia de tipo Western, etc. Las etiquetas adecuadas para las técnicas

15 y/o métodos de detección/análisis/diagnóstico conocidos en la técnica están dentro del alcance del experto en la técnica.

Además, las moléculas de unión humanas o inmunoconjugados de la invención también pueden fijarse a soportes sólidos, que son particularmente útiles para inmunoensayos in vitro o purificación de virus influenza H5N1 o un fragmento del mismo. Tales soportes sólidos pueden ser porosos o no porosos, planos o no planos. Las moléculas de unión de la presente invención pueden fusionarse con secuencias de marcador, tales como un péptido, para facilitar la purificación. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, la etiqueta de hexa-histidina, la etiqueta de hemaglutinina (HA), la etiqueta myc o la etiqueta flag. Alternativamente, puede conjugarse un anticuerpo a un segundo anticuerpo para formar un heteroconjugado de anticuerpos. En otro aspecto las moléculas de unión de la

25 invención pueden conjugarse/unirse a uno o más antígenos. Preferiblemente, estos antígenos son antígenos que se reconocen por el sistema inmunitario de un sujeto al que se le administra el conjugado de molécula de uniónantígeno. Los antígenos pueden ser idénticos, pero también pueden diferenciarse unos de otros. En la técnica se conocen bien métodos de conjugación para unir los antígenos y las moléculas de unión e incluyen, pero no se limitan a, usar agentes de reticulación. Las moléculas de unión de la invención se unirán a virus influenza H5N1 y los antígenos unidos a las moléculas de unión iniciarán un potente ataque de células T sobre el conjugado, lo que eventualmente conducirá a la destrucción del virus influenza H5N1.

Además de producir inmunoconjugados químicamente conjugando, directa o indirectamente, por ejemplo por medio de un ligador, los inmunoconjugados pueden producirse como proteínas de fusión que comprenden las moléculas de

35 unión de la invención y una etiqueta adecuada. Pueden producirse proteínas de fusión mediante métodos conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, de manera recombinante construyendo moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican para las moléculas de unión en marco con secuencias de nucleótidos que codifican para la(s) etiqueta(s) adecuada(s) y después expresando las moléculas de ácido nucleico.

Otro aspecto de la presente descripción es proporcionar una molécula de ácido nucleico que codifica para al menos una molécula de unión, variante funcional o inmunoconjugado según la invención. Tales moléculas de ácido nucleico pueden usarse como productos intermedios para fines de clonación, por ejemplo en el procedimiento de maduración de afinidad, tal como se describió anteriormente. En una realización preferida, las moléculas de ácido nucleico están aisladas o purificadas.

45 El experto en la técnica apreciará que también se pretende que variantes funcionales de estas moléculas de ácido nucleico formen parte de la presente descripción. Variantes funcionales son secuencias de ácido nucleico que pueden traducirse directamente, usando el código genético convencional, para proporcionar una secuencia de aminoácidos idéntica a la traducida a partir de las moléculas de ácido nucleico originales.

Preferiblemente, las moléculas de ácido nucleico codifican para moléculas de unión que comprenden las regiones CDR tal como se describió anteriormente. En un aspecto adicional las moléculas de ácido nucleico codifican para moléculas de unión que comprenden dos, tres, cuatro, cinco o incluso las seis regiones CDR de las moléculas de unión de la descripción.

55 En otra realización, las moléculas de ácido nucleico codifican para moléculas de unión que comprenden una cadena pesada que comprende las secuencias variables de cadena pesada tal como se describió anteriormente. En otra realización las moléculas de ácido nucleico codifican para moléculas de unión que comprenden una cadena ligera que comprende las secuencias variables de cadena ligera tal como se describió anteriormente. Las secuencias de nucleótidos de las moléculas de unión de la invención se facilitan en la sección de ejemplos (véase, por ejemplo, la tablas 6 y 8).

Otro aspecto de la invención es proporcionar vectores, es decir constructos de ácido nucleico, que comprenden una

o más moléculas de ácido nucleico según la presente invención. Pueden derivarse vectores de plásmidos tales

65 como, entre otros, F, R1, RP1, Col, pBR322, TOL, Ti, etc.; cósmidos; fagos tales como lambda, lambdoide, M13, Mu, P1, P22, Qβ, T-par, T-impar, T2, T4, T7, etc.; virus de plantas. Pueden usarse vectores para la clonación y/o para la

expresión de las moléculas de unión de la invención y pueden incluso usarse para fines de terapia génica. Vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico según la invención operativamente unidas a una o más moléculas de ácido nucleico reguladoras de la expresión también quedan cubiertos por la presente invención. La elección del vector depende de los procedimientos recombinantes seguidos y del huésped usado. La introducción de 5 vectores en células huésped puede realizarse, entre otros, mediante transfección de fosfato de calcio, infección por virus, transfección mediada por DEAE-dextrano, transfección de lipofectamina o electroporación. Los vectores pueden replicarse de manera autónoma o pueden replicarse junto con el cromosoma en el que se han integrado. Preferiblemente, los vectores contienen uno o más marcadores de selección. La elección de los marcadores puede depender de las células huésped de elección, aunque no es crítico para la invención tal como saben bien los expertos en la técnica. Incluyen, pero no se limitan a, kanamicina, neomicina, puromicina, higromicina, zeocina, gen de timidina cinasa del virus del herpes simple (VHS-TK), gen de dihidrofolato reductasa de ratón (dhfr). Vectores que comprenden una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para las moléculas de unión humanas tal como se describió anteriormente operativamente unidas a una o más moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas o péptidos que pueden usarse para aislar las moléculas de unión humanas también quedan cubiertos por

15 la invención. Estas proteínas o péptidos incluyen, pero no se limitan a, glutatión-S-transferasa, proteína de unión a maltosa, polihistidina de unión a metal, proteína verde fluorescente, luciferasa y beta-galactosidasa.

Huéspedes que contienen una o más copias de los vectores mencionados anteriormente son un objeto adicional de la presente invención. Preferiblemente, los huéspedes son células huésped. Las células huésped incluyen, pero no se limitan a, células de origen de mamífero, vegetal, de insecto, fúngico o bacteriano. Las células bacterianas incluyen, pero no se limitan a, células de bacterias Gram-positivas o bacterias Gram-negativas tales como varias especies de los géneros Escherichia, tales como E. coli, y Pseudomonas. En el grupo de células fúngicas se usan preferiblemente células de levadura. La expresión en levadura puede lograrse usando cepas de levadura tales como, entre otras, Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisiae y Hansenula polymorpha. Además, pueden usarse 25 células de insecto tales como células de Drosophila y Sf9 como células huésped. Además de esto, las células huésped pueden ser células vegetales tales como, entre otras, células de plantas de cultivo tales como plantas de silvicultura, o células de plantas que proporcionan alimentos y materiales de partida tales como plantas de cereales

o plantas medicinales, o células de plantas ornamentales, o células de cultivos de bulbos florales. Se producen células vegetales o plantas transformadas (transgénicas) mediante métodos conocidos, por ejemplo, transferencia génica mediada por Agrobacterium, transformación de discos de hojas, transformación de protoplastos mediante transferencia de ADN inducida por polietilenglicol, electroporación, sonicación, microinyección o transferencia génica balística. Adicionalmente, un sistema de expresión adecuado puede ser un sistema de baculovirus. Los sistemas de expresión que usan células de mamífero tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células COS, células BHK, células NSO o células de melanoma de Bowes se prefieren en la presente invención. Las células de mamífero 35 proporcionan proteínas expresadas con modificaciones postraduccionales que son muy similares a moléculas naturales de origen de mamífero. Dado que la presente invención trata con moléculas que pueden tener que administrarse a seres humanos, se preferirá particularmente un sistema de expresión completamente humano. Por tanto, incluso más preferiblemente, las células huésped son células humanas. Ejemplos de células humanas son, entre otras, células HeLa, 911, AT1080, A549, 293 y HEK293T. En realizaciones preferidas, las células productoras humanas comprenden al menos una parte funcional de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una región de adenovirus E1 en formato expresable. En realizaciones incluso más preferidas, dichas células huésped se derivan de retina humana y se inmortalizan con ácidos nucleicos que comprenden secuencias adenovirales E1, tales como células 911 o la línea celular depositada en la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC), CAMR, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG, Gran Bretaña el 29 de febrero de 1996 con el número 96022940 y comercializada con

45 la marca comercial PER.C6® (PER.C6 es una marca comercial registrada de Crucell Holland B.V.). Para los fines de esta solicitud “células PER.C6” se refiere a células depositadas con el número 96022940 o ancestros, pases anteriores o posteriores así como descendientes de ancestros de células depositadas, así como derivados de cualquiera de los anteriores. La producción de proteínas recombinantes en células huésped puede realizarse según métodos bien conocidos en la técnica. El uso de las células comercializadas con la marca comercial PER.C6® como plataforma de producción para proteínas de interés se ha descrito en el documento WO 00/63403.

Un método de producción de una molécula de unión según la invención es una parte adicional de la invención. El método comprende las etapas de a) cultivar un huésped según la invención en condiciones que conducen a la expresión de la molécula de unión, y b) opcionalmente, recuperar la molécula de unión expresada. Las moléculas de

55 unión expresadas pueden recuperarse del extracto libre de células, pero preferiblemente se recuperan del medio de cultivo. El método anterior de producción también puede usarse para preparar variantes funcionales de las moléculas de unión y/o inmunoconjugados de la presente invención. Métodos para recuperar proteínas, tales como moléculas de unión, a partir de extractos libres de células o medio de cultivo los conoce bien el experto en la técnica. Moléculas de unión, variantes funcionales y/o inmunoconjugados según pueden obtenerse mediante el método descrito anteriormente también forman parte de la presente invención.

Alternativamente, además de la expresión en huéspedes, tales como células huésped, las moléculas de unión e inmunoconjugados de la invención pueden producirse sintéticamente mediante sintetizadores peptídicos convencionales o en sistemas de traducción libres de células usando ácido nucleico ARN derivado de moléculas de 65 ADN según la invención. Moléculas de unión e inmunoconjugados según pueden obtenerse mediante los métodos de producción sintéticos descritos anteriormente o sistemas de traducción libres de células también forman parte de

la presente invención.

En aún otra realización, también pueden producirse moléculas de unión de la presente invención en mamíferos transgénicos, no humanos, tales como, entre otros, conejos, cabras o vacas, y secretarse, por ejemplo, en la leche 5 de los mismos.

En aún otro aspecto alternativo, pueden generarse moléculas de unión según la presente invención, preferiblemente moléculas de unión humanas que se unen específicamente a virus influenza H5N1 o a un fragmento del mismo, mediante mamíferos transgénicos no humanos, tales como por ejemplo ratones o conejos transgénicos, que expresan genes de inmunoglobulina humana. Preferiblemente, los mamíferos transgénicos no humanos tienen un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera humana que codifican para la totalidad o una parte de las moléculas de unión humanas tal como se describió anteriormente. Los mamíferos transgénicos no humanos pueden inmunizarse con una preparación purificada o enriquecida de virus influenza H5N1 o un fragmento del mismo. En la técnica están bien establecidos protocolos para inmunizar 15 mamíferos no humanos. Véase Using Antibodies: A Laboratory Manual, editado por: E. Harlow, D. Lane (1998), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nueva York y Current Protocols in Immunology, editado por: J. E. Coligan, A. M. Kruisbeek, D. H. Margulies, E. M. Shevach, W. Strober (2001), John Wiley & Sons Inc., Nueva York. Los protocolos de inmunización con frecuencia incluyen múltiples inmunizaciones, o bien con o bien sin adyuvantes tales como adyuvante completo de Freund y adyuvante incompleto de Freund, pero también pueden incluir inmunizaciones de ADN desnudo. En otra realización, las moléculas de unión humanas se producen por células B, células de plasma y/o de memoria derivadas de animales transgénicos. En aún otra realización, las moléculas de unión humanas se producen mediante hibridomas, que se preparan mediante fusión de células B obtenidas a partir de los mamíferos transgénicos no humanos descritos anteriormente con células inmortalizadas. Las células, células de plasma e hibridomas según pueden obtenerse a partir de los mamíferos transgénicos no humanos descritos

25 anteriormente y las moléculas de unión humanas según pueden obtenerse a partir de los mamíferos transgénicos no humanos, células B, células de plasma y/o de memoria e hibridomas descritos anteriormente también forman parte de la presente invención.

En un aspecto adicional, la descripción proporciona un método de identificación de una molécula de unión, tal como una molécula de unión humana, por ejemplo un anticuerpo monoclonal humano o fragmento del mismo, que se une específicamente a virus influenza H5N1 o moléculas de ácido nucleico que codifican para tales moléculas de unión y comprende las etapas de: (a) poner en contacto una colección de moléculas de unión sobre la superficie de paquetes genéticos replicables con virus influenza H5N1 o un fragmento del mismo en condiciones que conducen a la unión, (b) seleccionar al menos una vez un paquete genético replicable que se une a virus influenza H5N1 o a un 35 fragmento del mismo, (c) separar y recuperar el paquete genético replicable que se une a virus influenza H5N1 o a un fragmento del mismo de paquetes genéticos replicables que no se unen a virus influenza H5N1 o a un fragmento del mismo. Un paquete genético replicable tal como se usa en el presente documento puede ser procariota o eucariota e incluye células, esporas, levaduras, bacterias, virus, (bacterió)fago, ribosomas y polisomas. Un paquete genético replicable preferido es un fago. Las moléculas de unión, tales como por ejemplo Fv de cadena simple, se presentan en el paquete genético replicable, es decir están unidas a un grupo o molécula situado en una superficie exterior del paquete genético replicable. El paquete genético replicable es una unidad seleccionable que comprende una molécula de unión que va a seleccionarse unida a una molécula de ácido nucleico que codifica para la molécula de unión. La molécula de ácido nucleico debe ser replicable o bien in vivo (por ejemplo, como un vector) o bien in vitro (por ejemplo, mediante PCR, transcripción y traducción). La replicación in vivo puede ser autónoma (tal como

45 para una célula), con la ayuda de factores de huésped (tal como para un virus) o con la ayuda tanto de huésped como de virus auxiliar (tal como para un fagémido). Los paquetes genéticos replicables que presentan una colección de moléculas de unión se forman introduciendo moléculas de ácido nucleico que codifican para moléculas de unión exógenas que van a presentarse en los genomas de los paquetes genéticos replicables para formar proteínas de fusión con proteínas endógenas que se expresan normalmente en la superficie exterior de los paquetes genéticos replicables. La expresión de las proteínas de fusión, el transporte a la superficie exterior y el ensamblaje dan como resultado la presentación de moléculas de unión exógenas en la superficie exterior de los paquetes genéticos replicables.

La(s) etapa(s) de selección en el método según la presente descripción puede(n) realizarse con virus influenza

55 H5N1 que están vivos y todavía son infecciosos o están inactivados. La inactivación de virus influenza H5N1 puede realizarse mediante métodos de inactivación viral bien conocidos por el experto en la técnica tales como, entre otros, tratamiento con formalina, β-propiolactona (BPL), mertiolato y/o luz ultravioleta. El experto en la técnica conoce métodos para someter a prueba si el virus influenza H5N1 todavía está vivo, es infeccioso y/o viable o está parcial o completamente inactivado. El virus influenza H5N1 usado en el método anterior puede no estar aislado, por ejemplo estar presente en suero y/o sangre de un individuo infectado. El virus influenza H5N1 usado también puede aislarse de un cultivo celular en un medio adecuado.

En una realización el virus influenza H5N1 está en suspensión cuando se pone en contacto con los paquetes genéticos replicables. Alternativamente, también puede estar acoplado a un portador cuando tiene lugar el contacto. 65 En una realización puede tener lugar una primera selección y una adicional contra una cepa de virus influenza H5N1 del mismo clado. Alternativamente, pueden realizarse ciclos de selección primero y adicional contra cepas de virus

influenza H5N1 de diferentes clados (por ejemplo primera selección con cepas de clado 1 y segunda selección con cepas de clado 2 ó 3).

Alternativamente, la(s) etapa(s) de selección puede(n) realizarse en presencia de un fragmento de virus influenza

5 H5N1 tal como por ejemplo preparaciones de membrana celular, proteínas o polipéptidos de H5N1 recombinantes, proteínas de fusión que comprenden proteínas o polipéptidos de H5N1, células que expresan proteínas o polipéptidos de H5N1 recombinantes, y similares. También pueden usarse partes expuestas extracelularmente de estas proteínas o polipéptidos como material de selección. Los fragmentos de virus influenza H5N1 pueden inmovilizarse en un material adecuado antes de su uso o pueden usarse en suspensión. En una realización la selección puede realizarse con fragmentos de virus influenza H5N1 diferentes o fragmentos de cepas de virus influenza H5N1 diferentes. Encontrar combinaciones de selección adecuadas está dentro del alcance del experto en la técnica. Pueden realizarse selecciones mediante ELISA o FACS.

En aún un aspecto adicional, la descripción proporciona un método de obtención de una molécula de unión que se

15 une específicamente a una cepa de virus influenza H5N1 o fragmento de la misma o una molécula de ácido nucleico que codifica para una molécula de unión de este tipo, comprendiendo el método las etapas de a) realizar el método descrito anteriormente de identificación de moléculas de unión, y b) aislar del paquete genético replicable recuperado la molécula de unión y/o la molécula de ácido nucleico que codifica para la molécula de unión. La colección de moléculas de unión sobre la superficie de paquetes genéticos replicables puede ser una colección de scFv o Fab. Una vez que se ha establecido o identificado un nuevo scFv o Fab con el método de identificación de moléculas de unión o moléculas de ácido nucleico que codifican para las moléculas de unión mencionado anteriormente, el ADN que codifica para el scFv o Fab puede aislarse de las bacterias o fagos y combinarse con técnicas de biología molecular convencionales para preparar constructos que codifican para scFv, scFv bivalentes, Fab o inmunoglobulinas humanas completas con una especificidad deseada (por ejemplo IgG, IgA o IgM). Estos

25 constructos pueden transfectarse en líneas celulares adecuadas y eventualmente pueden producirse anticuerpos monoclonales humanos completos (véase Huls et al., 1999; Boel et al., 2000).

Tal como se mencionó anteriormente, el paquete genético replicable preferido es un fago. Los métodos de presentación en fago para identificar y obtener moléculas de unión (humanas), por ejemplo anticuerpos monoclonales (humanos), son en la actualidad métodos bien establecidos conocidos por el experto en la técnica. Se describen, por ejemplo, en la patente estadounidense número 5.696.108; Burton y Barbas, 1994; de Kruif et al., 1995b; y Phage Display: A Laboratory Manual; editado por: CF Barbas, DR Burton, JK Scott y GJ Silverman (2001), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nueva York. Para la construcción de bibliotecas de presentación en fago, se expresan colecciones de genes de región variable de cadena pesada y ligera de anticuerpo 35 monoclonal humano sobre la superficie de partículas de bacteriófago, preferiblemente bacteriófago filamentoso, por ejemplo en formato de Fv de cadena simple (scFv) o de Fab (véase de Kruif et al., 1995b). Grandes bibliotecas de fagos que expresan fragmentos de anticuerpo contienen normalmente más de 1,0x109 especificidades de anticuerpo y pueden ensamblarse a partir de las regiones V de inmunoglobulina expresadas en los linfocitos B de individuos inmunizados o no inmunizados. En una realización específica de la invención la biblioteca de fagos de moléculas de unión, preferiblemente biblioteca de fagos de scFv, se prepara a partir de ARN aislado a partir de células obtenidas de un sujeto que se ha vacunado contra virus influenza (por ejemplo, H5N1), recientemente vacunado contra un patógeno no relacionado, que ha padecido recientemente infección por virus influenza H5N1 o de un individuo sano. Puede aislarse ARN, entre otros, de médula ósea o de sangre periférica, preferiblemente linfocitos de sangre periférica o células B aisladas o incluso subpoblaciones de células B tales como células B de memoria. El sujeto

45 puede ser un animal, preferiblemente un ser humano. En una realización preferida las bibliotecas pueden ensamblarse a partir de las regiones V de inmunoglobulina expresadas por células B de memoria de IgM.

Alternativamente, pueden construirse bibliotecas de presentación en fago a partir de regiones variables de inmunoglobulina que se han ensamblado parcialmente in vitro para introducir diversidad de anticuerpo adicional en la biblioteca (bibliotecas semisintéticas). Por ejemplo, regiones variables ensambladas in vitro contienen tramos de ADN producido sintéticamente, aleatorizado o parcialmente aleatorizado en las regiones de las moléculas que son importantes para la especificidad de anticuerpo, por ejemplo regiones CDR. Pueden seleccionarse anticuerpos de fago específicos para virus influenza H5N1 a partir de la biblioteca exponiendo el virus o fragmento del mismo a una biblioteca de fagos para permitir la unión de fagos que expresan fragmentos anticuerpo específicos para el virus o 55 fragmento del mismo. Se eliminan fagos no unidos mediante lavado y se eluyen los fagos unidos para la infección de bacterias E.coli y posterior propagación. Habitualmente se requieren múltiples ciclos de selección y propagación para enriquecer suficientemente fagos que se unen específicamente al virus o al fragmento del mismo. Si se desea, antes de exponer la biblioteca de fagos al virus o al fragmento del mismo, en primer lugar puede sustraerse la biblioteca de fagos exponiendo la biblioteca de fagos a material no diana tal como virus o fragmentos de los mismos de una cepa diferente, es decir virus influenza distintos de H5N1. Estos virus de sustracción o fragmentos de los mismos pueden estar unidos a una fase sólida o pueden estar en suspensión. También pueden seleccionarse fagos para su unión a antígenos complejos tales como mezclas complejas de proteínas o (poli)péptidos de H5N1 opcionalmente complementados con otro material. También pueden usarse células huésped que expresan una o más proteínas o (poli)péptidos de virus influenza H5N1 para fines de selección. Un método de presentación en fago 65 usando estas células huésped puede extenderse y mejorarse sustrayendo elementos de unión no relevantes durante la selección mediante adición de un exceso de células huésped que no comprenden moléculas diana o que

comprenden moléculas que no son diana que son similares, pero no idénticas, a la diana, y potenciando así fuertemente la posibilidad de encontrar moléculas de unión relevantes. Evidentemente, la sustracción puede realizarse antes, durante o después de la selección con virus o fragmentos del mismo. El procedimiento se denomina procedimiento MABSTRACT® (MABSTRACT® es una marca registrada de Crucell Holland B.V., véase

5 también la patente estadounidense número 6.265.150 ).

En aún otro aspecto la descripción proporciona un método de obtención de una molécula de unión que tiene posiblemente actividad neutralizante contra virus influenza H5N1, preferiblemente al menos contra cepas de virus influenza H5N1 de clado 1, clado 2 y clado 3, comprendiendo el método las etapas de (a) realizar el método de obtención de una molécula de unión que se une específicamente a virus influenza H5N1 o a un fragmento del mismo

o una molécula de ácido nucleico que codifica para una molécula de unión de este tipo tal como se describió anteriormente, y (b) verificar si la molécula de unión aislada tiene actividad neutralizante contra el virus, preferiblemente contra al menos cepas de virus influenza H5N1 del clado 1 y clado 2. Ensayos para verificar si una molécula de unión tiene actividad neutralizante se conocen bien en la técnica (véase WHO Manual on Animal

15 Influenza Diagnosis and Surveillance, Geneva: World Health Organisation, 2005 versión 2002.5).

En un aspecto adicional la descripción se refiere a una molécula de unión que tiene actividad neutralizante que puede obtenerse mediante los métodos tal como se describieron anteriormente.

En aún un aspecto adicional, la descripción proporciona composiciones que comprenden al menos una molécula de unión preferiblemente un anticuerpo monoclonal humano según la invención, al menos una variante funcional del mismo, al menos un inmunoconjugado según la invención o una combinación de los mismos. Además de eso, las composiciones pueden comprender, entre otras, moléculas estabilizantes, tales como albúmina o polietilenglicol, o sales. Preferiblemente, las sales usadas son sales que conservan la actividad biológica deseada de las moléculas

25 de unión y no confieren ningún efecto toxicológico no deseado. Si es necesario, las moléculas de unión humanas de la invención pueden recubrirse en o sobre un material para protegerlas frente a la acción de ácidos u otras condiciones naturales o no naturales que pueden inactivar las moléculas de unión.

En aún un aspecto adicional, la invención proporciona composiciones que comprenden al menos una molécula de ácido nucleico tal como se reivindica en la presente invención. Las composiciones pueden comprender disoluciones acuosas tales como disoluciones acuosas que contienen sales (por ejemplo, NaCl o sales tal como se describieron anteriormente), detergentes (por ejemplo, SDS) y/u otros componentes adecuados.

Además, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden al menos una molécula

35 de unión tal como un anticuerpo monoclonal humano de la invención (o fragmento o variante funcional del mismo), al menos un inmunoconjugado según la invención, al menos una composición según la invención, o combinaciones de los mismos. La composición farmacéutica de la invención comprende además al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. El experto en la técnica conoce bien excipientes farmacéuticamente aceptables. La composición farmacéutica según la invención puede comprender además al menos otro agente terapéutico. El experto en la técnica también conoce bien agentes adecuados.

En una realización las composiciones farmacéuticas pueden comprender dos o más moléculas de unión que tienen actividad neutralizante contra virus influenza H5N1. En una realización, las moléculas de unión muestran actividad neutralizante sinérgica, cuando se usan en combinación. En otras palabras, las composiciones comprenden al

45 menos dos moléculas de unión que tienen actividad neutralizante, caracterizadas porque las moléculas de unión actúan sinérgicamente en la neutralización de virus influenza H5N1. Tal como se usa en el presente documento, el término “sinérgico” significa que el efecto combinado de las moléculas de unión cuando se usan en combinación es mayor que sus efectos aditivos cuando se usan individualmente. Las moléculas de unión que actúan sinérgicamente pueden unirse a diferentes estructuras en el mismo o en distintos fragmentos de virus influenza H5N1. Una manera de calcular la sinergia es por medio del índice de combinación. El concepto de índice de combinación (CI) se ha descrito por Chou y Talalay (1984). Las composiciones también pueden comprender una molécula de unión que tiene actividad neutralizante y una molécula de unión específica para H5N1 no neutralizante. Las moléculas de unión específicas para H5N1 neutralizante y no neutralizante también pueden actuar de manera sinérgica en la neutralización de virus influenza H5N1.

55 Una composición farmacéutica según la invención puede comprender además al menos otro agente terapéutico, profiláctico y/o de diagnóstico. Preferiblemente, la composición farmacéutica comprende al menos otro agente profiláctico y/o terapéutico. Preferiblemente, dichos agentes terapéuticos y/o profilácticos son agentes que pueden prevenir y/o tratar una infección por virus influenza H5N1 y/o un estado resultante de tal infección. Los agentes terapéuticos y/o profilácticos incluyen, pero no se limitan a, agentes anti-virales. Tales agentes pueden ser moléculas de unión, moléculas pequeñas, compuestos orgánicos o inorgánicos, enzimas, secuencias de polinucleótido, péptidos anti-virales, etc. Otros agentes que se usan actualmente para tratar a pacientes infectados por virus influenza H5N1 sin inhibidores de M2 (por ejemplo, amantidina, rimantadina) y/o inhibidores de neuraminidasa (por ejemplo, zanamivir, oseltamivir). Estos pueden usarse en combinación con las moléculas de

65 unión de la invención. También pueden usarse como otros agentes terapéuticos y/o profilácticos útiles en la presente invención agentes que pueden prevenir y/o tratar una infección por virus influenza H5N1 y/o un estado resultante de

tal infección que están en fase experimental.

Las moléculas de unión o composiciones farmacéuticas de la invención pueden someterse a prueba en sistemas de modelo animal antes de su uso en seres humanos. Tales sistemas de modelo animal incluyen, pero no se limitan a, 5 ratón, hurón y mono.

Normalmente, las composiciones farmacéuticas deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. Las moléculas de unión, inmunoconjugados, moléculas de ácido nucleico o composiciones de la presente invención pueden estar en forma de polvo para su reconstitución en el excipiente farmacéuticamente aceptable apropiado antes o en el momento del suministro. En el caso de polvos estériles para la preparación de disoluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado a vacío y secado por congelación (liofilización) que proporcionan un polvo del principio activo más cualquier componente deseado adicional a partir de una disolución de los mismos previamente esterilizada por filtración.

15 Alternativamente, las moléculas de unión, inmunoconjugados, moléculas de ácido nucleico o composiciones de la presente invención pueden estar en disolución y el excipiente farmacéuticamente aceptable apropiado puede añadirse y/o mezclarse antes o en el momento del suministro para proporcionar una forma inyectable de dosificación unitaria. Preferiblemente, el excipiente farmacéuticamente aceptable usado en la presente invención es adecuado para una alta concentración de fármaco, puede mantener una fluidez apropiada y, si es necesario, puede retrasar la absorción.

La elección de la vía de administración óptima de las composiciones farmacéuticas se verá influida por varios factores incluyendo las propiedades fisicoquímicas de las moléculas activas dentro de las composiciones, la urgencia de la situación clínica y la relación de las concentraciones en plasma de las moléculas activas con respecto

25 al efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, si es necesario, las moléculas de unión de la invención pueden prepararse con portadores que las protegerán frente a una liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Entre otros, pueden usarse polímeros biodegradables, biocompatibles, tal como etileno-acetato de vinilo, polianhídridos, poli(ácido glicólico), colágeno, poliortoésteres y poli(ácido láctico). Además, puede ser necesario recubrir las moléculas de unión, o co-administrar las moléculas de unión, con un material o compuesto que evita la inactivación de las moléculas de unión humanas. Por ejemplo, las moléculas de unión pueden administrarse a un sujeto en un portador apropiado, por ejemplo, liposomas o un diluyente.

Las vías de administración pueden dividirse en dos categorías principales, administración oral y parenteral. La vía de 35 administración preferida es intravenosa o por inhalación.

Pueden formularse formas farmacéuticas orales, entre otras, como comprimidos, trociscos, pastillas para chupar, suspensiones acuosas o aceitosas, gránulos o polvos dispersables, emulsiones, cápsulas duras, cápsulas de gelatina blanda, jarabes o elixires, pastillas, grageas, líquidos, geles o suspensiones espesas. Estas formulaciones pueden contener excipientes farmacéuticos incluyendo, pero sin limitarse a, diluyentes inertes, agentes de granulación y disgregantes, agentes aglutinantes, agentes lubricantes, conservantes, colorantes, agentes aromatizantes o edulcorantes, aceites vegetales o minerales, agentes humectantes y agentes espesantes.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden formularse para su administración

45 parenteral. Las formulaciones para administración parenteral pueden estar, entre otros, en forma de suspensiones o disoluciones de infusión o inyección no tóxicas, estériles, isotónicas, acuosas o no acuosas. Las disoluciones o suspensiones pueden comprender agentes que no son tóxicos para los receptores a las dosificaciones y concentraciones empleadas tales como 1,3-butanodiol, disolución de Ringer, disolución de Hank, disolución isotónica de cloruro de sodio, aceites, ácidos grasos, agentes anestésicos locales, conservantes, tampones, agentes que aumentan la viscosidad o solubilidad, antioxidantes solubles en agua, antioxidantes solubles en aceite y agentes quelantes de metales.

En un aspecto adicional, las moléculas de unión tales como anticuerpos monoclonales humanos (fragmentos y variantes funcionales de los mismos), inmunoconjugados, composiciones o composiciones farmacéuticas de la

55 invención pueden usarse como medicamento. Por tanto, un método de tratamiento y/o prevención de una infección por virus influenza H5N1 usando las moléculas de unión, inmunoconjugados, composiciones o composiciones farmacéuticas de la invención es otra parte de la presente invención. Las moléculas mencionadas anteriormente pueden usarse, entre otros, en el diagnóstico, la profilaxis, el tratamiento o combinación de los mismos, de una infección por virus influenza H5N1. Son adecuadas para el tratamiento de pacientes aún no tratados que padecen infección por virus influenza H5N1 y pacientes que ya se han tratado o están tratándose por una infección por virus influenza H5N1. Pueden usarse para pacientes tales como profesionales sanitarios, familiares de sujetos infectados, criadores (de aves de corral), etc.

Las moléculas o composiciones mencionadas anteriormente pueden emplearse junto con otras moléculas útiles en

65 el diagnóstico, la profilaxis y/o el tratamiento. Pueden usarse in vitro, ex vivo o in vivo. Por ejemplo, las moléculas de unión tales como anticuerpos monoclonales humanos (o variantes funcionales de los mismos), inmunoconjugados, composiciones o composiciones farmacéuticas de la invención pueden coadministrarse con una vacuna contra virus influenza H5N1 (si está disponible). Alternativamente, la vacuna también puede administrarse antes o después de la administración de las moléculas de la invención. En vez de una vacuna, también pueden emplearse agentes antivirales junto con las moléculas de unión de la presente invención. Anteriormente se mencionaron agentes anti

5 virales adecuados.

Las moléculas se formulan normalmente en las composiciones y composiciones farmacéuticas de la invención en una cantidad eficaz desde el punto de vista terapéutico o de diagnóstico. Alternativamente, pueden formularse y administrarse por separado. Por ejemplo las otras moléculas tales como los agentes anti-virales pueden aplicarse sistémicamente, mientras que las moléculas de unión de la invención pueden aplicarse por vía intravenosa.

Pueden ajustarse regímenes de dosificación para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica). Un intervalo de dosificación adecuado puede ser por ejemplo de 0,1-100 mg/de peso corporal, preferiblemente de 0,5-15 mg/de peso corporal. Además, por ejemplo, puede administrarse un único bolo, 15 pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o puede reducirse o aumentarse proporcionalmente la dosis según se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Las moléculas y composiciones según la presente invención son preferiblemente estériles. En la técnica se conocen bien métodos para hacer que esas moléculas y composiciones sean estériles. Las otras moléculas útiles en el diagnóstico, la profilaxis y/o el tratamiento pueden administrarse en un régimen de dosificación similar al propuesto para las moléculas de unión de la invención. Si las otras moléculas se administran por separado, pueden administrarse a un paciente antes de (por ejemplo, 2 min., 5 min., 10 min., 15 min., 30 min., 45 min., 60 min., 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h, 14 h, 16 h, 18 h, 20 h, 22 h, 24 h, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 7 días, 2 semanas, 4 semanas o 6 semanas antes), concomitantemente con o posteriormente a (por ejemplo, 2 min., 5 min., 10 min., 15 min., 30 min., 45 min., 60 min., 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h, 12 h,14 h, 16 h, 18 h, 20 h, 22 h, 24 h, 2 días, 3 días, 4 días, 5 días, 7 días, 2 semanas,

25 4 semanas o 6 semanas después) la administración de una o más de las moléculas de unión humanas o composiciones farmacéuticas de la invención. El régimen de dosificación exacto se decide habitualmente durante ensayos clínicos en pacientes humanos.

Moléculas de unión humanas y composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de unión humanas son particularmente útiles, y con frecuencia se prefieren, cuando van a administrarse a seres humanos como agentes terapéuticos in vivo, ya que la respuesta inmunitaria del receptor al anticuerpo administrado será con frecuencia sustancialmente inferior a la provocada por la administración de una molécula de unión monoclonal murina, quimérica o humanizada.

35 En otro aspecto, la invención se refiere al uso de las moléculas de unión tales como anticuerpos monoclonales humanos neutralizantes (fragmentos y variantes funcionales de los mismos), inmunoconjugados, moléculas de ácido nucleico, composiciones o composiciones farmacéuticas según la invención en la preparación de un medicamento para diagnóstico, profilaxis, tratamiento o combinación de los mismos, de una infección por virus influenza H5N1.

Además de esto, kits que comprenden al menos una molécula de unión tal como un anticuerpo monoclonal humano neutralizante (fragmentos y variantes funcionales del mismo), al menos un inmunoconjugado, al menos una molécula de ácido nucleico, al menos una composición, al menos una composición farmacéutica, al menos un vector, al menos un huésped según la invención o una combinación de los mismos también forman parte de la presente invención. Opcionalmente, los componentes anteriormente descritos de los kits de la invención se envasan 45 en recipientes adecuados y se marcan para diagnóstico, profilaxis y/o tratamiento de los estados indicados. Los componentes anteriormente mencionados pueden almacenarse en recipientes unitarios o de múltiples dosis como disolución acuosa, preferiblemente estéril, o como formulación liofilizada, preferiblemente estéril, para reconstitución. Los recipientes pueden formarse a partir de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico y pueden tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede ser una bolsa de disolución intravenosa o un vial que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica). El kit puede comprender además más recipientes que comprenden un tampón farmacéuticamente aceptable. Puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, medio de cultivo para uno o más de los huéspedes adecuados y, posiblemente, incluso al menos otro agente terapéutico, profiláctico o de diagnóstico. Asociadas con los kits puede haber instrucciones incluidas habitualmente en envases

55 comerciales de productos terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico, que contienen información sobre, por ejemplo, indicaciones, uso, dosificación, fabricación, administración, contraindicaciones y/o advertencias referentes al uso de tales productos terapéuticos, profilácticos o de diagnóstico.

La invención se refiere además a un método de detección de virus influenza H5N1 en una muestra, comprendiendo el método las etapas de (a) poner en contacto una muestra con una cantidad eficaz desde el punto de vista de diagnóstico de una molécula de unión (fragmentos y variantes funcionales de la misma) o un inmunoconjugado según la invención, y (b) determinar si la molécula de unión o inmunoconjugado se une específicamente a una molécula de la muestra. La muestra puede ser una muestra biológica incluyendo, pero sin limitarse a, sangre, suero, heces, esputo, aspirados nasofaríngeos, lavados bronquiales, orina, tejido u otro material biológico de sujetos 65 (posiblemente) infectados, o una muestra no biológica tal como agua, bebida, etc. Los sujetos (posiblemente) infectados pueden ser sujetos humanos, pero también pueden someterse a prueba animales que se sospecha que

son portadores de virus influenza H5N1 para determinar la presencia del virus usando las moléculas de unión humanas o inmunoconjugados de la invención. En primer lugar puede manipularse la mezcla para hacer que sea más adecuada para el método de detección. La manipulación significa, entre otras cosas, tratar la muestra que se sospecha que contiene y/o que contiene el virus de tal manera que el virus se disgregará para dar componentes

5 antigénicos tales como proteínas, (poli)péptidos u otros fragmentos antigénicos. Preferiblemente, las moléculas de unión humanas o inmunoconjugados de la invención se ponen en contacto con la muestra en condiciones que permiten la formación de un complejo inmunológico entre las moléculas de unión humanas y el virus o los componentes antigénicos del mismo que pueden estar presentes en la muestra. Entonces se detecta la formación de un complejo inmunológico, si lo hay, que indica la presencia del virus en la muestra, y se mide mediante medios adecuados. Tales métodos incluyen, entre otros, inmunoensayos de unión homogéneos y heterogéneos, tales como radioinmunoensayos (RIA), ELISA, inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, FACS, BIACORE y análisis de inmunotransferencia de tipo Western.

Técnicas de ensayo preferidas, especialmente para el examen clínico a gran escala de sueros y sangre de pacientes

15 y productos hemoderivados, son ELISA y técnicas de inmunotransferencia de tipo Western. Las pruebas ELISA se prefieren particularmente. Para su uso como reactivos en estos ensayos, las moléculas de unión o inmunoconjugados de la invención se unen convenientemente a la superficie interior de pocillos de microtitulación. Las moléculas de unión o inmunoconjugados de la invención pueden unirse directamente al pocillo de microtitulación. Sin embargo, la unión máxima de las moléculas de unión o inmunoconjugados de la invención a los pocillos puede lograrse tratando previamente los pocillos con polilisina antes de la adición de las moléculas de unión

o inmunoconjugados de la invención. Además, las moléculas de unión o inmunoconjugados de la invención pueden fijarse covalentemente a los pocillos mediante medios conocidos. Generalmente, las moléculas de unión o inmunoconjugados se usan entre 0,01 y 100 μg/ml para el recubrimiento, aunque también pueden usarse cantidades superiores así como inferiores. Entonces se añaden muestras a los pocillos recubiertos con las moléculas de unión o

25 inmunoconjugados de la invención.

Además, pueden usarse moléculas de unión de la invención para identificar estructuras de unión específicas de virus influenza H5N1. Las estructuras de unión pueden ser epítopos en proteínas y/o polipéptidos. Pueden ser lineales, pero también estructurales y/o conformacional. En una realización, las estructuras de unión pueden analizarse por medio de análisis PEPSCAN (véanse, entre otros, los documentos WO 84/03564, WO 93/09872, Slootstra et al., 1996). Alternativamente, puede examinarse una biblioteca de péptidos al azar que comprende péptidos de una proteína de virus influenza H5N1 para seleccionar péptidos que pueden unirse a las moléculas de unión de la invención. Las estructuras de unión/péptidos/epítopos encontrados pueden usarse como vacunas y para el diagnóstico de infecciones por virus influenza H5N1. En caso de que las moléculas de unión se unan a fragmentos

35 distintos de proteínas y/o polipéptidos, pueden identificarse estructuras de unión mediante espectrometría de masas, cromatografía de líquidos de alta resolución y resonancia magnética nuclear.

En un aspecto adicional, la descripción proporciona un método de examen de una molécula de unión (o un fragmento o variante funcional de la misma) para seleccionar la unión específica al mismo epítopo de virus influenza H5N1, que el epítopo al que se une una molécula de unión humana de la invención, comprendiendo el método las etapas de (a) poner en contacto una molécula de unión que va a examinarse, una molécula de unión de la invención y virus influenza H5N1 o un fragmento del mismo, (b) medir si la molécula de unión que va a examinarse puede competir por la unión específica a virus influenza H5N1 o a un fragmento del mismo con la molécula de unión de la invención. En una etapa adicional puede determinarse si las moléculas de unión examinadas que pueden competir 45 por la unión específica a virus influenza H5N1 o a un fragmento del mismo tienen actividad neutralizante. Una molécula de unión que puede competir por la unión específica a virus influenza H5N1 o a un fragmento del mismo con la molécula de unión de la invención forma otra parte de la presente invención. En el método de examen descrito anteriormente, “unirse específicamente al mismo epítopo” también contempla la unión específica a sustancial o esencialmente el mismo epítopo que el epítopo al que se une la molécula de unión de la invención. La capacidad para bloquear, o competir con, la unión de las moléculas de unión de la invención a virus influenza H5N1 indica normalmente que una molécula de unión que va a examinarse se une a un epítopo o sitio de unión en virus influenza H5N1 que se solapa estructuralmente con el sitio de unión en virus influenza H5N1 que se reconoce inmunoespecíficamente por las moléculas de unión de la invención. Alternativamente, esto puede indicar que una molécula de unión que va a examinarse se une a un epítopo o sitio de unión que está lo suficientemente próximo al

55 sitio de unión reconocido inmunoespecíficamente por las moléculas de unión de la invención como para inhibir estéricamente o de otro modo la unión de las moléculas de unión de la invención al virus influenza H5N1.

En general, la inhibición competitiva se mide por medio de un ensayo, en el que se mezcla una composición de antígeno, es decir una composición que comprende virus influenza H5N1 o fragmentos del mismo, con moléculas de unión de referencia, es decir las moléculas de unión de la invención, y moléculas de unión que van a examinarse. Habitualmente, las moléculas de unión que van a examinarse están presentes en exceso. Protocolos basados en ELISA e inmunotransferencia de tipo Western son adecuados para su uso en tales estudios de competición simples. Usando anticuerpos secundarios isotópicos o de especie podrán detectarse sólo las moléculas de unión de referencia unidas, cuya unión se reducirá por la presencia de una molécula de unión que va a examinarse que 65 reconoce sustancialmente el mismo epítopo. Al realizar un estudio de competición de molécula de unión entre una molécula de unión de referencia y cualquier molécula de unión que va a examinarse (independientemente de la especie o el isotipo), puede etiquetarse en primer lugar la molécula de unión de referencia con una etiqueta detectable, tal como, por ejemplo, biotina, una etiqueta enzimática, una radiactiva u otra para permitir la posterior identificación. Las moléculas de unión identificadas mediante estos ensayos de competición (“moléculas de unión competitivas” o “moléculas de unión de reacción cruzada”) incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos, fragmentos de 5 anticuerpo y otros agentes de unión que se unen a un epítopo o sitio de unión al que se une la molécula de unión de referencia, es decir una molécula de unión de la invención, así como anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y otros agentes de unión que se unen a un epítopo o sitio de unión lo suficientemente próximo a un epítopo al que se une la molécula de unión de referencia como para que se produzca unión competitiva entre las moléculas de unión que van a examinarse y la molécula de unión de referencia. Preferiblemente, las moléculas de unión competitivas de la invención, cuando están presentes en exceso, inhibirán la unión específica de una molécula de unión de referencia a una especie diana seleccionada en al menos el 10%, preferiblemente en al menos el 25%, más preferiblemente en al menos el 50%, y lo más preferiblemente en al menos el 75%-90% o incluso más. La identificación de una o más moléculas de unión competitivas que se unen de manera aproximada, sustancial, esencial o al mismo epítopo que las moléculas de unión de la invención es un asunto técnico sencillo. Como la identificación de moléculas de unión

15 competitivas se determina en comparación con una molécula de unión de referencia, es decir una molécula de unión de la invención, se entenderá que determinar realmente el epítopo al que se unen la molécula de unión de referencia y la molécula de unión competitiva no se requiere de ninguna manera para identificar una molécula de unión competitiva que se une al mismo o sustancialmente al mismo epítopo que la molécula de unión de referencia.

Ejemplos

Para ilustrar la invención, se proporcionan los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1 25

Construcción de bibliotecas de presentación en fago de scFv usando ARN extraído de células B de memoria

Se recogió sangre periférica de donantes sanos normales mediante venopunción en tubos de muestra anticoagulación con EDTA. Se diluyó una muestra de sangre (45 ml) dos veces con PBS y se pusieron alícuotas de 30 ml como sustrato con 10 ml de Ficoll-Hypaque (Pharmacia) y se centrifugaron a 900xg durante 20 min. a temperatura ambiente sin pausas. Se eliminó el sobrenadante cuidadosamente hasta justo encima de la capa blanca que contenía la fracción linfocítica y trombocítica. Luego, se retiró cuidadosamente esta fase (∼10 ml), se transfirió a un tubo de 50 ml nuevo y se lavó tres veces con 40 ml de PBS y se centrifugó a 400xg durante 10 min. a temperatura ambiente para eliminar los trombocitos. Se resuspendió el sedimento que contenía linfocitos obtenido 35 en medio RPMI que contenía FBS al 2% y se determinó el número de células mediante recuento celular. Se tiñeron aproximadamente 1x108 linfocitos para la clasificación celular fluorescente usando CD24, CD27 e IgM de superficie como marcadores para el aislamiento de células B de memoria de IgM. Se usó un aparato Becton Dickinson Digital Vantage configurado en modo Yield para la clasificación y el aislamiento físicos de células B de memoria. Se agruparon linfocitos como la población compacta pequeña a partir de la ventana FSC/SSC. Posteriormente se separaron células B de memoria (CD24+/CD27+) de células B no diferenciadas (CD24+/CD27-) y las células T de memoria (CD24-/CD27+). En una etapa siguiente, se separaron células B de memoria de IgM (IgM+) de células B de memoria diferenciadas (IgM-) usando la expresión de IgM. En esta etapa se clasificaron las células B de memoria de IgM en un tubo de muestra separado. Se recogieron 1x105 células en DMEM/FBS al 50% y tras la finalización de la clasificación se centrifugaron a 400xg durante 10 min. y se lisaron en 500 μl de disolución de extracción de ARN total 45 TRIZOL (Invitrogen). Se extrajo el ARN de la disolución de lisis usando 200 μl de cloroformo y precipitación con isopropanol tal como se detalla en el protocolo de la disolución TRIZOL. Luego, se aplicó 1 μl de Pellet Paint (Novogen) para potenciar y visualizar el proceso de sedimentación. Se disolvió la preparación de ARN completo en 23 μl de agua ultrapura tratada con DEPC (Invitrogen) y se usó para la conversión en ADNc con transcriptasa inversa SuperScript III (Invitrogen). Se añadió 1 μl de hexámeros al azar (500 ng/μl) (Promega) a la muestra de ARN y se mezcló y se fundió a 65ºC durante 5 min. en una máquina de PCR de tapa calentada. Se enfrió inmediatamente la muestra sobre hielo húmedo y se añadieron los siguientes componentes: 8 μl de tampón RT 5X (Tris-HCl 250 mM pH 8,3, KCI 375 mM, MgCl2 15 mM), 2 μl de dNTP (10 mM de cada uno) (Invitrogen), 2 μl de DTT (100 mM), 2 μl de inhibidor de ARNasa (40 U/μl) (Promega), 2 μl de SuperScript III (200 U/μl) (Invitrogen). En primer lugar, se incubó la mezcla obtenida durante 5 min. a temperatura ambiente y entonces se transfirió a una máquina de PCR de tapa

55 calentada a 50ºC durante 1 h. Se detuvo la reacción calentado hasta 75ºC durante 15 min. Se diluyó el ADNc obtenido hasta 200 μl con agua ultrapura y se almacenó a -20ºC hasta su uso adicional.

Se aplicó un enfoque de amplificación por PCR de dos rondas usando los conjuntos de cebadores mostrados en las tablas 1 y 2 para aislar las regiones VH y VL de inmunoglobulina del repertorio de donante específico. La formulación de PCR para la amplificación usada a lo largo de todo procedimiento era tal como sigue: 5 μl de molde de ADNc, 32,75 μl de agua ultrapura, 2,5 μl de cada cebador (10 μM), 5 μl de tampón de PCR 10X (Tris-HCl 200 mM pH 8,4, KCl 500 mM), 1,5 μl de MgCl2 (50 mM), 0,5 μl de dNTP (25 mM de cada uno), 0,25 μl de Taq polimerasa (5 U/μl) (Invitrogen). La primera ronda de amplificación sobre el ADNc respectivo usando los conjuntos de cebadores mencionados en la tabla 1 produjo 7, 6 y 9 productos de aproximadamente 650 pares de bases para las regiones 65 VH, Vkappa y Vlambda respectivamente. Para la amplificación de la región VH de células B de memoria de IgM se usó el cebador constante OCM en combinación con OH1 a OH7. El programa de ciclado térmico para las amplificaciones de primera ronda era: 2 min. a 96ºC (etapa de desnaturalización), 30 ciclos de 30 s a 96ºC/30 s a 55ºC/60 s a 72ºC, 10 min. de elongación final a 72ºC y refrigeración a 4ºC. Se cargaron los productos sobre y se aislaron a partir de un gel de agarosa al 1% usando columnas de extracción de gel (Qiagen) y se eluyeron en 50 μl 5 de Tris-HCl 1 mM pH 8,0. Se sometió el diez por ciento de los productos de la primera ronda (5 μl) a la amplificación de segunda ronda usando los cebadores mencionados en la tabla 2. Se extendieron estos cebadores con sitios de restricción que permitían la clonación direccional de las regiones VL y VH respectivas en el vector de presentación en fago PDV-C06. El programa de PCR para las amplificaciones de segunda ronda era tal como sigue: 2 min. a 96ºC (etapa de desnaturalización), 30 ciclos de 30 s a 96ºC/30 s a 60ºC/60 s a 72ºC, 10 min. de elongación final a 72ºC y 10 refrigeración a 4ºC. En primer lugar, se combinaron los productos de segunda ronda (∼350 pares de bases) según la aparición natural de segmentos J encontrados en productos génicos de inmunoglobulina, dando como resultado 7, 6 y 9 combinaciones para las regiones variables VH, Vkappa y Vlambda respectivamente (véanse las tablas 3 y 4). Para obtener una distribución normalizada de secuencias de inmunoglobulina en la biblioteca inmunitaria, se mezclaron las combinaciones de cadena ligera 6 Vkappa y 9 Vlambda según los porcentajes mencionados en la 15 tabla 3. Se digirió esta combinación de VL final individual (3 μg) durante la noche con las enzimas de restricción SalI y NotI, se cargó sobre y se aisló a partir de un gel de agarosa al 1,5% (∼350 pares de bases) usando columnas de extracción de gel Qiagen y se ligó en el vector PDV-C06 cortado con SalI-NotI (∼5000 pares de bases) tal como sigue: 10 μl de vector PDV-C06 (50 ng/μl), 7 μl de inserto de VL (10 ng/μl), 5 μl de tampón de ligación 10X (NEB), 2,5 de ADN ligasa de T4 (400 U/μl) (NEB), 25,5 μl de agua ultrapura (la razón de vector con respecto a inserto era 20 de 1:2). Se realizó la ligación durante la noche en un baño de agua de 16ºC. Luego, se duplicó el volumen con agua, se extrajo con un volumen igual de fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (75:24:1) (Invitrogen) seguido por extracción con cloroformo (Merck) y se precipitó con 1 μl de Pellet Paint (Novogen), 10 μl de acetato de sodio (3 M pH 5,0) y 100 μl de isopropanol durante 2 h a -20ºC. Posteriormente, se centrifugó la muestra obtenida a 20000xg durante 30 min. a 4ºC. Se lavó el precipitado obtenido con etanol al 70% y se centrifugó durante 10 min. a 20000xg a 25 temperatura ambiente. Se eliminó el etanol mediante aspiración a vacío y se secó al aire el sedimento durante varios min. y entonces se disolvió en 50 μl de tampón que contenía Tris-HCl 10 mM, pH 8,0. Se usó 1 μl de mezcla de ligación para la transformación de 40 μl de células electro-competentes TG-1 (Stratagene) en una cubeta de electroporación de 0,1 cm enfriada (Biorad) usando un aparato Genepulser II (Biorad) configurado a 1,7 kV, 200 Ohm, 25 μF (constante de tiempo ∼4,5 ms). Directamente tras el pulso, se purgaron las bacterias de la cubeta con 30 1000 μl de medio SOC (Invitrogen) que contenía glucosa al 5% (p/v) (Sigma) a 37ºC y se transfirieron a un tubo de cultivo de fondo redondo de 15 ml. Se usaron otros 500 μl de SOC/glucosa para purgar bacterias residuales de la cubeta y se añadieron al tubo de cultivo. Se recuperaron las bacterias cultivando durante exactamente 1 h a 37ºC en un incubador agitador a 220 rpm. Se sembraron en placa las bacterias transformadas sobre placas de Petri cuadradas de 240 mm grandes (NUNC) que contenían 200 ml de agar 2TY (bacto-triptona 16 g/l, extracto de bacto35 levadura 10 g/l, NaCl 5 g/l, agar 15 g/l, pH 7,0) complementado con ampicilina 50 μg/ml y glucosa al 5% (p/v) (Sigma). Se sembró en placa una dilución de 1 a 1000 para fines de recuento sobre placas de Petri de 15 cm que contenían el mismo medio. Se repitió secuencialmente este procedimiento de transformación veinte veces y se sembró en placa la biblioteca completa sobre un total de treinta placas de Petri cuadradas grandes y se hizo crecer durante la noche en una estufa de cultivo a 37ºC. Normalmente, se obtuvieron aproximadamente 1x107 ufc usando

40 el protocolo anterior. Se recogió la biblioteca de cadena ligera VL intermedia de las placas raspando suavemente las bacterias en 10 ml de medio 2TY por placa. Se determinó la masa celular mediante medición de DO600 y se usó 500 DO de bacterias dos veces para la preparación de ADN de maxi plásmido usando dos columnas P500 maxiprep (Qiagen) según las instrucciones del fabricante.

45 De manera análoga a las regiones variables VL, se mezclaron entre sí en primer lugar los productos VH-JH de segunda ronda para obtener la distribución de uso de segmentos J normal (véase la tabla 4), dando como resultado 7 subcombinaciones de VH denominadas PH1 a PH7. Se mezclaron las combinaciones para adquirir una distribución de secuencia normalizada usando los porcentajes representados en la tabla 4, obteniendo una fracción de VH que se digirió con las enzimas de restricción SfiI y XhoI y se ligó en la biblioteca intermedia de PDV-VL

50 cortada con SfiI-XhoI obtenida tal como se describió anteriormente. El sistema de ligación, el método de purificación, la transformación posterior de TG1 y la recogida de bacterias eran exactamente tal como se describió para la biblioteca intermedia de VL (véase anteriormente). Se comprobó la biblioteca final (aproximadamente 5x106 ufc) para determinar la frecuencia de insertos con una PCR de colonias usando un conjunto de cebadores que flanqueaban las regiones VH-VL insertadas. Más del 95% de las colonias mostraban un inserto de longitud correcta (véase la

55 tabla 5). Se usaron los productos de PCR de colonias para el posterior análisis de la secuencia de ADN para comprobar la variación de secuencia y para evaluar el porcentaje de colonias que mostraban un ORF completo. Esto estaba normalmente por encima del 70% (véase la tabla 5). También se analizó la frecuencia de mutaciones en los genes V. De 50 secuencias, 47 (94%) no estaban en la configuración de la línea germinal, lo que indica un proceso de maduración y concuerda con el fenotipo de memoria de las células B usadas como fuente de ARN para la

60 biblioteca. Finalmente, se rescató la biblioteca y se amplificó usando fagos auxiliares CT (véase el documento WO 02/103012) y se usó para la selección de anticuerpos de fago mediante métodos de cribado tal como se describe a continuación.

Ejemplo 2 65

Selección de fagos que portan fragmentos Fv de cadena sencilla contra H5N1

Se seleccionaron fragmentos de anticuerpo usando bibliotecas de presentación en fago de anticuerpos construidas esencialmente tal como se describió anteriormente y tecnología de presentación en fago general y tecnología

5 MABSTRACT® esencialmente tal como se describe en la patente estadounidense n.º 6.265.150 y en el documento WO 98/15833. Además, se usaron en la presente invención los métodos y los fagos auxiliares descritos en el documento WO 02/103012.

Se realizó la selección contra el subtipo H5 de hemaglutinina (HA) recombinante (A/Vietnam/1203/2004; véase SEQ ID NO:110) producido usando vectores de baculovirus en células de insecto (Protein Sciences, CT, EE.UU.). La secuencia de aminoácidos de HA de A/Vietnam/1194/2004 (H5N1TV) aislado y la secuencia de aminoácidos consenso que representa HA de cepas aisladas en Indonesia y China (H5N1IC) se muestran en SEQ ID NO:111 y SEQ ID NO: 12, respectivamente. También se realizaron selecciones contra HA recombinante soluble (sHA) de H5N1. Se clonaron la secuencia que codifica para la parte extracelular (soluble) de HA (sHA) de

15 A/Vietnam/1194/2004 (H5N1) aislado, que representa las HA identificadas en cepas de influenza aisladas en Tailandia y Vietnam (sHA de H5N1TV, SEQ ID NO:113) en 2004 (clado 1) y una secuencia consenso que representa partes solubles de HA de cepas H5N1 aisladas en Indonesia y China (sHA de H5N1IC, SEQ ID NO: 114) en 2003/2004 (clado 2) en un vector de expresión que contenía una etiqueta myc y una etiqueta his usando técnicas de clonación de ADN convencionales. Las HA de H5N1TV y H5N1IC difieren en 9 posiciones de aminoácido, todas ubicadas en la subunidad HA1 de las moléculas. Se realizaron transfecciones de ADN en células PER.C6 para expresión transitoria y/o estable usando técnicas convencionales. Se purificó sHA a partir del sobrenadante de cultivo usando cromatografía de afinidad por quelatos metálicos usando columnas HisTrap™ FF (Amersham Biosciences) según las instrucciones del fabricante.

25 Se diluyeron antígenos de HA (HA recombinante y sHA de H5N1TV) en PBS (5,0 μg/ml), se añadieron a inmunotubos de Nunc MaxiSorp™ (Nunc) y se incubaron durante la noche a 4ºC sobre una rueda giratoria. Se vaciaron los inmunotubos y se lavaron tres veces en tampón de bloqueo (leche en polvo desnatada al 2% (ELK) en PBS). Posteriormente, se llenaron los inmunotubos completamente con tampón de bloqueo y se incubaron durante 1-2 h a temperatura ambiente. Además, se recubrieron los inmunotubos durante la noche con anticuerpo anti-myc y se incubaron con tampón de bloqueo que contenía sHA etiquetada con myc 5 μg/ml de H5N1TV. Se bloquearon alícuotas de biblioteca de presentación en fago combinada (500-1000 μl, 0,5x1013 - 1x1013 ufc, amplificada usando fago auxiliar CT (véase el documento WO 02/103012)) en tampón de bloqueo complementado con suero bovino fetal no inactivado por calor al 10% y suero de ratón al 2% durante 1-2 h a temperatura ambiente. Se añadió la biblioteca de fagos bloqueada a los inmunotubos, se incubó durante 2 h a temperatura ambiente y se lavó con tampón de

35 lavado (Tween-20 al 0,05% (v/v) en PBS) para eliminar los fagos no unidos. Se eluyeron los fagos unidos del antígeno respectivo mediante incubación con 1 ml de trietilamina 100 mM (TEA) durante 10 min. a temperatura ambiente. Posteriormente, se mezclaron los fagos eluidos con 0,5 ml de Tris-HCl 1 M pH 7,5 para neutralizar el pH. Se usó esta mezcla para infectar 5 ml de un cultivo de E. coli XL1-Blue que se había hecho crecer a 37ºC hasta una DO a 600 nm de aproximadamente 0,3. Se dejó que los fagos infectaran las bacterias XL1-Blue durante 30 min. a 37ºC. Entonces, se centrifugó la mezcla durante 10 min. a 3000xg a temperatura ambiente y se resuspendió el sedimento bacteriano en 0,5 ml de medio de extracto de 2-triptona levadura (2TY). Se dividió la suspensión bacteriana obtenida sobre dos placas de agar 2TY complementado con tetraciclina, ampicilina y glucosa. Tras la incubación durante la noche de las placas a 37ºC, se rasparon las colonias de las placas y se usaron para preparar una biblioteca de fagos enriquecida, esencialmente tal como se describe por De Kruif et al. (1995a) y el documento

45 WO 02/103012. En resumen, se usaron las bacterias raspadas para inocular el medio 2TY que contenía ampicilina, tetraciclina y glucosa y se hicieron crecer a una temperatura de 37ºC hasta una DO a 600 nm de ∼0,3. Se añadieron fagos auxiliares CT y se dejó que infectaran las bacterias tras lo cual se cambió el medio a 2TY que contenía ampicilina, tetraciclina y kanamicina. Se continuó la incubación durante la noche a 30ºC. El siguiente día, se eliminaron las bacterias del medio 2TY mediante centrifugación tras lo cual se precipitaron los fagos en el medio usando polietilenglicol (PEG) 6000/NaCl. Finalmente, se disolvieron los fagos en 2 ml de PBS con albúmina sérica bovina al 1% (BSA), se esterilizaron por filtración y se usaron para la siguiente ronda de selección.

Alternativamente, se realizaron selecciones de fagos usando líneas celulares que expresan HA de longitud completa. Para este fin, se usaron vectores de expresión que contenían la secuencia codificante completa de HA de 55 longitud completa a partir de A/Vietnam/1194/2004 (H5N1TV) aislado y una secuencia consenso que representa HA de longitud completa de cepas H5N1 aisladas en Indonesia y China (H5N1IC) para transfectar células PER.C6. Se realizó un análisis por citometría de flujo usando un anticuerpo anti-HA en paralelo con cada selección de fagos para garantizar la expresión de HA por células PER.C6 transfectadas con H5N1TV y H5N1IC (datos no mostrados). Se resuspendieron 10x106 células PER.C6 no transfectadas en 0,5 ml de biblioteca de fagos combinada y 0,5 ml de medio de cultivo de PER.C6 complementado con ELK al 4% y se incubaron durante 1 h en un conjunto de rotor por volteo a 5 rpm a 4ºC. Tras 5 min. de centrifugación a 300xg a 4ºC de la mezcla de biblioteca de fagos/células PER.C6 no transfectadas, se sustrajeron del sobrenadante que contenía los fagos una segunda vez 10x106 células PER.C6 no transfectadas. Posteriormente, se mezcló la preparación de fagos sustraída con 1x106 células PER.C6 que expresan HA y se incubó durante 2 h en un conjunto de rotor por volteo a 5 rpm a 4ºC. Posteriormente, se 65 centrifugaron las células durante 2 min. a 3000xg y se resuspendió el sedimento celular en 1 ml de PBS/Tween-20 al 0,05% para eliminar por lavado los fagos no unidos. Se centrifugaron las células durante 2 min. a 3000xg y se repitió

el lavado 5 veces adicionales. Tras cada lavado, se transfirieron las células a un tubo nuevo. Se eluyeron los fagos unidos del antígeno mediante incubación con 1 ml de TEA 100 mM durante 10 min. en un conjunto de rotor por volteo a 5 rpm a temperatura ambiente. Se centrifugaron las células durante 2 min. a 3000xg y se transfirieron los fagos eluidos a un tubo de 50 ml que contenía 0,5 ml de Tris-HCl 1 M, pH 7,5. Se realizó el rescate y la propagación

5 de los fagos eluidos tal como se describió anteriormente. Se realizaron dos rondas de selecciones antes del aislamiento de anticuerpos de fago de cadena sencilla individuales. Tras la segunda ronda de selección, se usaron colonias de E. coli individuales para preparar anticuerpos de fago monoclonales. Esencialmente, se hicieron crecer colonias individuales hasta la fase logarítmica en formato de placa de 96 pocillos y se infectaron con fagos auxiliares VCS-M 13 tras lo cual se dejó que avanzara la producción de anticuerpos de fago durante la noche. Se usaron directamente los sobrenadantes que contenían anticuerpos de fago en ELISA para la unión a antígenos de HA. Alternativamente, se precipitaron anticuerpos de fago mediante PEG/NaCl y se esterilizaron por filtración para el análisis por citometría de flujo.

Ejemplo 3 15

Validación de los anticuerpos de fago de cadena sencilla específicos de HA

Se validaron anticuerpos de fago de cadena sencilla seleccionados que se obtuvieron en la selección descrita anteriormente en ELISA para determinar su especificidad, es decir, su unión a antígenos de HA. Para este fin, se recubrieron placas de ELISA Maxisorp™ con HA recombinante expresada en baculovirus (Protein Sciences, CT, EE.UU.) y sHA de H5N1TV y H5N1IC purificados. Se inmovilizó Am anti-myc 9E10 (Roche) sobre placas de ELISA Maxisorp™ como antígeno de control negativo. Tras recubrir, se lavaron las placas tres veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,1% v/v y se bloquearon en PBS que contenía BSA al 3% o ELK al 2% durante 1 h a temperatura ambiente. Se incubaron los anticuerpos de fago de cadena sencilla seleccionados durante 1 h en un volumen igual

25 de PBS que contenía ELK al 4% para obtener anticuerpos de fago bloqueados. Se vaciaron las placas, se lavaron tres veces con PBS/Tween-20 al 0,1% y se añadieron los anticuerpos de fago de cadena sencilla bloqueados a los pocillos. Se dejó avanzar la incubación durante 1 h, se lavaron las placas con PBS/Tween-20 al 0,1% y se detectaron anticuerpos de fago unidos (usando medición de la DO a 492 nm) usando un anticuerpo anti-M13 conjugado con peroxidasa. Como control, se realizó el procedimiento simultáneamente sin anticuerpo de fago de cadena sencilla y con un anticuerpo de fago de cadena sencilla de control negativo. A partir de las selecciones en los diferentes antígenos de HA con la biblioteca de células B de memoria de IgM, se obtuvieron 92 anticuerpos de fago de cadena sencilla únicos específicos para o bien HA recombinante o bien sHA.

Alternativamente, se sometió a prueba la reactividad de anticuerpos de cadena sencilla que se seleccionaron por su

35 unión a células PER.C6 que expresan HA usando análisis por citometría de flujo. Se mezclaron fagos precipitados con PEG/NaCl con un volumen igual de PBS/ ELK al 2% bloqueado durante 30 min. sobre hielo. Se añadieron los fagos bloqueados a las células sedimentadas (células PER.C6 no transfectadas y PER.C6 que expresan HA) y se incubaron durante 1 h sobre hielo. Se lavaron las células tres veces con PBS/BSA al 1%, seguido por una centrifugación de 1 minuto a 300xg, y se visualizo la unión de los anticuerpos de fago de cadena sencilla a las células usando un anticuerpo anti-M13 biotinilado (Fitzgerald) seguido por conjugado de estreptavidina-ficoeritrina (Caltag). Las selecciones que usaron células PER.C6 que expresan HA proporcionaron 24 anticuerpos de fago de cadena sencilla únicos que no se identificaron durante las selecciones que usaron las diferentes proteínas de HA recombinante.

45 Ejemplo 4

Caracterización de los scFv específicos de HA

A partir de los clones de anticuerpos de fago de cadena sencilla (scFv) específicos seleccionados se obtuvo ADN plásmido y se determinaron secuencias de aminoácidos y de nucleótidos según las técnicas convencionales. La secuencia de aminoácidos y de nucleótidos y la identidad génica de VH y VL (véase Tomlinson IM et al. V-BASE Sequence Directory. Cambridge Reino Unido MRC Centre for Protein Engineering (1997)) de los scFvs se representan en la tabla 6. Las regiones CDR de las inmunoglobulinas específicas de HA se muestran en la tabla 7.

55 Ejemplo 5

Construcción de moléculas de inmunoglobulina completamente humanas (anticuerpos monoclonales humanos) a partir de Fv de cadena sencilla seleccionados

Se clonaron directamente regiones variables de cadena pesada y ligera de los scFvs mediante digestión por restricción para detectar la expresión en los vectores de expresión de IgG plg-C911-HCgamma1 (véase SEQ ID No:141), pIG-C909-Ckappa (véase SEQ ID NO:142) o pIg-C910-Clambda (véase SEQ ID No:143). Se verificaron las secuencias de nucleótidos de todos los constructos según técnicas convencionales conocidas por el experto en la técnica. Se expresaron de manera transitoria los constructos de expresión resultantes que codifican para las 65 cadenas pesada y ligera de IgG1 humana en combinación en células 293T y se obtuvieron los sobrenadantes que contenían anticuerpos de IgG1 humana y se produjeron usando procedimientos de purificación convencionales. Se

titularon los anticuerpos de IgG1 humana en un intervalo de concentración de entre 10 y 0,003 μg/ml contra H5 (datos no mostrados). Se incluyó un anticuerpo específico de SARS-CoV como anticuerpo de control. Las moléculas de IgG1 mostraron el mismo patrón de reactividad al demostrado para los anticuerpos de fago se cadena sencilla.

5 Las secuencias de aminoácidos y de nucleótidos de la cadena pesada y ligera de los anticuerpos denominados CR6141, CR6255, CR6257, CR6260, CR6261, CR6262, CR6268, CR6272, CR6296, CR6301, CR6307, CR6310, CR6314, CR6323, CR6325, CR6327, CR6328, CR6329, CR6331, CR6332, CR6334, CR6336, CR6339, CR6342, CR6343 y CR6344 así como sus regiones variables de cadena pesada y ligera se facilitan en la tabla 8. Posteriormente, se investigó la unión de la IgG anti-HA a células PER.C6 que expresan HA mediante citometría de flujo. El análisis por citometría de flujo para detectar la unión de anticuerpo a HA demostró que los anticuerpos CR6255, CR6257, CR6260, CR6261, CR6262, CR6268, CR6307, CR6310, CR6314, CR6323, CR6325, CR6331 y CR6344 se unen a células PER.C6 que expresan HA (H5N1TV) (véase la tabla 9). Los anticuerpos CR6261 y CR6344 también presentaban unión a células de control no transfectadas, pero las señales obtenidas eran aproximadamente 10 veces inferiores a las señales obtenidas para la unión a células PER.C6 que expresan HA

15 (H5N1TV) (véase la tabla 9). No se observó unión del anticuerpo de control CR3014 a células que expresan HA y células de control no transfectadas.

Ejemplo 6

Neutralización in vitro de virus influenza H5N1 mediante IgG específicas de H5N1 (ensayo de neutralización del virus)

Con el fin de determinar si las IgG seleccionadas podían bloquear la infección por H5N1, se realizaron ensayos de neutralización de virus (VNA) in vitro. Se realizaron los VNA sobre células MDCK (ATCC CCL-34). Se cultivaron 25 células MDCK en medio de cultivo celular de MDCK (medio MEM complementado con antibióticos, Hepes 20 mM y bicarbonato de sodio al 0,15% (p/v) (medio MEM completo), complementado con suero bovino fetal al 10% (v/v)). Se diluyó la cepa reordenante de H5N1 NIBRG-14 que se usó en el ensayo hasta un título de 4x103 TCID50/ml (dosis infectiva en cultivo tisular al 50% por ml), con el título calculado según el método de Spearman y Karber. Se diluyeron en serie las preparaciones de IgG (200 μg/ml) dos veces (1:2 - 1:16) en medio MEM completo en pocillos por duplicado. Se mezclaron 25 μl de la dilución de IgG respectiva con 25 μl de suspensión de virus (100 TCID50/25 μl) y se incubó durante 1 h a 37ºC. Entonces, se transfirió la suspensión por duplicado sobre placas de 96 pocillos que contenían cultivos de MDCK confluentes en 50 μl de medio MEM completo. Antes de su uso, se sembraron células MDCK a 3x104 células por pocillo en medio de cultivo celular de MDCK, se hicieron crecer hasta que las células habían alcanzado la confluencia, se lavaron con 300-350 μl de PBS, pH 7,4 y finalmente se añadieron 50 μl

35 de medio MEM completo a cada pocillo. Se cultivaron las células inoculadas durante 3-4 días a 33ºC y se observaron a diario para detectar el desarrollo de efecto citopático (CPE). Se comparó el CPE con el control positivo (células inoculadas NIBRG-14) y controles negativos (células inoculadas de manera simulada). Se definió la ausencia completa de CPE en un cultivo celular individual como protección. Se usó anticuerpo anti-HA de virus influenza H5N1 A/Vietnam/1194/04 de oveja como control positivo en el ensayo.

Además, se sometieron a prueba cultivos para detectar la presencia de virus usando inmunohistoquímica. Para este fin, se desechó el sobrenadante de cultivo y se fijaron las células con acetona al 40% (v/v) y metanol al 60% (v/v) durante 15 min. Se bloquearon las células fijadas durante 30 min. a 37ºC en tampón de bloqueo (NaCl 200 mM, albúmina sérica bovina (BSA) al 0,2% (p/v), timerosal al 0,01%, Tween-20 al 0,2% (v/v), Tris-HCl 20 mM, pH 7,45)

45 complementado con BSA al 2% (p/v) y suero de cabra al 5% (v/v). Posteriormente, se incubaron las células durante 1 h a 37ºC con 50 μl de combinación de anticuerpo monoclonal anti-influenza A de ratón (Chemicon) diluida 1:1000 en tampón de lavado. Tras tres lavados con tampón de lavado, se añadieron 50 μl de anticuerpo de cabra anti-IgG de ratón conjugado con biotina (Jackson) diluido 1:1000 en tampón de lavado y se incubó durante 1 h a 37ºC. Tras tres lavados con tampón de lavado, se añadieron 50 μl de conjugado de estreptavidina-peroxidasa (Calbiochem) diluido 1:3000 en tampón de lavado y se incubó durante 30 min. a 37ºC. Tras otros tres lavados con tampón de lavado, se visualizó la tinción usando disolución de AEC (3-amino-9-etilcarbazol al 0,12% (p/v), N-Ndimetilformamida al 30% (v/v) y tampón acetato al 70% (v/v)) que contenía 1 μl de H2O2/1 ml de disolución de AEC. Tras tres lavados con tampón de lavado, se analizó la tinción bajo microscopio.

55 Los anticuerpos anti-HA humanos denominados CR6255, CR6257, CR6260, CR6261, CR6262, CR6268, CR6307, CR6310, CR6314, CR6323, CR6325, CR6331 y CR6344 se sometieron al VNA anteriormente descrito. Todos los anticuerpos neutralizaron la cepa reordenante de H5N1 NIBRG-14. Las concentraciones (en μg/ml) a las que estos anticuerpos protegen cultivos de MDCK contra CPE se facilitan en la tabla 10. En pocillos en los que se observó CPE, se confirmó las presencia de virus mediante tinción inmunohistoquímica (datos no mostrados).

Con el fin de determinar la potencia neutralizante de las IgG específicas de H5N1 de manera más precisa, se repitieron los ensayos de neutralización de virus in vitro con NIBRG-14, pero esta vez se diluyeron adicionalmente las preparaciones de IgG. Se diluyeron en serie las preparaciones de IgG (200 μg/ml) dos veces (1:1 - 1:512) en medio MEM completo y se sometieron a prueba en pocillos por cuadruplicado en el VNA tal como se describió 65 anteriormente. Se determinó la potencia neutralizante de los anticuerpos anti-H5N1 humanos denominados CR6255,

CR6257, CR6260, CR6261, CR6262, CR6268, CR6272, CR6307, CR6310, CR6314, CR6323, CR6325, CR6327, CR6328, CR6329, CR6331, CR6332, CR6334, CR6336, CR6339, CR6342, CR6343 y CR6344 en el VNA. Todos los anticuerpos, excepto CR6272 y CR6339, neutralizaron la cepa reordenante de H5N1 NIBRG-14. Las concentraciones (en μg/ml, en presencia de 100 TCID50 de virus) a las que estos anticuerpos protegen cultivos de

5 MDCK contra CPE se indican en la tabla 11. En pocillos en los que se observó CPE, se confirmó la presencia de virus mediante tinción inmunohistoquímica (datos no mostrados).

Ejemplo 7

Análisis de inmunotransferencia de IgG específicas de H5N1

Para investigar adicionalmente la especificidad de los anticuerpos anti-HA, se sometieron diferentes antígenos de influenza A de hemaglutinina recombinante a SDS-PAGE en condiciones reductoras seguido por análisis de inmunotransferencia anti-HA. El polipéptido HA0 está compuesto por la subunidad HA1 y HA2. El anticuerpo

15 CR5111, un anticuerpo de control específico de H5N1, reconocía la subunidad HA1 y el polipéptido HA0 intacto (no escindido) de sHA de H5N1TV (véase la figura 1, parte derecha, carril 1). Además, CR5111 reconocía la subunidad HA1 de HA recombinante, subtipo H5 (A/Vietnam/1203/2004 (H5N1); véase SEQ ID NO: 110) producida usando vectores de baculovirus en células de insecto (Protein Sciences, CT, EE.UU.) (figura 1, parte derecha, carril 2). No se detectó el polipéptido HA0 no escindido en esta preparación de HA. Podría explicarse la diferencia en tamaño entre las subunidades de HA en los carriles 1 y 2 por una glicosilación diferente de HA expresada en células de insecto y células PER.C6. CR5111 no reconoció los polipéptidos HA1 y/o HA0 de HA recombinante, subtipo H1 (A/New Caledonia/20/99 (H1N1)) (véase la figura 1, parte derecha, carril 4) o de HA recombinante, subtipo H3 (A/Wyoming/3/2003(H3N2)) (figura 1, parte derecha, carril 3).

25 Los anticuerpos CR6307 y CR6323 reconocieron las subunidades HA2 de sHA de H5N1TV (véase la figura 1, parte media e izquierda, carriles 1) y HA recombinante, subtipo H5 (A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) (véase la figura 1, parte media e izquierda, carriles 2). De manera interesante, no se reconoció la subunidad HA2 como presente en los polipéptidos HA0 intactos, no escindidos. Aparentemente, el epítopo reconocido por CR6307 y CR6323 se vuelve accesible tras la escisión de HA0. Además, los anticuerpos CR6307 y CR6323 reconocieron la subunidad HA2 de HA recombinante, subtipo H1 (A/New Caledonia/20/99 (H1N1)) (véase la figura 1, parte media e izquierda, carriles 4), pero no la subunidad HA2 de HA recombinante, subtipo H3 (A/Wyoming/3/2003(H3N2)) (véase la figura 1, parte media e izquierda, carriles 3), ambas HA recombinantes producidas usando vectores de baculovirus en células de insecto (Protein Sciences, CT, EE.UU.). Debido a que el sitio de unión de anticuerpos neutralizantes CR6307 y CR6323 se conserva dentro de las cepas de influenza A del subtipo H1 y H5, podría considerarse una molécula que

35 comprende el sitio de unión como (parte de una) vacuna que puede inducir una respuesta de anticuerpos antiinfluenza con amplia reactividad cruzada.

Junto con los anticuerpos CR6307 y CR6323, se usaron los anticuerpos denominados CR6141, CR6296, y CR6301 en análisis de inmunotransferencia. Cada uno de los tres anticuerpos podía unirse a la subunidad HA2 de sHA de H5N1TV y HA recombinante, subtipo H5 (A/Vietnam/1203/2004; H5N1) (datos no mostrados).

Ejemplo 8

Análisis de FACS para determinar la especificidad de subunidad de IgG específicas de H5N1

45 Con el fin de evaluar la contribución de la subunidad HA1 a la unión de anticuerpos anti-H5N1, se estableció un ensayo, en el que se libera la subunidad HA1 a partir de células PER.C6 que expresan HA. Se lavaron células PER.C6 que expresan HA tres veces con PBS, pH 7,4, y se incubaron durante 10 min. en PBS acidificado, pH 4,9. Posteriormente, se lavaron las células con PBS, pH 7,4, y se trataron durante 10 min. con tripsina 10 μg/ml en PBS, pH 7,4, para escindir moléculas de HA0 en subunidades HA1 y HA2 unidas por enlaces disulfuro. Finalmente, se incubaron las células durante 20 min. en DTT 20 mM en PBS, pH 7,4, para liberar la subunidad HA1 a partir de la subunidad HA2 anclada a la membrana. Se lavaron las células no tratadas y tratadas con ácido/tripsina/DTT dos veces con PBS que contenía BSA al 1% p/v. Para el análisis por citometría de flujo, se usaron 2,5x105 células por tinción. No se observó tinción de células tratadas y no tratadas con el anticuerpo de control negativo CR3014. El

55 anticuerpo CR5111, que se une a la subunidad HA1 en análisis de inmunotransferencia, tiñó la población de células PER.C6 que expresan HA no tratadas, mientras que no se reconocieron células tratadas (datos no mostrados). Esto proporciona una prueba adicional de que CR5111 reconoce la subunidad HA1. Se tiñeron células tratadas y no tratadas en un grado similar por los anticuerpos CR6307 y CR6323 (datos no mostrados). La liberación de la subunidad HA1 obviamente no influye en la unión de estos anticuerpos, confirmando adicionalmente los resultados del análisis de inmunotransferencia que los anticuerpos se unen a la subunidad HA2. Los anticuerpos CR6325 y CR6331 se unían a células no tratadas, mientras que la unión a células tratadas estaba marcadamente reducida en comparación con la unión a células no tratadas (datos no mostrados). Esto sugiere que la afinidad de los anticuerpos por su epítopo se reduce de manera significativa por el cambio conformacional inducido por el tratamiento con ácido

o por la reducción del enlace disulfuro que une la subunidad HA1 y HA2.

65 Ejemplo 9

ELISA de competición de hemaglutinina con anticuerpos de fago e IgG

Para identificar anticuerpos que se unen a epítopos no-solapantes, no-competitivos, se realizó un ELISA de

5 competición de hemaglutinina. Se recubrieron placas Nunc-Immuno™ Maxisorp F96 durante la noche a 4ºC con HA recombinante, subtipo H5 0,5 μg/ml (A/Vietnam/1203/2004 (H5N1) (Protein Sciences) en PBS. Se eliminó por lavado la proteína no recubierta antes de bloquear los pocillos con 300 μl de PBS que contenía leche en polvo desnatada al 2% p/v (disolución de bloqueo) durante 1 h a temperatura ambiente. Se desechó la disolución de bloqueo y se incubaron 50 μl de IgG anti-H5N1 10 μg/ml en disolución de bloqueo por pocillo durante 1 h a temperatura ambiente.

10 Posteriormente, se añadieron 50 μl de anticuerpo de fago en disolución de bloqueo en una concentración dos veces la concentración que daba como resultado el 50% de la unión máxima (tal como se determinó en un ensayo previo) por pocillo y se incubó durante otra h a temperatura ambiente. Se lavaron los pocillos tres veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,1% v/v. Se detectó anticuerpo de fago unido usando un anticuerpo anti-M13 conjugado con peroxidasa. Se lavaron los pocillos de nuevo tal como se describió anteriormente y se reveló adicionalmente el

15 ELISA mediante la adición de 100 μl de reactivo OPD (Sigma). Se detuvo la reacción añadiendo 50 μl de H2SO4 1 M y entonces se midió la DO a 492 nm. Se expresó la unión de anticuerpo de fago, en presencia de IgG, como porcentaje de unión en ausencia de IgG, que se fijó al 100%. Se incluyeron como controles anticuerpo de fago SC05-111 y la correspondiente IgG CR5111, que reconoce un epítopo en la subunidad HA1 de hemaglutinina H5.

20 Los resultados indican que la mayoría de los anticuerpos de fago e IgG se unen a un epítopo solapante en HA recombinante, subtipo H5 (A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)) (datos no mostrados). Se bloqueó la unión del anticuerpo de fago SC05-111 mediante IgG CR5111, pero no por ninguna otra IgG, lo que sugiere que las otras IgG reconocen un epítopo diferente de la región de unión de CR5111. Cinco IgG, CR6262, CR6272, CR6307, CR6339 y CR6343 competían en un grado inferior por la unión que el resto de las IgG (más del 25% de unión residual). Para las IgG

25 CR6262, CR6272, CR6339 y CR6343, esto puede explicarse por una afinidad inferior por HA. Esto se apoya mediante la observación de que los anticuerpos de fago que corresponden a estos anticuerpos se eliminaron por competición de manera más eficaz por las otras IgG. Se bloquea la unión de anticuerpo de fago SC06-307 mediante IgG CR6307, pero menos eficazmente por las otras IgG. Esto sugiere que SC06-307 y CR6307 reconocen un único epítopo que difiere del epítopo reconocido por las otras IgG.

30 Ejemplo 10

ELISA de reactividad cruzada usando IgG anti-H5N1

35 Para someter a prueba si el epítopo de los anticuerpos anti-H5N1 se conserva entre HA distintas del subtipo H5, se realizó un ELISA de reactividad cruzada de hemaglutinina. Se recubrieron placas Nunc-Immuno™ Maxisorp F96 (Nunc) durante la noche a 4ºC con HA recombinante 0,5 μg/ml, subtipo H1 (A/New Caledonia/20/99 (H1N1)), subtipo H3 (A/Wyoming/3/03 (H3N2)), subtipo H5 (A/Vietnam/1203/04 (H5N1)), subtipo H7 (A/Netherlands/219/03 (H7N7)) y subtipo H9 (A/Hong Kong/1073/99 (H9N2)) (Protein Sciences Corp.) en PBS. Adicionalmente, se recubrieron las

40 placas con preparaciones de virus inactivado con BPL que contenían 0,5 μg/ml de HA de A/New Caledonia/20/99 (H1N1) y cepa reordenante NIBRG-14 (A/Vietnam/1194/04 (H5N1)) durante la noche en PBS. Se lavaron los pocillos tres veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,1% v/v para eliminar la proteína no recubierta y posteriormente se bloquearon con 300 μl de PBS que contenía leche en polvo desnatada al 2% p/v (disolución de bloqueo) durante 1 h a temperatura ambiente. Se desechó la disolución de bloqueo y se incubaron 100 μl por pocillo de anticuerpos anti

45 H5N1 5 μg/ml en disolución de bloqueo durante 1 h a temperatura ambiente. Se lavaron los pocillos tres veces con PBS que contenía Tween-20 al 0,1% v/v y se detectaron anticuerpos unidos usando un anticuerpo anti-IgG humana de ratón conjugado con peroxidasa (Jackson). Se reveló la reacción y se midió tal como se describió anteriormente. La tabla 12 muestra que todas las IgG anti-H5N1 se unían a HA recombinante, subtipo H5 (A/Vietnam/) 203/2004 (H5N1)) y una preparación de virus inactivado con BPL de NIBRG-14, que contiene la HA de la cepa

50 A/Vietnam/1194/2004 (H5N1). No se reconocieron HA recombinantes de subtipo H3 y H7 mediante ninguna de las IgG anti-H5N1 sometidas a prueba. De manera interesante, todas las IgG anti-H5N1, con la excepción de CR5111 y CR6307, se unían a HA recombinante de subtipos H1 y H9, y una preparación de virus inactivado con BPL de la cepa A/New Caledonia/20/99 (H1N1). Esto indica que el epítopo de la mayoría de las IgG anti-H5N1 se conserva entre moléculas de HA de diferentes subtipos.

55 Ejemplo 11

Mapeo de epítopos de IgG anti-H5N1

60 Okuno et al. (1993) y Smirnov et al. (1999) demostraron la existencia de un epítopo común compartido por las HA de los subtipos H1, H2 y H5 del virus influenza A y la neutralización de estos subtipos mediante el anticuerpo monoclonal murino C179 dirigido contra este epítopo. Este epítopo conformacional está compuesto por dos sitios diferentes que están ubicados en la subunidad HA1 y HA2. Ambos sitios se encuentran en proximidad estrecha en el medio de la región de tallo de la molécula de HA. Con el fin de evaluar si los anticuerpos anti-HA descritos

65 anteriormente reconocían este epítopo, se prepararon moléculas de HA que contienen sustituciones de aminoácidos

en esta región.

El epítopo reconocido por el anticuerpo C179 (Takara Bio Inc.) se ha atribuido a regiones que abarcan los residuos 318-322 de la subunidad HA1 y los residuos 47-58 de la subunidad HA2 (numeración de aminoácidos tal como se 5 describe por Okuno et al.1999). Los virus de escape que contienen HA que portan una sustitución de Thr por Lys en la posición 318 en la subunidad HA1 o una sustitución de Val por Glu en la posición 52 en la subunidad HA2 no se reconocieron más y se neutralizaron por C179. Se introdujeron estas mutaciones (posición 318 de Thr por Lys, mutante I; posición 52 de Val por Glu, mutante II), una sustitución de Leu por Met en la posición 320 en la subunidad HA1 (mutante III, Met320 está presente en la región 318-322 de HA 1 de subtipo H3 y H7), una sustitución de Ser por Arg en la posición 54 en la subunidad HA2 (mutante IV, Arg54 está presente en la región 47-58 de HA2 de subtipo H3 y H7) y una sustitución de Asp por Asn en la posición 57 en la subunidad HA2 (mutante V, Asn57 está presente en la región 47-58 de HA2 de la cepa A/Hong Kong/156/97 (H5N1)) en HA de longitud completa a partir de A/Vietnam/1194/2004 (H5N1TV) aislado y se transfectaron en células PER.C6. Se evaluó la unión de C179 y los anticuerpos anti-HA humanos a células PER.C6 que expresan estos mutantes mediante análisis de FACS tal como 15 se describió anteriormente. El anticuerpo CR5111, que se dirige contra un epítopo en la subunidad HA1, y un suero de oveja policlonal anti-H5 confirmaron la expresión de H5N1TV y mutantes de HA mediante células PER.C6 transfectadas (datos no mostrados). No se observó tinción con el anticuerpo de control negativo CR3014 o en ausencia de anticuerpo (datos no mostrados). Como se esperaba, el anticuerpo C179 no reconoció los mutantes I y II, que portaban las mismas sustituciones de aminoácidos que las HA en los virus de escape C179 (véase Okuno et al., 1993). Además, C179 no se unió al mutante IV, mientras que la unión de C179 a los mutantes III y V no se veía afectada. Se observó un patrón de reactividad similar para el anticuerpo CR6342, lo que sugiere que el anticuerpo C179 y CR6342 reconocen un epítopo similar. Los anticuerpos CR6261, CR6325 y CR6329 reconocieron todos los mutantes, con la excepción del mutante II. Esto sugiere que el epítopo de los anticuerpos CR6261, CR6325 y CR6329 es diferente del de C179. Puesto que las sustituciones en la subunidad HA1 no suprimieron la unión de

25 estos anticuerpos, su epítopo está ubicado lo más probablemente en la subunidad HA2. Los anticuerpos CR6307 y CR6323 reconocieron todos los mutantes, lo que sugiere que el epítopo de estos anticuerpos también es diferente del de C179. Se facilita un resumen de la secuencia de los mutantes y la unión de los anticuerpos en la tabla 13. En conclusión, los resultados indican que los anticuerpos CR6261, CR6325, CR6329, CR6307 y CR6323 son candidatos ideales para unirse a y neutralizar virus influenza que tienen mutaciones en el epítopo reconocido por el anticuerpo monoclonal murino C179 y como consecuencia de esto no se neutralizan más por este anticuerpo.

Ejemplo 12

Actividad profiláctica de anticuerpos monoclonales de IgG humanos contra la exposición a H5N1 letal in vivo

35 Se administró una dosis letal de la cepa H5N1 de influenza A/HongKong/156/97 a ratones con el fin de estudiar el efecto profiláctico de los anticuerpos de IgG monoclonales humanos CR6261, CR6323 y CR6325. Un día antes de la infección, se les inyectaron a 8 grupos de 10 ratones cada uno por vía intraperitoneal diferentes dosis de anticuerpo. Como control negativo, a un grupo de ratones se les inyectó un anticuerpo de control no relevante (CR3014). Se monitorizaron los signos clínicos, la pérdida de peso y la mortalidad hasta 21 días tras la infección. Se realizó este estudio para evaluar el efecto profiláctico de los anticuerpos de IgG anti-H5N1 humanos monoclonales in vivo.

Se obtuvo originalmente la cepa H5N1 de un niño de 3 años de edad que padecía enfermedad respiratoria. Se pasó el virus dos veces en células MDCK. El lote [título 8,1 log TCID50/ml] usado para infectar ratones se propagó una vez

45 en huevos embrionados.

Se dividieron 80 ratones Balb/c de 7 semanas de edad hembra en los 8 grupos de 10 ratones cada uno con las siguientes inyecciones antes de la exposición con el virus H5N1:

1.: CR6261 15 mg/kg.

2.: CR6261 5 mg/kg.

3. CR6261 2 mg/kg. 55

4.: CR6261 0,7 mg/kg.

5.: CR6323 15 mg/kg.

6.: CR6325 15 mg/kg

7.: 500 μl de suero inmunitario anti-H5N3 de conejo (diluido 100x).

8.: CR3014 15 mg/kg.

65 Se aclimataron todos los animales y se mantuvieron durante un periodo de 6 días antes del comienzo del estudio.

Un día antes de la infección con el virus H5N1, se administraron 500 μl de anticuerpo mediante inyección intraperitoneal. Se les inoculó a los animales por vía intranasal en el día 0 25 DL50 de virus (aproximadamente 50 μl), y se siguieron durante 21 días. Se estimó la dosis real del virus administrada titulando unas cuantas muestras duplicadas a partir del inóculo que quedaba tras completarse la inoculación de los animales. Se determinaron los

5 títulos de virus (TCID50/ml) del inóculo en células MDCK. Los resultados mostraron que no se había producido involuntariamente inactivación del virus durante la preparación o administración del inóculo. El grupo 8 actuó como control negativo. Se les inyectó a los animales en este grupo un anticuerpo monoclonal irrelevante (CR3014) en el día 0. Se supuso que el grupo 7 actuaba como control positivo. Se les inyectó a los ratones en este grupo anticuerpo de suero policlonal de conejo generado contra virus influenza H5N3.

Se evaluaron diariamente los pesos y signos clínicos desde el día -1 hasta 21 días tras la inoculación del virus. Se puntuaron los signos clínicos con un sistema de puntuación (0 = sin signos clínicos; 1 = pelaje rugoso; 2 = pelaje rugoso, menos reactivo, pasivo durante la manipulación; 3 = pelaje rugoso, enrollado, respiración laboriosa, pasivo durante la manipulación; 4 = pelaje rugoso, enrollado, respiración laboriosa, no se da la vuelta sobre su estómago

15 cuando yace sobre su espalda) y se registraron. Se sacrificaron los animales supervivientes y se les extrajo sangre en el día 21. Para el análisis de los niveles de anticuerpos de IgG séricos, se recogieron muestras de sangre de cada ratón en el día 0. Se prepararon sueros según el procedimiento convencional. Para generar sueros tras la infección, se recogió sangre de los animales supervivientes en el día 21. Se almacenaron los sueros a -20ºC ± 2ºC hasta que se sometieron a ensayo para determinar la presencia de anticuerpos específicos de virus. Se sometieron a prueba los sueros por duplicado usando 4 HAU del sustrato H5N1 HK/97. Se expresaron los títulos como la inversa de la dilución de suero más alta que mostraba H1, comenzando con una dilución de 1/10.

Todos los ratones estaban activos y parecían sanos sin mostrar signos de enfermedad durante el periodo de aclimatación. Se calculó la puntuación clínica promedio (puntuación clínica total dividida entre el número de animales 25 supervivientes en cada grupo) al día y los resultados se indican en la figura 2 (puntuación clínica promedio por grupo), la tabla 14 (puntuaciones clínicas) y la tabla 15 (dificultad respiratoria). Se observó aparición de signos clínicos negativos en el día 3 tras la infección en el grupo al que se le inoculó el Ac de control negativo CR3014 (grupo 8). Se registró por primera vez dificultad respiratoria en el día 6, y duró de 1 a 4 días. No se observaron signos clínicos en ratones que se trataron con 15 mg/kg de CR6325 (grupo 6). En el grupo 5 (CR6323), un ratón mostró signos clínicos leves (puntuación 1) desde el día 5 hasta el 8 y murió al día siguiente. En el grupo 1, un ratón murió el día 13 sin haber mostrado ningún signo clínico previo. Dosis de Ac superiores de CR6261 se correlacionaban con aparición posterior y puntuaciones clínicas inferiores en promedio. Se notó dificultad respiratoria en el grupo con la dosis más baja (0,7 mg/kg), pero no en los grupos con dosis superiores (2, 5 y 15 mg/kg). Todos los ratones mostraron mejora en su estado clínico entre el día 9 y 13 (grupo 2, 3 y 5) o desde el día 17 en adelante

35 (grupo 4). Los ratones a los que se les inyectó el anticuerpo policlonal de conejo (grupo 7) desarrollaron enfermedad grave en el plazo de 3 días y luego murieron, lo que demuestra que el anticuerpo de conejo no protegió contra la infección in vivo. Se sacrificaron dos animales (uno en el grupo 4 y uno en el grupo 8) en el día 10 y se retiraron del estudio, porque se consideró que los animales estaban gravemente enfermos (puntuación 4).

Los animales infectados con H5N1 mostraron grados variables de pérdida de peso (figura 3). La pérdida de peso proporcional y el momento de aparición estaban relacionados con la dosis de anticuerpo. En los grupos tratados con las dosis más altas de anticuerpos, el peso aumentó regularmente a lo largo del tiempo de manera consecuente con una ganancia de peso relacionada con la edad. El grupo de animales a los que se les inoculó la dosis más baja de CR6261 perdieron peso más rápidamente que los grupos de animales que recibieron dosis superiores de anticuerpo.

45 La cantidad total de pérdida de peso era mayor en los grupos con dosis inferiores, con una pérdida de peso promedio de aproximadamente el 15 y el 40% del peso de partida en los grupos inoculados con CR6261 2 y 0,7 mg/kg, respectivamente. En los grupos con dosis inferiores, el peso corporal promedio parecía aumentar de nuevo al mismo tiempo que los animales mostraban algo de mejoría clínica.

La figura 4 muestra el número de ratones que sobrevivían por grupo en cada día. Estaba presente una clara relación de dosis-respuesta entre la cantidad de anticuerpo administrada y el tiempo de supervivencia promedio. La figura 5 muestra la mortalidad de una manera sensible a la dosis. Los primeros ratones murieron 7 días tras la inoculación en el grupo con la dosis más baja (0,7 mg/kg) y en el grupo de ratones que recibieron el control negativo: CR3014. Menos del 50% de los animales estaban protegidos contra la muerte cuando se les administraron 0,7 mg/kg de

55 anticuerpo CR6261. Sin embargo, de 9 a 10 ratones sobrevivieron cuando se les administró la dosis más alta de anticuerpo. Ningún ratón del grupo de control negativo (CR3014) sobrevivió, mostrando que de hecho se usó una exposición letal al 100% en este estudio.

Para evaluar si los anticuerpos de IgG podían producir una protección completa contra la infección, se realiza un ensayo de HI con sueros recogidos en el día 21 de ratones que habían recibido 15 mg/kg de CR6261 (grupo 1). Estos datos deben indicar que los ratones experimentaron una infección por H5N1 aunque sin manifestación clínica.

Estos resultados muestran que al menos tres anticuerpos anti-H5N1 humanos, identificados y desarrollados tal como se da a conocer en el presente documento (CR6261, CR6323 y CR6325) pueden proporcionar cada uno por 65 separado protección contra una dosis letal de influenza H5N1 in vivo. Se observó una clara relación de dosisrespuesta entre la cantidad de anticuerpo CR6261 administrada y el tiempo de supervivencia promedio. Los

resultados muestran que cada anticuerpo de IgG anti-H5N1 monoclonal sometido a prueba podía prevenir la manifestación clínica de la infección por H5N1 en ratones cuando se administró un día antes de la infección a una dosis de 15 mg/kg.

5 Ejemplo 13

Efectos protectores y terapéuticos de anticuerpos anti-H5N1 monoclonales humanos administrados tras una infección con una dosis letal de virus influenza H5N1 in vivo

Se realizó un estudio para someter a prueba el efecto terapéutico de los anticuerpos monoclonales dados a conocer en el presente documento, mostrados a modo de ejemplo mediante CR6261, en un modelo post-infección, contra una exposición a virus influenza H5N1 A/HK/97 letal in vivo. El lote y el tipo de virus, y la edad de los ratones eran los mismos que se usaron en el ejemplo 12. Como control negativo, se le inyectó a un grupo de ratones un anticuerpo de control no relevante (CR2006). Se monitorizaron los signos clínicos, la pérdida de peso y la mortalidad

15 hasta 21 días tras la infección.

Se dividieron 58 ratones Balb/c ratones de 7 semanas de edad hembra en 5 grupos que recibieron el anticuerpo a diferentes estadios tras la infección, tal como sigue:

1.: 10 ratones; CR6261 15 mg/kg a las 4 h tras la infección

2.: 14 ratones; CR6261 15 mg/kg 1 día tras la infección

3. 10 ratones; CR6261 15 mg/kg 2 días tras la infección 25

4.: 10 ratones; CR6261 15 mg/kg 3 días tras la infección

5.: 14 ratones; CR2006 15 mg/kg 1 día tras la infección

Se aclimataron todos los animales y se mantuvieron durante un periodo de 6 días antes del inicio del estudio. Se les inoculó a los animales por vía intranasal en el día 0 25 DL50 de virus influenza H5N1 (aproximadamente 50 μl), y se monitorizaron durante 21 días. Se estimó la dosis real de los virus administrados titulando unas cuantas muestras duplicadas del inóculo que quedaba tras completarse la inoculación de los animales. Se determinaron los títulos del virus (TCID50/ml) del inóculo en células MDCK. Los resultados mostraron que no se había producido

35 involuntariamente inactivación del virus durante la preparación o administración del inóculo. A los puntos de tiempo especificados tras la inoculación, se administraron 500 μl de anticuerpo mediante inyección intraperitoneal. El grupo 5 actuó como control negativo. A los animales en este grupo se les inyectó un anticuerpo monoclonal irrelevante (CR2006) el día 1 tras la infección.

Se evaluaron los signos clínicos y los pesos cada día desde el día -1 hasta el día 21. Se puntuaron los signos clínicos tal como se describe en el ejemplo 12, con un intervalo de puntuación de desde 0 hasta 4. Se sacrificaron los animales supervivientes y se les extrajo sangre en el día 21. Para la evaluación de los cambios patológicos, se sacrificaron 4 animales del grupo 2 y 5 en el día 6 tras la exposición. Estos animales se preseleccionaron ya en el día 0, y se mantuvieron aparte de los otros. Por este motivo, los grupos 2 y 5 comenzaron con 14 animales,

45 quedando 10 ratones tras la selección. Se evaluaron los signos clínicos y los pesos diariamente desde el día -1 hasta 21 días tras la inoculación del virus.

Todos los ratones eran activos y parecían sanos sin mostrar signos de enfermedad durante el periodo de aclimatación. Se calculó la puntuación clínica promedio (puntuación clínica total dividida entre el número de animales supervivientes en cada grupo) al día y los resultados se indican en la figura 6 (puntuación clínica promedio por grupo), la tabla 16 (puntuaciones clínicas) y la tabla 17 (dificultad respiratoria). Claramente, todos los grupos contenían ratones que mostraban signos clínicos ya en el día 1 tras la infección. Dependiendo del momento en el que se administró el anticuerpo, los signos clínicos disminuyeron y en todos los grupos los signos clínicos estaban ausentes de nuevo en el día 15. En el grupo de control 5, todos los animales padecían signos clínicos graves y todos 55 los animales habían muerto, o se sacrificaron debido a que alcanzaron el nivel 4 en las puntuaciones clínicas, en el día 9. Esto muestra que de nuevo se administró una dosis letal de virus influenza a los animales. En el grupo 1, en el que los animales ya recibieron el anticuerpo 4 h tras la infección, algunos animales no desarrollaron signos clínicos, mientras que otros sí. El número de animales que presentaba signos clínicos que podían puntuarse se proporciona en la tabla 16. Puesto que el virus influenza puede tener un efecto dramático sobre los órganos respiratorios, también puede medirse la dificultad respiratoria y en el presente documento se proporciona en la tabla 17. La figura 7 y la tabla 18 muestran el número de animales supervivientes y la tasa de mortalidad respectivamente para todos los grupos. Por motivos desconocidos, un animal en el grupo 1 que recibió el anticuerpo 4 h tras la infección murió en el día 10. Todos los animales restantes en los grupos que recibieron el anticuerpo tras la infección por influenza sobrevivieron y estaban sanos en el día 21. Esto se muestra claramente en los datos de peso corporal que se 65 obtuvieron de todos los ratones. La figura 8 muestra el peso corporal medio en cada grupo de ratones durante los 21 días del estudio. Aunque el peso corporal de todos los ratones disminuyó tras la infección, el peso corporal volvió a

los niveles normales tras la administración del anticuerpo. Claramente, la vuelta a niveles de peso corporal normales dependió del momento del tratamiento con anticuerpo, en el que los animales que se trataron 4 h tras la exposición se recuperaron rápidamente y alcanzaron niveles normales en el día 7, los animales que se trataron 3 días tras la infección alcanzaron su peso corporal normal en el día 17. Todos los animales alcanzaron un peso corporal similar y

5 sano al final del estudio, en el día 21. Claramente, todos los animales que recibieron el anticuerpo de control negativo no recuperaron peso corporal y las mediciones se detuvieron en el día 9.

Estos resultados muestran que un tratamiento tras la infección con un anticuerpo monoclonal dirigido contra virus influenza H5N1, tal como se da a conocer en el presente documento y se muestra a modo de ejemplo mediante el

10 anticuerpo CR6261, puede rescatar a sujetos mamíferos, tal como se muestra en el presente documento en ratones, tras la exposición con una dosis letal de virus influenza H5N1. Incluso en un estadio tardío, 3 días tras la infección, el anticuerpo puede revertir los síntomas clínicos hasta un nivel en el que ya no pudieron monitorizarse signos clínicos. Sorprendentemente, en el día 21 tras la infección, todos los animales tratados con anticuerpo alcanzaron niveles de peso corporal normales y no mostraban ningún signo clínico restante.

15 Ejemplo 14

Protección cruzada in vivo contra la exposición letal a subtipos de influenza heterólogos usando anticuerpos monoclonales dirigidos contra HA de H5N1.

20 Tal como se dio a conocer anteriormente (ejemplo 11), algunos de los anticuerpos de la presente invención reconocen aparentemente un único epítopo en el dominio HA2 de la proteína hemaglutinina H5. En el ejemplo 7, se mostró que determinadas moléculas de unión de la presente invención podían interaccionar con el epítopo HA2 de una manera no conformacional, en otras palabras, la forma en la que la proteína hemaglutinina se pliega no parece

25 dificultar la actividad neutralizante y los efectos protectores de estos anticuerpos tal como se dan a conocer en el presente documento.

Las secuencias de las partes de la proteína hemaglutinina de influenza que no son propensas a la deriva antigénica (= el cambio de las regiones inmunodominantes dentro de la región HA1 de la proteína, que da como resultado la 30 necesidad de actualizar anualmente las vacunas de la gripe) se conocen en la técnica. El epítopo en HA2 que se reconoce por CR6261, CR6325 y CR6329 está contenido en la secuencia de aminoácidos GVTNKVNSIIDK (SEQ ID NO:368, véase la tabla 13) y también está presente en las proteínas hemaglutinina de los subtipos H1 y H9, véase la tabla 22. Se mostró en el ejemplo 10 que la interacción de las moléculas de unión de la presente invención al epítopo no se limitaba a HA de H5, sino que también se reconocían HA de H1 y H9 (véase la tabla 12). Por tanto, las

35 moléculas de unión de la presente invención reconocen un epítopo que está presente en múltiples proteínas HA de diferentes serotipos de influenza.

Para estudiar la aplicabilidad cruzada de estos anticuerpos para terapia in vivo, se realizó un experimento en ratones que estaba en línea con el programa de dosificación del experimento descrito en el ejemplo 13. En el presente 40 experimento, se administró en ratones una dosis letal, muy alta de otro virus influenza relacionado con el brote pandémico de 1918 y ahora circulante estacionalmente en seres humanos, concretamente H1N1. Posteriormente, se trataron los ratones con un anticuerpo de la presente invención, mostrado a modo de ejemplo mediante CR6261, y se monitorizaron los signos clínicos, la dificultad respiratoria y el peso corporal durante 3 semanas tras la infección. Resultó que estas moléculas de unión que podían rescatar a ratones cuando se infectaron con H5N1, también

45 podían rescatar a sujetos mamíferos cuando se infectaron con H1N1, tal como se resume a continuación.

Se realizó un estudio para someter a prueba el efecto terapéutico de los anticuerpos monoclonales, mostrados a modo de ejemplo mediante CR6261, en un modelo post-infección contra una exposición a virus influenza H1N1 A/WSN/33 letal in vivo. El lote del virus se obtuvo de la ATCC (VR-219) y se propagó una vez en huevos

50 embrionados. El título era de 8,5 log TCID50/ml. Como control negativo, se le inyectó a un grupo de ratones un anticuerpo monoclonal irrelevante (IgG1, λ denominado “CR57”, anticuerpo de control negativo de isotipo coincidente). Se monitorizaron los signos clínicos, el peso corporal y la mortalidad hasta 21 días tras la infección.

Se dividieron 50 ratones Balb/c de 6 a 8 semanas de edad hembra en 5 grupos que recibieron el anticuerpo a 55 diferentes estadios relacionados con la infección, tal como sigue:

1. 10 ratones; CR6261 15 mg/kg 1 día antes de la infección

2. 10 ratones; CR6261 15 mg/kg 1 día tras la infección 60

3.: 10 ratones; CR6261 15 mg/kg 2 días tras la infección

4.: 10 ratones; CR6261 15 mg/kg 3 días tras la infección

65 5. 10 ratones; control negativo CR57 15 mg/kg 1 día tras la infección Se aclimataron todos los animales y se mantuvieron durante un periodo de al menos 4 días antes del inicio del estudio. Se inoculó a los animales por vía intranasal en el día 0 una dosis letal de virus H1N1 (6,6 log TCID50; equivalente a 25x la DL50) en aproximadamente 50 μl, y se monitorizaron. A los puntos de tiempo especificados antes/después de la inoculación, se administraron 500 μl de anticuerpo mediante inyección intraperitoneal. Se

5 monitorizó la salud general de los ratones a lo largo de todo el estudio. Se evaluaron los signos clínicos y los pesos cada día desde el día -1 hasta el día 21. Se puntuaron los signos clínicos con las tasas de puntuación tal como se da a conocer en el ejemplo 12 y 13, oscilando entre 0 y 4. Se sacrificaron los animales supervivientes y se les extrajo sangre en el día 21.

10 Se proporciona la tasa de mortalidad para cada grupo en la tabla 19, que muestra el número de ratones vivos en cada grupo de estudio a lo largo de todo el estudio. Dos ratones murieron poco después del acontecimiento de inoculación (en el día 1, uno en el grupo 2 y uno en el grupo 3) y se excluyeron del análisis tal como se definió previamente en el plan de estudio. Todos los ratones en el grupo de control 5 estaban muertos en el día 9 como en el estudio previo con H5N1 (véase la tabla 18). El porcentaje de animales que sobrevivía a esta dosis de exposición

15 letal de H1N1 también se representa gráficamente en la figura 9. El número de ratones que muestran signos clínicos relevantes en cada grupo se proporciona en la tabla 20. No se observaron signos clínicos en el grupo 1, mientras que en el grupo 2, 3 y 4, algunos ratones presentaban signos clínicos que desparecieron completamente después del día 14 tras la inoculación. Todos los animales en el grupo 5 comenzaron mostrando signos clínicos en el día 2. Ningún ratón en este grupo se recuperó. El número de ratones que mostraban dificultad respiratoria en la categoría

20 2 ó 3 se facilita en la tabla 21. Ya no se observó dificultad clínica después del día 13 en los grupos 1-4, mientras que todos los ratones restantes en el grupo de control 5 padecían dificultad respiratoria grave.

La figura 10 muestra el peso corporal promedio de los ratones en cada grupo de estudio. Claramente, no se proporcionan mediciones para los ratones en el grupo 5 después del día 8. Tal como puede observarse a partir de

25 esta figura, todos los ratones que recibieron el anticuerpo anti-H5N1 y que se recuperaron de los signos clínicos alcanzaron su nivel de peso corporal esperado en el día 21.

Los anticuerpos podían proteger a estos ratones cuando se administraban antes de la infección o después de la infección. De manera notable, la dosis de infección era bastante alta: 25x la dosis DL50, lo que indica que los 30 anticuerpos proporcionaban una protección muy fuerte contra el virus incluso cuando estaba presente a altos títulos en el pulmón. Esto es clínicamente relevante ya que virus altamente patógenos como H5N1 se replican a un alto título tras la infección y estas cargas virales altas se han vinculado al desenlace frecuentemente grave en seres humanos infectados. Además, todos los ratones protegidos se recuperaron completamente de esta infección letal a lo largo del tiempo. Se concluyó que los anticuerpos anti-H5N1 de la presente invención (tales como CR6261, 35 CR6325 y CR6329) que se unen a epítopos (únicos) en la región HA2, una región que no es propensa a deriva antigénica, proporcionan protección cruzada in vivo contra múltiples serotipos de influenza, evitando la necesidad de anticuerpos contra la región HA1 altamente sensible a mutaciones. Debe entenderse que las moléculas de unión de la presente invención que no están limitadas por epítopos que están sólo presentes en HA de un serotipo de influenza H5, también pueden usarse en el tratamiento profiláctico o terapéutico de todos los serotipos de influenza

40 que contienen el mismo epítopo en la región estable de HA2, tal como H1N1, y virus influenza que comprenden las proteínas hemaglutinina H2, H6 y H9.

Ejemplo 15

45 Estudios de afinidad

Se realizaron estudios de afinidad usando análisis de resonancia de plasmón superficial con un sistema analítico BIAcore3000 a 25ºC y 37ºC, usando HBS-EP (Biacore AB, Suecia) como tampón de ejecución a una velocidad de flujo de 75 μl/min. Se inmovilizaron IgG sobre un chip detector de 4 canales de flujo (Fc) CM5 de calidad de

50 investigación (Biacore AB, Suecia) usando acoplamiento de amina. Se inyectó una cantidad variable de HA de un virus H5N1 (A/Vietnam/1203/2004) para analizar la interacción de unión entre la proteína HA y las IgG inmovilizadas. Se realizó la regeneración usando NaOH 20 mM al final de cada medición para eliminar la HA unida, mientras se dejaba la IgG inmovilizada sobre el chip.

55 Se determinaron las constantes de afinidad para los anticuerpos CR6261, CR6323 y CR6325. Se inyectaron cinco concentraciones en diluciones de 4 veces de HA (100 μl por inyección), seguido por una fase de disociación de 3600 s, y regeneración usando 10 μl de NaOH 20 mM. Se ajustaron los datos resultantes usando un modelo 1:1 (Langmuir). Sin embargo, no pudo calcularse una constante de disociación (KD) exacta. Esto se debió a tasas de disociación extremadamente bajas a 25ºC (incluso con una medición prolongada) que conducían a un error

60 inaceptable en el cálculo. Cuando se repitieron los experimentos a 37ºC, se produjo una disociación apreciable pero todavía no suficiente para medir de manera exacta la KD. Se realizaron experimentos para establecer una KD definitiva para los anticuerpos. Se estima que éstos están al menos en el intervalo de nM de un único dígito y lo más probablemente en el intervalo de pM de afinidad. Estos experimentos muestran que las moléculas de unión de la presente invención tienen una afinidad muy alta por su epítopo presente en la proteína HA del virus influenza.

65 A continuación, se proporcionan los detalles de las secuencias de ácido nucleico y aminoácidos denominadas en el presente documento SEQ ID NO:58-143, SEQ ID NO:212-237 y SEQ ID NO:316-367.

Tabla 1: Amplificaciones de Vkappa, Vlambda y VH de primera ronda

Nombre del cebador: Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO:

OK1 (HuVK1B): GAC ATC CAG WTG ACC CAG TCT CC 144

OK2 (HuVK2): GAT GTT GTG ATG ACT CAG TCT CC 145

OK3 (HuVK2B2): GAT ATT GTG ATG ACC CAG ACT CC 146

OK4 (HuVK3B): GAA ATT GTG WTG ACR CAG TCT CC 147

OK5 (HuVK5): GAA ACG ACA CTC ACG CAG TCT CC 148

OK6 (HuVK6): GAA ATT GTG CTG ACT CAG TCT CC 149

OCK (HuCK): ACA CTC TCC CCT GTT GAA GCT CTT 150

OL1 (HuVLIA) *: CAG TCT GTG CTG ACT CAG CCA CC 151

OL1 (HuVL1B) *: CAG TCT GTG YTG ACG CAG CCG CC 152

OL1 (HuVL1C) *: CAG TCT GTC GTG ACG CAG CCG CC 153

OL2 (HuVL2B): CAG TCT GCC CTG ACT CAG CC 154

OL3 (HuVL3A): TCC TAT GWG CTG ACT CAG CCA CC 155

OL4 (HuVL3B): TCT TCT GAG CTG ACT CAG GAC CC 156

OL5 (HuVL4B): CAG CYT GTG CTG ACT CAA TC 157

OL6 (HuVL5): CAG GCT GTG CTG ACT CAG CCG TC 158

OL7 (HuVL6): AAT TTT ATG CTG ACT CAG CCC CA 159

OL8 (HuVL7/8): CAG RCT GTG GTG ACY CAG GAG CC 160

OL9 (HuVL9) #: CWG CCT GTG CTG ACT CAG CCM CC 161

OL9 (HuVL10) #: CAG GCA GGG CTG ACT CAG 162

OCL (HuCL2)X: TGA ACA TTC TGT AGG GGC CAC TG 163

OCL (HuCL7)X: AGA GCA TTC TGC AGG GGC CAC TG 164

OH1 (HuVH1B7A) +: CAG RTG CAG CTG GTG CAR TCT GG 165

OH1 (HuVH1C) +: SAG GTC CAG CTG GTR CAG TCT GG 166

OH2 (HuVH2B): CAG RTC ACC TTG AAG GAG TCT GG 167

OH3 (HuVH3A): GAG GTG CAG CTG GTG GAG 168

OH4 (HuVH3C): GAG GTG CAG CTG GTG GAG WCY GG 169

OH5 (HuVH4B): CAG GTG CAG CTA CAG CAG TGG GG 170

OH6 (HuVH4C): CAG STG CAG CTG CAG GAG TCS GG 171

OH7 (HuVH6A): CAG GTA CAG CTG CAG CAG TCA GG 172

OCM (HuCIgM): TGG AAG AGG CAC GTT CTT TTC TTT 173

* Mezcla en razón 1:1:1 # Mezcla en razón 1:1 X Mezcla en razón 1:1

+ Mezcla en razón 1:1

Tabla 2: Amplificaciones de Vkappa, Vlambda y VH de segunda ronda

Nombre del cebador: Secuencia de nucleótidos del cebador SEQ ID NO

OK1S (HuVK1B-SAL): 174

OK2S (HuVK2-SAL): 175

OK3S (HuVK2B2-SAL): 176

OK4S (HuVK3B-SAL): 177

OK5S (HuVK5-SAL): 178

OK6S (HuVK6-SAL): 179

OJK1 (HuJK1-NOT): 180

OJK2 (HuJK2-NOT): 181

OJK3 (HuJK3-NOT): 182

OJK4 (HuJK4-NOT): 183

OJK5 (HuJK5-NOT): 184

OL1S (HuVL1A-SAL) *: 185

OL1S (HuVL1B-SAL) *: 186

OL1S (HuVL1C-SAL) *: 187

OL2S (HuVL2B-SAL): 188

OL3S (HuVL3A-SAL): 189

OL4S (HuVL3B-SAL): 190

OL5S (HuVL4B-SAL): 191

OL6S (HuVL5-SAL): 192

OL7S (HuVL6-SAL): 193

OL8S (HuVL7/8-SAL): 194

OL9S (HuVL9-SAL) #: 195

OL9S (HuVL10-SAL) #: 196

OJL1 (HuJL1-NOT): 197

OJL2 (HuJL2/3-NOT): 198

OJL3 (HuJL7-NOT): 199

OH1S (HuVH1B-SFI) +: 200

OH1S (HuVH1C-SFI) +: 201

OH2S (HuVH2B-SFI): 202

OH3S (HuVH3A-SFI): 203

OH4S (HuVH3C-SFI): 204

OH5S (HuVH4B-SFI): 205

OH6S (HuVH4C-SFI): 206

OH7S (HuVH6A-SFI): 207

OJH1 (HuJH1/2-XHO): 208

OJH2 (HuJH3-XHO): 209

OJH3 (HuJH4/5-XHO): 210

OJH4 (HuJH6-XHO): 211

* Mezcla en razón 1:1:1 # Mezcla en razón 1:1

+ Mezcla en razón 1:1

Tabla 3. Visión general de la amplificación de regiones VL de segunda ronda

Molde: Cebador 5’ Cebador 3’ Producto Compartido en PK/PL(-) Combinación Compartido en Vl (-)

K1: OK1S OJK1 K1J1 25 PK1 30

OK1S: OJK2 K1J2 25

OK1S: OJK3 K1J3 10

OK1S: OJK4 K1J4 25

OK1S: OJK5 K1J5 15

K2: OK2S OJK1 K2J1 25 PK2 4

OK2S: OJK2 K2J2 25

OK2S: OJK3 K2J3 10

OK2S: OJK4 K2J4 25

OK2S: OJK5 K2J5 15

K3: OK3S OJK1 K3J1 25 PK3 1

OK3S: OJK2 K3J2 25

OK3S: OJK3 K3J3 10

OK3S: OJK4 K3J4 25

OK3S: OJK5 K3J5 15

K4: OK4S OJK1 K4J1 25 PK4 19

OK4S: OJK2 K4J2 25

OK4S: OJK3 K4J3 10

OK4S: OJK4 K4J4 25

OK4S: OJK5 K4J5 15

K5: OK5S OJK1 K5J1 25 PK5 1

OK5S: OJK2 K5J2 25

OK5S: OJK3 K5J3 10

OK5S: OJK4 K5J4 25

OK5S: OJK5 K5J5 15

K6: OK6S OJK1 K6J1 25 PK6 5

OK6S: OJK2 K6J2 25

OK6S: OJK3 K6J3 10

OK6S: OJK4 K6J4 25

OK6S: OJK5 K6J5 15

L1: OL1S OJL1 L1J1 30 PL1 14

OL1S: OJL2 L1J2 60

OL1S: OJL3 L1J3 10

L2: OL2S OJL1 L2J1 30 PL2 10

OL2S: OJL2 L2J2 60

OL2S: OJL3 L2J3 10

L3: OL3S OJL1 L3J1 30 PL3 10

OL3S: OJL2 L3J2 60

OL3S: OJL3 L3J3 10

L4: OL4S OJL1 L4J1 30 PL4 1

OL4S: OJL2 L4J2 60

OL4S: OJL3 L4J3 10

L5: OL5S OJL1 L5J1 30 PL5 1

OL5S: OJL2 L5J2 60

OL5S: OJL3 L5J3 10

L6: OL6S OJL1 L6J1 30 PL6 1

OL6S: OJL2 L6J2 60

OL6S: OJL3 L6J3 10

L7: OL7S OJL1 L7J1 30 PL7 1

OL7S: OJL2 L7J2 60

OL7S: OJL3 L7J3 10

L8: OL8S OJL1 L8J1 30 PL8 1

OL8S: OJL2 L8J2 60

OL8S: OJL3 L8J3 10

L9: OL9S OJL1 L9J1 30 PL9 1

OL9S: OJL2 L9J2 60

OL9S: OJL3 L9J3 10

VL 100 -

Tabla 4. Visión general de la amplificación de regiones VH de segunda ronda Tabla 5: Características de las bibliotecas de células B de memoria de IgM individuales.

Molde: Cebador 5’ Cebador 3’ Producto Compartido en PK/PL (-) Combinación Compartido en VH (-)

H1: OH1S OJH1 H1J1 10 PH1 25

OH1S: OJH2 H1J2 10

OH1S: OJH3 H1J3 60

OH1S: OJH4 H1J4 20

H2: OH2S OJH1 H2J1 10 PH2 2

OH2S: OJH2 H2J2 10

OH2S: OJH3 H2J3 60

OH2S: OJH4 H2J4 20

H3: OH3S OJH1 H3J1 10 PH3 25

OH3S: OJH2 H3J2 10

OH3S: OJH3 H3J3 60

OH3S: OJH4 H3J4 20

H4: OH4S OJH1 H4J1 10 PH4 25

OH4S: OJH2 H4J2 10

OH4S: OJH3 H4J3 60

OH4S: OJH4 H4J4 20

H5: OH5S OJH1 H5J1 10 PH5 2

OH5S: OJH2 H5J2 10

OH5S: OJH3 H5J3 60

OH5S: OJH4 H5J4 20

H6: OH6S OJH1 H6J1 10 PH6 20

OH6S: OJH2 H6J2 10

OH6S: OJH3 H6J3 60

OH6S: OJH4 H6J4 20

H7: OH7S OJH1 H7J1 10 PH7 1

OH7S: OJH2 H7J2 10

OH7S: OJH3 H7J3 60

OH7S: OJH4 H7J4 20

VH: 100%

Bibliotecas de memoria de IgM

Donante: Células Bibliotecas

PBL totales (x106) %: % de células B de memoria Tamaño (x106) % de frecuencia del inserto % de ORF % único

Individuo 1: 3 96 74 98

Individuo 2: 72,5 1,7 5 98 79 98

Individuo 3: 67,5 1,4 3 96 79 98

Individuo 4: 132,5 2,3 6 98 69 99

Tabla 6: Datos de los Fv de cadena sencilla específicos de HA.

Nombre de scFv: SEQ ID NO (secuencia de nucl.) SEQ ID NO (secuencia de aminoácidos)* Locus de VH Locus de VL

SC06-141: 212 213 (Vh 1-115; Vl 132-245) VH1 (1-18) VKIV (B3)

SC06-255: 115 116 (Vh 1-121; Vl 138-248) VH1 (1-69) VL1 (V1-16)

SC06-257: 117 118 (Vh 1-121; Vl 138-248) VH1 (1-69) VL2 (V1-4)

SC06-260: 119 120 (Vh 1-121; Vl 138-248) VH1 (1-69) VL1 (V1-17)

SC06-261: 121 122 (Vh 1-121; Vl 138-249) VH1 (1-69) VL1 (V1-19)

SC06-262: 123 124 (Vh 1-120; Vl 137-245) VH1 (1-69) VKI (A20)

SC06-268: 125 126 (Vh 1-120; Vl 137-243) VH1 (1-69) VL3 (V2-1)

SC06-272: 214 215 (Vh 1-120; Vl 137-247) VH1 (1-69) VL2 (V1-3)

SC06-296: 216 217 (Vh 1-121; Vl 138-246) VH1 (1-2) VKIII (A27)

SC06-301: 218 219 (Vh 1-117; Vl 134-246) VH1 (3-23) VKII (A3)

SC06-307: 127 128 (Vh 1-122; Vl 139-246) VH3 (3-21) VKIII (A27)

SC06-310: 129 130 (Vh 1-121; Vl 138-246) VH1 (1-69) VL3 (V2-14)

SC06-314: 131 132 (Vh 1-121; Vl 138-248) VH1 (1-69) VL1 (V1-17)

SC06-323: 133 134 (Vh 1-120; Vl 137-245) VH1 (1-69) VKIII (A27)

SC06-325: 135 136 (Vh 1-121; Vl 138-248) VH1 (1-69) VL2 (V1-4)

SC06-327: 220 221 (Vh 1-121; Vl 138-246) VH1 (1-69) VL3 (V2-14)

SC06-328: 222 223 (Vh 1-128; Vl 145-252) VH1 (1-69) VKIII (A27)

SC06-329: 224 225 (Vh 1-121; Vl 138-246) VH1 (1-69) VKIII (A27)

SC06-331: 137 138 (Vh 1-120; Vl 137-245) VH1 (1-69) VL3 (V2-14)

SC06-332: 226 227 (Vh 1-120; Vl 137-243) VH1 (1-69) VKI (A20)

SC06-334: 228 229 (Vh 1-120; Vl 137-245) VH1 (1-69) VL3 (V2-14)

SC06-336: 230 231 (Vh 1-120; Vl 137-245) VH1 (1-69) VKIII (A27)

SC06-339: 232 233 (Vh 1-121; Vl 138-246) VH1 (1-69) VL3 (V2-14)

SC06-342: 234 235 (Vh 1-126; Vl 143-256) VH1 (1-69) VKIV (B3)

SC06-343: 236 237 (Vh 1-120; Vl 137-245) VH1 (1-69) VL3 (V2-14)

SC06-344: 139 140 (Vh 1-123; Vl 140-250) VH1 (1-69) VL1 (V1-13)

* entre paréntesis se muestran los aminoácidos que constituyen la región variable de cadena pesada (VH) y la región variable de cadena ligera (VL)

Tabla 7: Datos de las regiones CDR de las inmunoglobulinas específicas de HA. Se facilita la SEQ ID NO entre paréntesis.

Nombre de scFv: HCDR1 HCDR2 HCDR3 LCDR1 LCDR2 LCDR3

SC06141: GYYVY (238) WISAYNGNTNY AQKFQG (239) SRSLDV (240) KSSQSVLYSSN NKNYLA (241) WASTRES (242) QQYYSTPLT (243)

SC06255: SYAIS (1) GIIPIFGTTKY APKFQG (2) HMGYQVRET MDV (3) SGSTFNIGSNA VD (4) SNNQRPS (5) AAWDDILNV PV (6)

SC06257: SYAIS (1) GIIPIFGTTKY APKFQG (2) HMGYQVRET MDV (3) TGTSSDVGGYN YVS (7) EVSNRPS (8) SSYTSSSTY V (9)

SC06260: SYAIS (1) GIIPIFGTTKY APKFQG (2) HMGYQVRET MDV (3) SGSRSNVGDNS VY (10) KNTQRPS (11) VAWDDSVDG YV (12)

SC06261: SYAIS (1) GIIPIFGTTKY APKFQG (2) HMGYQVRET MDV (3) SGSSSNIGNDY VS (13) DNNKRPS (14) ATWDRRPTA YVV (15)

SC06262: GSAIS (16) GISPLFGTTNY AQKFQG (17) GPKYYSEYM DV (18) RASQGISSYLA (19) DASTLRS (20) QRYNSAPPI T (21)

SC06268: SYAIS (1) GIMGMFGTTNY AQKFQG (22) SSGYYPEYF QD (23) SGHKLGDKYVS (24) QDNRRPS (25) QAWDSSTAV (26)

SC06272: SYAIT (244) GIIGMFGSTNY AQNFQG (245) STGYYPAYL HH (246) TGTSSDVGGYN YVS (247) DVSKRPS (248) SSYTSSSTH V (249)

SC06296: SYYMH (250) WINPNSGGTNY AQKFQG (251) EGKWGPQAA FDI (252) RASQSVSSSYL A (253) DASSRAT (254) QQYGSSLW (255)

SC06301: IYAMS (256) AISSSGDSTYY ADSVKG (257) AYGYTFDP (258) RSSQSLLHSNG YNYLD (259) LGSNRAS (260) MQALQTPL (261)

SC06307: SYSMN (27) SISSSSSYIYY VDSVKG (28) GGGSYGAYE GFDY (29) RASQRVSSYLA (30) GASTRAA (31) QQYGRTPLT (32)

SC06310: SYAIS (1) GIIPIFGTTKY APKFQG (2) HMGYQVRET MDV (3) GGNNIGSKSVH (33) DDSDRPS (34) QVWDSSSDH AV (35)

SC06314: SYAIS (1) GIIPIFGTTKY APKFQG (2) HMGYQVRET MDV (3) SGSSSNIGSNY VY (36) RDGQRPS (37) ATWDDNLSG PV (38)

SC06323: SYGIS (39) DIIGMFGSTNY AQNFQG (40) SSGYYPAYL PH (41) RASQSVSSSYL A (42) GASSRAT (43) QQYGSSPRT (44)

SC06325: FYSMS (45) GIIPMFGTTNY AQKFQG (46) GDKGIYYYY MDV (47) TGTSSDVGGYN YVS (7) EVSNRPS (8) SSYTSSSTL V (48)

SC06327: THAIS (262) GIIAIFGTANY AQKFQG (263) GSGYHISTP FDN (264) GGNNIGSKGVH (265) DDSDRPS (266) QVWDSSSDH VV (267)

SC06328: GYAIS (268) GIIPIFGTTNY AQKFQG (269) VKDGYCTLT SCPVGWYFD L (270) RASQSVSSSYL A (271) GASSRAT (272) QQYGSSLT (273)

SC06329: SNSIS (274) GIFALFGTTDY AQKFQG (275) GSGYTTRNY FDY (276) RASQSVSSNYL G (277) GASSRAS (278) QQYGSSPLT (279)

SC06331: SYAIS (1) GIIGMFGTANY AQKFQG (49) GNYYYESSL DY (50) GGNNIGSKSVH (33) DDSDRPS (34) QVWDSSSDH YV (51)

SC06332: NFAIN (280) GIIAVFGTTKY AHKFQG (281) GPHYYSSYM DV (282) RASQGISTYLA (283) AASTLQS (284) QKYNSAPS (285)

SC06334: SNAVS (286) GILGVFGSPSY AQKFQG (287) GPTYYYSYM DV (288) GGNNIGRNSVH (289) DDSDRPS (290) QVWHSSSDH YV (291)

SC06336: SYAIS (292) GIFGMFGTANY AQKFQG (293) SSGYYPQYF QD (294) RASQSVSSSYL A (295) GASSRAT (296) QQYGSSSLT (297)

SC06339: SYAIS (298) GIIAIFHTPKY AQKFQG (299) GSTYDFSSG LDY (300) GGNNIGSKSVH (301) DDSDRPS (302) QVWDSSSDH VV (303)

SC06342: SYAIS (304) GVIPIFRTANY AQNFQG (305) LNYHDSGTY YNAPRGWFD P (306) KSSQSILNSSN NKNYLA (307) WASTRES (308) QQYYSSPPT (309)

SC06343: YYAMS (310) GISPMFGTTTY AQKFQG (311) SSNYYDSVY DY (312) GGHNIGSNSVH (313) DNSDRPS (314) QVWGSSSDH YV (315)

SC06344: NYAMS (52) GIIAIFGTPKY AQKFQG (53) IPHYNFGSG SYFDY (54) TGSSSNIGAGY DVH (55) GNSNRPS (56) GTWDSSLSA YV (57)

Tabla 8. Datos de las IgG específicas de HA.

Nombre de IgG: SEQ ID NO de secuencia de nucl. de cadena pesada SEQ ID NO de secuencia de aminoácidos* de cadena pesada SEQ ID NO de secuencia de nucl. de cadena ligera SEQ ID NO de secuencia de aminoácidos* de cadena ligera

CR6141: 316 317 (Vh 1-115) 318 319 (Vl 1-114) (

CR6255: 58 59 (Vh 1-121) 84 85 (Vl 1-111)

CR6257: 60 61 (Vh 1-121) 86 87 (Vl 1-111)

CR6260: 62 63 (Vh 1-121) 88 89 (Vl 1-111)

CR6261: 64 65 (Vh 1-121) 90 91 (Vl 1-112)

CR6262: 66 67 (Vh 1-120) 92 93 (Vl 1-109)

CR6268: 68 69 (Vh 1-120) 94 95 (Vl 1-107)

CR6272: 320 321 (Vh 1-120) 322 323 (Vl 1-111)

CAR6296: 324 325 (Vh 1-121) 326 327 (Vl 1-109)

CR6301: 328 329 (Vh 1-117) 330 331 (Vl 1-113)

CR6307: 70 71 (Vh 1-122) 96 97 (Vl 1-108)

CR6310: 72 73 (Vh 1-121) 98 99 (Vl 1-109)

CR6314: 74 75 (Vh 1-121) 100 101 (Vl 1-111)

CR6323: 76 77 (Vh 1-120) 102 103 (Vl 1-109)

CR6325: 78 79 (Vh 1-121) 104 105 (Vl 1-111)

CR6327: 332 333 (Vh 1-121) 334 335 (Vl 1-109)

CR6328: 336 337 (Vh 1-128) 338 339 (Vl 1-108)

CR6329: 340 341 (Vh 1-121) 342 343 (Vl 1-109)

CR6331: 80 81 (Vh 1-120) 106 107 (Vl 1-109)

CR6332: 344 345 (Vh 1-120) 346 347 (Vl 1-107)

CR6334: 348 349 350 351

(Vh 1-120): (Vl 1-109)

CR6336: 352 353 (Vh 1-120) 354 355 (Vl 1-109)

CR6339: 356 357 (Vh 1-121) 358 359 (Vl 1-109)

CR6342: 360 361 (Vh 1-126) 362 363 (Vl 1-114)

CR6343: 364 365 (Vh 1-120) 366 367 (Vl 1-109)

CR6344: 82 83 (Vh 1-123) 108 109 (Vl 1-111)

Tabla 9. Unión de IgG a células PER.C6 que expresan HA (H5N1TV).

Células PER.C6 que expresan HA (H5N1TV): Células PER.C6 control

Anticuerpo: 10 μg/ml 1 μg/ml 0,1 μg/ml 10 μg/ml 1 μg/ml 0,1 μg/ml

CR6255: 414,18 257,13 60,43 3,16 2,64 2,48

CR6257: 365,17 283,87 62,08 2,59 2,44 2,53

CR6260: 323,42 168,49 31,06 5,42 3,34 2,57

CR6261: 330,77 278,81 85,82 29,43 13,22 3,89

CR6262: 84,29 20,91 8,06 2,71 2,53 2,48

CR6268: 421,70 218,70 43,71 3,82 2,74 2,50

CR6307: 484,78 266,55 82,42 4,87 3,02 2,48

CR6314: 399,54 166,98 44,51 5,99 3,49 2,64

CR6323: 445,08 116,52 33,38 5,05 2,92 2,71

CR6325: 478,29 239,28 64,36 4,00 3,11 2,57

CR6344: 768,25 328,16 106,65 80,90 26,33 10,17

CR3014: 13,10 10,00 6,21 3,11 2,69 2,55

CR6310*: 597,04 290,93 86,91 14,92 6,05 4,42

CR6331*: 421,14 165,43 41,04 7,87 4,59 4,55

CR3014*: 9,15 7,95 10,51 4,74 4,12 4,57

* Indica análisis de FACS que se realizaron en un experimento separado Tabla 10. Potencia de los anticuerpos anti-HA en el ensayo de titulo de anticuerpos neutralizantes.

Anticuerpo: Concentración (μg/ml)

CR6255: 25

CR6257: 12,5

CR6260: 12,5

CR6261: 12,5

CR6262: 100

CR6268: 50

CR6307: 50

CR6314: 12,5

CR6323: 50

CR6325: 12,5

CR6344: 25

CR6310: 25

CR6331: 100

CR4098: -*

*A 50 μg/ml no se observó neutralización 10 Tabla 11. Potencia de los anticuerpos anti-HA en el ensayo de título de anticuerpo neutralizante.

Anticuerpo: Concentración (μg/ml)

CR6255: 3,12

CR6257: 1,56

CR6260: 3,12

CR6261: 0,78

CR6262: 25

CR6268: 6,25

CR6272: -

CR6307: 25

CR6310: 6,25

CR6314: 3,12

CR6323: 6,25

CR6325: 6,25

CR6327: 6,25

CR6328: 25

CR6329: 3,12

CR6331: 25

CR6332: 12,5

CR6334: 6,25

CR6336: 25

CR6339: -

CR6342: 6,25

CR6343: 50

CR6344: 25

Tabla 12. Reactividad cruzada de IgG anti-H5N1 frente a moléculas de HA de diferentes subtipos de HA tal como se mide mediante ELISA (DO 492 nm). ND: No determinado

-: significa que a 100 μg/ml no se observó neutralización a de 10 a menos que se indique lo contrario

H1: H3 H5 H7 H9 A/NC/20/99 (H1N1) inact. con BPL NIBRG14 (H5N1) inact. con BPL

CR6255: 1,91 0,08 1,44 0,22 1,97 1,38 1,18

CR6257: 1,93 0,08 1,37 0,16 2,06 1,34 1,21

CR6260: 1,88 0,08 1,45 0,19 2,00 1,34 1,17

CR6261: 2,04 0,07 1,44 0,31 2,32 1,46 1,41

CR6262: 1,48 0,09 1,02 0,17 1,93 0,51 0,35

CR6268: 1,78 0,08 1,30 0,15 2,16 1,39 1,13

CR6272: 0,81 0,07 0,58 0,15 0,96 0,92 0,79

CR6307: 0,22 0,11 0,99 0,22 0,17 0,23 0,50

CR6310: 1,92 0,08 1,37 0,18 2,17 1,31 1,00

CR6314: 1,93 0,07 1,48 0,25 2,21 1,37 1,42

CR6323: 2,32 0,07 1,89 0,15 2,27 1,40 0,93

CR6325: 1,92 0,07 1,30 0,17 2,04 1,09 1,20

CR6327: 1,75 0,08 1,11 0,14 1,93 1,16 0,73

CR6328: 2,43 0,07 1,78 0,16 2,38 1,39 0,98

CR6329: 1,98 0,08 1,43 0,17 2,16 1,04 1,01

CR6331: 1,75 0,06 1,32 0,16 2,02 1,25 0,92

CR6332: 2,20 0,15 1,65 0,26 2,11 1,20 1,11

CR6334: 2,04 0,07 1,19 0,15 1,82 1,13 0,91

CR6336: 1,92 0,10 1,41 0,18 2,02 1,09 0,94

CR6339: 1,25 0,07 0,81 0,14 1,96 0,94 0,50

CR6342: 1,99 0,09 1,25 0,17 2,13 1,32 0,90

CR6343: 1,28 0,07 0,76 0,15 1,88 0,91 0,64

CR6344: 1,80 0,09 1,31 0,18 2,15 1,31 0,96

CR5111: 0,08 0,07 1,57 0,15 0,17 0,09 0,81

CR3014: 0,08 0,07 0,09 0,17 0,16 0,09 0,11

Sin IgG: 0,13 0,08 0,09 0,15 0,16 0,09 0,14

anti-H5 de oveja: ND ND ND 0,90 2,07 2,62 2,93

Tabla 13. Mapeo de epítopos de anticuerpos anti-HA humanos.

HA1: HA2 CR5111 CR6342 C179 CR6307 CR6323 CR6261 CR6325 CR6329

H5N1TV: TGLRN GVTNKVNSIIDK + + + +

Mutante I: K---- ------------ + - + +

Mutante II: ----- -----E----- + - + -

Mutante III: --M-- ------------ + + + +

Mutante IV: ----- -------R---- + - + +

Mutante V: ----- ----------N- + + + +

Tabla 15. Dificultad respiratoria de ratones pretratados con anticuerpo, seguido por una exposición letal con virus influenza H5N1

10 Tabla 16. Puntuaciones clínicas de ratones infectados con virus H5N1 y tratados con anticuerpo a diferentes puntos de tiempo tras la infección

a con 14 ratones en los grupos 2 y 5 hasta el día 6 p.i.

15 Tabla 17. Dificultad respiratoria de ratones infectados con virus H5N1 y tratados con anticuerpo a diferentes puntos de tiempo tras la infección

a puntuación 3

20 Tabla 18. Mortalidad de ratones infectados con virus H5N1 y tratados con anticuerpo a diferentes puntos de tiempo tras la infección

Número de ratones vivos en cada día del estudio

Día del estudio

Id de grupo: Intervalo de tiempo p.i. -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

1: 4h 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

2: 1d 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

3: 2d 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

4: 3d 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

5: CR2006 10 10 10 10 10 10 10 10 6 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabla 19. Mortalidad de ratones infectados con virus H1N1 y tratados con anticuerpo a diferentes puntos de tiempo antes y después de la infección

Número de ratones vivos en cada día del estudio

Día del estudio

Intervalo de tiempo p.i: -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

-1d: 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10

1d: 10 10 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

2d: 10 10 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8

3d: 10 10 10 10 10 10 10 9 9 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8

control: 10 10 10 10 10 10 10 10 5 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

Tabla 20. Puntuaciones clínicas de ratones infectados con virus H1N1 y tratados con anticuerpo a diferentes puntos de tiempo antes y después de la infección

a con 9 ratones en los grupos de tratamiento de 1d y 2d p.i.

10 Tabla 21. Dificultad respiratoria de ratones infectados con virus H1N1 y tratados con anticuerpo a diferentes puntos de tiempo antes y después de la infección

a una puntuación de 2 ó 3

15 Tabla 22. Secuencia de epítopo HA2 en diferentes subtipos de influenza. El aminoácido subrayado representa la sustitución valina (V) -> ácido glutámico (E) en el mutante de escape H2N2 (mutante II; tabla 13)

HA2: SEQ ID NO:

H5N1: A/Vietnam/1203/2004: GVTNKVNSIIDK 368

H5N1: A/Hong Kong/156/97: GVTNKVNSIINK 369

H5N2: A/mald/PA/84: GVTNKVNSIIDK 368

H1N1: A/PR/8/34 A/South Carolina/1/1918 A/WSN/33 A/New Caledonia/20/99 A/Bangkok/10/83 A/Yamagata/120/86: GITNKVNSVIEK 372

H2N2: A/Okuda/57 A/Kumamoto/1/65 A/Korea/426/68 A/Izumi/5/65: GITNKVNSVIEK 372

H2N2: A/Izumi/5/65 (R): GITNKENSVIEK 373

H6N2: A/Mallard/Netherlands/16/99: GITNKVNSIIDK 374

H9N2: A/Hong Kong/1073/99: KITSKVNNIVDK 375

H3N2: A/Aichi/2/68: QINGKLNRVIEK 376

H3N2: A/Fukuoka/C29/85: QINGKLNRLIEK 377

Bibliografía

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Anticuerpo humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, que puede reconocer y unirse a un epítopo en la subunidad HA2 de la proteína hemaglutinina (HA) de influenza, caracterizado porque dicho anticuerpo

o fragmento de unión a antígeno del mismo tiene actividad neutralizante contra un virus influenza que comprende HA del subtipo H5, tal como H5N1, H5N2, H5N8 y H5N9, y porque el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo comprende una región variable de cadena pesada que comprende los aminoácidos 1-121 de SEQ ID NO: 65 y una región variable de cadena ligera que comprende los aminoácidos 1-112 de SEQ ID NO: 91.
2.

Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1, teniendo también dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo actividad neutralizante contra un virus influenza que comprende HA del subtipo H1, tal como H1N1, y preferiblemente teniendo también dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo actividad neutralizante contra un virus influenza que comprende HA del subtipo H2, H6 y/o H9.
3.

Anticuerpo humano aislado, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 1 ó 2, comprendiendo el anticuerpo una región CDR1 de cadena pesada de SEQ ID NO:1, una región CDR2 de cadena pesada de SEQ ID NO:2 y una región CDR3 de cadena pesada de SEQ ID NO:3.
4.

Molécula de ácido nucleico que codifica para un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3.
5.

Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso como medicamento y preferiblemente para el tratamiento terapéutico y/o profiláctico de la infección por influenza.
6.

Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 5, en el que dicha infección por influenza está provocada por un virus influenza que está asociado con un brote pandémico, o tiene el potencial de asociarse con un brote pandémico.
7.

Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según la reivindicación 6, en el que dicha cepa del virus influenza que está asociada con un brote pandémico se selecciona del grupo que consiste en: H1N1, H5N1, H5N2, H5N8, H5N9, una cepa basada en H2 y H9N2.
8.

Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3 y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
9.

Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso en la profilaxis y/o el tratamiento de una infección por virus influenza.
10.

Anticuerpo, o fragmento de unión a antígeno del mismo, según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, para su uso en el diagnóstico de una infección por virus influenza.